CN105986028A - 一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法,具体地,本发明提供了一种HER2拷贝数变异检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括:用于检测HER2基因的两对引物,和用于检测选自下组的内参基因的一对或多对引物:CEP17、EFTUD2,或其组合。本发明采用ddPCR技术结合多内参基因进行组合的方式,可以有效地判断出常规方法只能判定为疑似阳性的样本是否存在HER2阳性,从而辅助指导乳腺癌用药。
Description
技术领域
本发明涉及指导肿瘤治疗的分子检测技术领域,具体是涉及一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法。
背景技术
乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的疾病之一。不同分子分型的患者对临床治疗的反应及预后可能会有很大差别。
人类表皮生长因子受体-2(HER2)是由HER2(又称为ERBB2或NEU)原癌基因编码的具有受体酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜糖蛋白,能启动酪氨酸激酶调控的信号转导系统。HER2基因扩增及蛋白的过度表达会过度传递信号,刺激癌细胞增殖。HER2是乳腺癌分型的一个主要指标,20%~30%的乳腺癌患者罹患的是具有“黑蝴蝶”之称的HER2阳性乳腺癌,浸润性强,无病生存期短,预后差。测定HER2在乳腺癌患者的肿瘤中是否存在过度表达对于患者的预后判断、治疗方案的选择具有重要意义,能够极大地提升治疗的安全有效性,增加治疗费效比。目前医学界已经达成共识,生物靶向治疗是HER2阳性乳腺癌的一种有效治疗手段。
赫赛汀(Herceptin,曲妥珠单抗)是一种针对HER2原癌基因产物的单克隆抗体,是唯一被美国FDA批准用于治疗转移性乳腺癌和早期乳腺癌的HER2靶向药物,已被广泛应用于各期HER2阳性乳腺癌的治疗。赫赛汀能选择性地作用于HER2受体胞外段,干扰HER2与其它ErbB家族成员形成异源二聚体,从而抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。经中国食品药品监督管理局的批准,赫赛汀作为HER2过度表达晚期乳腺癌患者的一线治疗方案。
目前临床实验室只有免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术被广泛应用于检测手术切除标本HER2蛋白或基因状态。IHC检测结果为0或1+者即可判定HER2表达阴性,不适合使用Her2靶向药物;IHC 3+者即判定HER2表达阳性,适用Her2靶向药物;而IHC 2+者需要再进一步应用FISH进行HER2基因扩增检测。IHC技术检测的是HER2蛋白层面的表达,检测过程的人为影响因素较多,导致准确性和可重复性较差,从而影响患者的治疗用药选择。利用FISH技术从基因水平上进行检测是Her2阳性检测的“金标准”。通过计算HER2基因探针与17号染色体着丝粒(CEP17)探针杂交信号之比来判断HER2基因是否有扩增,将检测结果小于的1.8定位为HER2阴性,检测结果大于2.2定位阳性,而检测结果为1.8-2.2之间的则无法准确界定,为疑似阳性。对于HER2阳性患者,可以使用HER2靶向药物,如赫赛汀等;而HER2阴性患者,则不推荐使用这类药物。
然而目前这些检测方法都存在很大的不足,IHC检测HER2蛋白过度表达的错误率平均为18%,FISH检测HER2基因扩增的错误率在13%。近来有研究发现,一些HER2疑似阳性患者,以及部分HER2阴性患者也对HER2靶向药物敏感,认为根据IHC或FISH法检测结果指导用药并不十分准确。因此需要一种更灵敏更准确的HER2阳性/阴性乳腺癌检测方法,以指导患者对HER2靶向药物的使用,使更多的患者受益。
综上所述,本领域尚缺乏一种能够准确有效地检测HER2突变阳性的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够准确有效地检测HER2突变阳性的方法。
本发明的第一方面,提供了一种HER2拷贝数变异检测试剂盒,所述的试剂盒包括:用于检测HER2基因的两对引物,和用于检测选自下组的内参基因的一对或多对引物:CEP17、EFTUD2,或其组合。
在另一优选例中,所述的试剂盒包括用于检测CEP17基因的一对引物。
在另一优选例中,所述的试剂盒包括用于检测EFTUD2基因的2对引物。
在另一优选例中,所述的试剂盒还包括选自下组的探针:用于检测HER2基因的探针、用于检测CEP17基因的探针、用于检测EFTUD2基因的探针。
在另一优选例中,所述的探针为VIC探针或FAM探针。
