CN108619530B - SNORA18L5在肝癌风险预警及抑制SNORA18L5的siRNA在抑制肝癌生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了试剂在制备药物中的用途、SNORA18L5作为肝癌风险预警标志物中的用途以及抑制SNORA18L5表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用。所述试剂用于沉默SNORA18L5，所述药物用于下列的至少之一：促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制18S和28S rRNAs的成熟；抑制核糖体的生物合成；促进p53的表达；抑制MDM2对p53的泛素化；促进RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11的细胞核仁‑核质易位。用于沉默SNORA18L5的试剂在促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制18S和28S rRNAs的成熟；抑制核糖体的生物合成；促进P53的表达；抑制MDM2对p53的泛素化；促进RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11细胞核仁‑核质易位方面效果显著。

Description

SNORA18L5在肝癌风险预警及抑制SNORA18L5的siRNA在抑制 肝癌生长中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及试剂在制备药物中的用途、SNORA18L5作为肝癌风险预警标志物中的用途以及抑制SNORA18L5表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用。
背景技术
原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，90％以上的原发性肝癌为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC；以下简称肝癌)。据世界卫生组织统计，全球各地肝癌的发病率近年来都呈上升趋势。我国是肝癌高发国家，每年新发病例约30万，约占全球肝癌新发病例的半数以上。肝癌属于多因素复杂疾病，是病毒因素、环境因素和机体的遗传因素交互作用，经过多个阶段的发展而产生的。在我国，慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染仍是肝癌发生的最主要原因，超过80％的肝癌与慢性乙型肝炎相关，但在乙肝患者中，只有小部分个体最终罹患肝癌，提示机体的遗传因素也是肝癌发生的重要原因。此外，肝癌的发生存在显著的家族聚集性和遗传易感性，其发病率呈患者的一级亲属、二级亲属和普通人群递减的趋势；移民流行病学、家系的分离和连锁分析以及遗传关联研究的结果也表明机体的遗传因素在肝癌的发病中起重要作用。发现和鉴定肝癌的致病/易感基因，研究其与肝癌发生、临床转归和预后等之间的关系，不仅有助于阐明肝癌形成的病理机制，而且对于肝癌新的防、诊、治措施的研发有着极为重要的意义。
小核仁RNAs(small nucleolar RNAs,snoRNAs)是一类发现较早的非编码RNAs，定位于细胞核内。SnoRNAs的传统作用与其对rRNAs的修饰及功能发挥有关。除此之外，包括snRNAs、tRNAs以及mRNAs在内的多种RNAs均可作为snoRNAs的作用靶点。snoRNAs在发挥其核内rRNAs修饰作用，进而参与核糖体RNA的成熟和合成。另外，研究人员发现，某些snoRNAs在肿瘤的发生发展中同样具有重要意义，在其他疾病的诊断以及治疗应用方面也具有深远的研究价值和良好的应用前景。
snoRNAs按照结构、基因序列、结合蛋白组分以及对rRNAs修饰功能的不同分为四类，其中数量最多且功能研究较深入的有box H/ACA snoRNAs和box C/D snoRNAs两大类，特异性小卡扎尔体RNAs(small Cajal RNAs,scaRNAs)及孤儿型snoRNAs(orphan snoRNAs)数量相对较少。
Box H/ACA snoRNAs普遍长于box C/D snoRNAs，约120～250nt，主要作用是对rRNAs残基的假尿嘧啶进行修饰。这组分子经过折叠后可形成两个特异的发夹结构。通过铰链结构[ANANNA](也就是H box)连接。另一种二级结构成分由ACA序列组成，位于距离分子3′末端3个碱基的位置。分子内部形成的茎环结构可被假尿苷酸转移酶活性识别，主要用于保证假尿苷酸化。这两种结构共同组成了此类snoRNAs的特征性二级结构“发卡-铰链-发卡-尾端结构”。该结构在snoRNAs的加工、稳定、假尿嘧啶修饰功能以及snoRNAs在核仁内的定位过程中发挥着至关重要的作用。
Box C/D snoRNAs长约60～200nt,具有特异的保守序列C box[RUGAUGA]及Dbox[CUGA]。C box与D box分别位于RNA分子的5’末端和3’末端。借助两末端所具有的茎状结构，分子进一步折叠，将C box与D box聚集于相邻空间区域，是功能蛋白(例如纤维蛋白转甲基酶)结合的重要识别位点。该结构被证实在snoRNAs的加工形成、稳定性的维持、甲基化修饰活性的发挥、核仁内的定位以及5’帽状结构的超甲基化修饰中均发挥关键作用。除此之外，此类snoRNAs中还存在一组保守性相对较低的序列，即C’box和D’box基因序列。C’box与D’box之间或相距3～9nt，或通过内部形成的茎环结构被聚集到相邻区域，C’box以及D’box位于距离rRNA修饰位点前5个碱基的位置，对RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的形成起到重要作用。
