CN107022625B - 一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码rna、扩增检测方法及应用 - Google Patents

一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码rna、扩增检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用。本发明首次发现并克隆了一个新的长链非编码RNA基因序列，并通过实验证明该基因在肝细胞癌中的特异性表达与肝细胞癌的恶性程度及转移能力有关，该基因具有肝细胞癌辅助诊断、肝细胞癌基因治疗及肝细胞癌预后预测的用途。发明也提供了该基因的RNAi靶序列、用于RNAi干扰的短发夹片段，二者具有抑制该基因表达的能力，具有肝细胞癌的辅助诊断和基因治疗的用途。

Description

一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方 法及应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，占整个原发性肝癌(Liver Cancer)的90％以上。全世界每年发病估计不少于一百万新患者，占恶性肿瘤发病率第6位，死亡率第2位，每年约60万人死于肝癌。据全国的几次死亡回顾调查显示我国70年代、90年代及21世纪初的肝癌在全部恶性肿瘤死亡中占前3位，是威胁健康和生命的主要疾病之一。我国HCC多发生在慢性肝炎或肝硬化的基础上，高度恶性和复杂难治；且我国人口基数大的事实，HBV、HCV感染人群的增加及人口老龄化，今后一段时间内肝癌的发生率可能仍将上升。肝癌患者的预后差，俨然已严重威胁世界和我国人民的健康和生命，也给患者家属带来了沉重的经济负担和精神压力。因此，研究HCC的发病机制、新型治疗靶点及早期诊断/预后生物标记物迫在眉睫。
长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类长度大于200nucleotides(nt)的不具备编码蛋白质能力的功能性RNA分子，其具有许多类似mRNA的结构，如poly(A)尾、5’帽子结构和启动子。它位于细胞核或者细胞质中，可被选择性剪接或聚腺苷酸化。LncRNAs曾被认为是基因转录过程中的“噪音”。但随着高通量测序和其它新兴研究技术的涌现，lncRNAs的生物学功能逐渐被研究并得到认可。越来越多的证据表明lncRNAs在广泛的生物学过程中发挥重要作用，其包含细胞生长、迁移、侵袭和分化等。然而，lncRNAs在人类肝细胞癌中的生物学功能和分子机制有待阐明。
2015年美国总统奥巴马宣布精准医学计划(Precision Medicine Initiative)的启动，引起了全世界的广泛关注。精准医学(Precision Medicine)是以个性化医疗为基础，联合最新分子遗传学检测技术对遗传物质及相关分子进行检测，这就要求我们探索更多的新型分子，以更深入、更准确和更全面地反映疾病(肝细胞癌也不例外)的本质特征，为疾病诊断和治疗以及健康管理。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用。
为实现本发明的上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明所述人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA的序列如SEQ ID NO.1所示，将其在NCBI数据库中进行比对，发现其是在LOC105371083的基础上5’延长了86个核苷酸(catgcgtaga taaaagtaaa taaacgccct caagttagga atgaacggag gaaatgggttaaacgagaat aaataattga aggcaga)，3’增加了多聚A尾(aaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa)。该长链非编码RNA可用于制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌试剂或药物。该长链非编码RNA的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。用于该长链非编码RNA中siRNA的作用靶序列的序列如SEQ IDNO.7至SEQ ID NO.10任一所示。这些靶序列可用于制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌疾病的药物。用于该长链非编码RNA中RNAi用的短发夹片段shRNA的序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。这些短发夹片段shRNA可用于制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌疾病的药物。以上这些序列可以进一步构建成载体或重组子。
扩增、检测上述长链非编码RNA的试剂盒中包含3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N、5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N；所述3’RACE引物3L5序列如SEQ ID NO.2所示，所述3’RACE巢式PCR引物3L5N序列如SEQ ID NO.3所示，所述5’RACE引物5L5序列如SEQ ID NO.4所示，所述5’RACE巢式PCR引物5L5N序列如SEQ ID NO.5所示。
基于上述试剂盒扩增、检测本发明所述长链非编码RNA的方法包括如下步骤：
(1)以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N进行PCR获得3’RACE产物；以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N进行PCR获得5’RACE产物；
