CN109593848B - 一种肿瘤相关序列、长链非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤相关序列、长链非编码RNA(lncRNA)及其应用，其中，lncRNA GMAN在胃癌中相对高表达，尤其是在产生远端转移的M1期胃癌病人的样本中显著高表达，而且GMAN的高表达与胃癌病人的不良预后显著相关。研究显示GMAN在胃癌的发生发展中发挥重要的作用，GMAN能显著促进胃癌细胞的侵袭和转移。进一步的研究发现GMAN的MFR区段对于GMAN发挥功能至关重要。通过CRISPR/Cas9的治疗实验表明，GMAN特别是GMAN的MFR区段能够有效的抑制胃癌的转移，可作为临床上控制肿瘤转移的一个新策略。

Description

一种肿瘤相关序列、长链非编码RNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种肿瘤相关序列、长链非编码RNA及其应用。

背景技术

最近的转录组研究已经显示超过70％的人类基因组被转录为RNA，其中大多数是非编码转录物。目前已知的非编码转录物至少有20多种，一般分为两类，一类为非编码小RNA(sncRNA，Small non-coding RNA)，其转录长度少于200个核苷酸，另一类为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)，被广泛的定义为转录长度超过200个核苷酸并且没有表观编码能力的RNA。根据LncRNA基因所处的位置可将其分为正义LncRNA、反义LncRNA、双向LncRNA、内含子内LncRNA以及基因间LncRNA等五大类。目前越来越多的证据显示，很多非编码RNA具有重要的生物学功能，在基因转录、转录后调控、RNA剪切、翻译、表观遗传调控、遗传印迹、X染色体失活以及疾病发生发展等过程中都发挥着重要作用。

越来越多的研究发现，LncRNA的突变或异常与癌症的发生发展密切相关。对LncRNA与癌症关系的研究可以上溯至20世纪90年代，H19是第一个发现与癌症相关的LncRNA。研究表明LncRNA在多种肿瘤的发生、侵袭、转移过程中起重要作用，其中包括黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、白血病、肝癌、乳腺癌等，然而，有关其具体作用机制报道较少。Rajnish等人发现LncRNA HOTAIR位于HOX家族基因的内含子中，其在乳腺癌中高表达，并与肿瘤转移高度相关；进一步研究显示HOTAIR过表达可以促进肿瘤的侵袭和转移能力。另外，还有一些LncRNA在抑制肿瘤发生过程中也扮演着重要角色，在乳腺癌中表达下调的LncRNAGAS5(growth arrest-specific5)，可通过抑制细胞生长及诱导凋亡，而发挥着肿瘤抑癌基因的功能。

LncRNA的肿瘤发生发展中的重要功能为肿瘤治疗开拓了一个新的视野，可能为有效的肿瘤治疗提供重要的潜在价值。在乳腺癌中，lncRNA MAYA在促进乳腺癌的骨转移中发挥重要的作用。在乳腺癌细胞中，ROR1磷酸化HER3，招募LLGL2-MAYA-NSUN6RNA蛋白复合物，促进Hippo/MST1的甲基化，导致MST1失活并使YAP靶向基因活化，进而促进乳腺癌的骨转移。MAYA的治疗实验显示，在产生乳腺癌细胞骨转移的小鼠中，注射MAYA的LNA能显著的抑制乳腺癌细胞的骨转移。虽然关于lncRNA对于肿瘤治疗的研究还相对比较少，但是已有的这些研究都显示LncRNA不仅在肿瘤中发挥重要的调控作用而且具有有效治疗肿瘤的极大潜能，表明lncRNA可作为肿瘤治疗的新型药物靶点。

目前，关于LncRNA在胃癌中的具体调控作用也有了一些报道。在胃癌中高表达的GClnc1作为WDR5和KAT2A的支架，影响组蛋白修饰，进而影响组蛋白调控的一系列基因，包括SOD2，影响胃癌细胞的生长和转移。LncRNA BC032469作为miR-1207-5P的海绵，调控hTERT表达，促进胃癌细胞的增殖。LncRNA HOXA11-AS作为染色体调控因子PRC2，LSD1，DNMT1的支架，促进胃癌细胞的增殖和侵袭等。但是，关于LncRNA作为胃癌治疗潜能的研究目前还尚未有报道。

而胃癌作为全球最常见的恶性肿瘤之一，是导致癌症死亡的重要因素之一。在全球范围内，胃癌是第五高发病率和第三高死亡率的恶性肿瘤，而中国是胃癌高发的国家。胃癌的发生与发展已严重危害到人类的健康。但是，胃癌器官转移起病隐匿，发现时多数患者都难以手术切除，因而预后极差，其5年生存率低于10％，是晚期胃癌患者死亡的主要原因之一。因此，我们迫切需要深入了解胃癌器官转移的发病机理，寻找调控胃癌细胞转移过程的关键因子。LncRNA在多种肿瘤中发挥重要的作用，提示LncRNA的功能可能为胃癌细胞转移的诊断预后和治疗提供新靶点和新思路。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种肿瘤相关序列、长链非编码RNA及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种肿瘤相关序列，其序列为如SEQID NO.1所示的MFR序列。

进一步地，所述肿瘤包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，涎腺肿瘤，颅内肿瘤，甲状腺癌，舌癌，肺癌，食管癌，贲门癌，乳腺癌，纵膈肿瘤，胃癌，大肠癌，直肠癌，肝癌，胰腺癌与壶腹周围癌，小肠恶性肿瘤，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌，皮肤恶性黑色素瘤，淋巴瘤。