很多snoRNAs在一些肿瘤以及艾滋病等病毒感染性疾病中表达水平出现明显改变。例如，U3在上皮类肿瘤中表达量较高；H/ACA box snoRNAs(SNORA42)参与非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)的发生，在癌症发生过程中表达量显著上调。以上内容说明snoRNAs的异常与很多疾病存在相关性。除此之外，snoRNAs的宿主基因与疾病的发生之间同样具有密切的相关性，如SNORD44的宿主基因GAS5在头颈部鳞状细胞肿瘤以及乳腺癌中均显著下调，这进一步加深了人们对于snoRNAs与疾病之间相关关系重要性的认识。综上所述，snoRNAs分子，特别是其衍生的sdRNAs在未来疾病的临床诊断以及治疗中可能具有较好的应用价值。另外，snoRNAs在细胞周期以及正常生命活动中发挥重要的生理功能。这不仅与snoRNAs通过snoRNP作用于rRNAs有关，同时还可能与sdRNAs的转录后调控功能相关。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：
申请人进行了全基因组水平的SNP和CNV扫描，又通过多种分析软件和算法进行系统的CNVs推算，并进行了这些CNVs与肝癌易感性的遗传相关性分析，进一步样本验证和荧光定量PCR验证，最后通过Ensembl和UCSC网站的Genes and Gene Prediction Tracks分析，在15q13.3CNV区段内部发现一个核仁小分子RNA(Small nucleolar RNA,snoRNA)基因SNORA18L5。分析结果提示，15q13.3CNV可能是SNORA18L5基因表达个体差异的分子遗传学基础，该CNV的扩增可能影响SNORA18L5的表达，进而影响肝癌的发生和发展。
在本发明的第一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述试剂用于沉默SNORA18L5，所述药物用于下列的至少之一：促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制18S和28S rRNAs的成熟；抑制核糖体的生物合成；促进p53的表达；抑制MDM2对p53的泛素化；促进RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11细胞核仁-核质异位。发明人通过实验发现，在肿瘤细胞中SNORA18L5的拷贝数增多，促进了核糖体RNA的加工成熟和核糖体的生物合成，更多的核糖体蛋白(RPL5和RPL11)从细胞核质穿梭到细胞核仁参与核糖体的生物合成，进而与MDM2结合的核糖体蛋白(RPL5和RPL11)减少，更多的MDM2与p53结合促进了p53的泛素化降解，使p53的稳定性和表达降低，最终促进肿瘤细胞的生长并且抑制肿瘤细胞的凋亡。进而用于沉默SNORA18L5的试剂在促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制18S和28SrRNAs的成熟；抑制核糖体的生物合成；促进p53的表达；抑制MDM2对p53的泛素化；促进RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11细胞核仁-核质异位方面效果显著。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述细胞为肝癌细胞。进而用于沉默SNORA18L5的试剂对于促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制18S和28S rRNAs的成熟；抑制核糖体的生物合成；促进p53的表达；抑制MDM2对p53的泛素化；促进RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11细胞核仁-核质异位的效果更加显著。
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防肝癌。用于沉默SNORA18L5的试剂所制备的药物用于治疗或预防肝癌的效果佳。
根据本发明的实施例，所述沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一实现的。上述方式的至少之一可有效实现SNORA18L5的特异性沉默。
根据本发明的实施例，所述沉默是通过shRNA实现的，所述试剂具有SEQ ID NO：1～2至少之一所示的核苷酸序列。
UUCCUGUAGCCUGCACGUU(SEQ ID NO：1)。
GAAGGAACCACAAGACAGU(SEQ ID NO：2)。
进而实现SNORA18L5的特异性沉默和敲低。