(2)将3’RACE产物与5’RACE产物拼接，获得长链非编码RNA。
下面对本发明作进一步说明：
本发明研究中，构建lncRNA(命名为lncRNA HCCL5)的过表达载体，并转染人肝细胞癌细胞HepG2和SMMC-7721，结果表明lncRNA HCCL5过表达能明显增加肝细胞癌细胞的恶性生物学行为，提高其侵袭转移能力。
针对lncRNA HCCL5基因设计RNAi靶序列，合成siRNA进行有效干扰位点的筛选，获得有效位点后设计了用于RNAi的短发夹片段，构建相应的shRNA质粒表达载体，并转染人肝细胞癌细胞SMMC-7721和HCCLM3，结果表明在肝细胞癌细胞中表达相应的shRNA能降解细胞内源性lncRNA HCCL5并抑制肝细胞癌细胞的发生发展和转移，减少其恶性程度。通过上述工作可提供lncRNA相关的高效干扰位点，可用于shRNA表达载体构建与siRNA的合成，以及相关基因治疗制剂。
本发明证明了该lncRNA基因具有评估肝细胞癌发生发展的作用，并可以作为肿瘤预后相关的标志物，用于肝细胞癌的辅助诊断；shRNA靶序列及用于RNAi的短发夹片段具有基因治疗的作用，可以用作肝细胞癌的基因治疗。本发明所述的长链非编码RNA基因克隆自肝细胞癌细胞，但不仅限于肝细胞癌，未来更多研究将提供在其他恶性肿瘤中应用。
在精准医学的指导下，本发明通过电子克隆技术对肝细胞癌未知基因进行筛选，cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)克隆肝细胞癌新lncRNA的全长，Northern blotting验证了其大小，核质分离试剂盒检测其细胞定位；RT-PCR、Western blot、裸鼠成瘤等技术/方法从细胞、裸鼠和患者三个层次观察发现，lncRNAHCCL5可促进肝细胞癌的发生发展。该课题有望寻找肝细胞癌的治疗靶点、预后预测和预防的生物标记物提供新的线索，可为肝细胞癌的“精准医学”事业贡献一分力量。此外，通过抑制lncRNA HCCL5表达进行基因治疗，具有重要的实用价值。为开发肝细胞癌相关的长链非编码RNA及其shRNA在肝细胞癌诊疗方面的应用，本发明提供了一条新的肝细胞癌相关的长链非编码RNA及其相关的特异性shRNA序列，该序列可以用于肝细胞癌相关的诊断、治疗和预后预测。
综上所述，本发明首次发现并克隆了一个新的长链非编码RNA基因序列，并通过实验证明该基因在肝细胞癌中的特异性表达与肝细胞癌的恶性程度及转移能力有关，该基因具有肝细胞癌辅助诊断、肝细胞癌基因治疗及肝细胞癌预后预测的用途。发明也提供了该基因的RNAi靶序列、用于RNAi干扰的短发夹片段，二者具有抑制该基因表达的能力，具有肝细胞癌的辅助诊断和基因治疗的用途。
附图说明
图1A-B为生物信息学初步筛选肝细胞癌相关新基因。图1A：cDNA文库差异片段生物信息学初步筛选比对结果，子集A为所有肝癌相关的cDNA文库，子集B为除肝癌以外的所有癌与非癌的cDNA文库；图1B：电子克隆进一步筛选结果的PCR验证，在Genbank数据库中进行比对，排除已知的重复基因及基因组污染序列，获得5条EST序列进行PCR扩增，结果显示2、5泳道得到有效扩增，条带单一，本发明以第5号泳道EST序列为最初基础。M为分子标量，大小依次为：2000、1000、750、500、250、100bp；
图2A-G为全长lncRNA HCCL5的扩增与初步的生物信息学分析。图2A：新基因lncRNA HCCL5的3’RACE扩增结果；图2B：新基因lncRNA HCCL5的5’RACE扩增结果；图2C：lncRNA HCCL5序列在人染色体位置示意图；2D：lncRNA HCCL5基因的Northern blot杂交结果图；2E-G：lncRNA HCCL5编码潜能的生物信息学分析图。M为分子标量，大小依次为：2000、1000、750、500、250、100bp；First PCR为第一轮RACE结果；Nest PCR为巢式PCR结果。3’RACE和5’RACE扩增结果(图2A、B)拼接后成功获得lncRNA基因的全长序列，全长823bp，位于人类基因组16号染色体短臂1区3带1亚带3次亚带(16p13.13)上区域，由两个外显子构成(图2C)。Northern blot杂交结果确认了该基因大小符合预期且确实存在(图2D)。通过生物信息学分析发现该基因不存在有效的开放阅读框架，也不能编码有效的肽段(图2E)；ORFFinder预测发现HCCL5最长的两个ORF区长度分别为261bp和222bp，经蛋白质数据库比对，两个ORF区预测编码的氨基酸序列中并没有找到同源的氨基酸序列，且这两个ORF区均无法形成有效的结构域(图2F)；保守域数据库分析发现HCCL5序列没有保守结构域(图2G)；
图3核质分离检测肝细胞癌新基因的亚细胞定位。使用细胞质标记物GAPDH和细胞核标记物U6作为内参，结果显示，细胞质内参主要定位于细胞质，细胞核内参U6主要定位于细胞核，表明结果可靠。此外，lncRNA HCCL5可能在细胞核和细胞质中均有表达，但主要分布于细胞质(图3)；
图4A-B表示lncRNA HCCL5过表达和干扰的肝细胞癌稳定转染细胞系筛选。图4A：lncRNA HCCL5过表达的肝细胞癌稳定转染细胞系筛选。其中untransfected为未转染质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、lncRNA HCCL5为过表达lncRNA的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞。筛选到lncRNA HCCL5过表达的HepG2和SMMC-7721稳定细胞系后进行了筛选，结果显示lncRNAHCCL5过表达稳定转染肝细胞癌细胞系构建成功。图4B：lncRNA HCCL5干扰的肝细胞癌稳定转染细胞系筛选。其中，pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNA HCCL5的干扰组。筛选到lncRNA HCCL5干扰的SMMC-7721和HCCLM3稳定细胞系后进行了筛选，结果显示lncRNA HCCL5干扰稳定转染肝细胞癌细胞系构建成功；
