WO2018139679A1 - 癌浸潤または転移阻害核酸薬および癌バイオマーカー - Google Patents

癌浸潤または転移阻害核酸薬および癌バイオマーカー Download PDF

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WO2018139679A1
WO2018139679A1 PCT/JP2018/003055 JP2018003055W WO2018139679A1 WO 2018139679 A1 WO2018139679 A1 WO 2018139679A1 JP 2018003055 W JP2018003055 W JP 2018003055W WO 2018139679 A1 WO2018139679 A1 WO 2018139679A1
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WO
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snora23
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hlmc
aso
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PCT/JP2018/003055
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賢二 中野
林 崔
聡 小比賀
剛史 山本
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賢二 中野
国立大学法人大阪大学
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid capable of inhibiting cancer invasion or metastasis and an anticancer agent containing the nucleic acid.
  • Pancreatic cancer or pancreatic ductal adenocarcinoma is invasive, has high metastatic potential, and has a poor prognosis. From ancient times, it has been known by pathological examination that the degree of malignancy and poor prognosis of cancer cells are related to the degree of nuclear and nucleolus atypia.
  • RNA Nucleolar small molecule RNA
  • SNORA42 Non-Patent Document 1
  • SNORA55 Non-Patent Document 2
  • h5sn2 Non-Patent Document 3
  • SNORD44 Non-Patent Document 4
  • SNORD50A / B Non-Patent Document 5
  • RNA interference for example, use of siRNA or miRNA
  • antisense method for example, use of siRNA or miRNA
  • nucleic acids such as nucleic acid utilization 0.
  • various artificial nucleic acids are used.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • AmNA amide-bridged nucleic acid
  • snoRNA which is nuclear non-translated RNA
  • a nucleic acid agent capable of suppressing snoRNA expression in vivo has not been established yet.
  • an effective therapeutic agent for eliminating cancer invasion and metastasis such as PDAC is used as a target gene.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid agent capable of suppressing the expression of nuclear untranslated RNA in vivo. Furthermore, an object of the present invention is to provide an antitumor agent comprising an expression inhibitor of snoRNA involved in cancer invasion and metastasis.
  • the present invention provides an antitumor agent containing a SNORA23 gene expression inhibitor.
  • the SNOR23 gene expression inhibitor includes a nucleic acid molecule that can bind to the SNORA23 gene and has an activity of suppressing the expression of the SNOR23 gene.
  • the nucleic acid molecule is an oligonucleotide that is complementary to the target region that is part of the base sequence of the SNORA23 gene shown in SEQ ID NO: 1 and is 12 to 20 bases in length, or Including pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the oligonucleotide or pharmacologically acceptable salt thereof comprises one or more nucleotides containing a sugar modifying moiety.
  • the oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof is A nucleoside structure represented by the following formula (I):
  • Base may have one or more purine-9-yl groups optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group, or may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group 2
  • a divalent group represented by R 1 is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group
  • the aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain one or more of the optional substituents and may contain a hetero atom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or an amino-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 13 and R 14 are each independently a hydrogen atom; a hydroxyl group; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring; A group selected from the group consisting of: an alkoxy group of 7; an amino group; and an amino group protected with a protecting group for nu
  • nucleoside structure represented by the formula (I) is
  • the nucleoside structure represented by the formula (I) is a structure represented by the formula (I ′), and in the formula (I ′), the m is 0, and R 1 is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group.
  • the oligonucleotide is a gapmer consisting of a 6-10 base gap region, 3-5 base 5 ′ wings and 3-5 base 3 ′ wings, The gap region is positioned between the 5 ′ wing and the 3 ′ wing, and the 5 ′ wing and the 3 ′ wing include a nucleoside structure represented by the above formula (I).
  • the SNORA23 gene expression inhibitor suppresses the expression of SYNE2.
  • the present invention also provides an antitumor agent containing a SYNE2 expression inhibitor.
