CN108342390A - 用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码rna及制备、用途 - Google Patents

用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码rna及制备、用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA及制备、用途，长链非编码RNA的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，首次克隆了精确的lncRNA MYU的全长基因序列，为研究其在前列腺癌发生发展过程中的功能奠定了基础，通过分析得到长链非编码RNA在前列腺癌中高表达，在正常组织中表达相对较低，且长链非编码RNA的表达同前列腺癌的恶化显著相关，因此本发明还公开长链非编码RNA在制备诊断或治疗前列腺癌的产品中应用，如长链非编码RNA的RNAi靶位点的短发夹片段和转录短发夹RNA的重组质粒在前列腺癌细胞中表达能明显降解细胞内源性长链非编码RNA并抑制前列腺癌细胞的恶性生长和迁移。

Description

用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA及制备、用途
技术领域
本发明属于人前列腺癌的分子诊断领域，具体涉及一种用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA及制备、用途。
背景技术
前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一种发生在前列腺的非上皮性恶性肿瘤，严重危害男性健康。世界范围内，前列腺癌在男性恶性肿瘤中的发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二。在欧美等发达国家地区，前列腺癌的发病率较高，而在贫困或者部分农村地区的前列腺癌患者的生存率较低。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。目前，在我国男性的重要健康难题中，前列腺癌的严重程度正在逐步上升，现已成为我国男性第五大常见癌症。
前列腺癌目前最常用的临床诊断指标为血清前列腺特异性抗原(ProstateSpecific Antigen，PSA)。PSA为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。所以PSA并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。因此，需要一种新的前列腺癌标志物来弥补PSA的上述缺陷。
最近，随着基因相关技术的发展，长链非编码RNA(lncRNA)逐渐应用于诊断肿瘤的标志物。由于lncRNA在基因的转录，转录后以及基因调控的表观遗传学上都有着不同的功能，因此lncRNA在肿瘤的发生与发展中扮演了重要的角色。在前列腺癌中，已经有越来越多的lncRNA的异常表达被检测出。由于lncRNA独特的性质，带来了无创而高效的检测前列腺癌的方法。相比PSA，一些lncRNA已经被证实了在某些情况下具备对前列腺癌更强的诊断效能。而随着认识的逐渐加深与技术的持续发展，lncRNA有可能在未来成为替代PSA的检测前列腺癌的更好的标志物。
目前，PCA3是唯一被FDA批准的可临床上用于诊断前列腺癌的lncRNA，而其他更多的lncRNA则还处于基础研究中。PCA3与PSA相比，PCA3有更好的诊断效力(AUC：0.68for PCAscore of 35VS 0.52for PSA≥2.0ng/ml,p＝0.008)(Haese A,De La Taille A,VanPoppel H,et al.Clinical utility ofthe PCA3urine assay in European menscheduled for repeatbiopsy[J].Eur Urol,2008,54(5):1081-1088)。在亚洲人群里，PCA3同样有着很好的诊断表现，一项在经过前列腺穿刺的日本人群里进行的PCA3试验的临床研究显示，当PCA3高于35时，该试验的敏感性与特异性分别达到66.5％与71.6％，其诊断效能也高于处于灰区时(PSA4-10ng/ml)的PSA游离比(f/t)(0.742VS 0.647，p<0.05)。虽然PCA3具有上述优异的表现，有着更可观的诊断准确度，它仍有不完善的地方：PCA3与局部进展期前列腺癌的相关性不高，因此在检测侵袭性肿瘤时效果不理想，最后，与PSA一样没有cut-off值。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中的用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA前列腺癌的相关性不高，诊断准确度低，进而提供一种用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA及制备、用途，如基于所述长链非编码RNA的RNA干扰靶位点、RNAi的短发夹片段，以及shRNA重组质粒可用于人前列腺癌的相关治疗。
本发明提供了一种长链非编码RNA，其选自如下(a)-(b)中所示的核酸分子中的至少一种：
(a)其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子；
(b)为与(a)中的如SEQ ID NO：1所示的核酸分子具有85％及以上同源性的核酸分子。
本发明提供了一种所述的长链非编码RNA在制备前列腺癌、前列腺癌预后复发或前列腺癌临床分期的分子标志物中的用途。
本发明提供了一种分子标志物，包括所述的长链非编码RNA。
本发明提供了一种可特异性识别所述的长链非编码RNA的引物组，所述引物组包括如下引物：
GSP1,其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
GSP2,其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；
P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
本发明提供了一种制备所述的长链非编码RNA或所述的分子标志物的方法，包括如下步骤：
1、提取前列腺癌细胞总RNA并反转录为cDNA；
2、以步骤1中的cDNA为模板，根据预测序列设计引物并进行PCR扩增，将所述扩增的片段克隆至载体上，然后进行测序验证所述序列的正确性，若测序正确，则所得片段即为所述的长链非编码RNA，若测序不正确，则进行下述步骤3-5；
3、以步骤1中的cDNA为模板，利用引物组中的引物P3和引物P4，进行PCR反应，沿序列的5’端延伸扩增，测序；以步骤1中的cDNA为模板，利用引物组中的引物P5和引物P6，进行PCR反应，沿序列的3’端延伸扩增，测序；将上述获得的序列进行拼接得到目的基因序列；
4、利用引物组中的GSP1和GSP2，分别与SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit中的引物扩增出所述的长链非编码RNA的5’末端序列和3’末端序列；
5、将上述步骤4得到的3’末端片段和5’末端片段以及步骤3中的目的基因序列拼接得到所述长链非编码RNA的全长cDNA序列。
本发明提供了一种用于检测所述的长链非编码RNA或所述的分子标志物的特异性引物。优选的，所述的特异性引物如下：
MYU-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
MYU-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明提供了一种用于人前列腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，包括使用所述的特异性引物。优选的，所述反应体系如下：Premix Ex Taq(Tli NaseH Plus)(2×)，10μL；所述的上游引物MYU-F，10μM,0.4μL；所述的下游引物MYU-R，10μM,0.4μL；ROXReference Dye II，0.4μL；模板，2μL；dH2O，6.8μL。
本发明提供了一种用于检测所述的长链非编码RNA或所述的分子标志物的特异性探针。
本发明提供了一种芯片，包括所述的特异性探针。
本发明提供了一种所述的长链非编码RNA或所述的分子标志物的RNAi靶位点的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或SEQ ID NO：7所示。
