WO2019181305A1 - ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を有効成分とするがん増殖抑制剤 - Google Patents

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政一 親泊
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小胞体ストレス研究所株式会社
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a novel cancer growth inhibitor, and further to a cancer therapeutic agent, comprising as an active ingredient a compound having an action of suppressing the expression of small nucleolar RNA (snoRNA).
  • small nucleolar RNA small nucleolar RNA
  • the snoRNA is an RNA present in a nucleolus and is one of non-coding RNAs as shown in FIG. It is a group of small RNA molecules that lead to chemical modification of ribosomal RNA (rRNA) and other RNA genes such as methylation and pseudouridine formation (Non-patent Document 1).
  • SnoRNA is encoded in an intron of a ribosomal gene and synthesized by RNA polymerase II. And snoRNA couple
  • the snoRNP complex binds complementarily to a target site for chemical modification such as rRNA and catalyzes chemical modification such as rRNA. It is the base sequence of snoRNA that induces the binding of rRNA and the like, and binds to the base sequence portion of rRNA complementary to the base sequence.
  • the snoRNA is mainly divided into two types, boxC / d and boxH / ACA, depending on its sequence, and it is said that it has a function of arranging RNA modifying enzymes at the correct position by its complementary base sequence.
  • ribosomal diseases A group of diseases that cause ribosome abnormalities due to abnormalities such as snoRNA and are caused as a result are called “ribosomal diseases”.
  • a typical disease is congenital erythropoiesis, called diamond blackfan anemia (DBA), which is closely related to an abnormality in the gene encoding ribosomal protein (RP).
  • snoRNA is often used as a disease biomarker (Patent Document 1), but it is not yet known that snoRNA is used as a disease therapeutic agent. As a use of snoRNA, it is known to administer a specific snoRNA as a replacement therapy in order to prevent the progression of aging (Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a cancer therapeutic agent having a new mechanism of action that suppresses colonization and growth of cancer cells in vivo.
  • the present inventor while pursuing research on non-coding RNA involved in the endoplasmic reticulum stress response, focused on the stress response of the nucleolus involved in protein synthesis and investigated the relationship between snoRNA that controls the stress response and cancer. investigated.
  • protein synthesis is abnormally increased due to fostering proliferation, and the cancer cells themselves are always starved. Therefore, ribosome construction specialized in the synthesis of proteins necessary for proliferation is performed in cancer cells. It is considered that snoRNA controls this as shown in FIG. That is, it was considered that highly expressed snoRNA unique to cancer cells greatly contributed to the construction of ribosomes for supplying proteins necessary for cancer survival and growth.
  • the present inventor believes that if snoRNA specifically expressed in cancer cells is picked up and the expression of the snoRNA is suppressed, it will be difficult to construct a ribosome that supplies proteins necessary for cancer survival and growth. It was. We thought that if ribosome construction becomes difficult, proteins necessary for cancer survival and growth could not be supplied, and cancer cells would become difficult to survive and grow and die. Based on the above concept, the present inventor has selected snoRNA that is specifically highly expressed in many cancer cells. And it discovered that the growth of cancer can be suppressed by suppressing the expression of the selected highly expressed snoRNA. That is, suppression of cancer growth induces cancer death by cancer apoptosis and biological immune reaction.
  • the present inventor was able to find a cancer growth inhibitor or a cancer therapeutic agent having a new mechanism of action based on suppression of snoRNA expression. Further, the present inventor can specify SNORA50C, SNORA56, SNORD42B, SNORA69, SNORD111, SNORD99, SNOR74A, SNORD105B, SNORD37, SNORD54 as snoRNAs that are specifically highly expressed in cancer cells. It has been found that the growth of cancer cells can be suppressed by suppressing the expression of any one or more. The present inventor completed the present invention based on the above findings.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a cancer growth inhibitor comprising, as an active ingredient, a snoRNA expression inhibitor specifically highly expressed in cancer cells.
  • the cancer growth suppression according to (1) wherein the cancer cell is any one of breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung cancer (lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma), and stomach cancer.
  • Agent. (3)
  • one or more of the snoRNAs are selected from SNORA50C, SNORA56, SNORD42B, SNORA69, SNORD111, SNORD99, SNORA74A, SNORD105B, SNORD37, and SNORD54. Cancer growth inhibitor.
  • the cancer cell is a breast cancer (for example, invasive breast cancer) cell, and the snoRNA is one or more selected from SNORA50C, SNORA56, and SNORD42B, (1) or (2) ) Growth inhibitor for breast cancer (for example, invasive breast cancer).
  • liver cancer for example, hepatocyte
  • the cancer cell is a cell of liver cancer (for example, hepatocellular carcinoma)
  • the snoRNA is SNORA74A and / or SNORD99. Cancer) growth inhibitor.
  • the lung cancer for example, lung gland
  • the cancer cell is a lung cancer cell (for example, lung adenocarcinoma) and the snoRNA is SNORD105B and / or SNORD37. Cancer) growth inhibitor.
  • the lung cancer for example, lung
  • the cancer cell is a lung cancer cell (for example, lung squamous cell carcinoma) and the snoRNA is SNORA74A and / or SNORD54.
  • Squamous cell carcinoma Cancer growth inhibitor.
  • the expression inhibitor of snoRNA is the siRNA of SEQ ID NO: 1, the siRNA of SEQ ID NO: 1, the siRNA of SEQ ID NO: 2, the siRNA of SEQ ID NO: 3, the siRNA of SEQ ID NO: 4, the siRNA of SEQ ID NO: 6, One or more of siRNA, siRNA of SEQ ID NO: 7, siRNA of SEQ ID NO: 8, siRNA of SEQ ID NO: 9, and siRNA of SEQ ID NO: 10 are selected. Growth inhibitor.
  • the snoRNA expression inhibitor is one or more selected from siRNA of SEQ ID NO: 1, siRNA of SEQ ID NO: 1, siRNA of SEQ ID NO: 2, and siRNA of SEQ ID NO: 3, The growth inhibitor of breast cancer (for example, invasive breast cancer) as described in 1) or (2).