上述MFR序列在制备肿瘤诊断试剂中的应用，所述诊断试剂识别SEQ ID NO.1所示的MFR序列。

进一步地，诊断试剂包括但不限于：

(1)识别所述MFR序列的引物/引物组，或荧光标记的识别所述MFR序列的的引物/引物组；

(2)识别所述MFR序列的小分子化合物；

(3)识别所述MFR序列的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

进一步地，所述抑制剂靶向SEQ ID NO.1所示的MFR序列。

进一步地，抑制剂包括但不限于：

(1)抑制所述MFR序列的siRNA、shRNA或功能类似的干扰小RNA；

(2)抑制所述MFR序列的寡核苷酸片段，所述的寡核苷酸片段包括但不限于：反义寡核苷酸ASO、锁核酸LNA或功能类似的化学修饰的寡核苷酸。

(3)抑制所述MFR序列的小分子化合物；

(4)抑制所述MFR序列的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段、其他抑制MFR功能的蛋白分子。

(5)敲除或破坏所述MFR序列的工具分子。

进一步地，能敲除或破坏MFR序列的工具分子，包括但不限于DNA同源重组质粒，TALEN-TALEA靶向基因敲除质粒系统，Cre/Loxp质粒系统，四环素/干扰素等诱导性Cre/Loxp质粒系统，FLP-frt质粒系统，CRISPR/Cas9等CRISPR基因编辑质粒系统等。

一种肿瘤相关长链非编码RNA，包含上述MFR序列序列。具体的，可以为SEQ IDNO.2所示的GMAN。

本发明的有益效果在于：相比于现有技术的优势。

附图说明

图1.1为lncRNA GMAN示意图；

图2.1为Northern印迹检测人胃癌细胞系中GMAN的表达；

图2.2为TCGA转录组数据分析人的组织器官中GMAN的表达；

图3.1为GMAN在胃癌组织中的表达水平；

图3.2为40例具有5年生存信息的胃癌患者队列；

图3.3为Cohort 3，cohort 4和TCGA数据库中年龄，性别匹配的不具有转移的M0期胃癌组织与具有远端转移的M1期胃癌组织中分析GMAN的表达；**，P<0.01。

图4.1为Northern印迹检测GMAN的敲低效率；

图4.2为MTT和克隆形成实验检测GMAN对细胞增殖的影响；

图4.3为细胞流式检测GMAN对细胞周期的影响；

图4.4为敲低GMAN对胃癌细胞的细胞粘附能力的影响；n.s.，没有意义；

图4.5为敲低GMAN对胃癌细胞的细胞侵袭能力的影响；***，P<0.001。

图5.1为Northern印迹检测GMAN的过量表达效果；

图5.2为MTT和克隆形成实验检测GMAN对细胞增殖的影响；

图5.3为细胞流式检测GMAN对细胞周期的影响；

图5.4为过量表达GMAN对胃癌细胞的细胞粘附能力的影响；n.s.，没有意义。

图5.5为过量表达GMAN对胃癌细胞的细胞侵袭能力的影响；***，P<0.001。

图6.1为敲低GMAN对胃癌细胞的转移能力的影响；***，P<0.001。

图7.1为利用CRISPR/Cas9基因编辑构建GMAN的MFR段缺失的胃癌细胞突变株(ΔMFR)；

图7.2为MFR缺失的细胞株对胃癌细胞的细胞增殖能力的影响；

图7.3为MFR缺失对胃癌细胞的细胞周期的影响；

图7.4为MFR缺失对胃癌细胞的细胞粘附能力的影响；n.s.，没有意义。

图7.5为MFR缺失对胃癌细胞的侵袭能力的影响；***，P<0.001。

图8.1为MFR缺失对胃癌细胞的肺转移能力的影响；***，P<0.001(n＝6)。

图8.2为小鼠肺部HE染色检测MFR缺失对胃癌细胞的肺转移能力的影响；***，P<0.001(n＝6)。

图8.3为接种ΔMFR的胃癌细胞对小鼠体重的影响；P<0.001(n＝6)。

图8.4为MFR缺失对肺转移裸鼠的生存的影响；使用对数秩检验计算P值，P<0.001(n＝8)，HR＝25.9(6.1,110.1)。

图9.1为靶向GMAN的MFR区段的CRISPR/Cas9治疗胃癌细胞肺转移的示意图；

图9.2为BLI实时监测靶向GMAN的MFR区段的CRISPR/Cas9治疗胃癌细胞肺转移的情况；

图9.3为CRISPR/Cas9递送系统相关的细胞毒性检测；

图10.1为TCGA数据库中分析GMAN在结直肠癌病人中的表达情况，A图为癌和癌旁配对的病例，B图为总体癌和癌旁的表达情况，C图为年龄，性别匹配的不具有转移的M0期结直肠癌组织与具有远端转移的M1期结直肠癌组织中分析GMAN的表达。***，P<0.001。

图10.2为TCGA数据库中分析GMAN在食管癌病人中的表达情况，A图为食管癌和癌旁配对的病例，B图为年龄，性别匹配的不具有转移的M0期食管癌组织与具有远端转移的M1期食管癌组织中分析GMAN的表达。*，P<0.05。

图10.3为TCGA数据库中分析GMAN在肝癌病人中的表达情况，A图为肝癌和癌旁配对的病例，B图为总体肝癌和癌旁的表达情况，***，P<0.001。

具体实施方式

本发明首次提出一种新的lncRNA GMAN，显著的促进胃癌细胞的侵袭和转移，并且具有治疗胃癌转移的重要潜能。具体内容如下：

1)3’Race和5’Race确认lncRNA GMAN的序列，Northern印迹显示在人的胃癌组织及细胞中可检测到GMAN的表达。

2)发现了在胃癌组织中表达上调的lncRNA GMAN，GMAN的高表达与肿瘤的侵润深度，淋巴转移，远端转移和胃癌病人的不良预后显著相关。

2)研究显示GMAN对胃癌细胞的细胞增殖，细胞周期，克隆形成和细胞粘附没有明显影响，但是GMAN能显著的促进胃癌细胞的体外侵袭和体内转移。

3)证明了GMAN的MFR(main function region)区段是GMAN发挥促进肿瘤侵袭和转移的主要作用的区域。

4)CRISPR/Cas9技术靶向GMAN的MFR区段，构建GMAN的MFR区缺失的胃癌细胞系。显示MFR区域缺失的细胞侵袭和转移能力受到显著的抑制。

5)体内治疗实验证明了，GMAN尤其是GMAN的MFR区段可作为治疗胃癌转移的重要靶点。

综上，lncRNA GMAN在胃癌中相对高表达，尤其是在产生远端转移的M1期胃癌病人的样本中显著高表达，而且GMAN的高表达与胃癌病人的不良预后显著相关。研究显示GMAN在胃癌的发生发展中发挥重要的作用，GMAN能显著促进胃癌细胞的侵袭和转移。进一步，GMAN的MFR区段对于GMAN发挥功能至关重要。通过CRISPR/Cas9的治疗实验表明，GMAN特别是GMAN的MFR区段能够有效的抑制胃癌的转移，可作为临床上控制肿瘤转移的一个新策略。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：lncRNA GMAN是一个855nt的lncRNA

