CN102460173A - 组蛋白修饰用于癌症的临床诊断和预后 - Google Patents

组蛋白修饰用于癌症的临床诊断和预后 Download PDF

Info

Publication number
CN102460173A
CN102460173A CN2010800251368A CN201080025136A CN102460173A CN 102460173 A CN102460173 A CN 102460173A CN 2010800251368 A CN2010800251368 A CN 2010800251368A CN 201080025136 A CN201080025136 A CN 201080025136A CN 102460173 A CN102460173 A CN 102460173A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
histone
level
patient
histone modification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800251368A
Other languages
English (en)
Inventor
D·W·道森
S·K·库尔迪斯坦尼
D·B·泽尔格森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN102460173A publication Critical patent/CN102460173A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

通过用选自H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的组蛋白修饰模式的改变来鉴定癌症，本发明提出诊断包括但不限于胰腺癌的癌症并提供预后和治疗，以及对胸苷酸合酶抑制剂(例如，5-FU)治疗的反应性的方法。

Description

组蛋白修饰用于癌症的临床诊断和预后
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年4月14日提交的美国临时申请序列号61/169212、2009年4月14日提交的美国临时专利申请序列号61/169216和2009年7月13日提交的美国临时申请序列号61/225162的在先权益，其内容全文纳入本文。
联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
本研究得到国立癌症研究院早期检测研究网络(National CancerInstitute Early Detection Research Network)政府基金项目(EDRN NCICA-86366)的部分资助，还得到赫氏博格胰腺癌研究基金会(HirshbergFoundation for Pancreatic Cancer Research)CURE消化疾病研究中心(DK041301，NIH/NIDDK)和放射治疗肿瘤组翻译研究项目(RadiationTherapy Oncology Group Translational Research Program)基金NCIU10CA21661的资助；政府享有本发明的某些权益。
在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件
无
发明领域
本发明涉及用整体组蛋白修饰预测癌症的预后，并预测患者对含胸苷酸合酶抑制剂的治疗响应的可能性。
发明背景
胰腺癌是高度侵袭性致死癌症，其治疗选择很有限。和遗传事件一样，肿瘤相关外遗传改变也是胰腺癌起始和进展的重要决定因素(Maitra，A.，Hruban，R.H.，Annu Rev Pathol 3：157-88(2008)；Hezel等，Genes Dev20：1218-49(2006))并代表有希望的生物标记和治疗靶标。癌症中的外遗传改变包括全基因组和基因座特异性的DNA甲基化改变和翻译后组蛋白修饰，其影响染色质可接近性和基因活性(Bernstein等，Cell 128：669-81(2007)；Ting等，Genes Dev 20：3215-3231(2006)；Esteller，M.，Nat Rev Genet8：286-98(2007))。
组蛋白乙酰化或甲基化的基因座特异性改变已与多个胰腺癌关键基因的表达改变相关联(Fitzgerald等，Neoplasia 5：427-36(2003)；Fujii等，J BiolChem 283：17324-32(2008)；Kikuchi等，Oncogene 21：2741-9(2002)；Kumagai等，Int J Cancer 124：827-33(2009))，而用组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理细胞系后的微阵列分析发现基因表达的广泛变化，提示组蛋白修饰可能在胰腺癌的基因表达调控中起着更广泛的作用(Kumagai等，Int J Cancer124：827-33(2009)；Sato等，Cancer Res 63：3735-42(2003))。
癌症相关的全基因组组蛋白修饰的改变包括其在基因组内的水平和分布的变化，例如基因启动子、重复DNA序列和其它异染色质结构域(Esteller，M.，Nat Rev Genet 8：286-98(2007))。最后，肿瘤细胞核免疫组化染色中的细胞间差异表明给定肿瘤内组蛋白修饰在细胞水平上的不齐性(Kurdistani，S.K.，Br J Cancer 97：1-5(2007))，更增加了癌症外基因组代表性变化谱的复杂性。
包括癌症在内的人类疾病中发生组蛋白修饰异常。已证明癌症细胞中发生组蛋白翻译后修饰的异常，但仅发生于单独的启动子(Jacobson等，Curr.Opin.Genet.Dev.9：175-84(1999))且未与临床结果相关联。这些异常可通过组蛋白修饰酶的不恰当靶向局部发生于启动子处，引起在肿瘤发生中起重要作用的个体基因的不当表达或抑制。然而，尽管检查了大量基因，很少报道不同癌症中局部基因靶向组蛋白修饰改变的相似性。也已报道了与DNA重复序列相关的组蛋白异常修饰。这些异常包括血液恶性肿瘤和结直肠腺癌中的组蛋白H4 K16Ac和K20diMe水平较低。但是，无论是个体基因还是重复DNA元件，这些变化无一与临床结果关联。
组蛋白修饰如赖氨酸(K)和精氨酸(R)的乙酰化和甲基化也发生于染色质的较大区域包括非启动子序列，这种修饰称为整体组蛋白修饰(Vogelauer等，Nature 408：495-8(2000))。如上所述，癌症中修饰组蛋白的酶的活性改变。例如，p300组蛋白乙酰转移酶的错义突变和p300基因座的杂合性丢失与结直肠癌、乳腺癌和成胶质细胞瘤相关(Giles等，Trends.Genet.14：178-83(1998)；Gayther等，Nat.Genet.24：300-3(2000)；Muraoka等，Oncogene12：1565-9(1996))。目前将组蛋白修饰酶活性改变的结果与在肿瘤生物学中起作用的少数基因的不适当表达相关联。例如，p300参与雄激素受体反式激活，可能在前列腺癌的进展中起作用(Debes等，Cancer Res.63：7638-40(2003))。
然而，除靶向启动子以外，这些酶还影响基因组内的大多数核小体，这种影响独立于明确的序列特异性DNA结合蛋白(Vogelauer等，Nature408：495-8(2000)；Reid等，MoI Cell 6，1297-307(2000)；Krebs等，Cell 102，587-98(2000))。此外，组蛋白修饰酶具有高度底物特异性，区分各组蛋白内的组蛋白亚型和独立侧链(Peterson等，Curr.Biol.14，R546-51(2004)；Suka等，Mol Cell 8：473-9(2001))。因此，将以不同程度整体修饰各残基，反映组蛋白修饰酶的选择性但又广泛的活性。
需要改良的癌症预后和治疗标记。本发明满足了这些需要，涉及我们对特异性组蛋白修饰在胰腺癌和其它癌症中用作预后和预测性生物标记的意外发现。这些细胞水平组蛋白修饰明确了此前未识别的具有不同外遗传表型和临床结果的胰腺癌患者子集，并代表预后和预测性生物标记，还为临床决定包括5-FU和类似化疗的使用提供信息。
发明概述
一方面，本发明提供为患癌的人对象提供预后的方法，所述癌症包括但不限于胰腺癌。所述方法一般包括接触来自患癌个体的测试组织样品；检测测试组织样品中选自H3K4me2、H3K9me2、H3K18ac中的1种、2种或更多组蛋白的蛋白修饰，并与按存活史分类的患者的代表数值作比较。通常，所述组织样品是组织活检。较低水平的H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac组蛋白修饰与癌症患者存活降低显著相关，个体中存在相似的低水平修饰可预测存活时间或预期寿命缩短。相反，存在较高水平修饰可预测存活时间或预期寿命延长。在优选实施方式中，所述个体处于患病较早期(即低级或早期)，该分类迫切需要预后标记。
另一方面，本发明提供治疗患有低级癌症的个体的方法，所述癌症包括但不限于胰腺癌，所述方法包括步骤：与比较组织样品(有已知存活情况、治疗或疾病结果的人)相比，确定测试组织样品中整体组蛋白修饰水平，组蛋白修饰水平表明所述癌症根据比较可能发展成恶性或转移时，给予患者比所述病级通常所用更具攻击性的癌症疗法。在一些实施方式中，所述步骤包括从个体获取测试或活检样品，将个体的测试或活检组织样品与抗体或适体接触，所述抗体或适体特异性结合选自H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac的经修饰组蛋白；以及
另一方面，本发明提供方法以评估癌症患者对医疗处理的响应，所述患者包括但不限于胰腺癌患者，所述方法包括步骤：与治疗前、或治疗过程早期或晚期时、或在改变治疗之前或之后取自患者的组织样品相比，确定测试组织样品中组蛋白修饰水平。在一些实施方式中，所述治疗是免疫治疗、靶向分子治疗、外遗传治疗、化疗或放疗或促凋亡治疗。在一些实施方式中，测试或活检样品得自患者，所述样品接触抗体，所述抗体特异性结合选自H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的经修饰组蛋白。
另一方面，本发明提供包含至少两种抗体的试剂盒，所述抗体各自结合不同的组蛋白修饰。在一些实施方式中，所述抗体选自下组：H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac。在一些实施方式中，所述抗体标记有可检测部分。在一些实施方式中，所述试剂盒提供在这些抗体用作标记时加以检测的试剂。在一些实施方式中，所述试剂盒提供用所述抗体进行组织免疫组化染色的额外试剂和/或说明书。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括关于如何对免疫组化染色结果就癌症风险或预后进行评估的说明。
因此，本发明提供给予向对象或者为对象提供预后的方法，所述对象患有癌症，包括但不限于胰腺癌，所述方法包括确定来自癌症的组织样品中H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的组蛋白修饰水平，其中存在低水平组蛋白修饰表明存活预后较差，而存在H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的高组蛋白修饰水平表明存活预后较好。在一些实施方式中，所述对象患有淋巴结阴性癌症或正接受5-氟尿嘧啶。在上述任意方面的其它实施方式中，用组蛋白修饰H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的阳性肿瘤细胞染色将患者分成低或高染色，其中低染色分类支持总体存活较差的预后。在其它实施方式中，预后是基于H3K4me2和H3K18ac两者的低水平组蛋白修饰(最差预后组定义为所述修饰中其一或两者为低水平)。在一些实施方式中，H3K4me2和H3K18ac两者的低水平组蛋白修饰预测存活可能性较低。在优选实施方式中，由免疫细胞化学确定组蛋白修饰水平。对象可通过选自H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac的组蛋白修饰染色百分秩次分入低或高风险组。例如H3K9dime≥10％、H3K4me2＞60％或K18ac染色＞35百分位。
另一方面，本发明提供方法预测患有胰腺癌或另一癌症的对象对5-FU或另一胸苷酸合酶抑制剂治疗(例如，雷替曲塞、培美曲塞、诺莱曲塞(nolatrexed)、ZD9331和GS7904L)的响应，所述5-FU或另一胸苷酸合酶抑制剂治疗有或没有甲酰四氢叶酸，其中所述预测基于相对已知所述响应的比较群体所确定的数值，是否存在更低水平的H3K4me2或H3K18ac。在所述方法中，修饰水平低预示无病存活率差。比较组可以就修饰水平和相关存活结果作二分、连续或不连续分级。5-FU治疗的癌症包括但不限于结肠、直肠、头颈、乳腺、卵巢癌和皮肤基底细胞癌。在大多数情况中，5-FU与甲酰四氢叶酸联用。
另一方面，本发明提供方法，鉴定能受益于在5-FU外添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的患者，所述患者有胰腺癌或所患癌症采用5-氟尿嘧啶或另一胸苷酸合酶抑制剂作为标准化疗。在所述方法中，确定癌症患者的组织样品中的H3K18ac组蛋白修饰水平。所述修饰水平低(根据与对比群体所确定数值的相似性，已知对比群体的所述修饰和对不加抑制剂的5-FU的响应概况)指示组蛋白脱乙酰酶抑制剂用于治疗是有益的或者有补充益处。因此，本发明还提供治疗方法，其中如上鉴定出的患者随后用所述抑制剂治疗，并可选地与5-FU或本文所述的另一疗法联用。
另一方面，本发明提供方法，鉴定在5-FU治疗外添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂能受益的癌症患者，所述癌症以5-氟尿嘧啶作标准化疗(例如，结直肠癌、乳腺癌)。在所述方法中，确定所述癌症患者组织样品中的H3K18ac组蛋白修饰水平。所述修饰水平低(根据与对比群体所确定数值的相似性，已知对比群体的所述修饰和对不加抑制剂的5-FU的响应概况)指示组蛋白脱乙酰酶抑制剂有补充益处。因此，本发明还提供治疗方法，其中如上鉴定出患者随后用5-FU和所述抑制剂进行治疗。
上述任一方面的进一步实施方式中，提供预后、鉴定、评估、治疗、预测或确定方法，用组蛋白修饰H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的阳性肿瘤细胞染色将患者分为低或高染色，其中低染色组表明总体存活预后较差和/或胸苷酸抑制剂无响应；在其它实施方式中，所述预后是基于H3K4me2和H3K18ac两者的低水平组蛋白修饰(预后较差组定义为这两种修饰其一或两者的水平较低)。在一些实施方式中，H3K4me2和H3K18ac两者的低水平组蛋白修饰预测存活可能性较低。在优选实施方式中，由免疫细胞化学确定组蛋白修饰水平。对象可通过选自H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac的组蛋白修饰染色百分秩次分入高或低风险组。在一些实施方式中，本发明根据组蛋白修饰模式，对鉴定为抗治疗或可能有较差结果或预后(例如，总体存活较差)的患者选用更具攻击性的疗法。
在上述任一方面的一些实施方式中，用选自H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac组蛋白修饰中的1种、2种或3种的组蛋白修饰水平提供预后、鉴定、评估、治疗、预测或确定。在这些实施方式中，仅选择两种修饰时，所述组蛋白修饰可选自下组：H3K4me2与H3K9me2、H3K4me2与H3K18ac、或H3K9me2与H3K18ac。在一些实施方式中，根据组蛋白规则对某修饰是否为低或高水平进行分类。比较组可以就修饰水平和相关存活结果作二分、连续或不连续分级。
上述任一方面的任一实施方式中，所述患者可以是人，所述癌症可以是腺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、胆囊癌或肾癌。在上述任一方面的一些实施方式中，所述方法提供额外的非冗余预后信息，该信息用于为癌症提供预后或选择疗法。
在一些实施方式中，将各肿瘤根据按其细胞染色阳性中值百分数确定的百分秩次分配到低水平或高水平染色组，包括H3K4me2(百分秩次＜60与≥60)、H3K9me2(RTOG TMA百分秩次＜30与≥30或UCLA I/II期TMA百分秩次＜25与≥25)与H3K18ac(百分秩次＜35与≥35)。
附图简要说明
图1.胰腺癌中组蛋白修饰的细胞异质性。(A)低级(患者1)或高级(患者2)组织学肿瘤的组蛋白修饰的代表性免疫组化分析，10x或40x物镜(小图)。在(B)RTOG 9704或(C)UCLA I/II期TMA中，显示对于各组蛋白修饰，指定百分数肿瘤细胞具有阳性核染色的肿瘤分布。
图2.基于指定组蛋白修饰组的UCLA I/II期胰腺癌TMA的总体患者存活率。卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)作图显示高水平(实线)相对低水平(虚线)组蛋白组的存活概率，(A)H3K4me2，(B)H3K18ac，(C)H3K9me2和(D)低水平H3K4me2和/或H3K18ac相对高水平H3K4me2与H3K18ac。p值为对数秩检验。
图3.在RTOG 9704 TMA中治疗组首次分组后指定组蛋白修饰的总体存活。根据辅助化疗对患者分组(A-B为5-氟尿嘧啶或C-D为吉西他滨)。然后用卡普兰-迈耶作图显示高水平(实线)相对低水平(虚线)(A，C)H3K4me2或(B，D)H3K9me2的患者的存活概率。p值为对数秩检验。
图4.原发癌症组织中组蛋白修饰水平的细胞异质性，用抗H3K18ac抗体免疫组化染色来自(A)肺腺癌(2级)和(B)肾透明细胞癌(1级)的癌组织。含褐色核癌细胞的百分数决定给定个体的各组蛋白修饰的整体水平。放大倍数：左图为10X；右图为40X。显示了来自(C)肺与(D)肾的癌组织中H3K4me2(黑色柱)与H3K18ac(灰色柱)水平的患者分布。这些图表示根据细胞染色百分数(x轴)具有指定组蛋白修饰水平的患者分率(y轴)。
图5.用组蛋白修饰预测不同癌症的临床结果。对各癌症类型，先将患者根据H3K4me2与H3K18ac水平分成两组，然后比较两组的临床结果。用卡普兰-迈耶作图显示(A)肺癌(对数秩p＝0.018，n＝159)与(B)肾癌(对数秩p＝0.028，n＝192)中两组的存活概率(第1组，黑线；第2组，红线)。图内框中列表给出各组中按级别的患者分布。
图6.H3K9me2细胞水平预测前列腺癌和肾癌的临床结果。显示来自(A)前列腺与(C)肾的癌组织中H3K9me2水平的患者分布。这些图表示根据细胞染色百分数(x轴)具有指定组蛋白修饰水平的患者分率(y轴)。对各癌症类型，先将患者根据H3K9me2水平分成两组，然后比较两组的临床结果(第1组，H3K9me2＞10％，黑线；第2组，H3K9me2≤10％，红线)。用卡普兰-迈耶作图显示(B)低级前列腺癌(对数秩p＝0.0043，n＝109)与(D)全部肾癌(对数秩p＝0.00092，n＝359)患者中两组的存活概率差异。图内框中列表给出各组中按级别的患者分布。
图7.癌细胞系中组蛋白修饰水平的细胞异质性。(A)LNCaP与PC3前列腺癌细胞系中H3K9me2的免疫组化检查。注意到PC3细胞中较低水平H3K9me2(蓝色核)的百分数高于LNCaP细胞。(B)LNCaP与PC3细胞酸提组蛋白的Western印迹，分析H3K9me2水平，组蛋白H3(不考虑修饰)作为加样对照。三角形指示从左向右增加加样。
