CN105838778A - ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法，及其在监控帕尼单抗/西妥昔单抗治疗结直肠癌过程中的应用。本发明首先对结直肠癌患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中KRAS的耐药突变位点G13D的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。

Description

ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，具体地涉及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆中KRAS基因耐药突变位点G13D基因突变的方法及其在监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药性等方面的应用。

背景技术

随着生物医药科技的发展，分子靶向药物已经广泛应用于肿瘤的治疗中，与常规化疗相比，靶向治疗具有效果好、副作用小等优点。临床应用结果表明，部分患者对靶向药物会产生耐药性。美国癌症协会研究表明，90％以上的肿瘤患者在治疗过程中不同程度上受耐药影响。肿瘤细胞的耐药性分为为原发性耐药和继发性耐药。前者在治疗开始时癌细胞对药物即不敏感，后者是指原来对药物敏感的癌细胞群，在反复治疗经与药物屡次接触的过程中出现了耐药性。

Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。作为原癌基因的ras基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因，ras基因通过突变而激活。其中，K-ras则对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则不受上游EGFR的信号影响，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。这也是具有突变型K-ras基因患者对帕尼单抗/西妥昔单抗治疗无效的理论基础。

近期研究表明，KRAS基因的突变是造成很多患者对“抗-EGFR抗体”产生获得性抗药性的原因。Misale等人通过细胞系模型发现，KRAS突变会造成对“西妥昔单抗”(cetuximab)的抗药性。在用“西妥昔单抗”或“帕尼单抗”治疗的结肠直肠癌患者中，抗药性与事先存在的亚克隆选择的KRAS突变或者治疗过程中获得的突变相关。Diaz等还发现，KRAS突变在对“帕尼单抗”有抗药性的患者中会积累。因此，检测病人KRAS基因是否突变成为实时监测能否持续使用帕尼单抗/西妥昔单抗的必要前提条件。

继发性耐药检测一般在服用分子靶向药物之后进行，有研究发现，继发性耐药突变存在累积效应，在服用药物之前，也有患者体内已经存在微小的耐药突变；因此，也可在治疗之前进行继发性突变位点检测，超早期发现其耐药情况。然而,传统的检测方法需要以肿瘤组织的基因组DNA为模板，这为患者在治疗过程中的多次检测和实时监控带来了困难。

血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。

研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。

然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、数字PCR)，仍难以准确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠癌患者中循环游离DNA的平均含量(4771ng/ml)与健康人的平均含量(0.85ng/ml)存在显著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原(CEA)的检测只有47％检测结果对诊断有意义。

因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。

综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中肿瘤相关突变(如KRAS G13D突变)的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够用非肿瘤组织(如血液或血浆样品)检测患者KRAS G13D突变的方法。

本发明的第一方面，提供了一种对KRAS基因耐药突变位点进行检测的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；

(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；

(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和

(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出KRAS基因耐药突变位点的突变形式和/或比例。

在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：KRAS G13D。

在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。

在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本。

在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。

在另一优选例中，所述的预处理包括：

(a)将采集的外周血至于非肝素的抗凝管(如EDTA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝管))中；

(b)经一级离心处理，去除沉淀，分离获得液相(血浆)；

(c)对上一步骤的获得的液相进行二级离心，去除沉淀，分离获得液相作为用于提取DNA的检测样本。

在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：

(b-i)2000-5000rmp；

(b-ii)离心约1-15分钟；

(b-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。

在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件：

(c-i)10000-15000rmp；

(c-ii)离心约5-30分钟；

(c-iii)温度0-8℃，较佳地4±2℃。

在另一优选例中，在步骤(3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50～100ng。

在另一优选例中，所述的突变是KRAS G13D。

在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。

在另一优选例中，ddPCR中所用的PCR扩增引物对为包含KRAS G13D突变位点的特异引物对。

在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。

在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；

或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。

在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，KRAS G13D的特异引物对(9μM)及探针(5μM)各1μl。