图5A-D表示lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞增殖的影响。其中untransfected为未转染质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1-L5为过表达lncRNA的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721。图5A-B：CCK-8实验检测lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞增殖的影响；图5C-D：lncRNA HCCL5过表达后对肝细胞癌细胞集落形成的影响。筛选到lncRNAHCCL5过表达的HepG2和SMMC-7721稳定转染细胞系后进行了相关细胞增殖实验，结果显示与未转染组(untransfected)和对照载体组(pcDNA3.1)相比，lncRNA HCCL5过表达(pcDNA3.1-L5)的HepG2和SMMC-7721细胞系的克隆形成数增加(p<0.05)；
图6A-D表示lncRNA HCCL5干扰对肝细胞癌细胞增殖的影响。其中pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNA HCCL5的干扰组。图6A-B：CCK-8实验检测lncRNA HCCL5干扰对肝细胞癌细胞增殖的影响；图6C-D：lncRNA HCCL5干扰后对肝细胞癌细胞集落形成的影响。筛选到lncRNA HCCL5干扰的SMMC-7721和HCCLM3稳定转染细胞系后进行了相关细胞增殖实验，结果显示与对照载体组(pGU6/GFP/Neo-shNC)相比，lncRNAHCCL5的干扰组(L5-shRNA 1和L5-shRNA 2)中SMMC-7721和HCCLM3细胞系的克隆形成数增加(p<0.05)、克隆形成大小增大。以上CCK-8和平板克隆形成的增殖实验结果均显示lncRNAHCCL5促进肝细胞癌细胞系的增殖；
图7A-C表示lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞周期的影响。其中untransfected为未转染质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌细胞系、pcDNA3.1-L5为过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌细胞系。筛选到lncRNA HCCL5过表达的HepG2和SMMC-7721稳定转染细胞系后进行了流式细胞术周期实验，结果显示，与未转染组(untransfected)和对照载体组(pcDNA3.1)相比，HepG2和SMMC-7721细胞中lncRNA HCCL5过表达(pcDNA3.1-L5)后G0/G1期细胞增多，而S期则相应的增加；SMMC-7721细胞中lncRNA HCCL5过表达后G2/M期细胞也增加(p<0.05)。该结果表明，lncRNAHCCL5过表达加速细胞周期，促进G0/G1期向S期转换，从而促进肝细胞癌细胞系的细胞生长；
图8A-C表示lncRNA HCCL5干扰对肝细胞癌细胞周期的影响。其中pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNA HCCL5的干扰组。筛选到lncRNAHCCL5干扰的SMMC-7721和HCCLM3稳定转染细胞系后进行了流式细胞术周期实验，结果显示，与对照载体组(pGU6/GFP/Neo-shNC)相比，lncRNA HCCL5的干扰组(L5-shRNA 1和L5-shRNA 2)中SMMC-7721和HCCLM3细胞系的S期显著减少；lncRNA HCCL5的干扰组(L5-shRNA1和L5-shRNA 2)中HCCLM3细胞系的G0/G1期增加；lncRNA HCCL5的干扰组(L5-shRNA 2)中SMMC-7721细胞系的G2/M期增加；lncRNA HCCL5的干扰组(L5-shRNA 2)中HCCLM3细胞系的G2/M期显著减少(p<0.05)。该结果表明lncRNA HCCL5干扰则减慢细胞周期，发生S期阻滞，从而抑制肝细胞癌细胞系的细胞生长。总之，lncRNA HCCL5促进G1/S转换，使更多的肝细胞癌细胞异常停滞于合成遗传物质的S期，使得肝细胞癌细胞的突变可能性增加，提高了其恶性程度；
图9A-B表示lncRNA HCCL5过表达和干扰对肝细胞癌细胞形态的影响。其中untransfected为未转染质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1-L5为过表达lncRNA的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721。图9A：荧光显微镜观察lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞形态的影响。结果显示，形态上，未转染组和过表达的对照组呈圆形、椭圆形及梭形等上皮细胞样，而lncRNA HCCL5过表达组细胞则变得细长，呈现间质细胞样。该结果表明lncRNA HCCL5过表达可促进细胞在形态上发生EMT。此外，图9B：荧光显微镜观察lncRNA HCCL5干扰对肝细胞癌细胞形态的影响。其中pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNA HCCL5的干扰组。干扰的对照组SMMC-7721呈圆形、椭圆形及梭形等上皮细胞样，而lncRNA HCCL5干扰组细胞依然是圆形、椭圆形及梭形等上皮细胞样，呈现上皮细胞样；同时，干扰的对照组HCCLM3细胞细长，呈现间质细胞样，而lncRNA HCCL5干扰组细胞变得是圆形、椭圆形及梭形等上皮细胞样，呈现上皮细胞样。该结果表明lncRNA HCCL5干扰可部分逆转细胞形态上发生的EMT；