本发明提供了一种所述的长链非编码RNA或所述的分子标志物的shRNA或LNA序列；优选的，所述shRNA序列选自shRNA1或shRNA2，所述shRNA1如SEQ ID NO：8所示，所述shRNA2如SEQ ID NO：9所示。
本发明提供了一种载体，包括所述的长链非编码RNA、所述的分子标志物或所述的shRNA或LNA序列。
所述的长链非编码RNA、所述的分子标志物、所述的特异性引物、所述的qRT-PCR反应体系、所述的特异性探针、所述的芯片、所述的RNAi靶位点的核苷酸序列、所述的shRNA或LNA序列或所述的载体在制备用于早期诊断、检测、缓解或治疗前列腺癌或前列腺癌预后复发的芯片、药物或试剂盒中的用途。
本发明提供了一种芯片、药物或试剂盒，包括所述的长链非编码RNA、所述的分子标志物、所述的特异性引物、所述的qRT-PCR反应体系、所述的特异性探针、所述的芯片、所述的RNAi靶位点的核苷酸序列、所述的shRNA或LNA序列或所述的载体。
本发明相对现有技术具有如下优点：
(1)本发明所述的一种长链非编码RNA，选自如下核酸分子中的任意一种：(a)其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子；(b)为与(a)中的如SEQ ID NO：1所示的核酸分子具有85％及以上同源性的核酸分子；首次克隆了精确的lncRNA MYU的全长基因序列，为进一步研究lncRNA MYU在前列腺癌发生发展过程中的功能奠定了基础，通过分析得到所述长链非编码RNA在前列腺癌中高表达，在正常组织中表达相对较低，说明所述前列腺癌的长链非编码RNA与前列腺癌的相关性高，可以提高诊断前列腺癌的准确度，另外所述长链非编码RNA具有更多的RNA干扰靶点，进而能够为针对lncRNA MYU的抗前列腺癌药物研发提供更多的功能靶点，显著提高其基因治疗效果。
(2)本发明所述的一种可特异性识别所述的长链非编码RNA的引物组，通过设计上述的引物组可以制备得到精确的lncRNA MYU的全长基因序列。
(3)本发明所述的一种制备所述的长链非编码RNA的全长cDNA序列的方法，通过所述方法可以制备得到精确的lncRNA MYU的全长基因序列，且所述制备方法步骤简单，易操作，时间短，效率高。
(4)本发明所述的一种特异性引物，所述特异性引物用于检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平；所述特异性引物包括上游引物MYU-F和下游引物MYU-R，所述上游引物MYU-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物MYU-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；通过设计上述特异性引物，基于qRT-PCR技术，可以检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平，进而可以对于人前列腺癌进行早期诊断。
(5)本发明所述的一种用于人前列腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，利用所述qRT-PCR反应体系，基于qRT-PCR技术，可以检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平，进而可以对于人前列腺癌进行早期诊断。
(6)本发明所述的的长链非编码RNA的RNAi靶位点的核苷酸序列，和对应的RNAi的短发夹片段，能够有效抑制该基因的表达，所述RNAi靶序列、RNAi短发夹片段可用于制备抗前列腺癌的药物，也可采用基因治疗的方法，如以RNAi短发夹片段构建的shRNA质粒具有较好的稳定性，以shRNA质粒为表达载体，使其在癌变部位高表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中5’RACE的测序检测结果；
图2为本发明实施例1中5’RACE的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道从左到右依次为lncRNA MYU的5’末端片段和DNA分子标记；
图3为本发明实施例1中3’RACE的测序检测结果；
图4为本发明实施例1中3’RACE的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道从左到右依次为lncRNA MYU的3’末端片段和DNA分子标记；
图5为本发明实施例2中所述长链非编码RNA的保守性和转录活性分析结果；
图6为本发明实施例2中所述长链非编码RNA的编码能力计算值；
图7为本发明实施例3中所述长链非编码RNA在不同前列腺细胞株中的相对表达量，柱形图从左向右依次代表前列腺癌细胞株22Rv1、DU145、LNCaP、PC3；
图8为本发明实施例3中所述长链非编码RNA在前列腺癌细胞系LNCaP的核质分离比；
图9为本发明实施例3中所述长链非编码RNA在前列腺癌细胞系LNCaP的细胞核相对细胞质中的表达量百分比；
图10为本发明实施例4中所述长链非编码RNA在多种癌症及对应癌旁组织中的不同表达量图；
图11为本发明实施例4中所述长链非编码RNA在正常前列腺组织与前列腺癌组织中的不同表达量；
图12为本发明实施例4中所述长链非编码RNA在正常前列腺组织与前列腺癌组织中不同表达量的ROC曲线；
图13为本发明实施例6中所述长链非编码RNA的shRNA1和shRNA2在DU145细胞株中的干扰效率；柱形图从左向右依次代表转染乱序RNA的DU145阴性对照品、转染shRNA1的DU145敲减样品和转染shRNA2的DU145敲减样品；
图14为本发明实施例6中显示分别使用shRNA1和shRNA2敲减所述长链非编码RNA的DU145细胞生长曲线，曲线从上到下依次代表转染乱序RNA的DU145阴性对照品、转染shRNA1的DU145敲减样品和转染shRNA2的DU145敲减样品；
图15为本发明实施例6中分别使用shRNA1和shRNA2敲减所述长链非编码RNA的DU145细胞克隆形成结果，其中左图示培养皿从左向右依次代表转染乱序RNA的DU145阴性对照品、转染shRNA1的DU145敲减样品和转染shRNA2的DU145敲减样品；
图16为本发明实施例6中分别使用shRNA1和shRNA2敲减所述长链非编码RNA的DU145细胞克隆形成结果的量化图；
图17为本发明实施例6中分别使用shRNA1和shRNA2敲减所述长链非编码RNA的DU145细胞迁移能力结果图；
图18为本发明实施例6中分别使用shRNA1和shRNA2敲减所述长链非编码RNA的DU145细胞迁移能力结果的量化图；
图19为本发明实施例6中分别使用shRNA1和shRNA2敲减所述长链非编码RNA的DU145细胞中的蛋白印迹图；
图20为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞株的过表达效率，柱形图从左向右依次代表转染pLVX-neo的阴性对照细胞株和转染pLVX-neo-MYU的过表达细胞株；
图21为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞生长曲线，曲线由上到下依次代表转染pLVX-IRES-Neo的阴性对照细胞株和转染pLVX-Neo-MYU的过表达细胞株；
图22为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞克隆形成结果，其中左图示培养皿从左向右依次代表转染pLVX-neo的阴性对照细胞株和转染pLVX-Neo-MYU的过表达细胞株；
图23为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞克隆形成结果的量化图。
图24为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞迁移能力结果图；
图25为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞迁移能力结果的量化图；
图26为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的PC3细胞中的蛋白印迹图。
图27为本发明实施例8中miR-184在正常组织以及Pca组织中的表达量；
图28为本发明实施例8中miR-184与lncRNA MYU在216个TCGA PCa组织中的相关分析结果；
图29为本发明实施例8中假定的lncRNA MYU与miR-184碱基配对由目标预测算法RNA分子杂交鉴定；
图30为本发明实施例8中假定的c-Myc的3’UTR与miR-184碱基配对由目标预测算法RNA分子杂交的鉴定；