在另一优选例中,所述的用于检测HER2基因的两对引物对的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2,或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中,所述的用于检测CEP17基因的引物对的序列如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示。
在另一优选例中,所述的用于检测EFTUD2基因的两对引物对的序列如SEQ ID NO:SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中,所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示;优选地,所述的探针为FAM探针。
在另一优选例中,所述的用于检测CEP17基因的探针的序列如SEQ ID NO:15所示;优选地,所述的探针为VIC探针。
在另一优选例中,所述的用于检测EFTUD2基因的探针的序列如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:12所示;优选地,所述的探针为VIC探针。
在另一优选例中,所述试剂盒包括:
(a)第一容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对;
(b)第二容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对;
(c)第三容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含CEP17基因的特异引物对;
(d)第四容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物对;
(e)第五容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物对;
(f)使用说明书(如插页),其中,所述说明书记载了使用方法。
在另一优选例中,所述的使用方法包括:(1)提供一检测样本,所述的检测样本是肿瘤组织样本;
(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理,从而获得含抽提DNA的DNA抽提物;
(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板,进行微滴式数字PCR(ddPCR),从而获得含HER2基因和内参基因的扩增产物;和
(4)对所述扩增产物进行分析,从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或比例;
其中,所述的内参基因是CEP17和EFTUD2。
在另一优选例中,在所述步骤(2)中,对于每2毫升的检测样本而言,所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液。
在另一优选例中,在步骤(3)中,所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~100ng。
在另一优选例中,所述的方法是非诊断且非治疗性的。
在另一优选例中,所述的方法还包括:对HER2基因进行两组扩增,且所述的扩增是用不同的引物对进行的。
在另一优选例中,所述的方法还包括:对EFTUD2基因进行两组扩增,且所述的扩增是用不同的引物对进行的。
本发明的第二方面,提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒的用途,其特征在于,用于制备:(a)用于检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感的试剂盒;(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用赫赛汀进行治疗的试剂盒;(c)用于检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感。
在另一优选例中,所述的肿瘤患者包括乳腺癌患者。
在另一优选例中,所述的肿瘤患者为人。
在另一优选例中,所述是检测包括在给予赫赛汀之前、之中、或之后进行检测。
本发明的第三方面,提供了一种样本中HER2突变阳性检测方法,所述方法包括:
(1)提供一检测样本,所述的检测样本是肿瘤组织样本;
(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理,从而获得含抽提DNA的DNA抽提物;
(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板,进行微滴式数字PCR(ddPCR),从而获得含HER2基因和内参基因的扩增产物;和
(4)对所述扩增产物进行分析,从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或比例;
其中,所述的内参基因是CEP17和EFTUD2。
