CN108753973B - 一种长链非编码rna的应用和生物制品 - Google Patents

Abstract

本公开的实施例涉及一种长链非编码RNA作为分子标志物在诊断或治疗前列腺癌的生物制品中的应用，所述长链非编码RNA具有SEQ ID No.1所示的序列，或SEQ ID No.1所示的序列的转录序列，或SEQ ID No.1所示的序列的同源序列或SEQ ID No.1所示的序列的修饰序列。申请人进行的实验证实，本公开实施例的长链非编码RNA在前列腺癌发生和发展中的表达明显高于正常前列腺组织细胞。

Description

一种长链非编码RNA的应用和生物制品

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其在诊断和治疗前列腺癌中的应用。

背景技术

前列腺癌是一种男性高发恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌。近年来，随着人们生活方式的改变、人口的老龄化，前列腺癌的发病率呈明显上升趋势，上海市的统计数据显示，前列腺癌的发病率已经从1991年的2.9/10万男性上升至目前的12.6/10万男性，成为严重危害我国男性身体健康的重要疾病之一。

已有的研究显示，前列腺癌是多种致病因素共同作用下缓慢形成的恶性肿瘤，具有显著的肿瘤异质性，由于其疾病进展缓慢，对患者及其家属所造成的疾病负担长期而且高昂。前列腺癌缺少有效的、特异性的早期肿瘤标志物，患者发病去医院就诊，诊断时疾病就已经处于中晚期，错过了最佳的治疗时期。

目前，临床上主要采用前列腺特异性抗原(PSA)作为前列腺癌患者的筛查、诊断、术后肿瘤复发监测的肿瘤标志物，临床实践显示PSA的局限性很明显，比如缺乏明显的组织特异性，良性前列腺组织也能分泌PSA，尤其是在前列腺炎症时分泌更多，不能很好的区分良恶性。临床上有许多患者由于PSA在灰度区间(PSA 4-10ng/mL)，担心恶性肿瘤的存在，从而选择进行了前列腺穿刺活检，因而遭受了不必要的医疗伤害。

因此，本领域存在寻找一种能够用于诊断前列腺癌的分子诊断标记物的迫切需求。

发明内容

在一个方面，本公开的实施例提供了一种长链非编码RNA作为分子标志物在诊断或治疗前列腺癌的生物制品中的应用，所述长链非编码RNA具有SEQ ID No.1所示的序列，或SEQ ID No.1所示的序列的转录序列，或SEQ ID No.1所示的序列的同源序列或SEQ IDNo.1所示的序列的修饰序列。

在本公开的一些实施例中，作为分子标志物在诊断前列腺癌的生物制品中的应用，包括作为分子标志物在诊断前列腺癌的临床病理Gleason分级、前列腺癌的肿瘤分期的生物制品中的应用。

在又一方面，本公开的实施例提供了一种诊断前列腺癌的生物制品，所述生物制品包括试剂，所述试剂包括用于检测生物样品中长链非编码RNA表达量的试剂，所述长链非编码RNA为上述的长链非编码RNA。

在本公开的一些实施例中，所述生物制品为试剂盒，所述试剂盒包括所述试剂，所述试剂，包含对所述长链非编码RNA具有特异性的标记物。

在本公开的一些实施例中，所述标记物包括所述长链非编码RNA的引物组，或荧光标记的所述长链非编码RNA的引物组，或结合所述长链非编码RNA的化合物。

在本公开的一些实施例中，所述生物制品为芯片，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于上述的长链非编码RNA。

在本公开的一些实施例中，所述长链非编码RNA的引物组是SEQ ID No.2所示的序列和SEQ ID No.3所示的序列组成的引物对；或SEQ ID No.4所示的序列和SEQ ID No.5所示的序列组成的引物对。

在还一方面，本公开的实施例提供了一种用于治疗前列腺癌的生物制品，包括用于抑制或沉默所述长链非编码RNA表达的成分，所述长链非编码RNA为上述的长链非编码RNA。

在本公开的一些实施例中，所述成分为siRNA，包括SEQ ID No.8所示的序列和SEQID No.9所示的序列组成的引物对；或SEQ ID No.10所示的序列和SEQ ID No.11所示的序列组成的引物对；或SEQ ID No.12所示的序列和SEQ ID No.13所示的序列组成的引物对。