图31为本发明实施例8中荧光素酶报告基因在Lenti-XTM293T细胞中表达的荧光素酶的相对活性，其中Lenti-XTM293T细胞共转染miR-184和双重荧光素酶基因，所述双重荧光素酶基因包括空载体、lncRNA MYU、lncRNA MYU突变掉miR-184结合位点的序列和包含miR-184结合位点的c-Myc 3’非翻译区(3’UTR)序列；
图32为本发明实施例8中lncRNA MYU和c-Myc的表达在216个TCGA PCa组织中的相关分析结果；
图33为本发明实施例8中在细胞中lncRNA MYU基因敲减或过表达时c-Myc的表达水平结果；
图34为本发明实施例8中c-Myc基因敲减后限制了在PCa细胞中lncRNA MY过表达的活性结果；
图35为图34中c-Myc基因的蛋白印迹表达结果；
图36为本发明实施例8中miR-184mimic过表达抑制lncRNA MY过表达的PC3细胞的活性结果；
图37为图36中c-Myc基因的蛋白印迹表达结果；
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，所有引物合成以及测序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。如T-vector购自promega，pSIH-H1购自addegene，Lenti-XTM293T购自Takara，PMD2G购自addegene，PSPAX2购自addgene，opti-MEM购自gibco；下述实施例中所有涉及的细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
实施例1RACE法获得lncRNA MYU的精准全长cDNA序列
本实施例提供了lncRNA MYU精准全长cDNA序列的获得方法，所述lncRNA MYU精准全长cDNA序列即为本发明所述的长链非编码RNA，具体包括以下步骤：
1、采用提取试剂RNAiso Plus reagent(Takara)利用Trizol提取法提取前列腺癌细胞系DU145的总RNA，并用Thermo Fisher的PrimerScript RT-PCR kit(Takara)的反转录试剂盒以oligo dT为反转录引物，将总RNA反转录为cDNA。
2、以步骤1中的cDNA为模板，根据预测序列(所述预测序列为Mitranscriptome数据库中的已知序列Assembly Gene ID：G032453)设计引物5’-F和3’-R，所述引物5’-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述引物3’-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，用引物5’-F和3’-R来进行PCR扩增，获得lncRNA MYU的全长，连接T-vector，通过测序验证序列的正确性(与预测序列比对)，若是测序正确，则该序列即为lncRNA MYU的精准全长cDNA序列，若是测序不正确，则进行下述步骤，结果发现序列不准确，于是进行下述的步骤。
3、以步骤1中的cDNA为模板，根据所述预测序列设计引物P1，P2，所述引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，先进行PCR扩增，所述PCR反应体系为：Fast Taq polymerase，0.5μl；10×Fast Taq buffer 2μl；引物P1，10μM，2μl；引物P2，10μM，2μl；dNTPs，2.5mM，2μl；cDNA模板，1μl；dH2O，10.5μl；扩增程序：95℃保持5min，95℃保持30s，60℃保持30s，72℃保持1min，72℃保持10min，扩增反应后进行测序，再根据测序得到的序列设计引物P4和P5，同时根据所述预测的序列设计P3和P6，所述引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，所述引物P5的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述引物P6的核苷酸序列如SEQ IDNO：17所示。利用引物P3和P4继续往5’端扩增，即，所述PCR反应体系为：Fast Taqpolymerase，0.5μl；10×Fast Taq buffer 2μl；引物P3，10μM，2μl；引物P4，10μM，2μl；dNTPs，2.5mM，2μl；步骤1中的cDNA为模板，1μl；dH2O，10.5μl；扩增程序：95℃保持5min，95℃保持30s，60℃保持30s，72℃保持1min，72℃保持10min，扩增反应后进行测序；利用引物P5和P6继续往3’端扩增，即，所述PCR反应体系为：Fast Taq polymerase，0.5μl；10×FastTaq buffer 2μl；引物P5，10μM，2μl；引物P6，10μM，2μl；dNTPs，2.5mM，2μl；步骤1中的cDNA为模板，1μl；dH2O，10.5μl；扩增程序：95℃保持5min，95℃保持30s，60℃保持30s，72℃保持1min，72℃保持10min，扩增反应后进行测序；然后通过将上述利用引物P3和P4扩增后的测序序列和利用引物P5和P6扩增的测序序列拼接得到了目的基因的序列；
4、在用P1和P2扩增出来的片段(步骤3中利用引物P1、P2扩增后的进行测序的序列)来设计基因特异性引物(gene specific primer,GSP)GSP1和GSP2，所述引物GSP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物GSP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，再分别与SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit中的引物扩增出5’端序列和3’端序列：
1)用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒中的5'-RACE CDS Primer为反转录引物，将步骤1提取的总RNA反转录为cDNA，获得lncRNA MYU的5’末端的cDNA；所述5'-RACE CDS Primer：5'–(T)25V N–3'，(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)；
2)、以步骤1)中的cDNA为模板，用10X Universal Primer A Mix和GSP1为引物扩增lncRNA MYU的5’末端片段，5’末端片段琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；5’末端片段连接T-vector，通过测序获得lncRNA MYU的5’端序列，5’端序列测序结果如图1；10X UniversalPrimer A Mix为：Long(0.4μM):5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCA GAGT–3'；Short(2μM):5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'；
3)用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒中的3'-RACE CDS Primer为反转录引物，将步骤1提取的总RNA反转录为cDNA，获得lncRNA MYU的3’末端cDNA；所述3'-RACE CDS Primer：5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'，(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)；
4)以步骤3)中的cDNA为模板，用所述10X Universal Primer A Mix和引物GSP2扩增lncRNA MYU的3’末端片段，所述3’末端片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示；所述3’末端片段连接T-vector，通过测序获得的3’端序列，3’端序列的测序结果如图3所示；
5、将上述步骤2)得到的5’末端片段和步骤4)所得到的3’末端片段以及步骤3中的目的基因序列进行拼接得到所述长链非编码RNA的全长cDNA序列,如序列表中SEQ ID NO.1所示。
实施例2所述长链非编码RNA的保守性、转录活性和编码能力的分析
本实施例利用生物信息学算法，对实施例1中获得的所述长链非编码RNA(lncRNAMYU的精准全长cDNA序列)的保守性、转录活性和编码能力进行了分析，分析方法具体如下：