图8.H3K9me2整体水平与其在重复DNA元件处的水平相关。(A)LNCaP与PC3细胞中H3K9me2的ChIP-芯片分析。每行代表给定基因标注转录起始位点(TSS)的-5.5至+2.5区域，该区域分成各为500bp的16个片段。根据所述8kb启动子区的e1a-结合模式的相似性将基因分组。颜色指示各细胞经ChIP(染色质免疫沉淀)DNA(黄色)相比进样(蓝色)的相对富集或消耗。(B)LNCaP与PC3细胞之间所有启动子的16片段各处H3K9me2水平的关联。(C)ChIP-定量实时PCR分析指示DNA重复元件处的H3K9me2与H3K18ac水平。数值表示进样的百分值。误差线代表3次独立实验的标准差。用组蛋白H3ChIP作为对照，显示PC3细胞内的较低修饰水平不是由于核小体损失。
图9.肾癌中组蛋白修饰的细胞模式。(A)基于H3K4me2和H3K18ac的细胞组蛋白修饰模式不能预测患有转移性疾病患者的结果(p＝0.99，n＝163)。(B)将低级分类(1和2级，n＝221)的肾癌患者根据H3K4me2与H3K18ac水平分成两组，比较两组的临床结果。用卡普兰-迈耶作图显示两组(第1组，黑线；第2组，红线)(对数秩p＝0.0055，HR＝1.9，95％CI 1.2-3.1)的存活概率。组蛋白修饰不能预测3级与4级肾癌患者的结果(数据未显示)。
图10.H3K9me2的细胞模式预测肾癌预后。首先根据肿瘤定位(局限性相对转移性疾病)将肿瘤分级。各级中的患者根据H3K9me2水平分成两组—≤10％染色，第2组，红线与蓝线；＞10％染色，第1组，黑线与绿线—比较两组的临床结果。用卡普兰-迈耶作图显示各级中两个H3K9me2组的存活概率。在局限性(黑线与红线)和转移性(绿线与蓝线)疾病中，低水平H3K9me2都预测了存活概率较差。
图11.癌细胞系中组蛋白修饰水平的细胞异质性。(A)LNCaP与PC3前列腺癌细胞系中H3K4me2与H3K18ac的免疫组化检查。注意到PC3细胞中较低水平组蛋白修饰(橙色箭头指示的蓝色核)的百分数高于LNCaP细胞。染色强度也由(B)LNCaP与PC3细胞酸提组蛋白的Western印迹分析H3K4me2与H3K18ac水平三角形指示从左向右增加加样。
图12.组蛋白修饰预测乳腺癌的预后。
发明详述
组蛋白修饰的细胞模式为多种肿瘤类型提供了额外的独立预后信息，这些肿瘤包括前列腺癌(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009)；Seligson等，Nature 435：1262-6(2005))、肾癌(Seligson等，Am J Pathol174：1619-1628(2009))、肺癌(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009)；Seligson等，Nature 435：1262-6(2005)；Barlesi等，J Clin Oncol 25：4358-64(2007))、胃癌(Park等，Ann Surg Oncol 15：1968-76(2008))和卵巢癌(Wei等，Mol Carcinog 47：701-6(2008))。最近还发现H3K27me3的低细胞水平与胰腺癌结果差相关(Wei等，Mol Carcinog 47：701-6(2008))。但是，未发现组蛋白修饰的细胞水平预测对特定疗法的响应。我们采用两个大型胰腺癌患者组的组织微阵列，检查此前未在胰腺癌中研究过的三种组蛋白修饰的细胞水平，包括H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac。我们发现这些修饰在胰腺癌中是高度显著和独立的预后因子。此外，我们发现H3K4me2与H3K9me2的细胞水平较低可特定预测接受辅助5-FU化疗患者的存活结果较差。我们的数据表明，组蛋白修饰的细胞水平代表胰腺癌的新型预后标记，有助于预测对5-FU的响应。
在此，我们证明低细胞水平组蛋白修饰鉴定出不太可能从辅助5-FU化疗获得存活益处的胰腺癌患者，而高细胞水平组蛋白鉴定出从采用辅助吉西他滨或5-FU化疗会获得相似存活益处的患者。我们认为细胞组蛋白修饰水平代表了新的一类生物标记，能预测切除的胰腺癌中对辅助5-氟尿嘧啶化疗的响应，可能应用于肿瘤辅助治疗设定或晚期胰腺癌。更普遍地，在利用5-氟尿嘧啶为标准化疗的其它恶性肿瘤(即，结直肠或乳腺癌)中，可证明细胞组蛋白修饰水平能用作对5-FU或其它胸苷酸合酶抑制剂响应的预测性生物标记。
在另一方面，本发明提供治疗患有低级或早期癌症的个体的方法，通过确定所述个体是否患有低级癌症，并将所述个体的测试组织样品与抗体接触，该抗体特异性结合选自H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac的经修饰组蛋白；并与对照组织样品比较确定所述测试组织样品中整体组蛋白修饰模式，整体组蛋白修饰模式表明所述癌症可能发展或转移时，给予患者更具攻击性的癌症疗法。可以在确定组蛋白修饰模式之前或之后确定癌症分级或分期。
在其它实施方式中，本发明提供方法，根据在手术去除癌组织之前、期间或之后而另一癌症治疗之前、期间或之后所得患者组织样品中整体组蛋白修饰模式的改变，将患者靶向更具攻击性的或替代癌症疗法，或者提高癌症复发监控。可如本文所述确定所述整体组蛋白修饰模式的改变。鉴定为选自H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac的整体组蛋白修饰模式有改变且转移、复发风险增大或治疗耐受性癌症的患者，可据此进一步选择免疫疗法、化疗和/或放疗。
另一方面，本发明提供方法，评估癌症患者对医疗处理的响应，所述方法包括以下步骤：将接受所述处理的个体的测试组织样品接触抗体，该抗体特异性结合选自H3K4me2、H3K9me2与H3K18ac的经修饰组蛋白；与所述处理前、或处理过程早期或后期、或改变处理之前与之后取自所述患者的组织样品相比，确定测试组织样品中选自H3K4me2、H3K9me2与H3K18ac的整体组蛋白修饰模式。在一些实施方式中，所述治疗是激素去除治疗或化疗或放疗或促凋亡治疗。
另一方面，本发明提供方法为癌症提供预后，通过将来自有患癌风险或已知患有癌症的个体的测试组织样品与抗体接触，该抗体特异性结合经修饰的组蛋白，并与对照组织样品比较，确定测试组织样品中整体组蛋白修饰模式；从而通过鉴定改变的组蛋白修饰模式为给定癌症提供预后。在一些实施方式中，所述组织样品是肿瘤活检样品，在一些实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。在优选实施方式中，所述个体处于患病较早期(即低级或早期)，该分类迫切需要预后标记。
另一方面，本发明提供包含至少两种抗体的试剂盒，所述抗体各自结合不同的组蛋白修饰，在一些实施方式中，所述抗体选自下组：H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化与H4R3双甲基化。在一些实施方式中，所述抗体标记有可检测部分，在一些实施方式中，所述试剂盒提供试剂，用于当所述抗体结合具有其所识别组蛋白修饰的组蛋白时检测该抗体。在其它实施方式中，所述试剂盒包括将组蛋白修饰模式改变与癌症转移或发展风险的提高或降低相关联的说明。在其它实施方式中，所述试剂盒还包含在用所述抗体的免疫组化方法中应用的试剂。
上述任一方面的进一步实施方式中，所述整体组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化中的一种或多种。在其更进一步实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。所述癌症可以是转移性癌症。
在上述任一方面的一些实施方式中，检测1种、2种、3种、4种或至少2种或3种不同组蛋白修饰的整体组蛋白修饰模式。在进一步实施方式中，所述至少两种不同组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化。在一些优选实施方式中，所述组蛋白修饰是H3K4双甲基化和H3K18乙酰化。在其它实施方式中，所述组蛋白选自H3和H4组蛋白中其一或两者的甲基化和乙酰化。在其它实施方式中，所述组蛋白选自H2A和H2B组蛋白中其一或两者的甲基化和乙酰化。所述组蛋白和个体优选为人类的。
在一些实施方式中，所述患有癌症或怀疑患有癌症的个体中，整体组蛋白修饰模式改变如下确定：(a)从部分对象中获得组织样品，其中所述部分具有或怀疑具有癌细胞；和(b)检测样品中1种、2种、3种、4种或更多整体组蛋白修饰，提供整体组蛋白修饰模式；以及(c)将所述组蛋白修饰模式与对象的对照或正常整体组蛋白修饰模式作比较，鉴定出已改变的整体组蛋白修饰模式。在进一步的这类实施方式中，利用特异性结合感兴趣组蛋白修饰的抗体检测所述整体组蛋白修饰。所述抗体可以是针对感兴趣组蛋白修饰模式的单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，所述方法还包含固定所述细胞并检测该固定细胞内整体组蛋白修饰的步骤。
在进一步的这类实施方式中，以及一般在上述任一方面中，所述免疫组化染色利用抗体特异性结合感兴趣的组蛋白修饰。所述抗体可以是针对感兴趣组蛋白修饰模式的单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体可标记有可检测标记(例如，放射性标记、酶标记、荧光标记、或化学发光标记或分子标签)。可通过放射自显影、荧光测定、发光测定或磷光成像分析检测结合于感兴趣组蛋白修饰的标记。在优选实施方式中，对样品中的多个单独固定细胞检测整体组蛋白修饰，对所述多个细胞确定各自的免疫组化染色强度和/或频率，从而根据在感兴趣区域上获得的染色强度确定细胞的频率分布。优选地，感兴趣区域集中在具有提示癌症的已改变表型的细胞处。所述区域可凭经验确定，根据具有最强染色(若修饰与癌症的风险、级别或发展正相关)样品的区域，或者若修饰与癌症的风险、级别或发展负相关则为最弱染色样品的区域。所述区域可以是足以有效测量感兴趣区域内染色模式的预定尺寸。可从各组织样品中取样并比较多个区域。
上述任一方面的一些实施方式中，所述组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化中的一种或多种。在其更进一步实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。所述癌症可以是转移性癌症。在一些实施方式中，判定组蛋白修饰为高或低水平修饰的界值如下：H3K9dime为约≥10％，H3K4me2为约＞60％或H3K18ac染色为约＞35百分位。
上述任一方面的一些实施方式中，检测至少2种或3种不同组蛋白修饰的整体组蛋白修饰模式，在进一步实施方式中，所述至少2种不同的组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化。在一些优选实施方式中，所述组蛋白修饰是H3K4双甲基化和H3K18乙酰化。在其它实施方式中，所述组蛋白选自H3和H4组蛋白中其一或两者的甲基化和乙酰化。所述组蛋白优选为人类的，在一些实施方式中，所选修饰是H3或H4的修饰。在一些进一步的实施方式中，所选修饰是H3或H4的甲基化和/或乙酰化。在其它实施方式中，所选修饰包含H3或H4的磷酸化或泛素化。在进一步实施方式中，所述至少两种不同组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4甲基化、H3K9甲基化和H4R3甲基化。鉴定整体组蛋白修饰模式能确定改变的整体组蛋白修饰，该改变具有诊断和预后价值。
在上述任一方面与实施方式的其它实施方式中，所述方法使用特异性结合感兴趣组蛋白修饰的抗体以检测所述修饰。所述抗体可以是针对感兴趣组蛋白修饰模式的单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，确定样品的多个整体组蛋白修饰模式。分析特定修饰所用组蛋白可首先从样品中分离，再使用流体介质中的免疫化学方法检测。
在一些实施方式中，经修饰组蛋白与组蛋白总水平的比例提供基于已改变的整体组蛋白修饰模式的预测性度量。例如，样品分析可采用检测修饰和未修饰形式组蛋白的抗体和选择性检测具感兴趣修饰组蛋白的抗体。确定两者在细胞群体或样品中的比例，并与正常细胞的比例作比较，建立已改变的整体组蛋白修饰的预测性比例，该比例可用于本发明所述方法。
在一些实施方式中，已改变的整体组蛋白修饰模式对于某癌症或肿瘤是否难于治疗或对治疗耐受有预测性，或者提供更好的预后(例如，存活的可能性提高(例如存活6个月、1年、2年、3年、4年、5年或更久)，或癌症复发可能性降低，或癌症转移可能性降低；或对包括但不限于5-FU的胸苷酸合酶抑制治疗有阳性响应的可能性)。
在上述任一方面的一些实施方式中，所述组织通过酶促、研磨或其它方式分解，通过采用本文所述抗体进行免疫荧光染色鉴定个体细胞的整体组蛋白修饰模式，然后用FACS分选和/或计分并对细胞计数，其可提供样品的整体组蛋白修饰频率的频率分布。这类方法中，还可采用其它荧光标记鉴定特定细胞或其表型以促进特定感兴趣细胞的分选和计数。
本发明涉及我们关于单独组蛋白修饰的整体水平变化与癌症的存在相关联的发现，且重要的是，该变化对临床结果有预测性(参见，WO2006/119264和对应于2008年5月29日所提交美国专利申请序列号11/912,429的美国专利申请公开号US20080248039，这些申请的受让人与本申请相同，其内容通过引用全文纳入本文)。通过主要前列腺切除样品的免疫组化染色，确定组蛋白H3与H4中5个残基组蛋白乙酰化(Ac)和双甲基化(diMe)染色的细胞百分数。将具有相似修饰模式的样品分组从低级前列腺癌患者中鉴定出具有不同肿瘤复发风险的两种疾病亚型。这些组蛋白修饰模式是独立于肿瘤分期、术前前列腺特异性抗原(PSA)水平与包膜侵犯的预测指标。因此，特定组蛋白修饰的广泛变化代表前列腺癌中的新型分子异质性，并构成癌症患者所示广泛临床现象的基础。在后续工作中，所述标记被进一步鉴定为肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌和其它癌症以及前列腺癌的有用标记。
该证据表明癌细胞的主体或整体组蛋白修饰的变化对临床结果有预测性。此类变化的机制目前尚未明确，但可能与不同组蛋白修饰酶的表达和/或整体活性的改变有关。已证明在2种或多种联用时，这些变化对于患者的癌症复发风险特别有预示性，尤其是对于患有低级前列腺癌的患者。考虑到组蛋白的大量修饰，其它修饰位点的整体模式信息将有助于进一步对包括高病级在内的所有患者作分类。免疫组化的使用加上有大量抗体可用于探测组蛋白修饰，有助于此方法应用于其它肿瘤和其它组蛋白修饰模式。
因此，本发明一方面提供癌症诊断方法，将来自有患癌风险或怀疑患有癌症个体的测试组织样品与抗体接触，所述抗体特异性结合经修饰的组蛋白；并与对照组织样品比较，确定测试组织样品中的整体组蛋白修饰模式；从而通过鉴定出改变的整体组蛋白修饰模式来诊断所述癌症。在一些实施方式中，所述组织样品是肿瘤活检样品。在一些实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。在优选实施方式中，所述个体处于患病较早期(即低级或早期)，该分类迫切需要诊断标记。所述整体组蛋白修饰模式可根据标准免疫组化方法评分。
另一方面，本发明提供治疗患有低级或早期癌症的个体的方法，通过确定所述个体是否患有低级癌症，并将所述个体的测试组织样品与抗体接触，该抗体特异性结合经修饰组蛋白；并与对照组织样品比较确定所述测试组织样品中整体组蛋白修饰模式，整体组蛋白修饰模式表明所述癌症可能发展或转移时，给予患者更具攻击性的癌症疗法。可以在确定组蛋白修饰模式之前或之后确定癌症分级或分期。
在其它实施方式中，本发明提供方法，根据在手术去除癌组织(如前列腺切除)之前、期间或之后而另一癌症治疗之前、期间或之后所得患者组织样品中整体组蛋白修饰模式的改变，将患者靶向更攻击性的或替代癌症疗法，或者提高癌症复发监控。可如本文所述确定所述整体组蛋白修饰模式的改变。例如，所述癌症可以是前列腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或肝癌。在优选实施方式中，所述癌症是前列腺或膀胱癌。鉴定为具有与转移、复发风险增大或治疗耐受性癌症相关的整体组蛋白修饰模式改变的的患者，可据此进一步选择用外源或内源激素去除处理，可选补充有化疗和/或放疗。在前列腺癌的情况中，所述激素去除为雄激素去除(例如，用非那雄胺和其它抗睾酮或抗DHT剂处理)。
另一方面，本发明提供方法评估癌症患者对医疗处理的响应，所述方法包括以下步骤：将接受所述处理的个体的测试组织样品接触抗体，该抗体特异性结合经修饰组蛋白；与所述处理前、或处理过程早期或后期、或改变处理之前与之后取自所述患者的组织样品相比，确定测试组织样品中整体组蛋白修饰模式，在一些实施方式中，所述治疗是激素去除疗法或化疗或放疗或促凋亡治疗。
另一方面，本发明提供癌症预后方法，将来自有患癌风险或已知患有癌症个体的测试组织样品与抗体接触，所述抗体特异性结合经修饰的组蛋白；与对照组织样品比较，确定测试组织样品中的整体组蛋白修饰模式；从而通过鉴定出改变的整体组蛋白修饰模式来提供所述癌症的预后。在一些实施方式中，所述组织样品是肿瘤活检样品。在一些实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。在优选实施方式中，所述个体处于患病较早期(即低级或早期)，该分类迫切需要预后标记。
另一方面，本发明提供包含至少两种抗体的试剂盒，所述抗体各自结合不同的组蛋白修饰。在一些实施方式中，所述抗体选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化。在一些实施方式中，所述抗体标记有可检测部分。在一些实施方式中，所述试剂盒提供试剂，用于当所述抗体结合具有其所识别组蛋白修饰的组蛋白时检测该抗体。在其它实施方式中，所述试剂盒包括将组蛋白修饰模式改变与癌症转移或发展风险的提高或降低相关联的说明。在其它实施方式中，所述试剂盒还包含在用所述抗体的免疫组化方法中应用的试剂。
上述任一方面的进一步实施方式中，所述整体组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化中的一种或多种。在其更进一步实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。癌症可以是转移性癌症。
在上述任一方面的一些实施方式中，检测1种、2种、3种、4种或至少2种或3种不同组蛋白修饰的整体组蛋白修饰模式。在进一步实施方式中，所述至少两种不同组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化。在一些优选实施方式中，所述组蛋白修饰是H3K4双甲基化和H3K18乙酰化。在其它实施方式中，所述组蛋白选自H3和H4组蛋白中其一或两者的甲基化和乙酰化。在其它实施方式中，所述组蛋白选自H2A和H2B组蛋白中其一或两者的甲基化和乙酰化。所述组蛋白和个体优选为人类的。
在一些实施方式中，所述患有癌症或怀疑患有癌症的个体中，整体组蛋白修饰模式改变如下确定：(a)从部分对象中获得组织样品，其中所述部分具有或怀疑具有癌细胞；和(b)检测样品中1种、2种、3种、4种或更多整体组蛋白修饰，提供整体组蛋白修饰模式；以及(c)将所述组蛋白修饰模式与对象的对照或正常整体组蛋白修饰模式作比较，鉴定出已改变的整体组蛋白修饰模式。在进一步的这类实施方式中，利用特异性结合感兴趣组蛋白修饰的抗体检测所述整体组蛋白修饰。所述抗体可以是针对感兴趣组蛋白修饰模式的单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，所述方法还包含固定所述细胞并检测固定细胞内的整体组蛋白修饰的步骤。