本公开的其它方面和技术细节，结合具体实施方式部分的描述将为本领域技术人员所理解。

附图说明

图1为LncRNA在前列腺癌细胞中的表达和利用siRNA对其进行抑制对表达的影响示意图，其中A显示了LncRNA在各个前列腺癌细胞中的表达；B显示了通过siRNA下调LncRNA的表达；C显示了下调LncRNA的表达对前列腺癌细胞的活性和增殖能力的影响；D显示了下调LncRNA表达对前列腺癌细胞的增殖能力的影响。

图2为LncRNA在前列腺癌细胞中的表达和利用siRNA对其进行抑制对前列腺癌细胞迁移能力的影响示意图，其中A为NC对照组，显示了LncRNA在前列腺癌细胞中的表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响，B为通过siRNA2下调LncRNA的表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响，C为通过siRNA3下调LncRNA的表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响。

图3显示了LncRNA在前列腺癌细胞中的表达对前列腺癌患者生存的影响，其中A显示了LncRNA的高表达和低表达对患者总生存率和存活月数的影响，B显示了LncRNA的高表达和低表达对患者无进展存活期(PFS)和无进展月数的影响。

具体实施方式

长链非编码RNA(LncRNA)是一种一般不编码蛋白或编码蛋白能力有限的碱基序列，其在表观遗传学、转录调控、转录后调控等多种层面调控基因表达，在多种生物学进程中发挥重要作用，包括人类基因调节、细胞生长分化以及肿瘤疾病的发生、脂肪代谢等。部分研究发现，有些长链非编码RNA与癌症的发生发展存在密切的关系，长链非编码RNA表达水平上的差异或某些癌症类型特异性有关，因此如果能够获得一种与前列腺癌相关联的LncRNA，将有助于开发新的诊断或治疗前列腺癌的方法。

在下述实施例中，所涉及的实验操作均可按照《分子克隆实验指南(第三版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3red黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述条件和方法进行。其它未详细描述的试验方法如无特殊说明，均为本领域的技术人员所熟知的常规方法。下面就各相关试验操作简述如下：

细胞培养

在下述中，涉及到的前列腺癌肿瘤细胞及其培养条件如下所示：

表1前列腺癌肿瘤细胞类型及其培养条件

名称	种类	培养条件
			WPMY-1	正常人前列腺基质细胞	10％FBS+DMEM+1％PS
LNCaP	前列腺癌雄激素依赖型细胞	10％FBS+RPMI+1％PS
			PC-3	前列腺癌雄激素非依赖型细胞	10％FBS+RPMI+1％PS
Du-145	前列腺癌雄激素非依赖型细胞	10％FBS+RPMI+1％PS
			PC-3M-IE8	前列腺癌雄激素非依赖型细胞	10％FBS+DMEM+1％PS

各前列腺癌肿瘤细胞在在37℃含5％CO₂的恒温培养箱中培养。每天更换培养基，当细胞密度长满瓶底时进行传代。

在上述的培养条件中，10％FBS+DMEM+1％PS表示以DMEM为基础培养基，加入10％体积百分比含量的FBS、1％体积百分比含量的PS。其余培养条件同理。

总RNA的提取

待培养皿中细胞密度在80％左右时，用无菌PBS洗细胞两次，把PBS全部吸出。在六孔板中加1mL/well Trizol，冰上静置5-7min。用移液枪吹打细胞悬浮液，把用Trizol试剂裂解的细胞收集于无RNA酶的EP管中，加氯仿，震荡，静置，低温离心。用移液器吸取上清转入新的EP管中，加异丙醇，静置，离心，弃上清液，加70％乙醇重悬白色沉，离心，弃上清，温室静置，待沉淀自然风干后用DDW充分溶解，通过酶标仪测定纯度。

