CN108367995A - 靶向组蛋白途径以检测和克服蒽环类抗生素耐受性 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于通过鉴别患者中至少一种组蛋白基因的上调来确定癌症患者中耐蒽环类抗生素或不良存活的可能性的方法。

Description

靶向组蛋白途径以检测和克服蒽环类抗生素耐受性
技术领域
本发明涉及组蛋白途径的靶向以评价和克服蒽环类抗生素(蒽环类化合物、蒽环霉素、蒽环类药物，anthracycline)耐受性。
背景技术
乳腺癌是妇女癌症死亡的第二主要原因。大部分患者表现出早期疾病并且进行手术，通常随后再以治愈性目的施用佐剂放射疗法和化疗+/-内分泌疗法或曲妥珠单抗进行治疗；然而，由于患有耐受性疾病，40-50％用佐剂化疗治疗的高风险患者最总会复发(EBCTCG 2005)。即使出现靶向疗法，化疗对于患有转移性疾病的妇女的治疗仍是主要的，这些妇女通常对缓解性化疗起反应，但是由于耐受性，包括对结构上不相关的抗癌药物的交叉耐受性会适时复发(Guo等人2004)。
紫杉烷和蒽环类抗生素广泛用作辅助疗法，并且还在转移性背景中使用。两者靶向快速增殖的癌细胞。紫杉烷干扰微管解聚，从而导致细胞周期阻滞(Ringel and Horwitz1991；Chazard等人1994)，而蒽环类抗生素引起DNA断裂，形成自由基并共价结合拓扑异构酶II-DNA复合物(Minotti等人2004；Minotti等人2004)。紫杉烷和蒽环类抗生素两者均为天然产物并且对多药转运体P-糖蛋白过表达介导的耐受性敏感。公认的体外耐受性机制包括MDR1和MDR2/3的活性，其非特异性结合至多种药物并且主动将它们输出穿过细胞膜(Schinkel等人1991；van der Bliek等人1988)。尽管这导致胞内药物浓度和细胞毒性降低，但是MDR基因的临床相关性仍需确定。其它机制包括拓扑异构酶活性降低(Giaccone等人1992；de Jong等人1990)，Fas配体表达降低(Friesen等人1997)和TP53表达下调(Lowe等人1993)。然而，临床蒽环类抗生素耐受性的驱动分子仍基本上是未知的。申请人先前将作为染色体不稳定性的替代标记物的染色体17(CEP17)上着丝粒区的复制鉴别为临床蒽环类抗生素敏感性的预测标记物(Munro等人2012；Pritchard等人2012；Bartlett等人2015)。然而，鉴别临床中可以靶向的途径以消除蒽环类抗生素-耐受性乳腺癌仍是主要问题。
发明内容
在一个方面中，提供了用于确定癌症患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的方法，其包括：提供来自所述受试者的样品；检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因样品的表达水平；将所检测的至少一种基因的水平与对照样品中至少一种基因的表达水平相比较；并且其中如果与对照样品相比，所述受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则存在蒽环类抗生素耐受性的可能性。
在一个方面中，提供了用于预测癌症患者的存活的方法，其包括：提供来自所述受试者的样品；检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因样品的表达水平；将所检测的至少一种基因的水平与对照样品中至少一种基因的表达水平相比较；和其中如果与对照样品相比，所述受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则存在不良存活的可能性。
在一个方面中，提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在接受蒽环类抗生素并显示出至少一种组蛋白基因上调的癌症患者的治疗中的使用。
在一个方面中，提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在接受蒽环类抗生素的乳腺癌患者的治疗中的使用。
在一个方面中，提供了使乳腺癌患者对蒽环类抗生素敏化或再敏化的方法，其包括向患者施用组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
在一个方面中，提供了包含多种试剂、优选核酸序列的组合物，其中每种试剂用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因样品的表达水平。
在一个方面中，提供了阵列，对于来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的多个基因，其包含与所述基因的表达产物互补且可杂交的一个或多个多核苷酸探针。
在一个方面中，提供了用于确定患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的试剂盒，其包含用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因样品的表达水平的检测试剂和使用说明。
在一个方面中，提供了用于预测癌症患者的存活的试剂盒，其包含用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因样品的表达水平的检测试剂和使用说明。
在一个方面中，提供了结合具有处理器和连接至所述处理器的存储器的计算机使用的计算机程序产品，计算机程序产品包含具有其上所编码的计算机机制(computermechanism)的计算机可读存储介质，其中所述计算机程序机制(computer programmechanism)可以载入所述计算机的存储器并使所述计算机实施根据权利要求1-6中任一项所述的方法。
在一个方面中，提供了确定患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的计算机实施产品，其包含：接收对应于受试者样品中受试者表达谱的值的装置(工具，方式，means)；包含与来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因有关的对照表达谱的数据库；和处理器，其设置用于将受试者表达谱与对照表达谱相比较，并且如果与对照样品相比，存在受试者样品中至少一种基因相对较高的表达水平，则确定蒽环类抗生素耐受性的可能性。
在一个方面中，提供了预测癌症患者的存活的计算机实施产品，其包含：接收对应于受试者样品中受试者表达谱的值的装置；和包含与来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因有关的对照表达谱的数据库；和处理器，其设置用于将受试者表达谱与对照表达谱相比较，并且如果与对照样品相比，存在受试者样品中至少一种基因相对较高的表达水平，则确定存在不良存活的可能性。
附图说明
在参考附图的下列详细说明中，本发明优选实施方式的这些和其它特征将变得更显而易见，其中：
图1显示了表柔比星-耐受性细胞系的鉴定。将天然和耐受性细胞暴露于范围在0.3nM至3000nM的药物浓度。通过CCK-8测定在72h后确定细胞存活力。A)将相对于DMSO对照的活细胞百分比对表柔比星浓度作图。黑色＝天然细胞，深红色＝耐受性细胞。B)以nM浓度为单位的IC50值±标准偏差。括号中显示了耐受性因子并且它表示耐受性IC50/天然IC50。
图2显示了常规乳腺癌生物标记物的表达和对多重耐受性基因的选择。在补充有Complete Mini蛋白酶抑制剂和PhosSTOP磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中制备细胞裂解液。将10-50μg总蛋白在10％凝胶(MDR1)、4-20％预制凝胶(EGFR、ER、PgR、TOPOIIα)和Any kD预制凝胶(HER2、HER3)上电泳，然后转移至PVDF膜并使用化学发光底物显像。Nat＝天然；Epi-R＝表柔比星耐受性。