图10A-B为lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞迁移的影响。其中untransfected为未转染质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1-L5为过表达lncRNA的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721。筛选到lncRNA HCCL5过表达的HepG2和SMMC-7721稳定转染细胞系后进行了划痕实验，结果显示：与未转染组(untransfected)和对照载体组(pcDNA3.1)相比，lncRNA HCCL5过表达(pcDNA3.1-L5)的HepG2和SMMC-7721细胞系的迁移距离显著增加(p<0.05)；
图11A-B为lncRNA HCCL5干扰对肝细胞癌细胞迁移的影响。其中pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNA HCCL5的干扰组。筛选到lncRNAHCCL5干扰的SMMC-7721和HCCLM3稳定转染细胞系后进行了划痕实验，结果显示：与对照载体组(pGU6/GFP/Neo-shNC)相比，48小时之后的SMMC-7721和HCCLM3细胞干扰(L5-shRNA 1和L5-shRNA 2)组细胞迁移距离明显缩短(p<0.05)；
图12A-B为lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞侵袭和转移的影响。其中untransfected为未转染质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1-L5为过表达lncRNA的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721。筛选到lncRNA HCCL5过表达的HepG2和SMMC-7721稳定转染细胞系后进行了划痕实验，结果显示：与未转染组(untransfected)和对照载体组(pcDNA3.1)相比，48小时之后的HepG2和SMMC-7721细胞过表达(pcDNA3.1-L5)组细胞转移数目和侵袭数目均显著增加(p<0.05)；
图13A-C为lncRNA HCCL5干扰对肝细胞癌细胞侵袭和转移的影响。其中pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNA HCCL5的干扰组。不含基质胶的transwell实验反映细胞转移，而含基质胶的transwell则反映侵袭能力。筛选到lncRNAHCCL5干扰的SMMC-7721和HCCLM3稳定转染细胞系后进行了transwell实验，结果显示：与对照载体组(pGU6/GFP/Neo-shNC)相比，48小时之后的SMMC-7721和HCCLM3细胞干扰(L5-shRNA 1和L5-shRNA 2)组细胞转移数量和侵袭数量均显著减少(p<0.05)。以上细胞生物学实验结果均显示lncRNA HCCL5可使其细胞形态向上皮样细胞转换，明显加速肝细胞癌的侵袭与转移能力，并且使肝细胞癌细胞恶性程度增加；
图14A-D为lncRNA HCCL5表达改变后对肝细胞癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响。图14A，C：lncRNA HCCL5过表达对肝细胞癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响。其中pcDNA3.1为转染对照质粒的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721、pcDNA3.1-L5为过表达lncRNA的肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC-7721。结果显示：与对照载体(pcDNA3.1)组相比，lncRNA HCCL5过表达(pcDNA3.1-L5)后肿瘤尺寸明显增大(p<0.05)。图14B，D：lncRNAHCCL5干扰对肝细胞癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响。其中pGU6/GFP/Neo-shNC为对照组、L5-shRNA 1和L5-shRNA 2均为lncRNAHCCL5的干扰组。结果显示：与对照载体组(pGU6/GFP/Neo-s hNC)相比，lncRNA HCCL5干扰(L5-shRNA 2)后肿瘤尺寸显著减小(p<0.05)。该结果表明，lncRNA HCCL5促进裸鼠肿瘤形成；
图15为lncRNA HCCL5表达改变后对肝细胞癌细胞在裸鼠体内侵袭转移的影响。结果显示，lncRNA HCCL5过表达组肺部表面结节数明显多于对照组，其干扰组肺部表面结节数则明显少于对照组(图15)。
具体实施方式
实施例1：生物信息学初步筛选肝细胞癌相关新基因
使用癌症基因组解析计划CGAP平台的cDNA xProfiler与美国国立生物技术信息中心NCBI平台的BLAST、DDD(Digital Differential Display)工具共同筛选。
(1)使用CGAP平台的cDNA xProfiler工具：
Pool A选择肝癌相关的所有cDNA文库；
Pool B选择除肝癌以外所有的癌与非癌cDNA文库。