在进一步的这类实施方式中，以及一般在上述任一方面中，所述免疫组化染色利用抗体特异性结合感兴趣的组蛋白修饰。所述抗体可以是针对感兴趣组蛋白修饰模式的单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体可标记有可检测标记(例如，放射性标记、酶标记、荧光标记、或化学发光标记或分子标签)。可通过放射自显影、荧光测定、发光测定或磷光成像分析检测结合于感兴趣组蛋白修饰的标记。在优选实施方式中，对样品中的多个单独固定细胞检测整体组蛋白修饰，对所述多个细胞确定各自的免疫组化染色强度和/或频率，从而根据在感兴趣区域上获得的染色强度确定细胞的频率分布。优选地，感兴趣区域集中在具有提示癌症的已改变表型的细胞处。所述区域可凭经验确定，根据具有最强染色(若修饰与癌症的风险、级别或发展正相关)样品的区域，或者若修饰与癌症的风险、级别或发展负相关则为最弱染色样品的区域。所述区域可以是足以有效测量感兴趣区域内染色模式的预定尺寸。可从各组织样品中取样并比较多个区域。
上述任一方面的一些实施方式中，所述整体组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化中的一种或多种。在其更进一步实施方式中，所述癌症或肿瘤是前列腺、膀胱、肾、结肠或乳腺癌。所述癌症可以是转移性癌症。
在上述任一方面的一些实施方式中，检测至少2种或3种不同组蛋白修饰的整体组蛋白修饰模式。在进一步实施方式中，所述至少两种不同组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和H4R3双甲基化。在一些优选实施方式中，所述组蛋白修饰是H3K4双甲基化和H3K18乙酰化。在其它实施方式中，所述组蛋白选自H3和H4组蛋白中其一或两者的甲基化和乙酰化。所述组蛋白和个体优选为人类的。在一些实施方式中，所选修饰是H3或H4的修饰。在一些进一步实施方式中，所选修饰是H3或H4的甲基化和/或乙酰化。在其它实施方式中，所选修饰包含H3或H4的磷酸化或泛素化。在进一步实施方式中，所述至少两种不同组蛋白修饰选自H3K9乙酰化、H3K18乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4甲基化、H3K9甲基化和H4R3甲基化。鉴定整体组蛋白修饰模式能确定改变的整体组蛋白修饰，该改变具有诊断和预后价值。
在一些实施方式中，用于分析的组蛋白修饰根据它们经改变的组蛋白修饰模式对癌症严重性、分级或发展可能性的预测能力进行选择。在一些实施方式中，待分析的组蛋白修饰是其组蛋白修饰模式本身，或与第二、第三或第四组蛋白修饰模式联合，能提供至少为1.5、2、3、4或5倍或更高，或者为1.5-3倍或1.5-4倍或2-5倍的相对风险，所述风险是癌症的更严重结果或分级、或转移或对胸苷酸合酶治疗无响应的可能性增加的风险。
在上述任一方面与实施方式的其它实施方式中，所述方法使用特异性结合感兴趣组蛋白修饰的抗体以检测所述修饰。所述抗体可以是针对感兴趣组蛋白修饰模式的单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，确定样品的多个整体组蛋白修饰模式。分析特定修饰所用组蛋白可首先从样品中分离，再利用流体介质中的免疫化学方法检测。
在一些实施方式中，经修饰组蛋白与组蛋白总水平的比例提供基于已改变的整体组蛋白修饰模式的预测性度量。例如，样品分析可采用检测修饰和未修饰形式组蛋白的抗体和选择性检测具感兴趣修饰组蛋白的抗体。确定两者在细胞群体或样品中的比例，并与正常细胞的比例作比较，建立已改变整体组蛋白修饰的预测性比例，该比例可用于本发明所述方法。
在一些实施方式中，所述改变的整体组蛋白修饰模式对某癌症或肿瘤是否难于处理或者是治疗耐受有预测性。
在上述任一方面的一些实施方式中，K4双甲基化染色值等于或大于约60百分位的癌症患者适用组蛋白规则，这些患者比染色值低于该水平的患者有更好的预后。在一些其它实施方式中，K18乙酰化和K4双甲基化染色值各自等于或大于约35百分位的癌症患者比染色值低于该水平的患者具有更好的预后。
在上述任一方面的一些实施方式中，所述组织是血液，并确定血细胞经改变的组蛋白修饰模式在一些实施方式中，所述样品来自患有白血病或淋巴瘤的患者，所述已改变的组蛋白修饰模式包括白血病或淋巴瘤细胞的模式。所述整体组蛋白修饰模式的检测可采用细胞免疫荧光染色，然后用FACS分选和/或评分并对细胞计数。这些方法能提供样品中感兴趣细胞的整体组蛋白修饰频率的频率分布。这类方法中，还可采用其它荧光标记鉴定特定细胞或其表型以促进白血病或淋巴瘤细胞的分选和计数。
在上述任一方面的一些实施方式中，所述组织通过酶促、研磨或其它方式分解，通过采用本文所述抗体进行免疫荧光染色鉴定个体细胞的整体组蛋白修饰模式，然后用FACS分选和/或计分并对细胞计数，提供样品的整体组蛋白修饰频率的频率分布。这类方法中，还可采用其它荧光标记鉴定特定细胞或其表型以促进特定感兴趣细胞的分选和计数。
在一些实施方式中，根据按细胞染色的中位百分数指定的百分秩次值(分位数)将所述修饰的分析相对于TMA数据集进行评估，用SAS系统RANK程序，采用TIES＝LOW选项，该选项对等值数据取相应秩次的最低值。然后，各肿瘤可根据其百分秩次分到低水平或高水平染色组，包括H3K4me2(百分秩次＜60相对≥60)、H3K9me2(RTOG TMA百分秩次＜30相对≥30或UCLA I/II期TMA百分秩次＜25相对≥25)与H3K18ac(百分秩次＜35相对≥35)(H3K9ac≥10％)或者在这些数值的0.8-1.2、0.9-1.1或0.95-1.05倍范围内。应当理解细胞染色百分数会受所用染色方法影响。因此，在本发明的一些实施方式中，若百分数通过相同方法获得，将等同于本文所得数值。
一种预测患者对胸腺酸合酶抑制剂的响应或为选择癌症疗法的方法，包括以下步骤：(a)将来自有患癌风险或已知患有癌症个体的测试组织样品与特异性结合经修饰组蛋白的抗体或其免疫活性片段或适体接触；以及(b)确定H3K4双甲基化、H3K9双甲基化和/或H3K18乙酰化整体组蛋白修饰模式。在一些实施方式中，所述组织样品是胰腺、前列腺、膀胱、肾、卵巢、结肠或乳腺癌的肿瘤活检样品。然后，各肿瘤可根据其百分秩次分到低水平或高水平染色组，包括H3K4me2(百分秩次约＜60相对≥60)、H3K9me2(百分秩次约＜30或25相对≥30或≥25)与H3K18ac(百分秩次约＜35相对≥35)或者在这些数值的0.8-1.2、0.9-1.1或0.95-1.05倍范围内。应当理解细胞染色百分数会受所用染色方法影响。因此，在本发明的一些实施方式中，若百分数通过相同方法获得，将等同于本文所得数值。
定义
除非另有说明，本说明书和权利要求书中所用下列术语具有下文给定含义。应注意到，本说明书和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非另有明确说明。
在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通用三字母符号或单字母符号表示。
“整体组蛋白修饰”指组蛋白修饰模式，其不限于启动子区域且还涵盖包括非启动子区在内的染色质较大区域。整体组蛋白修饰模式可用本领域已知的任何方式确定，包括采用能结合感兴趣组蛋白修饰的抗体、适体及抗体的免疫活性片段的免疫学方法和类似方法。免疫组化和免疫细胞学方法可用于检测经修饰的组蛋白或染色细胞以确立整体组蛋白修饰模式及对所述修饰细胞染色的百分数。也可使用质谱和电化学方法。可使用包括不基于抗体的方法在内能测量整体组蛋白修饰的所有可能方法，当染色组织的组蛋白标记使某些与染色组蛋白标记染色模式关联的形态或表型模式引起注意时，可将为检测可识别外遗传模式提供的软件程序纳入所述方法。在一些情况中，对于单一标记如H3k9me2，可将10％＞＝用作界值，评分低于该值表示预后差，可考虑用二分方式。通常，百分数界值包括用另一方法所确定或测得它们的对等值。在优选实施方式中，确立所述界值，划分出相对存活率、预后或对治疗的响应性差异显著的组。例如，可以为6个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或更久的存活期选择界值使所提供的存活相对可能性差异，或响应治疗的存活率差异为至少20％、30％、40、50％、60％。
“组蛋白”指染色体中结合DNA的结构蛋白。组蛋白具有高比例的带正电氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸，其有助于结合DNA。五类主要组蛋白分成两大组：核小体组蛋白H2A、H2B、H3、H4；和H1组蛋白。“经修饰组蛋白”指组蛋白具有一种或多种以下化学修饰，其包括但不限于赖氨酸乙酰化、赖氨酸甲基化(单-、双-和三甲基化)、赖氨酸泛素化、精氨酸甲基化(单-、双-、对称和不对称甲基化)、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化。
关于氨基酸序列，组蛋白H3包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示蛋白质(参见Swiss Prot登录号：Q93081(其全部自身序列通过引用纳入本文)，其天然产生的变体包括但不限于，由其经修饰的组蛋白，以及与其基本一致的蛋白质，特别是缺失上述序列位置1处的N末端甲硫氨酸残基的蛋白质(例如，翻译后缺失所述N末端甲硫氨酸残基)。经修饰的组蛋白是本领域熟知的。例如，适当的组蛋白修饰可包括但不限于以下所列的一种或多种。下面列出可能根据本发明应用的示例性蛋白质修饰。
Figure BPA00001480064400211
Figure BPA00001480064400221
上表中，″Me″指甲基化修饰，″Ac″指乙酰化修饰，″P″或″phos″指磷酸化修饰，″Ub″指泛素化。标明Me时，可以是单、双或三甲基化。对特定蛋白质残基列出两种修饰时，这两种修饰可以是替换修饰。
表中的残基位置是将SEQ ID No：1-6中的位置按照没有N末端甲硫氨酸重新编号(即，SEQ ID No：1-6中的残基位置号减1)。在优选实施方式中，待检测SEQ ID NO：1-6的组蛋白缺少N末端甲硫氨酸残基。
如本发明所述使用的组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括但不限于，伏立诺他(vorinostat)、FK228、PXD1O1、PCI-24781、ITF2357、MGCD0103、MS-275、丙戊酸和LBH589(参见Tan等，Journal of Hematology & Oncology 2010，3：5)。因此，所述抑制剂可以是(a)有机异羟肟酸(例如，曲古抑菌素A(TSA)和辛二酰苯胺双异羟肟(SAHA))，(b)短链脂肪酸(例如丁酸和丙戊酸(VPA))，(c)苯甲酰胺(例如，MS-275)，(d)环形四肽(例如，曲泼素(trapoxin))和(e)氨磺酰苯胺。试剂包括LBH589(帕比司他(panobinostat))，PCI24781(CRA-024781)，LAQ824I、II，PXD101(贝林司他(belinostat))，ITF2357，SB939，JNJ-16241199(R306465)，间-羧基肉桂酸双异羟肟(CBHA)，Scriptaid，Oxamflatin，Pyroxamide，含肽环化异羟肟酸(CHAP)，AN-9，OSU-HD AC42，苯甲酰胺MS-275(恩替司他(entinostat))，MGCDO103，庚二酸二苯基胺，M344，N-乙酰基地那林(CI-994)，环形四肽Apicidine，曲泼素，HC-毒素，厚膜素(Chlamydocin)，酯肽(FR901228或FK228)(迪司肽(romidepsin))，氨磺酰苯胺，N-2-氨基苯基-3-[4-(4-甲基苯磺酰基氨基)-苯基]-2-丙烯酰胺，Depudecin，NDH-51和KD5150。
″免疫组织化学″指用抗体或适体检测生物样品如细胞和组织切片中的蛋白质。例如，本发明中的检测方法可使用本领域已知的标准免疫组织化学技术进行(综述于牛津大学出版社2000年版Gosling，Immunoassays：APractical Approach《免疫测试：实践方法》))。通过用例如放射性同位素、荧光标记、酶或本领域已知的任何其它可检测标记来标记第一抗体或第二抗体而实现检测。本领域熟知通过染色强度对组织切片的视觉分级。本领域技术人员常规使用来自肿瘤和健康组织样品的标准对照以控制样品与试剂间的差异。此外，不含特异于所需靶标(即组蛋白)的第一抗体的阴性对照通常用作对照。Van Diest等，Anal.Quant.Cytol.Histol.18(5)：351-4(1996)公开了仅需数分钟培训，即使是无经验观测者也能基于免疫组织化学染色强度将乳腺肿瘤切片可重复地分级为0-4级。因此，本领域技术人员能根据等级(例如，0-4级或其它)、根据染色百分数、或根据阳性或阴性的简单确定进行样品分级。免疫组织化学染色方法的示例见说明书。在一些实施方式中，组织样品细胞染色发生指定百分数或程度的频率对于各修饰是确定的。本领域普通技术人员了解用来自肿瘤与健康组织样品的标准对照来控制样品与试剂间的差异。此外，在提交本申请时，不含特异于所需靶标的第一抗体的阴性对照可常规用于控制背景。免疫组织化学评分的方法也为本领域熟知。在一些实施方式中，免疫组织化学评分在0-4或1-4级之间。例如，Van Diest等，Anal.Quant.Cytol.Histol.18(5)：351-4(1996)公开了仅需数分钟培训，即使是无经验观测者也能基于免疫组织化学染色强度将乳腺肿瘤切片可重复地分级为0-4级。普通技术人员知道如何调整方法用适体取代抗体。
″标记″或″可检测部分″是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记包括32P、荧光染料、电子密集试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、或半抗原与蛋白质，所述半抗原或蛋白质通过在肽内掺入放射性标记从而可以检测或用于检测与所述肽特异性反应的抗体。可采用本领域熟知的常规方法将标记与生物识别分子或结合这些分子的探针直接结合。本领域已知多重标记方案，这些方案允许同时进行多种结合测试。不同的标记可以是放射性、酶促、化学发光、荧光、量子点或其它。本领域普通技术人员熟知将标记与抗体共价或非共价结合的方法。本领域普通技术人员也熟知用带标记抗体检测蛋白质与经修饰蛋白质的方法。
″癌″指人的癌和癌症、肉瘤、腺癌、淋巴癌、白血病等，包括但不限于实体瘤和淋巴癌，肾、乳腺、肺、肾、膀胱、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、胃、脑、头颈、皮肤、子宫、睾丸、食道和肝癌，淋巴癌包括但不限于非霍奇金和霍奇金淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。在优选实施方式中，癌症是腺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌或肾癌。特定类型的癌症包括可如本发明所述评估其预后和5-FU响应性的原发或继发性恶性肿瘤，包括但不限于骨癌、喉癌、胆囊、直肠、头颈、支气管、基底细胞癌、溃疡性与乳头状鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞肿瘤、小细胞肺癌、胰岛细胞肿瘤、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴与粒细胞肿瘤、毛发细胞肿瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、宫颈癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、成骨和其他肉瘤、肾细胞肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、恶性黑色素瘤、人表皮样癌。
5-FU治疗包括但不限于用5-FU和5-FU的前药及使用5-FU及其前药的联合疗法(例如，联用甲酰四氢叶酸)。
“生物样品”包括组织切片，例如活检或尸检样品，以及为组织学目的获取的冰冻切片。组织、培养的细胞如原代培养、外植体和转化细胞。在一种实施方式中，生物样品为免疫组织化学制备的组织样品。在另一实施方式中，生物样品是制备为高通量筛选所用组织微阵列(TMA)的组织样品。生物样品通常获自真核生物体，更优选人或哺乳动物，例如灵长动物，如黑猩猩；牛；犬；猫；啮齿动物如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟类；爬行动物；或鱼类。
″活检″指为诊断或预后评估取出组织样品的过程，和所述组织样品本身。可将本领域已知的任何活检技术用于本发明的诊断和预后方法。所用活检技术取决于待评估的组织类型、肿瘤的尺寸和类型等因素。代表性活检技术包括切除式活检、切入式活检、针吸活检、手术活检与骨髓活检。″切除式活检″指切除全部肿瘤体与围绕肿瘤的少量边缘正常组织。″切入式活检″指切除一块包含肿瘤截面直径的组织。内窥镜或荧光镜所作诊断或预后可要求肿瘤体的″核针活检″或通常从肿瘤体内获得细胞悬液的″细针吸出活检″。例如，在Kasper等编著的Harrison′s Principles of Internal Medicine(《哈里森内科学原理》)，第16版，2005年，第70章和第五部分中讨论了活检技术。
″抗体″指含能特异性结合并识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们分别依次定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区对结合的特异性和亲和力最关键。
示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单位包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。各链的N末端确定约100-110个或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。
例如，抗体以完整的免疫球蛋白形式或用不同肽酶消化而产生的许多研究透彻的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在绞链区二硫连接以下消化抗体产生F(ab′)2，F(ab′)2是Fab二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可在温和条件下还原F(ab′)2以打断铰链区中的二硫连接，从而将F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体主要是带部分绞链区的Fab(参见Fundamental Immunology(《基础免疫学》，Paul编，第3版，1993年)。虽然根据完整抗体的消化定义了不同抗体片段，但是本领域技术人员应理解，也可用化学方法或通过重组DNA方法从头合成这些片段。因此，本文中所用的术语抗体也包括通过全抗体修饰、或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。