在本发明的第二方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述试剂用于过表达SNORA18L5，所述药物用于下列的至少之一：促进细胞G1/S期、抑制细胞凋亡；促进细胞的生长；促进18S和28S rRNAs的成熟；促进核糖体的生物合成；抑制p53的表达；促进MDM2对p53的泛素化；抑制RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11的核仁转移。发明人通过实验发现，在正常状态下SNORA18L5处于稳定状态，成熟的核糖体18S、5.8S和28S与从细胞核仁-核质异位到细胞核仁中的核糖体蛋白一起形成成熟的核糖体40S小亚基和60S大亚基。在外界核糖体应激压力下，游离状态的核糖体蛋白(包括RPL5、RPL11等)增多，此时从细胞核仁穿梭到细胞核质中的核糖体蛋白增多，穿梭到细胞核质中的核糖体蛋白与MDM2结合，使得与p53结合的MDM2减少，而导致p53的稳定性增强、表达增多，最终抑制细胞生长、引发细胞凋亡。在肿瘤细胞中SNORA18L5的拷贝数增多，促进了核糖体RNA的加工成熟和核糖体的生物合成，更多的核糖体蛋白(RPL5和RPL11)从细胞核质穿梭到细胞核仁参与核糖体的生物合成，进而与MDM2结合的核糖体蛋白(RPL5和RPL11)减少，更多的MDM2与p53结合促进了p53的泛素化降解，使p53的稳定性和表达降低，最终促进肿瘤细胞的生长并且抑制肿瘤细胞的凋亡。进而，过表达SNORA18L5的试剂用于促进细胞G1/S期、抑制细胞凋亡；促进细胞的生长；促进18S和28S rRNAs的成熟；促进核糖体的生物合成；抑制P53的表达；促进MDM2对p53的泛素化；抑制RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；以及促进RPL5和RPL11的核仁转移方面效果显著。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂为携带有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸的载体。
5’-GTTGAGGTCTATCCCGATAGGTCTTTTCCTGTAGCCTGCACGTTGTTGGAAATGCCTCATAGAGTAACTCTGTGATTTTACTTTACTTACAGGACTATTGTTACATCTGTGGGAAGGAACCACAAGACAGTT-3’(SEQ IDNO：3)。
将上述试剂导入受体细胞，可实现SNORA18L5在受体细胞的过表达。
根据本发明的实施例，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在本发明的第三方面，本发明提出了SNORA18L5作为癌症细胞生物标志物中的用途。发明人发现，SNORA18L5在肿瘤细胞中的拷贝数明显高于癌旁正常组织，高表达的SNORA18L5可作为区分正常细胞和癌细胞的生物标志物。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述癌症细胞为肝癌细胞。发明人发现，肝癌细胞中的SNORA18L5基因表达水平明显高于正常细胞，SNORA18L5作为肝癌细胞的生物标志物可信度更高。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选药物与癌细胞进行接触；以及检测所述接触前后，癌细胞中SNORA18L5的表达量，其中，所述接触后癌细胞中SNORA18L5的表达量低于所述接触前癌细胞中SNORA8L5的表达量，是候选药物为目标药物的指示。根据本发明的实施例，癌细胞中SNORA18L5表达量显著高于正常细胞，敲低SNORA18L5可抑制癌细胞的生长，利用根据本发明实施例的上述筛选药物的方法，获得的目标药物可有效用于抑制癌细胞的生长，有效用于治疗或预防癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症为肝癌。利用根据本发明实施例的上述方法筛选获得的药物用于治疗肝癌，疗效更加显著。
附图说明
图1是根据本发明实施例的SNORA18L5在肝癌中高表达且与肝癌的低生存率显著相关的结果图；
图2是根据本发明实施例的稳定细胞株中SNORA18L5的表达鉴定结果图；
图3是根据本发明实施例的体外实验证明SNORA18L5促进肝癌细胞系的生长的结果图；
图4是根据本发明实施例的体内裸鼠皮下成瘤实验证明SNORA18L5促进肝癌细胞系的生长的结果图；
图5是根据本发明实施例的SNORA18L5抑制细胞周期阻滞和细胞凋亡的结果图；
图6是根据本发明实施例的SNORA18L5的特征的结果图；
图7是根据本发明实施例的SNORA18L5促进rRNA的成熟进而加快核糖体的生物合成的结果图；
图8是根据本发明实施例的SNORA18L5过表达或敲低均不影响核仁的结构的结果图；
图9是根据本发明实施例的SNORA18L5过表达后p53的表达减低的结果图；
图10是根据本发明实施例的SNORA18L5对细胞周期和细胞凋亡的影响是p53依赖的结果图；
图11是根据本发明实施例的在Huh7细胞中过表或敲低SNORA18L5后细胞周期、凋亡和生长无显著变化的结果图；
图12是根据本发明实施例的HCC样本中SNORA18L5表达和p53突变与患者总体生存率(OS)和无病生存率(DFS)的分析的结果图；
图13是根据本发明实施例的SNORA18L5通过蛋白酶体途径抑制p53的表达的结果图；
图14是根据本发明实施例的SNORA18L5促进MDM2对p53的泛素化抑制p53的表达的结果图；
图15是根据本发明实施例的SNORA18L5可以抑制RPL5和RPL11的核仁-核质易位的结果图；
图16是根据本发明实施例的SNORA18L5可以抑制RPL5和RPL11与MDM2的相互作用的结果图；
图17是根据本发明实施例的SNORA18L5依赖于RPL5和RPL11发挥促癌功能的结果图；以及