  • Growth inhibitor is included in the renal cancer according to (1) or (2) above, wherein the snoRNA expression inhibitor is one or more selected from siRNA of SEQ ID NO: 5 and siRNA of SEQ ID NO: 10. For example, renal clear cell carcinoma) growth inhibitor.
  • the liver cancer according to (1) or (2) above, wherein the snoRNA expression inhibitor is one or more selected from siRNA of SEQ ID NO: 6 and siRNA of SEQ ID NO: 10. , Hepatocellular carcinoma) growth inhibitor.
  • the snoRNA expression inhibitor is one or more selected from siRNA of SEQ ID NO: 7 and siRNA of SEQ ID NO: 8 , Lung adenocarcinoma) growth inhibitor.
  • the snoRNA expression inhibitor is one or more selected from siRNA of SEQ ID NO: 6 and siRNA of SEQ ID NO: 9 (for example, , Lung squamous cell carcinoma) growth inhibitor.
  • RNA comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 10.
  • RNA is siRNA.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention suppresses the growth of cancer cells and inhibits the treatment of cancer by inhibiting or preventing the expression of snoRNA specifically expressed in cancer cells.
  • the expression inhibitor used to suppress or prevent highly expressed snoRNA in cancer cells include those using RNA interference such as siRNA, shRNA, dsRNA, known means such as antisense oligonucleotide, decoy, etc. Can be used.
  • SNOR50C, SNORA56, SNORD42B, SNOR69, SNORD111, SNORD99, SNORA74A, SNORD105B, SNORD37, and SNORD54 can be identified as snoRNAs that are highly expressed specifically in cancer cells, and one or more snoRNAs can be identified from these. It has been found that the growth of breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, and stomach cancer can be suppressed by using an agent capable of suppressing the expression. Therefore, the cancer growth inhibitor of the present invention is an effective therapeutic agent for these cancers.
  • SNODR99 has been identified as a snoRNA that is highly expressed specifically in renal cancer, and is a figure showing that the prognosis is poor in renal cancer patients that highly express SNODR99.
  • a human kidney cancer cell line lacking SNORD99 (786O99KO) and a positive control human kidney cancer cell line (786O mock) were transplanted into nude mice, and the engraftment / proliferation status of the transplanted renal cancer after 6 weeks was compared. It is the figure (photograph) represented. In human renal cancer cell line (786O99KO) deficient in SNORD99, it was revealed that the growth of renal cancer was suppressed.
  • the cancer growth inhibitor of the present invention is an agent containing an expression inhibitor of snoRNA specifically highly expressed in cancer cells, and in particular, an agent containing this expression inhibitor as an active ingredient.
  • the “cancer cell” of the present invention is not particularly limited, but cancer cells that highly express snoRNA include breast cancer (invasive breast cancer, non-invasive breast cancer), colon cancer, renal cancer (clear). Cell carcinoma, papillary kidney cancer, chromophore renal cancer, multilocular cystic kidney cancer, spindle cell carcinoma, collecting duct cancer), liver cancer (hepatocellular carcinoma, intrahepatic cholangiocarcinoma), lung cancer (small cell lung cancer (lung gland) Cancer, lung squamous cell carcinoma, large cell lung cancer), non-small cell lung cancer), and gastric cancer.
  • the “specifically highly expressed snoRNA” of the present invention refers to snoRNA that is significantly or significantly expressed in cancer cells as compared to healthy individuals. Preferably, it refers to a cancer cell that exhibits an expression level of snoRNA that is about 4 times or more that of a healthy person. More preferable examples include cancer cells having about 5 times or more snoRNA expression level.
  • cancer-specific highly expressed snoRNA include SNORA50C, SNORA56, SNORD42B, SNORA69, SNORD111, SNORD99, SNORA74A, SNORD105B, SNORD37, and SNORD54.
  • snoRNA can include SNORA50C, SNORA56, and SNORD42B, and as high expression snoRNA specific to colon cancer cells, SNORA56 and SNORA69 can be exemplified.
  • SNORA56 and SNORA69 can be exemplified.
  • SNORD111 and SNORD99 can be mentioned as high expression snoRNA specific to renal cancer (eg, clear cell renal cell) cells, and SNORA74A and SNORD99 can be mentioned as high expression snoRNA specific to liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma) cells.
  • Examples of highly expressed snoRNA specific to lung cancer cells such as lung adenocarcinoma cells include SNORD105B and SNORD37, and examples of highly expressed snoRNA specific to lung squamous cell carcinoma cells include SNORA74A.
  • SNORD54 can be mentioned, of gastric cancer cells specific as a high expression snoRNA, it can be mentioned SNORA69.
  • the “expression inhibitor” of the present invention is not particularly limited as long as it is an agent that suppresses the expression of snoRNA that is specifically highly expressed.
  • the agent that suppresses the expression of the target snoRNA may exhibit an inhibitory action on the expression of the target snoRNA at any stage of transcription of the gene encoding the target snoRNA, post-transcriptional regulation, and the like.
  • disassembles target snoRNA and what suppresses functional expression of target snoRNA may be sufficient.
  • the agent that suppresses the expression of the target snoRNA include a decoy nucleic acid as a nucleic acid molecule that suppresses the transcription of a gene encoding the target snoRNA, and an RNA molecule that decomposes the target snoRNA by RNA interference or a precursor thereof.
  • the body include siRNA, shRNA, dsRNA, and the like, and examples of the nucleic acid molecule that hybridizes to the target snoRNA to suppress the expression of its function or decompose it include an antisense nucleic acid.
  • These nucleic acid drugs may be used alone or in combination of two or more.
  • the base sequences of these nucleic acid drugs can be appropriately designed by those skilled in the art based on information on the base sequence of the gene encoding the target molecule by a known method.
  • these nucleic acid drugs siRNA, shRNA, and dsRNA are preferable from the viewpoint of ease of clinical application, and siRNA is more preferable.
  • siRNAs containing any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 shown in Tables 2 and 3 can be mentioned.
  • the upper limit of the length of these siRNAs is about 30 bases, and can be particularly about 27 bases.