1、利用Roadmap得到前列腺癌细胞株PC3中H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac的数据，利用ENCODE数据库(https://www.encodeproject.org/)得到正常组织组织中H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac的数据，GEO accession number分别为GSE96019(H3K4me3，PC3)、GSE96418(H3k36me3，PC3)和GSE96399(H3K27ac，PC3)，ENCODE Experiment ID为ENCSR748RBT(H3K4me3，Normal prostate)、ENCSR499FXI(H3k36me3，Normal prostate)和ENCSR763IDK(H3K27ac，Normal prostate)，将所得数据在UCSC网站显示(http://genome.ucsc.edu/)，得到H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac在所述长链非编码RNA(图5中的“lncRNA MYU”)基因启动子区的富集情况(图5)。
结果显示同正常肺组织相比，H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac在前列腺癌细胞株PC3中高度富集，表明所述长链非编码RNA在前列腺癌细胞中有较强的转录活性，在正常组织中有相对较高的保守性。
2、通过PhyloCSF方法分析了lncRNA MYU、HOTAIR、SChLAP1、ACTB和GAPDH的编码能力(图6)，结果显示所述长链非编码RNA(图6中的“lncRNA MYU”)的PhyloCSF score为负值，介于HOTAIR与SChLAP1之间，HOTAIR和SChLAP1均为长链非编码RNA，对比蛋白编码基因GAPDH和ACTB的PhyloCSF score均为正值，表明所述长链非编码RNA基因不具备蛋白编码能力。
实施例3不同前列腺癌细胞株中所述长链非编码RNA表达量的检测
本实施例提供了一种特异性引物，所述特异性引物用于检测所述的长链非编码RNA(lncRNA MYU)在细胞和组织中的表达水平；所述特异性引物包括上游引物MYU-F和下游引物MYU-R，所述上游引物MYU-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物MYU-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本实施例提供了一种用于人前列腺癌早期诊断的试剂盒，包括上述的特异性引物。
所述的用于人前列腺癌早期诊断的试剂盒，包括：Premix Ex Taq(TliNaseH Plus)(2×)，10μL；所述的上游引物MYU-F，10μM，0.4μL；所述的下游引物MYU-R，10μM，0.4μL；ROX Reference Dye II，0.4μL；dH2O，6.8μL。
本实施例提供了一种用于人前列腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，包括：Premix Ex Taq(Tli NaseH Plus)(2×)，10μL；所述的上游引物MYU-F，10μM,0.4μL；所述的下游引物MYU-R，10μM,0.4μL；ROX Reference Dye II，0.4μL；模板，2μL；dH2O，6.8μL。
本实施例提供了基于qRT-PCR的检测前列腺癌细胞株中所述长链非编码RNA表达量的方法，具体步骤如下：
1、提取细胞总RNA，按照如下方法分别提取细胞LNCaP，22Rv1，PC3，DU145的总RNA，上述所用细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心：
(1)将一个培养有上述任一细胞的6cm培养皿用PBS(pH为7.4)清洗，加入1mlTrizol，移入1.5ml EP管中，混匀，静置5min；
(2)12000rpm，4℃离心10min；
(3)加入200μl氯仿，剧烈摇晃15s，静置5min；
(4)12000rpm，4℃离心15min；小心将上层水相移入新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10min或在-20℃下放置1小时；
(5)12000rpm，4℃离心10min，小心弃上清；
(6)加入1ml的体积浓度为75％乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀，加入乙醇后，将RNA沉淀弹起漂洗；
(7)12000rpm，4℃离心10min，倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀；
(8)室温晾干，用30μl的DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，测浓度。
2、去除基因组DNA的反应，将步骤1中提取的细胞总RNA配制为表1所示的混合体系，所述混合体系在42℃下静置2min，去除RNA中混有的基因组DNA。
表1去除DNA的反应混合体系
试剂 使用量
5*gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA 1μg
RNase Free H2O up to 10μl
3、使用III First-Strand Synthesis System Kit，将步骤2中获得的细胞总RNA反转录为cDNA，所述细胞总RNA反应液为10μl，反转录的反应程序为：37℃保持15min，85℃保持5s，4℃恒温静置，所述反转录的扩增体系如下所示：
表2反转录扩增体系
试剂 使用量
步骤2细胞总RNA反应液 10μl
PrimeScriptRT Enzyme Mix 1 1μl
RT Primer Mix*4 1μl
5*PrimeScript Buffer 2 4μl
RNase Free dH2O 4μl
4、以步骤3中所得的cDNA为模板，通过所述用于人前列腺癌早期诊断的试剂盒和所述用于人前列腺早期诊断的qRT-PCR反应体系，荧光定量PCR检测所述长链非编码RNA(lncRNA MYU)的表达水平，荧光定量PCR在ABI StepOne PCR instrument上进行检测，内参基因选用GAPDH，内参GAPDH的qPCR引物GAPDH-F和GAPDH-R，引物GAPDH-F核苷酸序列如SEQID NO：18所示，引物GAPDH-R核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述cDNA的qPCR的扩增引物MYU-F的序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，引物MYU-R的序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；荧光定量PCR的扩增体系如下所示：
表3荧光定量PCR扩增体系
反应程序为：50℃保持2min，95℃保持10min，95℃保持15s，60℃保持30s，40个循环，95℃保持15s，60℃保持1min，95℃保持15s。
在4种前列腺癌细胞中所述长链非编码RNA表达水平的检测结果如图7所示，由图中可知，所述长链非编码RNA(lncRNA MYU)在LNCaP，22Rv1，PC3和DU145前列腺癌细胞株中均有较高的表达量。
检测所述长链非编码RNA在前列腺癌细胞系LNCaP的核质分离比如图8所示，由图中可知前列腺癌细胞系LNCaP的细胞核和细胞质分离成功，然后分别提取细胞核中的总RNA和细胞质中的总RNA利用上述qRT-PCR方法(步骤2-步骤4)检测前列腺癌细胞系LNCaP的细胞核相对细胞质中的lncRNA MYU的表达量百分比，结果如图9所示，三次独立重复实验结果表明，58％的lncRNA MYU分布在细胞核中，42％的lncRNA MYU分布在细胞质当中，这对后续研究其分子机制的方向选择很关键。
实施例4所述长链非编码RNA作为人前列腺癌早期诊断标志物的能力评估
所述长链非编码RNA及它的表达数据从Mitranscriptome下载，病人样本从TCGA上下载，通过Wilcoxon rank sum test检测所述长链非编码RNA在多种癌症及对应癌旁组织中表达量的差异(如图10所示)，结果发现同正常组织相比，lncRNA MYU在多种癌症组织当中都有显著高表达的，表明lncRNA MYU在癌症中高表达是具有广谱性的，同时也发现MYU在前列腺癌组织中是显著高表达的；同时通过Wilcoxon rank sum test检测所述长链非编码RNA在正常组织与前列腺癌组织中的表达量的差异(如图11所示)，同时结合ROC曲线分析(如图12所示)，所述长链非编码RNA区分前列腺癌组织和正常组织的AUC可达0.906，具有较高的灵敏度和较强的特异性，所述长链非编码RNA可作为前列腺癌诊断的分子标志物。