图3显示耐受性细胞系克服表柔比星-引起的G2/M阻滞。(A-D)通过胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步并用DMSO或处于对每个耐受性细胞系所建立的选择剂量的表柔比星处理细胞：MDA-MB-231，25nM表柔比星；MCF7，30nM表柔比星；SKBR3，15nM表柔比星和ZR-75-1，15nM表柔比星。对于MCF7和SKBR3细胞，表柔比星浓度提高至100nM，这是因为在较低的表柔比星剂量下未观察到G2/M阻断。在48h收集细胞，通过PI染色并通过流式细胞术分析。排除碎片。
图4显示了表柔比星-耐受性细胞系的基于网络的分析。A)乳腺癌细胞系中表达显著变化的基因的文氏图。B)从功能相互作用网络分析鉴别的组蛋白组件。彩色圆环表示在所有4个系中显示出一致变化的基因。红色圆环(较深)＝上调基因，绿色圆环(较浅)＝下调基因，菱形＝接头基因。C)对分离自天然和表柔比星-耐受性细胞系的RNA进行qRT-PCR。柱状图表示平均定量平均值，而误差线代表SEM。使用非配对t检验计算p-值；ns＝不显著。D)天然和表柔比星-耐受性细胞系中总H2A和H2B组蛋白的免疫印迹。将GAPDH用作管家对照。E)在部分B中所示的组件内显著富集的Reactome途径。
图5显示组蛋白基因敲低不足以使乳腺癌细胞对表柔比星再敏化。用30nM靶向HIST1H2AC和HIST1H2BK的每个siRNA(Dharmacon,Waltman,USA)转染总计7×104个ZR75-1EpiR细胞和MDA-MB-231EpiR细胞(为简单起见，未显示个体敲低)。阴性对照包括仅培养基、仅脂质体或用非靶向siRNA的转染对照。表4显示了基因表达敲低的百分比。B)使用非线性回归分析产生IC50值并对两个独立实验的平均值作图。误差线表示标准偏差。
图6显示组蛋白组件是蒽环类抗生素疗法的生物标记物。在其中用标准化疗(CMF)或含蒽环类抗生素化疗(E-CMF)治疗患者的BR9601试验中，测试了组蛋白组件的高表达和低表达与长期无复发存活(DRFS)和整体生存(OS)之间的关系。A)相对于CMF，对于用E-CMF治疗的患者，DRFS和OS分成高或低组蛋白基因表达组。B)对于HER2状态、ER状态、节状态、分级和年龄，调整后通过标记物分析的多变量处理。HR＝危险比，CI＝置信区间。
图7显示表柔比星-耐受性细胞系中HDAC抑制剂引起细胞毒性。A)对于耐受性细胞系细胞毒性更强(对于MDA-MB-231，普西司他；对于MCF7，ST-2-92；对于SKBR3，oxamflatin)或者在天然和表柔比星-耐受性细胞(ZR-75-1)之间无选择性差异的抑制剂的实例。表5显示了IC50值。B)参与表柔比星耐受性的分子机制的工作模型。存在三种HDACi使细胞对表柔比星敏化的提议机制：1)通过抑制子和促凋亡基因的转录激活，2)通过耐受性基因的抑制和3)由于对DNA的可接近性提高。
图8显示了临床试验BR9601的信息。A)对分析可用的患者样品的示意图。B)对于组蛋白分析可用的患者信息。
图9A-图9D共同显示了来自61个一致变化基因的整个功能相互作用网络。红色(较深)圆环＝上调基因；绿色(较浅)圆环＝下调基因；菱形＝接头基因。当分别如下所示按象限：左上、左下、右上、右下布置时，图9A-图9D构成一个图。
图10显示了四个乳腺癌细胞系中61个一致变化基因的探针的热图。用基因符号和微阵列探针ID标记行。A)原始表达值。B)行缩放的表达值。
图11显示了预处理方法的组合。所选择的最优方法位于顶部，通过黑色表示(高排名)。
图12通过基因热图显示样品。行代表患者，列代表基因。使用Ward聚类算法对患者和基因聚类分析。
图13显示了从组蛋白组件产生的功能相互作用网络。圆环＝组件内的基因，菱形＝接头基因。
图14显示了多曲线图(multiplot)，其显示了每个组蛋白基因缩放的mRNA丰度水平。对每个基因，用通过标记物相互作用治疗(treatment-by-marker interaction)Cox比例风险模型拟合，并且在右侧以正方形表示危险比(HR)和部分末端表示log2尺度(log2scale)中的95％置信区间来显示结果。按照DRFS事件在x轴上对患者分类，并且按照log2HR降低在y轴上对基因分类。
具体实施方式
在以下说明中，描述了多个细节以提供对本发明的透彻理解。然而，应理解可以在没有这些细节的情况下实践本发明。
乳腺癌中的耐受性是通过化疗有效治疗的主要障碍。尽管多重耐受性(MDR)基因的上调是多种癌症中耐受性的关键部分，但是非MDR驱动的耐受性途径的复杂性和层级基本上仍是未知的。本研究旨在建立蒽环类抗生素耐受性乳腺癌细胞系以阐明驱动耐受性的机制，这可以在临床试验群组中测试。选择细胞系以反映四个主要乳腺癌亚型(Perou等人2000；Sorlie等人2001)：MCF7(ER+HER2-，管腔A型(luminal A))、ZR-75-1(ER+HER2+，管腔B型(luminal B))、SKBR3(ER-HER+，HER2-扩增型)和MDA-MB-231(ER-/PR-/HER2-，三重阴性)，并将其暴露于提高浓度的表柔比星直至产生耐受性细胞。为了鉴别驱动表柔比星耐受性的机制，研究人员使用了包括基因表达分析在内的互补方法来鉴别参与耐受性的信号途径，并使用小分子抑制剂来逆转耐受性。申请人表明组蛋白H2A和H2B的过表达与表柔比星耐受性有关，并且靶向组蛋白途径的小分子抑制剂逆转耐受性并在所有表柔比星耐受性细胞系中引起细胞毒性。最重要地，在BR9601临床试验中将所鉴别的耐受性机制概括为与具有相同组件(模块，module)高表达的患者相比，具有低组蛋白组件(histone module)表达的患者受益于蒽环类抗生素治疗(HR：0.35，95％CI 0.13-0.96，p＝0.042)。因此，我们的研究鉴别染色质重塑代表了乳腺癌中蒽环类抗生素耐受性的重要机制，并且建立了在全部四种乳腺癌亚型中研究蒽环类抗生素耐受性的可靠体外模型系统；由于小分子抑制剂可以靶向组蛋白修饰，因此它提供了逆转临床蒽环类抗生素耐受性的可能方式。
在一个方面中，提供了用于确定癌症患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的方法，其包括：提供来自所述受试者的样品；检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因样品的表达水平；将所检测的至少一种基因的水平与对照样品中至少一种基因的表达水平相比较；和其中如果与对照样品相比，所述受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则存在蒽环类抗生素耐受性的可能性。
在一个方面中，提供了用于预测癌症患者的存活的方法，其包括：提供来自所述受试者的样品；检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因样品的表达水平；将所检测的至少一种基因的水平与对照样品中至少一种基因的表达水平相比较；和其中如果与对照样品相比，所述受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则存在不良存活的可能性。
存在五个主要组蛋白家族：H1/H5、H2A、H2B、H3和H4[2][4][5]。组蛋白H2A、H2B、H3和H4被称为核心组蛋白，而组蛋白H1和H5被称为接头组蛋白。
H1家族包括H1F亚家族，其包含H1F0、H1FNT、H1FOO和H1FX；和H1H1亚家族，其包含HIST1H1A、IST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E和HIST1H1T。