在另一优选例中,在所述步骤(2)中,对于每2毫升的检测样本而言,所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液。
在另一优选例中,在步骤(3)中,所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~100ng。
在另一优选例中,所述的方法是非诊断且非治疗性的。
在另一优选例中,所述的方法还包括:对HER2基因进行两组扩增,且所述的扩增是用不同的引物对进行的。
在另一优选例中,所述的方法还包括:对EFTUD2基因进行两组扩增,且所述的扩增是用不同的引物对进行的。
在另一优选例中,在ddPCR中,反应体系中还含有用于检测HER2基因和内参基因的探针。
在另一优选例中,所述的探针为FAM探针或HEX探针。
在另一优选例中,所述的用于检测HER2基因的两对引物对的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2,或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中,所述的用于检测CEP17基因的引物对的序列如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示。
在另一优选例中,所述的用于检测EFTUD2基因的两对引物对的序列如SEQ ID NO:SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中,所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示;优选地,所述的探针为FAM探针。
在另一优选例中,所述的用于检测CEP17基因的探针的序列如SEQ ID NO:15所示;优选地,所述的探针为VIC探针。
在另一优选例中,所述的用于检测EFTUD2基因的探针的序列如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:12所示;优选地,所述的探针为VIC探针。
在另一优选例中,所述的PCR反应的反应体系包括:待测基因组50~100ng,2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl,引物对上下游各1μl,及探针1μl,无菌蒸馏水补足至20μl;其中,所述的引物对选自下组:HER-2引物对H1、H2,内参基因CEP17引物对C1、内参基因EFTUD2引物对E1和E2。
在另一优选例中,所述的样本来自于选自下组的检测对象:乳腺癌患者。
在另一优选例中,所述的肿瘤组织包括:新鲜组织、和石蜡包埋组织。
在另一优选例中,在所述步骤(2)中,所述的抽提处理包括步骤:
(i)提供一组织样本;
(ii)对所述样本进行溶解,优选地,加入蛋白酶K对所述样本进行溶解,得到样本溶解液;
(iii)对所述的样本溶解液进行离心,得到抽提的基因组DNA。
在另一优选例中,当所述的组织为新鲜组织时,所述步骤(iii)中,所述的离心包括:
(iii-1)将样本溶解液倒入吸附柱中,在第一离心管中11000-13000rpm离心10-50秒,倒去收集管中废液;
(iii-2)向吸附柱内加入缓冲液,在第一离心管中11000-13000rpm离心10-50秒,倒掉收集管中废液;
(iii-3)向吸附柱内加入漂洗液,在第一离心管中11000-13000rpm,离心10-50秒,倒掉收集管中废液,并重复一次;
(iii-4)空转11000-13000rpm,1-3分钟;
(iii-5)将吸附柱放入第二离心管中,向吸附膜中间加入30-70μl的缓冲液TE,室温孵育1-3分钟,11000-13000rpm离心1-3分钟,得到抽提的基因组DNA。
在另一优选例中,当所述的组织为石蜡包埋组织时,所述步骤(iii)中,所述的离心包括:
(iii-1)将样本溶解液倒入吸附柱中,在第一离心管中6000-10000rpm离心0.5-2分钟,倒去收集管中废液;
(iii-2)向吸附柱内加入500μl缓冲液,在第一离心管中6000-10000rpm离心0.5-2分钟,倒掉收集管中废液,再重复两次;
(iii-3)空转11000-13000rpm,1-3分钟;
(iii-4)将吸附柱放入第二离心管中,向吸附膜中间加入30-70μl的缓冲液TE,室温孵育1-3分钟,11000-13000rpm离心1-3分钟,得到抽提的基因组DNA。
在另一优选例中,所述步骤(2)中PCR反应条件为:95℃变性10min;随后94℃变性30sec,60℃退火60sec,进行40个循环;最后98℃延伸10min,4℃保存。
在另一优选例中,所述的步骤(4)包括:分析所述HER-2引物对H1、H2,内参基因CEP17引物对C1、内参基因EFTUD2引物对E1和E2扩增产物的拷贝数,并用HER-2基因拷贝数去除以内参基因拷贝数,得到六组比值,即H1/C1,H1/E1,H1/E2,H2/C1,H2/E1,H2/E2,若六个比值均小于等于2.0,则判定为Her2阴性,若六个比值中有1个大于2.0,则判定为Her2阳性。