实施例5所述长链非编码RNA特异性RNA干扰质粒与过表达质粒的构建
1、根据实施例1中所获得的lncRNA MYU精准全长cDNA序列，利用RNAi设计网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/；http://cancan.cshl.edu/RNAi_central/RNAi.cgi？type＝shRNA)，获得可信度高的RNAi的靶位点序列，靶位点序列如序列表中SEQ ID NO.6所示或SEQ ID NO.7所示。
2、根据上述的RNAi的靶位点序列，设计RNAi用的短发夹片段，短发夹片段的序列如序列表中SEQ ID NO.8所示或SEQ ID NO.9所示。
3、根据序列为SEQ ID NO.8所示的短发夹片段构建相应的shRNA1质粒，根据序列为SEQ ID NO.9所示的短发夹片段构建相应的shRNA2质粒，具体构建步骤如下：
(1)选择步骤2中的段发夹片段作为目的序列，选择pSIH-H1作为干扰载体设计引物，构建shRNA1质粒的引物为shRNA1-F如序列表中SEQ ID NO.20所示，shRNA1-R如序列表中SEQ ID NO.21所示，构建shRNA2质粒的引物为shRNA2-F如序列表中SEQ ID NO.22所示，shRNA2-R如序列表中SEQ ID NO.23所示，上述引物由金唯智生物科技有限公司提供，插入序列的酶切位点5’-BamHI,3’-EcoRI；
(2)退火反应
反应条件为：37℃保持30min，95℃保持5min,以6℃/min速度梯度退火至25℃；退火反应体系如下所示：
shRNA1-F或shRNA2-F，100μM，1μl，
shRNA1-R或shRNA2-R，100μM，1μl，
10X T4DNA ligase buffer，1μl，
T4PNK，0.3-0.5μl，
ddH2O，补齐10μl；
(3)连接
以1μl退火产物加入99μl ddH2O的比例稀释上述退火产物，按照如下反应体系连接：
pSIH-H1(Bamh1/EcoR1双酶切)，100ng，
Diluted oligo，2μl，
10XT4ligase buffer，2μl，
T4ligase，0.5μl，
ddH2O，补齐20μl，
连接条件：4℃过夜或37℃3-5h。
(3)转化突变挑克隆送测序。
4、过表达质粒pLVX-IRES-Neo的构建过程
(1)设计引物MYU-F2和MYU-R2，MYU-F2序列如序列表SEQ ID NO.24所示，MYU-R2序列如序列表SEQ ID NO.25所示(所述引物由苏州金唯智生物有限公司合成)
(2)PCR反应
PCR扩增反应体系：
ddH20，31μl；
含有lncRNA MYU全长的质粒，所述含有lncRNA MYU全长的质粒为采用实施例1中获得的长链非编码RNA的cDNA序列合成在pUC-57载体上(由苏州金唯智公司合成)，2μl；
MYU-F2，10μM，1μl；
MYU-R2，10μM，1μl；
PFU，1μl；
PFU buffer(5×)，10ul；
dNTPs，2.5mM，4μl；
ddH2O，补齐50μl，
PCR反应程序设定：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃2-4kb/min延伸，35个循环，72℃终延伸：10min，最后降温至4℃；
(3)将上述PCR产物纯化后与pLVX-IRES-Neo载体同时双酶切(EcoR1/Xho1双酶切)，跑胶纯化，连接，连接体系如下所示：
pLVX-IRES-Neo(Bamh1/EcoR1双酶切产物)，30ng，
PCR产物(Bamh1/EcoR1双酶切产物)，100ng，
10*T4ligase buffer，2μl，
T4ligase，1μl，
ddH2O，补齐20μl，
连接条件：4℃过夜，将连接产物转化挑克隆送测序。
实施例6shRNA质粒干扰前列腺癌细胞测定细胞生长曲线与克隆形成能力以及迁移能力
1、将实施例5中构建的shRNA1和shRNA2质粒分别转染至前列腺癌细胞株DU145中，转染具体操作步骤为：
(1)第一天用6cm细胞培养皿铺Lenti-XTM293T，使第二天转染时能够达到70-80％；
(2)第二天当细胞密度达到70-80％可以转染时，取两个EP管，质粒在第一个EP管中按照PMD2G:PSPAX2:目的质粒＝1.5ug:3ug:4ug进行混匀，然后在两个EP管中分别加入160μl opti-MEM，再在第二个EP管中加入25.5μl的PEI转染试剂，旋涡混匀，静置5min；
(3)将含有转染试剂PEI的溶液加入质粒中，旋涡混匀，静置15min；
(4)取出细胞，吸弃上清，用PBS(pH)洗一下，加入1.6ml opti-MEM；
(5)将质粒加入细胞；
(6)6h后换液；
(7)第二天铺目的细胞，使第二天感染时能够达到70-80％；
(8)第三天将48h病毒取出，3000rpm离心10min；
(9)取出目的细胞，吸弃上清，加入病毒，同时加入polybrene(聚凝胺)(8ug/ml)；
(10)第四天同一时间加入含有puromycin(嘌呤霉素)的DMEM培养基，其中DU145细胞使用含有puromycin浓度为2.0ug/ml的培养基，筛选感染成功的阳性细胞。
2、生长曲线及克隆形成
(1)在96孔板中，将不同shRNA质粒转染的细胞株调整为每100μL中2000个细胞。使用Luminescent Cell Viability Assay(CTG)每48h测定一次，每天读三个复孔，通过GraphPad Prism5.0处理数据后得到生长曲线，统计三次独立重复试验结果；
(2)分别将不同shRNA质粒敲减所述长链非编码RNA(lncRNA MYU)的DU145细胞株以及对照DU145细胞株按照2000/孔或者1000/孔种植于六孔板中，培养10-14天后，细胞克隆形成，将培养基去掉，用PBS洗一两次，甲醇：乙酸＝3:1固定1h，用结晶紫染色处理12h以后，用PBS清洗，拍照用imageJ软件计数，通过GraphPad prism5.0处理数据，统计三次独立重复试验结果。
shRNA1和shRNA2在DU145细胞株中对所述长链非编码RNA的干扰效率如图13所示，两种shRNA质粒对所述长链非编码RNA的干扰效率均在60％以上，可得到所述长链非编码RNA稳定敲降的细胞株；图14所示的生长曲线和图15-16所示的细胞克隆形成结果显示在所述长链非编码RNA敲减后，DU145细胞的细胞增殖率和细胞的克隆能力都得到有效抑制，且转染shRNA2质粒的DU145细胞获得相对更有效的抑制效果；图17所示的细胞迁移能力结果显示在所述长链非编码RNA敲减后，DU145细胞的迁移能力都得到有效抑制，且转染shRNA2质粒的DU145细胞获得相对更有效的抑制效果，图18为图17细胞迁移能力结果的量化图，图19为在所述长链非编码RNA敲减后DU145细胞的蛋白印迹图，结果显示为上皮间质转化(EMT)的三个Marker的蛋白水平变化情况，其中E-Cadherin是上皮细胞的Marker，N-Cadherin和Vimentin是间质细胞的Marker。
上述结果表明shRNA1和shRNA2可明显抑制前列腺癌细胞的生长克隆以及迁移，可以shRNA质粒为表达载体，使其在癌变部位高表达，用于前列腺癌的基因治疗途径；同时，本实施例所提供的RNAi的靶位点序列以及短发夹片段，可用于抗前列腺癌药物的研发。
实施例7所述长链非编码RNA过表达对前列腺癌的影响
将实施例5中构建的过表达质粒pLVX-IRES-Neo转染到所述长链非编码RNA低表达的人前列腺癌细胞PC3中，转染方法如实施例6中所述的转染方法(其中过表达载体用的筛选药物是G418，浓度是1000μg/ml)，得到所述长链非编码RNA过表达后的细胞生长曲线(如图20-21所示)、细胞克隆形成结果(如图22-23所示)以及细胞迁移能力结果(如图24-26所示)。
图20显示转染了pLVX-IRES-Neo(图20中Neo-MYU)质粒的前列腺癌细胞，所述长链非编码RNA表达量显著性增加，pLVX-IRES-Neo质粒的表达效果好，所述长链非编码RNA过表达后，人前列腺癌细胞PC3的细胞增殖率显著增加(图21所示)，细胞克隆形成能力显著增强(图22-23所示)，结果显示所述长链非编码RNA的过表达可增加人前列腺癌细胞的恶性程度。细胞迁移能力显著增强(图24-26所示)，结果显示所述长链非编码RNA的过表达可增加人前列腺癌细胞的迁移能力。
实施例8所述长链非编码RNA上调c-MYC的表达的机制