可采用本领域已知的许多技术制备抗体如重组、单克隆或多克隆抗体(参见例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(《单克隆抗体与癌症治疗》)第77-96页，ARL有限公司(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(《最新免疫学实验方法》)(1991)；Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(1988)；和Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(《单克隆抗体：原理与实践》)(第2版，1986年))。可从细胞克隆出编码感兴趣抗体重链和轻链的基因，例如可从杂交瘤克隆出编码单克隆抗体的基因并用于生产重组单克隆抗体。也可从杂交瘤或浆细胞制得编码单克隆抗体重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合产生大量具有不同抗原特异性的抗体(参见例如Kuby，Immunology(《免疫学》)(第3版，1997年)。可调整单链抗体或重组抗体的生产技术(美国专利4,946,778、美国专利号4,816,567)用于生产本发明多肽的抗体。转基因小鼠或其它生物体如其它哺乳动物也可用于表达人源化或人抗体(参见例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；和Lonberg与Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。或者，噬菌体展示技术可用来鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚体Fab片段(参见例如，McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10：779-783(1992))。抗体也可制成双特异性的，即能识别两种不同抗原(参见例如，WO 93/08829，Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)和Suresh等，Methods in Enzymology 121：210(1986))。抗体也可以是异源偶联物，例如，两种共价结合的抗体或免疫毒素(参见例如，美国专利号4,676,980，WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。
本领域熟知人源化或灵长源化非人抗体的方法。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为输入残基，它们一般取自输入可变区。人源化可基本按照Winter及其同事的方法进行(参见例如Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))，用相应的人抗体序列取代啮齿类的CDR或CDR序列。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代。实践中，人源化抗体一般是一些CDR残基且可能是一些FR残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。
″嵌合抗体″是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换使其抗原结合位点(可变区)结合于类型、效应功能和/或种类有所不同或已改变的恒定区，或结合于赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或是(b)用具有不同或已改变抗原特异性的可变区改变、替换或交换所述可变区或其部分。
患者耐受5-FU或胸苷酸合酶抑制剂或根据其整体组蛋白修饰模式预期存活较差时，采用的治疗包括影响dhfr途径的要求、激素疗法、免疫疗法、RNAi疗法、放射疗法、营养疗法、″冥想″疗法，影响细胞能量代谢的任何一般疗法和/或有助于使组蛋白修饰整体模式从低水平修饰向较高水平修饰转变的药物，发明人认为这可能是对影响细胞组蛋白修饰水平由低到高转变的任何药物的响应预测的全方位描述。
组蛋白修饰模式表明不太可能响应5-FU或另一胸苷酸合酶抑制剂的患者可以用5-FU或胸苷酸合酶抑制剂的补充或替代疗法进行治疗，包括但不限于用另一化疗剂、免疫疗法、放射疗法、反义疗法、RNAi疗法、激素疗法、影响dhfr途径的药物和抗代谢疗法(例如，叶酸抑制剂，氨甲喋呤)、紫杉烷(例如，紫杉醇、泰素)、紫杉醇纳米制剂(Abraxane)、激酶抑制剂特别是c-met、MEK、Apo2L/TRAIL、EGFR(EGFR内部和外部结构域的抑制剂)的抑制剂、抗VEGF疗法和抗IGF1R与IGF2R疗法，此外，可以施用营养疗法或影响细胞能量代谢的任何一般疗法和/或有助于组蛋白修饰的整体模式从低水平修饰向较高水平修饰转变的药物。整体组蛋白修饰表明预后将比较差的对象也可施用更攻击性的治疗，包括上述疗法中的任一种或其组合。
在一种实施方式中，抗体与″效应″部分偶联。所述效应部分可以是任意数量的分子，包括但不限于标记部分例如放射性标记或荧光标记，或可以是治疗部分。在一个方面，抗体调节蛋白质的活性。
涉及蛋白质或肽时，术语″特异性(或选择性)结合″抗体或″特异性(或选择性)与……免疫反应″指能在蛋白质和其它生物物质的异质群体中确定是否存在蛋白质的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，指定抗体与特定蛋白质的结合至少为背景的两倍，更典型地是背景的10-100倍以上。在这些条件下与抗体特异性结合需要选择对特定蛋白质特异性的抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与选定抗原特异性免疫反应而不与其它蛋白质反应的那些多克隆抗体。可通过消减与其它分子交叉反应的抗体来实现该选择。可利用各种免疫试验形式选择能与特定蛋白质特异性免疫反应的化合物。例如，常规采用固相ELISA免疫试验选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(例如参见，Harlow和Lane，Using Antibodies，A LaboratoryManual(《使用抗体：实验手册》)(1998)中对可用于确定特异性免疫反应性的免疫试验形式和条件的描述)。
在两种或多种核酸或多肽分子序列中，术语“相同”或“相同性”百分数指，采用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文所述默认参数、或通过手工比对或目测检查所确定的，两个或多个序列或子序列在指定区域相同或其中有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即，比较和比对比较窗口或指定区域上的最大对应性时，相同性约60％，优选相同性为65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)(参见例如，NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。然后，可称这些序列“基本相同”。该定义也指，或可应用于，测试序列的互补序列。该定义还包括含缺失和/或添加的序列，以及含取代的序列。如下文所述，优选的算法可考虑缺口等。优选在长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性，或者更优选在长度50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性。
对于序列比较，一般将一个序列用作参比序列，将测试序列与之相比。使用序列比较算法时，测试和参比序列均输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。优选可使用默认的程序参数，或者可指定另外的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。
本文所用的“比较窗口”包括参考选自20-600，通常约50-200，更常见约100-150数量的毗连位置的区段，对两个序列进行最优比对后，可将该区段的序列与相同数量的毗连位置的参比序列作比较。比对序列的比较方法是本领域熟知的。可通过，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)，通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI)科学大道575号)，或通过手工比对和目测(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(Ausubel等编，1995增刊))进行最优序列比对以便比较。
适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选例子分别是BLAST和BLAST 2.0算法，其描述参见Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。使用BLAST和BLAST 2.0，设定本文所述的参数，以确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得(http://ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。只要可提高累积比对评分，该字命中在沿各序列的两个方向上延伸。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到各序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。
本文中互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即结合于氢、羧基、氨基和R基的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但与天然产生的氨基酸的基本化学结构保持相同。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构，但作用方式类似于天然产生的氨基酸的化学化合物。
实施例
提供以下实施例，以说明而非限制要求保护的本发明。
实施例1.三种组蛋白修饰在胰腺癌中的预后与预测价值。
方法：检测了两个大型胰腺癌患者组的组织微阵列(TMA)，包括RTOG9704的195例患者组，该多中心III期随机治疗实验比较辅助吉西他滨与5-氟尿嘧啶(5-FU)，和UCLA医学中心含140例患者的I期和II期癌症组。进行了三种组蛋白修饰(H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac)的免疫组织化学。用组蛋白修饰的阳性肿瘤细胞染色将患者分入低染色和高染色组，该分组与临床病理参数和临床结果度量有关。
结果：在单变量和多变量模型中，低细胞水平H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac各是存活率差的重要和独立的预测因子，在UCLA I/II期TMA组中，H3K4me2和/或H3K18ac的低水平组合预测最差的总体存活率(危险比例[HR]，2.54；95％置信区间[CI]，1.53-4.22；P＝0.0003)。亚组分析中，组蛋白水平在RTOG 9704组内仅对淋巴结阴性癌症患者或接受辅助5-FU而不接受吉西他滨的患者的存活率有预测性。
胰腺癌患者及组织微阵列。RTOG 9704胰腺癌组织微阵列(TMA)由获自参与RTOG 9704患者的229例胰腺癌组成，该III期随机术后辅助治疗实验在化放疗之前和之后比较5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(Regine等，Jama 299：1019-26(2008))。在RTOG 9704中，所有患者在化放疗前1个月到化放疗后3个月的时间段内接受辅助化疗(5-FU或吉西他滨)，所述放化疗包括5-FU输注作为放射致敏剂。在患者征集中，采集临床病理因子，以及治疗方案和包括毒性、总体存活率和无病存活在内的后续临床信息。UCLA I/II期胰腺癌TMA由UCLA病理学与实验医学系存档的140例AJCCI或II期胰腺癌组成，代表了1987-2005年间在UCLA医学中心进行肿瘤完全性切除的患者。所有工作均在有关机构审查委员会批准下进行。
免疫组织化学。使用DAKO Envision系统(加州卡朋特里亚(Carpenteria，CA))对所有抗体采用标准2步间接IHC染色法，如前人所述(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009))。兔抗组蛋白第一多克隆抗体在室温下应用60分钟，包括1∶800使用的H3K9me2(密理博公司上州公司(Upstate/Millipore)，马萨诸塞州比莱瑞卡(Billerica，MA))、1∶200使用的H3K18ac(上州公司)和1∶800使用的H3K4me2(Abcam公司，马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA))。以同一方式不用第一抗体进行对照染色。对具有阳性核染色的肿瘤细胞百分数(0-100％范围)的半定量评估由三个病理学家(D.D.，N.D.或A.M.)中的两个独立进行，这些病理学家对所有临床病理和结果参数均不了解。对各患者肿瘤，3个代表性的0.6mm核心(RTOG 9704TMA)或2个代表性的1.0mm直径核心(UCLA I/II期TMA)作评分并用来计算细胞染色的中值百分数，包括两个病理学家的所有评分。
统计分析。已显示特定组蛋白界值预测多种癌症患者的子集中的存活率，所述癌症包括前列腺、肺和肾癌(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009)；Seligson等，Nature 435：1262-6(2005))。为了在两种胰腺癌TMA中标准化并应用相同的界值，根据细胞染色的中位百分数指定各肿瘤相对其TMA数据集的百分秩次值(分位数)，用SAS系统RANK程序采用TIES＝LOW选项，该选项对等值数据取相应秩次的最低值。将各肿瘤根据其百分秩次分入低水平或高水平染色组，包括H3K4me2(百分秩次＜60相对≥60)、H3K9me2(对于RTOG TMA百分秩次＜30相对≥30或对于UCLAI/II期TMA百分秩次＜25相对≥25)与H3K18ac(百分秩次＜35相对≥35)。产生存活评估并用卡普兰-迈耶法呈现，对数秩检验比较存活曲线。采用多变量Cox比例风险模型检验多个预测因子的统计学独立性和显著性。计量随机日期(RTOG 9704 TMA)或手术日期(UCLA I/II期TMA)到因任何原因死亡或最后一次随访的日期之间总体存活时间。仅对RTOG 9704确定从随机日期到首次破坏无病事件的日期之间的无病生存时间，所述事件定义为局部或区域性疾病复发、远距离疾病、第二原发癌或任何原因导致的死亡。
胰腺癌TMA中的细胞组蛋白修饰水平。在两种不同胰腺癌TMA中，通过使用经修饰组蛋白残基的特异性抗体的免疫组织化学检测H3K4me2、H3K9me2与H3K18ac的细胞水平。所检测的第一种TMA由征入RTOG9704的患者组成，RTOG 9704是III期多中心随机带对照实验，比较吉西他滨相对氟尿嘧啶辅助化疗联合胰腺癌全切除后的氟尿嘧啶化放疗(Regine等，Jama 299：1019-26(2008))。TMA中初始229个未治疗的切除肿瘤中，195个具有用于免疫组织化学评估的诊断学肿瘤，包括氟尿嘧啶治疗组的103位患者和吉西他滨治疗组的91位(或对H3K9me2而言为92位)患者。第二种TMA由在UCLA医学中心接受完全手术切除的140位AJCC I或II期胰腺癌患者组成。图1显示3种组蛋白修饰中每一种的代表性染色。没有核染色表明给定细胞中的总体降低，从而评估该组蛋白修饰的细胞异质性。对3种组蛋白修饰中的每一种，肿瘤细胞染色的百分数范围为0-100％，其中H3K4me2与H3K18ac倾向细胞染色百分数总体较高，而H3K9me2倾向细胞染色百分数总体较低(图1)。
在前列腺癌、肺癌和肾癌上的先前工作鉴定并证实了″组蛋白规则″，这是一种根据各组蛋白修饰染色的百分秩次将患者分成高风险和低风险组的分类指标(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009)；Seligson等，Nature 435：1262-6(2005))(这些工作对此规则的公开通过引用具体纳入本文)。对两种胰腺癌TMA中的每一种，我们采用这一相同的组蛋白规则将患者分入低染色或高染色组。也采用2种或多种组蛋白修饰的组合进行患者分组。在RTOG 9704 TMA中，基线临床病理学参数与组蛋白分组状态之间未发现统计学显著关联，尽管低H3K4me2和淋巴结阴性状态(NO)趋近统计学显著性(p＝0.051，X2检验；数据未显示)。类似地，在UCLA I/II期TMA中，除了低H3K4me2与低病理学T期之间的高度显著关联(p＝0.007，X2检验；数据未显示)以外，基线参数和组蛋白分组之间未发现显著关联。尽管在两种TMA中，低H3K4me2都与预后较差相关联(见下文)，自相矛盾的是，N0状态(RTOG 9704TMA)或低病理学T期(UCLA I/II期TMA)与预后较好相关联。这些数据表明患者组蛋白分组独立于预测临床结果的既定病理学分级参数。
组蛋白修饰水平预测胰腺癌存活率。在RTOG 9704 TMA中，经多变量风险分析，低H3K4me2(百分秩次＜60)或低H3K9me2(百分秩次＜30)是较差总体存活和无病存活的显著且独立的预测因子，而低H3K18ac(百分秩次＜35)是较差无病存活的显著预测因子并趋向于较差总体存活(表1)。卡普兰-迈耶存活曲线显示低水平H3K4me2或H3K9me2与较差总体存活之间的显著关联(数据未显示)。也可采用2种或多种组蛋白修饰的组合对患者分组，其中低水平组合的组蛋白组再次成为较差总体存活和无病存活的显著和独立的预测因子(表1)。这些数据表明，细胞组蛋白修饰水平是RTOG9704胰腺癌组中有力的预后标记。
为了独立地验证RTOG 9704TMA中的结果，单独检测UCLA I/II期胰腺癌TMA中的组蛋白分组。通过多变量Cox回归分析，H3K4me2与H3K18ac低水平组在UCLA I/II期TMA中是较差总体存活的显著且独立的预测因子而低水平H3K9me2趋向于较差的总体存活(表2)。卡普兰-迈耶存活曲线证实各低组蛋白分组的中位存活时间显著缩短(图2)，包括低与高H3K4me2(1.68年，95％CI 1.02-2.33相对3.66年，95％CI 1.84-5.49，P＝0.0003)，低与高H3K9me2(1.68年，95％CI 0.74-2.61相对2.39年，95％CI1.76-3.03；P＝0.039)以及低与高H3K18ac(1.56年，95％CI 1.25-1.86相对2.74年，95％CI 2.04-3.43；P＝0.006)。联用的低H3K4me2和/或低H3K18ac相对高H3K4me2和高H3K18ac是通过多变量风险分析的最高度显著且独立的存活率预测因子(表2)，卡普兰-迈耶存活分析(对数秩次检验，p＝0.00002，图2)所确定的中位存活时间分别是1.70年(95％CI 1.20-2.20)与＞5年(置信区间无法确定)。因此，UCLA I/II期胰腺癌组证实RTOG组的发现，表明细胞组蛋白修饰是总体切除胰腺癌的显著且独立的预后标记。
组蛋白修饰预测淋巴结阴性胰腺癌的预后。肿瘤分期，淋巴结病变或组织学分级是胰腺癌临床结果的重要预测因子(Garcea等，Jop 9：99-132(2008))。然而，即使在这些有用的临床病理分组内，仍有大范围的存活率结果。为确定组蛋白分组是否能进一步将患者分入不同的预后组，我们在基于T期、N期或组织学分级的首次患者分级后，进行了组蛋白水平的亚组分析。对于UCLA I/II期TMA中患有淋巴结阴性胰腺癌的患者，组蛋白分组是总体存活较差的显著且独立的预测因子，且对由低水平H3K4me2和/或H3K18限定的患者组最显著(HR＝5.00，95％CI 2.25-11.1；p＝0.00007)。相反，组蛋白分组不区分患有淋巴结阳性胰腺癌患者的子集中存活率的差别(数据未显示)。惊人的是，该结果也在RTOG 9704 TMA中得到验证，通过多变量Cox回归分析确定，H3K4me2、H3K18ac或两者的组合在淋巴结阴性患者中仍是总体存活的显著预测因子，但对淋巴结阳性胰腺癌则不是(数据未显示)。这些发现表明细胞组蛋白水平可最佳用作淋巴结阴性胰腺癌的预后标记。
