CN107604066A - miR‑518a‑3p在口腔癌诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR‑518a‑3p在口腔癌诊断中的应用，具体的涉及miR‑518a‑3p及其前体在制备口腔鳞癌诊断制剂中的应用。发明采用SAM法对口腔鳞癌及癌旁正常组织进行miRNA芯片数据分析，筛选出差异性表达显著的miRNA，找到与口腔鳞癌相关的新的分子诊断标志物miR‑518a‑3p，进一步，荧光定量PCR实验结果验证miR‑518a‑3p在口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞系中高表达。本发明为临床口腔癌的精准诊断提供了新分子标志物，为后续口腔鳞癌分子诊断产品的开发奠定基础。

Description

miR-518a-3p在口腔癌诊断中的应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体的涉及口腔癌早期分子诊断标志物及其在临床诊治中的应用，更具体的涉及miR-518a-3p及其前体在制备口腔鳞癌诊断制剂中的应用。

背景技术

在过去20年中，随着科技的进步肿瘤检查、治疗手段及仪器设备的不断改善及更新，口腔鳞癌症五年生存率有了5％的改善，但相对于其他肿瘤在过去二十年中五年生存率的提高，口腔鳞癌的五年生存率仍在50％左右，处于较低水平。手术切除仍然是主要的治疗方式，尽管微血管游离皮瓣重建的进展打破了许多切除的限制，并能在功能和外观上最大限度的进行恢复，但因口腔鳞癌发生部位的特殊性，口腔鳞癌对症患者术后发音、进食、社交产生了严重的影响。且因口腔鳞癌患者术后劳动能力受到严重影响，导致口腔鳞癌患者家庭生存状态、生活质量急剧下降。作为21世纪生命科学研究重大发现之一，miRNA在动物的基因表达调控、细胞分化等过程中起着重要的作用。近年来研究发现，miRNA的表达异常与人类肿瘤关系密切，在肿瘤发生、发展过程中有类似癌基因或抑癌基因的作用。作为解决方案，miRNA作为最有前景也是最符合条件的检测及治疗方法受到了学者们广泛的关注。已经提出若干具有口腔鳞癌检测及治疗前景的生物标志物。miRNA可以容易地在肿瘤活组织检查中检测到，并且也可在血液，血浆，血清和唾液等体液组织中检测到。肿瘤的分子靶向治疗被认为是未来医学的治疗策略。

本发明采用SAM法对本课题组前期口腔鳞癌及癌旁正常组织(6例)miRNA芯片数据进行分析，筛选出差异性表达显著的miRNA。找到一些与口腔癌相关的分子标志物，其中miR-518a-3p在癌组织中的表达量高于癌旁组织，进一步，荧光定量PCR实验结果与高通量测序结果一致。本发明为临床口腔癌的精准诊断提供了潜在的分子标志物，为后续口腔鳞癌分子诊断产品的开发奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种口腔癌诊断试剂，所述诊断试剂检测样本中miR-518a-3p及其前体的表达情况。

所述miR-518a-3p序列见SEQ ID NO 1：gaaagcgcuucccuuugcugga，其前体miRNA为mir-518a-1和mir-518a-2，序列见SEQ ID NO 2：ucucaagcugugacugcaaagggaagcccuuucuguugucugaaagaagagaaagcgcuucccuuugcuggauuacgguuugaga和SEQ ID NO 3：ucucaagcugugggucugcaaagggaagcccuuucuguugucuaaaagaagagaaagcgcuucccuuugcuggauuacgguuugaga。

进一步，口腔癌包括牙龈癌、舌癌、软硬腭癌、颌骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上颌窦癌。

优选为口腔鳞癌。

所述的样本为肿瘤组织或外周血。

进一步，口腔癌诊断试剂基于高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中miR-518a-3p及其前体的转录情况。

高通量测序方法主要是指454life sciences公司、ABI公司和illumina公司推出的二代测序技术以及helicos heliscope^TM和pacific biosciences的单分子测序技术。

优选采用二代测序方法、单分子测序方法、northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miR-518a-3p及其前体的转录。

优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增miR-518a-3p及其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与miR-518a-3p及其前体的核酸序列杂交的探针。