在另一优选例中，所述的样本来自于结直肠癌患者。

在另一优选例中，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：

(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；

在另一优选例中，蛋白酶K的加入量为200μg/100微升检测样本。

在另一优选例中，(2a)中还包括：在消化结束后，对蛋白酶K进行灭活。

(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；

在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0.1ng/100微升检测样本。

在另一优选例中，步骤(2b)的放置时间为5-10分钟。

(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；

(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量为20-100ng/微升；和/或所述含洗脱DNA的洗脱液的体积为20-100微升。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的大小为100-250bp，更佳地为150-200bp。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占DNA总量的80-100％，较佳地90-100％。

在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。

在另一优选例中，所述的洗脱包括：AVE洗脱。

在另一优选例中，在步骤(2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的片段大小。

本发明的第二方面，提供了一种KRAS基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法；

其中，所述的突变位点包括KRAS G13D。

在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。

在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针。

在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。

本发明的第三方面，提供了一种KRAS基因耐药突变位点G13D检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对，并且引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中所示；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法；

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；并且所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为HEX探针；

或所述的突变型探针为HEX探针，所述的野生型探针为FAM探针。

本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面或本发明第三方面所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对帕尼单抗/西妥昔单抗的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗的试剂盒。

在另一优选例中，所述的肿瘤患者包括结直肠癌患者。

在另一优选例中，所述的肿瘤患者为人。

在另一优选例中，所述是检测包括在给予帕尼单抗/西妥昔单抗之前、之中、或之后进行检测。

本发明的第五方面，提供一种肿瘤患者帕尼单抗/西妥昔单抗耐药性的检测方法，包括步骤：用如本发明第一方面所述的方法进行KRAS基因耐药突变位点G13D检测；和

若检测结果为阳性，则判定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药；若检测结果为阴性，则判定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗敏感。

在另一优选例中，所述的肿瘤为结直肠癌。

本发明的第六方面，提供了一种肿瘤患者治疗方法，包括步骤：

(a)用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象进行KRAS基因耐药突变位点G13D检测，并对检测结果为阴性的对象，采用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗；

(b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象再次进行KRAS基因耐药突变位点G13D检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗。

在另一优选例中，在步骤(b)中还包括：记录首次检测到KRAS G13D突变阳性的时间。

在另一优选例中，所述的治疗周期为3-9个月。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是ddPCR仪微滴数目结果显示。图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数；纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目；其中图1(A.B)显示了KRAS G13D位点突变阳性的检测结果，图1(C.D)显示了KRAS G13D位点突变阴性的检测结果。

图2是ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果显示。图中蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区；纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度；其中图2(A)显示了KRAS G13D位点突变阳性的检测结果，图2(B)显示了KRAS G13D位点突变阴性的检测结果。

图3显示实施例中KRAS(G13D)突变阳性的检测结果。其中图3(A)为该检测位点的突变型检测结果图，图3(B)为该检测位点的野生型检测结果图；图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数；纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。

图4为实施例1中的血浆游离DNA跑胶图。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，通过对于大量方法和试剂的筛选，意外地发现，通过改进的血浆样本制备和添加特定的富集剂(如RNA carrier)，并结合微滴式数字PCR技术和高特异性的引物序列和探针序列，居然可以用外周血浆样本高效地提取到的肿瘤相关性的DNA分子，从而高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中KRAS G13D突变，从而可辅助判断患者是否对帕尼单抗/西妥昔单抗产生耐药。基于上述发现，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“肿瘤相关突变”指与肿瘤的发生、进展、治疗、和/或预后相关的基因突变，尤其是与肿瘤治疗的耐药性相关的DNA突变。

如本文所用，术语“本发明突变”、“本发明的耐药性突变”或“KRAS G13D突变”可互换使用，指KRAS蛋白的G13D突变(在蛋白质水平，KRAS蛋白第12/13号氨基酸均由甘氨酸(G)突变为其他氨基酸，如天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)等(优选为由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D))，以及导致该氨基酸突变的相应的核苷酸突变(基因水平)。研究表明，通过检测KRASG13D这一突变位点的突变情况，对于肿瘤患者是否采用或继续采用帕尼单抗/西妥昔单抗治疗，有指导作用。