为了探索所述长链非编码RNA(lncRNA MYU)潜在机制——lncRNA MYU可能调控前列腺癌的发生发展。众所周知，lncRNAs可以通过海绵作用与microRNAs(miRNAs)结合，从而引起miRNAs靶向调节的基因表达上调，这一分子机制也称之为竞争性内源RNA网络(ceRNA网络)。ceRNA网络机制通常发生在细胞质当中。前面通过核质分离实验发现lncRNA MYU一部分也是分布在细胞质当中的，所以猜想MYU可能通过ceRNA网络的方式发挥作用。因此，本实施例分析了lncRNA MYU的表达水平与成熟的miRNAs的表达水平之间的关系，结果发现，lncRNA MYU与15个成熟的miRNAs呈显著的负相关关系，(r<-0.3,P<0.0001)，结果见下表4，
表4 lncRNA MYU与15个成熟的miRNAs的关系
miRNA R p-value
hsa.miR.187.3p -0.420633196 1.14E-10
hsa.miR.221.3p -0.40755072 4.74E-10
hsa.miR.143.3p -0.395310718 1.71E-09
hsa.miR.873.5p -0.369065673 2.25E-08
hsa.miR.187.5p -0.365681346 3.09E-08
hsa.miR.184 -0.3619539 4.36E-08
hsa.miR.378c -0.359757081 5.33E-08
hsa.miR.222.3p -0.350223717 1.25E-07
hsa.miR.222.5p -0.349057455 1.39E-07
hsa.miR.23c -0.343942199 2.16E-07
hsa.miR.27b.3p -0.334526294 4.81E-07
hsa.miR.133b -0.332952086 5.48E-07
hsa.miR.767.5p -0.327593572 8.51E-07
hsa.miR.452.5p -0.31499159 2.32E-06
hsa.miR.152.3p -0.306935385 4.30E-06
基于上述15个成熟的miRNAs，在PubMed数据库中搜索其已经报道过的目标编码基因，结果发现，miR-184在多种肿瘤中都发挥着抑癌基因的功能，并有相关研究发现miR-184能够抑制c-Myc(原癌基因)的表达。
TCGA(癌症基因组图谱)数据揭露了miR-184在前列腺癌组织中显著低表达(如图27所示)，以及miR-184与lncRNA MYU在216个TCGA前列腺癌组织中的相关分析，结果显示miR-184与MYU呈负相关的关系(r＝-0.1966,P＝0.0037)(如图28所示)。
RNAhybrid网站用于预测miR-184/lncRNA MYU以及miR-184/c-Myc的3’UTR(3’非翻译区)的结合位点(如图29所示和如图30所示)。本实施例构建了荧光素酶报告基因，分别包含lncRNA MYU、突变的miR-184结合位点或c-Myc的3’UTR，并进行了双荧光报告试验，步骤如下：
构建荧光素酶报告基因分别包含lncRNA MYU、突变的miR-184结合位点或c-Myc的3’UTR(即双重荧光素酶基因载体)步骤：
分别将lncRNA MYU全长序列，lncRNA MYU突变掉miR-184结合位点的序列，包含miR-184结合位点的c-Myc 3’非翻译区(3’UTR)序列连接到pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression Vector(pmirGLO vector)上，选用的酶切位点是5’-Nhe1和3’-Xho1：
先通过PCR扩增出含5’-Nhe1和3’-Xho1的lncRNA MYU全长序列，lncRNA MYU突变掉miR-184结合位点的序列，包含miR-184结合位点的c-Myc 3’非翻译区(3’UTR)序列得到片段。
然后将上述得到的这些片段与pmirGLO vector分别进行双酶切反应，先将pmirGLO vector进行双酶切反应，反应体系如下：
pmirGLO vector，5μg，
Nhe1，0.4μl，
Xho1，0.4μl，
10×FastDigest Green buffer，10μl，
ddH2O，补齐100μl，
然后将上述双酶切后的载体进行电泳纯化回收，目的片段直接进行酶切产物纯化回收；
最后将上述纯化回收的载体和目的片段进行连接反应，反应体系如下：
pmirGLO vector与目的片段按照摩尔比为1:5混合，
T4DNA ligase，1μl，
10*T4DNA ligase buffer，1μl
ddH2O，补齐10μl，
4℃连接过夜，第二天挑克隆，摇菌，菌落PCR鉴定之后送测序。
双荧光报告试验：
将生长于24孔板的Lenti-XTM293T细胞共转染200ng的上述构建的双重荧光素酶基因载体，所述双重荧光素酶基因载体包括lncRNA MYU全长序列、lncRNA MYU突变掉miR-184结合位点的序列或包含miR-184结合位点的c-Myc 3’非翻译区，以及利用转染试剂Lipofectamie 3000转染50mM的miR-184mimics，miR-NCmimics作为对照，细胞培养48小时后，利用dual luciferase reporter assay kit(Promega)和酶标仪分析。miR-184mimics以及miR-NC mimics的序列见下表5，
表5 miR-184mimics以及miR-NC mimics的序列
Mimics 序列
miR-184mimics 5’UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU3’
miR-NC mimics 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3’
结果如图31所示，miR-184mimics的过表达降低了包含lncRNA MYU或包含miR-184结合位点的c-Myc 3’非翻译区的荧光素酶的活性，但是空载体和lncRNA MYU突变掉miR-184结合位点的MYU荧光素酶活性几乎不发生变化。
进一步，探索了lncRNA MYU对于c-Myc的表达的影响，在TCGA前列腺癌组织中c-Myc的表达水平与lncRNA MYU呈正相关(r＝0.3598,P<0.0001)，结果见图32。
进一步，收集实施例6中培养的采用不同shRNA质粒敲减所述长链非编码RNA(lncRNA MYU)的DU145细胞株以及对照DU145细胞株，通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测在细胞中lncRNA MYU基因沉默或过表达时c-Myc的表达水平的变化，通过qRT-PCR检测c-Myc的表达水平所用的引物c-Myc qPCR-F如序列表中SEQ ID NO.26所示，c-Myc qPCR-R如序列表中SEQ ID NO.27所示，其余步骤与实施例3中的基于qRT-PCR的检测前列腺癌细胞株中所述长链非编码RNA表达量的方法基本相同，检测结果发现在DU145细胞中，敲减lncRNA MYU可以降低c-Myc的mRNA和蛋白水平。相反，在PC3细胞中lncRNA MYU的过表达可以增强c-Myc的mRNA和蛋白质表达水平，结果如图33所示。
另外，构建c-Myc干扰质粒c-Myc shRNA，构建方法与实施例5中构建相应的shRNA方法基本相同，区别仅在于，c-Myc shRNA的引物c-Myc shRNA-F如序列表中SEQ ID NO.28所示，c-Myc shRNA-R如序列表中SEQ ID NO.29所示。将c-Myc shRNA、空载的过表达质粒pLVX-IRES-Neo(图34中简写为pLVX-Neo)、实施例5制备的含有lncRNA MYU全长过表达质粒pLVX-MYU，转染到所述长链非编码RNA低表达的人前列腺癌细胞PC3中，转染方法如实施例6中所述的转染方法(其中过表达载体用的筛选药物是G418，浓度是1000μg/ml)，检测细胞的相对活力发现，敲减c-Myc会阻碍过表达lncRNA MYU引起的PC3细胞增殖能力的提升效应。此外蛋白质印迹实验证实c-Myc的蛋白水平与细胞增殖的水平变化结果一致，结果见图34-35，显示c-Myc可以部分的影响lncRNA MYU。
为了进一步阐明lncRNA MYU、miR-184和c-Myc之间的关系，将miR-184mimic转染至lncRNA MYU过表达的上述步骤培养的PC3细胞中，发现miR-184的过表达显著抑制了由于lncRNA MYU的过表达引起的对细胞的增殖能力的加快效应，同时蛋白质印迹实验结果显示，过表达miR-184同样抑制c-Myc的蛋白水平，结果见图36-37。
通过以上发现，lncRNA MY U调控c-Myc通过竞争性结合miR-184。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
<120> 用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA及制备、用途