  • siRNAs comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 10 shown in Tables 2 and 3 are preferred.
  • the expression inhibitor when it is an RNA molecule, it may be designed so that it can be generated in vivo. Specifically, a DNA encoding the RNA molecule may be inserted into an expression vector for mammalian cells. Examples of such expression vectors include virus vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai viruses, and animal cell expression plasmids. Further, when the expression inhibitor is an RNA molecule, it may be chemically modified to improve stability.
  • RNA containing nucleic acid analogs such as phosphorothioate, morpholino phosphorodiamidate, boranophosphate, LNA (Locked Nucleic Acid), 2′-O-methylated RNA, 2′-O—. And methoxyethylated RNA.
  • the “cancer growth inhibitor” of the present invention is an agent that can suppress the growth of cancer, and can be achieved by using an agent that suppresses the expression of snoRNA as an active ingredient.
  • the “cancer therapeutic agent” of the present invention refers to cancer cells that completely or incompletely induce apoptosis of cancer cells by suppressing the growth of cancer, or that cause cancer cells that have stopped growing to undergo immunity in the living body. A therapeutic agent that is killed completely or incompletely by reaction.
  • the growth inhibitor and therapeutic agent of the present invention are not only used for treatment of cancer-bearing patients, but may be administered for the purpose of preventing recurrence and metastasis after the cancer has been removed from the cancer-bearing patient. It can also be used as a prognostic improver or cancer metastasis preventive agent in patients after resection.
  • the growth inhibitor and therapeutic agent of the present invention are used as follows.
  • the method of administration is not particularly limited as long as the growth inhibitor and therapeutic agent of the present invention can be delivered to cancer in vivo.
  • intravascular intraarterial or intravenous
  • continuous infusion subcutaneous administration
  • local administration Administration intramuscular administration and the like.
  • intraarterial and intravenous administration is preferable.
  • the dosage may be appropriately set within a range in which expression of the target molecule can be suppressed (including function inhibition) according to the type of active ingredient to be used, the patient's symptom level, the patient's sex, age, and the like.
  • the growth inhibitor and therapeutic agent of the present invention may be used alone, or may be used in combination with one or more other drugs having antitumor activity and / or radiation therapy.
  • the growth inhibitor and therapeutic agent of the present invention are formulated by adding a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the formulation form.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the formulation form.
  • a solid preparation it can be formulated using an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant and the like.
  • a liquid preparation it can be formulated using physiological saline, a buffer solution, or the like.
  • nucleic acid introduction aid in the growth inhibitor and therapeutic agent of the present invention, if a nucleic acid molecule is used as an active ingredient, it is formulated with a nucleic acid introduction aid so that the nucleic acid molecule can be easily transferred into cancer cells. It is desirable. Specific examples of the nucleic acid introduction aid include lipofectamine, oligofectamine, RNAifect, liposome, polyamine, DEAE dextran, calcium phosphate, dendrimer and the like.
  • Example 1 Identification of highly expressed snoRNA specific to cancer cells (1) Method: a) Database: Cancer genomes, epigenomes, transcriptomes in various tissues collected in projects by National Cancer Institute (NCI) (National Cancer Institute) and National Human Genome Research Institute (NHGRI) (National Human Genome Research Institute) Data such as mutation information is collected in The Canser Genome Atlas (TCGA). b) Identification method: From the TCGA listing data, normal specimens and cancer specimens could be compared and data including snoRNA expression information was extracted.
  • NCI National Cancer Institute
  • NHGRI National Human Genome Research Institute
  • snoRNA whose expression is significantly increased in the cancer sample as compared with the normal sample is extracted, and further, the life prognosis of the cancer patient group with high expression of snoRNA in the Cox proportional hazard model is A snoRNA that was defective compared to it was identified as an oncogenic snoRNA.
  • Invasive breast cancer (breast invasive carcinoma) Colon adenocarcinomas Clear renal cell carcinoma (kidney renal clear cell carcinoma) Hepatocellular carcinoma (liver hepatocyte cellular carcinoma) Lung adenocarcinoma Lung squamous cell carcinoma (lung squamous cell carcinoma) Stomach cancer (stomach adenocarcinoma)
  • the expression level of SNORA50C is 4.6 times that of healthy individuals, and the p-value is significantly less than 0.05 in Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis.
  • the expression level of SNORA56 was 5.7 times that of healthy individuals, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a significant difference of 0.01 or less in p value.
  • SNORD42B had an expression level of 7.0 times that of healthy individuals, and a Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a p-value of 0.01 or less.
  • the expression level of SNORA56 was 5.9 times that of healthy individuals, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a significant difference of 0.01 or less.
  • the expression level of SNORA69 was 3.7 times that of a healthy person, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a p-value of 0.01 or less.
  • the expression level of SNORD111 was 4.0 times that of healthy individuals, and the p-value was 0.01 or less in Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis.
  • the expression level of SNORD99 was 13.0 times that of healthy subjects, and the p-value was 0.01 or less in Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis.
  • the expression level of SNORA74A was 5.7 times that of healthy individuals, and the p value was significantly different from 0.01 or less in Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis.
  • SNORD99 was 4.6 times more expressed than healthy individuals, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a p-value of 0.05 or less.
  • the expression level of SNORD105B was 5.3 times that of healthy subjects, and the p value was significantly different from 0.05 in Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis.
  • the expression level of SNORD37 was 8.6 times that of healthy individuals, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis was significantly different from the p value of 0.01 or less.
  • the expression level of SNORA74A was 4.3 times that of healthy individuals, and the p value was significantly different from 0.05 in Cox proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis.
  • the expression level of SNORD54 was 5.7 times that of healthy individuals, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a significant difference of 0.01 or less in p value.
  • the expression level of SNORA69 was 13.0 times that of a healthy person, and the Co value proportional hazard analysis between the expression level and life prognosis showed a p-value of 0.01 or less.
  • Tables 2 and 3 show examples of the base sequence of the identified carcinogenic snoRNA and the base sequence of siRNA that suppresses its expression.
