一种cfDNA野生型标准品及其制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体地涉及一种cfDNA标准品的制备方法。
背景技术
Mandel与Metais于1948年首先在人血液样本中发现了细胞游离DNA的存在(cfDNA)(Mandel P,Métais P.Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme[The nucleic acids of blood plasma in humans].Cr hebd séances Acadsci.1948;(142):241-243.)。三十年后发现,癌症病人的血清和血浆中cfDNA的浓度比健康人的要高(Leon SA,Shapiro B,Sklaroff DM,Yaros MJ.Free DNA in the serum ofcancer patients and the effect of therapy.Cancer Res.1977;(37):646-650.)。随后发现,前者含有肿瘤特异性的分子突变,提示源自肿瘤的cfDNA,即循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),能够出现在血液循环中。cfDNA和ctDNA也被报道能够在患有膀胱癌、结肠癌和非小细胞肺癌的病人的尿液中被检测到。到目前为止,cfDNA的具体来源仍然不清楚。推测cfDNA通过正常或恶性细胞的凋亡或坏死得以释放。此外也有研究提供证据表明cfDNA的释放可能通过胞外囊泡如外泌体进行。
近年来,基于cfDNA和ctDNA的液体活检技术发展迅速,包括对靶向的分子检测进行高通量测序、疾病监控、治疗效果的评价,以及未来可能的癌症检测。患者血液中含有游离DNA(cell-free DNA,cfDNA),含量与肿瘤的大小和分期有关,其中来源于肿瘤细胞的cfDNA(ctDNA)携带基因突变相关信息,可作为一种肿瘤标志物。液体活检克服了肿瘤组织取样有创伤,且受肿瘤部位、大小、患者情况限制的问题,可在疾病进程中随时获取,取样方便、微创。然而由于人体液中cfDNA的丰度很低,持续获取病人相关材料的难度非常大,这些新的技术平台的开发具有很大的挑战性。要将cfDNA和ctDNA的检测结果解释为具有临床意义的结果还需要精准的技术来实现高灵敏度和高特异性的测量。并且,在工作流程、样本采集或检测中存在限制的情况下,特别需要确保检测的临床相关性。同任何临床流程一样,cfDNA的样本处理需也需要质量有保证的技术和对照方法,包括全面的确证过程。cfDNA检测中的标准品对于解决这些问题起到了重要的作用。
目前对cfDNA进行基因突变检测方法主要有数字PCR和二代测序。与数字PCR相比,二代测序不但能够检测未知基因序列和未知突变,更能够高通量地检测多个基因位点。市面上已有多种针对二代测序的商业化捕获探针组合,用户可根据不同研究目的进行搭配使用,一次测序便可获得上百个基因突变数据,大大节约珍贵的临床样本,随着二代测序技术的不断更新和测序价格的下降,应用也会越来越广泛。通过二代测序检测cfDNA微量基因突变需要有适合检测目的的cfDNA标准品,以评估测序方法的稳定性、精确度、和分析效果。早期的手段与近年的基于NGS的孕妇cfDNA分析鉴定得到的cfDNA的长度分布结果显示,cfDNA片段的长度非常突出地集中在167bp左右。cfDNA的标准品的长度通常集中分布在160-175bp。目前市场上商品化的cfDNA标准品较少。进口的cfDNA标准品(Horizon:https://www.horizondiscovery.com/)有多种突变基因cfDNA标准品出售,网上标价505美元一支,每支350ng,该产品是以基因编辑的人类细胞系gDNA通过机械打断片段化来模拟人体内cfDNA。国产的cfDNA标准品(安可济:http://www.accuragen.com.cn/portal/article/index/id/58.html)涵盖五种常见突变基因,该产品在DNA片段化过程中引入了酶切工艺,价格比进口标准品稍低但对用量极大的测序平台来说同样高昂,因此目前尚缺少成本低廉、片段长度分布相对集中的cfDNA标准品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服目前缺少商品化的cfDNA标准品这一技术问题,提供了一种cfDNA标准品及其制备方法。本发明提供的cfDNA标准品制备方法简单易行,通过该方法制得的标准品DNA片段的长度主要集中分布在160-175bp的范围,与提取的血浆中cfDNA的大小分布接近,所建文库片段长度也更匹配,减少了过大片段和过小片段的影响,若用突变细胞系与野生细胞系的gDNA来混合制作cfDNA突变质控品,则可用于鉴定建库及测序方法的灵敏度。
本发明一方面提供了一种cfDNA标准品的制备方法,包括:1)对基因组DNA进行片段化,获得片段化的基因组DNA;2)纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA。
在一优选实施方案中,所述基因组DNA为人基因组DNA。
在一优选实施方案中,所述人基因组DNA提取自人血液样本。
在一优选实施方案中,所述人基因组DNA提取自人细胞系样本。
在一优选实施方案中,所述人基因组DNA提取自不含基因突变的人的血液样本和/或细胞样本。
在另一优选实施方案中,所述人基因组DNA提取自含有基因突变的人的血液样本和/或细胞系样本。
在一优选实施方案中,含有所述基因组DNA的溶液的总体积为50–500μL;优选地为130μL。
在一优选实施方案中,所述基因组DNA的总质量为1-5μg;优选地,为5μg;优选地,所述基因组DNA溶于无核酸酶溶剂,如无核酸酶水。
在一优选实施方案中,所述片段化的方法为核酸酶酶切法片段化和/或超声打断;
优选地,所述超声打断的温度为18-22℃,更优选地为20℃;
优选地,所述超声打断的功率为30-75W,更优选地为50W;
优选地,所述超声打断的工作比为2%-20%,更优选地为20%;
优选地,所述超声打断的循环次数为50-200次,更优选地为200次;
优选地,所述超声打断的处理时间为20-500秒,更优选地为330-370秒,进一步更优选地为330-350秒,最优选地为350秒;
优选地,所述超声打断使用Covaris M220进行。
在一优选实施方案中,2)中纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA的方法为使用固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization,SPRI)磁珠纯化;优选地,所述SPRI磁珠为购自贝克曼-库尔特公司的SPRISelect,货号为B23317、B23318或B23319。