例如，细胞RNA的提取可以通过如下步骤进行：

待培养皿中细胞密度在80％左右时，先用预冷的PBS将细胞洗2遍后弃PBS。向六孔板中加1mL/well Trizol，冰上静置5-7min。用枪吹打细胞悬浮液后收集于无RNA酶的1.5mL离心管中。每管加入0.2mL氯仿后混匀。室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min。然后用移液器轻轻吸取上层水样层(含有核酸)至新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入加入0.5-1倍体积的异丙醇，-20℃静置20min，12000rpm，4℃离心15min。然后弃上清液，加入1mL的70％乙醇重悬白色沉淀。12000rpm，4℃离心5min。再次弃上清，温室静置5min，用20-50μL无RNA酶的DDW溶解，用酶标仪测OD260/OD280。RT-PCR引物的选择

根据SEQ ID No.1序列(为表述清楚和符合本领域常规表达方式，SEQ ID No.1序列为本发明所述非编码RNA对应的cDNA序列)，申请人结合自身经验，设计了两组RT-PCR引物以及对应的内参引物，如下表2所示。根据提取的WPMY-1、Du-145、PC-3M-IE8、PC-3、LnCAP细胞的总RNA，然后反转录成cDNA，分别用表2所示的两种引物组进行RT-PCR，显示两个引物组均可以满足RT-PCR要求。

表2：PCR引物组

其中，相对于第一组引物，第二组引物的扩增产物杂带较少或不存在。因此，本申请以采用第二对引物为例进行RT-PCR。

siRNA序列的选择

根据SEQ ID No.1序列，申请人结合自身经验，设计了三组siRNA序列和一组空白对照序列，如下表3所示：

表3：siRNA引物组

RNA反转录成cDNA

用Trizol法提取各组培养皿中细胞RNA，用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,采用上游引物5’-AGCAGGCCATTTCCAATCCA-3’，下游引物5’TCATCCAGCTCACATTCCCG-3’。内参上游引物5’-CTCCATCCTGGCCTCGECTGT,内参下游引物:5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’进行PCR。

实时荧光定量PCR反应条件为预变性94℃5min；变性，94℃30sec；退火，60℃30sec，延伸，72℃1min进行40次反应循环。在72℃延伸阶段采集荧光信号。每个样品设置3个复孔，实验重复3次。

例如，细胞RNA的反转录可以通过如下方法进行：

用Trizol法提取各组培养皿中细胞的总RNA作为模板，用逆转录试剂盒行反转录反应，进行cDNA的第一链合成。总RNA取500μg，置于DEPC水处理过的EP管中，如下步骤进行反转录：

总RNA 500μg

Random Primers 1μL

Oligo(dT)Primer 1μL

再加RNase Free去离子水补充到12μL，65℃条件下孵育5min，再短暂离心，并迅速转移到冰上静置2min。同时配制接下来反应所需的反应混合液：

表4

5×第一链缓冲液	4μL
		RNase Inhibitor(40U/μL)	1μL
0.1M的DTT	2μL
		dNTP(10mM)	1μL
Reverse Transcriptase M-MLV	1μL

将配好的混合液，每管8μL的量分别加入放置在冰上的EP管中并混匀，在37℃条件下静置2min，然后再加入反转录酶M-MLV各1μL到每管中，轻轻吹打混匀，置于PCR仪中，按照37℃条件下50min，再70℃条件下15min反应，最终得到cDNA存于-20℃冰箱中备用。

例如，RT-PCR可以通过如下方法进行：

RT-PCR反应试剂盒采用Invitrogen公司AceQ qPCR SYBER Green Master Mix试剂盒。反应体系如下：

表5

ACEQ	10μL
		样品cDNA	2.0μL
去离子水	up to 20μL
		dNTP(10mM)	0.8μL
ROX Reference	0.4μL
		Primer F(10μmol/L)	0.4μL
Primer R(10μmol/L)	0.4μL

采用Bi 7300实时定量仪器检测反应信号，设置3个复孔，反应条件为：

预变性：94℃，5min。

变性：变性，94℃30sec，退火，60℃30sec，延伸，72℃1min进行40个反应循环；在72℃延伸阶段采取荧光信号。

第三步：制作熔解曲线。

第四步：4℃，保存。退火。

细胞转染

将状态良好的细胞以1.5×10⁵细胞密度接种到6孔板中，每孔加入2mL无双抗的10％的FBS(fetal calf serum)的RPMI-1640细胞培养液进行细胞培养过夜，当细胞丰度在30％-50％时进行转染。弃去六孔板中的培养液，用PBS洗2-3遍。将预先准备好的转染混合物加入孔中。并再加入1.5mL无双抗的10％的FBS(fetal calf serum)的RPMI-1640细胞培养液。转染六小时后弃培养基，更换含有双抗的RPMI-1640完全培养基培养箱中继续培养，当细胞密度处于80％左右时用Trizol提取细胞总RNA。

