CN109913551A - 乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法 - Google Patents
乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法。该乳腺癌分型的核酸组合物包括多个扩增引物对及与多个扩增引物对对应的多种探针，各探针上均连接有荧光基团，多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对。通过探针及扩增引物对的配合，能够减少未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，提高定量结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。根据福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织中的生物标志物人类表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的病理评分结果，可将乳腺癌分为四种分子亚型：腔面A型、腔面B型、HER2过表达型和三阴型乳腺癌。
随着液滴数字PCR(ddPCR)近年来的迅速发展。虽然可以利用ddPCR在单个荧光通道上的探针浓度改变来区分不同的靶标基因，对乳腺癌进行分型，但这种方法一般只对片段完整的样本的准确性较高，而对片段化的DNA的准确性较低。而FFPE标本是经过福尔马林固定的石蜡样本，在此基础上提取的DNA已被高度片段化，所以目前采用ddPCR对FFPE样本进行靶基因定量时，准确性较低。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高乳腺癌分型准确性的乳腺癌分型的核酸组合物。
此外，还提供一种能够提高乳腺癌分型准确性的乳腺癌分型试剂盒及其使用方法。
一种乳腺癌分型的核酸组合物，包括多个扩增引物对及与所述多个扩增引物对对应的多种探针，各所述探针上均连接有荧光基团，所述多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；
所述扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对；所述HER2引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；所述ESR1引物对的序列如SEQ ID No.3～SEQ IDNo.4所示；所述PGR引物对的序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示。
利用ddPCR在单个荧光通道上的探针浓度改变来区分不同的靶标基因时，高度片段化的DNA在PCR扩增反应中容易形成未完全扩增的液滴，这些未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，进而对结果的判读造成影响，从而影响定量结果的准确性。而上述乳腺癌分型的核酸组合物，在使用时通过多个扩增引物及对应的探针配合，能够减少未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，提高定量结果的准确性。
在其中一个实施例中，与所述HER2引物对、所述ESR1引物对及所述PGR引物对对应的探针的序列或其互补序列分别如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示。
在其中一个实施例中，所述多种探针中至少一种探针具有不同浓度。
在其中一个实施例中，各所述探针上连接的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。
在其中一个实施例中，与所述HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与所述ESR1引物对对应的探针包括连接有FAM的第一探针及连接有HEX的第二探针，与所述PGR引物对应的探针上连接有HEX。
在其中一个实施例中，与所述HER2引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM；所述第一探针的浓度为50nM～300nM，所述第二探针的浓度为50nM～300nM；与所述PGR引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM。
在其中一个实施例中，还包括参比引物对和与所述参比引物对对应的探针，与所述参比引物对应的探针上连接有荧光基团。
在其中一个实施例中，所述与所述参比引物对对应的探针包括连接有FAM的第三探针及连接有HEX的第四探针，所述第三探针的浓度为50nM～300nM，所述第四探针的浓度为50nM～300nM。
一种乳腺癌分型试剂盒，包括上述乳腺癌分型的核酸组合物。
在其中一个实施例中，还包括数字PCR预混液、液滴稳定剂、RNA提取试剂及逆转录试剂中的至少一种。
一种乳腺癌分型试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
提取核酸，得到核酸样本；
将所述核酸样本、上述乳腺癌分型试剂盒中的扩增引物对和对应的探针混合后，制备PCR微反应液滴；
将所述PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；及
收集PCR扩增反应后的产物的荧光信号，得到检测结果。
附图说明
图1为实施例1的液滴分布图；
图2为实施例2的液滴分布图；
图3为实施例3的操作流程图；
图4为实施例3中HER2的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图；
图5为实施例3中HER2的ROC曲线图；