为了检测GMAN的5’和3’的末端终序列，我们根据SMARTer^TMRACE cDNAAmplification Kit(购自美国Clontech)的使用说明进行实验。

1.按照Race说明书中设计引物的原则，设计Race的特异引物如下：

5'race for GMAN:5'-CAAGACTTCTATACCAT-3'

3'race for GMAN:5'-CAGGCTGGTCTCGAACTCCT-3'

2.提取人胃癌细胞系的RNA并对RNA进行加PolyA处理和纯化

细胞总RNA的分离提取利用TRIZOL试剂(购自美国Invitrogen)，并按照试剂说明书的标准操作进行。取适量的RNA利用DNase I试剂盒(购自美国Invitrogen)消化RNA中残留的基因组，去除基因组污染。

RNA加PolyA处理，利用PolyA试剂盒(购自美国NEB)。取适量RNA与polyA酶，buffer，RNase inhibitor混匀，37℃孵育。DNA凝胶电泳检测RNA的PloyA加尾情况。

用RNeasy Plus Mini Kit(购自美国QIAGEN)纯化RNA，备用。

3.RACE-Ready first-strand cDNA合成

3.1配制5’-and 3’-RACE-Ready cDNA合成的buffer mix

4.0μl	5X First-Strand Buffer
		0.5μl	DTT(100mM)
1.0μl	dNTPs(20mM)
		5.5μl	Total Volume

3.2取新的PCR管配制如下溶液

5’-RACE-Ready cDNA的配制

1ug	RNA
		1μl	5’-CDS Primer A
0-9μl	Sterile H2O
		11μl	Total Volume

3’-RACE-Ready cDNA的配制

1ug	RNA
		1.0μl	3’-CDS Primer A
0–10μl	Sterile H2O
		12μl	Total Volume

3.3步骤3.2中的PCR管在72℃孵育3分钟，42℃孵育2分钟，冰上冷却，14000g离心10秒使溶液都位于PCR管的底部。在5’-RACE-Ready cDNA的配制的PCR管中加入1μlSMARTer II A Oligonucleotide。

3.4步骤3.1中的buffer mix分别加入RNase inhibitor和转录酶，室温混匀。

3.5步骤3.4中的buffer mix分别加入到步骤4(3’-RACE cDNA)和步骤5(5’-RACEcDNA)中，使终体积为20ul。温和混匀，离心使溶液都位于PCR管的底部。42℃孵育90分钟，70℃孵育10分钟。用Tricine-EDTA Buffer稀释3’-和5’-RACE-Ready cDNA，-20℃保存备用。

4.cDNA末端快速扩增(Race)

4.1配制3’-和5’-RACE的PCR反应的mix

15.5μl	PCR-Grade H2O
		25.0μl	2X SeqAmp Buffer
1.0μl	SeqAmp DNA Polymerase
		41.5μl	Total Volume

4.2配制PCR反应，如下

4.3PCR反应

反应一：5cycles:94℃ 30sec；72℃ 3min*

反应二：5cycles:94℃ 30sec；70℃ 30sec；72℃ 3min*

反应三：20cycles:94℃ 30sec；68℃ 30sec；72℃ 3min*

5.分析Race产物

5.1Race产物凝胶电泳并纯化

Race的DNA产物进行凝胶电泳。切胶回收纯化的DNA备用。

5.2Race产物与克隆载体融合

配制融合体系并混匀，如下：

50℃孵育15分钟后置于冰上。从10ul的融合体系中取出2.5ul加入到StellarCompetent Cells中，温和混匀。加入SOC培养基孵育一段时间，把溶液均匀的涂在带有Amp+抗性的LB平板上，37℃孵育过夜，挑取LB平板上的克隆进行测序与分析。

实验结果

为了研究GMAN的功能，我们首先要确认在人体内是否存在GMAN这个分子以及GMAN的具体序列。通过3’Race和5’Race确认，在人的胃癌细胞系中存在GMAN，而且GMAN是位于染色体1q22位上的一个855nt的lncRNA。GMAN位于EphrinA1的基因簇中，GMAN的大部分是位于EphrinA1的内含子中(图1.1)。

实施例2：GMAN在人的胃组织和胃癌细胞系中表达

1.体外转录GMAN的特异性RNA探针(靶向MFR区域)

1.1通过NCBI的Blast工具，找到GMAN的一段特异序列，并设计引物，同时设计GAPDH的引物(购自上海生工)，如下：

利用PCR反应获得GMAN/GAPDH的一段特异序列，以人胃癌细胞系的cDNA为模板，用上述引物，进行PCR反应，获得目的基因(购自日本Toyobo)。取PCR管，加入cDNA模板2ul，KOD高保真酶1ul，10xPCR buffer 5ul，dNTP 5ul，Forward primer 1ul，reverse primer 1ul，加入ddH2O至50ul，混匀，按以下反应程序进行PCR反应：