(2)选择整理cDNA文库差异比对结果中未知的1142条EST序列，在Genbank数据库中进行比对，排除已知的重复基因及基因组污染序列，获得5条EST序列可用于进行下一步筛选，排除3条EST序列中PCR扩增无特异条带的片段，留下HCCL2和HCCL5对比，发现HCCL5更亮，且有功能意义，故将HCCL5片段进行RACE扩增其全长序列(图1)。
实施例2：PCR扩增全长基因
1)制备抽提制备人肝细胞癌HepG2细胞RNA；
2)以RNA为模板合成3’RACE cDNA模板，使用以下引物进行PCR获得3’RACE产物；
HCCL5的3’RACE引物3L3核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2；
HCCL5的3’RACE巢式PCR引物：3L3N核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3
3)以RNA为模板合成5’RACE cDNA模板，使用以下引物进行PCR获得5’RACE产物；
HCCL5的5’RACE引物5L3核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4；
HCCL5的5’RACE巢式PCR引物5L3N核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5；
4)通过5’RACE及3’RACE序列拼接，得到全长序列。
按照常规RACE方法，准备RACE相关试剂，进行RACE扩增；以RACE产物为模板，进行Nest-PCR扩增，3’RACE和5’RACE扩增结果(图2A、B)拼接后成功获得HCCL5基因的全长序列；通过生物信息学分析比对后判断该基因为长链非编码RNA，含多聚A尾，全长为823bp，位于人类基因组16号染色体p13.13区域，由两个外显子构成(图2C)；通过Northern blot杂交确定RACE扩增所得片段已为该基因的全部长度，并且真实存在(图2D)；初步命名为lncRNAHCCL5。
实施例3：lncRNA HCCL5基因全长的获得及真核表达载体的构建
设计PCR引物扩增lncRNA HCCL5的全长，引物上分别加入Hind III与Xho I酶切位点，所得片段连接至pcDNA3.1(+)真核表达载体，扩增引物核苷酸序列见核苷酸序列表SEQID NO.2、NO.5。扩增所得片段，经过常规的酶切，连接等操作，插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体。获得的重组质粒，经DNA测序进行确定，结果显示重组质粒正确，可以用于后续研究。
实施例4：lncRNA HCCL5基因过表达后对肝细胞癌细胞的影响
将成功构建的lncRNA HCCL5过表达载体转染至生长状态良好的肝细胞癌细胞HepG2和SMMC-7721。HepG2和SMMC-7721细胞接种于24孔板中，每孔2.2×105个细胞，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，待培养细胞生长至90％融合度即可开始转染。
48小时后加入G418抗生素筛选，半个月后挑取单克隆进行扩大培养。细胞数量足够后抽提RNA逆转录成cDNA，PCR鉴定出lncRNA HCCL5稳定表达的肝细胞癌细胞系用于后续实验(图4A)。
a.CCK-8实验检测lncRNA HCCL5对肝细胞癌细胞增殖的影响
取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各1000个分别加入96孔板中，5％血清的完全培养基培养。每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2h后测定450nm处的各孔吸光度，连续检测7天，并进行统计。通过CCK-8实验分析发现HepG2和SMMC-7721促进细胞的增殖速度(图5A)。
c.克隆形成实验检测lncRNA HCCL5过表达后对肝细胞癌细胞集落形成的影响
取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各200个分别加入6孔板中，5％血清的完全培养基培养连续培养10天，结晶紫染料染色20分钟观察克隆形成情况。显微镜下观察，大于50个细胞的细胞集落计为有效克隆，并进行统计。
集落形成实验发现有效克隆的个数或者说克隆形成率显著增加，恶性程度增加(图5C，D)。
b.流式细胞术检测lncRNA HCCL5对肝细胞癌细胞增殖的影响
取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各5×106个，充分打散为单个细胞，D-Hanks液洗涤细胞3次，分别加入-20℃预冷的75％乙醇固定。检测前用含有0.01％RNase和0.5％碘化丙锭的溶液4℃处理细胞20分钟，于488nm激发波下检测细胞各周期DNA含量。
流式细胞术分析发现lncRNA HCCL5增加表达后，细胞G1期数量减少，S期数量明显上升，其恶性程度明显增加(图7)。
d.细胞形态变化
取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各2×105个分别加入6孔板中，10％血清的完全培养基培养至合适密度。荧光显微镜下观察细胞形态的改变情况。
细胞形态变化结果显示lncRNA HCCL5表达增加后潜在地发生上皮间质转换(图10)。
e.伤口愈合实验检测细胞的迁移能力
取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各1×106个分别加入6孔板中，10％血清的完全培养基培养24小时后进行划痕。划线后使用D-Hanks液洗涤2次去除脱落的细胞，加入1％血清的完全培养基连续培养48小时，观察细胞迁徙的情况。
伤口愈合实验显示lncRNA HCCL5表达增加后肝细胞癌细胞的侵袭转移能力均明显提高，恶性程度增加(图10)。
f.Transwell实验