克隆细胞计数

细胞转染siRNA 24小时后予以消化，计数，以1000cell/well接种至六孔板中，每孔加入2mL含有双抗的RPMI-1640完全培养基培养箱中继续培养。每隔两天观察细胞生长情况，并更换培养液。七天后取出六孔板，弃去培养液，用PBS清洗两遍。

每孔加入800mL的0.1％结晶紫进行细胞染色20分钟。拍照并观察计数克隆细胞数。

细胞划痕检测

以1.5×10⁵个细胞密度接种到6孔板中，每孔加入2mL无双抗的含有10％的FBS(fetal calf serum)的RPMI-1640细胞培养液，细胞培养箱孵育过夜，当细胞密度在30％-50％时进行siRNA转染。弃去六孔板中的培养液，用PBS洗2-3遍。将转染混合物加入孔中。并再加入1.5mL无双抗的10％的FBS(fetal calf serum)的RPMI-1640细胞培养液。转染六小时后弃培养基，更换含有双抗的RPMI-1640完全培养基，培养箱中继续孵育。

当细胞密度处于90％，用黄色枪头划痕，并用PBS清洗两遍，洗除漂浮细胞。每孔加入RPMI-1640细胞培养液。分别于0，24小时予以拍照记录。

MTT检测细胞增殖实验

将细胞接种于培养皿中，分实验组和对照组。实验组转染siRNA,非特异性对照组转染si-NC。48小时后胰酶消化收集细胞，接种于四块编号为D1，D2，D3，D4的96孔板中，每孔细胞密度调整至2×10³cells/well，每组设置五个复孔。在37℃、体积分数5％CO2中孵育。

编号为D1，D2，D3，D4的96孔板逐日从培养箱中取出，进行染色测定。

每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4,5一二甲基噻唑-2)2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethy 1-2-thiazolyl)-2-5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT),置孵育箱继续培养4小时。

弃尽培养液，每孔加入150μL的二甲基亚枫，摇床上振荡10分钟。

利用博酶标仪检测其每个孔OD₅₄₀吸光度，分析数值后绘制出生长曲线图。

统计分析

-

实验数据分析均采用SPSS软件处理，数据统计采用均数均数±标准差(x±s)呈现，组间差异使用t检验，双侧P＜0.05差异有统计学意义。

在下述实施例中，涉及到生物学领域的诸多概念，此处做非约束性描述。

非编码RNA(Non-coding RNAs)是指不编码蛋白质的RNA。

在非编码RNA中，根据大小的不同，具有调控作用的分子主要分为两类:短链非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)。

“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，可以互换使用，都是指一种由RNA聚合酶转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。

长链非编码RNA，例如可以从离体生物样品，包括但不限于来自被检测对象的离体的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液分离。“分离”是指物质从其原始环境中分离出来。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

长链非编码RNA例如可以从前体LncRNA加工而来，前体LncRNA可剪切生成成熟的LncRNA，成熟的LncRNA可能与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。

“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，例如两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的，例如至少有80％的核苷酸是互补的，例如至少有95％的核苷酸是互补的，例如98％,99％或100％的核苷酸是互补的。。

“同源性”是指两种核酸分子的核苷酸序列之间的相似程度，同源序列与目标序列具有足够的相似性，例如同源性不低于90％，例如同源性不低于95％，例如同源性不低于98％。

“修饰序列”是指对核苷酸序列进行的非功能性修饰衍生的序列，例如硫代修饰，例如甲氧基修饰。

在本公开的至少一个实施例中，提供了一种长链非编码RNA，具有SEQ ID No.1所示的序列，或SEQ ID No.1所示的序列的转录序列，或SEQ ID No.1所示的序列的同源序列或SEQ ID No.1所示的序列的修饰序列。