<130> SHA201700683
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工合成(lncRNA MYU)
<400> 1
ctacaaagcc tgggcccgtg ggggacgcac atggtcctgt tcgtactcca ggatggcggc 60
gtaaagggcc cgctgctccc gttcctccgg ggtcagggcg acttggctgc aaaacctcct 120
ggggagaaag gcacgcggtg ggtgccgggg ccaggccctc cccgcagcgg ccccaggggc 180
gggcaggagt cccacctgtt ggcggcctcc tggagccgca gccggcgctc ctccatcttt 240
ctctggagct gggtgcagag tcaaggggcc gagcgtggga tctgagcggg ccctcggttc 300
ccaaccccgt cccacacccg gagaggccgg gacgtcccag ggacctcctc tcggtgaggg 360
gctgtcccca gggaggcctc ctccagtggc gtcagctctc tggaaatgtg acaagctgct 420
gtctagaccc caggaagccc agtggtgtct ggacaccaga ggagtctctc tcatcctccc 480
ggattgctct gaggccagga gctttgtgac tctgccccct gaagcttctg gaagatctcg 540
ggtggcagaa aaggagagag ctttcctcct tcatcggagt atacacggcg gtgtcggccg 600
gcaggctggg gaatgggagc agctgcaggc atggttggct tcaggcctct gggaagtggc 660
cgttttacag agacaaggac gtgctgaggg gatcgcctca cccatctccc accggctgtg 720
tccccaaagt cctgccttcc cgtagcttgg catggagcac ctctgcgcga ccatggacct 780
gctcacacag cccttctgcg cgccgtggga gctgcctctc tgtgactcgc ccctggaccc 840
accgccccag cgcctgaccc acctccctgc tgcccttcac agaaaacttc tcatagactc 900
ccattttctc atcccgcccc gatttagccc ccgactcccc ccggaaactg cccttacccg 960
tccccacctt gccagacacg gtgggccact ggagttcctc tgtcttctgg gactttgctc 1020
tccccagggg atcctctgcc actcctccac ccaactcctc aatcttggag cgccagagct 1080
cagccgagct caccggctcc ctagggagct ggggcaactg ttagctcccc ctgacctgtg 1140
tgatcctacg tccagtggct gccccgacct ctgtgatccc acgtccaggg gctcccccga 1200
cctctgtgat cccacgtcca gtggctcccc cgacctctgt gctcccacgt ccagtggctc 1260
ccccgacctc tgtgctccca cgtccagtgg ctcccccgac ctctgtgctc ccacgtccag 1320
tgggtccccc tgacctctgt gatcccacgt ccagtggctc cccctgacct ctgtgctcta 1380
tgtccagtgg ctccccctga cctctgtgat cctttgtgca gcggctgctg gcctctcaaa 1440
cttaatgtgt tcattgcgga a 1461
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(GSP1)
<400> 2
gattacgcca agctttttgc tcctgcccca tctgcc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(GSP2)
<400> 3
gattacgcca agcttggcag atggggcagg agcaaa 36
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(MYU-F)
<400> 4
agtggccgtt ttacagagac a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(MYU-R)
<400> 5
catgccaagc tacgggaagg 20
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(RNAi-1)
<400> 6
gaccatggac ctgctcacac agcccttct 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(RNAi-2)
<400> 7
gccactggag ttcctctgtc ttctgggac 29
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(shRNA1)
<400> 8
gaccatggac ctgctcacac agcccttcta gaagggctgt gtgagcaggt ccatggtc 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(shRNA2)
<400> 9
gccactggag ttcctctgtc ttctgggacg tcccagaaga cagaggaact ccagtggc 58
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(5'-F)
<400> 10
aggcggctct gaccccg 17
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(3'-R)
<400> 11
atctcccagg tgttactaga agaagtgg 28
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(P1)
<400> 12
ctctgggaag tggccgtttt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(P2)
<400> 13
gcgctccaag attgaggagt 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(P3)
<400> 14
ctgttcgtac tccaggatgg c 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(P4)
<400> 15
catgccaagc tacgggaagg 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(P5)
<400> 16
tctgtcttct gggactttgc tc 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(P6)
<400> 17
aggatgggag cagtaaacgg 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(GAPDH-F)
<400> 18
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(GAPDH-R)
<400> 19
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 20
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成(shRNA1-F)
<400> 20
gatccgacca tggacctgct cacacagccc ttctttcaag agaagaaggg ctgtgtgagc 60
aggtccatgg tcttttttg 79
<210> 21