图6为实施例3中ESR1 IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图；
图7为实施例3中ESR1 ROC曲线图；
图8为实施例3中PGR的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图；
图9为实施例3中PGR的ROC曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种乳腺癌分型的核酸组合物，包括多个扩增引物对及与多个扩增引物对对应的多种探针，各探针上均连接有荧光基团，多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同。
扩增引物对用于扩增目的基因，该目的基因是能够用于乳腺癌的分型判断。比如编码人类表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的基因。在其中一个实施例中，扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对。HER2引物对用于扩增HER2。进一步地，HER2引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。其中，SEQ ID No.1的序列为：5’-ACGTTTGAGTCCATGCCCAA-3’；SEQ ID No.2的序列为：5’-GGATCCCACGTCCGTAGAA-3’。ESR1引物对用于扩增ESR1。进一步地，ESR1引物对的序列如SEQID No.3～SEQ ID No.4所示。其中，SEQ ID No.3的序列为：5’-ACCAACCAGTGCACCATTGA-3’；SEQ ID No.4的序列为：5’-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTT-3’。PGR引物对用于扩增PGR。进一步地，PGR引物对的序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示。其中，SEQ ID No.5的序列为：5’-TTTCATCCACGTGCCTATCC-3’。SEQ ID No.6的序列为5’-GCCGTCGTAACTTTCGTCTT-3’。
与扩增引物对对应的探针上均连接有荧光基团，各个探针上连接的荧光基团的选择无特别要求，只要每个探针上均连接有荧光基团，且所有探针上连接的荧光基团的种类至少两种即可。当然，在探针上还连接有与荧光基团对应的淬灭基团。进一步地，荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。在其中一个实施例中，荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。
在其中一个实施例中，与HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与PGR引物对应的探针上连接有HEX，与ESR1引物对对应的探针包括连接有FAM的第一探针及连接有HEX的第二探针。第一探针与第二探针的核苷酸序列相同。
在其中一个实施例中，多种探针中至少一种探针具有不同浓度。在其中一个实施例中，多种探针中至少一种探针具有不同浓度，此时，该不同浓度的探针上连接的荧光基团不同。进一步地，与HER2引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM。第一探针的浓度为50nM～300nM，第二探针的浓度为50nM～300nM。与PGR引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM。可以理解的是，各探针的浓度是指使用浓度，在使用时只要使得整个反应体系在PCR扩增反应之后的荧光信号能够区分，不重叠即可。
在其中一个实施例中，与HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对对应的探针的序列或其互补序列分别如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示。具体地，与HER2引物对对应的探针的序列或其互补序列如SEQ ID No.7所示。SEQ ID No.7的序列为：5’-TGACTGCCTGTCCCTACAACTA-3’。与ESR1引物对对应的探针的序列或其互补序列如SEQ IDNo.8所示。SEQ ID No.8的序列为：5’-AGCTGCCAGGCCTGCCGGCTC-3’。与PGR引物对对应的探针的序列或其互补序列如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.9的序列为：5’-CAGCCCGCACTCGGCAGCTGC-3’。
在其中一个实施例中，上述乳腺癌分型的核酸组合物还包括参比引物对和与参比引物对对应的探针，与参比引物对对应的探针上连接有荧光基团。参比引物对用于扩增PUM1。通过对PUM1的准确定量，便于对乳腺癌的准确分型。
具体地，与参比引物对对应的探针包括连接有FAM的第三探针及连接有HEX的第四探针。第三探针与第四探针的核苷酸序列相同。第三探针的浓度为50nM～300nM，第四探针的浓度为50nM～300nM。进一步地，第三探针的浓度为50nM～300nM，第四探针的浓度为50nM～300nM。
在其中一个实施例中，参比引物对的序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.11所示。其中，SEQ ID No.10的序列为：5’-TGGTCCAGAAGATGATTGACG-3’；SEQ ID No.11的序列为：5’-TGTGGGGCCGGATCTTAT-3’。与参比引物对对应的探针的序列如SEQ ID No.12所示，SEQID No.12的序列为：5’-AGCCAGGCCAGCGGAAGATCGTCATG-3’。
