CN115725693A

CN115725693A - 一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法及其应用

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Publication number: CN115725693A
Application number: CN202211351386.1A
Authority: CN
Inventors: 顾凯丽; 陆亚红; 邓啸; 蒋泽宇; 张亚飞
Original assignee: Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Current assignee: Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority date: 2022-10-31
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2042-10-31
Also published as: CN115725693B

Abstract

本发明提供了一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法及其应用，制备方法包括：将甲基转移酶缺陷型细胞系的基因组DNA进行全基因组扩增，获得完全未甲基化DNA样品；将完全未甲基化DNA样品进行打断处理并进行磁珠分选纯化，获得类似天然cfDNA片段长度分布的完全未甲基化模拟cfDNA样品；将所述完全未甲基化模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理，获得完全甲基化模拟cfDNA样品；将所述完全未甲基化cfDNA样品和完全甲基化cfDNA样品按比例混合，得到一系列不同甲基化水平的模拟cfDNA甲基化标准品。所述标准品制备方法简单，与肿瘤中相关cfDNA具有类似的片段分布，甲基化水平可控，可根据需求灵活定制。

Description

一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化(DNA methylation)是一种表观(epigenetic)修饰，是指在DNA甲基转移酶(DNMT)催化下，DNA链上的特定碱基获得活性甲基的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。这种甲基化修饰不改变DNA序列，但是会导致基因沉默，在个体的发育中起到重要作用。

大量的研究表明，DNA甲基化异常与肿瘤的发生发展具有密切的联系。在肿瘤细胞中，通常伴随着抑癌基因的甲基化或原癌基因的甲基化水平降低。因此，DNA甲基化水平(即甲基化谱)和/或特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤早筛、诊断或微小残留病的生物标记物。其中，对于肿瘤早筛及微小残留病检测，往往是在还未形成肿瘤组织的情况下进行的。此时，肿瘤组织无法获得，只能通过游离DNA(Circulating free DNA or Cell free DNA，cfDNA)来检测相应的肿瘤细胞甲基化标记。cfDNA存在于各种体液中，如血液、尿液、脑脊液等，是由凋亡或坏死的细胞进入循环系统中释放产生的80-250bp小片段DNA，主要长度在167bp左右。由于cfDNA取样的无创性，基于cfDNA的肿瘤液态活检产品越来越多。近年来，cfDNA甲基化被证明可以用来作为肿瘤早筛、早诊及微小残留病监测。

然而，天然的cfDNA目前仅能从体液中获得，并且含量低，难以获得。具体到cfDNA甲基化研究，由于甲基化是一种表观修饰，很难人工控制甲基化水平。在相应的cfDNA甲基化检测产品开发中缺乏甲基化水平可控、同时制备方法简单的模拟cfDNA甲基化标准品。

因此，提供一种制备方法简单，具有类似cfDNA的片段分布，同时甲基化水平可控的模拟cfDNA甲基化标准品具有重要的应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法及其应用。本发明中的标准品制备方法简单，与天然cfDNA具有类似的片段分布，同时甲基化水平可控，可根据需求灵活定制。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

S1：将甲基转移酶缺陷型细胞系的基因组DNA进行全基因组扩增，获得完全未甲基化DNA样品；

S2：将所述完全未甲基化DNA样品进行打断处理；

S3：将S2中打断的DNA样品进行磁珠分选纯化，获得类似天然cfDNA片段长度分布的完全未甲基化模拟cfDNA样品；

S4：将S3中的完全未甲基化模拟cfDNA样品用甲基转移酶处理，获得完全甲基化模拟cfDNA样品；

S5：将S3及S4中所述完全未甲基化cfDNA样品和完全甲基化cfDNA样品按比例混合，得到一系列不同甲基化水平的模拟cfDNA甲基化标准品。

本发明提供的制备方法基于甲基转移酶缺陷型细胞系制备模拟cfDNA甲基化标准品，本发明所述模拟cfDNA甲基化标准品的制备流程图如图1所示，将甲基转移酶缺陷型细胞系的DNA经全基因组扩增得到完全未甲基化DNA样品，再进行打断及磁珠分选纯化得到类似天然cfDNA片段长度的模拟cfDNA，作为完全非甲基化模拟cfDNA样品；通过甲基转移酶处理完全未甲基化模拟cfDNA样品得到完全甲基化模拟cfDNA样品；通过按比例掺比，得到一系列不同甲基化水平的模拟cfDNA甲基化标准品。

优选地，步骤S1中，所述甲基转移酶缺陷型细胞系的基因组DNA采用如下方法制备得到：采用CRISPR基因编辑技术将正常细胞系的DNMT3A及DNMT3B两个甲基转移酶基因敲除，得到甲基转移酶缺陷型细胞系，从甲基转移酶缺陷型细胞系中提取基因组DNA。

优选地，所述DNMT3A基因敲除区域为NM_175629转录本exon7-exon9，优选为NM_175629转录本exon8，进一步优选为NM_175629转录本exon8的第288-346个氨基酸。

优选地，所述DNMT3B基因敲除区域为NM_006892转录本exon6-exon8，优选为NM_006892转录本exon7，进一步优选为NM_006892转录本exon7的第231-265个氨基酸。