  • the SYNE2 expression inhibitor includes a nucleic acid molecule capable of binding to SYNE2 and having an activity of suppressing the expression of SYN2.
  • the anti-tumor agent is an anti-tumor agent used for tumors having invasive or metastatic potential.
  • the antitumor agent is an antitumor agent used for the treatment or prevention of pancreatic cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer or gastric cancer.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition containing the antitumor agent.
  • the present invention still further provides the use of SNORA23 as a biomarker, characterized by measuring SNORA23 in blood samples to detect cancer invasion or metastasis.
  • RNA nuclear untranslated RNA
  • the present invention makes it possible to suppress the expression of snoRNA, which is an intranuclear untranslated RNA, in vivo. Furthermore, according to the present invention, the expression of snoRNA involved in cancer invasion or metastasis can be suppressed, and a therapeutic agent based on the antitumor effect can be provided.
  • FIG. 1a The figure which shows the result of cDNA microarray analysis of mRNA and untranslated RNA for the HLMC cells and parental cells of Suite2 and MIA PaCa2 cancer cells (FIG. 1a), CEA mRNA by qRT-PCR (FIG. 1b), and SNORA23 RNA (FIG. 1c) ); And a graph showing SNOR23 expression levels in various pancreatic cancer cell lines, normal pancreatic ductal epithelial (NPDE) cells, and cancer-associated fibroblasts (CAF) (FIG. 1d).
  • NPDE normal pancreatic ductal epithelial
  • CAF cancer-associated fibroblasts
  • FIG. 2 is a labeled fluorescence microscope image obtained by transfecting HLMC cells and parental cells of SNIT23 and MIA PaCa2 cancer cells and SNORA23 knockdown cells with a fluorescently labeled probe.
  • FIG. 2 is a boxplot of relative expression of SNORA23 in PDAC and normal liver and pancreatic tissues by qRT-PCR analysis. It is a graph which shows each survival curve of a disease-free survival rate and a total survival rate about each PDAC patient group of SNOR23 high expression produced according to the Kaplan-Meier method.
  • transfection with SNORA23 ASO # 1 (“SN-ASO # 1”)
  • transfection with SNORA23 ASO # 2 (“SN-ASO # 2”)
  • control ASO 2 is a graph showing the relative expression level of RNA by qRT-PCR analysis when each of the transfections (“Ctrl”) is performed. It is a graph which shows the typical image of the Matrigel invasion assay of HLMC cell ("HLMC”) and a parent cell (“WT”), and the number of infiltrating cells about Suite2 and MIA PaCa2.
  • a representative image of a soft agar colony formation assay and its magnified image for the transfection with SNORA23 pDNA (“SN-OE”) and mock pDNA transfection (“Mock”) for Sweet2 cells and MIA PaCa2 cells. is there.
  • SNORA23 pDNA SNORA23 pDNA
  • Mock mock pDNA transfection
  • IVIS image of mice treated with SNORA23 ASO # 1 (“SN-KD”: square) and their control mice (“Ctrl”: rhombus) for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells 2 is a graph showing daily changes in the amount of luciferase signal in the whole body of a mouse measured by crystallization, and a representative image showing a signal distribution.
  • MIA PaCa2-HLMC cells For MIA PaCa2-HLMC cells, representative images showing the signal distribution by IVIS imaging of liver and pancreas excised from SNOR23 ASO # 1 treated mice (SN-KD) and control mice (Ctrl) were measured and measured. It is a graph which shows the amount of luciferase signals (photon / second). Heat of cDNA microarray analysis when Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells were transfected with SNORA23ASO (“SN-KD”) and control ASO (“Ctrl”), respectively. A map (A) and a heat map (B) for proteomic analysis are shown.
  • SNORA23 ASO # 1 For Sweet2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells, in the case of their parent cells (WT) and untreated (HLMC), transfection with SNORA23 ASO # 1 (“SN-ASO # 1”), SNORA23 ASO # 2 is a graph showing the relative expression level of SYNE2 mRNA in the case of transfection with 2 (“SN-ASO # 2”), transfection with control ASO (“Ctrl ASO”), and untreated cases, respectively. is there.