组蛋白修饰水平预测对辅助5-FU化疗的响应。我们接着检查组蛋白水平是否能预测RTOG 9704TMA中对5-FU或吉西他滨辅助化疗的响应。首先，我们根据患者组蛋白分组对患者分级，并进行卡普兰-迈耶存活分析以比较辅助治疗。对各高水平组蛋白亚组，接受吉西他滨或5-FU辅助化疗的患者的总体或无病存活率没有显著差异(数据未显示)。相反，对于低H3K4me2亚组或低H3K18ac亚组，接受5-FU与吉西他滨的患者的无病存活率较差(对数秩次检验，分别为p＝0.014和p＝0.015)，还有在低H3K4me2亚组中对于5-FU与吉西他滨，非显著性的趋于较差的总体存活率(数据未显示)。其次，我们根据辅助疗法对患者分级，并进行卡普兰-迈耶存活分析以比较各低组蛋白与高组蛋白分组。低水平H3K4me2或H3K9me2与接受5-FU的患者亚组中的较差总体存活显著相关，但在接受吉西他滨的患者亚组中则不然(图3)。单变量风险模型也表明，低水平H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac在接受5-FU的患者亚组中和较差总体与无病存活率相关，但在接受吉西他滨的亚组中则不然(数据未显示)。这些结果表明，低组蛋白水平鉴定出不太可能从5-FU辅助疗法中获得生存益处的那些胰腺癌患者。
讨论。我们在两个大型胰腺癌患者组中分析了多种组蛋白修饰，发现组蛋白修饰的细胞模式提供既定临床病理学标准以外的其它预后和预测性信息。和已发表的H3K27me316结果类似，我们发现在胰腺癌中H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的细胞水平降低和较差预后之间有显著关联。本文中我们的工作以及在其它癌症中的研究(Seligson等，Am J Pathol174：1619-1628(2009)；Seligson等，Nature 435：1262-6(2005))凸显细胞组蛋白修饰水平作为预后标记的广泛应用性，并表明检测细胞组蛋白水平的标准免疫组织化学过程能提供额外的非冗余预后信息。
胰腺癌患者的存活率差异很大，即便在由临床病理学标准如肿瘤分级、分期或淋巴结状态进行分级的患者子集内仍有很大差异。在我们的两个TMA数据集中，组蛋白水平对淋巴结阴性胰腺癌患者子集都有预后性。这与先前的报道一致，这些报道中，组蛋白修饰的预后价值基本局限于侵袭性较弱的癌症或早期癌症，包括格利森评分较低的前列腺癌13，较早期肺癌(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009))和局限性肾癌(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009))。因此，在与常规临床病理学分级和分期信息联用时，细胞组蛋白水平最适合作为生物标记。
比较正常细胞与癌症细胞的全基因组分布研究表明激活性与抑制性组蛋白标记和改变基因表达之间的动态相互作用(Ke等，PLoS ONE 4：e4687(2009))。尽管在特定遗传基因座上的组蛋白修饰变化能可预测地改变基因表达，由于组蛋白修饰对转录活性可能有相反的功能性效果，且我们对组蛋白修饰在癌症基因组中分布的了解还不完全，很难预测多种组蛋白修饰水平整体变化的结果。尽管迄今所研究的组蛋白修饰中，几乎所有的水平降低都与较差预后相关，这些相同的组蛋白修饰与转录活化(例如，H3K4me2与H3K18ac)或转录沉默(H3K27me3、H3K9me2)有不同关联(Esteller，M.，Nat Rev Genet 8：286-98(2007))。一种可能的解释是，与癌症中的整体DNA低甲基化(Eden等，Science 300：455(2003))相似，组蛋白修饰的总体降低可能引起基因组不稳定性。支持该假设的有，H3K9me2水平有很大差异的前列腺癌细胞系显示几乎仅限于改变重复DNA元件处而非基因启动子处H3K9me2的分布(Seligson等，Am J Pathol 174：1619-1628(2009))。类似地，癌症细胞中H4K16ac与H4K20me3的整体缺失已显示与DNA低甲基化一起主要发生在重复元件处(Fraga等，Nat Genet 37：391-400(2005))。实验显示，通过敲减组蛋白甲基化转移酶G9a降低H3K9me2水平可引起染色体不稳定性，而对癌症细胞系中的基因表达影响很小(Kondo等，PLoS ONE 3：e2037(2008))。需要进一步研究以确定组蛋白修饰的整体分布和临床上更具侵袭性的胰腺癌子集中组蛋白修饰水平降低的原因，还需要研究以确定改变的组蛋白修饰水平对基因组不稳定性和基因转录的直接影响。
目前用于经切除胰腺癌的辅助化疗方法主要涉及吉西他滨和5-FU之间的选择，得到的共识是吉西他滨提供改进的生存益处(Ueno H.K.，T.，JHepatobiliary Pancreat Surg 15：468-472(2008))。但应注意，RTOG 9704得出结论，在基于氟尿嘧啶的化放疗设定中，辅助吉西他滨相对辅助5-FU提供的生存益处不具统计学显著性(Regine等，Jama 299：1019-26(2008))，该发现凸显对能更好告知治疗结果的预测性生物标记的需求。为此目的，积累的数据显示药物传输或代谢的一种或多种介体的水平可用于预测对癌症对吉西他滨或5-FU化疗的响应。在此，我们的数据表明细胞组蛋白修饰水平是预测对5-FU响应的新型生物标记。与我们观察到的较低H3K18ac水平和较差5-FU响应关联相一致，某些组蛋白脱胰腺抑制剂(起提高H3K18ac整体水平的作用)显示与5-FU协同作用以提高其在癌细胞系中的细胞毒性和生长抑制效应(Lee等，Mol Cancer Ther 5：3085-95(2006)；Tumber等，Cancer Chemother Pharmacol 60：275-83(2007))。这看来至少部分由于胸苷酸合酶水平降低(Lee等，Mol Cancer Ther 5：3085-95(2006)；Fazzone等，Int J Cancer Epub(PMID：19384949)(2009))，该酶水平降低与5-FU化疗耐受相关。展开来说，H3K18ac的细胞水平可用于鉴定出在5-FU化疗中更可能受益于添加HDAC抑制剂的患者。
在此，我们证明低细胞水平组蛋白修饰鉴定出不太可能从辅助5-FU化疗获得存活益处的胰腺癌患者，而高细胞水平组蛋白鉴定出从采用辅助吉西他滨或5-FU化疗会获得相似存活益处的患者。我们认为组蛋白修饰的细胞水平代表了新的一类生物标记，能预测切除胰腺癌患者中对辅助5-氟尿嘧啶化疗的响应，可能应用于肿瘤辅助治疗设定或晚期胰腺癌。更普遍地，在利用5-氟尿嘧啶作为标准化疗的其它恶性肿瘤(即，结直肠或乳腺癌)中，也可证明细胞组蛋白修饰水平能用作预测性生物标记。
实施例2：组蛋白修饰整体水平预测不同癌症的预后。
本实施例公开的主题见优先权申请，2009年4月14日提交的美国临时专利申请序列号61/169212，以及Seligson等，The American Journal ofPathology，第174卷第5期：1619-28页，2009年5月，其各自内容通过引用全文纳入本文。
癌细胞在个体细胞的单核水平上表现出个体基因和整体的组蛋白修饰模式的改变。我们之前证明组蛋白H3赖氨酸4双甲基化(H3K4me2)和H3K18乙酰化(ac)的较低整体/细胞水平可预测较高的前列腺癌复发率。在此，我们显示H3K4me2与H3K18ac的细胞水平还预测肺癌和肾癌患者的临床结果，其较低水平在这两种癌症中预测显著较差的存活概率。我们还显示H3K9me2的较低细胞水平也是前列腺和肾癌较差结果的预后，该修饰与基因活性和抑制都相关。所述组蛋白修饰的预测能力独立于组织特异性临床病理学变量、增殖标记Ki67或p53肿瘤抑制突变。染色质免疫沉淀实验表明，在更具侵袭性的癌细胞系中，较低的组蛋白修饰细胞水平与DNA重复元件处的较低修饰水平关联，但不与基因组范围内的基因启动子关联。我们的结果显示，较低的组蛋白修饰整体水平对更具侵袭性癌症表型有预测性，揭示了不同组织来源的腺癌间外遗传模式预后的惊人共性。
癌症是遗传与外遗传改变的疾病。外遗传包括DNA甲基化和组蛋白修饰的相互关联过程，在人癌症中所述过程通常出现异常(Baylin，S.B.，Ohm，J.E.，Nat Rev Cancer 6：107-116(2006)；Feinberg，A.P.，Tycko，B.，Nat RevCancer，4：143-153(2004)；Jones，P.A.，Baylin，S.B.，Cell 128：683-692(2007))。对于组蛋白修饰，这些失常可通过组蛋白修饰酶的不恰当靶向局部发生于基因启动子处，引起在肿瘤发生中起重要作用的个体基因的不当表达或抑制。例如，E2F转录因子将肿瘤抑制视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)聚集到其靶基因处。Rb进而聚集HDAC1，后者引起肿瘤生物学中有重要作用的基因如细胞周期蛋白E的转录沉默(Brehm等，Nature 391：597-601(1998)；Hake等，Br J Cancer 90：761-769(2004))。还报道了与DNA重复序列相关的组蛋白异常修饰，包括血液恶性肿瘤和结直肠腺癌中H4K16ac与H4K20me3的较低水平(Fraga等，Nat Genet 37：391-400(2005))。此外，用原发肿瘤组织的免疫染色检查整体水平时，个体肿瘤核显示组蛋白修饰的水平变化，产生细胞水平上的又一重外遗传异质性(Seligson等，Nature435：1262-1266(2005))。因此，在单核水平上，肿瘤细胞可在个体启动子、重复元件处和整体上具有异常的组蛋白修饰模式。
在癌症患者中，预测临床结果一般基于肿瘤负荷与扩散程度，和由组织学分类及患者人口统计学所提供的补充信息。然而具有相似肿瘤特征的癌症患者仍在疾病进程和结果中显示异质性。因此，靶向治疗和个性化患者护理的开发需要将相似临床结果的患者进行精确的亚分类(Ludwig，J.A.，Weinstein，J.N.，Nat Rev Cancer 5：845-856(2005))。对此，分子生物标记已可用于区分有不同临床结果的癌症患者亚型，从而扩展了我们的预后能力。在各种生物标记中，单独地或特别是成组用作分子指纹分析的基因表达分析(Golub等，Science 286：531-537(1999))已广泛用于在多种癌症中鉴定具有不同结果的疾病亚型，例如淋巴瘤(Alizadeh等，Nature 403：503-511(2000))和乳腺癌(Perou等，Nature 406：747-752(2000)；Sorlie等，Proc Natl Acad SciUSA 98：10869-10874(2001)；Sotiriou等，Proc Natl Acad Sci USA100：10393-10398(2003))。与基因表达类似，特定基因的DNA甲基化也被用作生物标记，特别是用于预测对治疗的响应(Esteller，M.，Curr Opin Oncol17：55-60(2005))。例如，在胶质瘤中，MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)启动子区的甲基化状态与烷基化剂的响应或耐受关联(Esteller等，NEngl J Med 343：1350-1354(2000))。
我们之前显示可用免疫组织化学(IHC)在组织样品中癌细胞全核水平上检测组蛋白修饰细胞(即，整体或主体)水平的异质性(Seligson等，Nature435：1262-1266(2005))。在取自个体患者的前列腺癌组织中，恶性细胞表现出不相似的组蛋白修饰水平。组蛋白修饰水平的不相似程度—定量为细胞染色百分数—在患者之间有差异。这些差异产生外遗传模式，在前列腺癌的情况中，这些差异预测去除原发性肿瘤后肿瘤复发的风险。我们在前列腺癌中检查的五种修饰中，H3K4me2和H3K18ac被证明对预后最具报道性。这两种修饰的细胞模式足以区分临床结果不同的两组患者，这两组患者原本不能用标准的临床病理学变量加以区分(Seligson等，Nature435：1262-1266(2005))。通常，与这两种修饰水平较高的患者相比，H3K4me2与H3K18ac细胞水平低(即，细胞染色百分数降低)的患者预后较差，肿瘤复发的风险显著提高。这些发现证明癌症患者中细胞外遗传与临床表现之间的新型关联。
考虑到组蛋白及其修饰广泛存在，我们在前列腺癌中得到的结果提出组蛋白修饰模式在其它癌症类型中用作预后标记的可能性。此外，组蛋白修饰的预后用途可能不限于迄今已检查的修饰。其它组蛋白修饰可能提供改善或互补的预后能力。对于基因表达预后因子，一个或多个基因的表达对临床结果可能有预测性，但在大多数情况中，不同癌症中预后基因的特征不同。将这一逻辑扩展至外遗传，会预期不同的组蛋白修饰预测不同癌症中的预后。但是，我们在此提供证据证明，在其它腺癌(即，腺体上皮的癌症)也就是肺癌和肾癌中，对前列腺癌最具报道性的同样两种组蛋白修饰H3K4me2与H3K18ac的较低细胞水平区分出存活概率降低的患者。我们未检查在我们的原始研究7中其它3种修饰的水平。但是，我们显示了与基因活性和抑制相关的另一种组蛋白修饰H3K9me2的细胞水平本身是临床结果的有力预测因子，在前列腺和肾癌中该修饰水平较低预测差的结果。与初生组织的结果一致，我们显示了前列腺癌细胞系也表现出不同的组蛋白修饰的细胞水平。癌细胞系中的这些整体差异与重复DNA元件处的组蛋白修饰水平变化相关，而与启动子区的相关性较弱。我们的发现表明，组蛋白修饰的细胞水平可以是不同组织来源腺癌中临床结果的通用预测因子；组蛋白修饰的整体降低可与更具侵袭性的癌症表型关联。
样品采集与组织微阵列(TMA)。经UCLA机构审查委员会批准，从病理学系1984-2002年间发生的手术病例获得人肺、肾和前列腺的良性和肿瘤组织的福尔马林固定石蜡包埋样品。样品采集时不了解临床数据，这些数据在TMA构建后获得。如之前所述，从各石蜡包埋样品的选定形态代表性区域取得至少3份直径0.6mm的肿瘤组织核心活检并排成阵列(Seligson，D.B.，Biomarkers 10 Suppl 1：S77-82(2005))。按照美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)对恶性肿瘤的肿瘤-淋巴结-转移性(TNM)分类进行所有组织类型的肿瘤分期。从手术病理学确定T期，用术后病理学、临床和/或放射显影数据确定N和M期。
所检查的肺癌与肾癌研究终点是疾病特异性死亡。存活时间按月计，是从疾病诊断或从手术开始(分别针对肺癌和肾癌)到死亡的期间。在末次随访时检查末次随访时还存活或并非因病死亡的患者。对于肺癌，检查不明原因的死亡；对于肾癌患者，所有原因均已知。前列腺癌的终点是疾病复发，定义为术后血清PSA达到0.2ng/ml或更高。末次随访时检查无复发的患者。对肾癌和肺癌，在初次呈现时确定美国东部肿瘤协作组体能状况(ECOG PS)。
肺癌患者。采用世界卫生组织(WHO)的肺癌组织学分类。肺癌TMA含285个患者样品，其中262个(92％)为临床报道性的。262个病例中的257个(98％)也是H3K18ac和H3K4me2报道性的。腺瘤包括具细支气管肺泡组分的肿瘤。根据AJCC癌症分级手册对肺肿瘤分级。该组中肺癌患者的中位年龄为67岁(范围为41-87岁)，男女比例为1∶1.4。中位肿瘤尺寸是2.5cm。该组中的中位随访时间为59.0个月(范围为1.0-229个月)。
肾癌患者。根据1997UICC/AJCC恶性肿瘤分类进行肾癌的病理学肿瘤亚型分类。从患肾细胞癌患者的完全或部分肾切除中取得肾肿瘤。所述TMA的379个病例中，373个(98％)为临床报道性，其中又有359个(96％)为H3K18ac、H3K4me2与H3K9me2报道性。局限性组中肾癌患者的中位年龄为63.5岁(范围为27-88岁)，男女比例为1.9∶1。中位肿瘤尺寸是4.5cm。该组中的中位随访时间为43.1个月(范围为0.0-142个月)。
前列腺癌患者。前列腺癌是所有组织学类型″腺癌，常规的、未明确载明的″。所述TMA的226位接受耻骨后前列腺全切除的前列腺癌患者中，212位为临床报道性，其中的185位(87％)还是H3K9me2报道性的。采用格利森评分系统(相当于格利森求和)进行前列腺评级；组内″低级″包括格利森评分2-6的病例。组内前列腺癌患者的中位年龄是64岁(范围为46-75岁)。该组中的中位随访时间为60.0个月(范围为2.0-120个月)。
免疫组织化学(IHC)和Western印迹。使用DAKO Envision系统对所有抗体采用标准2步间接IHC染色法，如前所述(Seligson，D.Biomarkers 10Suppl 1：S77-82(2005))。兔的抗组蛋白第一多克隆抗体在室温下应用60分钟—对肺癌TMA，H3K18ac(Suka等，Mol Cell 8：473-479(2001))1∶300稀释使用，H3K4me2(上州公司)1∶600稀释使用；对肾癌TMA，H3K18ac1∶400稀释、H3K9me2(阿柏堪穆公司(Abcam))1∶50稀释和H3K4me21∶800稀释使用；对于前列腺癌TMA，H3K9me2 1∶100稀释使用；对于细胞系IHC，H3K9me2 1∶100稀释使用，上述稀释均为从母液稀释。多克隆兔抗H3(阿柏堪穆公司)使用浓度为5μg/ml。单克隆抗Ki-67MEB-1(7.5μg/ml)和抗人p53 DO-7(15μg/ml)(大科公司(Dako))分别用于检测Ki67和p53。我们使用含20-40个病例的测试TMA优化各抗体的浓度以观察各种组织类型中染色范围的最大变化。切片用哈里斯苏木精复染。阴性对照是染色时不用第一抗体的相同阵列切片。对于Western分析，从PC3(前列腺癌的骨转移；ATCC)和LNCaP(前列腺癌的淋巴结转移；ATCC)细胞系酸提取组蛋白，并进行标准western印迹。
所有组织的免疫组织化学评分。由不了解任何临床病理学变量的病理学家进行TMA上抗体染色的半定量评估。两名病理学家对所有TMA进行评分，但每个癌症组仅由一人评分(肺TMA-V.M.，肾和前列腺TMAs-H.Y.)。我们选择IHC和半定量分析以产生数据集，因为这基本上是临床病理学情境中最常用的免疫染色方法，使我们的方法能被现有病理学实验室方便地采用。仅对癌性上皮组织进行评分，本研究中仅包括来自首次手术的原发性肿瘤细胞。给定组织点位评分的可接受下限为10个细胞。但是，在多数肿瘤点位中，细胞数在100-1000之间，对大多数情况，由超过一个包含靶组织的点位代表肿瘤(每个病例的标记报道性原发肿瘤组织位点平均数为：肾3.1个，肺2.4个，前列腺3.0个)。评分中排除癌症样品中的正常上皮、间充质或浸润的炎性细胞和转移灶。对各TMA位点采用“标记指数”方法作阳性核表达频率(范围为0-100％)的评分。为对各病例产生单一代表性染色，各病例内各肿瘤位点的细胞阳性百分数被合并且用于确定各数据集内患者的百分秩次。
统计分析。我们用非参数多组比较测试的克-瓦二氏检验法检验各组间序数变量是否有差异。我门用卡普兰-迈耶作图显示存活分布。采用多变量Cox比例风险模型检验多个预测因子的统计学独立性和显著性。用经折算Schoenfeld残差检验比例风险假设。我们采用菲希尔精确检验研究各患者分级之间的分类组蛋白表达分组是否有差异。用对数秩检验进行存活分布之间的差异检验。认为p值＜0.05是显著的。