在另一优选例中,所述方法具有以下的灵敏度:从10万个正常DNA分子中检测到一个HER2突变分子。
在另一优选例中,所述的方法还包括:对来自于同一检测对象的外周血浆进行ddPCR检测,得到其mRNA表达和DNA拷贝数变异。
本发明的第四方面,提供了一种肿瘤患者赫赛汀耐药性的检测方法,包括步骤:用如本发明第三方面所述的方法进行HER2阳性检测;和
若检测结果为阳性,则判定患者对赫赛汀敏感,可以对其使用赫赛汀治疗;若检测结果为阴性,则判定患者对赫赛汀耐药,不适合使用赫赛汀治疗。
在另一优选例中,所述的肿瘤患者为乳腺癌患者。
在另一优选例中,所述的耐药为原发性耐药或继发性耐药。
本发明的第五方面,提供了一种肿瘤患者治疗方法,所述方法包括步骤:
(a)用如本发明第三方面所述的方法,对所述对象进行HER2阳性检测,并对检测结果为阳性的对象,采用HER2靶向药物进行治疗。
在另一优选例中,所述的肿瘤患者为乳腺癌患者。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1是实施例中样本1的ddPCR仪拷贝数结果显示。图中纵坐标为目的基因拷贝数浓度(copies/μl),横坐标为对应所检测的基因,每个点的误差线表示95%置信区间。H1,H2为基因Her2的两组引物探针(蓝色框);C1为的引物探针(绿色框);E1,E2为基因CEP17基因EFTUD的两组引物探针(绿色框)。
图2是实施例中样本2的ddPCR仪拷贝数结果显示。图中纵坐标为目的基因拷贝数浓度(copies/μl),横坐标为对应所检测的基因,每个点的误差线表示95%置信区间。H1,H2为基因Her2的两组引物探针(蓝色框);C1为基因CEP17的引物探针(绿色框);E1,E2为基因EFTUD的两组引物探针(绿色框)。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究,意外地发现,采用ddPCR扩增技术,并使用CEP17和EFTUD2共同作为内参基因,从而对HER2阳性突变进行检测的方式,能够极大程度地排除假阴性的情况,从而确证一些常规方法中疑似突变阳性的患者是否存在HER2阳性。基于上述发现,发明人完成了本发明。
本发明的目的是提供一种用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法。
本发明的另一目的是提供乳腺癌HER2阳性的判定方法。
本发明的最终目的是通过ddPCR技术,检测乳腺癌患者肿瘤组织中HER2基因拷贝数与内参基因CEP17和EFTUD2基因拷贝数,再根据HER2和内参基因拷贝数的比值判定该乳腺癌患者是否为HER2阳性,指导患者对HER2靶向药物的使用。
HER2基因阳性检测
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术被称为“第三代PCR”技术,是一项检测和定量核酸分子的新技术,在不依靠任何校准物或外标的情况下,可直接进行单个目标分子的计数,以实现绝对定量。微滴式数字PCR系统(droplet digitalPCR,ddPCR)将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴,其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后,逐个对每个微滴进行荧光检测,因此具有极高的灵敏度,能用于检测样品中含量极低的DNA拷贝。与传统PCR、定量PCR相比,其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检靶分子的绝对数目,特别适合拷贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。
在本发明中,利用ddPCR技术检测肿瘤组织中HER2基因拷贝数,并将其与17号染色的内参基因(CEP17和EFTUD2)进行比较,可以更精确的得出HER2基因扩增情况,更灵敏的界定HER2阳性乳腺癌患者,为乳腺癌患者提供更准确的靶向药物用药指导。
本发明运用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法包括如下步骤:
(1)提供一检测样本,所述的检测样本是肿瘤组织样本;
(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理,从而获得含抽提DNA的DNA抽提物;
(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板,进行微滴式数字PCR(ddPCR),从而获得含HER2基因和内参基因的扩增产物;和
(4)对所述扩增产物进行分析,从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或比例;其中,所述的内参基因是CEP17和EFTUD2。
在另一优选例中,在所述步骤(2)中,对于每2毫升的检测样本而言,所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液。