优选地，针对所述DNMT3A基因的gRNA包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，针对所述DNMT3B基因的gRNA包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

优选地，步骤S1中，所述全基因组扩增采用的DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶；优选为Phi29 DNA聚合酶。

优选地，步骤S2中，所述打断处理的方式包括采用超声波破碎打断或酶切打断。

优选地，所述超声波破碎打断采用如下步骤进行：将DNA样品置于核酸打断管中，加入H₂O混匀，依次进行第一阶段超声打断处理和第二阶段超声打断处理，打断处理后进行磁珠分选纯化。

优选地，所述打断处理的温度为18-22℃，例如可以是18℃、19℃、20℃、21℃或22℃等，优选为20℃。

优选地，所述第一阶段超声打断处理的功率为60-90W，例如可以是60W、65W、70W、75W、80W、85W或90W等，优选为75W；第二阶段超声打断的功率为35-65W，例如可以是35W、40W、45W、50W、55W、60W或65W等，优选为50W。

优选地，所述第一阶段超声打断处理的负载比为8-12％，例如可以是8％、9％、10％、11％或12％等，优选为10％；第二阶段超声打断的负载比为8-12％，例如可以是8％、9％、10％、11％或12％等，优选为10％。

优选地，所述第一阶段超声打断的单次脉冲循环次数为200-1000次，例如可以是200、300、400、500、600、700、800、900或1000等，优选为600次；第二阶段超声打断的单次脉冲循环次数为100-500次，例如可以是100、200、300、400或500等，优选为200次。

优选地，第一阶段超声打断的处理时间为410-710秒，例如可以是410、450、500、550、600、650或710等，优选为550-650秒，进一步优选为610秒；第二阶段超声打断的处理时间为360-600秒，例如可以是360、400、450、500、550、570或600等，优选为500-580秒，进一步优选为560秒。

优选地，步骤S3中，所述磁珠分选纯化的步骤包括依次进行的两轮磁珠处理，两轮磁珠处理的步骤如下所示：

第一轮磁珠处理：在打断后的DNA片段溶液中加入磁珠，混匀后在磁力架上吸取上清转移至新管，丢弃磁珠；

第二轮磁珠处理：向新管上清中加入磁珠，混匀后在磁力架上待溶液澄清后丢弃上清，保留磁珠，并加入洗脱液进行洗脱。

优选地，两轮磁珠处理采用的磁珠包括AMPure XP beads或SPRI磁珠；优选为采用AMPure XP beads分选纯化。

优选地，第一轮磁珠与打断后的DNA片段溶液的体积比为(1.1-1.3):1，第二轮磁珠与打断后的DNA片段溶液的体积比为(0.3-0.5):1。

优选地，步骤S4中，所述甲基化处理采用如下步骤进行：将所述完全未甲基化模拟cfDNA样品与S-腺苷甲硫氨酸及甲基转移酶混合孵育，得到完全甲基化模拟cfDNA样品。

优选地，所述甲基转移酶为M.SssⅠ酶和/或M.CviPI酶，优选为M.SssⅠ酶和M.CviPI酶的组合。

优选地，所述M.ssI酶与M.CviPI酶的酶活单位比例在1:(0.1-0.3)，例如可以是1:0.1、1:0.2或1:0.3。

优选地，所述甲基转移酶的使用量为11-13U甲基转移酶/μg完全未甲基化模拟cfDNA样品，例如可以是11U、12U或13U，优选为12U。

优选地，所述孵育中使用的反应缓冲液为：40-60mM NaCl(例如可以是40mM、45mM、50mM、55mM或60mM等)，10-50mM Tris-HCl(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)，1-10mM DTT(例如可以是1mM、2mM、4mM、6mM、8mM或10mM等)，PH值为7.8-8.2(例如可以是7.8、7.9、8.0、8.1或8.2等)。

优选地，所述孵育的时间为15-120min，例如可以是15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min或120min等，优选为120min。

优选地，步骤S5中，所述完全未甲基化cfDNA样品和完全甲基化cfDNA样品混合的比例为1:(0-199)，例如可以是1:0、1:1、1:3、1:9、1:19、1:99或1:199等。

优选地，所述混合的比例为1:0、1:1、1:3、1:9、1:19、1:99或1:199，所述模拟cfDNA甲基化标准品的甲基化水平为100％、50％、25％、10％、5％、1％或0.5％。

本发明中，制得模拟cfDNA甲基化标准品后采用高通量测序方法分别测定上述模拟cfDNA甲基化标准品的甲基化水平。

第二方面，本发明提供一种模拟cfDNA甲基化标准品，所述模拟cfDNA甲基化标准品由第一方面所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供第二方面所述的模拟cfDNA甲基化标准品在肿瘤早筛、细胞溯源及微小残留病检测中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的标准品制备方法简单，具有类似天然cfDNA的片段分布，同时甲基化水平可控，可根据需求灵活定制。

(2)本发明制备的模拟cfDNA甲基化标准品的甲基化水平与预期接近，表明本发明制备模拟cfDNA甲基化标准品的方案可行且有效。

附图说明

图1是本发明所述模拟cfDNA甲基化标准品的制备流程图；

图2是本发明所述完全未甲基化模拟cfDNA标准品的片段分布图。

图3是本发明所述完全甲基化模拟cfDNA标准品片段分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1CRISPR/Cas9敲除DNMT3A及DNMT3B基因获得甲基转移酶缺陷型细胞系