申请人经过实验发现，该长链非编码RNA在前列腺癌中的表达明显高于正常前列腺组织细胞，从而可作为预测、诊断前列腺癌进展情况的标志物，及其作为靶点治疗前列腺癌。

在本公开的至少一个实施例中，提供了一种诊断前列腺癌的生物制品，所述生物制品包括试剂，所述试剂包括用于检测生物样品中长链非编码RNA表达量的试剂，所述长链非编码RNA为上述的长链非编码RNA。

可选地，所述生物制品为试剂盒，所述试剂盒包括所述试剂，所述试剂包含对所述长链非编码RNA具有特异性的标记物。

可选地，所述标记物包括所述长链非编码RNA的引物组，或荧光标记的所述长链非编码RNA的引物组。

其中，所述试剂可以表现为生物学上任何可接受的产品形式，包括但不限于探针、基因芯片，或PCR引物。

其中，该生物制品可以制成为生物工程上可接受和应用的产品形式，例如芯片，芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针特异性地对应于上述的长链非编码RNA。

其中，该生物制品还可以制成为试剂盒，作为完整商业销售和应用封装的试剂盒，为了提高检测的准确性，便于进行阴性和阳性对照，上述试剂盒中还可含有相关的阳性对照和阴性对照、还可以包含便于快速操作使用的其它辅助试剂，如DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂等，这些成分是PCR扩增检测中常用的，其用量和使用也为本领域技术人员熟练掌握，此处不予赘述。

在本公开的一些实施例中，所述长链非编码RNA的引物组是SEQ ID No.2所示的序列和SEQ ID No.3所示的序列组成的引物对。

在本公开的一些实施例中，所述长链非编码RNA的引物组是SEQ ID No.4所示的序列和SEQ ID No.5所示的序列组成的引物对。

在本公开的至少一个实施例中，提供了一种用于治疗前列腺癌的生物制品，包括用于抑制或沉默所述长链非编码RNA表达的成分，所述长链非编码RNA为上述的长链非编码RNA。

例如，包括上述长链非编码RNA的siRNA。

可选地，所述siRNA可以包括上述长链非编码RNA的反义链，例如SEQ ID No.6所示的序列和SEQ ID No.7所示的序列组成的引物对siRNA1，例如SEQ ID No.8所示的序列和SEQ ID No.9所示的序列组成的引物对siRNA2，例如SEQ ID No.10所示的序列和SEQ IDNo.11所示的序列组成的引物对siRNA3。

基于前述的实验方法，通过qPCR检验了所述长链非编码RNA在WPMY-1、DU-145、PC-3M-IE8、LnCAP、PC-3细胞株中的表达情况。其中LnCAP是前列腺癌雄激素依赖型细胞，DU-145、PC-3M-IE8、PC-3细胞是前列腺癌雄激素非依赖型细胞。

参考图1-A，qPCR实验结果显示该长链非编码RNA在各个前列腺癌细胞株中的表达明显高于WPMY-1(正常前列腺癌基质永生化细胞)，特别是在前列腺癌细胞株DU-145(前列腺癌雄激素非依赖型细胞)中表达升高最显著(t＝15.67P＜0.05)。

上述结果显示，所述长链非编码RNA可以作为诊断各类前列腺癌(包括雄激素依赖性前列腺癌、雄激素非依赖性前列腺癌)的生物标志物，尤其可以对雄激素非依赖性前列腺癌(或称激素抵抗性前列腺癌)具有显著的诊断效果。

基于前述的实验方法，以长链非编码RNA表达量最高的前列腺癌雄激素非依赖型细胞DU-145为例，观察siRNA对长链非编码RNA在DU-145细胞中的表达的影响。

如图1-B所示，三组siRNA都能下调LncRNA在DU-145细胞中的表达，其中第三组siRNA效果最明显，第二组siRNA效果次之。

基于前述的实验方法，研究了通过siRNA来下调LncRNA的表达的效果，并观察下调LncRNA的表达后前列腺癌细胞表型的改变。为了进一步检测LncRNA表达水平变化能否改变前列腺细胞的增殖表型，在下调LncRNA表达后行MTT实验，克隆形成实验。MTT实验即琥珀酸脱氢酶可将MTT还原为蓝紫色小结晶颗粒样颜色，其产量与待测存活细胞数成正比，同时也与细胞活力成正比。