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成(shRNA1-R)
<400> 21
aattcaaaaa agaccatgga cctgctcaca cagcccttct tctcttgaaa gaagggctgt 60
gtgagcaggt ccatggtcg 79
<210> 22
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成(shRNA2-F)
<400> 22
gatccgccac tggagttcct ctgtcttctg ggacttcaag agagtcccag aagacagagg 60
aactccagtg gcttttttg 79
<210> 23
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成(shRNA2-R)
<400> 23
aattcaaaaa agccactgga gttcctctgt cttctgggac tctcttgaag tcccagaaga 60
cagaggaact ccagtggcg 79
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(MYU-F2)
<400> 24
atgcgaattc ctacaaagcc tgggcccgtg g 31
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成(MYU-R2)
<400> 25
atgcctcgag ttccgcaatg aacacattaa gtttgagag 39
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(c-Myc qPCR-F)
<400> 26
tagtggaaaa ccagcagcct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(c-Myc qPCR-R)
<400> 27
agaaatacgg ctgcaccgag 20
<210> 28
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成(c-Myc shRNA-F)
<400> 28
gatcccagcg aggatatctg gaagaaattc gagcttcaag agagctcgaa tttcttccag 60
atatcctcgc tgttttttg 79
<210> 29
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成(c-Myc shRNA-R)
<400> 29
aattcaaaaa acagcgagga tatctggaag aaattcgagc tctcttgaag ctcgaatttc 60
ttccagatat cctcgctgg 79

Claims (14)

1.一种长链非编码RNA，其特征在于，其选自如下(a)-(b)中所示的核酸分子中的至少一种：
(a)其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子；
(b)为与(a)中的如SEQ ID NO：1所示的核酸分子具有85％及以上同源性的核酸分子。
2.如权利要求1所述的长链非编码RNA在制备前列腺癌、前列腺癌预后复发或前列腺癌临床分期的分子标志物中的用途。
3.一种分子标志物，其特征在于，包括权利要求1所述的长链非编码RNA。
4.一种可特异性识别如权利要求1所述的长链非编码RNA的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下引物：
GSP1,其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
GSP2,其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；
P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
5.一种制备如权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求3所述的分子标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1、提取前列腺癌细胞总RNA并反转录为cDNA；
2、以步骤1中的cDNA为模板，根据预测序列设计引物并进行PCR扩增，将所述扩增的片段克隆至载体上，然后进行测序验证所述序列的正确性，若测序正确，则所得片段即为所述的长链非编码RNA，若测序不正确，则进行下述步骤3-5；
3、以步骤1中的cDNA为模板，利用权利要求4中的引物组中的引物P3和引物P4，进行PCR反应，沿序列的5’端延伸扩增，测序；以步骤1中的cDNA为模板，利用权利要求4中的引物组中的引物P5和引物P6，进行PCR反应，沿序列的3’端延伸扩增，测序；将上述获得的序列进行拼接得到目的基因序列；
4、利用权利要求4中的引物组中的GSP1和GSP2，分别与SMARTerTMRACE cDNAAmplification Kit中的引物扩增出所述的长链非编码RNA的5’末端序列和3’末端序列；
5、将上述步骤4得到的3’末端片段和5’末端片段以及步骤3中的目的基因序列拼接得到所述长链非编码RNA的全长cDNA序列。
6.一种用于检测如权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求3所述的分子标志物的特异性引物。优选的，所述的特异性引物如下：
MYU-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
MYU-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.一种用于人前列腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，其特征在于，包括使用权利要求6所述的特异性引物。优选的，所述反应体系如下：Premix Ex Taq(Tli NaseHPlus)(2×)，10μL；所述的上游引物MYU-F，10μM,0.4μL；所述的下游引物MYU-R，10μM,0.4μL；ROX Reference Dye II，0.4μL；模板，2μL；dH2O，6.8μL。
8.一种用于检测如权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求3所述的分子标志物的特异性探针。
9.一种芯片，其特征在于，包括权利要求8所述的特异性探针。
10.一种如权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求3所述的分子标志物的RNAi靶位点的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或SEQ ID NO：7所示。
11.一种如权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求3所述的分子标志物的shRNA或LNA序列；优选的，所述shRNA序列选自shRNA1或shRNA2，所述shRNA1如SEQ ID NO：8所示，所述shRNA2如SEQ ID NO：9所示。
12.一种载体，其特征在于，包括权利要求1所述的长链非编码RNA、权利要求3所述的分子标志物或权利要求11所述的shRNA或LNA序列。
13.如权利要求1所述的长链非编码RNA、权利要求3所述的分子标志物、权利要求6所述的特异性引物、权利要求7所述的qRT-PCR反应体系、权利要求8所述的特异性探针、权利要求9所述的芯片、权利要求10所述的RNAi靶位点的核苷酸序列、权利要求11所述的shRNA或LNA序列或权利要求12所述的载体在制备用于早期诊断、检测、缓解或治疗前列腺癌或前列腺癌预后复发的芯片、药物或试剂盒中的用途。
14.一种芯片、药物或试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的长链非编码RNA、权利要求3所述的分子标志物、权利要求6所述的特异性引物、权利要求7所述的qRT-PCR反应体系、权利要求8所述的特异性探针、权利要求9所述的芯片、权利要求10所述的RNAi靶位点的核苷酸序列、权利要求11所述的shRNA或LNA序列或权利要求12所述的载体。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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