1、guide-RNA质粒构建：

本实施例的gRNA用U6启动，将U6-gRNA放到了pUG3这个载体的M13F和M13R之间，连接到pUG3载体上是利用两引物anneal的方法：为了和载体相连，在设计引物时加上XhoI和XbalI酶切位点。利用同尾酶NheI和XbaI把两个gRNA串联到同一载体上，最后与Cas9构建到同一载体pBC2上。其中gRNA序列如下：

DNMT3A gRNA1(SEQ ID NO:1)：cgaugacgagccagaguacgagg；

DNMT3A gRNA2(SEQ ID NO:2)：guaccgcaaagccaucuacgagg；

DNMT3B gRNA1(SEQ ID NO:3)：ggaauaggggaccucgugugggg；

DNMT3B gRNA2(SEQ ID NO:4)：augcgguggguccagugguuugg。

2、脂质体转染gRNA及筛选

(1)配制培养基：取450mL RPMI 1640培养基(购自Thermo Scientific，货号22400071)，加入50mL FBS(购自Hyclone，货号Cat.SH30406.02E)，混匀。

(2)铺15万个HCT116细胞(购自ATCC公司，货号CCL-247)到6孔板一个孔，培养16h后进行转染实验。

(3)A液：pBC2-Cas9-gRNA 2μg，Opti-MEM 200μL震荡混匀15s，室温静置5min；B液：Lipo2000 10μL，Opti-MEM 200μL震荡混匀15s，室温静置5min；将A液与B液混合得到AB混合液，震荡混匀15s，室温静置20min。

(4)给六孔板中的细胞换液，然后把AB混合液缓慢滴加到培养基中，摇匀；6h后换新鲜培养基。

(5)转染24h后换成含130μg/mL hygromycin B(潮霉素B)的新鲜培养基，筛选两天。

(6)更换正常培养基，继续培养1天。

(7)消化细胞，取一半到1.5mL EP管中，提基因组用于gRNA整体敲除效率鉴定，一半冻存，另铺500个细胞到6cm细胞培养板上。

3、挑细胞单克隆

(1)6cm培养板上的克隆生长约5天后，挑克隆鉴定；把体视镜放进超净台中，紫外照射30min杀菌；取48孔板，包被明胶备用。

(2)在96孔培养板中的48个孔内每孔加入20μL 0.1％ Trypsin(胰蛋白酶)。

(3)吸干净培养板内的废液，HBSS洗一遍，加入2mL新的HBSS。在体视镜下，用2μL量程的移液器将克隆从板上悬起；然后吸出克隆，放到96孔培养板的Trypsin中，37℃消化5min。

(4)96孔培养板中加入80μL培养基终止消化；用移液枪将克隆吹散成单细胞，一半转移到对应的明胶包被好的，加有200μL培养基的48孔培养板中，十字方向摇匀细胞培养板。将培养板置于37℃、5％ CO₂孵箱中孵育；另一半用于提取基因组DNA。

4、提取基因组DNA，DNA提取按照试剂盒的说明书进行(康为世纪，货号Cat.CW2106)。

(1)0.25％胰酶消化细胞，终止消化后置于1.5mL离心管中，12000rpm离心5min，弃上清。

(2)在上述细胞中，加300μL裂解液和3μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，颠倒混匀，37℃至少温育2h。

(3)12000rpm离心5min，取上清。

(4)向上清中加入等体积的异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

(5)弃上清，加1mL 75％的乙醇溶液清洗沉淀，12000rpm离心5min，弃上清，晾干后根据沉淀的量加入20μL H₂O，55℃孵育至少2h。

5、基因组PCR鉴定是否敲除

(1)以上述提取的克隆基因组为模板，进行基因组PCR；20μL PCR扩增体系如表1所示：

表1

组分名称	体积(μL)
		基因组DNA	1
DNMT正向引物(10μM)	0.1
		DNMT反向引物(10μM)	0.1
dNTPs	1.6
		EasyTaq DNA聚合酶	0.2
10×PCR缓冲液	2
		ddH<sub>2</sub>O	15

将扩增体系放入PCR仪中，设定程序如表2所示：

表2

PCR结束之后，取出样品，琼脂糖凝胶电泳检测。其中DNMT3A基因敲除克隆扩增产物约为260bp，野生型克隆扩增产物为382bp。DNMT3B敲除克隆扩增产物约为394bp，野生型克隆扩增产物为1371bp。先对DNMT3B基因进行敲除，挑选敲除克隆进行扩大培养，在该细胞株上重复上述敲除步骤，进行DNMT3A基因敲除，直至筛选出DNMT3A及DNMT3B基因双敲除的细胞系(甲基转移酶缺陷型细胞系)，并采用Sanger测序法进行测序验证。其中用于鉴定DNMT3A基因和DNMT3B基因敲除的扩增引物序列分别为：