  • SNORA23 ASO and SYNE2 pDNA transfection (“SNORA-ASO + SYNE2-pDNA”), SNORA23 ASO and mock pDNA transfection (“SNORA-ASO + Mock”), and control ASO and mock pDNA transfection (“Ctrl-ASO + Mock”)
  • SNORA-ASO + SYNE2-pDNA SNORA23 ASO and SYNE2 pDNA transfection
  • SNORA-ASO + Mock SNORA23 ASO and mock pDNA transfection
  • Ctrl-ASO + Mock A representative image of a Matrigel invasion assay of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells 48 hours after, and a graph showing the number of infiltrating cells are shown.
  • the first day when the transfection with SYN2 siRNA (SYNE2-KD; square) and the transfection with control siRNA (Ctrl: rhombus) was performed on the Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells ( 4 is a graph showing spheroid formation fluctuations on D1) to 4th day (D4).
  • SNORA23 ASO and SYNE2 pDNA transfection SYNE-OE + SN-KD
  • SNORA23 ASO and mock pDNA transfection SNORA23 ASO and mock pDNA transfection
  • control ASO and mock pDNA transfection 6 is a graph showing the spheroid formation variation on the first day (D1) to the fourth day (D4) when each of (Ctrl) is performed.
  • MNA PaCa2-HLMC cells, Suite2-HLMC cells, Hs766T cells, and S2-013 cell lines were transfected with SNORA23 ASO # 3 ((A) "SNORA23 # 153" or (B) "AN-ASO # 3 "), 48 hours after transfection (MIA PaCa2-HLMC cells and Hs766T cells) or 72 hours (Suit2-HLMC cells and S2-013) when transfection was performed with control ASO (" Ctrl "), respectively.
  • 2 is a graph showing a representative image (A) and the number of infiltrating cells (B) of a cell (matrigel invasion assay).
  • FIG. 4 is a graph showing the expression levels of SNORA23, SYNE2 and CEA in tumor tissue samples of spleen, pancreas and liver after 4 weeks and 5 weeks later. It is a photograph of tumor tissues of the spleen and liver after 3 weeks, 4 weeks and 5 weeks after the start of subcutaneous administration of ASO for each of the SNORA23 ASO subcutaneously administered mice and control mice. It is a graph which shows each survival curve of a disease-free survival rate and a total survival rate about each PDAC patient group of SNOR23 high expression produced according to the Kaplan-Meier method.
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, An n-butyl group, an n-pentyl group, or an n-hexyl group.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methyloxy group, an ethyloxy group, and an n-propyloxy group.
  • a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having an arbitrary linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples thereof include a methyloxy group, an ethyloxy group, an n-propyloxy group, an isopropyloxy group, an n-butyloxy group, an isobutyloxy group, a tert-butyloxy group, an n-pentyloxy group, and an isopentyloxy group.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group, and an n-propylthio group.
  • a linear or branched alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having an arbitrary linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples include a methylthio group, an ethylthio group, an n-propylthio group, an isopropylthio group, an n-butylthio group, an isobutylthio group, a tert-butylthio group, an n-pentylthio group, and an isopentylthio group.
  • C1-C6 cyanoalkoxy group refers to a group in which at least one hydrogen atom constituting the straight-chain alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is substituted with a cyano group.
  • linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms means a group in which one or two hydrogen atoms constituting the amino group are substituted with a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Is included. Examples thereof include a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, a methylethylamino group, and a diethylamino group.
  • a linear or branched alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms means any linear or branched group in which one or two hydrogen atoms constituting the amino group are 1 to 6 carbon atoms. Includes groups substituted with chain alkyl groups.
  • Examples include methylamino group, dimethylamino group, ethylamino group, methylethylamino group, diethylamino group, n-propylamino group, di-n-propylamino group, isopropylamino group, diisopropylamino group and the like.