  • the sequence of human snoRNA was extracted from a database constructed by NCBI in the United States.
  • the siRNA with respect to snoRNA designed the siRNA based on the snoRNA sequence, and the sequence
  • the siRNA can also function as an antisense RNA. It may also function like a decoy.
  • Example 2 Comparative evaluation of proliferative potential of human renal cancer cell line deficient in SNORD99, which is highly expressed in renal clear cell carcinoma (13.0 times that of normal cells), and human renal cancer cell line without deficiency renal cancer ( As shown in FIG. 2, SNORD99 is particularly prominently expressed as snoRNA in patients with clear renal cell carcinoma (kidney renal clear cell carcinoma), and it has been found that the prognosis of the renal cancer patients is poor. Therefore, in order to clarify the function of SNORD99 highly expressed in renal cancer in cancer, nude mice were used using human kidney cancer cell lines deficient in SNORD99 and positive control human kidney cancer cell lines. Transplantation was performed subcutaneously.
  • Human renal cancer cell line 786O mock of material, reagent, positive control -Human kidney cancer cell line 786O99KO deficient in SNORD99 A method for preparing the positive control cell line and the SNORD99-deficient cell line is as follows. 786O mock and 786O99KO were made by the Crispr-Cas9 method. After stably overexpressing Cas9 in human renal cancer cell line 786O cells, guide RNA (gccgggccttccaacccggt) was introduced by lentivirus and puromycin resistance selection was performed to prepare 786O99KO. SNORD99 gene deficiency was confirmed by quantitative PCR and genomic DNA sequencing.
  • 786O mock was prepared by stably overexpressing Cas9 in 786O and then introducing a lentivirus without guide RNA to select drug resistance.
  • Method Nude mice male, 4 weeks old
  • 786O99KO human kidney cancer cell lines
  • positive control human kidney cancer cell lines (786O mock).
  • the state of renal cancer formation after 6 weeks was visually observed, and the diameter of the transplanted renal cancer cells was measured.
  • Results As shown in FIG. 3, after 6 weeks, renal cancer formation was suppressed in the human kidney cancer cell line deficient in SNORD99 compared to the positive control human kidney cancer cell line.
  • the diameter of transplanted renal cancer is shown in Table 4 below.
  • the volume of transplanted renal cancer after 6 weeks was 21 mm 3 in the human kidney cancer cell line (786O99KO) deficient in SNORD99, and 436 mm 3 (p) in the positive control (786Omock). ⁇ 0.01).
  • the engraftment / proliferation of cancer cells in nude mice is remarkably suppressed. This indicates that suppression of highly expressed SNORD99 in renal cancer can suppress the growth of renal cancer, and that suppression of SNORD99 expression enables cancer treatment.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention effectively suppresses the growth of cancer cells by suppressing the expression of snoRNA specifically highly expressed in cancer cells, and performs cancer treatment with a new mechanism of action. I can do it.
  • the cancer growth inhibitor of the present invention can be used as a single agent, and can be used in combination with an immunostimulatory cancer therapeutic agent to enhance its effect. Therefore, as the cancer growth inhibitor of the present invention, nucleic acid drugs such as siRNA and decoy can be used as those capable of suppressing the expression of snoRNA, a new cancer growth inhibitor, and further a cancer. It can be used as a therapeutic agent.

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Abstract

がん細胞で特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡを発現抑制する剤が、がん細胞の生着や増殖を顕著に抑制することを見出し、新たな作用機序のがん治療剤になることを明らかにした。そして、がん細胞で特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂ、ＳＮＯＲＡ６９、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７、ＳＮＯＲＤ５４を見出した。この結果、本発明のがん治療剤は、副作用が少なく、また、がんの免疫療法剤との併用が可能な薬剤になる。

Description

ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を有効成分とするがん増殖抑制剤
　本発明は、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅｏｌａｒ　ＲＮＡ：ｓｎｏＲＮＡ）の発現抑制作用を有する化合物を有効成分とする新規ながん増殖抑制剤、更にはがんの治療剤に関する。