如图1-C所示，以DU-145细胞系为例，在通过siRNA转染下调后较NC组细胞活性减弱，增殖曲线低平(P＜0.05)。

由此显示，通过siRNA抑制LncRNA表达，可以显著降低前列腺癌细胞的存活和活力，可用于治疗或缓解前列腺癌的发生和发展。

基于前述的实验方法，检测反映细胞存活能力的克隆形成实验。细胞的克隆形成率指接种并贴壁的细胞存活，并且能形成克隆的数量，其中贴壁后的细胞并不是每一个都能进一步增殖并继续形成克隆，因此能形成克隆的细胞却一定是能贴壁并具有增殖活力的。因此克隆形成实验常被用来检测其细胞增殖能力和群体依赖性。

以DU-145细胞系为例，下调LncRNA表达后克隆形成实验的结果如图1-D所示，经过siRNA-2、siRNA-3转染沉默七天后，DU-145细胞所形成的克隆数要明显低于NC siRNA组。显示出LncRNA有增强前列腺癌细胞克隆形成的能力(P＜0.05)，而抑制其表达能够有效削减前列腺癌细胞克隆形成和存活。

基于前述的实验方法，在一些实施例中，申请人通过划痕实验验证了LncRNA的表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响。

参考图2-A、B、C所示，以DU-145细胞为例，显示了转染LncRNA siRNA2、siRNA3下调LncRNA表达，24小时后空白对照组DU-145细胞间距分别为(320±13)μm，siRNA2、siRNA3实验组细胞间距为(450±23)μm、(495±18)μm，显示通过siRNA抑制LncRNA表达能够显著抑制前列腺癌细胞迁移能力，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

在一些实施例中，申请人从根据以往的临床病例和检测数据，随机选取了498个前列腺癌患者的资料。检测结果显示，在498个患者中，均有LncRNA的表达，其中高表达组的有12人，低表达组的486人。

为了研究LncRNA表达与临床病理分期的相关性，对收集的498个临床患者数据进行统计分析，结果如表6所示，高表达组和低表达组在年龄、淋巴结计数、疾病复发状态、PSA结果、淋巴结远处转移无明显统计学差异(P>0.05),但表达情况与临床病理分期，肿瘤复发指标，临床病理Gleason分级呈显著性正相关(P<0.05)，其中，高表达组的患者肿瘤恶性程度明显较高，术后肿瘤复发时间短，疾病进展快，预后差。

表6：LncRNA表达水平与前列腺癌临床病理特征相关性分析[n(％)]

*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001

在疾病复发时间比较上，高表达组平均复发时间为30.91个月，低表达组平均无病状态大于180个月，高表达组患者的预后明显较差(P＝0.026)。在疾病生存时间比较上，高表达组的平均生存时间为81.1个月，低表达组平均生存时间大于180个月。高表达组患者的术后生存时间明显较短，预后较差(P＝0.0000355)。高表达的患者，临床肿瘤分期明显较低表达组晚，恶性程度更高，且能和肿瘤生化指标一样提示肿瘤复发。

参考图3所示，显示了LncRNA的表达水平(高表达、低表达)对患者生存曲线的影响，显示出LncRNA的高表达的患者预后较差。

上述研究结果显示，本公开所提供的LncRNA是一个良好的前列腺癌检测标志物，且可以用于区分前列腺癌的临床病理Gleason分级。

序列表

<110> 宜兴市人民医院

<120> 一种长链非编码RNA的应用和生物制品

<130> 0003

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3266

<212> DNA/RNA

<213> 人(Human)