染色质免疫沉淀(ChIP)和微阵列杂交。基本按之前所述进行ChIP(Wang等，Mol Cell 17：683-694(2005))。简单来讲，37℃下向生长的细胞培养物中加入甲醛，保持10分钟。PBS清洗后，从平板上刮下交联的细胞，用1ml含蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche))的PBS清洗。裂解细胞，冰上孵育10分钟并立即超声处理。用100μl裂解液与抗H3K9me2或H3K18ac的抗体一起免疫沉淀；10μl裂解液用作输入。65℃下交联反转过夜后，经ChIP样品和输入样品用RNA酶A在37℃下处理30分钟，然后用凯杰公司(Qiagen)的Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。IP与INP DNA各取10ng用WGA试剂盒(西格玛公司(Sigma))扩增。利用Bioprime标记试剂盒(英杰公司(Invitrogen))将2μg经扩增材料用Cy3或Cy5(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))标记。DNA与35μl随机引导溶液(英杰公司Bioprime试剂盒)混合至终体积75μl，煮沸5分钟然后在冰水浴中迅速冷却5分钟。对于输入与ChIP DNA，分别用60U Klenow，dNTP(0.12mM dATP、dGTP与dTTP和0.06mM dCTP)，1.28mM Cy3与Cy5，并在37℃下孵育3小时来完成标记反应。用凯杰公司的Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化已标记的DNA，用Nanodrop测定掺入。按照生产商说明书进行与人类启动子阵列(安捷伦公司(Agilent)-G4489A)的杂交、清洗和扫描。用安捷伦公司的DNA微阵列扫描仪扫描阵列。采用安捷伦公司的特征提取软件(Feature Extraction，9.1.3.1版)和芯片分析软件(Chip Analytics，1.2版)进行数据获取和分析。用Lowess归一化将探针信号归一化。
用癌组织免疫染色检测细胞组蛋白修饰。为确定获自患者的组织内组蛋白修饰的细胞水平，我们将用作检测细胞内特定抗原存在方法的IHC与组织微阵列(TMA)联用(Seligson，D.B.，Biomarkers 10 Suppl 1-.S77-82(2005)；Kononen等，Nat Med 4：844-847(1998))，对大量组织样品进行高通量分析(Liu等，J Biopharm Stat 14：671-685(2004))。我们利用识别特定修饰残基的抗体在肺癌、肾癌和前列腺癌的TMA上分析H3K4me2、H3K9me2和H3K18ac的水平(Seligson等，Nature 435：1262-1266(2005)；Suka等，Mol Cell 8：473-479(2001))。这些癌症的选择和每种阵列上的患者数量由具备完整随访临床数据的样品可供性决定。在此，组蛋白修饰的整体水平指各组织样品内给定抗体阳性染色的癌症细胞的百分数。这一评分系统常规并广泛用于目前在病理学实验室中临床应用的各种生物标记。图4A-B是用抗H3K18ac抗体染色的代表性肺癌(图4A)和肾癌(图4B)组织(物镜：左图10X；右图40X)。认为有褐色核的细胞是染色阳性，确定这些细胞在肿瘤组织内的百分数。由于识别未修饰组蛋白H3的抗H3抗体在基本所有细胞内都是染色阳性(数据未显示)，缺乏组蛋白修饰抗体的染色不太可能是因为其相应抗原的不易接近性。未染色细胞仍可能在某些基因座处含所述修饰，但其水平低于IHC的检测限度，标志在这些细胞内组蛋白修饰显著降低。
根据组蛋白修饰水平的患者分组。为确定组蛋白修饰是否预测临床结果，我们首先根据临床组织学特征例如分级或分期将患者分成大类。这种初始分组的理由是分级和分期是结果的有力预测因子(Ludwig，J.A.，Weinstein，J.N.，Nat Rev Cancer 5：845-856(2005))。分级是肿瘤分化的组织学度量。分期是肿瘤尺寸和扩散超出其原始位点的度量。通常，更高的分级与分期与更差的结果相关。然而，在分级和分期等同的癌症中，有些亚类的患者具有分子异质性和不同的临床结果(Ludwig，J.A.，Weinstein，J.N.，Nat Rev Cancer 5：845-856(2005))。因此，需要预后生物标记以在分级和分期的基础上将患者细分入更具临床内聚力的组。在分级或分期的分类后，我们根据特异性组蛋白修饰模式或简称“组蛋白模式”将各类患者分入两组。这一组蛋白模式最初源自前列腺癌患者的非监督群聚，该模式基于预测临床结果的H3K4me2和H3K18ac染色的细胞水平。本研究中，我们没有探索这两种修饰的新界值。组蛋白模式预测出，与H3K4me2和H3K18ac水平较高的患者相比，这两种修饰水平较低的患者预后较差。对各肺癌和肾癌的患者应用组蛋白模式后，我们检验了两个所得组将会有显著不同临床结果的预测。
组蛋白修饰预测肺癌存活概率。为评估H3K4me2与H3K18ac的染色分布，我们将对各修饰观察到的指定细胞染色百分数(x轴)的组织样品频率(y轴)作图(图4C)。H3K4me2染色显示广泛的分布，而H3K18ac染色偏向更高百分数的细胞染色(图4C)。为确定组蛋白修饰模式是否在肺癌中有临床报道性，我们首先将患者分成1-4期(数据未显示)。然后按照我们从前列腺癌中鉴定出的预测性组蛋白修饰模式将患者分入两组。H3K4me2与H3K18ac水平高的肿瘤被分入第1组(即，H3K4me2＞60或H3K4me2与H3K18ac＞35染色百分位)，所述修饰水平较低的其余肿瘤被分入第2组。我们发现在1期肺腺癌(n＝159)中，与第1组中的患者(图5A，黑线)相比，组蛋白修饰的细胞水平较低的第2组患者(图5A，红线)的15年存活概率显著较低(对数秩次p＝0.018，风险比例(HR)＝2.19，95％CI＝1.13-4.27)。两组间没有性别或手术年龄差别，但分级分布有统计学显著差异(p＝0.0026)。矛盾的是，分级分布的差异是因为结果较差的第2组内存在更多低级肿瘤(图5A，图内框)。在2期(n＝42)、3期(n＝40)与4期(n＝16)中，我们没有测定临床结果有显著差异的亚组。因此，前列腺癌中的同一组蛋白修饰模式在1期肺腺癌中用作预后标记。
组蛋白模式在肺癌中是独立的预后因子。为确定肺癌中组蛋白修饰与其它已知生物标记的相互比较，我们检查了p53阳性染色的细胞百分数，在1期腺癌中p53过量表达与差的患者结果显著关联(Maddau等，Am J ClinPathol 125：425-431(2006))。在两个组蛋白组中，p53的表达水平不同，预后较差的组内表达较低，第1组内平均阳性率为32.1％而第2组内为19.7％(p＝0.033)。因此，由组蛋白模式预测的较差预后不是因为p53突变的发生率上升。此外，在第1和第2组中，分别有30与25％患者的有丝分裂计数＞0(p＝0.64)，表明用组蛋白模式预后不是因为增殖率的提高。最后，在包括分级、有丝分裂计数、p53、患者体能状况(ECOG)的多变量Cox模型中，组蛋白分组仍是结果的显著预测因子(表2)。因此，所述组蛋白修饰模式是肺腺癌临床结果的独立预测因子。
组蛋白修饰预测肾癌存活概率。在肾癌中，H3K4me2和H3K18ac的染色水平都有广泛分布，＜10％的样品显示90-100％染色(图4D)。对局限性肾癌患者应用与上述相似的组蛋白模式(即，H3K4me2和H3K18ac染色百分位分别＞60或＞35)(n＝192；数据未显示)，我们鉴定出两组患者的存活概率显著不同(图5B)。与组蛋白修饰水平较高(第1组)的患者相比，两种修饰水平都低的患者(第2组)1年存活概率显著较低(对数秩次p＝0.028，HR＝2.22，95％CI＝1.07-4.62)。两组内患者基于性别、手术年龄、分级或分期的分布没有差异(图5B，图内框)。患有转移性疾病的患者中(n＝163)，我们未测得临床结果不同的亚组(见图9A)。当仅根据分级对患者分类时，组蛋白模式在1级和2级中区分存活概率显著不同的两组，但在3级和4级中则不然(数据未显示)。因此，和前列腺癌与肺癌中一样，同样两种组蛋白修饰的较低水平在局限性肾腺癌中预测差的临床结果。
组蛋白模式在肾癌中是独立的预后因子。为确定组蛋白修饰与肾癌中其它已知标记的比较，我们检查了Ki67和p53阳性染色的细胞百分数，Ki67是增殖标记。之前显示Ki67或p53的表达提高与肾腺癌中患者结果差显著相关(Shvarts等，J Urol 173：725-728(2005)；Visapaa等，Urology 61：845-850(2003))。两个组蛋白组中Ki67表达水平的中位值基本相同，第1组内是5％，第2组内是5％(p＝0.50)，表明组蛋白分组不是因为其增殖状态。在两个组蛋白组中，p53的表达水平不同，预后较差的组内平均表达较低，第1组内为7.3％而第2组内为3.2％(p＝0.0002)。因此，由组蛋白修饰预测的较差预后不是因为p53突变的发生率上升。在包括分级、Ki67与p53的多变量Cox模型中，组蛋白分组仍是结果的显著预测因子(表2)，但当模型还包括ECOG体能状况时则不再是。因此，在局限性肾癌中，组蛋白修饰模式是独立于分级、增殖率和p53表达的预测因子。
H3K9me2细胞水平预测前列腺癌和肾癌的临床结果。H3K4me2和H3K18ac都是与基因活性相关的修饰。我们接着探询低水平的H3K9me2—与基因抑制和活性以及异染色质都相关的一种修饰—是否在癌症中也预测较差预后。我们确定用与检查其它修饰的相同前列腺癌和肾癌TMA中的H3K9me2细胞水平。前列腺癌与肾癌样品中的染色分布都显示广泛的模式，染色范围从0到100％(图6A与6C)。在前列腺癌中，H3K9me2的细胞水平对高格利森评分(评分≥7；n＝76)肿瘤患者间的结果不具预测性。但是，在低格利森评分肿瘤(评分＜7，n＝109)中，H3K9me2的水平作为连续的非二分变量与肿瘤复发显著相关(Cox回归分析，p＝0.0037)。我们然后运用Rpart树形分析确定H3K9me2水平的最优截点以将患者二分入高水平和低水平H3K9me2组。如图6B所述，与H3K9me2染色＞10％的患者相比，H3K9me2染色≤10％的患者(第2组；红线)显示的肿瘤复发风险较高(Cox比例风险p＝0.0043，HR＝3.25，95％CI 1.38-7.63)。在低格利森评分的组内，用H3K9me2预后独立于肿瘤分级(图6B内框)、分期、术前PSA和包膜侵犯(表2)。
我们接着确定H3K9me2水平较低是否还在肾癌患者中预测较差预后。事实上，H3K9me2水平作为连续的非二分变量在所有癌症患者中(Cox回归分析p＝0.028，n＝359)和局限性癌症患者中(Cox回归分析p＝0.026，n＝189)与存活概率显著相关。利用前列腺癌中的相同截点，与H3K9me2染色＞10％的肾癌患者相比，H3K9me2染色≤10％(第2组；红线)的肾癌患者显示的存活概率显著降低(Cox比例风险p＝0.00092，HR＝1.7，95％CI 1.3-2.4；图6D)。对所有患者以及局限性或转移性疾病分类内的患者都是这样(见图10)。在包括分级、Ki67、p53和/或肿瘤定位的多变量Cox模型中，H3K9me2水平仍是结果的显著预测因子(表2)。总之，我们的数据显示，H3K9me2细胞水平较低也在前列腺癌与肾癌中预测差的预后。
组蛋白修饰整体水平的改变与其在重复DNA元件处的水平相关。为确定组蛋白修饰的细胞模式在分子水平上如何定位到个体启动子处，我们确定两种可用作原发肿瘤观察模型的前列腺癌细胞系。我们预期表型更侵袭性的癌细胞系一般含有较低的组蛋白修饰水平。对LNCaP和PC3和前列腺癌细胞系，情况确实如此。认为源自前列腺癌骨转移的PC3细胞系比分离自淋巴结转移形式的LNCaP细胞系更具侵袭性。图7A显示LNCaP和PC3细胞使用抗H3K9me2抗体的免疫组化染色。与LNCaP细胞相比，更具侵袭性的PC3细胞含有降低的H3K9me2水平。酸提组蛋白的Western印迹证实了IHC的结果(图7B)。PC3细胞还显示H3K18ac与H3K4me2水平低于LNCaP细胞(见图11)。
我们接着进行ChIP-芯片(染色质免疫沉淀与微阵列联用)实验以在启动子基因组范围内比较LNCaP与PC3细胞间H3K9me2的分布(图8A)。对各细胞系，我们比较用抗H3K9me2抗体的ChIP DNA与总基因组DNA(输入)。我们使用安捷伦公司的人启动子阵列，其中含17,054个启动子，平均覆盖各启动子标注转录起始位点(TSS)的-5.5kb至+2.5kb区域。归一化各基因的数据以产生如图8A所示的16个500bp片段。我们发现LNCaP与PC3细胞内的H3K9me2分布在启动子基因组范围内各位置处非常相似，关联度很高(图8B)。因此，LNCaP与PC3细胞之间总体H3K9me2水平的差异不太可能是由于基因启动子的整体变化。
我们接着探询PC3细胞中组蛋白修饰整体水平较低是否由于重复DNA元件处的水平降低。这些DNA元件共占人基因组的～70％，是显著甲基化的DNA，并在某些癌症中具有较低水平的H4K16ac于H4K20me3(Fraga等，Nat Genet 37：391-400(2005))。我们使用上述相同ChIP所得DNA，然后通过定量实时PCR(qRT-PCR)检查多个DNA重复元件处的H3K9me2水平(图8C)。为避免拷贝数变化，对各重复DNA元件，我们检查重复和非重复性DNA元件的边缘区域。如图8C所示，PC3细胞在亚端粒重复元件(D4Z4)处显示较低水平H3K9me2，该元件是发现于近端着丝染色体(NB L2)和紧靠着丝粒随体(Sat2)DNA序列的1.4kb串联元件。H3K9me2水平较低不是由于组蛋白减少(图8C)。H3K18ac也在D4Z4与NBL2元件处显示较低水平。这些结果表明，更具侵袭性癌症中组蛋白修饰的整体降低与DNA重复元件处修饰水平较低相关。
我们提供证据显示，除之前报道的前列腺癌外(Seligson等，Nature435：1262-1266(2005))，癌组织中相同组蛋白修饰的整体水平还可在肺和肾的不同腺癌中预测疾病结果。一般在各种癌症中，癌细胞H3K4me2与H3K18ac阳性染色百分数较低的患者的预后比染色百分数较高的患者差。有意思的是，H3K9me2的细胞水平也与疾病结果关联，在前列腺癌与肾癌中，其水平较低预测出预后较差(我们尚未检查肺癌组的H3K9me2)。因此，我们的数据呈现的一般结论是，组蛋白修饰细胞水平较低与较差临床结果关联。有意思的是，组蛋白修饰的水平彼此正相关，表明患者的一种组蛋白修饰的缺失通常与其它修饰的缺失关联(见表3)。其它实验室证实了组蛋白修饰的预后能力并扩展至其它修饰和包括非小细胞肺癌(Barlesi等，JClin Oncol 25：4358-4364(2007))与乳腺、卵巢和胰腺癌(Wei等，MolCarcinog 47：701-706(2008))在内的其它癌症。组蛋白修饰模式的这种普遍适用性与当前描述的大多数预后标记不同。组蛋白修饰的预后能力独立于包括增殖率在内的临床病理学变量和某些生物标记如肺癌中的p53表达和肾癌中的p53与Ki67表达。因此，组蛋白修饰细胞模式为预测癌症患者临床表现的现有预后标记增添了进一步的非冗余信息。
癌症中组蛋白修饰的分析通常集中在特定的基因座如单个基因的启动子处，揭示对下游基因的表达有顺向效应的组蛋白修饰局部扰动。将此主张扩展至PC3细胞，该细胞所含H3K9me2比LNCaP低～50％，我们意外地发现这两种细胞系的ChIP-芯片数据彼此基本相似。这表明组蛋白修饰整体水平的差异不太可能是基因启动子处的变化造成。但是，3种DNA重复元件的ChIP分析显示，PC3细胞中的H3K9me2水平低于LNCaP细胞。组蛋白修饰的整体水平与其在重复元件处而非在基因启动子处的水平之间的这种关联之前在其它癌症中已有展示(Fraga等，Nat Genet 37：391-400(2005))。由于DNA重复元件占基因组序列的～60-70％(Li等，Nature409：847-849(2001))，这些区域的组蛋白修饰水平可能解释癌细胞系和原发性癌组织中所观察到的整体差异。
癌症中，重复元件在DNA上去甲基化，这可能导致基因组不稳定性(Feinberg，A.P.，Tycko，B.，Nat Rev Cancer，4：143-153(2004))。我们的数据和他人的数据(Fraga等，Nat Genet 37：391-400(2005))目前表明，重复元件也可能在它们的相关组蛋白上去甲基化和/或去乙酰化。尚不清楚组蛋白在重复元件处的这种“去修饰”的生物学后果，但可能与更具侵袭性的表型有关，因为组蛋白修饰整体水平较低预测了较差的预后。对影响重复元件处组蛋白修饰的调节机制知之甚少，但可能是由于基因突变、表达变化和/或翻译后控制造成组蛋白修饰酶的不当靶向、表达和/或活性的改变(Esteller，M.，Br J Cancer 94：179-183(2006))。由于所有组蛋白修饰都是可逆的，一组组蛋白修饰因子如HDAC的活性提高可能改变组蛋白修饰的总体状态，导致整体水平上的可检测变化(Kurdistani，S.K.，Br J Cancer 97：1-5(2007))。这些组蛋白修饰因子中的一些可能优先影响DNA重复元件。尽管尚未在哺乳动物蛋白中证实这点，酵母内的Hos3HDAC优先对核糖体DNA重复序列去乙酰化(Robyr等，Cell 109：437-446(2002))。
在可能相关的研究中，我们已显示病毒致癌蛋白如腺病毒e1a能通过基因组范围的特定组蛋白修饰因子重分布来改变人细胞内组蛋白修饰的整体模式，所述重分布使那些修饰因子离开大多数基因组并将其限制在有限但生物学相关的一组基因处以利于细胞复制并因此促进病毒生产(Ferrari等，Science 321：1086-1088(2008)；Horwitz等，Science 321：1084-1085(2008))。和e1a致癌蛋白的情况相似，原发性癌中DNA重复元件处组蛋白修饰缺失可能也反映HAT和HMT离开这些区域并重分布到更少的一组基因，这些基因使发生重分布的细胞占优。无论具体机制如何，仍需确定组蛋白修饰很少或不可检测的细胞是否源自单一前体细胞(即，克隆)或是源自组织内不同肿瘤细胞中组蛋白修饰的平行缺失。
用组蛋白修饰进行预后可能影响外遗传疗法。一种可能性是，与H3K4me2、H3K18ac和/或H3K9me2水平高的患者相比，这些组蛋白修饰水平低的结果较差的患者会更得益于HDAC抑制剂。也可能结果差的组会需要各种外遗传治疗的不同方案(Egger等，Nature 429：457-463(2004)；Minucci等，Nat Rev Cancer 6：38-51(2006))。无论情况怎样，我们这种简单稳健的方法将促进开发标准有效的外遗传测试以鉴别癌症患者中具有相似临床结果的子集。
实施例3。组蛋白修饰预测乳腺癌的存活概率。
为确定组蛋白修饰模式是否在乳腺癌中为临床报道性，我们将所述组蛋白模式应用于1级和2级乳腺肿瘤患者(n＝33)。所述组蛋白模式鉴定出肿瘤复发风险显著不同的两组患者。第1组的患者(即H3K4me2与K18ac染色分别＞60或＞35百分位)8年肿瘤复发风险＜1％，而第2组的复发风险为30％(对数秩次p＝0.006)。两组之间，分级、分期、雌激素和孕酮受体状态没有显著差异。由于有丝分裂指数是乳腺癌分级系统中所用的三个参数之一，组蛋白分组也独立于有丝分裂指数，因而也独立于增殖率。在两个组蛋白分组中，原癌基因HER-2也未显示显著差异，该基因的过量表达与乳腺癌结果差相关联：第1组中15/24名患者，第2组中2/9名患者过量表达Her2(p＝0.057)。因此，与前列腺癌、肺癌和肾癌相同，组蛋白修饰的总体水平也作为乳腺癌的预后标记。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
Figure BPA00001480064400511
表2.多变量比例风险分析：
Figure BPA00001480064400521
表3.组蛋白修饰细胞水平通常彼此相关
肾癌—所有病例(n＝359)：
 H3K18ac   H3K4me2   H3K9me2
  H3K18ac  1
  H3K4me2  0.568   1
  H3K9me1  0.618   0.730   1
肺癌—所有病例(n＝257)：
 H3K18ac   H3K4me2   H3K9me2
  H3K18ac  1
  H3K4me2  0.546   1
  H3K9me1  NA   NA   1
前列腺癌—所有病例(n＝188)：
 H3K18ac   H3K4me2   H3K9me2
  H3K18ac  1
  H3K4me2  0.688   1
  H3K9me1  0.356   0.556   1
各表中显示的是所有临床随访病例和用阳性细胞平均百分数指示癌症的组蛋白标记报道性病例中，病例水平的皮尔逊相关性(Pearsoncorrelation)。
Figure IPA00001480063800011