95℃	2min
		95℃	30s
Tm-5℃	30s
		68℃	1min-2min(延伸1Kb/min)
68℃	10min

循环数：30cycle，PCR扩增产物于4℃保存备用

1.2载体PCS107和PCR产物的双酶切。

按照下表配制酶切反应体系(购自美国NEB)，37℃，酶切3h

DNA	1ug
		10×Buffer	5ul
Bam HⅠ	1ul
		XholⅠ	1ul
ddH2O	至50ul

1.3酶切产物回收纯化、连接、转化

1.4挑取单克隆菌落并培养、质粒小量提取与鉴定(购自美国Axygen)

1.5体外合成RNA探针

由于PCS107载体上含有SP6和T7的启动子，我们把GMAN/GAPDH的一段序列构建在两个启动子之间，通过单酶切的方式，可以选择通过SP6转录酶把GMAN/GAPDH的antisense链转录出来，或者通过T7转录酶转录GAMN/GAPDH的sense链。

把构建的PCS107-GMAN和PCS107-GAPDH的质粒用Xhol I进行单酶切，把线性化的PCS107载体作为模板。把转录所需的组分加到EP管中，混匀，37℃水浴孵育3h，具体组分如下：

模板	1ug
		SP6转录酶(购自瑞士Roche)	2ul
10*转录buffer	2ul
		RNA mix(dig标签，购自瑞士Roche)	2ul
RNase inhibitor(购自美国Invitrogen)	0.5ul
		DEPC	至20ul

转录后，加1ul DNase I，37℃，15min，去除模板DNA。用RNeasy Plus Mini Kit(购自美国QIAGEN)纯化RNA，测浓度并取一分部跑胶，确定转录的RNA只有单一的目的条带。把纯化的RNA分装并-80℃保存。

2.人的多种组织和人胃癌细胞系中GMAN的表达情况

2.1组织或者细胞总RNA的分离提取利用TRIZOL试剂(购自美国Invitrogen)，并按照试剂说明书的标准操作进行，并检测RNA的浓度。RNA中加入变形剂，混匀，70℃变性15min。RNA加入1.2％的变性琼脂糖凝胶孔中，1*MOPS buffer作为电泳缓冲液(购自美国Sigma)，100V预跑10min，45V电泳4-5h。利用盐桥进行硝酸纤维素膜的转膜，过夜。1500V的UV进行膜的cross link，并用亚甲基蓝染色。剪出目的条带位置的膜，用预杂交液(购自瑞士Rohce)，50℃孵育1h。加入含有Dig标签的RNA探针的杂交液，50℃孵育过夜(12h以上)。2*SSC溶液，60℃洗膜15min，重复两次。1*SSC溶液，50℃洗膜15min，重复两次。0.2*SSC溶液，50℃洗膜15min，重复两次。Northern wash buffer(购自美国Sigma)常温洗5min。Blockingbuffer(购自瑞士Roche)常温封闭30min。Anti-Dig-AP的抗体(购自瑞士Roche)常温孵育30min。Northern wash buffer常温洗15min，重复两次。Detection buffer孵育3min。用Dig-CDP star显色液(购自瑞士Roche)显色并曝光。

实验结果

GMAN是一个位于染色体1q22位的855nt的长链非编码RNA。我们进一步检测GAMN在人的组织以及人胃癌细胞系中的表达情况。Northern印迹显示，无论从RNA Marker的位置还是从GAPDH的相对位置都显示，GMAN的特异性RNA探针在鉴定的855nt位置能显示出一条比较特异的条带(图2.1)，验证了Race的结果。同时，我们利用TCGA(The Cancer GenomeAtlas)数据库中转录组的数据分析GMAN表达情况，GMAN在多种组织中均有表达(图2.2)。

实施例3：GMAN在胃癌组织中相对高表达并与胃癌病人的转移和不良预后显著相关

1.胃癌组织及其配对的正常组织的RNA反转录为cDNA

组织在极低温度下利用研钵研磨成粉末状，粉末状的组织的总RNA的分离提取利用TRIZOL试剂(购自美国Invitrogen)，并按照试剂说明书的标准操作进行。提取的RNA进行反转录PCR合成cDNA产物。

2.实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测GMAN在胃癌组织及其配对的正常组织中的表达情况

根据Taqman probe Kit的说明书(购自日本Takara)并配制PCR反应体系。使用BioRad公司CFX-Touch Systerem荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应。所有的反应都重复三次。根据仪器给出的荧光图得到ΔCt值，，从而计算相应表达水平的相对变化。引物如下：

Primer Names	Sequences(5'-3')
		GMAN Forward	CGGAGGAATGAAGGATGAAA
GMAN Reverse	CCTGCTTTCTCAGCTCCCTA
		GMAN probe	TGAACATTGGGCAGGAAGTTAGCAAAAAC

实验结果

通过实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)对111对胃癌组织与其配对的正常组织进行GMAN表达的分析，GMAN在76例(68.5％)胃癌肿瘤组织中相对上调表达(图3.1)。同时，我们也检测了GMAN的表达与111例胃癌患者的临床病理的相关性。结果显示，GMAN的相对高表达与严重的肿瘤侵袭深度(T阶段)，淋巴结转移(N阶段)，TNM阶段的进展具有明显相关性。此外，40例具有5年生存信息的胃癌患者进行Kaplan-Meier生存曲线分析，引人注目的是，GMAN的高表达与胃癌病人的不良预后显著相关(图3.2)。

进一步分析GMAN的转移的胃癌样本中的表达情况。通过分析cohort 3(n＝11)，cohort 4(n＝13)，TCGA数据库(n＝25)的转移的胃癌病人样本M1与年龄，性别匹配的未发生转移的胃癌病人样本M0中的表达情况，结果显示，GMAN在具有转移的M1样本中显著高表达(图3.3)。这些结果提示，GMAN可能在胃癌的转移过程中发挥重要的作用。

实施例4：敲低GMAN的表达能显著的抑制胃癌细胞的侵袭

1.细胞转染siRNA

通过siRNA设计软件，设计并合成两条特异靶向GMAN，沉默GMAN表达的siRNA(购自中国上海吉玛)。取对数生长期的细胞铺平板，待细胞密度达到50％左右，分别用OPTI培养基(购自美国Gibco)稀释Lipo RNAi MAX(购自美国Invitrogen)和siRNA，将稀释的siRNA加入Lipo RNAi MAX管中，混匀后静置5min，然后加至细胞培养液中，摇匀，24后更换培养基。