<400> 1

atgcgcggtc tgcctcccgc ggcgggccgg gtctccaggg aggacctgag tttttcttca 60

cccatggtca gggaggcgcc atcgccctgg ctttggggct ggggcctccg gggaggttcc 120

ggtaggggcg ttggagaggc cgctcttttt gcaaggcccg agatggcggg ccctgcgcag 180

gccgccctat tccgcgccct cagggcgtca gtatccgcct gaggccggat acccactctg 240

ggctcggata cccgcgctgg gcccggagca tcctcggcgc tgccctccca gagccccgca 300

gaggctgagg tggcgcgggg gcggccccgg ctccgcgaga agaggcggca gcgagggctg 360

gaggacccgg gctacggggc tccggggcgt ctggcctggg tgggactgag cccatccagg 420

gactgggact ccggggttct ggtgtaggtg gatcccgggc aggctcagga ccaagaccct 480

ctccttccac caaggagcgc ccagaggccg gcgggagctc caggttcacc tcctcctcct 540

ccagggacga cttgagaagg catcctgacc ctatgcagaa atgcagaaac acttccatga 600

gctaaacaac ctatgtgaag gcctgaaagc caaagcaaga tcctcttatt acaaagctgt 660

ccaacaaaaa gttttccaag taacactgga ggtccatcac tcactcttcc tggtctggaa 720

atgccagaaa tgtcctcctt ggtccttctg agagtcaaga tcttttcaaa gtcacctcag 780

gagccacaga accactccat cctacctgaa attgcaggat gactcttctt ttgaccagag 840

tctcaaaaat atattcgttg ataattttga ttcctgggag ccgccattgc ttgcaaaaga 900

tgtgccaggg actagacatt ttctgtctcc tcacttgtcc ggggaagact gaagttttac 960

tgaaacacag agatgggaat ctgaccctct gagcagcctc aggattttct aagtcttcca 1020

agcagagtgg aaatactgga aatcccactt ccagctggat gtctggatga actcctgaaa 1080

gctgctgagt gtcctgcagc aggtgagctg tggccagagc ccaaggatga aggggactcc 1140

ctcactctgt gactgtgaag aggaagcctg aggtgtagca ggcccaggcc ccagaagtat 1200

ggaaaaaatg agcctttcat cccaaagatg cagccgactt gattgtggtg gatgagcttt 1260

ttgatgtgct gctggattct gtttgctagt attctattaa gaatttttgc attgatgttc 1320

atcagggata ttggcctgga ttgagcaggc catttccaat ccagaggaag accttctaga 1380

agaagtgatg ggtgggagag tgctgacata ctatgcaaag ctactatttg gagttggaca 1440

cgagtgcatg tgaccttgtg ccacagcggg aatgtgagct ggatgacaaa tggagatttg 1500

gacttgtgat aattggcctc tgtgtcattg tgtggaagac tgactggtcc ctttatttcc 1560

tgtagcttga ctaccacaca aattaatcca ctcaaatgtt ggcaagtgga gcagagtccc 1620

aggacagtct gcaatctcta caggtacaga aacaccccca gttcaaggat cttcacacct 1680

ggatttaggc ctacacctgc aactacccca ggccagttat ccaggcagtg actttctgta 1740

cagctacagt cacctctgga cacctgcgga gactttaaaa atttccagaa ggtcaggaat 1800

ttttggagac ctttcttatg gctacgttgc ctgcaaaggt gaatcaataa gcttctgaac 1860

tgacttagaa aatgttgcag agactcttgt gaacagatag accctctcct gccactccag 1920

atagacgtat ccgggtcaca cacacctgat ttaacaacat ctcattatct caggcaccaa 1980

tttgatcttc tactactttg cagacatctc ttctgcaaac accagacaaa ctgagacaat 2040

gaacttccgc aggacccaaa gcacctctta ctgcaggaaa gaagatccag tgagatagtt 2100

agtccacaaa tggaatgtca atccataaac acacttaagt aacagaataa atttagtatg 2160

agcgttttta tgtgggagct cttgaaatgg ttgctgctca tatgtcagag acatatgcag 2220

tttaagaaag gtagcagttc caatcctggt ttggcccaac agtcactgca tttttggtgg 2280

ggaaaaggga tgtgggagga gatggtacat cttcatcttt ttctctgggt tttctgtcag 2340

aaagggatgt tgcttactcc agtggcaaaa aatgccagtg tcttctgcca gagtgggtta 2400

ctgagggcca tggtggttcc accttgtggc tgatacagat agtccctttc tgcttttgtt 2460

tctagccaaa aaagatgttt ctcgcatctc aggtatgcag acttcagcag ctgttttttc 2520

tatatggcta tttttttttt ctttcactct ctctttctct cttttttttt tgttggcttc 2580

actgtgttgc catagtttct taaatggtcc cttgaaccct cccagagcta ttttggtttg 2640