1)细胞迁徙实验：取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各4×104个悬浮于无血清培养基中，加至无基质胶的Transwell小室中，下室24孔板每孔加入500μL的10％血清的完全培养基，连续培养48小时后染色观察细胞穿过Transwell小室的情况，随机多个视野下计数统计。
2)细胞侵袭实验：取对数生长期的过表达lncRNA HCCL5的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞、转染对照质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞以及未转染质粒的肝细胞癌HepG2和SMMC-7721细胞各4×104个悬浮于无血清培养基中，加至铺好基质胶(稀释比1：8)的Transwell小室中，下室24孔板每孔加入500μL的10％血清的完全培养基，连续培养48小时后染色观察细胞穿过Transwell小室的情况，随机多个视野下计数统计。
Transwell实验均明确显示lncRNA HCCL5表达增加后肝细胞癌细胞的侵袭转移能力均明显提高，恶性程度增加(图12)。
该实施例数据显示，lncRNA HCCL5过表达的增加促进肿瘤的恶性程度，有作为临床诊断辅助指标的应用前景。
实施例5：lncRNA HCCL5的RNA干扰靶点及短发夹寡核苷酸序列设计
根据新克隆的lncRNA HCCL5序列，应用RNAi设计软件，寻找该lncRNA的最佳的靶点，得到4个最佳干扰靶点序列，见表1：
表1
Figure GDA0002487765050000091
Figure GDA0002487765050000101
按照以上靶点合成siRNA，瞬时转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721和HCCLM3细胞，筛选有效的干扰靶点，最后确认RNAi-1和RNAi-2均为有效干扰位点。
针对RNAi-1和RNAi-2干扰靶点，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，其退火后复性可形成两端分别带BamH I和Hind III限制性酶切位点的DNA双链。所合成的各条寡核苷酸序列如表2：
表2
短发夹shRNA序列名称 序列表中SEQ ID
shRNA-1 11
shRNA-2 12
将上述2条单链互补寡核苷酸序列，溶解至等浓度，互补单链各取10μL混合，95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链DNA片段。将退火所得的双链DNA片段以合适的方法克隆到pGPU6/GFP/Neo对照载体质粒中，将得到的质粒转染生长状态良好的肝细胞癌细胞SMMC-7721和HCCLM3，筛选稳定转染的细胞系。
成功转染shRNA-1和shRNA-2干扰质粒并筛选获得干扰lncRNA表达的细胞系用于后续实验(图4B)。
实施例6：抑制lncRNA HCCL5表达后对肝细胞癌细胞的影响
以下lncRNA HCCL5抑制表达后对肝细胞癌细胞的影响实验同实施例3中所列实验，实验证明lncRNA HCCL5促进肝细胞癌的增殖能力，同时增强肝细胞癌细胞的侵袭与转移能力。在抑制lncRNA HCCL5表达后，利用克隆形成实验检测其对肝细胞癌细胞集落形成的影响，通过伤口愈合实验、Transwell实验研究lncRNA HCCL5抑制表达后对肝细胞癌细胞侵袭与转移的影响，进而探讨以lncRNA为突破口进行基因治疗的可行性。
结果显示lncRNA HCCL5降低后CCK-8实验显示细胞生长减慢(图6A、B)；集落形成实验发现有效克隆的个数虽然明显减少，克隆大小减小，恶性程度降低(图6C、D)；细胞周期发生G1/S期阻滞(图7)；细胞形态由易转移且恶性程度较高的梭形转变为椭圆形，表现出正常上皮样特征(图9B)。伤口愈合实验以及Transwell实验均明显表明lncRNA HCCL5表达降低后肝细胞癌细胞的侵袭转移能力均明显降低(图11，图13)。
实施例7：动物实验进一步研究lncRNA HCCL5表达改变后对肝细胞癌细胞成瘤能力的影响
将32只4周龄的雄性BALB/c Nude小鼠随机平均分为4组，分别为lncRNA HCCL5过表达组(pcDNA3.1-L5)、过表达对照组(pcDNA3.1+)、shRNA-2干扰组(L5-shRNA 2)、干扰对照组(pGFU6/GFP/Neo-shNC)，取其稳定转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721，分别通过皮下注射200μL含5×106个相应组别细胞的细胞悬液溶液至小鼠体内。每天观察裸鼠，从肉眼可见肿瘤开始，每隔一天测量肿瘤大小。饲养4周后处死取肿瘤，观察组织结构变化及成瘤情况，通过动物实验进一步研究以lncRNA做为临床诊断辅助标准及基因治疗靶点的可行性。
将lncRNA HCCL5过表达组(pcDNA3.1-L5)、对照质粒对照组(pcDNA3.1+)、lncRNAHCCL5干扰组(L5-shRNA 2)和对照质粒对照组(pGFU6/GFP/Neo-shNC)的稳定转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721分别通过皮下注射接种于雄性BALB/c裸鼠。每天观察裸鼠，从肉眼可见肿瘤开始，每隔一天测量肿瘤大小，4周后处死取肿瘤。结果如示，与对照载体(pcDNA3.1)组相比，lncRNA HCCL5过表达(pcDNA3.1-L5)后肿瘤尺寸明显增大(图2-14A,C)。与对照载体组(pGU6/GFP/Neo-shNC)相比，lncRNA HCCL5干扰(L5-shRNA 2)后肿瘤尺寸显著减小(图2-14B,D)。该结果表明，lncRNA HCCL5过表达促进裸鼠成瘤能力，干扰则抑制肿瘤形成。