2.细胞增殖(MTT)与克隆形成实验

转染后的细胞用10％FBS(购自以色列BI)的1640培养基(购自美国Gibco)进行重悬，用血球计数板计数。对于MTT实验，在96孔板中每孔加入3000个细胞(100ul培养基)，每组五个复孔，共需铺4块板用于检测细胞在不同时间点的增殖情况(0h，24h，48h，72h)。在每个时间点，每孔加5mg/ml MTT(购自美国Sigma)在37℃培养箱孵育4h，用枪头小心吸取孔中溶液(注意不要碰到孔的底部)，加入150ul DMSO(购自中国国药)，混匀。在M5酶标仪上检测各时间点的OD490/OD570的吸收光值并分析。

克隆形成实验，在6孔板中每孔加入500个细胞(2mL培养基)，在37℃培养箱培养2周，弃去培养基，PBS温和洗两遍，4％PFA固定10min，0.1％结晶紫染色15min，PBS洗4-5遍，显微镜下进行观察并拍照分析。

3.细胞周期实验

1)转染48h后的细胞，弃去培养基，PBS洗两遍，用胰酶(购自美国Thermo Fisher)进行消化。PBS重悬细胞并转移至1.5mL EP管中，800g，4℃离心5min。弃去上清，保留细胞沉淀，用250μL PBS重悬细胞。将250μL细胞重悬液逐滴加入到750μL的95％乙醇(购自中国国药)，4℃固定2h。将固定后的细胞进行离心，800g，4℃离心5min。弃去上清，500μL PBS重悬细胞，800g，4℃离心5min。弃去上清，500μL PBS重悬细胞，将细胞悬液通过细胞筛过滤，在过滤后的细胞悬液中加入PI染料(购自美国Solarbio)和RNase A(购自美国ThermoFisher)，37℃水浴孵育30min。用流式细胞仪(美国Beckman)检测各处理组细胞的细胞周期分布。

4.细胞粘附实验

取96-well板进行预处理。Matrigel(购自美国BD)包被的细胞板，用预冷的无FBS的1640(购自美国Gibco)对matrigel进行1:40的稀释，每孔加入50μL进行包被；Fibronectin(购自美国BD)包被的细胞板，用预冷的无FBS的1640稀释fibronectin至0.02μg/μL，每孔加入50μL进行包被。将matrigel和fibronectin包被的96-well板放入37℃细胞培养箱中孵育24h。吸去未凝固的matrigel和fibronectin，每孔加入100μL，0.5％BSA(购自中国上海生工)(PBS溶)，37℃封闭30min。弃去BSA，PBS温和洗两遍，每孔加入100μL，2x104的1％FBS的1640培养基重悬的细胞，37℃培养箱培养30min。弃去上清，PBS温和洗两遍，每孔加100μL，4％PFA固定30min，弃去PFA(中国国药)，PBS温和洗两遍。每孔加100μL亚甲基蓝染色30min，弃去亚甲基蓝染色液，用PBS温和洗4-5次。配制裂解液(无水乙醇与0.1M HCl体积比1:1混合)，每孔加入150μL裂解液，混匀。并在无细胞的孔中加入150μL裂解液作为空白对照。在M5酶标仪上检测OD620的吸收光值并分析。

5.细胞侵袭实验

在8μm的Transwell(24-well，购自美国Corning)中预先铺上10倍稀释的基质胶(购自美国BD)和0.5％的明胶(购自中国上海生工)按照体积比1:1的混合胶50ul，37℃细胞培养箱孵育2h。转染后的细胞按照细胞传代的方式进行重悬(1％FBS的1640培养基重悬细胞)并用血球计数板进行细胞计数。在transwell的上层小室中每孔中加入200ul细胞悬液(细胞数目：5×10⁴)，在下室中加入700ul的10％FBS的1640培养基，放入培养箱中。待细胞迁移适当时间后，取出transwelll并用4％PFA固定10min。0.1％的结晶紫染色15min。PBS清洗掉多余的结晶紫，用棉签小心的擦去transwell小室上层膜的细胞，在显微镜下观察侵袭到transwell下层膜上的细胞并进行拍照和统计分析。

实验结果

临床病理分析提示，GMAN的表达与胃癌的发生发展密切相关。那么，GMAN在胃癌的进程中，特别是胃癌的转移过程中是如何发挥作用的？这个重要的问题引起了我们极大的兴趣。由于GMAN在胃癌组织中相对高表达，而且GMAN在大部分胃癌细胞系中也表达丰富。我们设计了两个特异靶向GMAN，沉默GMAN表达的siRNA。在胃癌细胞系BGC823中转染GMAN的siRNA，敲低GMAN的表达，并通过Northern印迹检测GMAN的敲低效率，结果显示与对照组的siRNA相比较，特异性靶向GMAN的siRNA下调GMAN的水平至对照组的30％左右(图4.1)。在胃癌细胞系BGC823上检测敲低GMAN对胃癌细胞系的影响。

由于肿瘤细胞的两个重要特征是能够无限增殖和容易转移。我们通过MTT实验和克隆形成实验检测GMAN对胃癌细胞的细胞增殖能力的影响，结果显示，GMAN的敲低对胃癌细胞的细胞增殖和克隆形成能力没有明显影响(图4.2)。进一步的细胞周期实验也显示，GMAN的下调几乎不影响胃癌细胞的细胞周期(图4.3)。通过细胞侵袭实验和细胞粘附实验检测GMAN对肿瘤转移方面的影响。细胞粘附实验显示，GMAN的敲低对胃癌细胞与细胞外基质的粘附能力没有明显影响(图4.4)。但是，GMAN的敲低能够显著的抑制胃癌细胞的细胞侵袭能力(图4.5)。提示，GMAN可能通过影响胃癌细胞的侵袭能力影响胃癌的发生与发展。