  • an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring means any linear alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms. Includes a chain alkyl group and any cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms. It may be simply referred to as “lower alkyl group”.
  • arbitrary linear alkyl groups having 1 to 7 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, and n-heptyl group.
  • Examples of the branched alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include isopropyl group, isobutyl group, tert-butyl group, isopentyl group and the like, and optional cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include A cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, etc. are mentioned.
  • an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring means any linear alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms. Chain alkenyl groups, and any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms are included. It may be simply referred to as “lower alkenyl group”.
  • Examples of the branched alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms include isopropenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl -2-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-butenyl group, etc., and any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms includes a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • an alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring means any linear alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms. It includes a chain alkoxy group and any cyclic alkoxy group having 3 to 7 carbon atoms. It may be simply referred to as “lower alkoxy group”.
  • any linear alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms includes a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an n-butoxy, an n-pentyloxy group, an n-hexyloxy group, and an n-heptyloxy group.
  • Examples of the branched alkoxy group having 3 to 7 carbon atoms include isopropoxy group, isobutoxy group, tert-butoxy group, isopentyloxy group, etc., and any cyclic group having 3 to 7 carbon atoms
  • Examples of the alkoxy group include a cyclobutoxy group, a cyclopentyloxy group, and a cyclohexyloxy group.
  • an aryl group having 3 to 12 carbon atoms that may contain a heteroatom refers to any aryl group having 6 to 12 carbon atoms, which is composed of only hydrocarbons, and the aryl group. Including any heteroaryl group having 3 to 12 carbon atoms in which at least one carbon atom constituting the ring structure is substituted with a heteroatom (eg, a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom, and combinations thereof) To do.
  • a heteroatom eg, a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom, and combinations thereof
  • Examples of the aryl group having 6 to 12 carbon atoms include a phenyl group, a naphthyl group, an indenyl group, and an azulenyl group, and examples of the heteroaryl group having 3 to 12 carbon atoms include a pyridyl group, a pyrrolyl group, A quinolyl group, an indolyl group, an imidazolyl group, a furyl group, a thienyl group, and the like can be given.
  • aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom examples include a benzyl group, a phenethyl group, a naphthylmethyl group, a 3-phenylpropyl group, -Phenylpropyl, 4-phenylbutyl, 2-phenylbutyl, pyridylmethyl, indolylmethyl, furylmethyl, thienylmethyl, pyrrolylmethyl, 2-pyridylethyl, 1-pyridylethyl, 3 -Thienylpropyl group and the like.
  • examples of the term “acyl group” include aliphatic acyl groups and aromatic acyl groups.
  • examples of the aliphatic acyl group include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, pentanoyl group, pivaloyl group, valeryl group, isovaleryl group, octanoyl group, nonanoyl group, decanoyl group, 3-methylnonanoyl group, 8-methylnonanoyl group, 3-ethyloctanoyl group, 3,7-dimethyloctanoyl group, undecanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, tetradecanoyl group, pentadecanoyl group, hexadecanoyl group, 1-methylpentadecanoyl group, 14-methylpentadecanoyl group, 13,13-
  • aromatic acyl group examples include arylcarbonyl groups such as benzoyl group, ⁇ -naphthoyl group and ⁇ -naphthoyl group; halogenoarylcarbonyl groups such as 2-bromobenzoyl group and 4-chlorobenzoyl group; 2 , 4,6-trimethylbenzoyl group, lower alkylated arylcarbonyl group such as 4-toluoyl group; lower alkoxylated arylcarbonyl group such as 4-anisoyl group; 2-carboxybenzoyl group, 3-carboxybenzoyl group, 4 A carboxylated arylcarbonyl group such as a carboxybenzoyl group; a nitrated arylcarbonyl group such as a 4-nitrobenzoyl group or a 2-nitrobenzoyl group; a lower alkoxycarbonylated arylcarbonyl such as a 2- (methoxycarbonyl) benzoyl
  • sil group examples include trimethylsilyl group, triethylsilyl group, isopropyldimethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, methyldiisopropylsilyl group, methyldi-t-butylsilyl group, and triisopropylsilyl group.