本发明的方法可以在DNA模板量较低的情况下完成扩增,在另一优选例中,在步骤(3)中,所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~100ng。
在所述的PCR中,各引物对可以选用针对特定目标序列进行扩增的引物对。在另一优选例中,所述的方法中,对HER2基因进行两组扩增,且所述的扩增是用不同的引物对进行,针对不同的目标序列。
在另一优选例中,所述的方法中,对EFTUD2基因进行两组扩增,且所述的扩增是用不同的引物对进行,针对不同的目标序列。
在另一优选例中,所述的用于检测HER2基因的两对引物对的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2,或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示所示。
在另一优选例中,所述的用于检测CEP17基因的引物对的序列如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示。
在另一优选例中,所述的用于检测EFTUD2基因的两对引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中,在所述的ddPCR中,所述的反应体系中还含有用于检测HER2基因和内参基因的探针。所述探针的种类没有特别的限制,在另一优选例中,所述的探针为FAM探针或VIC探针。
在另一优选例中,所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示;优选地,所述的探针为FAM探针。
在另一优选例中,所述的用于检测CEP17基因的探针的序列如SEQ ID NO:15所示;优选地,所述的探针为VIC探针。
在另一优选例中,所述的用于检测EFTUD2基因的探针的序列如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:12所示;优选地,所述的探针为VIC探针。
在另一优选例中,所述的PCR反应的反应体系包括:待测基因组50~100ng,2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl,引物对及探针共1μl,无菌蒸馏水补足至20μl;其中,所述的引物对选自下组:HER-2引物对H1、H2,内参基因CEP17引物对C1、内参基因EFTUD2引物对E1和E2。
所述的样本优选地为来自于乳腺癌患者的样本,当所述的样本来自于乳腺癌患者时,所述的方法还可以用于辅助判断该患者是否对于赫赛汀敏感。
在另一优选例中,所述的肿瘤组织包括:新鲜组织、和石蜡包埋组织。
在另一优选例中,在所述步骤(2)中,所述的抽提处理包括步骤:(i)提供一组织样本;
(ii)对所述样本进行溶解,优选地,加入蛋白酶K对所述样本进行溶解,得到样本溶解液;
(iii)对所述的样本溶解液进行离心,得到抽提的基因组DNA。
在另一优选例中,当所述的组织为新鲜组织时,所述步骤(iii)中,所述的离心包括:
(iii-1)将样本溶解液倒入吸附柱中,在第一离心管中11000-13000rpm离心10-50秒,倒去收集管中废液;
(iii-2)向吸附柱内加入缓冲液,在第一离心管中11000-13000rpm离心10-50秒,倒掉收集管中废液;
(iii-3)向吸附柱内加入漂洗液,在第一离心管中11000-13000rpm,离心10-50秒,倒掉收集管中废液,并重复一次;
(iii-4)空转11000-13000rpm,1-3分钟;
(iii-5)将吸附柱放入第二离心管中,向吸附膜中间加入30-70μl的缓冲液TE,室温孵育1-3分钟,11000-13000rpm离心1-3分钟,得到抽提的基因组DNA。
在另一优选例中,当所述的组织为石蜡包埋组织时,所述步骤(iii)中,所述的离心包括:
(iii-1)将样本溶解液倒入吸附柱中,在第一离心管中6000-10000rpm离心0.5-2分钟,倒去收集管中废液;
(iii-2)向吸附柱内加入500μl缓冲液,在第一离心管中6000-10000rpm离心0.5-2分钟,倒掉收集管中废液,再重复两次;
(iii-3)空转11000-13000rpm,1-3分钟;
(iii-4)将吸附柱放入第二离心管中,向吸附膜中间加入30-70μl的缓冲液TE,室温孵育1-3分钟,11000-13000rpm离心1-3分钟,得到抽提的基因组DNA。
优选的抽提处理包括步骤:
新鲜组织抽提:将组织样本置于冰上,剪取米粒大小组织样本放入1.5m1离心管,并用手术刀尽可能的剪碎。加入200μl缓冲液和20μl蛋白酶K溶液,56℃水浴2小时以上直至组织溶解。加入200μl缓冲液,充分颠倒混匀,70℃水浴10分钟。加200μl的无水乙醇,充分震荡15秒。将所有的溶液和沉淀都倒入吸附柱中,12000rpm离心30秒,倒去收集管中废液。向吸附柱内加入500μl的缓冲液,12000rpm离心30秒,倒掉收集管中废液。向吸附柱内加入700μl的漂洗液,12000rpm,离心30秒,倒掉收集管中废液,并重复一次。空转12000rpm 2分钟,将吸附柱放入新的1.5ml离心管中,向吸附膜中间加入50μl的缓冲液TE,室温孵育2分钟,12000rpm离心2分钟,离心管中的液体即为抽提的基因组DNA。