进一步，加尾法扩增miR-518a-3p的引物为序列SEQ ID NO 4：gaaagcgcttccctttgctgga。

一种口腔鳞癌检测试剂盒，该试剂盒包含扩增miR-518a-3p的引物，所述引物序列为SEQ ID NO 4。

本发明的目的还在于提供上述miR-518a-3p及其前体在制备口腔鳞癌诊断制剂中的应用。

本发明的目的在于提供一种治疗口腔鳞癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：

(a)化合物或组合物，所述化合物下调miR-518a-3p及其前体的转录和/或抑制miR-518a-3p及其前体的活性；

(b)药剂学上能接受的载体。

进一步，采用反义寡核苷酸、miRNA inhibitor、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、Target Masking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调miR-518a-3p及其前体的转录和/或抑制miR-518a-3p及其前体的活性。

进一步，药物组合物抑制口腔癌细胞的生长。

本发明的目的在于提供上述药物组合物在治疗口腔癌中的应用。

定义：

miRNA是一类内源性、高度保守的、长度大约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA通过其5'端可以与靶基因的3'端非翻译区(3'UTR)特异性结合，在转录后水平发挥调控作用。当miRNA与靶基因3'UTR以碱基完全互补配对的方式结合会引起靶mRNA的降解，而通过非完全互补配对结合的方式则会抑制mRNA的蛋白翻译。近年来，循环miRNA作为各类疾病标志物的研究备受关注。循环miRNA是指存在于血清、血浆、一些体液如唾液、尿液和脑脊液中，游离于组织外的miRNA的统称。循环miRNA作为一个较新且有前景的研究领域，近几年关于其作为肿瘤诊断标志物的研究成为热点。

现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基因芯片、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。

(1)Northern杂交

又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

(2)miRNA表达谱芯片

原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

(3)核酶保护分析技术(RPA)

miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。

(4)RAKE法

RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。

(5)原位杂交(in situ hybridization)

原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(LockedNucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。

(6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)

是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。

(7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)

荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

(8)测序法

大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。

高通量测序又称下一代测序技术，是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(shorthairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性miR Mimics技术该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调节作用。

说明书附图

图1是SAM法分析口腔鳞癌及癌旁正常组织miRNA芯片数据绘制的火山图

图2是miR-518a-3p口腔鳞癌细胞系和正常表皮细胞系相对表达图

图3是miR-518a-3p在口腔鳞癌组织和癌旁组织相对表达图：C为口腔鳞癌组织，N为癌旁正常组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1样品的收集、测序及数据分析

6例口腔鳞癌组织及其癌旁正常组织的样本均来自医院手术切除的标本，所有标本均在离体10分钟以内放入液氮罐中，随后转移至-80℃冰箱中储存。送往公司进行miRNA芯片数据进行分析，筛选出差异性表达显著的miRNA。通过对miRNA的Ford Change值进行log2处理、及相应p值进行-log10处理，绘制出火山图(见图1)。在分析结果中p<0.05的miRNA有55个，其中上调38个，下调17个。除了已有文献报道的和口腔鳞癌密切相关的几个miRNA外(如miR-125b、miR-145、miR-21、miR-181b、miR-362-3p、miR-99a、let-7e等)，本研究还发现几个之前未报道过与口腔鳞癌相关的miRNA(如miR-518a-3p)，将新发现的分子标志物进行进一步的研究。

实施例2细胞培养

实验中所采用的人属口腔鳞癌细胞株UM1、UM2由中山大学光华口腔医学院惠赠，人属口腔鳞癌细胞株SCC9、SCC15购自ATCC(American Type Culture Collection)公司，人属口腔鳞癌细胞株CAL27、Tca8113为广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所惠赠，上述细胞用含10％胎牛血清，1×10⁵U/L青霉素及1×10⁵U/L链霉素DMEM/F12(1:1)完全培养基培养，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养，2-3天传代1次，取指数生长期的细胞用于实验。HaCat为人属正常表皮细胞购自中科院基础医学研究所，细胞用含10％胎牛血清，1×10⁵U/L青霉素及1×10⁵U/L链霉素DMEM完全培养基培养，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养，2-3天传代1次，取指数生长期的细胞用于实验。

2.1细胞的复苏

将液氮罐中冻存管取出后，保持管体直立并立即放入预热的37℃恒温水浴箱加热，迅速解冻，注意冻存管盖下缘应保持于水浴平面以上以防止污染，摇晃加速解冻，约在2至3min内解冻。预先在细胞培养瓶中加入4ml对应种类培养基。待细胞解冻成悬液后，以酒精棉球轻拭冻存管封口处。将解冻的细胞悬液吸出小心转移至细胞培养瓶中，振荡混匀，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度细胞培养箱中，待细胞大部分贴壁(6-8小时)后再次更换液培养。