  • a tri-lower alkylsilyl group such as diphenylmethylsilyl group, butyldiphenylbutylsilyl group, diphenylisopropylsilyl group, tri-lower alkylsilyl group substituted with 1 to 2 aryl groups such as phenyldiisopropylsilyl group, etc.
  • a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, and a t-butyldiphenylsilyl group are preferable, and a trimethylsilyl group is more preferable.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom. Preferable is a fluorine atom or a chlorine atom.
  • protecting group for amino group for nucleic acid synthesis is capable of stably protecting an amino group, a hydroxyl group, a phosphate group or a mercapto group during nucleic acid synthesis. If it is, it will not be restrict
  • protecting group that is stable under acidic or neutral conditions and can be cleaved by chemical methods such as hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, and photolysis.
  • protecting groups include lower alkyl groups, lower alkenyl groups, acyl groups, tetrahydropyranyl or tetrahydrothiopyranyl groups, tetrahydrofuranyl or tetrahydrothiofuranyl groups, silyl groups, lower alkoxymethyl groups, lower alkoxy groups.
  • examples of the tetrahydropyranyl group or tetrahydrothiopyranyl group include a tetrahydropyran-2-yl group, a 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, a 4-methoxytetrahydropyran-4-yl group, a tetrahydro Examples include a thiopyran-4-yl group and a 4-methoxytetrahydrothiopyran-4-yl group.
  • examples of the tetrahydrofuranyl group or the tetrahydrothiofuranyl group include a tetrahydrofuran-2-yl group and a tetrahydrothiofuran-2-yl group.
  • Examples of the lower alkoxymethyl group include a methoxymethyl group, a 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl group, an ethoxymethyl group, a propoxymethyl group, an isopropoxymethyl group, a butoxymethyl group, and a t-butoxymethyl group.
  • Examples of the lower alkoxylated lower alkoxymethyl group include 2-methoxyethoxymethyl group.
  • Examples of the halogeno lower alkoxymethyl group include 2,2,2-trichloroethoxymethyl group and bis (2-chloroethoxy) methyl group.
  • Examples of the lower alkoxylated ethyl group include 1-ethoxyethyl group and 1- (isopropoxy) ethyl group.
  • Examples of the halogenated ethyl group include 2,2,2-trichloroethyl group.
  • Examples of the methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups include benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, ⁇ -naphthyldiphenylmethyl group, 9-anne.
  • Examples include a thrylmethyl group.
  • Examples of the “methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups in which the aryl ring is substituted with a lower alkyl group, lower alkoxy group, halogen atom or cyano group” include 4-methylbenzyl group, 2,4,6- Trimethylbenzyl group, 3,4,5-trimethylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group, 2-nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 4-cyanobenzyl group and the like.
  • Examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, and an isobutoxycarbonyl group.
  • Examples of the “aryl group substituted with a halogen atom, lower alkoxy group or nitro group” include 4-chlorophenyl group, 2-fluorophenyl group, 4-methoxyphenyl group, 4-nitrophenyl group, 2,4-dinitrophenyl group Etc.
  • Examples of the “lower alkoxycarbonyl group substituted with a halogen atom or tri-lower alkylsilyl group” include 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group, 2-trimethylsilylethoxycarbonyl group and the like.
  • Examples of the alkenyloxycarbonyl group include a vinyloxycarbonyl group and an aryloxycarbonyl group.
  • Examples of the “aralkyloxycarbonyl group whose aryl ring may be substituted with a lower alkoxy or nitro group” include benzyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl group, 2-nitro Examples include benzyloxycarbonyl group, 4-nitrobenzyloxycarbonyl group and the like.