石蜡包埋组织抽提:将5-8片10μm厚的组织切片样品刮入1.5ml离心管,加入1ml二甲苯,振荡2min,12000rpm,4℃的条件下离心2min,弃上清。再加入1ml无水乙醇,振荡2min,12000rpm,4℃的条件下离心2min,弃上清,再重复洗涤1次。37℃干燥10-15min,至酒精完全挥发。加入200μl缓冲液和20μl蛋白酶K溶液,混匀。56℃水浴2h以上,直至样品完全溶解,再于90℃水浴1h。加入220μl缓冲液,250μl无水乙醇,震荡混匀。将所有的溶液倒入吸附柱中,8000rpm离心1分钟,倒去收集管中废液。向吸附柱内加入500μl缓冲液,8000rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,再重复两次。空转12000rpm 2分钟,将吸附柱放入新的1.5ml离心管中,向吸附膜中间加入50μl的缓冲液TE,室温孵育2分钟,12000rpm离心2分钟,离心管中的液体即为抽提的基因组DNA。
在另一优选例中,所述步骤(2)中PCR反应条件为:95℃变性10min;随后94℃变性30sec,60℃退火60sec,进行40个循环;最后98℃延伸10min,4℃保存。
所述扩增产物的分析可以采用对HER2扩增产物和内参基因扩增产物的含量进行比较的方式。一般而言,该比值≥2.0即为突变阳性。常规方法中,由于测定结果浮动幅度较大,一般设定为该比值≥2.2时判断出现HER2阳性,≤1.8时为阴性,在上述两端点范围内则为疑似阳性。而本申请方法由于测定结果浮动幅度非常小(一般≤±0.02),故可以依据本申请方法测定的比值,对上述属于疑似阳性范围内的样本进行准确的判断。在另一优选例中,所述的步骤(4)包括:分析所述HER-2引物对H1、H2,内参基因CEP17引物对C1、内参基因EFTUD2引物对E1和E2扩增产物的拷贝数,并用HER-2基因拷贝数去除以内参基因拷贝数,得到六组比值,即H1/C1,H1/E1,H1/E2,H2/C1,H2/E1,H2/E2,若六个比值均小于等于2.0,则判定为Her2阴性,若六个比值中有1个大于2.0,则判定为Her2阳性。
在另一优选例中,所述方法具有以下的灵敏度:从10万个正常DNA分子中检测到一个HER2突变分子。
本发明的方法优选地还可以与其他HER2突变检测方法进行结合,从而进一步提高疑似阳性范围内的样本的判断准确度。例如,在本发明的一个优选实施方式中,所述的方法还包括:对来自于同一检测对象的外周血浆进行ddPCR检测,得到其mRNA表达和DNA拷贝数变异。
本发明一种特别优选的实施方式中,所述的扩增包括步骤:
(1)提取乳腺癌患者肿瘤组织基因组DNA。
(2)实验所用引物包括H1、H2、C1、E1、E2共5对引物。其中H1和H2扩增目的片段对应为HER2基因片段,C1扩增目的片段为CEP17基因片段,E1和E2扩增目的片段对应为EFTUD2基因片段。C1、E1、E2引物对所扩增片段作为内参基因片段。所有探针类型均为VIC或FAM探针。
(3)进行ddPCR反应。每个待测样本同时进行5组PCR反应,每组PCR反应用H1、H2、C1、E1、E2中的1对引物。
a.20μl PCR反应体系如下:待测肿瘤组织DNA 50~100ng,2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl,HER2基因或者内参基因引物上下游各1μl,HEX探针1μl,无菌蒸馏水补足至20μl;
b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器(Bio-RadLaboratories,USA)生成纳升级别的油包水的液滴;
c.PCR反应条件为:95℃变性10min;随后94℃变性30sec,60℃退火60sec,进行40个循环;最后98℃延伸10min,4℃保存;
d.PCR反应结束后,将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-RadLaboratories,USA)对所有样品孔进行荧光检测。
(4)结果分析
实验中共用了5组引物,分别是HER-2引物H1和H2,内参引物C1、E1和E2。通过ddPCR得出每个标本对应每对引物的拷贝数,然后用HER-2基因拷贝数去除以内参基因拷贝数,得到六组比值,即H1/C1,H1/E1,H1/E2,H2/C1,H2/E1,H2/E2。根据比值结果,六个比值均小于等于2.0,则判定该患者乳腺癌为Her2阴性,若六个比值中有1个大于2.0,则为Her2阳性。
本发明相对于现有技术,有以下优点:
(1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度(0.001%)(即可以从10万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在),仅需使用100ng的DNA模板即可完成检测。