如本文所用，术语“非肿瘤组织”指与肿瘤组织不同的组织。在本发明中，对于实体瘤而言，血液和血浆可视为“非肿瘤组织”。

如本文所用，术语“RNA Carrier”为一种市售的、用于协助分离RNA的试剂。其成分为ployG偶联到DNAmate一种高分子化合物。研究表明，RNA Carrier能特异吸附低浓度RNA，并且有助于减少提取过程中RNA被RNase降解。然而，研究表明，RNA Carrier对于常规双链DNA的提取无促进作用。

本发明的目的是提供一种用ddPCR技术通过检测结直肠癌患者外周血浆或血清中KRAS基因突变以判定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法。

本发明的另一目的是提供根据KRAS基因突变推测结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗产生继发耐药的时间的方法。

本发明的最终目的是利用ddPCR技术，检测结直肠癌患者外周血浆或血清中KRAS G13D的突变情况，再根据检测结果判定患者是否对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药，并推测患者对帕尼单抗/西妥昔单抗产生继发耐药的时间，为调整结直肠癌患者治疗方案提供指导。

外周血样本中提取DNA模板

由于外周血样本中可用于有效检测肿瘤相关性的DNA的量非常少，因此需通过一定的富集手段对外周血游离DNA进行富集，以得到能够用于检测量的DNA。

本发明中，优选的DNA的抽提方法如下：

(2a)将血浆或血清样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；

(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；

在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0.1ng/100微升检测样本。

在另一优选例中，步骤(2b)的放置时间为5-10分钟。

(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；

(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。

完成上述抽提后，所得到的的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量通常为20-100ng/微升，所述含洗脱DNA的洗脱液的体积通常为20-100微升。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的平均大小通常为≤300bp(即基本由游离DNA组成)，较佳地为100-250bp，更佳地为150-200bp。

在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占DNA总量的80-100％，较佳地90-100％。

在另一优选例中，所述的固相载体为硅膜。

在另一优选例中，所述的洗脱包括：AVE洗脱。

在另一优选例中，在步骤(2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的片段大小。

KRAS基因耐药突变位点G13D的检测

数字PCR(digital PCR，dPCR)技术被称为“第三代PCR”技术，是一项检测和定量核酸分子的新技术，在不依靠任何校准物或外标的情况下，可直接进行单个目标分子的计数，以实现绝对定量。微滴式数字PCR系统(droplet digitalPCR，ddPCR)将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离DNA。与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检靶分子的绝对数目，特别适合拷贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。

在本发明中，优选的DNA模板是用外周血分离的血浆或血清提取的，较佳地，在提取DNA模板前，将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4℃，之后将离心获得的血浆或血清用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4℃，弃沉淀，上清即为所需抽提DNA的血浆或血清。

优选的本发明实施例中，DNA模板的提取方法如下：

(i)抽提血浆或血清中的游离DNA；

(ii)对样本进行裂解、富集、过柱洗脱和AVE洗脱，得到待扩增的DNA模板；

任选地，所述方法还包括步骤：(iii)测试所述DNA模板的片段大小。

本申请的PCR方法中，所使用的引物对为包含KRAS G13D突变位点的特异引物。在本发明的一个优选实施例中，所述的特异引物具有如SEQ ID NO:3，(AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC)和SEQ ID NO:4，(CCTCTATTGTTGGATCATATTCG)所示的序列，或具有如SEQ ID NO:7(AAATGACTGAATATAAACTTGTGGT)和SEQ ID NO:8(TCTATTGTTGGATCATATTCGTC)所示的序列。所用探针包括一条用于检测突变型的突变型特异探针，和一条用于检测野生型的野生型特异探针。优选地，突变型探针类型为FAM探针(例如但并不限于SEQ ID NO:1，GGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAG或SEQ ID NO:5，GTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCA)，所述的野生型探针类型为HEX探针(例如但并不限于SEQ ID NO:2，GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAG，或SEQID NO:6，GTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCA所示的序列)。

在本发明的一个优选例中，所述的微滴式数字PCR的反应液首先通过QX100微滴发生器生成纳升级别的油包水的液滴，然后再进行PCR反应，最后将PCR板转移到QX100微滴分析仪对所有样品孔进行荧光检测。