当然，可以理解的是，在参比引物对存在时，还可以是其他扩增引物对对应探针具有不同浓度，只要选用相同荧光基团的探针的浓度各不相同，以能够将各个扩增引物对的扩增产物区分开即可。比如，在反应体系需要同时检测三种不同的基因，选用两种荧光基团(即第一荧光基团和第二荧光基团)时，则探针反应体系共有三种探针，即选用第一荧光基团的探针、选用第二荧光基团的探针、以及选用第二荧光基团且具有浓度与选用第二基团的探针不同的探针。或者选用第二荧光基团的探针、选用第一荧光基团的探针、以及选用第二基团且具有浓度与选用第一荧光基团的探针不同的探针。这三种探针分别对应着三种不同的基因。也即是，在这三种探针中，均选用第一荧光基团的探针的浓度不同；或者均选用第二荧光基团的探针的浓度不同。又比如，在反应体系需要同时检测四种不同的基因，选用的两种荧光基团(第一荧光基团和第二荧光基团)时，反应体系共有六种探针：两种荧光基团连接的探针分别具有三种各不相同的浓度。进一步地，有两种基因对应的探针均分别连接有这两种荧光基团，剩余两种基因对应的探针对应连接这两种荧光基团。
进一步地，与HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与HER2引物对对应的探针的浓度为5nM～30nM。与ESR1引物对对应的探针包括连接有FAM的第一探针及连接有HEX的第二探针。第一探针的浓度为5nM～30nM，第二探针的浓度为5nM～30nM。与PGR引物对应的探针上连接有HEX，与PGR引物对对应的探针的浓度为5nM～30nM。与参比引物对对应的探针包括连接有FAM的第三探针及连接有HEX的第四探针。第三探针的浓度为5nM～30nM，第四探针的浓度为5nM～30nM。进一步地，第三探针的浓度为5nM～30nM，第四探针的浓度为5nM～30nM。
液滴数字PCR(ddPCR)是近年来迅速发展起来的基于PCR的核酸定量技术。液滴数字PCR无需依赖Ct值或内参基因，即可实现对低至单拷贝待检测靶分子的绝对定量。但这种方法对片段完整的样本的准确性较高，而对片段化的DNA的准确性较低。因为高度片段化的DNA在PCR扩增反应中容易形成未完全扩增的液滴，这些未完全扩增的液滴会与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，进而对结果的判读造成影响，影响定量结果的准确性。上述乳腺癌分型的核酸组合物，通过至少一种探针具有多种浓度和各探针上连接的荧光基团不完全相同的配合，减少未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，提高定量结果的准确性，进而提高乳腺癌分型的准确性。
本发明一实施方式提供了一种乳腺癌分型试剂盒，该乳腺癌分型试剂盒包括上述乳腺癌分型的核酸组合物。
在其中一个实施例中，该乳腺癌分型试剂盒还包括数字PCR预混液、液滴稳定剂、RNA提取试剂及逆转录试剂中的至少一种。
上述乳腺癌分型试剂盒包括上述乳腺癌分型的核酸组合物，能够有效提高乳腺癌分型的准确性。
上述乳腺癌分型试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤S110、提取核酸，得到核酸样本。
具体地，从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本中提取RNA，并将提取的RNA逆转录，得到核酸样本。
步骤S130、将核酸样本、上述乳腺癌分型试剂盒中的扩增引物对和对应的探针混合后，制备PCR微反应液滴。
具体地，将核酸样本、数字PCR预混液、上述乳腺癌分型试剂盒中的扩增引物对和对应的探针混合，得到ddPCR反应液。然后将ddPCR反应液、微滴生成油放入微滴生成器中制备液滴，得到PCR微反应液滴。其中，微滴生成油包括氟碳化合物、氢氟烃、矿物油、硅油和烃油中的至少一种。
步骤S150、将PCR微反应液滴进行PCR扩增反应。
具体地，PCR扩增反应的体系的反应条件为：90℃～99℃预变性0min～15min，90℃～99℃1sec～30sec，50℃～70℃0.1min～2min；30～45个循环。
步骤S170、收集PCR扩增反应后的产物的荧光信号，得到检测结果。
具体地，收集PCR扩增反应后的产物的荧光信号、微滴分类及计数，计算得到FFPE样本中各目的基因的浓度。
上述乳腺癌分型试剂盒的使用方法简便，快速。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)制备核酸样本：利用HER2、ESR1、PGR和PUM1的引物从MCF-7细胞系的cDNA中扩增HER2、ESR1、PGR和PUM1的基因片段，其中HER2、ESR1、PGR和PUM1的引物如表1所示。利用pEASY-Blunt Cloning Kit完成克隆、转化；利用TaKaRa MiniBEST Plasmid PurificationKit Ver.4.0(TaKaRa)从E.coli中分别提取含有HER2的质粒、ESR1的质粒、PGR的质粒和PUM1的质粒。按1:1:1:1的浓度比例混合含有HER2的质粒、含有ESR1的质粒、含有PGR的质粒和含有PUM1的质粒，以浓度为25拷贝/微升作为核酸样本。
表1