图18是根据本发明实施例的SNORA18L5依赖促癌作用的机制图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
肿瘤的细胞生物学行为包括肿瘤细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭等。在正常机体中，新生细胞的生长与分裂和衰老细胞的死亡受到精细的调控，两者在动态平衡中维持组织和器官的稳定，而细胞生长和/或死亡调控的紊乱会破坏这一平衡，最终导致肿瘤的产生。细胞周期是细胞生长增殖的基础，细胞周期调控紊乱是癌症发生发展的另一重要生物学事件。许多调控细胞周期进程、细胞周期监测点(Cell cycle checkpoint)的蛋白及其介导的信号通路的失控已被证明直接参与肿瘤的发生与发展，因而是肿瘤相关基因。
为探讨CNV在肝癌发生发展过程中扮演的角色，发明人前期首先运用AffymetrixSNP 5.0芯片对来自广西扶绥的348名肝癌患者和359名正常对照个体进行了全基因组水平的SNP和CNV扫描，又通过多种分析软件和算法对这707个个体进行了系统的CNVs推算，并进行了这些CNVs与肝癌易感性的遗传相关性分析，发现了14个在两组人群间有显著频率差异的CNVs。进一步运用CNVplexTM大规模分型技术和实时荧光定量PCR技术在分别来自广西南宁、北京和上海的3个独立的肝癌病例-对照人群中进行重复验证，最终发现其中一个位于15q13.3区域的扩增型CNV在各人群中均显示与肝癌的发生风险显著相关(Overall P＝2.3×10-7)。
发明人又进一步应用实时荧光定量PCR技术在来自广西的肝癌核心家系人群(Nuclear family trios)中对15q13.3CNV的可遗传性进行了分析，结果检测到6例发生扩增的先证者，而其中5例的母亲也在这一位点发生了扩增，1例的父亲发生了扩增，提示该CNV是可遗传的(Heritable)。对检测结果为拷贝数扩增的样本，发明人采用实时荧光定量PCR技术，设计一系列引物，在扩增样本中进行检测以确定CNV区域的断点范围，最终将15q13.3CNV区域的最小范围缩至16,456bp，定位于chr15:29,997,395-30,013,851(NCBI36/hg18)。在此基础上，通过Ensembl和UCSC网站的Genes and Gene PredictionTracks分析，在15q13.3CNV区段内部发现一个核仁小分子RNA(Small nucleolar RNA,snoRNA)基因SNORA18。上述结果提示，15q13.3CNV可能是SNORA18基因表达个体差异的分子遗传学基础，该CNV的扩增可能影响SNORA18的表达，进而影响肝癌的发生和发展。
SnoRNAs是非编码RNA类别之一，研究已证明其主要位于细胞核内，参与核糖体RNA及其他RNA的转录后修饰，在核糖体的生物合成中发挥着重要的作用。已有多个snoRNAs被报道与肝癌及其他肿瘤的发生发展密切相关。目前还没有与SNORA18L5相关的研究报道。在下列实施例中，发明人将从临床、体内、体外三方面的研究证明SNORA18L5在肝癌发生中的重要作用及在在肝癌发生发展中的生物学行为。
实施例1 SNORA18L5在肝癌组织中表达上调，且与患者的不良预后显著相关
为了探究SNORA18L5在肝癌发生中的作用，首先，发明人检测了正常肝细胞系及肝癌细胞系中SNORA18L5的mRNA水平，发现与正常的肝细胞系L-02相比SNORA18L5在HepG2、BEL-7402等七个肝癌细胞中显著高表达(如图1a)。其次，发明人收集了123对HBV相关肝癌样本及其相应的癌组织，提取其中的小RNA，后进行qRT-PCR检测SNORA18L5的mRNA水平，发现SNORA18L5在HBV相关肝癌中表达显著高于其对应的癌旁组织(P＝0.013，如图1b)。对独立数据集GSE69164中正常的肝组织(normal liver tissue,NL)和肝癌组织(HCC)中SNORA18L5的表达情况进行分析，发现SNORA18L5在HCC中的表达显著高于在NL中的表达(P＝0.028，如图1c)。对独立数据集GSE54537中肿瘤的纤维组织(fibrinous capsule of thetumor,TC)、肿瘤附近的肝组织(tumor-adjacent liver parenchyma,LP)、与肿瘤相邻的肝硬化组织(cirrhotic septa of the tumor-adjacent liver,LC)和肿瘤组织(tumorparenchyma,TP)中SNORA18L5的表达情况进行分析，发现SNORA18L5在肿瘤组织中的表达显著高于在其他组织中的表达(P＝0.037，如图1d)。进一步地，对123对HCC样本的临床资料进一步分析发现，SNORA18L5与临床应用广泛的肝癌诊断标志物甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、肝癌病理组织分期(TNM分期)及血管侵犯有一定的相关性。血清中AFP>200ng/mL的肝癌患者癌组织中SNORA18L5相对表达水平明显高于血清中AFP≤200ng/mL的肝癌患者(P＝0.018，如表1)。肿瘤直径>5cm的肝癌患者癌组织中SNORA18L5相对表达水平明显高于直径≤5cm的肝癌患者(P＝0.034，如表1)。病理组织分期较高的HCC患者SNORA18L5的表达水平明显高于较低的HCC患者(P＝0.03，如表1)。发生血管侵犯的肝癌患者癌组织中SNORA18L5相对表达水平显著高于未发生血管侵犯的肝癌患者(P＝0.041，如表1)。以上实验说明，SNORA18L5在HBV相关肝癌中高表达并与肝癌不良预后显著相关，提示其可能在肝癌的发生中发挥促癌的功能。