tacataacta tctatatatt tttttcttgg ggggagtgtg tagagctaaa ggctggtata 2700

tcctgctcct gctccccgaa agtgacgtta ttcccccaag ctaatatttc aggctttcaa 2760

tttattcatg ctttcatctg tttaaacata agtagaaatt actttttctc tccacattta 2820

gatttgatct atctacttta attgctaata gtgtcttagt catagaatag attagttaga 2880

aaaaagtgtt tttgacatta taaatgattc tttcaatttg tgtctaaaag tggaaaatac 2940

tagaaagctt aacatttatt attgtattca gaccagtatt tcctccagat gacctttatt 3000

acaacaaaga taatttaatg aagatctctc taatggtaaa gctgatggct ttgtgctatt 3060

acaatatcct tcaaataaag tgacgatctg gtggaaagaa caactaaagc aaggattagg 3120

aagaaaacag ttaatacctt cattttggtc tcactctgca ttaagagttt tcattgtgtt 3180

aaggatttat tatacattaa gtaatttaat gttcatttaa taataaatgg atcctattaa 3240

atatgatttt taaaattata atcaca 3266

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成引物(prime)

<400> 2

acacgagtgc atgtgacctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成引物(prime)

<400> 3

tctgctccac ttgccaacat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成引物(prime)

<400> 4

agcaggccat ttccaatcca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成引物(prime)

<400> 5

tcatccagct cacattcccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成引物(prime)

<400> 6

ctccatcctg gcctcgctgt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工合成引物(prime)

<400> 7

gctgtcacct tcaccgttcc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 小分子干扰RNA(siRNA)

<400> 8

ccugacccua ugcagaaaut t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 小分子干扰RNA(siRNA)

<400> 9

auuucugcau agggucaggt t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 小分子干扰RNA(siRNA)

<400> 10

gccugcaaag gugaaucaat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 小分子干扰RNA(siRNA)

<400> 11

uugauucacc uuugcaggct t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 小分子干扰RNA(siRNA)

<400> 12

gccacuccag auagacguat t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 小分子干扰RNA(siRNA)

<400> 13

uacgucuauc uggaguggct t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 对照RNA(RNA)

<400> 14

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 对照RNA(RNA)

<400> 15

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (9)

1.一种长链非编码RNA作为分子标志物在制备诊断前列腺癌的生物制品中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA为SEQ ID No.1所示的序列。

2.权利要求1所述的长链非编码RNA的应用，其特征在于，包括作为分子标志物在制备诊断前列腺癌的临床病理Gleason分级、前列腺癌的肿瘤分期的生物制品中的应用。

3.一种诊断前列腺癌的生物制品，其特征在于，所述生物制品包括试剂，所述试剂包括用于检测生物样品中长链非编码RNA表达量的试剂，所述长链非编码RNA为SEQ ID No.1所示的序列。

4.根据权利要求3所述的生物制品，其特征在于，所述生物制品为试剂盒，所述试剂盒包括所述试剂，所述试剂，包含对所述长链非编码RNA具有特异性的标记物。

5.根据权利要求3所述的生物制品，其特征在于，所述生物制品为芯片，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于所述长链非编码RNA。

6.根据权利要求4所述的生物制品，其特征在于，所述标记物包括所述长链非编码RNA的引物组，或荧光标记的所述长链非编码RNA的引物组，或结合所述长链非编码RNA的化合物。

7.根据权利要求6所述的生物制品，其特征在于，所述长链非编码RNA的引物组是SEQIDNo.2所示的序列和SEQ ID No.3所示的序列组成的引物对；或SEQ ID No.4所示的序列和SEQ ID No.5所示的序列组成的引物对。

8.一种用于治疗前列腺癌的生物制品，其特征在于，包括用于抑制或沉默所述长链非编码RNA表达的成分，所述长链非编码RNA为SEQ ID No.1所示的序列。

9.根据权利要求8所述的生物制品，其特征在于，所述成分为siRNA，包括SEQ ID No.8所示的序列和SEQ ID No.9所示的序列组成的序列组；或SEQ ID No.10所示的序列和SEQIDNo.11所示的序列组成的序列组；或SEQ ID No.12所示的序列和SEQ ID No.13所示的序列组成的序列组。

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