2.2细胞培养

细胞用含10％胎牛血清的培养基培养于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，每2-3天换一次培养液，在细胞生长到大约80％汇合度时进行传代，取对数生长期的细胞用于实验。

2.3细胞传代

吸掉培养瓶中的培养基，用1×PBS洗两遍后，加入0.25％的胰蛋白酶(以消化液能覆盖整个瓶底为准)，室温放置20sec，后吸净胰酶，置于培养箱内2min后，到显微镜下观察，如发现有胞质回缩、细胞间隙增大，加入含血清的培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，使其形成细胞悬液，加入新鲜细胞培养基，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。

2.4细胞的冻存

按10％DMSO、90％FBS比例配制好冻存液，取对数生长期的细胞，用胰酶消化，再加入10％胎牛血清的细胞培养基终止消化后，1000rpm，离心10min。弃掉培养基，加入配制好的冻存液，轻轻吹打成细胞悬浮液，将悬浮液转入冻存管中，冻存管置于4℃保存的冻存盒中后放入-80℃冰箱，过夜后取出含细胞的冻存管，-80℃冰箱或-196℃液氮罐中保存。

实施例3miRNA的提取

3.1组织miRNA的提取

miRNAs提取过程均按The RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN、Germany)说明书进行。具体步骤如下：

1)将研钵、研磨棒在流水下洗净，风干后锡纸包裹，180℃高温烤箱中12小时使其灭酶。取出后室温下冷却，往研钵中倒入少量液氮使研钵温度低于4℃。将冷冻组织碎块放入研钵中，再加入液氮让组织变脆，研磨棒研碎，反复研磨，使组织粉碎，将粉末状组织转移到干洁的Ep管中。

2)在Ep管中加入70μl QIA20l Lysis Reagent，吹打，混匀1min，室温放置5min。

3)加入140μl氯仿，密封，震荡15s，室温静置2-3min，4℃12000g、离心15min。

4)取上清液约350μl至新EP管，加入70％乙醇350μl(1:1)混匀，移入红色RNaseMini Spin Columns，室温≥8000g、离心15s。

5)滤过液移至2mlEP管，纯化miRNA。

6)加入450μl(0.65倍体积)无水乙醇，混匀，取700μl至白色RNase Mini SpinColumns，室温≥8000g、离心15s，弃滤过液。此步骤重复一次。

7)加入700μl Buffer RWT，室温≥8000g、离心15s，弃滤过液。

8)加入500μl Buffer RPE，室温≥8000g、离心15s，弃滤过液。

9)加入500μl 80％乙醇，室温≥8000g、离心2min，弃滤过液和Tube。

10)将白色RNase Mini Spin Columns放入新EP管(2ml)中，开盖≥8000g、离心5min。

11)将白色RNase Mini Spin Columns放入新EP管(1.5ml)中，加入25μl RNase-Free Water，室温≥8000g、离心1min。此步骤重复一次。

3.2细胞miRNA的提取

细胞miRNAs提取过程按The RNeasy Plus Mini Kit说明书进行。具体步骤如下：

1)将培养瓶从培养箱中取出，在培养瓶中加入70μl QIA20l Lysis Reagent，吹打，混匀1min。

2)将培养瓶中悬浊液移入EP管中。

3)余步骤同以上组织miRNAs提取2)-11)。

3.3miRNAs质量和纯度鉴定

用TE(pH8.0)做空白对照，使用紫外/可见光分光光度计测OD260/OD280值：取1.5μl RNA样品进行RNA质量和浓度鉴定。

3.4miRNAs的保存

提取的miRNAs位于EP(1.5ml)中，直接将EP管保存于-80℃冰箱，或立即进行下一步的逆转录实验。

实施例4实时荧光定量核酸扩增检测实验

4.1逆转录合成cDNA

1)将逆转录所需的试剂缓慢溶解，轻震混匀，离心后置于4℃冰箱或碎冰上待用。

2)逆转录体系的配置。

组分	用量/反应
		Total miRNAs	18μl
2.5U/μl PolyA Polymerase	1μl
		RTase Mix	1μl
5×Reaction Buffe	5μl
		dd H2O(RNase free)	补足Total miRNAs至18μl
Final Volume	25μl

3)逆转录反应条件：AB-7500实时PCR仪上反应：37℃60min，85℃5min，4℃。

4.2Real-time qPCR反应检测miR-518a-3p

1)融解All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit中各试剂上下轻微颠倒混匀，离心后放置冰上待用。