Claims (23)

1.一种预测癌症患者对5-FU或另一胸苷酸合酶抑制剂治疗的响应的方法，所述方法包括确定取自所述患者的癌组织样品中H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac或其组合的整体组蛋白修饰水平。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，存在所述组蛋白修饰的低水平表明当用5-FU或另一胸苷酸合酶抑制剂治疗时的预后或存活可能性较差，而存在H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的高整体组蛋白修饰水平表明当用5-FU或另一胸苷酸合酶抑制剂治疗时的存活预后较好，其中高水平和低水平之间的界值是基于比较组观察所得整体组蛋白修饰水平的统计分析，所述比较组是用胸苷酸合酶抑制剂治疗的一组已知治疗存活率或预后的癌症患者。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者患有淋巴结阴性癌症或正接受5-氟尿嘧啶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述组蛋白修饰H3K4me2、H3K9me2或H3K18ac的阳性肿瘤细胞染色用于将患者分成低或高染色，其中低染色分类支持总体存活较差的预后。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述预后基于H3K4me2和H3K18ac两者的组蛋白修饰水平，其中H3K4me2和H3K18ac两者的低组蛋白修饰水平预测较差的存活可能性。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述组蛋白修饰水平由免疫细胞化学或免疫组织化学确定。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选自H3K4me2、H3K9me2与H3K18ac的2种或3种组蛋白修饰的组蛋白修饰水平用于提供所述预后。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是胰腺癌。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分类是基于组蛋白规则。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是腺癌。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述癌症是低级或早期癌症。
12.前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述划分组蛋白修饰为较高或较低水平的界值如下：H3K9dime为约≥30％，H3K4me2为约＞60％或H3K18ac为约＞35染色百分位。
13.一种鉴定癌症患者是否能受益于补充5-FU或其它癌症疗法的组蛋白脱乙酰酶抑制剂施用的方法，所述方法包括确定取自患者的胰腺癌的组织样品中H3K18ac组蛋白修饰的水平，其中所述修饰的水平低将表明组蛋白脱乙酰酶抑制剂会有益，其中低水平和高水平之间的界值是基于获自已知存活率或预后的癌症患者比较组的H3K18ac整体组蛋白修饰水平。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，选择5-FU和所述抑制剂以治疗患者且所述患者按此治疗或按此诊视。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述癌症是低级或早期癌症。
16.一种治疗胰腺癌患者的方法，所述方法包括：
(a)将取自患者的癌组织与抗体接触，所述抗体脱乙酰结合选自H3K4me2、H3K9me2与H3K18ac的经修饰组蛋白；和
(b)确定所述组织样品中所述经修饰组蛋白的水平与已知结果的比较群体中观察所得水平的比较；从而提供所述癌症的预后；和
(c)当所述预后表明癌症可能具有降低的存活率或对采用胸苷酸合酶抑制剂的治疗无响应时，施用更具攻击性的抗癌疗法代替胸苷酸合酶抑制剂或作为所述抑制剂的补充。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法预测癌症复发的可能性。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述胸苷酸合酶抑制剂是5-FU。
19.一种鉴定用吉西他滨或非胸苷酸合酶抑制剂的药剂治疗会优于单用胸苷酸合酶抑制剂或联用胸苷酸合酶抑制剂与甲酰四氢叶酸治疗的癌症患者的方法，所述方法包括确定取自所述患者的组织样品中H3K18ac组蛋白修饰的水平，其中所述修饰相较界值的低水平将表明优选采用吉西他滨或所述药剂治疗。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，给予所述患者吉西他滨。
21.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述胸苷酸合酶抑制剂是5-FU。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述癌症是胰腺癌。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述界值是基于对比较组观察所得整体组蛋白修饰水平的统计分析，所述比较组是经胸苷酸合酶抑制剂治疗的已知治疗存活率或预后的癌症患者，其中所述界值将所述比较组划分入两个群体，该两个群体之间按1年存活判断的治疗响应相差至少20％。
CN2010800251368A 2009-04-14 2010-04-14 组蛋白修饰用于癌症的临床诊断和预后 Pending CN102460173A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16921609P 2009-04-14 2009-04-14
US16921209P 2009-04-14 2009-04-14
US61/169,212 2009-04-14
US61/169,216 2009-04-14
US22516209P 2009-07-13 2009-07-13
US61/225,162 2009-07-13
PCT/US2010/031112 WO2010120942A2 (en) 2009-04-14 2010-04-14 Histone modification patterns for clinical diagnosis and prognosis of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102460173A true CN102460173A (zh) 2012-05-16