　ｓｎｏＲＮＡは、核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ）に存在するＲＮＡのことであり、図１に示すように、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡ）の１つである。リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びその他のＲＮＡ遺伝子のメチル化やシュードウリジン化の化学修飾を導く小さなＲＮＡ分子の一群である（非特許文献１）。
　ｓｎｏＲＮＡは、リボゾーム遺伝子のイントロンの中にコードされていて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって合成される。そして、ｓｎｏＲＮＡは、蛋白質と結合して核小体低分子リボ核酸蛋白質（ｓｎｏＲＮＰ）に変化する。ｓｎｏＲＮＰ複合体は、ｒＲＮＡ等の化学修飾の標的部位に相補的に結合し、ｒＲＮＡ等の化学修飾を触媒する。
　ｒＲＮＡ等の結合を誘導するのは、ｓｎｏＲＮＡの塩基配列であり、その塩基配列に対して相補的なｒＲＮＡの塩基配列部分に結合する。
　ｓｎｏＲＮＡはその配列によって主にｂｏｘＣ／ｄとｂｏｘＨ／ＡＣＡの二種に分けられており、その相補的塩基配列により、ＲＮＡ修飾酵素を正しい位置に並べる機能を有しているとされている。
　従って、ｓｎｏＲＮＡが変異を起こす場合や、異常に高発現する場合には、核小体の中でリボソームを適切に構築することが出来難くなる。即ち、リボソームが異常を起こすので、タンパク質の合成が正しく行われなくなり、そのため細胞は正常に機能できなくなり、異常に増殖したり、死滅したりするようになる。ｓｎｏＲＮＡ等の異常により、リボソーム異常を起こし、その結果引き起こされる疾患群は「リボソーム病」と呼ばれている。代表的な疾患は、ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）という先天性の赤芽球形成不全症であり、リボソームタンパク質（ＲＰ）をコードする遺伝子の異常と深く関連している。造血異常の他にも、角化不全、骨格異常、脾臓や肝臓の異常を示す疾患もリボソーム病に含まれている。
　現在では、ｓｎｏＲＮＡが、疾患のバイオマーカーとして使用される多いが（特許文献１）、ｓｎｏＲＮＡを疾患の治療剤として使用されることは未だ知られていない。ｓｎｏＲＮＡの用途としては、老化の進行を阻止するために、ある特定のｓｎｏＲＮＡを補充療法として投与することが知られている状況である（特許文献２）。
公表２０１４－５２６０３２号公報 公表２０１７－５０２６５０号公報
生化学第８５巻第１０号，８６１－８７０（２０１３年）
　本発明は、がん細胞の生体内での定着、増殖を抑制する、新たな作用機序のがんの治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者は、小胞体ストレス応答に関与するｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡの研究を進める中で、タンパク合成に係る核小体のストレス応答に着目し、ストレス応答を制御するｓｎｏＲＮＡとがんとの関係を検討した。
　がん細胞では、増殖が盛んなために、タンパク合成が異常に亢進しており、がん細胞自体は常に飢餓状態にある。そのため、がん細胞では、増殖に必要なタンパクの合成に特化したリボソーム構築が行われている。それをコントロールしているのが図１に示すようにｓｎｏＲＮＡと考えられる。即ち、がん細胞に特有の高発現ｓｎｏＲＮＡは、がんの生存と増殖に必要なタンパクを供給するためのリボソーム構築に大きく寄与していると考えられた。
　そこで、本発明者は、がん細胞に特異的高発現のｓｎｏＲＮＡをピックアップし、そのｓｎｏＲＮＡの発現を抑制すれば、がんの生存と増殖に必要なタンパクを供給するリボソーム構築が困難になると考えた。リボソーム構築が困難になれば、がんの生存と増殖に必要なタンパクが供給できず、がん細胞は生存と増殖が困難になり、死滅して行くと考えた。
　本発明者は、上記のコンセプトに基づいて、多くのがん細胞で特異的に高発現のｓｎｏＲＮＡを選択した。そして、選択した高発現のｓｎｏＲＮＡの発現を抑制することによって、がんの増殖が抑制できることを見出した。即ち、がんの増殖抑制は、がんのアポトーシスと生体の免疫反応により、がんの死滅を誘導することになる。このように、本発明者は、ｓｎｏＲＮＡの発現抑制に基づく新たな作用機序のがんの増殖抑制剤、あるいはがんの治療剤を見出すことができた。
　また、本発明者は、がん細胞に特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂ、ＳＮＯＲＡ６９、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７、ＳＮＯＲＤ５４を特定することができ、これらのｓｎｏＲＮＡのいずれか一つ以上を発現抑制することによって、がん細胞を増殖抑制できることを見出した。
　本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。
　即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）がん細胞で特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を有効成分とする、がんの増殖抑制剤。
（２）上記がん細胞が、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌（肺腺癌、肺扁平上皮癌）、胃癌のいずれかである、上記（１）に記載のがんの増殖抑制剤。
（３）上記ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂ、ＳＮＯＲＡ６９、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７、ＳＮＯＲＤ５４の中から一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載のがんの増殖抑制剤。
（４）上記がん細胞が、乳癌（例えば、浸潤性乳癌）の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂの中から一つ以上選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の乳癌（例えば、浸潤性乳癌）の増殖抑制剤。
（５）上記がん細胞が、結腸癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ５６及び／又はＳＮＯＲＡ６９である、上記（１）又は（２）に記載の結腸癌の増殖抑制剤。
（６）上記がん細胞が、腎癌（例えば、腎淡明細胞癌）の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＤ１１１及び／又はＳＮＯＲＤ９９である、上記（１）又は（２）に記載の腎癌（例えば、腎淡明細胞癌）の増殖抑制剤。
（７）上記がん細胞が、肝癌（例えば、肝細胞癌）の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ７４Ａ及び／又はＳＮＯＲＤ９９である、上記（１）又は（２）に記載の肝癌（例えば、肝細胞癌）の増殖抑制剤。
（８）上記がん細胞が、肺癌（例えば、肺腺癌）の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＤ１０５Ｂ及び／又はＳＮＯＲＤ３７である、上記（１）又は（２）に記載の肺癌（例えば、肺腺癌）の増殖抑制剤。
（９）上記がん細胞が、肺癌（例えば、肺扁平上皮癌）の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ７４Ａ及び／又はＳＮＯＲＤ５４である、上記（１）又は（２）に記載の肺癌（例えば、肺扁平上皮癌）癌の増殖抑制剤。
（１０）上記がん細胞が、胃癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ６９である、上記（１）又は（２）に記載の胃癌の増殖抑制剤。
（１１）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号２のｓｉＲＮＡ、配列番号３のｓｉＲＮＡ、配列番号４のｓｉＲＮＡ、配列番号５のｓｉＲＮＡ、配列番号６のｓｉＲＮＡ、配列番号７のｓｉＲＮＡ、配列番号８のｓｉＲＮＡ、配列番号９のｓｉＲＮＡ、配列番号１０のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）に記載のがんの増殖抑制剤。
（１２）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号２のｓｉＲＮＡ、配列番号３のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の乳癌（例えば、浸潤性乳癌）の増殖抑制剤。
（１３）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号２のｓｉＲＮＡ、配列番号４のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の結腸癌の増殖抑制剤。
（１４）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号５のｓｉＲＮＡ、配列番号１０のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の腎癌（例えば、腎淡明細胞癌）の増殖抑制剤。