2)Real-time qPCR反应检测体系的配置：qPCR反应液的配制均于碎冰上完成(所有反应体系设置3个复孔检测)。

组分	用量/反应
		2×All-in-OneTM Q-PCR Mix	13.6μl
All-in-OneTM miRNA Primer(SEQ ID NO 4)	2μl
		Universal Adaptor Primer	2μl
Rox Reference Dye	0.4μl
		cDNA(5倍稀释液)	2μl
Final Volume	20μl

3)Real-time qPCR反应条件：

步骤	循环数	温度	时间
				预变性	1	95℃	2min
变性		95℃	10min
				退火	50	62.5℃	10s
延伸		62℃	40s

4.3统计分析方法

本研究中各实验均重复三次以上，各组数据均以均数±标准差表示，统计分析均采用SPSS23.0for windows统计软件进行分析。均数比较采用t检验(两组比较)或单因素方差分析(三组及以上比较)，中位数比较采用非参数检验。所有统计学检验均采用双侧检验，p<0.05表示为具有统计学差异。miR芯片采用SAM法进行统计分析得出差异miRNA并标注差异量及p值。

4.4结果

首先比较miR-518a-3p在口腔癌细胞系和人属正常表皮细胞中的表达情况，结果表明，相对人属正常表皮细胞HaCat，miR-518a-3p在口腔癌细胞系SCC9和SCC15中均呈现高表达，具体见图2。

miRNA芯片分析的结果中显示miR-518a-3p在口腔鳞癌组织中高表达，为了验证芯片分析的结果，本发明另收取7例口腔鳞癌组织及癌旁正常组织进行RT-PCR验证，验证结果表明，荧光定量检测结果与前期miRNA芯片分析结果一致，miR-518a-3p在7例口腔鳞癌组织中的表达量均高于其癌旁正常组织，结果见图3。

虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。

因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。

序列表

<110> 湖南中南大学湘雅口腔医院

<120> miR-518a-3p在口腔癌诊断中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaagcgcuu cccuuugcug ga 22

<210> 2

<211> 85

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ucucaagcug ugacugcaaa gggaagcccu uucuguuguc ugaaagaaga gaaagcgcuu 60

cccuuugcug gauuacgguu ugaga 85

<210> 3

<211> 87

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ucucaagcug ugggucugca aagggaagcc cuuucuguug ucuaaaagaa gagaaagcgc 60

uucccuuugc uggauuacgg uuugaga 87

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaagcgctt ccctttgctg ga 22

Claims (10)

1.一种口腔癌诊断试剂，所述口腔癌诊断试剂能够检测样本中miR-518a-3p或其前体的表达情况，其特征在于，miR-518a-3p序列见SEQ ID NO 1，miR-518a-3p前体为mir-518a-1和mir-518a-2，序列见SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3。

2.根据权利要求1所述的口腔癌诊断试剂，其特征在于，口腔癌为口腔鳞癌。

3.根据权利要求1所述的口腔癌诊断试剂，其特征在于，口腔癌诊断试剂采用高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中miR-518a-3p及其前体的转录情况。

4.根据权利要求3所述的口腔癌诊断试剂，其特征在于，高通量测序方法主要是指454life sciences公司、ABI公司和illumina公司推出的二代测序技术以及helicosheliscope^TM和pacific biosciences的单分子测序技术。

5.根据权利要求3所述的口腔癌诊断试剂，其特征在于，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增miR-518a-3p及其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与miR-518a-3p及其前体的核酸序列杂交的探针。

6.根据权利要求1所述的口腔癌诊断试剂，其特征在于，样本为肿瘤组织或外周血。

7.一种口腔鳞癌检测试剂盒，该试剂盒包含扩增miR-518a-3p的引物，所述引物序列为SEQ ID NO 4。

8.权利要求1-6所述的口腔癌诊断试剂和权利要求7所述的口腔鳞癌检测试剂盒在制备口腔鳞癌诊断制剂中的应用。

9.一种治疗口腔鳞癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：

(a)化合物或组合物，所述化合物下调miR-518a-3p及其前体的转录和/或抑制miR-518a-3p及其前体的活性；

(b)药剂学上能接受的载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，采用反义寡核苷酸、miRNAinhibitor、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调miR-518a-3p及其前体的转录和/或抑制miR-518a-3p及其前体的活性。