DNMT3A F-primer(SEQ ID NO:5)：agagaaaggagtcgctgcctc；

DNMT3A R-primer(SEQ ID NO:6)：ttgctaattcctggagaggtcaa；

DNMT3B F-primer(SEQ ID NO:7)：acagtggagtggacaggacttg；

DNMT3B R-primer(SEQ ID NO:8)：aggctgctcttgttgttggc。

实施例2对甲基转移酶缺陷型细胞系进行DNA提取

(1)将甲基转移酶缺陷型细胞收集到15mL离心管中，1000g离心10min，弃上清，加入2mL 1×PBS清洗细胞，去除残留的培养基，1000g离心10min，弃上清，重复清洗2次，随后加入400μL 1×PBS重悬细胞。DNA提取按照试剂盒的说明书进行(购自迈杰转化医学研究(苏州)有限公司，货号N067A01)。

(2)取一支新的1.5mL离心管，加入300μL Buffer L1。

(3)向上述离心管中加入步骤1中的400μL细胞悬浮液，盖上管盖，剧烈涡旋振荡30s。

(4)加入300μL Buffer L2，激烈摇晃离心管3-5次，再剧烈涡旋振荡30s混匀，13000rpm离心2min。

(5)将步骤(4)中的上清液转移至核酸纯化柱(核酸纯化柱置于2mL离心管中)，盖上管盖，12000rpm离心30s。

(6)丢弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，在核酸纯化柱中加入500μL Buffer WA(确保加入无水乙醇)，盖上管盖，12000rpm离心30s。

(7)丢弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，在核酸纯化柱中加入500μL Buffer WB(确保加入无水乙醇)，盖上管盖，12000rpm离心30s。

(8)丢弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1min。

(9)丢弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在纯化柱中加入100-200μL 56℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温放置1min，12000rpm离心30s。

(10)丢弃纯化柱，洗脱的DNA进行Nanodrop及Qubit3.0质检，测得浓度为19.8ng/μL，-20℃保存。

实施例3进行全基因组扩增获得未甲基化DNA样品

本实施例对实施例2提取的DNA进行全基因组扩增获得未甲基化DNA样品，本实施例所用试剂盒购自QIAGEN公司，货号150043。

1、提前从冰箱中取出DLB缓冲液，置于金属浴中加热至30℃。

2、按表3制备变性缓冲液D1缓冲液及中和N1缓冲液。

表3

3、取5μL甲基转移酶缺陷型细胞系gDNA置入离心管，加入5μL D1缓冲液，涡旋混匀，短暂离心，室温放置3min。

4、向上管中加入10μL N1缓冲液，涡旋混匀，短暂离心。

5、冰上解冻REPLI-gDNA聚合酶；其他试剂置于室温解冻，涡旋后短暂离心。

6、按表4在冰上配制反应液，混匀，短暂离心。

表4

组分	体积
		REPLI-g反应缓冲液	29μL
REPLI-gDNA聚合酶	1μL

7、将步骤6中反应液加入步骤4中，置于PCR仪中30℃反应16h，然后65℃3min终止反应，设置PCR热盖温度为70℃。

8、取出扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳。

9、切胶回收扩增产物

9.1用刀片从琼脂糖凝胶中切除胶孔附近的DNA片段(>10kb)，小心地修剪多余的琼脂糖，将其转移到一个1.5mL的微型离心管中，并称量凝胶片。

9.2向装有DNA片段琼脂糖凝胶的1.5mL离心管中加入400μL Monarch GelDissolving Buffer(购自NEB公司，货号T1021L)。

9.3将样品在50℃金属浴上孵育10min，每2-3min翻转一次，直到凝胶完全溶解。

9.4将回收柱(购自NEB公司，货号T1034L)置入收集管中，将样品转移至柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。

9.5将回收柱重新置入收集管中，加入200μL DNA wash buffer(购自NEB,货号T1032L)，12000rpm离心1min，弃滤液。

9.6重复以上步骤一次。

9.7将回收柱转移到一个干净的1.5mL离心管中，确保回收柱的尖端不接触到滤液。

9.8在回收柱中心加入20μL DNA洗脱缓冲液(购自NEB公司，货号T1016L)，静置1min，然后12000rpm离心1min，收集DNA；

9.9利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂(购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号12642ES76)对9.8中的双链DNA模板池进行定量，记录浓度为123.8ng/μL，保存于-20℃。

实施例4打断处理

本实施例将实施例3中经全基因组扩增得到的完全未甲基化DNA样品进行超声打断。

1、将实施例3中的样品(浓度为123.8ng/μL)取8.08μL置于核酸打断管中，加入41.92μL H₂O，振荡混匀。

2、预设超声波仪器的运行条件：

第一阶段：峰值功率：75W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：600，处理时间610s；

第二阶段：峰值功率：50W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：200，处理时间570s。

4、在超声波仪器上装载溶液，运行程序。

实施例5打断处理

本实施例将实施例3中经全基因组扩增得到的完全未甲基化DNA样品进行超声打断。预设超声波仪器的运行条件：

第一阶段：峰值功率：60W，负载比：8％，单次脉冲循环次数：400，处理时间550s；

第二阶段：峰值功率：35W，负载比：8％，单次脉冲循环次数：100，处理时间500s。

实施例6打断处理

第一阶段：峰值功率：90W，负载比：12％，单次脉冲循环次数：1000，处理时间710s；

第二阶段：峰值功率：65W，负载比：12％，单次脉冲循环次数：500，处理时间580s。

实施例7打断处理

本实施例与实施例4的区别仅在于，第一阶段：峰值功率：50W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：600，处理时间800s。