(2)配制ddPCR反应液：10μL的ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad)，1.8μL的扩增引物混合物、1μL的探针混合物、5μL步骤(1)制备的核酸样本，2.2μL无菌水。其中，扩增引物混合物包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对；探针混合物包括与HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对对应的探针。ddPCR反应液中的HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对及对应探针的序列和浓度如表2所示。与HER2引物对对应的探针的5’端连接有FAM，与HER2引物对对应的探针的3’端连接有MGB。第一探针的5’端连接有FAM，第一探针的3’端连接有Blackhole Quencher1。第二探针的5’端连接有HEX，第二探针的3’端连接有Blackhole Quencher1。与PGR引物对对应的探针的5’端连接有HEX，与PGR引物对对应的探针的3’端连接有Blackhole Quencher1。第三探针的5’端连接有FAM，第三探针的3’端连接有Blackhole Quencher1。第四探针的5’端连接有HEX，第四探针的3’端连接有BlackholeQuencher1。
表2
(3)制备PCR微反应液滴：将配制好的ddPCR反应液，加入液滴发生器样品孔中，在油孔中加入70μL微滴生成油(Bio-Rad)，覆盖垫圈，放入Bio-rad ddPCR系统配套的QX200Droplet Generator中，制备得到PCR微反应液滴。
(4)PCR扩增反应：转移40μL微滴至96孔PCR板，封膜后于Bio-rad T100 PCR仪进行扩增，其中，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃30sec，59℃1min 40个循环。扩增完成后，将PCR反应板转移至Bio-rad ddPCR系统配套QX200 Droplet Reader，按仪器和软件操作说明，进行荧光信号检测及微滴计数；利用QuantaSoft Analysis Pro version 1.0.596软件对液滴进行分类，并计算得到HER2、ESR1、PGR和PUM1的浓度。其中，液滴分布图如图1所示。图1中，标号(1)～(10)分别对应HER2+(HER2阳性液滴)、PUM1+(PUM1阳性液滴)、ESR1+(HER2阳性液滴)、PGR+(PGR阳性液滴)、HER2+PUM1双阳性液滴、HER2+ESR1双阳性液滴、PUM1+ESR1双阳性液滴、HER2+PGR双阳性液滴、PUM1+PGR双阳性液滴、ESR1+PGR双阳性液滴，negative对应阴性液滴。
由图1可以看出，图1中含HER2+(HER2阳性液滴)、ESR1+(HER2阳性液滴)、PGR+(PGR阳性液滴)、、阴性液滴和双阳性液滴。
实施例2
实施例2采用的步骤和方法与实施例1大致相同，其不同在于，实施例2的质粒的浓度为800拷贝/微升，而实施例1的质粒浓度为25拷贝/微升。实施例2的液滴分布图如图2所示。图2中标号(1)～(10)的含义与图1中的含义相同，标号(11)～(15)分别对应HER2+PUM1+ESR1三阳性液滴、HER2+PUM1+PGR三阳性液滴、HER2+ESR1+PGR三阳性液滴、PUM1+ESR1+PGR三阳性液滴及HER2+PUM1+ESR1+PGR四阳性液滴，negative对应阴性液滴。
由图2可以看出，图2含HER2+(HER2阳性液滴)、ESR1+(HER2阳性液滴)、PGR+(PGR阳性液滴)、PUM1+(PUM1阳性液滴)、阴性液滴、双阳性液滴和三阳性液滴。
实施例3
(1)采用与实施例1类似的方法测定94个浸润性乳腺癌患者的FFPE标本的中HER2、ESR1、PGR和PUM1的浓度。具体步骤大致与实施例1相同(参见图3)，其不同在于，制备核酸样本的步骤，实施例3的制备核酸样本的步骤如下：选取94个浸润性乳腺癌患者的FFPE标本，每个样本进行如下操作：切下两张厚度为10μm、肿瘤面积大于50％的薄片。将两张薄片利用Qiagen RNeasy FFPE Kit提取RNA，最终用30μL无菌水洗脱RNA；然后用少于1000ng的RNA、2μL 5×PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa)，加无菌水至总体积为10μL进行逆转录。逆转录的条件为：37℃下孵育15min，85℃下孵育5s，得到核酸样本。
将步骤(1)得到的每个样本的最终结果表示为HER2、ESR1、PGR的cDNA浓度与参比基因PUM1的cDNA浓度的比值，并根据比值判断每个样本的分子亚型。判断规则为：若HER2/PUM1比值大于0.804，则认为是HER2阳性，否则为HER2阴性；若ESR1/PUM1比值大于0.0902，则认为是ER(1％以上)阳性，否则为ER阴性；若ESR1/PUM1比值大于0.1225，则认为是ER(10％以上)阳性，否则为ER阴性；若PGR/PUM1比值大于0.0123，则认为是PR(1％以上)阳性，否则为PR阴性；若PGR/PUM1比值大于0.03325，则认为是PR(10％以上)阳性，否则为PR阴性。
(2)采用金标准免疫组织化学(IHC)法对94个浸润性乳腺癌患者的FFPE标本进行分析。其中，IHC中的94个FFPE样本与步骤(1)中94个FFPE标本相同(参见图3)。
(3)将步骤(2)的IHC分型结果作为金标准，与步骤(1)得到的分型结果(也即是ddPCR法的结果)进行ROC分析。结果如表3～表5及图4～9所示。其中，图4～图5分别为HER2的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图和ROC曲线图；图6～图7分别为ESR1的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图及ROC曲线图；图8～图9分别为PGR的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图及ROC曲线图。
表3.HER2 ddPCR方法与IHC方法一致性评价表
表4.ESR1 ddPCR方法与IHC方法一致性评价表
表5.PGR ddPCR方法与IHC方法一致性评价表