（１５）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号６のｓｉＲＮＡ、配列番号１０のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の肝癌（例えば、肝細胞癌）の増殖抑制剤。
（１６）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号７のｓｉＲＮＡ、配列番号８のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の肺癌（例えば、肺腺癌）の増殖抑制剤。
（１７）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号６のｓｉＲＮＡ、配列番号９のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、上記（１）又は（２）に記載の肺癌（例えば、肺扁平上皮癌）の増殖抑制剤。
（１８）ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号４のｓｉＲＮＡである、上記（１）又は（２）に記載の胃癌の増殖抑制剤。
（１９）上記（１）～（１８）のいずれかに記載のがんの増殖抑制剤を有効成分とする、がん治療剤。
（２０）　配列番号１～１０の何れかの塩基配列からなるＲＮＡ。
（２１）　ＲＮＡがｓｉＲＮＡである（２０）に記載のＲＮＡ。
　本発明のがん治療剤は、がん細胞に特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡを抑制又は発現させないようにすることによって、がん細胞の増殖を抑制し、がんの治療を行うものである。がん細胞に高発現するｓｎｏＲＮＡを抑制又は発現させないために使用される発現抑制剤としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡ干渉を利用するもの、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイ等の公知の手段を使用することが出来る。
　がん細胞に特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡとしては、ＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂ、ＳＮＯＲＡ６９、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７、ＳＮＯＲＤ５４を特定することができ、これらの中から一つ以上のｓｎｏＲＮＡを発現抑制できる剤を使用することによって、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌の増殖を抑制できることを見出している。それ故、本発明のがん増殖抑制剤は、これらのがんの有効な治療薬となる。
ｓｎｏＲＮＡを含む多くのＲＮＡの種類とその機能をまとめた図である。 腎癌に特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＤＲ９９が同定されており、このＳＮＯＤＲ９９を高発現する腎癌患者では予後が悪いことを表した図である。 ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎癌細胞株（７８６Ｏ９９ＫＯ）とポジテイブ・コントロールのヒト腎癌細胞株（７８６Ｏ　ｍｏｃｋ）をヌードマウスに他家移植し、６週間後の移植腎癌の生着・増殖状態を比較して表した図（写真）である。ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎癌細胞株（７８６Ｏ９９ＫＯ）では、腎癌の増殖が抑制されていることが明らかとなった。
　本発明のがんの増殖抑制剤は、がん細胞で特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を含む剤であり、特に、この発現抑制剤を有効成分として含む剤である。
　本発明の「がん細胞」とは、特に限定されるものではないが、ｓｎｏＲＮＡを高発現するがん細胞として、乳癌（浸潤性乳癌、非浸潤性乳癌）、結腸癌、腎癌（淡明細胞癌、乳頭状腎癌、嫌色素性腎癌、多房嚢胞性腎癌、紡錘細胞癌、集合管癌）、肝癌（肝細胞癌、肝内胆管癌）、肺癌（小細胞肺癌（肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺大細胞癌がん）、非小細胞肺癌）、胃癌のいずれかのがん細胞を挙げることができる。
　本発明の「特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡ」とは、健常人と比較して、がん細胞において顕著に又は有意に発現しているｓｎｏＲＮＡのことを言う。好ましくは、健常人の発現量の約４倍以上のｓｎｏＲＮＡの発現量を示すがん細胞のことを言う。より好ましくは約５倍以上のｓｎｏＲＮＡの発現量を持つがん細胞を挙げることができる。
　がん特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとしては、例えばＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂ、ＳＮＯＲＡ６９、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７、ＳＮＯＲＤ５４を挙げることができる。
　このうち、乳癌（例えば、浸潤性乳癌）細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂを挙げることができ、結腸癌細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＡ６９を挙げることができ、腎癌（例えば、腎淡明細胞癌）細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９を挙げることができ、肝癌（例えば、肝細胞癌）細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ９９を挙げることができ、肺癌細胞、例えば、肺腺癌細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７を挙げることができ、また例えば、肺扁平上皮癌細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ５４を挙げることができ、胃癌細胞特有の高発現ｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＡ６９を挙げることができる。
　本発明の「発現抑制剤」とは、特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡの発現を抑制する剤であれば特に限定はされない。標的となるｓｎｏＲＮＡの発現を抑制する剤は、標的ｓｎｏＲＮＡをコードしている遺伝子の転写、転写後調節等のいずれかの段階で標的ｓｎｏＲＮＡの発現に対する抑制作用を発揮するものであってよい。また、標的ｓｎｏＲＮＡを分解するもの、標的ｓｎｏＲＮＡの機能発現を抑制するものであってもよい。
　標的ｓｎｏＲＮＡの発現を抑制する剤として、具体的には、標的ｓｎｏＲＮＡをコードする遺伝子の転写を抑制する核酸分子としてデコイ核酸等が挙げられ、標的ｓｎｏＲＮＡをＲＮＡ干渉作用により分解するＲＮＡ分子又はその前駆体としてｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等が挙げられ、標的ｓｎｏＲＮＡにハイブリダイズしてその機能の発現を抑制したり、分解したりする核酸分子としてアンチセンス核酸等が挙げられる。これらの核酸医薬は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの核酸医薬の塩基配列は、標的分子をコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。これらの核酸医薬の中でも、臨床応用への容易性等の観点から、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡが挙げられ、更に好ましくはｓｉＲＮＡが挙げられる。
　好ましいｓｉＲＮＡとして、表２、表３に記載の配列番号１～１０の何れかの塩基配列を含むｓｉＲＮＡを挙げることができる。これらのｓｉＲＮＡの長さの上限は、３０塩基程度であり、特に２７塩基程度とすることができる。中でも、表２、表３に記載の配列番号１～１０の何れかの塩基配列からなるｓｉＲＮＡが好ましい。
　また、前記発現抑制剤がＲＮＡ分子である場合は、生体内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。具体的には、当該ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
　また、前記発現抑制剤がＲＮＡ分子である場合は、安定性改善のために化学修飾が施されたものであってもよい。化学修飾ＲＮＡとして、例えば、ホスホロチオエート、モルフォリノホスホロジアミデート、ボラノホスフェート、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）のような核酸アナログを含むＲＮＡや、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル化ＲＮＡ等が挙げられる。