实施例8打断处理

本实施例与实施例4的区别仅在于，第一阶段：峰值功率：100W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：600，处理时间300s。

实施例9打断处理

本实施例与实施例4的区别仅在于，第二阶段：峰值功率：30W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：200，处理时间700s。

实施例10打断处理

本实施例与实施例4的区别仅在于，第二阶段：峰值功率：75W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：200，处理时间300s。

实施例11打断处理

本实施例的打断处理的步骤如下所示：峰值功率：70W，负载比：10％，单次脉冲循环次数：1000，处理时间360s。

实施例12打断处理

本实施例采用酶打断，所使用的酶为亚特兰提斯双链DNA酶(Atlantis dsDNase)，购自ZYMO RESEARCH公司，货号E2030，处理条件为2U/ug基因组DNA，37℃处理30min。

分别采用Agilent 2100生物分析仪，配套使用Agilent高敏DNA芯片及试剂对打断后的片段进行质检，统计实施例4-12的片段分布，分析结果如下表5所示。

表5

从表5的结果可知，超声打断所用峰值功率越大、负载比越高、单次脉冲循环次数越大、处理时间越长，打断后的片段越小。最终整个样本的片段分布是各个参数的综合结果，其中实施例4样品峰值为170bp，整个样品片段分布处于56-300bp之间，与天然cfDNA片段分布高度相似。

实施例13打断片段磁珠分选纯化

本实施例将实施例4中经超声打断的完全未甲基化DNA进行磁珠分选纯化，获得类似天然cfDNA片段分布的完全未甲基化cfNDA模拟样品。

1、提前将AMPure XP Beads(购自BECKMAN COULTER，货号A63882)从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30min。

2、震荡混匀AMPure XP Beads，取60μL Beads加入50μL实施例4中打断后的片段溶液中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min。

3、将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，吸取100μL上清转移至新的离心管中，丢弃磁珠。

4、向步骤3中的上清加入20μL AMPure XP Beads，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min。

5、将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，吸取110μL上清丢弃，保留磁珠。

6、保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清。

7、重复上述步骤一次。

8、使用10μL移液器将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5min至磁珠干燥完全。

9、向离心管中加入50μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育2min。

10、将离心管放在磁力架上2-3min，待溶液澄清。

11、小心吸取45μL上清至一新的1.5mL离心管中，丢弃磁珠，冰上放置。

实施例14打断片段磁珠纯化回收

本实施例与实施例13的区别仅在于，第一次加入磁珠的体积为55μL，第二次加入磁珠的体积为15μL。

实施例15打断片段磁珠纯化回收

本实施例与实施例13的区别仅在于，第一次加入磁珠的体积为65μL，第二次加入磁珠的体积为25μL。

实施例16打断片段磁珠纯化回收

本实施例与实施例13的区别仅在于，第一次加入磁珠的体积为60μL，第二次加入磁珠的体积为10μL。

实施例17打断片段磁珠纯化回收

本实施例与实施例13的区别仅在于，第一次加入磁珠的体积为60μL，第二次加入磁珠的体积为30μL。

实施例18打断片段磁珠纯化回收

本实施例与实施例13的区别仅在于，第一次加入磁珠的体积为40μL，第二次加入磁珠的体积为10μL。

实施例19打断片段磁珠纯化回收

本实施例与实施例13的区别仅在于，第一次加入磁珠的体积为70μL，第二次加入磁珠的体积为25μL。

采用Qubit及配套双链DNA定量试剂分别测定打断后的甲基化模拟cfDNA及非甲基化模拟cfDNA的浓度，统计实施例13-19的片段分布及浓度测定结果，分析结果如下表6所示。

表6

样品	80-250bp片段占比	模拟cfDNA样品浓度
			实施例13	89％	16.04ng/μL
实施例14	86％	15.68ng/μL
			实施例15	85％	15.45ng/μL
实施例16	74％	13.22ng/μL
			实施例17	66％	11.97ng/μL
实施例18	53％	9.91ng/μL
			实施例19	61％	10.38ng/μL

从表6的结果可知，一轮磁珠加入的体积比越大，二轮磁珠加入的体积比越小，片段的回收率越低。其中实施例13-15具有相近的回收效率，且能够保证80-250bp范围的片段占比超过85％。

实施例20对打断的完全未甲基化模拟cfDNA进行甲基转移酶处理

1、准备溶液：按表7稀释SAM(32mM)(S-腺苷甲硫氨酸，货号：B9003S)至1600μM。

表7

试剂	体积
		SAM(32mM stock solution)	1μL
无核酸酶水	19μL

2、甲基转移酶处理片段化DNA

2.1按表8配制反应液，混匀，所使用的甲基转移酶的NEB公司的M.SssⅠ酶，货号#M0226S，M.CviPI酶，货号#M0227S；

表8

试剂	体积
		无核酸酶水	7.33μL
反应缓冲液	5μL
		Diluted SAM(1600uM)	5μL
完全未甲基化模拟cfDNA	31.17μL
		M.SssI酶	1.25μL
M.CviPI酶	0.25μL