由表3～表5可知，ddPCR法的HER2结果与IHC法相比，Kappa值为0.919；ESR1结果的Kappa值为0.788(按1％ER阳性计算)或0.831(按10％ER阳性计算)；PGR结果的Kappa值为0.692(按1％ER阳性计算)或0.766(按10％ER阳性计算)。
由图4～图9可知，步骤(2)的金标准免疫组织化学(IHC)法与步骤(1)的ddPCR法具有较高的一致性，而且相较于IHC法，ddPCR法具有更好的重复性，可以有效减少不同病理医师对相同病理切片以及相同病理医师对相同病理切片结果判读的不一致性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgtttgagt ccatgcccaa 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
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<211> 20
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<211> 22
<212> DNA
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ggtcttttcg tatcccacct tt 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttcatccac gtgcctatcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccgtcgtaa ctttcgtctt 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggtccagaa gatgattgac g 21
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgtggggccg gatcttat 18
Claims (10)
1.一种乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，包括多个扩增引物对及与所述多个扩增引物对对应的多种探针，各所述探针上均连接有荧光基团，所述多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；
所述扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对；所述HER2引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；所述ESR1引物对的序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示；所述PGR引物对的序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，与所述HER2引物对、所述ESR1引物对及所述PGR引物对对应的探针的序列或其互补序列分别如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示。
3.根据权利要求1所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，所述多种探针中至少有一种探针具有不同浓度。
4.根据权利要求1～3任一项所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，各所述探针所连接的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。
5.根据权利要求4所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，与所述HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与所述ESR1引物对对应的探针包括连接有FAM的第一探针及连接有HEX的第二探针，与所述PGR引物对应的探针上连接有HEX。
6.根据权利要求5所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，与所述HER2引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM；所述第一探针的浓度为50nM～300nM，所述第二探针的浓度为50nM～300nM；与所述PGR引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM。
7.根据权利要求1～3任一项所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，还包括参比引物对和与所述参比引物对对应的探针，与所述参比引物对应的探针上连接有荧光基团。
8.一种乳腺癌分型试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的乳腺癌分型的核酸组合物。
9.根据权利要求8所述的乳腺癌分型试剂盒，其特征在于，还包括数字PCR预混液、液滴稳定剂、RNA提取试剂及逆转录试剂中的至少一种。
10.一种乳腺癌分型试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取核酸，得到核酸样本；
将所述核酸样本、权利要求8或9所述的乳腺癌分型试剂盒中的扩增引物对和对应的探针混合后，制备PCR微反应液滴；
将所述PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；及
收集PCR扩增反应后的产物的荧光信号，得到检测结果。
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