(2)本发明的方法采用两组内参基因的方式进行,从而有效地排除了由于CEP17扩增导致的假阴性结果,因此相较于现有技术中仅以CEP17作为内参的方案具有更高的准确性。
(3)在本领域中,常规的突变标准为待测基因拷贝数/内参基因拷贝数≥2.2,但由于本发明方法具有很好的扩增灵敏度,检测结果稳定,因此可以对于HER2疑似阳性(FISH检测结果1.8-2.2之间)的患者进行定性检测。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
各实施例中,引物和探针序列如下:
Her2:
H1-F:ACAACCAAGTGAGGCAGGTC
H1-R:GTATTGTTCAGCGGGTCTCC
H1-FAM:CCCAGCTCTTTGAGGACAAC
H2-F:CTCATCGCTCACAACCAAGT
H2-R:GGTATTGTTCAGCGGGTCTC
H2-FAM:CTGCGGATTGTGCGAGGC
EFTUD2:
E1-F:GGTCTTGCCAGACACCAAAG
E1-R:TGAGAGGACACACGCAAAAC
E1-VIC:GGACATCCTTTGGCTTTTGA
E2-F:GCACTCCTGTGACAGTGGTC
E2-R:GACACACGCAAAACCAAGAC
E2-VIC:CTCCAGGTAGGACATCCTTTGGCT
CEP17:
C1-F:CCTATGGTAGAAAAGGAAATACTC
C1-R:TGTCAACAGGAATGTTCAAAT
C1-VIC:AGACAGAATCATTATCAGAAACTAC
实施例1利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性
(1)提取乳腺癌患者肿瘤组织基因组DNA;
将组织样本置于冰上,剪取米粒大小组织样本放入1.5m1离心管,并用手术刀尽可能的剪碎。加入200μl缓冲液和20μl蛋白酶K溶液,56℃水浴2小时以上直至组织溶解。加入200μl缓冲液,充分颠倒混匀,70℃水浴10分钟。加200μl的无水乙醇,充分震荡15秒。将所有的溶液和沉淀都倒入吸附柱中,12000rpm离心30秒,倒去收集管中废液。向吸附柱内加入500μl的缓冲液,12000rpm离心30秒,倒掉收集管中废液。向吸附柱内加入700μl的漂洗液,12000rpm,离心30秒,倒掉收集管中废液,并重复一次。空转12000rpm 2分钟,将吸附柱放入新的1.5ml离心管中,向吸附膜中间加入50μl的缓冲液TE,室温孵育2分钟,12000rpm离心2分钟,离心管中的液体即为抽提的基因组DNA。
(2)进行PCR扩增。每个待测样本同时进行5组PCR反应,每组PCR反应用H1、H2、C1、E1、E2中的1对引物。
a.20μl PCR反应体系如下:待测肿瘤组织DNA 50~100ng,2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl,HER2基因或者内参基因引物上下游各1μl,HEX探针1μl,无菌蒸馏水补足至20μl;
b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器(Bio-RadLaboratories,USA)生成纳升级别的油包水的液滴;
c.PCR反应条件为:95℃变性10min;随后94℃变性30sec,60℃退火60sec,进行40个循环;最后98℃延伸10min,4℃保存;
d.PCR反应结束后,将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-RadLaboratories,USA)对所有样品孔进行荧光检测。
(3)结果分析
根据以上比值判断,样本1所有六组比值均小于2.0,判断该乳腺癌患者为HER2阴性;样本2中有四组比值大于2.0,判断该乳腺癌患为HER2阳性。
实施例2ddPCR技术检测赫赛汀耐药性
1-30号乳腺癌患者样本,分别用传统IHC和FISH技术和如实施例1中所述的方法,测定得到各个样本的H1/C1、H1/E1、H1/E2、H2/C1、H2/E1、H2/E2值。结果如下表所示:
其中,17和18号患者,在肿瘤确诊后进行了循环肿瘤细胞CTC检测,分别检出3个和5个CTC,其中分别有2个和3个CTC为Her2阳性。在医生的建议下,患者于手术后开始使用赫赛汀,一年后无复发现象,肿瘤控制较好。
另外13、14、15、16、19和20号患者因无法根据IHC和FISH技术进行Her2阳性判断,医生未对其使用赫赛汀。用本发明的方法,鉴定19号以及20号患者为Her2阳性,13、14、15、16号患者为Her2阴性。通过本发明方法鉴定为Her2阳性的患者(19和20号),1年内肿瘤均出现不同程度转移或复发;而用本发明的方法鉴定为Her2阴性的患者(13、14、15、16),仅1例患者在1年半后出现转移(14号)。