  • Examples of the “lower alkoxycarbonyl group substituted with a cyano group” include a cyanoethoxycarbonyl group.
  • Examples of the “benzenesulfonyl group substituted with 1 to 4 nitro groups” include 2-nitrobenzenesulfonyl group, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group and the like.
  • the “hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups, “lower alkyl, lower alkoxy, halogen, cyano” A methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups substituted with an aryl ring by a group ”, or a silyl group, and more preferably an acetyl group, a benzoyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzoyl group, a dimethoxy group A trityl group, a monomethoxytrityl group or a tert-butyldiphenylsilyl group;
  • Preferred examples of the protecting group for the “hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” include aliphatic acyl groups, aromatic acyl groups, “methyl groups substituted with 1 to 3 aryl groups
  • the “protecting group for the amino group for nucleic acid synthesis” is preferably an acyl group, more preferably a benzoyl group.
  • the “protecting group” of the “phosphate group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a cyano group, an aralkyl group, a “nitro group or a halogen atom”.
  • the protecting group constituting the “phosphate group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” may be one or more.
  • the “protecting group” of the “mercapto group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably an aliphatic acyl group or an aromatic acyl group, and more preferably a benzoyl group.
  • —P (R 24 ) R 25 wherein R 24 and R 25 are each independently a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 24 can be represented as —OR 24a and R 25 can be represented as —N (R 25a ) 2. It is called “phosphoramidite group”.
  • the phosphoramidite group is preferably a group represented by the formula —P (OC 2 H 4 CN) (N (iPr) 2 ) or a formula —P (OCH 3 ) (N (iPr) 2 ). And the group represented.
  • iPr represents an isopropyl group.
  • nucleoside refers to a “nucleoside” in which a purine or pyrimidine base is linked to a sugar, and substitution of a purine or pyrimidine base with aromatic heterocycles and aromatic hydrocarbon rings other than purine and pyrimidine. And “nucleosides” with sugars attached. Natural nucleosides are also referred to as “natural nucleosides”. A modified non-natural nucleoside is also referred to as a “modified nucleoside”, and a nucleotide having a modified sugar moiety is particularly referred to as a “sugar-modified nucleoside”. “Nucleotide” means a compound in which a phosphate group is bonded to a nucleoside sugar.
  • oligonucleotide is a polymer of “nucleotide” in which 2 to 50 identical or different “nucleosides” are linked by a phosphodiester bond or other bond, and is a natural type and a non-natural type. Includes types.
  • a sugar derivative in which the sugar moiety is modified a thioate derivative in which the phosphodiester moiety is thioated; an ester in which the terminal phosphate moiety is esterified; Examples include amides in which the amino group on the base is amidated, and more preferably, sugar derivatives in which the sugar moiety is modified.
  • a salt thereof refers to a salt of a compound represented by the following formula (II).
  • examples of such salts include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt, Metal salts such as nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts Guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine
  • the term “pharmacologically acceptable salt thereof” refers to a salt of an oligonucleotide analog containing at least one nucleoside structure represented by the formula (I) of the present invention.
  • Physiologically and pharmaceutically acceptable salts of the oligonucleotides i.e., salts that retain the desired biological activity of the oligonucleotide and do not impart undesired toxicological effects there.
  • salts include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt, Metal salts such as nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts Guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris (Hydroxy Amine salts such as organic salts such as
  • the present invention provides an antitumor agent containing a SNORA23 gene expression inhibitor.
  • the SNORA23 gene expression inhibitor includes a nucleic acid molecule that can bind to the SNORA23 gene and has an activity of suppressing the expression of the SNORA23.
  • binding to the SNORA23 gene includes, for example, direct binding to the SNORA23 gene and binding to RNA expressed from the SNORA23 gene.
  • Activity capable of binding to the SNORA23 gene and suppressing the expression of the SNORA23 means, for example, that an expression inhibitor binds to the SNORA23 RNA, which is a non-coding RNA expressed from the SNORA23 gene, and then the RNA is RNase H. It includes that the amount of RNA expressed by SNORA23 is suppressed as a result of degradation by action.