H2A家族包括H2AF亚家族，其包含H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2和H2AFZ；H2A1亚家族，其包含HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2AI、HIST1H2AJ、HIST1H2AK、HIST1H2AL和HIST1H2AM；H2A2亚家族，其包含HIST2H2AA3、HIST2H2AC。
H2B家族包含H2BF亚家族，其包含H2BFM、H2BFS和H2BFWT；H2B1亚家族，其包含HIST1H2BA、HIST1H2BB、HIST1H2BC、HIST1H2BD、HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2BI、HIST1H2BJ、HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN和HIST1H2BO；和H2B2亚家族，其包含HIST2H2BE。
H3家族包括H3A1亚家族，其包含HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I和HIST1H3J；H3A2亚家族，其包含HIST2H3C；和H3A3亚家族，其包含HIST3H3。
H4家族包括H41亚家族，其包含HIST1H4A、HIST1H4B、HIST1H4C、HIST1H4D、HIST1H4E、HIST1H4F、HIST1H4G、HIST1H4H、HIST1H4I、HIST1H4J、HIST1H4K和HIST1H4L；和H44亚家族，其包含HIST4H4。
可以通过多种癌症实践本文所述的方面。在一些实施方式中，所述癌症是多重耐受性癌症。癌症可以包括肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS肿瘤、乳腺癌、卡斯特莱曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤，胃肠基质肿瘤(GIST)、妊娠期滋养细胞病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和舌癌、白血病、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症和胚胎性癌肉瘤。
如本文所使用的术语“表达水平”是指生物标记物产物可测量的表达水平，无限制地如所表达的信使RNA转录本的水平或者转录本的特定外显子或其它部分的水平、生物标记物的所表达的蛋白或其部分的水平、生物标记物的DNA多态性的数目或存在、生物标记物的酶活力或其它活力和特定代谢产物的水平。
另外，本领域技术人员将理解一些方法可以用于确定本发明生物标记物的蛋白产物的量，其包括免疫测定，如免疫印迹、ELISA和免疫沉淀，在此之后进行SDS-PAGE和免疫细胞化学。
如本文所使用的，术语“对照”是指可以用于值，例如，得自与结局种类有关的测试样品的表达水平或参考表达谱的预测或分类的具体的值或数据组。本领域技术人员将理解测试样品中生物标记物的表达和对照中生物标记物的表达之间的比较将取决于所使用的对照。
如本文所使用的术语“差异表达的”或“差异表达”是指可以通过测量生物标记物产物的表达水平测定的生物标记物表达水平的差异，如生物标记物的所表达的信使RNA转录本或其部分或者所表达的蛋白的水平差异。在优选的实施方式中，所述差异是统计学显著的。术语“表达水平的差异”是指给定生物标记物可测量的表达水平的升高或降低，例如，如通过与对照中给定生物标记物可测量的表达水平相比，样品中信使RNA转录本的量和/或蛋白质的量所测量的。
如本文所使用的术语“样品”是指可以测定生物标记物表达产物和/或参比表达谱，例如，受试者中差异表达的基因的来自受试者的任何液体、细胞或组织样品。
在一些实施方式中，至少一种组蛋白基因来自H2A或H2B家族，其优选地选自由H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2、H2AFZ、HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2AI、HIST1H2AJ、HIST1H2AK、HIST1H2AL、HIST1H2AM、HIST2H2AA3、HIST2H2AC、H2BFM、H2BFS、H2BFWT、HIST1H2BA、HIST1H2BB、HIST1H2BC、HIST1H2BD、HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2BI、HIST1H2BJ、HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN、HIST1H2BO和HIST2H2BE；或它们的任意组合组成的组。
在一些实施方式中，至少一种组蛋白基因是HIST1H2AC、HIST1H2BK、HIST1H2BD或它们的任意组合。
在一些实施方式中，至少一种组蛋白基因包括表7中的任何基因或它们的组合。在一个实施方式中，至少一种组蛋白基因包括表7中所有的基因。
在一些实施方式中，如果与对照样品相比，受试者样品中存在至少一种基因相对较高的表达水平，则方法还包括使用不包含蒽环类抗生素的辅助疗法治疗患者。
在一些实施方式中，如果与对照样品相比，受试者样品中存在至少一种基因相对较高的表达水平，则方法还包括向患者施用蒽环类抗生素以及至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因的抑制剂。
在一些实施方式中，抑制剂是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，优选地帕比司他、奎诺司他、吉维司他、阿贝司他、普西司他、贝利司他、莫西司他、组蛋白脱乙酰酶抑制剂A、CAY10603、Oxamflatin、曲古抑菌素A、Sciptaid、CBHA或达西司他。
在一些实施方式中，癌症是乳腺癌、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌或肺癌。在一个实施方式中，乳腺癌是早期乳腺癌，优选地选自以下亚型：ER+HER2-，管腔A型；ER+HER2+，管腔B型；ER-HER2+，HER2-扩增型和ER-/PR-/HER2-，三重阴性。
在一些实施方式中，蒽环类抗生素是柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、戊柔比星或米托蒽醌，优选地，表柔比星。
在一个方面中，提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在接受蒽环类抗生素并显示出至少一种组蛋白基因上调的癌症患者的治疗中的用途。
在一个方面中，提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在接受蒽环类抗生素的乳腺癌患者的治疗中的用于。
在一个方面中，提供了使乳腺癌患者对蒽环类抗生素敏化或再敏化的方法，其包括向患者施用组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
在一个方面中，提供了包含多种试剂，优选地核酸序列的组合物，其中每种试剂用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因样品的表达水平。
在一个方面中，提供了阵列，对于来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的多个基因，其包含与基因的表达产物互补且可杂交的一个或多个多核苷酸探针。
在一个方面中，提供了用于确定患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的试剂盒，其包含用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因样品的表达水平的检测试剂和使用说明。