实施例5：过量表达GMAN能显著的促进胃癌细胞的侵袭

根据Race的结果获得GMAN的全长序列，设计GMAN的引物，通过PCR的方法获得GMAN的DNA产物，经过酶切，链接等步骤构建含有GMAN全长的pcDNA3.1过表达质粒。取对数生长期的细胞铺平板，待细胞密度达到80％左右，按照下表转染体系，分别用OPTI培养基稀释Lipo3000(购自美国Invitrogen)和质粒，将稀释的质粒加入Lipo3000管中，混匀后静置5min，然后加至细胞培养液中，摇匀，24后更换培养基。

实验结果

在GMAN含量相对丰富的BGC823细胞中敲低GMAN的表达能够显著的抑制胃癌细胞的侵袭能力。那么，过量表达GMAN对胃癌细胞又会有如何的影响？我们挑选了一株GMAN表达相对较少的细胞HGC27，检测在人胃癌细胞系HGC27细胞中过量表达GMAN对胃癌细胞的生物学功能的影响。Northern印迹检测GMAN的过表达效率，与作为对照的空载质粒相比，GMAN过量表达的效果是其表达的3-5倍(图5.1)。研究结果显示，在HGC27细胞中过量表达GMAN，对胃癌细胞的细胞增殖，克隆形成，细胞周期和细胞粘附(图5.2-5.4)没有明显影响，但是能显著的促进胃癌细胞的侵袭(图5.5)。这些数据与GMAN敲低的数据结果是一致的，显示GMAN调控胃癌细胞的侵袭。

实施例6：敲低GMAN能显著的抑制胃癌细胞的转移

1.慢病毒载体构建

根据shRNA设计原则，以GMAN RNA为靶序列，设计了一条针对GMAN的靶位点序列，合成相对应的正反向序列(购自中国上海生工)，这些序列接头设计退火后形成Bam HⅠ和EcoRⅠ的粘性末端。经过酶切，链接，鉴定，测序等步骤构建GMAN的shRNA慢病毒表达载体。靶点序列分别为：

GMAN sense：

5’-GATCCGGCTTATCTTGCAGCCAAATTCAAGAGATTTGGCTGCAAGATAAGCCTTTTTTG-3’

GMAN antisense：

5’-AATTCAAAAAAGGCTTATCTTGCAGCCAAATCTCTTGAATTTGGCTGCAAGATAAGCCG-3'

2.慢病毒包装

将HEK293T细胞铺入T25瓶中，待细胞密度达到80-90％时，进行转染。取15μLLippo3000混入250ul OPTI中(具体转染方法详见质粒转染步骤)。收集48h，72h的细胞培液，过滤分装后，浓缩，测滴度，-80℃冰箱中保存。

3.筛选GMAN敲低的稳定细胞系

取对数生长期的细胞铺平板，待细胞密度达到80％左右，换成新鲜的10％FBS的1640培养基。加入适量的病毒原液，并加入5ug/mL的Polybrene促进病毒的感染效率，后续可通过荧光显微镜观察细胞带有GFP的效率说明慢病毒的感染效率。同时，通过向细胞施加puromycin药物，筛选慢病毒表达的细胞，QRT-PCR检测GMAN的敲低效果。

4.裸鼠肺转移实验

10⁶的带有GFP标记的慢病毒稳定转染的胃癌细胞尾静脉注射到裸鼠的体内，每周观察小鼠的状态及体重变化，5-6周后，解剖观察肺转移情况。将肺组织固定、石蜡包埋、切片，后续进行苏木精伊红染色，或者ephrin A1抗体染色。

实验结果

GMAN能显著的促进胃癌细胞的侵袭。GMAN的表达与临床病理相关性的分析也显示，GMAN的高表达与胃癌病人的肿瘤侵袭深度(T阶段)，淋巴结转移(N阶段)，TNM阶段的进展具有明显相关性。而且与年龄，性别匹配的M0期胃癌组织相比较，GMAN在具有转移的M1期胃癌组织中显著高表达。这些数据都提示，GMAN可能在胃癌的转移中发挥重要的作用。我们构建GMAN敲低的稳定细胞系做裸鼠的肺转移实验。把对照组和GMAN敲低的稳定细胞系尾静脉注射裸鼠，建立肺转移模型。由于细胞带有GFP，我们利用小鼠成像仪检测裸鼠肺部的GFP信号来体现胃癌细胞的转移情况，显示GMAN敲低组的裸鼠GFP信号明显减弱，提示GMAN敲低组的胃癌细胞的肺转移能力受到抑制。无论是HE染色还是肉眼观察裸鼠肺部的转移灶，都显示GMAN敲低组的胃癌细胞产生的转移灶数目和转移灶大小都显著减弱(图6.1)。GMAN敲低能显著的抑制胃癌细胞的体外侵袭和体内肺转移能力，这与GMAN的临床病理相关性分析一致。

实施例7：GMAN主要通过MFR区段发挥抑制胃癌细胞侵袭的功能

1.靶向GMAN的CRISPR/Cas9基因编辑

CRISPR/Cas9基因编辑靶向蛋白编码基因，可通过改变编码基因的几个碱基引起移码突变等效应，敲除编码的蛋白的表达。与用于敲除蛋白表达的方法不同，对于长链非编码RNA的敲除，仅仅改变几个碱基很可能不能改变lncRNA的功能，需大片段的截短，改变RNA的二级结构或破坏主要作用区域，才能敲除lncRNA的表达。

设计并合成两个特异性靶向GMAN的sgRNA，构建CRISPR/Cas9-GMAN sgRNA的载体。序列如下：

GMAN sgRNA 1

GMAN-1-sense：5’-CACCGGAGTAGTATTAAGTGGCCC-3’

GMAN-1-antisense：5’-AAACGGGCCACTTAATACTACTCC-3’

GMAN sgRNA 2

GMAN-2-sense：5’-CACCGTTTCTTATTTAACCCCTGT-3’