所述甲基转移酶采用为M.SssⅠ酶与M.CviPI酶的混合物，二者酶活单位比例为1:0.2，所述甲基转移酶的使用量为12U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品(DNA的投入量为500ng时，所使用的M.SssI为5U，所使用的M.CviPI酶为1U)，所述反应缓冲液(在反应体系中的终浓度)中含有：50mM NaCl，30mM Tris-HCl及5mM DTT(PH值8.0)。

2.2在PCR仪中放入2.1中的混合体系，设置37℃孵育120min，65℃孵育20min停止反应。

3、纯化

3.1提前将AMPure XP Beads(购自BECKMAN COULTER，货号A63882)从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30min；

3.2震荡混匀AMPure XP Beads，取50μL Beads加入步骤2反应体系中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min；

3.3将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，弃上清，保留磁珠；

3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

3.5重复上述步骤一次；

3.6使用10μL移液器将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5min至磁珠干燥完全；

3.7向离心管中加入20μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育2min；

3.8将离心管放在磁力架上2-3min，待溶液澄清；

3.9小心吸取18μL上清至一新的1.5mL离心管中，丢弃磁珠，冰上放置；

3.10利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂对3.9中的双链DNA模板池进行定量，记录浓度为17.89ng/μL，工作液可保存于-20℃。

实施例21对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述甲基转移酶采用为M.SssⅠ酶与M.CviPI酶的混合物，且二者酶活单位比例为1:0.1，酶的总使用量为11U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品。

在PCR仪中放入配制的甲基转移酶处理体系，孵育的时间为100min。利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为17.68ng/μL。

实施例22对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述甲基转移酶采用为M.SssⅠ酶与M.CviPI酶混合物，且二者酶活单位比例为1:0.3，酶的总使用量为13U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品。

在PCR仪中放入配制的甲基转移酶处理反应体系，孵育的处理时间为50min。利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为17.11ng/μL。

实施例23对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，处理时间为60min。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为16.82ng/μL。

实施例24对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述甲基转移酶采用为M.ssⅠ酶与M.CviPI酶的混合物，且二者酶活单位比例为1:0.2，酶的总使用量为4.8U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为12.44ng/μL。

实施例25对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述甲基转移酶采用为M.ssⅠ酶与M.CviPI酶的混合物，且二者酶活单位比例为1:0.5，酶的总使用量为15U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为15.81ng/μL。

实施例26对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述反应缓冲液(在反应体系中的终浓度)中含有：50mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM DTT(PH值8.0)。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为16.29ng/μL。

实施例27对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述反应缓冲液(在反应体系中的终浓度)中含有：50mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM DTT(PH值8.0)。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为16.41ng/μL。

实施例28对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，甲基转移酶采用为M.SssⅠ酶单酶，酶使用量为12U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为15.93ng/μL。

实施例29对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，甲基转移酶采用为M.CviPI酶单酶，酶使用量为12U甲基转移酶/μg完全未甲基化DNA样品。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为15.27ng/μL。

实施例30对完全未甲基化的模拟cfDNA样品进行甲基转移酶处理

本实施例与实施例20的区别仅在于，所述反应缓冲液(在反应体系中的终浓度)中含有：50mM NaCl，60mM Tris-HCl，20mM DTT(PH值8.0)。

利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂进行检测，甲基转移酶处理后所得DNA的浓度为14.13ng/μL。

对实施例20-30的DNA进行甲基化水平检测，使用Illumina Novaseq6000测序仪进行高通量测序，测定相应的甲基化水平，分析结果如下表9所示。

表9

从表9的结果可知，采用M.SssⅠ酶与M.CviPI酶双酶相较于单酶处理的甲基化效率更高，处理后的样品甲基化水平更接近100％，并且两种酶的比例在1:(0.1-0.3)之间较好。此外甲基转移酶处理时间越长，甲基化水平越高。所需的缓冲液，尤其是DTT的浓度，需要在1-10mM之间效果较好。其中实施例20处理后的样品甲基化水平可达99.3％，可作为完全甲基化样品。

实施例31模拟cfDNA样品片段质检

本实施例将实施例13中完全未甲基化模拟cfDNA及实施例20中的完全甲基化模拟cfDNA采用Agilent 2100生物分析仪，配套使用Agilent高敏DNA芯片及试剂进行质检，得到的片段分布图分别如图2及图3所示，二者的峰值分别为170bp及168bp，总体分布在50-300bp之间，其中80-250bp的片段占比分别为89％和88％，与天然cfDNA片段分布高度类似。

实施例32模拟cfDNA样品甲基化标准品制备

本实施例将实施例13中完全未甲基化模拟cfDNA及实施例20中的完全甲基化模拟cfDNA按比例掺比混合，获得不同甲基化水平的模拟cfDNA甲基化标准品，具体掺比的比例如表10所示。

表10

实施例33高通量甲基化文库构建

本实施例对实施例32中的模拟cfDNA甲基化标准品进行高通量甲基化文库构建。

1、文库构建(所需试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，货号NG302-02)