在一优选实施方案中,使用SPRI磁珠纯化1)中所述片段化的基因组DNA的方法包括以下步骤:
(1)将1)中所述片段化的基因组DNA加入贝克曼-库尔特公司的SPRISelect悬液、孵育,所述贝克曼-库尔特公司的SPRISelect悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比为0.9︰1-1.2︰1,优选地为1.0︰1-1.2︰1,更优选地为1.1︰1-1.2︰1,最优选地为1.1︰1;
(2)通过磁力去除磁珠,将上清加入所述贝克曼-库尔特公司的SPRISelect悬液、孵育,所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比为0.3︰1-0.6︰1,优选地为0.3︰1-0.5︰1,更优选地为0.4︰1-0.5︰1,最优选地为0.4︰1;
(3)通过磁力吸附磁珠,弃上清,用洗脱试剂洗脱磁珠,即获得所述cfDNA标准品;优选地,所述洗脱试剂为无核酸酶的TE缓冲液或无核酸酶水。
本发明另一方面提供了一种cfDNA标准品,其通过前文所述方法制得。
本发明另一方面提供了前述cfDNA标准品在血液cfDNA检测中的应用。
本发明的有益效果在于,本发明提供的制备cfDNA标准品的制备方法简单易行且回收率高。通过该方法制得的标准品DNA片段的长度主要集中分布在160-175bp的范围,与提取的血浆中cfDNA的大小分布接近,所建文库片段长度也更匹配,减少了过大片段和过小片段的影响,若用突变细胞系与野生细胞系的gDNA来混合制作cfDNA突变质控品,则可用于鉴定建库及测序方法的灵敏度。
附图说明
图1:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图2:人血液cfDNA片段长度分布峰图。
图3:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图4:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图5:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图6:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图7:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图8:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图9:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图10:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图11:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图12:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图13:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图14:5μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图15:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图16:1μg人基因组DNA超声打断制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图17:1μg人基因组DNA超声打断310s未经纯化制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图18:1μg人基因组DNA超声打断250s未经纯化制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图19:1μg人基因组DNA超声打断450s未经纯化制得的cfDNA标准品的片段长度分布峰图。
图20:Horizon cfDNA标准品片段长度分布峰图。
图21:安可济cfDNA标准品片段长度分布峰图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度,一般为25℃。
实施例1使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
1、用Qiagen DNA提取试剂盒(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit,购自Qiagen,货号:55114)提取人血液基因组DNA,定量,最终取5μg提取的基因组DNA溶于130μL无核酸酶水;
2、用Covaris M220超声波打断仪(购自Covaris,MA USA)对提取的基因组DNA进行超声打断,超声打断的条件为:温度:20,Peak Incident Power(W):50,Duty Factor(工作比):20%,Cycles per Burst(循环次数):200,Treatment Time(处理时间):350s;
3、取2中经过超声打断的基因组DNA用SPRIselect试剂盒(购自Beckman-Coulter,B23318)进行纯化,纯化步骤为:(1)将片段化的基因组DNA加入SPRI磁珠悬液,混合均匀后孵育5min,所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比为1.1︰1;(2)在磁力架放置2min后弃去磁珠,取上清加新的SPRI磁珠悬液,混合均匀后孵育5min,所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比为0.4︰1;(3)在磁力架放置2min后弃去上清,用80%乙醇溶液洗涤磁珠两遍,待乙醇挥发后用无核酸酶水洗脱磁珠,即获得所述cfDNA标准品,计算最终得率为18%。
用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit在室温提取健康人血液cfDNA,用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer(购自Perkin Elmer)对制得的cfDNA标准品的片段和提取的人血液cfDNA的片段长度分布进行分析,结果分别如图1和图2所示。