表1：
实施例2 稳定敲低/过表达SNORA18L5细胞株的建立
为了研究SNORA18L5在肝癌中的生物学行为及其相应的分子机制，首先发明人针对SNORA18L5设计了两对shRNA序列(如表2)，将其构建到慢病毒载体pLV-Luc-puro上，包装慢病毒后感染肝癌细胞系HepG2、Bel-7402和SMMC-7721，用Puro进行筛选后得到稳定敲低SNORA18L5的细胞株。得到稳定细胞株后，提取RNA进行qRT-PCR鉴定，发现两个shRNA片段均能将SNORA18L5的表达水平敲低70％以上(如图2a)，可以用于后续实验。
为了全面分析SNORA18L5的功能，发明人同时将SNORA18L5构建到了稳定过表达的慢病毒载体pCMV上，包装慢病毒后感染正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2，用Puro进行筛选后得到稳定过表达SNORA18L5的细胞株(如图2b)。
表2：SNORA18L5的shRNA序列信息
编号 序列信息(从5’到3’)
敲低18L5-#1 UUCCUGUAGCCUGCACGUU(SEQ ID NO：1)
敲低18L5-#2 GAAGGAACCACAAGACAGU(SEQ ID NO：2)
实施例3 SNORA18L5显著促进肝癌细胞的生长
多年的研究发现，SnoRNAs是非常经典的非编码RNA(ncRNAs)之一，主要是通过影响核糖体RNA(rRNA)的转录后修饰来发挥功能。最近有多个研究发现SnoRNAs能够参与非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞肿瘤、乳腺癌等肿瘤的发生与发展。发明人的研究也发现了一个snoRNA即SNORA18L5与肝癌的发生密切相关，因此，发明人探究SNORA18L5对肝癌细胞的生物学行为的影响。通过CCK8实验和平板克隆形成实验，发明人发现过表达SNORA18L5后能够促进细胞的生长(如图3a)，增强平板克隆形成能力(如图3b)；而敲低SNORA18L5后能够抑制细胞的生长(如图3c)，减弱平板克隆形成能力(如图3d)。在稳定敲低SNORA18L5的细胞系中再次过表达SNORA18L5，细胞的生长能力得到恢复(如图3e)。
实施例4 SNORA18L5促进肝癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力
为了进一步证实SNORA18L5的促进肝癌细胞生长的功能，发明人进行了体内裸鼠皮下成瘤实验，将3×106个稳定过表达、敲低SNORA18L5的HepG2细胞分别注射入5周龄左右的雌性裸鼠皮下，待瘤块长至1cm3左右时，将裸鼠处死，取出瘤块，测量肿瘤的重量和长短径，后进行病理切片病理分析(HE)和免疫组织化学(IHC)等分析。发明人发现SNORA18L5过表达后促进HepG2细胞的裸鼠皮下成瘤能力(P<0.05，如图4a)，而SNORA18L5敲低后HepG2细胞的裸鼠皮下成瘤能力显著高于对照组细胞(P<0.01，如图4d)。发明人取出部分瘤块组织，提取RNA并鉴定了SNORA18L5的表达，发现在过表达组的瘤块中SNORA18L5的水平显著高于对照组(P<0.001，如图4b)，在敲低组的瘤块中SNORA18L5的水平显著低于对照组(P<0.01，如图4f)。病理HE分析发现裸鼠皮下形成的肿瘤确实是肝癌，同时ki67的IHC实验显示，在SNORA18L5过表达组的瘤块中ki67的比例显著高于对照组(如图4c)，而SNORA18L5敲低组的瘤块中ki67的比例显著低于对照组。促癌能力通过ki67的免疫组化进行了量化(如图4e)。通过体内裸鼠皮下成瘤实验，发明人进一步证实了SNORA18L5能够促进肝癌细胞的生长。
实施例5 SNORA18L5抑制细胞周期阻滞和细胞凋亡
细胞生长的减慢是由多方面的原因引起的，其中最主要的影响因素包括细胞周期紊乱和细胞凋亡的增加。为了探索SNORA18L5促进HCC细胞生长的诱导因素，发明人用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色借助流式细胞术的方法检测了SNORA18L5对HCC细胞周期的影响。检测发现，SNORA18L5过表达后促进了L-02和HepG2细胞G1/S的过渡(如图5a)，而抑制SNORA18L5表达后抑制HepG2和SMMC-7721细胞G1/S的过渡(如图5c)。另外，发明人借助流式细胞术用Annexin V APC/7-AAD双染法检测发现在600ng/mL的H2O2刺激下，SNORA18L5过表达后抑制了L-02和HepG2细胞凋亡(如图5b)，而抑制SNORA18L5表达后促进HepG2和SMMC-7721细胞凋亡(如图5d)。这一系列的实验证明SNORA18L5促进细胞G1/S期、抑制细胞凋亡从而促进肝细胞癌的发生。
在以上实施例中，首先分析了SNORA18L5在肝癌临床样本中的相关性分析，发现SNORA18L5在肝癌组织中的的表达显著高于癌旁组织，并且SNORA18L5的高表达与肝癌血清诊断标志物甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、肝癌病理组织分期(TNM分期)及血管侵犯具有显著的相关性。其次，发明人通过体外CCK8、平板克隆形成实验和体内裸鼠皮下成瘤实验均证明了SNORA18L5能够促进HCC细胞的生长。最后，发明人分别通过PI染色法和Annexin V APC/7-AAD双染法检测发现，SNORA18L5促进HCC细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡，进而促进了HCC细胞的生长。通过以上三方面的实验，发明人证实SNORA18L5是一个肝癌相关的癌基因。