　本発明の「がんの増殖抑制剤」とは、がんの増殖を抑制できる剤のことであり、ｓｎｏＲＮＡの発現を抑制する剤を有効成分として使用することによって達成することができるものを言う。
　本発明の「がん治療剤」とは、がんの増殖を抑制することにより、がん細胞のアポトーシスを完全に又は不完全に惹起するか、あるいは増殖が止まったがん細胞を生体の免疫反応によって完全に又は不完全に死滅させる治療剤のことを言う。
　本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、担癌患者の治療に使用されるだけでなく、担癌患者から癌を摘出した後に、再発や転移を予防する目的で投与してもよく、癌の切除後の患者における予後の改善剤又は癌の転移予防剤としても使用することもできる。
　また、本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、以下のように使用される。
（用量、用法）
　投与方法としては、本発明の増殖抑制剤及び治療剤を生体内で癌にデリバリーできることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
　投与量は、使用する有効成分の種類、患者の症状の程度、患者の性別、年齢等に応じて、標的分子の発現抑制（機能阻害を含む）が可能な範囲で適宜設定すればよい。
　本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、単独で使用してもよいが、抗腫瘍作用を有する１種又は２種以上の他の薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。
（製剤形態）
　本発明の増殖抑制剤及び治療剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
　また、本発明の増殖抑制剤及び治療剤において、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、当該核酸分子が癌細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤と共に製剤化されていることが望ましい。核酸導入補助剤としては、具体的には、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。
　以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
（実施例１）がん細胞に特有の高発現のｓｎｏＲＮＡの同定
（１）方法：
ａ）データベース：
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｓｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）（米国国立がん研究所) とＮａｔｉｏｎａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＨＧＲＩ）（米国国立ヒトゲノム研究所)によるプロジェクトで収集したさまざまな組織におけるがんのゲノムやエピゲノム、トランスクリプトーム、変異情報などのデータがＴｈｅ　Ｃａｎｓｅｒ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）に集約されている。
ｂ）同定方法：
　ＴＣＧＡの収載データから、正常検体と癌検体の比較が可能であり、かつｓｎｏＲＮＡ発現情報を含むデータの抽出を行った。そして、正常検体に比べて癌検体で発現が有意に増加しているｓｎｏＲＮＡを抽出し、さらにＣｏｘ比例ハザードモデルにてｓｎｏＲＮＡの高発現癌患者群の生命予後が低発現癌患者群の生命予後と比べて不良をしめすｓｎｏＲＮＡを、発癌ｓｎｏＲＮＡとして同定した。
（２）結果：
　上記検討の結果、がん細胞に特有の高発現のｓｎｏＲＮＡとして、表１に示される発癌ｓｎｏＲＮＡを同定することが出来た。例えば、表１の腎癌の場合、ＳＮＯＲＤ９９が健常人の１３倍も高発現していた。そして、図２に示されるように、ＳＮＯＲＤ９９が高発現している癌患者の予後が悪かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ［注記］
浸潤性乳癌（ｂｒｅａｓｔ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
結腸癌（ｃｏｌｏｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）
腎淡明細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ　ｒｅｎａｌ　ｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
肝細胞癌（ｌｉｖｅｒ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
肺腺癌（ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）
肺扁平上皮癌（ｌｕｎｇ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）
　上記表１に示されるように、浸潤性乳癌では、ＳＮＯＲＡ５０Ｃが健常人と比べて発現量が４．６倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０５以下と有意差があった。ＳＮＯＲＡ５６が健常人と比べて発現量が５．７倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。ＳＮＯＲＤ４２Ｂが健常人と比べて発現量が７．０倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。
　結腸癌では、ＳＮＯＲＡ５６が健常人と比べて発現量が５．９倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。ＳＮＯＲＡ６９が健常人と比べて発現量が３．７倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。
　腎淡明細胞癌では、ＳＮＯＲＤ１１１が健常人と比べて発現量が４．０倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。ＳＮＯＲＤ９９が健常人と比べて発現量が１３．０倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。
　肝細胞癌では、ＳＮＯＲＡ７４Ａが健常人と比べて発現量が５．７倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。ＳＮＯＲＤ９９が健常人と比べて発現量が４．６倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０５以下と有意差があった。
　肺腺癌では、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂが健常人と比べて発現量が５．３倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０５以下と有意差があった。ＳＮＯＲＤ３７が健常人と比べて発現量が８．６倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。
　肺扁平上皮癌では、ＳＮＯＲＡ７４Ａが健常人と比べて発現量が４．３倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０５以下と有意差があった。ＳＮＯＲＤ５４が健常人と比べて発現量が５．７倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。
　胃癌では、ＳＮＯＲＡ６９が健常人と比べて発現量が１３．０倍で発現量と生命予後とのＣｏｘ比例ハザード解析でｐ値が０．０１以下と有意差があった。
　同定された発癌ｓｎｏＲＮＡの塩基配列と、その発現を抑制するｓｉＲＮＡの塩基配列の一例を、表２、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ヒトｓｎｏＲＮＡの配列は、米国のＮＣＢＩで構築しているデータベースより抽出した。なお、ｓｎｏＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡ配列に基づき、そのｓｉＲＮＡを設計し、５０％以上の発現抑制効果がある配列を、上記表２、表３に示した。なお、上記ｓｉＲＮＡはアンチセンスＲＮＡとしても機能し得る。また、デコイ様に機能してもよい。
（実施例２）腎淡明細胞癌で高発現（正常細胞の１３．０倍）のＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎癌細胞株と欠損の無いヒト腎癌細胞株の増殖性の比較評価
　腎癌（腎淡明細胞癌：ｋｉｄｎｅｙ　ｒｅｎａｌ　ｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者では、図２に示すようにｓｎｏＲＮＡとして、ＳＮＯＲＤ９９が特に顕著に発現しており、その腎癌患者の予後が悪いことを見出している。そこで、腎癌で高発現しているＳＮＯＲＤ９９のがんにおける機能を明らかにするため、ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎がん細胞株と、ポジティブ・コントロールのヒト腎がん細胞株を用いて、ヌードマウスの皮下に他家移植を行った。