动物实验结果表明lncRNA HCCL5表达量增加后肝细胞癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力会明显提高，使其恶性程度增加，未来lncRNA HCCL5可被用于临床诊断的参考指标；而抑制该lncRNA的表达可有效减弱肿瘤细胞在动物体内的成瘤能力，使其恶性程度明显降低，抑制该lncRNA的表达可做为基因治疗抑制肿瘤转移的一个有效手段。
实施例8：动物实验进一步研究lncRNA HCCL5表达改变后对肝细胞癌细胞转移能力的影响
将24只4周龄的雄性BALB/c Nude小鼠随机平均分为4组，分别为lncRNA HCCL5过表达组(pcDNA3.1-L5)、过表达对照组(pcDNA3.1+)、shRNA-2干扰组(L5-shRNA 2)、干扰对照组(pGFU6/GFP/Neo-shNC)，取其稳定转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721，通过尾静脉分别注射200μL含5×106个相应组别细胞的生理盐水溶液至小鼠体内。饲养8周后处死观察肿瘤肺部转移情况，解剖显微镜下统计肺部转移形成的肿瘤结节数，组织切片HE染色观察组织结构变化情况，通过动物实验进一步研究以lncRNA做为临床诊断辅助标准及基因治疗靶点的可行性。
肺转移模型实验结果显示，lncRNA HCCL5过表达组肺部表面结节数明显多于对照组，其干扰组肺部表面结节数则明显少于对照组(图15)。
动物实验结果表明lncRNA HCCL5表达量增加后肝细胞癌细胞在裸鼠体内的侵袭转移能力会明显提高，使其恶性程度增加，未来lncRNA HCCL5可被用于临床诊断的参考指标；而抑制该lncRNA的表达可有效减弱肿瘤细胞在动物体内的侵袭转移能力，使其恶性程度明显降低，抑制该lncRNA的表达可做为基因治疗抑制肿瘤转移的一个有效手段。
实施例9：统计学分析
所有数据用均数±标准差(mean±SD)形式表示，n≥3。其中，两两比较采用student t检验，多组之间比较采用ANOVA方差分析，当p<0.05，认为差异有统计学意义。用图像分析软件Image lab进行半定量分析，用统计学软件SPSS 17.0进行数据分析，GraphPad Prism 5绘制统计图表。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学
<120> 一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 823
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
caugcguaga uaaaaguaaa uaaacgcccu caaguuagga augaacggag gaaauggguu 60
aaacgagaau aaauaauuga aggcagagag guaaagaacu uccucuuuca acgcaucuca 120
aaauuuggcg uggaugcaga ucaccuacag aguaugauua uucaucuuua cauugccuug 180
uuuugagaug augaaacuga gguucaagcc aaugacaagc cugaagccac auggcuagug 240
aguggcagag ucagaacuca aacccaaauc caccugaccc caaacuucau guaucuugaa 300
cuacaggcuc caucucacug uucacacucu cacccaccuc cacccaucaa aggugccucu 360
agaccuuugc uuguguuguu uguucucugc cugacaugcc ucccccucag ucgcucucag 420
uugaaaccug gcuuagucau caagugccug cucagcagca agaccucuuc ucuucacgga 480
gccuuuguug agccccacca cuggaauuaa ccucuuccuu ccagaccagu uugguggugc 540
cccuaaucca caguuuccca accucagccc uacugacacu ggggcuggau aaucuuuguc 600
gugggggcug ucgugugcac ugcaggauau ggagcaguac cccugcuuuc cacccacgag 660
augccauggc acccuccuca aguugcgaca accaaaauau gucuucagac auugccacug 720
uccccuaggg uacuaaauca ccucuaugga gaaccacugu ccuaagcuac aauacucacu 780
gcccucuguu uugagccuaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 823
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agaactcaaa cccaaatcca cctgaccc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acctggctta gtcatcaagt gcctgctc 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agggctgagg ttgggaaact gtggatt 27
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
agttctgact ctgccactca ctagccatg 29
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<211> 823
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
catgcgtaga taaaagtaaa taaacgccct caagttagga atgaacggag gaaatgggtt 60