21和22号的患者FISH检测为Her2阳性,IHC检测为临界值,本发明方法检测为阴性,医生推荐其使用了赫赛汀。两名患者分别在第8个月和第10个月复发,表明其未从赫赛汀使用中获益,这与使用本发明方法的鉴定结果一致(阴性)。
此外,可以看出,若仅用CEP17作为内参,则仅看H1/C1和H2/C1的结果,即18、20和25号患者检出结果与实际结果并不一致。当仅用CEP17作为内参时,显示这三位患者为Her2阴性,而采用CEP17和EFTUD2同时作为内参时,得出这三位患者均为阳性,与用药后的实际结果一致,说明EFTUD2内参位点的引入有助于提高乳腺癌Her2阳性的判断准确度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种HER2拷贝数变异检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括:用于检测HER2基因的两对引物,和用于检测选自下组的内参基因的一对或多对引物:CEP17、EFTUD2,或其组合。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括用于检测CEP17基因的一对引物。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括用于检测EFTUD2基因的2对引物。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
(a)第一容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对;
(b)第二容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对;
(c)第三容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含CEP17基因的特异引物对;
(d)第四容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物对;
(e)第五容器,以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物对;
(f)使用说明书(如插页),其中,所述说明书记载了使用方法。
5.一种如权利要求1-4中任一所述的试剂盒的用途,其特征在于,用于制备:(a)用于检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感的试剂盒;(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用赫赛汀进行治疗的试剂盒;(c)用于检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感。
6.一种样本中HER2突变阳性检测方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)提供一检测样本,所述的检测样本是肿瘤组织样本;
(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理,从而获得含抽提DNA的DNA抽提物;
(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板,进行微滴式数字PCR(ddPCR),从而获得含HER2基因和内参基因的扩增产物;和
(4)对所述扩增产物进行分析,从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或比例;
其中,所述的内参基因是CEP17和EFTUD2。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在ddPCR中,反应体系中还含有用于检测HER2基因和内参基因的探针。
8.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述的样本来自于选自下组的检测对象:乳腺癌患者。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤(4)包括:分析所述HER-2引物对H1、H2,内参基因CEP17引物对C1、内参基因EFTUD2引物对E1和E2扩增产物的拷贝数,并用HER-2基因拷贝数去除以内参基因拷贝数,得到六组比值,即H1/C1,H1/E1,H1/E2,H2/C1,H2/E1,H2/E2,若六个比值均小于等于2.0,则判定为Her2阴性,若六个比值中有1个大于2.0,则判定为Her2阳性。
10.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的方法还包括:对来自于同一检测对象的外周血浆进行ddPCR检测,得到其mRNA表达和DNA拷贝数变异。
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