CN109371122B - 一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用，属于生物技术领域。本发明用于熊猫乳汁miRNA实时定量PCR检测的内参为miR‑128‑2‑3和miR‑200a‑3p。本发明公开了检测该内参的引物。该内参与引物可用于制备熊猫乳汁miRNA内参检测试剂盒。本发明的内参miR‑128‑2‑3和miR‑200a‑3p在不同个体，不同时间点之间的表达最为稳定，且表达丰度高，适合乳汁检测应用的miRNA定量参考标准。

Description

一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用。

背景技术

自miRNA发现以来，以成为生命科学领域的研究重点。miRNA是一类长度20-25nt的内源性非编码RNA(noncoding RNAs)，是由具有发卡结构，长度约为70到90nt的前体miRNA加工而来。miRNA能够与靶mRNA的3’末端UTR区部分或完全结合，从而导致翻译的抑制或靶mRNA的降解。目前的研究发现miRNA的功能包括调控细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡和众多生理和病理进程中扮演着重要的调控作用，这种小分子不但在细胞内起到重要作用，也在血清、血浆、唾液、尿液等各种体液中执行特定功能。乳汁是哺乳动物新生儿最重要的营养和被动免疫来源，富含多种免疫成分，能够满足婴幼儿大脑发育、生长以及健康免疫系统的各种需求。

大熊猫已在地球上生存了至少800万年，被誉为“活化石”，据研究表明，大熊猫初乳分泌时间长达30～40天，且初乳中富含受miRNA调控的免疫相关蛋白，并通过哺乳过程对新生个体发育发挥重要作用。然而，同一miRNA表达特征在不同的研究中差异很大，一旦体液中的特定miRNAs表达特征被广泛接受，那么这种检测miRNA的方法就提供了一种非入侵或是低入侵式生长或免疫相关生物标记的检测方式。并且熊猫乳汁检测的标准一旦建立，即如同生化学检测那样具备普遍性、强制性和客观性的特点，会在最大限度上排除主观因素的干扰，进而提高诊断效率。但是，miRNA的表达特征在不同的研究中有较大差异，不仅表现在组织之间有差异性，而且在不同泌乳阶段上也有差异。

鉴定miRNA的方法通常会用到定量PCR法(q-PCR)，采用q-PCR技术对miRNA进行定量的方法主要有两种，第一种称为poly(A)加尾法，即先通过poly(A)聚合酶(PAP)处理总RNA，使得miRNA的3’端加上一段poly(A)尾巴然后使用5’端含有接头序列的poly(T)引物进行反转录，产生了有一段接头的Cdna,为后面PCR扩增提供反向通用引物，最后用一条与miRNA序列特异的正向引物实现PCR扩增。第二种方法是利用茎-环状引物反转录miRNA，即stem-loop RT-qPCR检测法,茎-环状反转录引物中除含有一段与miRNA互补的特异性序列外,还含有一段较长的共有序列,与靶miRNA退火反转录后,能得到一个较长的反转录扩增子(cDNA),共有序列提供了一个通用引物结合位点,然后通过一个与miRNA序列特异的引物和一个通用引物实现PCR扩增。

然而，目前对miRNA定量研究多采用核糖体RNA(5S rRNA)和核仁小RNA作为定量参考，如RNU6，RNU43，RNU44和RNU48。但是，这些定量标准存在着明显的合理性问题，比如，核糖体RNA和小核仁RNA的片段长度为60-300nt之间，与miRNA的19-23nt明显不同，这种分子量上的差异可能会导致核仁小RNA对提取过程和酶促反应的反应性不同于miRNA。另外更重要的是，与miRNA分布于细胞质和EXOSOME不同的是核仁小RNA主要分布于细胞核内，其分布区域有明显的不同。因此，核糖体RNA和核仁小RNA用来做miRNA定量的参考并不合适。

基于以上背景，本发明人分别取3只熊猫0d，10d，20d，40d，60d所分泌的乳汁进行高通量测序，其中miR-128-2-3和miR-200a-3p在不同实验组之间表达最稳定。接下来本发明人应用实时定量PCR的方法，确定miR-128-2-3和miR-200a-3p在几个候选内参基因里稳定性表达最高，且丰度最高，从而鉴定出了适合熊猫乳汁检测应用的miRNA定量参考标准。

发明内容

针对目前在miRNA相对定量过程中存在参考性不足、异质化、稳定性不同等问题，本发明提供了一种用于熊猫乳汁miRNA实时定量PCR检测的内参基因，克服了现有内源性和外源性内参标准的缺点和误区，提供了一种相对简便、效率更佳的血清miRNA含量标准化的内参。

为了实现上述技术效果，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因，所述的内参基因包括miR-128-2-3和miR-200a-3p。

所述的内参基因miR-128-2-3的核苷酸序列为：TCACAGTGAACCGGTCTCTTT；所述的内参基因miR-200a-3p的核苷酸序列为：TAACACTGTCTGGTAACGATGTT。