GAMN-2-antisense：5’-AAACACAGGGGTTAAATAAGAAAC-3’

按照质粒转染的方法，把两个带有GMAN sgRNA的CRISPR/Cas9载体共转染人胃癌细胞系，通过单克隆筛选，并且利用基因组PCR及测序、cDNA的PCR及测序等方法验证鉴定出敲除GMAN的MFR区段的突变细胞株。另一方面，为避免CRISPR/Cas9产生的脱靶效益，我们除了设计序列特异的sgRNA，同时根据sgRNA预测的潜在脱靶位点，进行PCR及测序验证，保证没有出现脱靶。

实验结果

以上的研究显示GMAN能显著的促进胃癌细胞的侵袭和转移。我们想进一步探索GMAN主要发挥作用的区域。在NCBI的Blast工具中分析GMAN的全长序列的特征显示，GMAN的5’端约400nt的序列是非特异的，许多其他的基因或者lncRNA的部分序列是与这段约400nt的核苷酸是类似的。GMAN的3’端不到100nt的序列是与EphrinA1的Exon3和部分Exon4是相同的。但是GMAN的中间段(暂称为MFR)的约300nt的序列是GMAN特异的序列，可以说GMAN的MFR区段是GMAN特有的序列，提示GMAN是不是通过这段特异的序列发挥功能。于是，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计两个靶向GMAN的特异的sgRNA，通过单克隆筛选，测序鉴定以及脱靶效应鉴定，成功建立敲除GMAN的MFR区段的胃癌细胞突变株(ΔMFR)(图7.1)。检测ΔMFR的胃癌细胞突变株的细胞生物学功能发现，与正常的野生型胃癌细胞相比较，GMAN的MFR区段缺失的胃癌突变株的细胞增殖，克隆形成，细胞周期和细胞粘附(图7.2-7.4)几乎不受影响。但是GMAN的MFR区段缺失的胃癌细胞突变株的细胞侵袭能力明显受到抑制(图7.5)。这些数据显示GMAN的MFR区段缺失的细胞生物学功能与GMAN敲低引起的细胞生物学功能的变化是高度一致的，显示GMAN的MFR区段是GMAN主要发挥作用的区域。同时，也说明我们利用CRISPR/Cas9技术建立的细胞株是成功敲除GMAN的突变株。

实施例8：MFR缺失能显著的抑制胃癌细胞的转移

产生胃癌细胞肺转移的裸鼠的预后分析：把野生型的胃癌细胞和ΔMFR的胃癌细胞突变株通过尾静脉注射建立裸鼠的肺转移模型。实时观测裸鼠的生活状态并记录两组裸鼠的存活时间，精确到天数。利用Kaplan-Meier生存曲线分析，绘制野生型胃癌细胞产生肺转移的裸鼠和ΔMFR的胃癌突变株产生肺转移的裸鼠的生存曲线。

实验结果

研究显示GMAN主要通过MFR区段发挥促进胃癌细胞侵袭和转移的功能。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向GMAN的MFR区段，获得GMAN的主要作用区域MFR区段的大片段缺失的GMAN突变的胃癌细胞株。由于GMAN的敲低能显著的抑制胃癌细胞的侵袭和转移。那么，GMAN突变是不是会有类似的功能呢？我们把构建的ΔMFR的胃癌细胞突变株通过尾静脉注射建立裸鼠的肺转移模型，研究MFR缺失对胃癌细胞转移的影响。裸鼠接种胃癌细胞5周后，评估裸鼠的肺转移情况。通过裸鼠解剖取肺观察显示，对照组野生型的胃癌细胞发展严重肺转移，肺的体积显著增大，肺的重量也明显增重，肺部含有大量的肿瘤细胞，形成实质的瘤块，几乎观察不到完整的肺泡结构；而ΔMFR组裸鼠的肺部几乎与正常的小鼠的肺部一样，呈现白色并具有相对完整的肺部结构(图8.1)。进一步的肺部HE染色也显示，对照组的肺部产生许多大的转移灶，但是ΔMFR组的肺部只观察到少许的微转移灶(图8.2)。同时，接种胃癌细胞的裸鼠，我们每周观察裸鼠的生长状态，并测量裸鼠的体重显示，对ΔMFR组的小鼠相比，对照组的裸鼠由于产生严重的肺转移，进而危害小鼠的健康状态，生活状态每况愈下，使小鼠在转移的后期体重明显下降(图8.3)。研究显示，UC-Mut胃癌细胞能显著降低胃癌的肺转移能力。另外，我们也做一组独立平行实验，检测GMAN对肺转移的裸鼠的生存的影响。把野生型胃癌细胞和ΔMFR的胃癌细胞尾静脉注射裸鼠后，实时观察裸鼠的生存状况，并记录每只老鼠的生存寿命。结果显示，对照组裸鼠在接种后35天开始出现死亡，到43天对照组的8只裸鼠全部死亡。但是我们观察到，ΔMFR组的裸鼠在接种后的60天内没有出现死亡。提示，与用对照组的小鼠相比，注射ΔMFR细胞的小鼠显示出优异的生活质量和更长的总存活率(图8.4)。这些分析表明，MFR缺失能够显著抑制胃癌细胞的肺转移。

实施例9：GMAN的MFR区段具有治疗胃癌转移的潜能

体内治疗实验：对于靶向GMAN的CRISPR/Cas9治疗测定，将10⁶个荧光素酶标记的SGC7901细胞(S胃癌-Luc)尾静脉注射到SCID小鼠(10只小鼠)中。接种后一天，将动物随机分配到两组，进行4周治疗。实验组尾静脉注射包裹有靶向GMAN的CRISPR/Cas9(CRISPR-GMAN)载体(每只小鼠2.5μg)的脂质体递送缓冲液(成分：用于体内的脂质体与10％葡萄糖溶液按照质量比为1:14混匀)，对照组为不含GMAN的CRISPR/Cas9载体的脂质体递送缓冲液，每周注射两次。每周通过BLI使用Xenogen IVIS 200成像系统监测SCID老鼠活体中胃癌细胞的luciferase信号，观察胃癌细胞的肺转移情况，并进行统计分析。