1.1末端修复加A；

1.1.1取出相关试剂置于冰上备用；其中5×ERA Enzyme Mix融化后用手指轻弹后混匀，不要涡旋，其余试剂可短暂涡旋混匀；

1.1.2取1个新的200μL薄壁管，按表11在冰上配置反应体系，甲基化cfDNA标准品投入10ng；

表11

组分名称	体积(μL)
		10×ERA缓冲液	5
DNA样本	2
		无核酸酶ddH<sub>2</sub>O	33
总计	40

1.1.3向上述薄壁管中加入10μL 5×ERA酶混合物，轻柔吸打10次混匀，注意不要涡旋；此步骤需要保持在冰浴中进行；

1.1.4将上述配制好的反应体系放入4℃预冷的PCR仪中，按表12程序运行进行反应，其中热盖温度设置为70℃；

表12

步骤	温度	时间
			1	4℃	1min
2	20℃	30min
			3	65℃	30min
4	4℃	保持温度

1.1.5当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置于冰上，立即开始后续接头连接步骤。

1.2接头连接(接头购自NEB公司，货号E7140S)

1.2.1向1.1.5反应体系中加入2.5μL的接头溶液，轻柔吸打混匀后置于冰上；

1.2.2按照表13配制接头连接反应体系，并将配制完成的反应体系轻柔混匀后置于冰上。

表13

组分名称	体积(μL)
		5×连接缓冲液	20
TIANSeq DNA连接酶	10
		无核酸酶ddH<sub>2</sub>O	17.5
总计	47.5

1.2.3将1.1.2中配制好的47.5μL连接反应液加入1.2.1中的反应液中，轻柔吸打混匀10次后，置于预设温度为20℃的金属浴或PCR仪中反应15min。如若此步骤使用PCR仪进行反应，PCR仪热盖温度设定为≤40℃。

1.3纯化接头连接产物

1.3.1提前将AMPure XP Beads从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30min；

1.3.2震荡混匀AMPure XP Beads，取110μL磁珠加入1.2.3反应体系中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min；

1.3.3将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，弃上清，保留磁珠；

1.3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

1.3.5重复上述步骤一次；

1.3.6使用10μL移液器将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5min至磁珠干燥完全；

1.3.7向离心管中加入29μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育2min；

1.3.8将离心管放在磁力架上2-3min，待溶液澄清；

1.3.9小心吸取28μL上清至一新的PCR管中，丢弃磁珠，冰上放置备用，用于后续的实验。

2、酶转化(所需试剂盒购自NEB公司，货号E7125S)

2.1 5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的氧化

2.1.1准备TET2缓冲液：加100μL TET2反应缓冲液到TET2反应缓冲液补充剂混匀；

2.1.2冰上配制表14所示成分，并加入28μL接头连接的DNA：

表14

2.1.3稀释500mM Fe(II)Solution，取1μL至1249μL无核酸酶水中；将稀释的Fe(II)溶液加入步骤2.1.2的组分中进行混匀，按如表15所示混合：

表15

组分名称	体积(μL)
		DNA(步骤2.1.2)	45
稀释的Fe(II)溶液	5
		总计	50

2.1.4将上述反应体系置于PCR仪中37℃孵育1h，设置热盖≥45℃；

2.1.5运行结束后将样品转移至冰上，加入1μL终止试剂，混匀；

2.1.6将上述反应体系置于PCR仪中37℃孵育30min，4℃保持，设置热盖≥45℃。

2.2纯化转化后的DNA

2.2.1提前将AMPure XP Beads从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30min；

2.2.2震荡混匀AMPure XP Beads，取90μL磁珠加入反应体系中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min；

2.2.3将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，弃上清，保留磁珠；

2.2.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

2.2.5重复上述步骤一次；

2.2.6使用10μL移液器将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5min至磁珠干燥完全；

2.2.7向离心管中加入17μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育2min；

2.2.8将离心管放在磁力架上2-3min，待溶液澄清；

2.2.9小心吸取16μL上清至一新的PCR管中，丢弃磁珠，冰上放置备用，用于后续的实验。

2.3变性DNA

2.3.1将PCR仪预热至85℃；

2.3.2向步骤2.2.9中16μL纯化的DNA加入4μL Formamide(甲酰胺)，混匀；

2.3.3将上述反应液置于PCR仪中85℃孵育10min，设置热盖105℃；程序运行结束后立即取出反应液置于冰上。

2.4胞嘧啶脱氨基

2.4.1在冰上向步骤2.3.3中反应液中加入如表16所示的组分：

表16

组分名称	体积(μL)
		无核酸酶水	68
APOBEC反应缓冲液	10
		BSA	1
APOBEC	1
		总计	100

2.4.2将上述反应液混匀，置于PCR仪中37℃孵育3h，4℃保持，设置热盖≥45℃。

2.5脱氨基DNA纯化

2.5.1提前将AMPure XP Beads从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30min；

2.5.2震荡混匀AMPure XP Beads，取100μL磁珠加入反应体系中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min；

2.5.3将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，弃上清，保留磁珠；

2.5.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

2.5.5重复上述步骤一次；

2.5.6使用10μL移液器将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5min至磁珠干燥完全；

2.5.7向离心管中加入21μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育2min；

2.5.8将离心管放在磁力架上2-3min，待溶液澄清；

2.5.9小心吸取20μL上清至一新的PCR管中，丢弃磁珠，冰上放置备用，用于后续的实验。

3、PCR扩增

3.1冰上配制如表17所示的组分，并加入至步骤2.5.9中DNA，混匀：

表17

组分名称	体积(μL)
		Index Primer	5
Q5U Master Mix	25
		总计	50

3.2按表18运行PCR仪程序：

表18

3.3纯化

3.3.1提前将AMPure XP Beads从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30min；