用于扩增所述的内参基因miR-128-2-3的引物如SEQ ID NO.1所示，用于扩增所述的内参基因miR-200a-3p的引物如SEQ ID NO.2所示。

所述的内参基因miR-128-2-3或miR-200a-3p在制备用于熊猫乳汁miRNA实时定量PCR检测的内参试剂或试剂盒中的应用。

上述所述的用于熊猫乳汁miRNA实时定量PCR检测的内参试剂或试剂盒也在本发明的保护范围之内。

所述的试剂盒包括上述如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的引物。

所述的试剂盒还包括用于miRNA提取及PCR反应所需的RNA分离液、试剂和酶。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

由于该标准属于内源性定量参考，其合理性相比核小RNA和核仁RNA以及插入式定量参考要强得多。并且，该标准表达量高，在实时定量PCR的检测手段中表现特异、稳定。最后，本定量标准似乎还可以移植至其他系统甚至物种中应用，并且不仅仅限于熊猫乳汁miRNA的质量标准。

本发明确定的内源性定量标准至少具备一个合格内参的一下几个特征：同一类型；不同物种间高度保守；高丰度；不同组织类型中的高度可比性。

目前miRNA作为疾病的诊断标记已经逐渐向临床应用转化，其检验敏感度和特异性已经得到诸多研究机构的证实。因此可以预期该诊断标记会在较短时间内在临床得到普遍应用。有了合适的内源性定量参考，可以在最大程度上节约检测成本。

附图说明

图1是本发明内参基因的筛选流程。

图2是本发明候选miRNA内参分子经过荧光定量PCR鉴定之后的稳定性评价；

图3是本发明候选分子的全体中的稳定性分析。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1，本发明的技术方案由以下步骤组成(1)乳汁制备；(2)乳汁RNA提取；(3)miRNA逆转录；(4)实时定量PCR；(5)miR-128-2-3/miR-200a-3p表达稳定性分析。各步骤之间有时间和技术上的承接关系。此技术上的序贯性不能更改。

具体步骤为：

1)乳汁制备：取等量的来自3个熊猫个体，5个时间点的乳汁；

2)乳汁RNA的提取：采用TaKaRa公司生产的Trizol提取试剂盒提取乳汁样品中的总RNA；

3)miRNA逆转录：用TaKaRa公司生产的Mir-X miRNA First-Strand SynthesisKit试剂盒对miRNA逆转录；

4)实时定量PCR

应用TaKaRa公司生产的Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒和TaKaRa公司生产的SYBR Green PCR试剂盒进行实时定量；

5)miR-128-2-3/miR-200a-3p表达稳定性分析

将Real-time PCR的Ct值输入稳定性评测软件Normfinder、geNorm和BestKeeper中，软件将针对每个miRNA分子在不同样本中的Ct值而给出稳定性指数。输入参考值后，针对每一个miRNA分子，在不同样本中的稳定性变异度都可以以柱形图的形式变现出来，需要说明的是:Normfinder所输出的稳定性参考值越小，表明该分子在不用样本中的稳定性越高。

将测序所得的每个候选分子的拷贝数输入Normfinder和geNorm，经过计算后得出每个候选分子在45个样本中表达的稳定性和变异度。所选的6个候选分子分别为miR-128-2-3、miR-200a-3p、miR-99b-5p、miR-200b-3p、miR-99a-5p和let-7e-5p。结果表明，miR-128-2-3和miR-200a-3p是表现最稳定的候选分子。Real-time PCR对内参分子的鉴定和验证结果表明，miR-128-2-3、miR-200a-3p的算术平均值的稳定性最好，在群体里面的分布最为均一。

基于上述实验结果，本发明提供了一种熊猫乳汁miRNA内参检测试剂盒，该试剂盒含所诉的miR-128-2-3、miR-200a-3p的引物，同时该试剂盒还可以含有PCR技术常用的试剂。

实施例1乳汁RNA提取

1)备品：无酶1.5ml离心管，无水乙醇，氯仿，异丙醇，无酶1ml、200μL、10μl移液枪头数盒，离心管架1个，移液器1套，桌面型低温离心机1台。TaKaRa公司生产的Mir-X miRNAFirst-Strand Synthesis Kit试剂盒一套。RNase Zap一瓶，无菌口罩和手套各一副。

2)将熊猫乳汁样本从冰箱中取出，冰上解冻，期间带口罩和手套，用RNase Zap喷涂操作台面、移液器和相关的提取耗材，灭活RNA酶。

3)4℃，3,000g条件下离心15min。

4)将下层混合物转移至一个新的1.5mL无酶离心管中(用移液器吸取250μL混合物转移至一个新的1.5mL无酶离心管中)，加入750mL Trizol，旋转或者吹打混匀，室温(15-25℃)孵育5min，向混合物中加入200μL氯仿，摇晃15s，充分混匀后室温孵育2-3min。