在一个方面中，提供了用于预测癌症患者的存活的试剂盒，其包含用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因样品的表达水平的检测试剂和使用说明。
在一个方面中，提供了结合具有处理器和连接至处理器的存储器的计算机使用的计算机程序产品，计算机程序产品包含具有其上所编码的计算机机制的计算机可读存储介质，其中计算机程序机制可以载入计算机的存储器并使计算机实施根据权利要求1-6中任一项的方法。
在一个方面中，提供了确定患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的计算机实施产品，其包含接收对应于受试者样品中受试者表达谱的值的装置；包含与来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因有关的对照表达谱的数据库；和处理器，其设置用于将受试者表达谱与对照表达谱相比较，并且如果与对照样品相比，存在受试者样品中至少一种基因相对较高的表达水平，则确定蒽环类抗生素耐受性的可能性。
在一个方面中，提供了预测癌症患者的存活的计算机实施产品，其包含：接收对应于受试者样品中受试者表达谱的值的装置；和包含与来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因有关的对照表达谱的数据库；和处理器，其设置用于将受试者表达谱与对照表达谱相比较，并且如果与对照样品相比，存在受试者样品中至少一种基因相对较高的表达水平，则确定存在不良存活的可能性。
如本文所使用的，“药物可用的载体”表示任何和所有生理学相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物可用的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。在一些情况下，优选地在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。药物可用的载体还可以包括少量的助剂物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其提高了药理学试剂的货架期或有效性。
如本文所使用的，“治疗有效量”是指以所需剂量和特定时间段对于实现所期望的治疗结果有效的量。药理学试剂的治疗有效量可以根据以下因素改变，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及药理学试剂在个体中引起所期望的反应的能力。治疗有效量还是其中与治疗有益作用相比，药理学试剂的任何毒性或不利作用是微不足道的量。
通过以下实施例，进一步说明了本发明的优势。仅出于说明的目的提供了在本文中描述的实施例以及它们的具体细节，并且不应将这些视为对本发明的权利要求的限制。
实施例
方法和材料
BR9601试验
BR9601试验招募了374位绝经前和绝经后妇女，其具有完全切除的组织学确认的乳腺癌和明确的佐剂化疗指示。将患者在每21天的8个CMF循环(静脉内环磷酰胺750mg/m2、甲氨蝶呤50mg/m2和5-氟尿嘧啶600mg/m2)和E-CMF(每21天4个表柔比星100mg/m2的循环，然后是4个相同的CMF治疗方案的循环)之间随机分组(Poole等人2006)(图8)。通过中央和地方伦理委员会批准该规程，并且在随机分组前每位患者提供书面知情同意。对于当前的分析，取回组织块并提取RNA。BR9601研究的主要结局为RFS和OS，尽管还报道了长期无复发的存活(Poole等人2006)。
细胞培养
乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，MCF7，ZR-75-1，SKBR3)购自ATCC并在补充有10％热失活的胎牛血清和1％L-谷氨酰胺(Gibco,Burlington,Canada)的DMEM(除SKBR3在RPMI中培养之外)中培养。通过将天然细胞暴露于初始浓度设置为0.5nM的提高浓度的表柔比星来产生表柔比星-耐受性细胞系。当IC50值取代相应天然细胞系的IC50值且耐受性细胞不能耐受药物浓度的进一步提高时，定义为耐受性。通过将细胞暴露于范围在0.3-3000nM的药物浓度72h来确定耐受性和交叉耐受性。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8,Dojindo,Cedarlane,Burlington,Canada)确定细胞存活力。在GraphPad Prism5中计算IC50。
流式细胞术
对于细胞周期，通过胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步(Whitfield等人2000)并与对每个细胞系所建立的DMSO或表柔比星剂量潜伏：MDA-MB-231 25nM；MCF7 30nM；SKBR315nM；ZR-75-1 10nM。在48h收集细胞，用80％乙醇固定并在分析之前，与2mg/ml RNA酶A和0.1mg/ml碘化丙啶(两者均来自Sigma,Oakville,Canada)培育。对于细胞凋亡实验，用DMSO或上述浓度的表柔比星处理细胞，并在72h收集细胞用于使用膜联蛋白V细胞凋亡-检测eFluor450(eBioscience,San Diego,USA)的染色。通过FACSCanto II和FACSDiva(BDBiosciences,Mississauga,Canada)收集数据，并通过FlowJo(Treestar,Ashland,USA)分析。
增殖
在存在或不存在表柔比星的情况下培养细胞长达96h(表柔比星浓度参见流式细胞术)。在24、48、72和96小时收集细胞并通过ViCell(Beckman Coulter,Mississauga,Canada)计数。在GraphPad Prism5软件中分析数据。
微阵列
通过加拿大多伦多的UHN微阵列中心，将Illumina人HT-12-V4珠芯片用于全基因组微阵列分析。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Toronto,Canada)提取总RNA并将其用于绘制基因表达变化谱图。使用简单缩放归一化(Simple Scaling Normalization)，通过R3.0.0lumi软件包将原始数据归一化；使用genefilter软件包，保留10％最大可变探针(most variable probes)用于差异分析。通过0.05的Benjamini-Hochberg修正的P-截止值，使用limma鉴别差异表达的探针。
基于网络的分析
为了鉴别功能相关组件，使用Cytoscape 2.8.3中的Cytoscape Reactome功能相互作用(FI)插件分析表现出一致的显著表达变化方向性的基因。作为基因集和相互作用，从FI 2012网络版加载符号，包括FI注释和接头基因。使用光谱聚类分析和使用ReactomeFI插件功能对每个组件计算的途径富集鉴别网络组件。将显示出FDR值<0.01的Reactome途径认为是富集的。
药物抑制剂
通过安大略癌症研究所(OICR,Toronto,Canada)的药物发现研究组(DrugDiscovery group)提供所有抑制剂。以1000-1500个细胞/孔将细胞接种到384-孔板(Greiner,Mississauga,Canada)中。24h后，使用D300数字化合物分配器(HP/Tecan,SanJose,USA)将耐受性细胞暴露于处于所建立的选择剂量(参见流式细胞术)的表柔比星，然后暴露于处于范围在0.0026-10μM的12个浓度的溶于DMSO的HDACi；最终药物溶液中的DMSO浓度不超过0.5％。72h之后，使用CellTiter-Glo细胞存活力发光测定(Promega,Madison,USA)和Wallac EnVision 2104多模式读板仪(Multilabel Reader)(Perkin-Elmer,Woodbridge,Canada)确定抑制剂的影响。将原始数据归一化至阴性(介质)和阳性(20μM星孢菌素)对照并在GraphPad Prism5中分析。