然而，SNORA18L5发挥癌基因的具体机制是怎样的呢？目前还未见关于SNORA18L5生物学功能和机制的报道。已有报道snoRNA主要参与核糖体RNA的转录后修饰进而参与核糖体的生物合成进程，而核糖体合成的紊乱会引发核糖体应激进而影响核糖体蛋白在核仁及核质中游离分布飞状态，最终影响MDM2对p53的泛素化降解而使p53及其下游细胞周期和细胞凋亡相关通路紊乱。在以下实施例中，发明人首先利用原位间接免疫荧光技术分析SNORA18L5的定位等生物学特性，再利用免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等多种实验手段揭示SNORA18L5促进HCC生长的分子机制。
实施例6 SNORA18L5属于H/ACA box snoRNA
SNORA18L5是七个SNORA18-like形式的RNA之一，为了分析其类型，发明人用snOPY数据库的数据分析发现SNORA18L5包含H box(AnAnnA)和ACA box，是H/ACA box类型的ncRNAs(如图6a)。发明人从UCSC(http://genome.ucsc.edu/ENCODE)上的ENCODE分析中心下载了小RNA-seq的数据，分析了SNORA18L5、SNORA18和其他6个SNORA18-like snoRNAs在细胞核中的表达水平，发现SNORA18L5在细胞核中高表达(如图6b)。进一步的FISH间接免疫荧光实验也证实SNORA18L5定位在细胞核仁中(如图6c)。
实施例7 SNORA18L5促进rRNA的加工及核糖体的生物合成
已报导snoRNAs的功能主要是参与调控核糖体RNA(rRNAs)的假尿苷化和剪切进而影响核糖体的生物合成。因此，发明人试图探究SNORA18L5是否在在rRNA成熟过程中发挥重要所用。首先，发明人设计了一些列可以区分rRNAs前体和成熟的rRNAs的引物(如图7a)，进行qPCR检测发现在HepG2和SMMC-7721细胞中过表达SNORA18L5后成熟的18S和28S rRNAs的水平显著升高(如图7b)，而敲低SNORA18L5后18S和28SrRNAs的水平显著降低(如图7c)。进一步的Northern blotting实验也证实SNORA18L5促进18S和28S rRNAs的成熟(如图7d)，更有趣的是，SNORA18L5高表达能够显著地减弱放线菌素D(Act.D)引起的rRNA加工的缺陷(如图7e)，而敲低SNORA18L5后细胞对放线菌素D的刺激更加敏感(如图7e)。rRN成熟的扰动最终会影响核糖体的生物合成，因此发明人采用蔗糖密度梯度离心方法进行多核糖体分析实验，发现在HepG2和SMMC-7721细胞中过表达SNORA18L5后核糖体的生物合成加快(如图7f)，而敲低SNORA18L5后核糖体的生物合成减慢(如图7g)。以上实验证明SNORA18L5促进rRNA的成熟进而加快核糖体的生物合成。
实施例8 SNORA18L5不影响细胞核仁结构
为了探究SNORA18L5是否会影响核仁结构，发明人进行了间接免疫荧光实验发现无论敲低SNORA18L5还是过表达SNORA18L5核仁的结构均无显著变化。说明SNORA18L5通过影响rRNA的成熟进而加快核糖体的生物合成，而不会殃及核仁的结构(如图8)。
实施例9 SNORA18L5抑制p53表达，且发挥促癌功能依赖于p53
最近的研究发现核糖体合成的紊乱会扰动p53的稳定性进而引起p53依赖的细胞生长异常，因此发明人假设p53可能是SNORA8L5发挥功能的一个下游扰动分子。为了验证这种可能性，首先发明人检测了SNORA8L5对p53蛋白水平的影响。在HepG2和L-02 cells中过表达SNORA18L5后引起p53蛋白水平表达上调(如图9a)，而在HepG2和SMMC-7721细胞中敲低SNORA18L5后p53蛋白水平上调(如图9b)。同时，p53转录调控的下游与细胞周期相关的靶分子p21和与细胞凋亡相关的靶分子PUMA的蛋白水平也发生相应的变化(如图9a,b)。将裸鼠皮下瘤的肿瘤组织取出后，发明人进行了免疫组织化学实验，分析p53的蛋白表达情况，发现在SNORA18L5过表达的皮下瘤中p53的表达水平显著低于对照组(如图9c)，在SNORA18L5敲低的皮下瘤中p53的表达水平显著高于对照组(如图9d)
进一步地，发明人应用p53野生的p53+/+HCT116和p53缺失的p53-/-HCT116细胞检测SNORA18L5是否依赖p53来发挥其促癌功能。发现在p53+/+HCT116细胞中过表达SNORA18L5显著促进细胞G1/S期过渡(如图10a左)、抑制细胞凋亡(如图10a右)和细胞平板克隆形成能力(如图10b)；敲低SNORA18L5能够显著抑制细胞G1/S期过渡(如图10c左)、促进细胞凋亡(如图10d左)和细胞平板克隆形成能力(如图10e上)。但是，在p53-/-HCT116细胞中过表达或敲低SNORA18L5均不影响细胞的周期(如图10a左,c)、凋亡(如图10a右,d)和细胞平板克隆形成能力(如图10b,e)。