3.3.2震荡混匀AMPure XP Beads，取45μL磁珠加入反应体系中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5min；

3.3.3将离心管放至磁力架上静置5min，待溶液澄清后，弃上清，保留磁珠；

3.3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

3.3.5重复上述步骤一次；

3.3.6使用10μL移液器将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5min至磁珠干燥完全；

3.3.7向离心管中加入21μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育2min；

3.3.8将离心管放在磁力架上2-3min，待溶液澄清；

3.3.9小心吸取20μL上清至一新的PCR管中，丢弃磁珠，冰上放置备用，用于后续的实验。

实施例34高通量测序

本实施例对实施例33中的模拟cfDNA甲基化标准品构建的甲基化文库使用Illumina Novaseq6000测序仪进行高通量测序，测定相应的甲基化水平，分析结果如表19所示。

表19

序号	预期模拟cfDNA标准品甲基化水平	高通量测序测定甲基化水平
			1	100％	99.31％
2	50％	49.52％
			3	25％	23.76％
4	10％	8.63％
			5	5％	4.19％
6	1％	0.82％
			7	0.5％	0.36％
8	0％	0.06％

由表19的分析结果可知，制备的模拟cfDNA甲基化标准品的甲基化水平与预期接近。表明制备模拟cfDNA甲基化标准品的方案可行且有效。

综上，本发明的标准品制备方法简单，具有类似cfDNA的片段分布，同时甲基化水平可控，可根据需求灵活定制，本发明提供的模拟cfDNA甲基化标准品在cfDNA甲基化检测中具有重要的应用价值。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S2：将所述完全未甲基化DNA样品进行打断处理；

2.根据权利要求1所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述甲基转移酶缺陷型细胞系的基因组DNA采用如下方法制备得到：采用CRISPR基因编辑技术将正常细胞系的DNMT3A及DNMT3B两个甲基转移酶基因敲除，得到甲基转移酶缺陷型细胞系，从甲基转移酶缺陷型细胞系中提取基因组DNA；

优选地，所述DNMT3A基因敲除区域为NM_175629转录本exon7-exon9，优选为NM_175629转录本exon8，进一步优选为NM_175629转录本exon8的第288-346个氨基酸；

优选地，所述DNMT3B基因敲除区域为NM_006892转录本exon6-exon8，优选为NM_006892转录本exon7，进一步优选为NM_006892转录本exon7的第231-265个氨基酸；

3.根据权利要求1或2所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述全基因组扩增采用的DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶；优选为Phi29 DNA聚合酶。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述打断处理的方式包括采用超声波破碎打断或酶切打断；

5.根据权利要求4所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，所述打断处理的温度为18-22℃；

优选地，所述第一阶段超声打断处理的功率为60-90W；第二阶段超声打断的功率为35-65W；

优选地，所述第一阶段超声打断处理的负载比为8-12％；第二阶段超声打断的负载比为8-12％；

优选地，所述第一阶段超声打断的单次脉冲循环次数为200-1000次；第二阶段超声打断的单次脉冲循环次数为100-500次；

优选地，第一阶段超声打断的处理时间为410-710秒，优选为550-650秒；第二阶段超声打断的处理时间为360-600秒，优选为500-580秒。

6.根据权利要求1-5中所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述磁珠分选纯化的步骤包括依次进行的两轮磁珠处理，两轮磁珠处理的步骤如下所示：

第二轮磁珠处理：向新管上清中加入磁珠，混匀后在磁力架上待溶液澄清后丢弃上清，保留磁珠，并加入洗脱液进行洗脱；

优选地，两轮磁珠处理采用的磁珠包括AMPure XP beads或SPRI磁珠；优选为采用AMPure XP beads分选纯化；

7.根据权利要求1-6中任一项所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述甲基化处理采用如下步骤进行：将所述完全未甲基化模拟cfDNA样品与S-腺苷甲硫氨酸及甲基转移酶混合孵育，得到完全甲基化模拟cfDNA样品；

优选地，所述甲基转移酶为M.SssⅠ酶和/或M.CviPI酶，优选为M.SssⅠ酶和M.CviPI酶的组合；

优选地，所述M.ssI酶与M.CviPI酶的酶活单位比例为1:(0.1-0.3)；

优选地，所述甲基转移酶的使用量为11-13U甲基转移酶/μg完全未甲基化模拟cfDNA样品；

优选地，所述孵育中使用的反应缓冲液为：40-60mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1-10mMDTT，PH值为7.8-8.2；

优选地，所述孵育的时间为15-120min。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述完全未甲基化cfDNA样品和完全甲基化cfDNA样品混合的比例为1:(0-199)；

9.一种模拟cfDNA甲基化标准品，其特征在于，所述模拟cfDNA甲基化标准品由权利要求1-8中任一项所述的模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的模拟cfDNA甲基化标准品在肿瘤早筛、细胞溯源及微小残留病检测中的应用。