图1为通过上述方法制得的cfDNA标准品的片段长度分布图,图2为人血液cfDNA的片段长度分布图。图1显示cfDNA标准品的DNA片段长度主要集中分布在160-175bp,片段峰值为171bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例2使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例1步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.2︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.3︰1,其他同实施例1。计算最终得率为10%。
结果如图3所示。图3显示cfDNA标准品的DNA片段长度主要集中分布在160-175bp,片段峰值为163bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例3使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例1步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.0︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.5︰1,其他同实施例1。计算最终得率为25%。
结果如图4所示。图4显示cfDNA标准品的DNA片段长度主要集中分布在160-175bp,片段峰值为175bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例4使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例1步骤2的超声处理时间改为370s,其他同实施例1。计算最终得率为6%。
结果如图5所示。图5显示cfDNA标准品的DNA片段长度主要集中分布在160-175bp,片段峰值为166bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例5使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例1步骤2的超声处理时间改为370s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.2︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.3︰1,其他同实施例1。计算最终得率为1%。
结果如图6所示。图6显示cfDNA标准品的DNA片段长度超过一半集中分布在160-175bp,片段峰值为156bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例6使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
1、用Qiagen DNA提取试剂盒(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit购自Qiagen,货号:55114)提取人血液基因组DNA,定量,最终取1μg提取的基因组DNA溶于130μL无核酸酶水;
2、用Covaris M220超声波打断仪(购自Covaris,MA USA)对提取的基因组DNA进行超声打断,超声打断的条件为:温度:20,Peak Incident Power(W):50,Duty Factor(工作比):20%,Cycles per Burst(循环次数):200,Treatment Time(处理时间):330s;
3、取2中经过超声打断的基因组DNA用SPRIselect试剂盒(购自Beckman-Coulter,B23318)进行纯化,纯化步骤为:(1)将片段化的基因组DNA加入SPRI磁珠悬液,混合均匀后孵育5min,所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比为1.2︰1;(2)在磁力架放置2min后弃去磁珠,取上清加新的SPRI磁珠悬液,混合均匀后孵育5min,所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比为0.3︰1;(3)在磁力架放置2min后弃去上清,用80%乙醇溶液洗涤磁珠两遍,待乙醇挥发后用无核酸酶水洗脱磁珠,即获得所述cfDNA标准品,计算最终得率为3%。
用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(购自Qiagen,货号:55114)在室温提取健康人血液cfDNA,用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer(购自PerkinElmer)对制得的cfDNA标准品的片段和提取的人血液cfDNA的片段长度分布进行分析,结果如图7所示。图7显示cfDNA标准品的DNA片段长度大部分集中分布在160-175bp,片段峰值为160bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例7使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤2的超声处理时间改为350s,其他同实施例1。计算最终得率为4%。
结果如图8所示。图8显示cfDNA标准品的DNA片段长度集中分布在160-175bp,片段峰值为160bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例8使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤2的超声处理时间改为350s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.0︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.5︰1,其他同实施例6。计算最终得率为24%。
结果如图9所示。图9显示cfDNA标准品的DNA片段长度集中分布在160-175bp,片段峰值为163bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例9使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤2的超声处理时间改为350s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.1︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.4︰1,其他同实施例6。计算最终得率为15%。