定量RT-PCR
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Toronto,Canada)从培养的细胞系分离RNA。根据生产商的规程(Life Technologies,Burlington,Canada)，使用TaqMan基因表达测定(HIST1H2BD-Hs00371070_m1；HIST1H2BK-Hs00955067_g1；HIST1H2AC-Hs00185909_m1)和EXPRESS One-Step Superscript qRT-PCR通用试剂盒分析总计20ng RNA。使用AppliedBiosystems Viia 7实时PCR仪和软件(Life Technologies,Burlington,Canada)进行反应；根据由对照Universal Human Reference RNA样品(Agilent,Mississauga,Canada)所产生的标准曲线定量转录本水平。使用非配对t检验确定统计显著性。
免疫印迹法
在补充有Complete Mini蛋白酶和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche,Laval,Canada)的RIPA缓冲液中制备全细胞裂解液(WCL)。对于细胞系鉴定，将10-50μg总蛋白在4-20％Mini-Protean TGX预制凝胶(Bio-Rad，Mississauga,Canada)上电泳。对于组蛋白，在0.1％NP40-PBS中收集细胞以释放核。通过添加相等体积的补充有25单位全能核酸酶(benzonasenuclease)(Sigma-Aldrich,Oakville,Canada)和Complete Mini蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Laval,Canada)的2×RIPA缓冲液，在冰上培育30分钟并以30-秒开关间隔超声处理15分钟制备WCL。将20μg WCL在12％凝胶上电泳。表6中提供了在免疫印迹中使用的一抗列表。使用BM化学发光印迹底物POD(Roche,Laval,Canada)和ChemiDoc成像系统(Bio-Rad,Mississauga,Canada)使信号显像。
ZR75-1和MDA-MB-231耐受性细胞的RNAi转染
均根据生产商的说明，用脂质体RNAiMAX(Invitrogen,Canada)和30nM靶向HIST1H2AC、HIST1H2BK的siRNA(Dharmacon,Waltman,USA)转染总计7×104个ZR75-1EpiR细胞和MDA-MB-231EpiR细胞。阴性对照包括仅培养基、仅脂质体或用非靶向siRNA的转染对照。在48h收集RNA并如上通过qRT-PCR进行分析；在GraphPad Prism5中产生IC50值。
nCounter代码集和数据预处理
nCounter基因表达代码集包括组蛋白组件内的7个基因和在Kegg途径中鉴别对于组蛋白功能重要的11个其它基因(表7)(Kanehisa等人2014)；由于探针交叉杂交至其它基因，因此代码集不包括HIST1H2AC。所有18个基因是功能相关的(图13)。根据生产商的说明(NanoString Technologies,Seattle,USA)，在nCounter上处理mRNA代码集。使用NanoStringNorm R软件包预处理原始mRNA丰度数据。如前，评价了一定范围的预处理方案以优化归一化参数(Sabine等人，已投稿)。
存活模型
为了评价单个基因是否预测存活，将每个基因中值二分成低和高表达组，并用单变量Cox比例风险模型拟合(图14)。临床变量的存活分析将年龄作为二元变量(在年龄>50二分)建模，而将节状态、病理分级、ER状态和HER2状态作为有序变量建模(图8B)。将肿瘤尺寸作为连续变量。
mRNA网络分析
研究人员假设整合分子组件可以相对于DRFS)和OS改善残癌风险预测。对于每个组件，研究人员计算了在单变量Cox比例风险模型中使用的“组件-失调得分”(MDS；方法)。应用了分层5-折交叉验证法；使用10-年DRFS作为终点，在训练群组中训练模型并在k-th测试群组中验证。使用存活软件包(v2.37-7)，在R统计环境中对DRFS和OS实施全部存活建模。使用Cox比例风险模型计算通过标记物相互作用项的处理。
mRNA丰度数据处理
使用R软件包NanoStringNorm(v1.1.19)预处理原始mRNA丰度计数数据。总的来说，评价了252个预处理方案，包括使用了6个阳性对照，8个阴性对照和6个管家基因(TRFC、TBP、GUSB、TMED10、SF3A1和PUM1)，然后进行全局归一化(图11)。如前，研究人员使用了两种标准来帮助鉴别最优预处理参数(Sabine等人，已投稿)。首先，基于使HER2-阳性和HER2-阴性患者之间的ERBB2mRNA丰度水平的欧氏距离最大化的能力，将预处理方案的252个组合中的每一个排名。对于稳健性，对每个预处理方案，对100万个HER2-阳性和HER2-阴性样品的随机子集重复整个过程。第二，研究人员包括了从随机选择的匿名FFPE乳腺瘤样品提取的RNA混合物的5个重复；在本文中，基本原则是评价不同预处理方案中每一个的批次内变化并对它们排名(Sabine等人，已投稿)。对于该评价，使用了混合效应线性模型，并将残差估计用作批次内变化的量度(R软件包：nlme v3.1-120)。最后，研究人员基于两种标准使用RankProduct(Breitling等人2004)估计了累积排名，并使用对于样本含量来源于最高的75个表达基因的几何平均数，然后通过分位数归一化(quantile normalisation)鉴别了最优预处理方案(图12)。在QAQC之后，未除去样品。重复进行6个样品，并且将它们的原始计数取平均值并随后当做单一样品。
组件失调得分(MDS)
如前(Sabine等人，已投稿；Haider等人，已投稿)，使用两步处理法对预定功能组件打分。首先，通过拟合多变量Cox比例风险模型估计所有基因的权重(β)，并且权重得自通过标记物相互作用项的处理(仅训练群组)。然后，将这些权重应用于缩放的mRNA丰度谱以使用以下等式1估计每个患者组件失调得分：
其中n代表给定组件中基因的数目，并且Xi是基因i的缩放的(Z-得分)丰度。随后在多变量Cox比例风险模型中和临床协变量一起使用MDS。
存活建模
使用分层5-折交叉验证法，将每个训练组内患者的MDS谱(等式1)用于拟合单变量Cox比例风险模型。将通过单变量模型估计的参数应用于每个折的测试集中逐患者的MDS以产生每个患者的风险得分。基于来源于每个训练组的中值阈值，将这些连续风险得分二分，并通过Kaplan-Meier分析评价所得二分组。使用截短至10年作为终点的DRFS训练和验证模型。
结果与讨论
表柔比星-耐受性乳腺癌细胞系的产生和鉴定。
从表柔比星-敏感性天然细胞系MDA-MB-231、MCF7、SKBR3和ZR-75-1产生的耐受性细胞系显示出对表柔比星耐受性7-至67-倍的提高。研究人员测试了表柔比星-耐受性细胞系是否对乳腺癌临床试验中使用的药物多柔比星、紫杉醇、多西他赛、SN-38和卡铂具有交叉耐受性。所有4种表柔比星-耐受性细胞系耐受多柔比星(图1B)。而MDA-MB-231、MCF7和ZR-75-1表柔比星-耐受性细胞不耐受紫杉烷，SKBR3表柔比星-耐受性细胞对紫杉醇和多西他赛两者交叉耐受(图1B)。MDA-MB-231和SKBR3细胞对SN-38交叉耐受，而MCF7和ZR-75-1仅耐受少量提高的SN-38浓度。细胞系无一对卡铂交叉耐受(图1B)。