在p53野生的p53+/+HCT116和p53缺失的p53-/-HCT116细胞中发明人验证了SNORA18L5对细胞周期、凋亡和细胞生长的影响是依赖于p53的。那么在肝癌细胞中是否也存在同样的现象呢？在肝癌细胞Huh7中p53是突变的，失去了野生型p53的抑癌基因的功能，因此，发明人在Huh7细胞中过表达或敲低SNORA18L5后发现细胞周期(如图11a)、细胞凋亡(如图11b)和细胞平板克隆形成能力(如图11c)均无显著变化。综上所述，SNORA18L5对细胞周期、细胞凋亡和细胞生长的影响是依赖于p53的。
在123对肝癌样本汇中有101对肝癌样本有详细的随访资料，因此发明人对这101对样本进行了总体生存率(overall survival,OS)和无病生存率(disease-freesurvival,DFS)分析。发明人根据SNORA18L5的表达中值将101对样本分为SNORA18L5高表达组(High,n＝51)和SNORA18L5高表达组(Low,n＝50)，分析发现，SNORA18L5高表达的HCC患者总体生存率(P＝0.018)和无病生存率均很差(P＝0.076)。为了在临床样本中检测SNORA18L5发挥促癌功能是否依赖于p53，发明人对101对有随访信息的样本中进行了p53突变检测，根据p53突变与否发明人将肝癌样本分成p53野生的HCC样本(WT p53,n＝68)和p53突变的HCC样本(Mutated p53,n＝33)两组。在两组中分别根据SNORA18L5的表达高低进行分组进行生存期分析。分析发现只有在p53野生的HCC样本SNORA18L5的高表达与HCC患者的很差的总体生存率(P＝0.0095)和无病生存率相关(P＝0.094)相关，而在p53突变的HCC样本中SNORA18L5的高表达与HCC患者的生存率无显著变化(如图12)。综上所述，SNORA18L5在肝癌中发挥促癌功能是依赖于p53的。
实施例10 SNORA18L5通过蛋白酶体途径抑制p53的表达
发明人进一步探究SNORA18L5是如何影响p53表达的，首先发明人用qRT-PCR技术检测p53的mRNA水平，发现在L-02和HepG2中过表达或在HepG2和SMMC-7721细胞中敲低SNORA18L5后p53的mRNA水平均无显著变化(如图13a b)，说明SNORA18L5对p53的影响不在转录水平。用放线菌酮(CHX)处理细胞来抑制蛋白质的生物合成，后检测p53的稳定性，发现SNORA18L5过表达的HepG2细胞中p53的半衰期缩短(如图13c)，相应地，SNORA18L5敲低的细胞中p53的半衰期延长(如图13d)。说明SNORA18L5影响了p53的稳定性。发明人进一步用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞来抑制通过蛋白酶体途径引起的蛋白的降解，后检测发现MG132处理后SNORA18L5过表达或敲低均不再影响p53的蛋白表达水平(如图13e)，以上实验证明SNORA18L5通过蛋白酶体途径影响p53的表达。
实施例11 SNORA18L5促进MDM2对p53的泛素化抑制p53的表达
MDM2是一个E3泛素连接酶，使p53泛素化进而促进p53的降解，因此发明人探究SNORA18L5是否干扰MDM2介导的p53的泛素化降解。发明人在稳定过表达或敲低SNORA18L5的HepG2细胞中转染血球凝集素标记的泛素(HA-Ub)、Flag标记的p53(Flag-p53)和Myc标记的MDM2(Myc-MDM2)质粒，后进行免疫共沉淀和Western Blot实验来检测p53的泛素化水平。在免疫共沉淀前加入蛋白酶体抑制剂MG132，抑制泛素化蛋白的降解。检测发现SNORA18L5过表达后p53的泛素化水平降低(如图14a)而SNORA18L5敲低后p53的泛素化水平升高(如图14b)。进一步，发明人设计合成了MDM2的siRNA序列，在HepG2细胞中敲低MDM2后无论过表达还是敲低SNORA18L5，p53的蛋白水平均无显著变化(如图14c d)。以上实验证明SNORA18L5促进MDM2对p53的泛素化抑制p53的表达。
实施例12 SNORA18L5可以抑制RPL5和RPL11的核仁-核质易位
在核糖体应激的情况下，一些核糖体蛋白会从核仁转移到细胞核质中与MDM2结合，进而抑制MDM2对p53的泛素化降解，导致p53的积累。因此发明人进一步探究几个广受关注的核糖体蛋白，包括RPL5、RPL11和RPL23。首先，发明人进行细胞质、细胞核质、细胞核核仁分离实验，探究SNORA18L5是否影响这几个核糖体蛋白的定位。发明人发现HepG2细胞过表达SNORA18L5后RPL5和RPL11在细胞核仁中的表达减少而细胞核质中的表达增多，说明二者发生了核仁到核质的异位(如图15a)。敲低SNORA18L5后的实验结果同样提示RPL5和RPL11发生了细胞核质到细胞核仁的异位(如图15b)。
实施例13 SNORA18L5可以抑制RPL5和RPL11与MDM2的相互作用
接下来，发明人研究扰动SNORA18L5引起游离的RPL5和RPL11蛋白在细胞核仁和细胞核质中的分布变化后是否引发了RPL5和RPL11蛋白与MDM2结合的变化。发明人提取了细胞核蛋白后进行一系列的免疫共沉淀(Immune precipitation,IP)分析。首先分别用RPL5和RPL11的抗体进行IP实验，发现SNORA18L5过表达后RPL5和RPL11与MDM2的相互作用减弱(如图16a)，SNORA18L5敲低后RPL5和RPL11与MDM2的相互作用增强(如图16b)。随后，发明人用MDM2的抗体进行IP实验，发现SNORA18L5过表达后MDM2与RPL5和RPL11的相互作用减弱(如图16c)，SNORA18L5敲低后MDM2与RPL5和RPL11的相互作用增强(如图16d)。以上实验证明了发明人的科学假设，即SNORA18L5高表达使更多的核糖体蛋白(RPL11和RPL5)从核仁-核质异位到核仁参与核糖体的生物合成，而在细胞核质中处于自由状态的核糖体蛋白(RPL11和RPL5)减少，进而减少了核糖体蛋白(RPL11和RPL5)与MDM2在细胞核质中的相互作用，使得细胞核质更多的MDM2与p53结合进而泛素化降解p53，p53稳定性减低，最终抑制了而p53下游细胞周期阻滞和细胞凋亡，使得肿瘤快速生长。