同时，为了排除CRISPR-GMAN递送系统相关的细胞毒性抑制SGC-Luc胃癌肺转移的可能性，我们使用体内剂量以及高于体内剂量5倍的药物处理胃癌细胞系，评估CRISPR-GMAN治疗对SGC-Luc细胞活力的影响。

实验结果

GMAN的MFR区段缺失的胃癌细胞能显著的抑制胃癌细胞的转移，而且CRISPR/Cas9是具有广泛治疗潜力的多功能基因组编辑工具。GMAN的MFR区段对GMAN的功能发挥起到至关重要的作用，GMAN的MFR区段位于基因组的内含子区域，是GMAN的特有序列，所以我们合理的设想GMAN的MFR区段可作为重要的抗转移效应的内含子靶位点，利用CRISPR/Cas9介导的治疗方法靶向GMAN的MFR区段可能是一种有前景的抗胃癌策略。

为了检测GMAN的MFR区段的抗肿瘤治疗的效应，我们合理的设计了靶向GMAN的MFR区段的体内抗肿瘤转移的治疗实验并绘制了治疗实验的示意图(图9.1)。我们将荧光素酶标记的SGC7901胃癌细胞(S胃癌-Luc)尾静脉内注射到SCID小鼠中。接种后一天，将动物随机分配到两组，进行4周的治疗。实验组尾静脉注射包裹有靶向GMAN的CRISPR/Cas9(CRISPR-GMAN)载体的脂质体递送缓冲液，对照组为不含GMAN的CRISPR/Cas9载体的脂质体递送缓冲液，每周进行两次注射。利用BLI以监测肺转移并评估CRISPR/Cas9递送的治疗功效。SGC-Luc细胞在对照递送缓冲液处理的动物中产生严重的肺转移，但CRISPR/Cas9靶向GMAN的MFR区段处理的药物递送后一周内显著阻断SGC-Luc细胞转移到肺中。CRISPR/Cas9靶向GMAN的MFR区段处理的药物连续的，每周两次的治疗增强了对SGC-Luc肺转移性生长的抑制作用。最终的组织学分析证实，与对照递送治疗的动物相比，在CRISPR/Cas9靶向GMAN的MFR区段递送治疗的动物的肺转移情况受到显著的抑制，转移性肺损伤显著减少(图9.2)。

同时，为了排除CRISPR/Cas9递送系统相关的细胞毒性抑制SGC-Luc胃癌肺转移的可能性，我们使用体内剂量以及高于体内剂量5倍的药物评价了CRISPR/Cas9治疗对SGC-Luc细胞活力的影响。靶向GMAN的MFR区段的CRISPR/Cas9递送缓冲液和对照递送缓冲液处理都不影响体外培养细胞的细胞活力。这表明靶向GMAN的MFR区段的CRISPR/Cas9处理对SGC-Luc肺转移的体内抑制作用不是由于非特异性细胞毒性导致的。

体内治疗实验的数据显示，靶向GMAN的MFR区段能够有效的治疗胃癌的转移，MFR区段具有潜在的价值。由于GMAN的MFR区段是基因组上的一小段内含子序列，而且MFR区段是一段在人体内相对特异的核苷酸序列。GMAN的MFR区段的序列特征使我们设计靶向MFR区段的药物既不会影响到其他基因或者RNA的表达又极大的降低了出现药物脱靶的可能。这些特征为我们合理的利用基因编辑技术或者合成靶向MFR区段的稳定核酸小分子药物提供了极大的便利和可能。因此，基于我们的治疗实验的效果以及GMAN的MFR区段的序列特征显示，GMAN的MFR区段具有重要的治疗胃癌转移的潜能。

实施例10：GMAN在其他消化系统肿瘤组织中相对高表达并与癌症病人的转移显著相关

分析TCGA公共癌症数据库，发现GMAN在多种肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤转移显著相关，其在转移性肿瘤患者(M1)中显著高于未转移的肿瘤患者(M0)。实施例显示的是GMAN在结直肠癌(图10.1)、食管癌(图10.2)和肝癌(图10.3)中的高表达情况。

序列表

<120> 一种肿瘤相关序列、长链非编码RNA及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 293

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

<210> 2

<211> 855

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ctaggcagga gtagtttttg tttttttgtt ttttttctga gacagagtct cgctctgtcg 60

cccagactgg agtgcagtgg cacgatctcg acttgctgca acctccacct cccgggttca 120

attgattctt ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta caggcatgtg ccaccatgcc 180

cggctaattt ttgtattttt agtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc 240

gaactcctga cctcgtgatc cgcccacctc ggcctctcaa agtgctggga ttacatgtgt 300

gagccaccgc gcctggccta ggagtagtat taagtggccc aggcaagagg aacatattca 360

gactcggagg aatgaaggat gaaatgtggg gaggggcagt gtctatgctg agggttattt 420

ccaaagaatg agaggctggg ctgaacattg ggcaggaagt tagcaaaaac taaggagggt 480

aggaatcaag gttagaggga agagaagaat gaaatggagt agggagctga gaaagcaggg 540

cgaggggcat ttggacttac attttcttcc agcaaaggtt tcttatttaa cccctgtggg 600

cttatcttgc agccaaaccc atccaccagc atgaagaccg ctgcttgagg ttgaaggtga 660

ctgtcagtgg caaaatcagt gagtgtcaga gccctgtggg cctccttcct ccatctctat 720

gctgggtgcg gtctagtgat ctaggatggt atagaagtct tgcagcccag cccactcata 780

cttacagccc tctgcctctt tgatacagta cctgatctac taccactctt gtctttcagc 840

tcacagtcct caggc 855

Claims (1)

1.一种肿瘤相关长链非编码RNA，其特征在于，为SEQ ID NO.2所示的GMAN。

Images