表柔比星-耐受性细胞显示在EGFR、HER2和HER3表达水平中无明显变化(图2)；与天然细胞相比，表柔比星-耐受性ZR-75-1细胞中ER和PR的表达轻微降低。MDR1仅在耐受性SKBR3细胞中上调，这可以解释它们对紫杉烷的交叉耐受性(图1B)。TOPOIIα表达在表柔比星-耐受性ZR-75-1细胞中下调(图2)；在表柔比星-耐受性MDA-MB-231和MCF7细胞系中，未观察到MDR或TOPOIIα的变化。这些结果表明对于四个细胞系中的三个，蒽环类抗生素耐受性不是MDR-驱使的，并且相对于常规乳腺癌生物标记物的表达，表柔比星-耐受性细胞系保持不变。
为了确定细胞-倍增时间，研究人员在存在或不存在表柔比星的情况下培养细胞长达96h。在不存在表柔比星的情况下，天然MDA-MB-231和MCF7细胞群体分别每25h和29h倍增(表2)，而天然SKBR3和ZR-75-1细胞生长的更缓慢，其分别每45h和50h倍增。在存在表柔比星的情况下，对于天然细胞来说，MDA-MB-231的倍增时间提高2.8-倍(p＝0.0371)，MCF7提高2.5-倍(ns)，SKBR3提高1.3-倍(p＝0.0494)并且ZR-75-1提高1.9-倍(p＝0.0258)。与天然细胞系相反，耐受性细胞的倍增时间无明显变化，这与是否添加表柔比星无关(表2)。有趣地，在不存在表柔比星的情况下，耐受性细胞的增殖无一像天然细胞一样快，这表明表柔比星选择在耐受性细胞中引起了永久变化。
蒽环类抗生素-耐受性细胞中受损的细胞凋亡
为了评价表柔比星对细胞凋亡的影响，在暴露于表柔比星72h后通过流式细胞术对凋亡细胞打分。与天然对照相比，耐受性细胞的凋亡指数一直较低(表1)。具体地，MDA-MB-231和SKBR3耐受性细胞需要显著较高的表柔比星浓度(1000nM)来引起细胞凋亡；即使在该表柔比星浓度，与天然细胞相比，凋亡指数仍几乎低50％(表1)。
耐受性细胞系克服了表柔比星-引起的G2/M阻滞
在暴露于DMSO或表柔比星之前使细胞同步。所有DMSO-处理的细胞系进行通过细胞周期(图3)。当分别将25nM和10nM表柔比星加入至MDA-MB-231和ZR-75-1细胞系中时，天然细胞阻滞在G2/M期，而耐受性细胞进行通过(图3A，C)。当分别将30nM和15nM表柔比星加入至MCF7和SKBR3细胞系时，研究人员仅观察到对细胞周期适中的影响(图3B，D)；这需要将表柔比星浓度提高至100nM，在该浓度天然细胞被阻滞在G2/M期，但对表柔比星-耐受性细胞影响最小(图3B，D)。因此，克服G2/M阻断可以是导致表柔比星耐受性的过程的一部分。
基因表达分析将含有组蛋白H2A和H2B的途径鉴别为表柔比星耐受性的潜在功能驱动分子
全基因组表达分析显示209个共同基因在全部四对天然和表柔比星-耐受性细胞系之间差异表达(图4A)。其中，在全部四个细胞系中，61个基因在相同方向调控：26个基因一致上调，35个一致下调(表3，图4)。将这61个基因用于产生基因相互作用网络并鉴别参与表柔比星耐受性的候选途径。将接头基因的最小集用于连接网络。标识网络内的群集基因揭示了四个组件(图9)；然而，仅组件I和II含有显著富集的途径注释，其错误发现率(FDR)<0.01。组件I含有三种组蛋白基因(HIST1H2AC、HIST1H2BK、HIST1H2BD)和参与RNA加工和有丝分裂的一些基因(图4B)。重要地，全部三个组蛋白基因在全部四个细胞系中上调并且在无接头基因的情况下直接互相连接。在组件I内，显著富集的途径包括细胞-周期调控(图4E)，这与我们在图3中的结果一致。组件II含有参与极光激酶A信号转导的三个直接连接的基因(TACC3、AURKA、NFKBIA)；而NFKBIA上调，TACC3和AURKA下调。
研究人员关注含有组蛋白的组件1，这是因为全部三个组蛋白上调，在无接头基因的情况下紧密互相连接并且参与一些分子途径。通过qRT-PCR验证所有三个组蛋白转录本的水平升高(图4C)。由于对单个组蛋白变体特异的抗体不可商购，因此研究人员使用泛H2A和H2B抗体评价了蛋白表达；研究人员在耐受性和天然细胞系之间未观察到总H2A和H2B水平的差异(图4D)。总的来说，我们的发现表明组蛋白上调是与乳腺癌细胞中表柔比星耐受性有关的常见事件，并且组蛋白-相关途径可能是表柔比星耐受性的功能驱动分子。
组蛋白基因敲低不足以使乳腺癌细胞对表柔比星再敏化
研究人员在MDA-MB-231和ZR-75-1耐受性细胞中实施了一系列基因敲低实验，其中在将细胞暴露于表柔比星之前，将HIST1H2AC、HIST1H2BK或两者沉默。由于该变体的高转录本水平与我们的电子分析中乳腺癌患者的不良存活有关(数据未显示；对于在线工具，参见参考文献(Gyorffy等人，2010))，因此选择HIST1H2BK而不是HIST1H2BD。在基因敲低后，实施增殖测定以评价耐受性细胞是否对表柔比星再敏化。通过qRT-PCR确认组蛋白转录本的减少并在表4中总结。有趣地，任一种组蛋白单独或两者瞬时敲低不会使细胞系对表柔比星再敏化(图5并且数据未显示)。结果表明一个或两个组蛋白基因的下调不足以逆转表柔比星耐受性，并且未来的方法可以靶向组蛋白组件内的多个分子。
组蛋白组件是蒽环类抗生素敏感性的临床标记物
不管所分配的佐剂化疗，对整个BR9601临床群组测试了18-基因组蛋白组件的预测意义。高组蛋白组件表达与长期无复发存活的降低有关(DRFS；HR：2.64，95％CI 1.7-4.09，p＝1.44×10-5)，这表明组蛋白组件升高预测了不良存活。
然后，通过评价危险比和通过标记物相互作用的处理，研究人员分析了BR9601试验中接受蒽环类抗生素(E-CMF)的患者和单独施用CMF的患者之间组蛋白组件对乳腺癌-特异性整体存活(OS)和DRFS的差异作用。与单独用CMF治疗的患者相比，当用E-CMF治疗时，肿瘤具有低基因表达的患者的OS提高(HR：0.38，95％CI 0.19-0.76，p＝0.005)；相反，在高组蛋白组件表达的患者中，对于OS，E-CMF相对于CMF无明显差异益处(HR：0.97，95％CI 0.57-1.64，p＝0.91)(图6A)。类似地，与单独用CMF治疗的患者相比，当用E-CMF治疗时，肿瘤具有低组蛋白组件表达的患者的OS提高(HR：0.35，95％CI 0.17-0.73，p＝0.0048)；在高组蛋白组件表达的患者中，对于DRFS，E-CMF相对于CMF无明显差异益处(HR：0.96，95％CI 0.58-1.59，p＝0.87)。在多变量分析中，在对HER2状态、节状态、年龄、分级和ER状态调整后，通过标记物相互作用的处理对OS未显示出统计学差异(HR：0.50，95％CI 0.19-1.31，p＝0.159)；然而，与高表达患者相比，低组蛋白组件基因表达的患者中，DRFS的可能性保持较低(HR：0.35，95％CI 0.13-0.96，p＝0.042)(图6B)。
HDAC抑制剂在表柔比星-耐受性细胞系中引起细胞毒性
基因表达分析将组蛋白组件鉴别为显著改变的并且是表柔比星耐受性可能功能上所需的。因此，研究人员使用逆转组蛋白低乙酰化并允许转录激活的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂测试了组蛋白活性变化是否可以使细胞对表柔比星敏化。对天然和表柔比星-耐受性细胞系测试了24种HDAC抑制剂(HDACi)；对于耐受性细胞系，在存在表柔比星的选择剂量的情况下测试了所有抑制剂。将阳性采样数定义为在至少50％的群体中显示出细胞毒性并且在全部八个细胞系中IC50<5μM的化合物。因此，14个HDACi对全部天然和表柔比星-耐受性细胞系具有细胞毒性(表5)。重要地，当提供一些HDACi时，4个耐受性细胞系中的3个比天然细胞对表柔比星更敏感。例如，与天然细胞系相比，对于MDA-MB-231，普西司他的细胞毒性更强，对于MCF7，ST-2-92更强，对于SKBR3表柔比星-耐受性细胞，oxamflatin更强(图7A)；对于所测试的任何细胞毒性HDACi，在天然和表柔比星-耐受性ZR-75-1细胞之间未观察到差异(图7A)。由于抑制剂靶向不同的HDAC并且抑制剂中无一使全部4个耐受性细胞系普遍再敏化(表5)，因此似乎不同种类的HDAC以乳腺癌-亚型特异的方式参与蒽环类抗生素耐受性。总的来说，我们的数据揭示了组蛋白先前未识别的作用并且表明H2A和H2B组蛋白参与临床蒽环类抗生素耐受性。