aaacgagaat aaataattga aggcagagag gtaaagaact tcctctttca acgcatctca 120
aaatttggcg tggatgcaga tcacctacag agtatgatta ttcatcttta cattgccttg 180
ttttgagatg atgaaactga ggttcaagcc aatgacaagc ctgaagccac atggctagtg 240
agtggcagag tcagaactca aacccaaatc cacctgaccc caaacttcat gtatcttgaa 300
ctacaggctc catctcactg ttcacactct cacccacctc cacccatcaa aggtgcctct 360
agacctttgc ttgtgttgtt tgttctctgc ctgacatgcc tccccctcag tcgctctcag 420
ttgaaacctg gcttagtcat caagtgcctg ctcagcagca agacctcttc tcttcacaga 480
gcctttgttg agccccacca ctggaattaa cctcttcctt ccagaccagt ttggtggtgc 540
ccctaatcca cagtttccca acctcagccc tactgacact ggggctggat aatctttgtc 600
gtgggggctg tcgtgtgcac tgcaggatat ggagcagtac ccctgctttc cacccacgag 660
atgccatggc accctcctca agttgcgaca accaaaatat gtcttcagac attgccactg 720
tcccctaggg tactaaatca cctctatgga gaaccactgt cctaagctac aatactcact 780
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 7
cacctacaga gtatgattat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
caaacttcat gtatcttgaa c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
catcaaaggt gcctctagac c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cagtcgctct cagttgaaac c 21
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gcacctacag agtatgatta tttcaagaga ataatcatac tctgtaggtg ttttttg 57
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gcaaacttca tgtatcttga acttcaagag agttcaagat acatgaagtt tgttttttg 59

Claims (10)

1.一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种扩增、检测权利要求1所述长链非编码RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N、5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N；所述3’RACE引物3L5序列如SEQ ID NO.2所示，所述3’RACE巢式PCR引物3L5N序列如SEQ IDNO.3所示，所述5’RACE引物5L5序列如SEQ ID NO.4所示，所述5’RACE巢式PCR引物5L5N序列如SEQ ID NO.5所示。
3.基于权利要求2所述试剂盒扩增、检测权利要求1所述长链非编码RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N进行PCR获得3’RACE产物；以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N进行PCR获得5’RACE产物；
(2)将3’RACE产物与5’RACE产物拼接，获得长链非编码RNA。
4.如权利要求1所述长链非编码RNA在制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌试剂或药物中的应用。
5.一种编码权利要求1所述长链非编码RNA的DNA，其特征在于，所述DNA序列如SEQ IDNO.6所示。
6.一种用于权利要求1所述长链非编码RNA中siRNA的作用靶序列，其特征在于，所述靶序列的序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10任一所示。
7.如权利要求6所述的靶序列在制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌疾病的药物中的应用。
8.一种用于权利要求1所述长链非编码RNA中RNAi用的短发夹片段shRNA，其特征在于，所述短发夹片段shRNA的序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。
9.如权利要求8所述的短发夹片段shRNA在制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌疾病的药物中的应用。
10.一种载体或重组子，其特征在于，所述载体或重组子中包含权利要求1、5、6、8任一项所述的序列。
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