5)4℃，12,000g条件下离心15min。

6)将上层水相层转移至一个新的收集管中，然后加入500μL异丙醇，充分混匀后室温孵育10min。

7)4℃，12,000g条件下离心10min。

8)弃上清，在沉淀中加入1mL 75％乙醇轻微晃动。

9)4℃，12,000g条件下离心5min。

10)弃上清，干燥沉淀，并溶于30μL DEPC水中。

11)-80℃保存，以便以后使用。

实施例2miRNA逆转录

逆转录采用TaKaRa公司生产的Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒，具体如下：

1)备品：Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒，无酶去离子水，无酶1.5μL离心管和200μL PCR薄壁反应管及盖子，无酶转移枪头各一盒。

2)从冰箱中取RNA样本、逆转录试剂盒及miR-128-2-3、miR-200a-3p引物。冰上融化后。期间用RNase Zap喷涂处理操作台面及移液器。

3)取一无酶的200μL PCR反应管，按照表一的体系建立逆转录反应体系，以10μL体系为例(表1)：

表1 10μL体系

组分	加样量(μL)
		2×miRNA Reaction Buffer Mix	5
RNA sample	3.75
		miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix	1.25
总体积	10

4)盖上盖子，轻轻反复颠倒6次混匀各个组分，短暂离心反应混合液流到PCR反应管底部。上PCR机逆转录。

5)逆转录反应，按照表2条件设置PCR仪。设置好反应条件后，将逆转录反应混合液的PCR管安放于PCR仪的加热模块上，盖上PCR仪的热盖，输入逆转录体系为15μL,启动逆转录反应。

表2

步骤	温度(℃)	时间(min)
			Hold	37	60
Hold	85	5
			Hold	4	∞

6)反应完毕，取出PCR反应管，加DEPC水90Μl，-20℃保存备用。

实施例3实时定量PCR

实时定量PCR仍然采用TaKaRa公司的试剂盒建立反应。

1)备品：Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒，SYBR Green PCR,无酶去离子水，无酶200μL，96孔PCR板，无酶枪头数盒。

2)用DEPC水将引物1:10的比例稀释，反复颠倒混匀后，短暂离心备用。

3)按照表3的实验设计在96孔PCR板里建立实时定量PCR反应，每个反应设定三个重复以减少系统和人为误差。

表3

组分	加样量(μL)
		SYBR Premix Ex Taq II(2×)	5
miRNA Specific Primer	0.5
		mRQ 3’Primer	0.5
cDNA	1
		RNase Free dH2O	3
总体积	10

将以上各组分加好，反复颠倒管子混匀，短暂离心后置于冰上。

4)启动Real-time PCR仪，打开热盖，将反应混合物置于Real-timePCR仪的加热模块上，紧盖盖子。按照表4设定反应条件。

表4

实施例4数据分析

将以miRNA为研究材料所获得的序列表达信息输入稳定性测评软件Normfinder和BestKeeper中，软件将针对每个miRNA分子在不同样本中的拷贝数而给出稳定性指数值。

6个候选miRNA内参分子经过荧光定量PCR鉴定之后的稳定性评价如图2所示。将测序得到的每个候选分子的拷贝数输入Normfinder。经过计算后得出每个候选分子在15个样本中表达的稳定性和变异度。所选择的6个候选分子分别为miR-128-2-3、miR-200a-3p、miR-99b-5p、miR-200b-3p、miR-99a-5p和let-7e-5p。此6个候选分子的全体中的稳定性经由Normfinder分析后如图3所示，可见miR-128-2-3、miR-200a-3p、miR-99b-5p是最为稳定的3个候选分子。

实施例5用于熊猫乳汁miRNA内参检测试剂盒的制备

miRNA试剂盒的制备和操作流程是基于RT-PCR技术。该试剂盒包括乳汁miRNA引物(包括miR-128-2-3的引物或miR-200a-3p的引物，其中，miR-128-2-3的引物对序列为SEOID NO:1和SEQ ID NO:2所示；miR-200a-3p的引物对序列为SEO ID NO:2所示)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或实际，如逆转录酶，缓冲液，去核酸酶水，荧光染料等，可以根据具体采用的实验方案选用，用这些常用酶和/或实际是本领域技术人员熟知的。此试剂盒可检测熊猫乳汁miRNA的内参，应用此内参试剂盒可促进乳汁miRNA相关研究结果的比较，为实验结果的评价奠定基础。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国大熊猫保护研究中心

<120> 一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcacagtgaa ccggtctctt t 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taacactgtc tggtaacgat gtt 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 内参基因(miR-128-2-3)

<400> 3

tcacagtgaa ccggtctctt t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 内参基因(miR-200a-3p)

<400> 4

taacactgtc tggtaacgat gtt 23

Claims (1)

1.一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因在制备用于熊猫乳汁miRNA实时定量PCR检测的内参试剂的应用，其特征在于，所述的内参基因包括miR-128-2-3和miR-200a-3p；

所述的内参基因miR-128-2-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的内参基因miR-200a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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