在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应所使用的反应体系每20μl组成如下：待测肿瘤组织DNA 50～100ng，2×ddPCR SuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，KRAS G13D的特异引物及探针各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应的反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

本发明的一种优选实施方式中，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)提取患者血清/血浆中游离DNA：抽取患者外周血4mL，分离得到血浆/血清，利用“QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit”对血浆/血清中游离DNA进行抽提。通过对样本的溶解、富集、过柱洗脱以及最后AVE洗脱获得高浓度/高纯度的DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定其片段大小(<313bp)，以保证抽提质量。

(2)反应体系配制

a.探针及引物设计：实验所用引物为包含KRAS密码子G13D位点的特异引物，所用探针包括每个位点各一条突变型特异探针和野生型特异探针。突变型探针标记为FAM荧光，野生型探针标记为HEX荧光。

b.20μl PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50～100ng，2×ddPCRSuperMix for Probes(Bio-Rad Laboratories)10μl，KRAS密码子12/13位点野生型和突变型的探针引物(已混合配制好)各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

(3)制备微滴

在DG8^TM微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX100微滴发生器内进行反应，QX100微滴发生器最多能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。

(4)PCR扩增

将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

(5)微滴检测

PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-Rad LaboratoriesUSA)上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行荧光检测。

(6)结果分析

在野生型片段有扩增(在HEX荧光信号区域有微滴分布)的前提下存在突变型片段的扩增(在FAM荧光信号区域有微滴分布)，则判断该基因有突变，KRASG13D位点突变阳性。

本发明的一个优选实施例中，检测ddPCR仪微滴荧光信号分布区结果如图1所示，图中，蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，橙色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道荧光信号强度，横坐标代表HEX通道荧光信号强度。其中，图1A显示了KRAS G13D突变阳性的检测结果，图1B显示了KRAS G13D突变阴性的检测结果。

本发明的一个优选实施例中的ddPCR仪微滴数目检测结果如图2所显示。图中，深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表微滴数目。其中图2A显示了KRAS G13D突变阳性的检测结果，图2B显示了KRAS G13D突变阴性的检测结果。

帕尼单抗/西妥昔单抗耐药性判断

由于KRAS G13D突变阳性与患者(优选为结直肠癌患者)帕尼单抗/西妥昔单抗耐药性相关(KRAS蛋白第13号氨基酸由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D))，因此，本发明的检测方法可以用于辅助判断患者是否对帕尼单抗/西妥昔单抗产生耐药。本申请利用ddPCR技术检测接受帕尼单抗/西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者外周血浆或血清中KRAS G13D的突变情况，根据检测结果判定患者是否对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药，并推测患者对帕尼单抗/西妥昔单抗产生继发耐药的时间，为调整结直肠癌患者治疗方案提供指导。

在本发明的优选实施例中，取患者外周血样本并提取基因组DNA，以待测外周血浆或血清基因组DNA为模板，利用上述方法对KRAS基因的耐药突变位点G13D进行检测，然后根据检测到KRAS基因的G13D位点突变阳性的时间确定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗产生耐药的时间。

由于本发明方法可以采用较易采样的外周血样本进行检测，因此，所述的检测可以多次进行，从而在患者的治疗过程中实时监控。

本发明方法既可以在用药前对患者的耐药性进行判断，也可以在用药过程中或之后判断患者是否已经产生耐药性，从而为后续治疗提供指导。在本发明的优选实施例中，所述的结直肠癌患者可以是尚未使用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗的结直肠癌患者，也可以是已经开始使用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗的患者。

在本发明的一个优选例中，在每个治疗周期前后，取结直肠癌患者外周血样本，分离血浆或血清并提取基因组DNA，以待测外周血浆或血清基因组DNA为模板，利用ddPCR技术对KRAS基因的耐药突变位点G13D进行检测，然后根据检测到KRAS基因的G13D位点突变的阳性或阴性，确定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗是否产生耐药。

若检测结果为KRAS密码子G13D位点突变阴性，则患者对帕尼单抗/西妥昔单抗敏感；若检测结果为KRAS密码子G13D位点突变阳性，则患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药。