蒽环类抗生素耐受性是乳腺癌妇女有效治疗的主要障碍。尽管多种机制可能有助于蒽环类抗生素耐受性，包括药物转运体的激活，TOPOIIα活性降低和细胞凋亡抑制，但是参与临床耐受性的主要分子机制仍是未知的。使用代表乳腺癌主要分子亚型的一组四对细胞系，研究人员显示在表柔比星耐受性细胞系中一致观察到了参与染色体维持、表观遗传途径、细胞分裂和基因调控的组蛋白失调(deregulation)。然后，在BR9601佐剂临床试验群组中临床验证了该观察结果。
组蛋白调节异常与细胞周期进程提高，具体地，在存在表柔比星的情况下G2/M细胞周期阻断解除和凋亡性细胞死亡减少有关。有趣地，可能由于两种原因，有助于调节异常特征的两种组蛋白变体的转录敲低不能使细胞对蒽环类抗生素再敏化。首先，尽管转录本水平减少了6-53％，但是在我们的实验窗期间，蛋白水平保持不变是可能的。第二，即使蛋白水平充分降低，但是仍可能的是其它组蛋白变体在功能上替代HIST1H2AC和HIST1H2BK，因此存在9个H2A和11个H2B非等位组蛋白变体(Bonenfant等人2006)。重要地，使用小分子抑制剂筛选，研究人员显示直接靶向HDAC功能的药物确实逆转了表柔比星耐受性。
通过将天然、非耐受性细胞系暴露于表柔比星提高的浓度产生了表柔比星-耐受性细胞系。有趣地，仅有单一细胞系SKBR3上调药物转运体，并且这与对紫杉烷的交叉耐受性有关。先前，Hembruff等人(Hembruff等人2008)开发了表柔比星-耐受性MCF-7细胞并且确立必需超过特定选择剂量以激活药物转运体；对于MCF-7，该临界阈值浓度为约30nM(19)。尽管该浓度与我们的耐受性MCF-7细胞的选择剂量相同，但是MDR未上调，表明了在耐受性途中发生的分子事件的随机性质。重要地，这表明存在先前未揭示且应评价临床相关性的独立于MDR的耐受性机制。
我们的研究显示那些机制之一包括H2A和H2B基因和一些途径，包括表观遗传和细胞周期途径的上调。H2A和H2B组蛋白与H3和H4组蛋白形成八聚体，其参与DNA向核小体的包装(Wyrick and Parra 2009)。这些组蛋白是复制-依赖性的和细胞-周期调控的，其在DNA复制期间在S-期提高了35倍(Harris等人1991)。因此，由于细胞努力修复表柔比星-引起的DNA损伤，因此组蛋白转录本水平提高可以是细胞周期停滞的结果。然而，由于耐受性细胞不停滞，因此研究人员消除了上调的组蛋白转录本仅是积累的mRNA的反映的可能性。
通过HDACi使耐受性细胞对表柔比星敏化的能力所支持的替代解释是组蛋白的上调有助于1)耐受性途径的激活，2)使细胞对蒽环类抗生素敏化的分子途径的沉默，和/或3)表柔比星对DNA的可接近性降低。H3和H4组蛋白修饰模式与活性或抑制基因转录状态强烈相关。当前对H2A和H2B组蛋白修饰的理解基于酵母和少数肿瘤细胞系中的研究；尽管如此，已显示了H2A和H2B组蛋白修饰的两种重要特征。首先，修饰位点是乙酰化、磷酸化和泛素化的，但不是甲基化的(Parra and Wyrick 2007；Parra等人2006；Beck等人2006)，但是最常见地通过H3和H4组蛋白观察到修饰。这突显了在我们的研究中HDACi的正确使用以及它们由于众多乙酰化位点所具有的效力，尽管这未消除抑制剂还作用于H3和H4组蛋白的可能性。由于H2A和H2B上的乙酰化位点与转录激活有关(Parra and Wyrick 2007；Parra等人2006)，因此改变乙酰化模式可以激活在我们的模型中所列的转录抑制子和促凋亡基因(图7B，点1)。第二，H2A和H2B组蛋白的N末端具有在约10％的酵母基因组中使基因转录失活的抑制域(Parra and Wyrick 2007；Parra等人2006)，表明这些域可以与HDACi引起的乙酰化模式协作以抑制参与耐受性的基因，如参与细胞周期或细胞凋亡的那些(图7B，点2)。最后，我们的模型还识别通过提高表柔比星对DNA的可接近性可以逆转耐受性(图7B，点3)。
Regel等人(Regel等人2012)显示HDACi帕比司他使胃癌细胞对蒽环类抗生素敏化。我们的发现与它们的研究一致，并且显示在乳腺癌细胞中多个HDACi逆转了蒽环类抗生素耐受性。这是重要的发现，因此在我们的研究中测试的多种药理学抑制剂在临床II/III期试验中作为单一试剂或作为组合疗法使用(Groselj等人2013；Wagner等人2010；Lee等人2012)；目前临床试验中的HDAC抑制剂包括帕比司他、奎诺司他、吉维司他、阿贝司他、普西司他、贝利司他和莫西司他(表5)。由于蒽环类抗生素耐受性可能导致对紫杉烷的交叉抗药性(Guo等人2004；Gosland等人1996)，如它在我们的耐受性细胞系中的一个中所表现的，因此可能在一线治疗中应使用紫杉烷，而不是蒽环类抗生素(Paridaens等人2000)。此外，由于癌细胞可以获得对HDACi的耐受性(Lee等人2012)，因此包括HDACi、紫杉烷和蒽环类抗生素的序贯治疗将是临床试验设计和医疗实践的重要方面。
研究人员已鉴别了含有组蛋白H2A和H2B基因的新型途径作为乳腺癌细胞系谱的耐受性机制，并且在BR9601佐剂临床试验群组中验证了该发现。此外，由于低组蛋白表达与更好的患者结局有关，因此研究人员发展了用于研究临床耐受性的相关模型。该模型系统拓展了其用于开发和测试新型单一或组合乳腺癌疗法的使用。
总之，研究人员产生了成对的天然和表柔比星-耐受性MDA-MB-231、MCF7、SKBR3和ZR-75-1表柔比星-耐受性乳腺癌细胞系以鉴别有助于蒽环类抗生素耐受性的途径。将天然细胞系暴露于提高浓度的表柔比星直至产生耐受性细胞；这些细胞的鉴定显示它们对多柔比星和SN-38交叉耐受，并且在细胞凋亡和细胞周期谱中具有变化。为了鉴别驱动表柔比星耐受性的机制，研究人员使用了互补的方法，包括鉴别参与耐受性的分子途径的基因表达分析和逆转耐受性的小分子抑制剂。基因表达分析鉴别了组蛋白H2A和H2B基因在全部4个细胞系中的失调。组蛋白去乙酰化酶小分子抑制剂逆转耐受性并且对表柔比星-耐受性细胞系是细胞毒性的，从而确认组蛋白途径与表柔比星耐受性有关。BR9601佐剂临床试验的基因表达分析显示与具有高表达的那些患者相比，具有低组蛋白组件表达的患者更受益于蒽环类抗生素治疗(HR：0.35，95％CI 0.13-0.96，p＝0.042)。本研究显示了有助于蒽环类抗生素耐受性的关键途径和在全部4个主要乳腺癌亚型中所建立的用于研究耐受性的模型系统。由于小分子抑制剂可以靶向该过程，因此它提供了逆转临床蒽环类抗生素耐受性的可能方式。
尽管已描述了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员将理解在不背离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其作出改变。本文所公开的所有文档，包括以下参考文献列表中的那些作为参考并入本文。
表1：表柔比星治疗72h后，凋亡*细胞的百分比
*凋亡细胞＝膜联蛋白V+。排除碎片和坏死细胞(膜联蛋白V+，7-AAD+)。
本发明所报道的百分比来自单一实验；对每个细胞系进行至少两个独立实验。
表2乳腺癌细胞系的倍增时间(小时)
数据基于三个独立实验，并且在括号中显示标准偏差。
*表示基于两个实验的数据。
表4：与非靶向siRNA对照相比，基因表达减少的百分比
表6：一抗列表
表7：Nanostring编码集中组蛋白组件基因列表
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Claims (23)

1.一种用于确定癌症患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的方法，包括：
a.提供来自受试者的样品；