（１）材料・試薬
・ポジテイブ・コントロールのヒト腎癌細胞株７８６Ｏ　ｍｏｃｋ
・ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎癌細胞株７８６Ｏ９９ＫＯ
　上記ポジテイブ・コントロール細胞株およびＳＮＯＲＤ９９欠損細胞株の作成方法は、次の通りである。
　７８６Ｏ　ｍｏｃｋおよび７８６Ｏ９９ＫＯは、Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９法により作成した。ヒト腎癌細胞株７８６Ｏ細胞にＣａｓ９を安定過剰発現させた後、ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｇｃｃｇｇｇｃｃｔｔｃｃａａｃｃｃｇｇｔ）をレンチウイルスにより導入しピューロマイシン耐性選択を行い７８６Ｏ９９ＫＯを作成した。ＳＮＯＲＤ９９遺伝子欠損は定量ＰＣＲおよびゲノムＤＮＡ配列決定により確認した。７８６Ｏ　ｍｏｃｋは７８６ＯにＣａｓ９を安定過剰発現させた後、ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡなしレンチウイルスを導入し薬剤耐性選択を行い作成した。
（２）方法
　ヌードマウス（雄性、４週令）の皮下に、ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎癌細胞株（７８６Ｏ９９ＫＯ）とポジテイブ・コントロールのヒト腎癌細胞株（７８６Ｏ　ｍｏｃｋ）を、５ｘ１０６個注入した。６週後の腎癌形成の様子を目視で観察し、移植腎癌細胞の直径を計測した。
（３）結果
　図３に示されるように、６週後に、ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎癌細胞株では、ポジテイブ・コントロールのヒト腎癌細胞株に比べて、腎癌形成が抑制されていた。移植腎癌の直径を、以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記表４に示すように、６週間後の移植腎癌の体積は、ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎がん細胞株（７８６Ｏ９９ＫＯ）では２１ｍｍ３であり、ポジテイブ・コントロール（７８６Ｏｍｏｃｋ）では、４３６ｍｍ３（ｐ＜０．０１）であった。
　以上のように、ＳＮＯＲＤ９９が欠損したヒト腎がん細胞株では、ヌードマウスに対するがん細胞の生着・増殖が顕著に抑制されることを見出した。このことは、腎癌で高発現のＳＮＯＲＤ９９を抑制すると、腎癌の増殖が抑制できることを示しており、ＳＮＯＲＤ９９の発現を抑制すれば、がん治療が可能であることを示している。
　本発明のがん治療剤は、がん細胞で特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡを発現抑制することによって、効果的にがん細胞の増殖を抑制し、新たな作用機序でがん治療を行うことが出来る。本発明のがん増殖抑制剤は、単剤で使用することができ、更には免疫賦活化のがん治療剤と併用して、その効果を高めることが出来る。それ故、本発明のがん増殖抑制剤としては、ｓｎｏＲＮＡを発現抑制ができるものとして、ｓｉＲＮＡやデコイ等の核酸医薬を使用することができ、新たながんの増殖抑制剤、更にはがんの治療剤として利用できる。

Claims (21)

  1. 　がん細胞で特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を有効成分とする、がんの増殖抑制剤。
  2. 　上記がん細胞が、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、胃癌のいずれかである、請求項１に記載のがんの増殖抑制剤。
  3. 　上記ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂ、ＳＮＯＲＡ６９、ＳＮＯＲＤ１１１、ＳＮＯＲＤ９９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、ＳＮＯＲＤ１０５Ｂ、ＳＮＯＲＤ３７、ＳＮＯＲＤ５４の中から一つ以上が選択されるものである、請求項１又は２に記載のがんの増殖抑制剤。
  4. 　上記がん細胞が、乳癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ５０Ｃ、ＳＮＯＲＡ５６、ＳＮＯＲＤ４２Ｂの中から一つ以上選択されるものである、請求項１又は２に記載の乳癌の増殖抑制剤。
  5. 　上記がん細胞が、結腸癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ５６及び／又はＳＮＯＲＡ６９である、請求項１又は２に記載の結腸癌の増殖抑制剤。
  6. 　上記がん細胞が、腎癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＤ１１１及び／又はＳＮＯＲＤ９９である、請求項１又は２に記載の腎癌の増殖抑制剤。
  7. 　上記がん細胞が、肝癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ７４Ａ及び／又はＳＮＯＲＤ９９である、請求項１又は２に記載の肝癌の増殖抑制剤。
  8. 　上記がん細胞が、肺癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＤ１０５Ｂ及び／又はＳＮＯＲＤ３７である、請求項１又は２に記載の肺癌の増殖抑制剤。
  9. 　上記がん細胞が、肺癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ７４Ａ及び／又はＳＮＯＲＤ５４である、請求項１又は２に記載の肺癌の増殖抑制剤。
  10. 　上記がん細胞が、胃癌の細胞であり、上記ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ６９である、請求項１又は２に記載の胃癌の増殖抑制剤。
  11. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号２のｓｉＲＮＡ、配列番号３のｓｉＲＮＡ、配列番号４のｓｉＲＮＡ、配列番号５のｓｉＲＮＡ、配列番号６のｓｉＲＮＡ、配列番号７のｓｉＲＮＡ、配列番号８のｓｉＲＮＡ、配列番号９のｓｉＲＮＡ、配列番号１０のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項１又は２に記載のがんの増殖抑制剤。
  12. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号１のｓｉＲＮＡ、配列番号２のｓｉＲＮＡ、配列番号３のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項２に記載の乳癌の増殖抑制剤。
  13. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号２のｓｉＲＮＡ、配列番号４のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項２に記載の結腸癌の増殖抑制剤。
  14. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号５のｓｉＲＮＡ、配列番号１０のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項２に記載の腎癌の増殖抑制剤。
  15. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号６のｓｉＲＮＡ、配列番号１０のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項２に記載の肝癌の増殖抑制剤。
  16. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号７のｓｉＲＮＡ、配列番号８のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項２に記載の肺癌の増殖抑制剤。
  17. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号６のｓｉＲＮＡ、配列番号９のｓｉＲＮＡの中から、一つ以上が選択されるものである、請求項２に記載の肺癌の増殖抑制剤。
  18. 　上記ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤が、配列番号４のｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の胃癌の増殖抑制剤。
  19. 　請求項１～１８のいずれかに記載のがんの増殖抑制剤を有効成分とする、がん治療剤。
  20. 　配列番号１～１０の何れかの塩基配列からなるＲＮＡ。
  21. 　ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項２０に記載のＲＮＡ。
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