在本发明的一个优选实施例中，利用ddPCR技术通过检测外周血浆或血清中基因突变以监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法包括如下步骤：

(1)提取结直肠癌患者血浆/血清中的游离DNA；

(2)以待测的游离DNA为模板，分别用KRAS G13D位点的野生型和突变型探针引物进行PCR扩增和ddPCR分析；

(3)根据ddPCR对目的基因位点突变情况的检测结果，分析患者对帕尼单抗/西妥昔单抗的耐药情况；

(4)根据患者出现KRAS密码子G13D位点突变阳性的时间判定其对帕尼单抗/西妥昔单抗产生耐药的时间。

其中，所述ddPCR的反应体系和反应条件没有特别的限制，在本发明的另一优选实施例中，所述的步骤(2)中，所述的PCR扩增反应体系为20μl，具体组成成分如下：待测患者血浆游离DNA 50～100ng，2×ddPCR SuperMix forProbes(Bio-Rad Laboratories)10μl，KRAS密码子G13D位点野生型和突变型的探针引物(已混合配制好)各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

在本发明的另一优选实施例中，所述步骤(2)中PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

本发明相对于现有技术，有以下优点：

(1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度(0.001％)(即可以从10万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)，仅需使用100ng的DNA模板即可完成检测。

(2)本发明的检测方法仅需使用检测对象的外周血浆或血清游离DNA即可完成检测，无需采集肿瘤组织进行检测，操作简便，无创，可重复进行。

(3)使用本发明方法，可以准确地检测出由于肿瘤组织异质性导致的KRAS突变假阴性，仅需使用外周血样本即可完成检测。

(4)在患者用药治疗的过程中，可定期从患者的血浆/血清中抽提DNA进行检测，实时监控其突变情况，确保在超早期发现患者是否产生继发性耐药突变，更好的指导后续的治疗措施。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

各实施例中所使用的引物序列和探针序列如下：

KRAS(G13D)

Probe-FAM:GGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAG

Probe-HEX:GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAG

F:AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC

R:CCTCTATTGTTGGATCATATTCG

通用方法

血浆/血清样本的预处理

血浆分离方法如下：

将待检测的外周血样本首先进行离心处理，3000rpm，3min，4℃，之后将离心获得的血浆用移液枪移至2ml的离心管中，再次离心，13300rpm，10min，4℃，弃沉淀，上清即为所需抽提DNA的血浆。

血清分离方法如下

提取血清的外周血样本需要用促凝管进行抽血并保存，分离血清的方法有2种：(1).室温进行自然沉降(约2h)后，3000rpm离心10min，取上清，即为血清；(2).4℃进行自然沉降(12h)，直接取上清，即为血清。后续与血浆一样进行DNA抽提

血浆/血清中DNA样本的分离

血浆样本中提取DNA的过程如下：

a、裂解

加入一定量的Proteinase K，使其终浓度为2mg/1ml血浆，在60℃的条件下裂解去除蛋白质从而将游离DNA释放出来。与此同时，加入ACL(carrier RNA)试剂来使DNase和RNase失活并使得游离核酸完全从结合的蛋白上释放出来。

b、过柱纯化

在裂解好的血浆中加入ACB溶液(QIAGEN公司)，使其终浓度为1.8ml/1ml血浆，冰浴5min后，用硅胶柱进行过柱纯化。

c、洗脱

过柱之后，加入相应的洗脱液对柱子进行洗涤，最后加入无水乙醇沉淀DNA分子。

d、溶解

在干燥之后的吸附柱中加入30ul Buffer AVE进行溶解，室温放置一段时间后,进行离心处理，得到纯化的基因组DNA。

e、对提取得到的血浆游离DNA进行质检，首先用Nanodrop检测其浓度，正常情况下2ml血浆可抽提出30～50ng/ul的血浆游离DNA。之后通过Agilentbioanalysis 2100检测其片段大小，以确定其为血浆游离DNA(<300bp)。图4为Agilent bioanalysis 2100质检图，横坐标为Marker大小(其中35bp和≈10000bp峰为外加标记物)，纵坐标为峰值强度，抽提得到的血浆游离DNA的片段大小主要集中在169bp左右，符合要求。