结果如图10所示。图10显示cfDNA标准品的DNA片段长度超过一半集中分布在160-175bp,片段峰值为155bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例10使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤2的超声处理时间改为370s,其他同实施例6。计算最终得率为5%。
结果如图11所示。图11显示cfDNA标准品的DNA片段长度集中分布在160-175bp,片段峰值为166bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
实施例11使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤2的超声处理时间改为370s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.1︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.4︰1,其他同实施例6。计算最终得率为17%。
结果如图12所示。图12显示cfDNA标准品的DNA片段长度集中分布在160-175bp,片段峰值为159bp,与人血液cfDNA的片段长度分布基本一致。
对比例1使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例1步骤2的超声处理时间改为330s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为0.9︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.6︰1,其他同实施例1。计算最终得率为24%。
结果如图13所示。图13显示cfDNA标准品的DNA片段长度偏大,主要集中分布在150-300bp,片段峰值为196bp,与人血液cfDNA的片段长度分布不一致。
对比例2使用5μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例1步骤2的超声处理时间改为350s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为0.9︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为0.6︰1,其他同实施例1。计算最终得率为24%。
结果如图14所示。图14显示cfDNA标准品的DNA片段长度偏大,主要集中分布在150-300bp,片段峰值为190bp,与人血液cfDNA的片段长度分布不一致。
对比例3使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.2︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为1.5︰1,其他同实施例1。计算最终得率为12%。
结果如图15所示。图15显示cfDNA标准品的DNA片段长度偏小,主要集中分布在100-185bp,片段峰值为140bp,与人血液cfDNA的片段长度分布不一致。
对比例4使用1μg血液基因组DNA制备cfDNA标准品
实施例6步骤2的超声处理时间改为350s,步骤3的(1)中所述SPRI磁珠悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比改为1.2︰1,(2)中所述SPRI磁珠悬液与所述上清的体积比改为1.5︰1,其他同实施例1。计算最终得率为14%。
结果如图16所示。图16显示cfDNA标准品的DNA片段长度偏小,主要集中分布在100-170bp,片段峰值为130bp,与人血液cfDNA的片段长度分布不一致。
对比例5未经SPRI磁珠纯化制备cfDNA标准品
实施例6步骤2中的超声打断时间改为310s,省去步骤3的纯化,其余与实施例6相同。
用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer对制得的对照cfDNA标准品的片段长度进行分析,结果如图17所示。
图17显示,当超声打断时间为310s且没有使用SPRI磁珠纯化时,cfDNA标准品的DNA片段分布与实施例6制得的标准品片段分布相比范围更宽,覆盖了较多的长度过小或过大的片段,与人血液cfDNA的片段分布差异较大。
对比例6未经SPRI磁珠纯化制备cfDNA标准品
实施例6步骤2中的超声打断时间改为250s,省去步骤3的纯化,其余与实施例6相同。
用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer对制得的对照cfDNA标准品的片段长度进行分析,结果如图18所示。
图18显示,当超声打断时间为310s且没有使用SPRI磁珠纯化时,cfDNA标准品的DNA片段分布与实施例6制得的标准品片段分布相比范围更宽,覆盖了较多的长度过小或过大的片段,与人血液cfDNA的片段分布差异较大。
对比例7未经SPRI磁珠纯化制备cfDNA标准品
实施例6步骤2中的超声打断时间改为450s,省去步骤3的纯化,其余与实施例6相同。
用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer对制得的对照cfDNA标准品的片段长度进行分析,结果如图19所示。
图19显示,当超声打断时间为450s且没有使用SPRI磁珠纯化时,cfDNA标准品的DNA片段分布与实施例6制得的标准品片段分布相比范围更宽,覆盖了较多的长度过小或过大的片段,与人血液cfDNA的片段分布差异较大。
对比例8Horizon公司的cfDNA标准品
用无核酶水稀释Horizon的cfDNA标准品(购自Horizon,货号:HD786)至浓度为2ng/ul,用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer对该cfDNA标准品的片段长度进行分析,结果如图20所示。
图20显示,Horizon的cfDNA标准品的DNA片段分布与前述实施例中制得的标准品片段分布相比范围更宽,覆盖了过多的长度过小或过大的片段,与人血液cfDNA的片段分布不够吻合。
对比例9安可济公司的cfDNA标准品
用无核酶水稀释安可济的cfDNA标准品(购自苏州安可济,货号:AG-STD-S-KA-8))至浓度为2ng/ul,用Labchip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer对该cfDNA标准品的片段长度进行分析,结果如图21所示。
图21显示,安可济的cfDNA标准品的DNA片段长度偏小,主要集中分布在100-175bp,片段峰值为143bp,与人血液cfDNA的片段长度分布的一致性弱于本发明前述实施例中制得的cfDNA标准品与人血液cfDNA片段长度分布的一致性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。