b.检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因的所述样品中的表达水平；
c.将在b.中检测的至少一种基因的所述水平与对照样品中的至少一种基因的表达的水平相比较；并且
其中如果与所述对照样品相比，受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则存在蒽环类抗生素耐受性的可能性。
2.一种用于预测癌症患者的存活的方法，包括：
a.提供来自受试者的样品；
b.检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因的所述样品中的表达水平；
c.将在b.中检测的至少一种基因的所述水平与对照样品中的至少一种基因的表达的水平相比较；并且
其中如果与所述对照样品相比，受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则存在不良存活的可能性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种组蛋白基因来自H2A或H2B家族，优选地选自由H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2、H2AFZ、HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2AI、HIST1H2AJ、HIST1H2AK、HIST1H2AL、HIST1H2AM、HIST2H2AA3、HIST2H2AC、H2BFM、H2BFS、H2BFWT、HIST1H2BA、HIST1H2BB、HIST1H2BC、HIST1H2BD、HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2BI、HIST1H2BJ、HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN、HIST1H2BO和HIST2H2BE；或它们的任意组合组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种组蛋白基因是HIST1H2AC、HIST1H2BK、HIST1H2BD或它们的任意组合。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种组蛋白基因包括表7中基因的任一种或它们的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种组蛋白基因包括表7中所有的基因。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括如果与所述对照样品相比，所述受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则使用不包含蒽环类抗生素的辅助疗法治疗所述患者。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括如果与所述对照样品相比，所述受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则向所述患者施用蒽环类抗生素以及至少一种组蛋白基因的调控途径中至少一种基因的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抑制剂是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，优选地帕比司他、奎诺司他、吉维司他、阿贝司他、普西司他、贝利司他、莫西司他、组蛋白脱乙酰酶抑制剂A、CAY10603、Oxamflatin、曲古抑菌素A、Sciptaid、CBHA或达西司他。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌或肺癌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述乳腺癌是早期乳腺癌，优选地选自以下亚型：ER+HER2-，管腔A型；ER+HER2+，管腔B型；ER-HER2+，HER2-扩增型和ER-/PR-/HER2-，三重阴性。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述蒽环类抗生素是柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、戊柔比星或米托蒽醌。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述蒽环类抗生素是表柔比星。
14.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在接受蒽环类抗生素并表现出至少一种组蛋白基因的上调的癌症患者的治疗中的用途。
15.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在接受蒽环类抗生素的乳腺癌患者的治疗中的用途。
16.一种使乳腺癌患者对蒽环类抗生素敏化或再敏化的方法，包括向患者施用组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
17.一种包含多种试剂、优选核酸序列的组合物，其中每种所述试剂用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中基因的样品中的表达水平。
18.一种阵列，对于来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的多个基因，所述阵列包含与所述基因的表达产物互补且可杂交的一个或多个多核苷酸探针。
19.一种用于确定患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的试剂盒，包含用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的基因的样品中的表达水平的检测试剂和使用说明。
20.一种用于预测癌症患者的存活的试剂盒，包含用于检测来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的基因的样品中的表达水平的检测试剂和使用说明。
21.一种计算机程序产品，用于与具有处理器和连接至所述处理器的存储器的计算机结合，所述计算机程序产品包含具有在其上编码的计算机机制的计算机可读存储介质，其中计算机程序机制可以载入所述计算机的存储器并使所述计算机实施根据权利要求1-6中任一项所述的方法。
22.一种用于确定患者中蒽环类抗生素耐受性的可能性的计算机实施产品，包括：
a.用于接收对应于受试者样品中的受试者表达谱的值的装置；
b.包含与来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的至少一种基因有关的对照表达谱的数据库；和
c.处理器，设置用于比较所述受试者表达谱与所述对照表达谱，并且如果与对照样品相比，受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则确定蒽环类抗生素耐受性的可能性。
23.一种用于预测癌症患者的存活的计算机实施产品，包含：
a.用于接收对应于受试者样品中的受试者表达谱的值的装置；和
b.包含与来自H1、H2A、H2B、H3和H4基因家族的至少一种组蛋白基因的调控途径中的至少一种基因有关的对照表达谱的数据库；和
c.处理器，设置用于比较所述受试者表达谱与所述对照表达谱，并且如果与对照样品相比，受试者样品中存在至少一种基因的相对较高的表达水平，则确定存在不良存活的可能性。
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