血清样本的DNA抽提过程与血浆样本中类似。

实施例1一种通过ddPCR技术检测血清/血浆中KRAS基因突变从而监测结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法

(1)某结直肠癌患者开始进行帕尼单抗/西妥昔单抗治疗开始前，采集外周血4mL，分离得到血浆/血清，对血浆/血清中游离DNA进行抽提。通过对样本的溶解、富集、过柱洗脱以及最后AVE洗脱获得高浓度/高纯度的DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定其片段大小(<313bp)，以保证抽提质量。

(2)反应体系配制：a.探针及引物设计：实验所用引物为包含KRAS密码子12/13位点的特异引物，所用探针包括每个位点各一条突变型特异探针和野生型特异探针。突变型探针标记为FAM荧光，野生型探针标记为HEX荧光。b.20μlPCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50～100ng，2×ddPCR SuperMix forProbes(Bio-Rad Laboratories)10μl，KRAS G13D位点野生型和突变型的探针引物(已混合配制好)各1μl，无菌蒸馏水补足至20μl。

(3)制备微滴：在DG8^TM微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR

反应液，70ul微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX100微滴发生器内进行反应，QX100微滴发生器最多能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。

(4)PCR扩增：将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

(5)微滴检测：PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪(Bio-RadLaboratories USA)上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行荧光检测。

(6)结果分析：经检测，该患者的KRAS G13D位点未发生突变，提示患者目前尚未产生对帕尼单抗/西妥昔单抗的继发性耐药，但应定期(每3-6个月)进行实时监控，一旦发现产生对帕尼单抗/西妥昔单抗的继发性耐药，及时指导患者调整治疗方案。

(7)该患者开始进行帕尼单抗/西妥昔单抗治疗6个月后，采集其外周血，对血浆/血清中游离DNA进行抽提，重复以上(1)-(5)步骤。

(8)经检测，该患者的KRAS G13D突变阴性，提示患者目前仍未对帕尼单抗/西妥昔单抗产生继发性耐药，建议定期(每3-6月)进行实时监测。

(9)该患者开始进行帕尼单抗/西妥昔单抗治疗9个月后，采集其外周血，对血浆/血清中游离DNA进行抽提，重复以上(1)-(5)步骤。

(10)经检测，该患者的KRAS G13D位点突变阳性，突变率为3.14％，见(图3)，提示患者已出现帕尼单抗/西妥昔单抗耐药，产生耐药的时间是在开始帕尼单抗/西妥昔单抗治疗第6个月到9个月之间，提示患者应及时调整治疗方案。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对KRAS基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本或血液样品；

(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；

(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和

(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出KRAS基因耐药突变位点的突变形式和/或比例。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，以及用于检测突变位点的探针。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于结直肠癌患者。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的抽提处理包括步骤：

(2a)将血浆样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液；

(2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液；

(2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附有DNA的固相载体；

(2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。

5.一种KRAS基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法；

其中，所述的突变位点包括KRAS G13D。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。

7.一种KRAS基因耐药突变位点G13D检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对，并且引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中所示；

(b)RNA carrier；

(c)使用说明书(如插页)，其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法；

(d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；并且所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示。

8.一种如权利要求5或7所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对帕尼单抗/西妥昔单抗的耐药性的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗的试剂盒。

9.一种肿瘤患者帕尼单抗/西妥昔单抗耐药性的检测方法，其特征在于，包括步骤：用如权利要求1-4任一所述的方法进行KRAS基因耐药突变位点G13D检测；和

若检测结果为阳性，则判定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药；若检测结果为阴性，则判定患者对帕尼单抗/西妥昔单抗敏感。

10.一种肿瘤患者治疗方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用如权利要求1所述的方法，对所述对象进行KRAS基因耐药突变位点G13D检测，并对检测结果为阴性的对象，采用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗；

(b)在一个或多个治疗周期之中或之后，用如权利要求1所述的方法，对所述对象再次进行KRAS基因耐药突变位点G13D检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用帕尼单抗/西妥昔单抗进行治疗。