实施例14 SNORA18L5依赖于RPL5和RPL11发挥促癌功能
发明人已经证明SNORA18L5抑制了RPL5和RPL11从细胞核仁转移到细胞核质中与MDM2结合，从而使游离的MDM2增多，最终促进了MDM2对p53的泛素化降解，导致p53稳定性降低，而促进肝癌细胞的生长，发挥促癌功能。那么SNORA18L5对p53和对细胞生长的影响是否依赖于RPL5和RPL11呢？发明人进行了一系列的回复性和依赖性试验。首先，发明人在过表达SNORA18L5的HepG2中分别过表达RPL5、RPL11和RPL23后检测p53的蛋白水平和细胞生长，发现过表达RPL5和RPL11后能够回复SNORA18L5对p53表达的抑制和对细胞生长的促进作用，而过表达RPL23后却无此效应(如图17a,b)。另外，发明人分别敲低RPL5、RPL11和RPL23后再敲低SNORA18L5后检测p53的蛋白水平和细胞的生长，发现敲低RPL5和RPL11后SNORA18L5敲低对p53表达的促进和对细胞生长的抑制作用消失了，但是敲低RPL23后却无此效应(如图17c,d)。综上所述，SNORA18L5依赖于RPL5和RPL11发挥促癌功能。
总结以上实施例，参考图18，在正常状态下SNORA18L5处于稳定状态，成熟的核糖体18S、5.8S和28S与从细胞核仁-核质异位到细胞核仁中的核糖体蛋白一起形成成熟的核糖体40S小亚基和60S大亚基。在外界核糖体应激压力下，游离状态的核糖体蛋白(包括RPL5、RPL11等)增多，此时从细胞核仁穿梭到细胞核质中的核糖体蛋白增多，穿梭到细胞核质中的核糖体蛋白与MDM2结合，使得与p53结合的MDM2减少，而导致p53的稳定性增强、表达增多，最终抑制细胞生长、引发细胞凋亡。在肿瘤细胞中SNORA18L5的拷贝数增多，促进了核糖体RNA的加工成熟和核糖体的生物合成，更多的核糖体蛋白(RPL5和RPL11)从细胞核质穿梭到细胞核仁参与核糖体的生物合成，进而与MDM2结合的核糖体蛋白(RPL5和RPL11)减少，更多的MDM2与p53结合促进了p53的泛素化降解，使p53的稳定性和表达降低，最终促进肿瘤细胞的生长并且抑制肿瘤细胞的凋亡。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> SNORA18L5在肝癌风险预警及抑制SNORA18L5的siRNA在抑制肝癌生长中的应用
<130> PIDC3176913A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> 实现SNORA18L5的特异性沉默的shRNA序列
<400> 1
uuccuguagc cugcacguu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于实现SNORA18L5的特异性沉默的shRNA序列
<400> 2
gaaggaacca caagacagu 19
<210> 3
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 实现SNORA18L5在受体细胞的过表达的核酸序列
<400> 3
gttgaggtct atcccgatag gtcttttcct gtagcctgca cgttgttgga aatgcctcat 60
agagtaactc tgtgatttta ctttacttac aggactattg ttacatctgt gggaaggaac 120
cacaagacag tt 132

Claims (4)

1.试剂在制备用于治疗或预防肝癌的药物中的用途，所述试剂用于沉默SNORA18L5，所述药物用于下列的至少之一：
促进肝癌细胞周期阻滞和肝癌细胞凋亡；
抑制肝癌细胞的生长；
抑制肝癌细胞18S和28S rRNAs的成熟；
抑制肝癌细胞核糖体的生物合成；
促进肝癌细胞p53的表达；
抑制肝癌细胞MDM2对p53的泛素化；
促进肝癌细胞RPL5和RPL11与MDM2的相互作用；促进肝癌细胞RPL5和RPL11细胞核仁-核质异位。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一实现的。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述沉默是通过shRNA实现的，所述试剂具有SEQ ID NO：1～2至少之一所示的核苷酸序列。
4.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗癌症，其特征在于，包括：将候选药物与癌细胞进行接触；以及
检测所述接触前后，癌细胞中SNORA18L5的表达量，
其中，所述接触后癌细胞中SNORA18L5的表达量低于所述接触前癌细胞中SNORA18L5的表达量，是候选药物为目标药物的指示。
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