Family

ID=42983132

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800251368A Pending CN102460173A (zh) 2009-04-14 2010-04-14 组蛋白修饰用于癌症的临床诊断和预后

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20120094949A1 (zh)
EP (1) EP2419737A4 (zh)
JP (1) JP2012524278A (zh)
CN (1) CN102460173A (zh)
AU (1) AU2010236415A1 (zh)
BR (1) BRPI1013546A2 (zh)
CA (1) CA2758933A1 (zh)
WO (1) WO2010120942A2 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106103739A (zh) * 2013-12-30 2016-11-09 新加坡科技研究局 用于测量胃肠癌中的生物标记物的方法
CN107209190A (zh) * 2014-10-29 2017-09-26 比利时意志有限责任公司 用于富集循环肿瘤dna的方法
CN108367995A (zh) * 2015-10-06 2018-08-03 安大略省癌症研究所 靶向组蛋白途径以检测和克服蒽环类抗生素耐受性
CN108957004A (zh) * 2018-07-09 2018-12-07 东南大学 检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用
CN109564225A (zh) * 2016-08-09 2019-04-02 B.R.A.H.M.S 有限公司 作为指示不良事件的标志物的组蛋白和/或proADM
CN109791154A (zh) * 2016-07-25 2019-05-21 比利时意志有限责任公司 结肠直肠癌的组合测试
CN110221072A (zh) * 2019-06-10 2019-09-10 东南大学 检测H3K9甲基化和E-cadherin表达量试剂在制备肝癌预后评估试剂盒的应用
CN112904006A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 中山大学 一种乳腺癌预后预测分子标志物及其应用
WO2024077601A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Guangdong Tcrcure Biopharma Technology Co., Ltd. Peptide vaccines against glioma and uses thereof

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201115095D0 (en) 2011-09-01 2011-10-19 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting nucleosomes containing nucleotides
ES2649404T3 (es) * 2011-12-07 2018-01-11 Belgian Volition Sprl Procedimiento para detectar aductos de nucleosomas
GB201303575D0 (en) * 2013-02-28 2013-04-10 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting histone modifications in nucleosomes
GB201303576D0 (en) * 2013-02-28 2013-04-10 Singapore Volition Pte Ltd Method for predicting therapy efficacy using nucleosome structure biomarkers
JP2016044993A (ja) * 2014-08-20 2016-04-04 有限会社マイテック ヒストン化学修飾判定による癌診断方法
US10639349B2 (en) 2015-04-06 2020-05-05 The Johns Hopkins University H3T3A mutant protein efficiently reduces H3T3P and causes increased cell death of rapidly dividing cells
US10441644B2 (en) 2015-05-05 2019-10-15 The Regents Of The University Of California H3.3 CTL peptides and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
EP1896849B1 (en) * 2005-04-29 2010-11-24 The Regents of The University of California Antibodies against histone modifications for clinical diagnosis and prognosis of cancer
WO2007015947A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Bayer Healthcare Llc Methods and kits for the prediction of therapeutic success, recurrence free and overall survival in cancer therapies

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106103739A (zh) * 2013-12-30 2016-11-09 新加坡科技研究局 用于测量胃肠癌中的生物标记物的方法
CN107209190A (zh) * 2014-10-29 2017-09-26 比利时意志有限责任公司 用于富集循环肿瘤dna的方法
CN108367995A (zh) * 2015-10-06 2018-08-03 安大略省癌症研究所 靶向组蛋白途径以检测和克服蒽环类抗生素耐受性
CN108367995B (zh) * 2015-10-06 2021-08-27 安大略省癌症研究所 靶向组蛋白途径以检测和克服蒽环类抗生素耐受性
CN109791154A (zh) * 2016-07-25 2019-05-21 比利时意志有限责任公司 结肠直肠癌的组合测试
CN109564225A (zh) * 2016-08-09 2019-04-02 B.R.A.H.M.S 有限公司 作为指示不良事件的标志物的组蛋白和/或proADM
CN108957004A (zh) * 2018-07-09 2018-12-07 东南大学 检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用
CN108957004B (zh) * 2018-07-09 2021-10-19 东南大学 检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用
CN110221072A (zh) * 2019-06-10 2019-09-10 东南大学 检测H3K9甲基化和E-cadherin表达量试剂在制备肝癌预后评估试剂盒的应用
CN112904006A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 中山大学 一种乳腺癌预后预测分子标志物及其应用
WO2024077601A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Guangdong Tcrcure Biopharma Technology Co., Ltd. Peptide vaccines against glioma and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2419737A2 (en) 2012-02-22
AU2010236415A1 (en) 2011-12-01
WO2010120942A2 (en) 2010-10-21
WO2010120942A3 (en) 2011-02-24
US20120094949A1 (en) 2012-04-19
BRPI1013546A2 (pt) 2019-04-09
JP2012524278A (ja) 2012-10-11
CA2758933A1 (en) 2010-10-21
EP2419737A4 (en) 2013-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102460173A (zh) 组蛋白修饰用于癌症的临床诊断和预后
Huang et al. Long non-coding RNA NKILA inhibits migration and invasion of tongue squamous cell carcinoma cells via suppressing epithelial-mesenchymal transition
Tung et al. miRNA-34c-5p inhibits amphiregulin-induced ovarian cancer stemness and drug resistance via downregulation of the AREG-EGFR-ERK pathway
Khramtsov et al. Wnt/β-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome
Stahl et al. Heterogeneity of amplification of HER2, EGFR, CCND1 and MYC in gastric cancer
Qu et al. The impact of androgen receptor expression on breast cancer survival: a retrospective study and meta-analysis
Karagiannis et al. Signatures of breast cancer metastasis at a glance
Zhu et al. Overexpression of HE4 (human epididymis protein 4) enhances proliferation, invasion and metastasis of ovarian cancer
Nodin et al. Molecular correlates and prognostic significance of SATB1 expression in colorectal cancer
Martín-Pérez et al. Deregulated expression of the polycomb-group protein SUZ12 target genes characterizes mantle cell lymphoma
Zhang et al. Genome wide proteomics of ERBB2 and EGFR and other oncogenic pathways in inflammatory breast cancer
Dibb et al. The FOXM1-PLK1 axis is commonly upregulated in oesophageal adenocarcinoma
Yang et al. TNFAIP 8 overexpression is associated with lymph node metastasis and poor prognosis in intestinal‐type gastric adenocarcinoma
Kawatsu et al. The combination of strong expression of ZNF143 and high MIB-1 labelling index independently predicts shorter disease-specific survival in lung adenocarcinoma
Walsh et al. Global gene repression by the steroid receptor coactivator SRC-1 promotes oncogenesis
Pan et al. Ubiquitin-protein ligase E3C promotes glioma progression by mediating the ubiquitination and degrading of Annexin A7
Zhu et al. Prognostic role of parafibromin staining and CDC73 mutation in patients with parathyroid carcinoma: A systematic review and meta‐analysis based on individual patient data
Hokka et al. Psf3 is a prognostic biomarker in lung adenocarcinoma
Qiu et al. ANKRD22 is involved in the progression of prostate cancer
Lawrence et al. Alterations in the methylome of the stromal tumour microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer
Shi et al. NEDD9 overexpression correlates with the progression and prognosis in gastric carcinoma
Elebro et al. Expression and prognostic significance of human epidermal growth factor receptors 1, 2 and 3 in periampullary adenocarcinoma
Larson et al. Analytical validation of a highly quantitative, sensitive, accurate, and reproducible assay (HERmark®) for the measurement of HER2 total protein and HER2 homodimers in FFPE breast cancer tumor specimens
den Uil et al. Quantitative analysis of CDX2 protein expression improves its clinical utility as a prognostic biomarker in stage II and III colon cancer
Fadia et al. PD-L1 expression in papillary thyroid cancer with and without lymphocytic thyroiditis: a cross sectional study

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120516