  • can bind means that a plurality of different single-stranded oligonucleotides or nucleic acids can form a nucleic acid having two or more strands by complementation of nucleobases. Preferably, it means that a double-stranded nucleic acid can be formed.
  • T m melting temperature
  • the melting temperature (T m ) of the double-stranded nucleic acid can be determined, for example, as follows: Buffer (8.1 mM Na 2 HPO 4 , 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , pH 7.2) ), The oligonucleotide and the target RNA are mixed in an equimolar amount, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then slowly cooled to room temperature and annealed to form a double-stranded nucleic acid. The temperature of the double-stranded nucleic acid was heated from 20 ° C. to 95 ° C.
  • Tm Melting temperature ( Tm ) is 40 degreeC or more, for example, Preferably it is 50 degreeC or more.
  • “complementary” means that two different single-stranded oligonucleotides or nucleic acids have a pairing relationship capable of forming a double-stranded nucleic acid.
  • the base sequence of the region forming the double strand is completely complementary, but may have one or several mismatches as long as it can form the double-stranded nucleic acid and has the effect of suppressing expression.
  • One or several mismatches may depend on the length of the oligonucleotide, but means 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 mismatches.
  • the oligonucleotide of the present invention preferably has complete (100%) complementarity to the base sequence of the region forming a double strand.
  • an antisense oligonucleotide As a nucleic acid molecule capable of binding to the SNORA23 gene and having an activity of suppressing the expression of the SNORA23 gene, an antisense oligonucleotide (ASO), siRNA, shRNA, DNA / RNA hybrid targeting the SNORA23 gene or Examples include chimeric oligonucleotides and aptamers.
  • An antisense oligonucleotide (ASO) is a gene that can bind to RNA / DNA of a target gene, has an activity of suppressing the expression of the target gene, and is complementary to the RNA / DNA sequence of the target gene. A single-stranded oligonucleotide.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA small hairpin RNA: small hairpin RNA or short hairpin RNA: short hairpin RNA
  • shRNA small hairpin RNA sequence used for gene silencing by RNA interference.
  • a double-stranded oligonucleotide composed of DNA and RNA that inhibits expression of a target gene for example, Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • RNA is a DNA / RNA in which one of the double strands is DNA and the other is RNA Even a hybrid may be a DNA / RNA chimera in which part of the same strand is DNA and the other part is RNA.
  • a double-stranded oligonucleotide is preferably 19 to 25 base pairs, more preferably 19 to 23 base pairs, and even more preferably 19 to 21 base pairs in length.
  • the sense strand is preferably DNA and the antisense strand is preferably RNA.
  • a part of the upstream of the double-stranded oligonucleotide is RNA. Some are preferred.
  • Such an oligonucleotide can be prepared as having an arbitrary sequence according to a known chemical synthesis method.
  • An aptamer may be a generic term for nucleic acid molecules or peptides that specifically bind to a specific molecule, and the nucleic acid may be either RNA or DNA.
  • SNOR23 gene expression inhibitor can bind to a target region that is an arbitrary part of SEQ ID NO: 1.
  • the target region is particularly preferably a region related to the activity of suppressing the expression of SNORA23 or the knockdown activity.
  • the target region is, for example, 12 to 25 bases long, preferably 12 to 23 bases long, more preferably 13 to 23 bases long, more preferably 14 to 23 bases long, particularly preferably 15 to 23 bases long, particularly preferably.
  • the region may be 15-20 bases long.
  • Nucleic acid molecule or oligonucleotide binds to target region means that the nucleic acid molecule or oligonucleotide does not necessarily form two or more strands (preferably double strands) with the entire target region, and the expression of SNORA23 gene As long as it exhibits the activity of suppressing or knockdown activity, it may form two or more chains (preferably two chains) with a region that is a part of the target region.
  • the nucleic acid molecule of the SNORA23 gene expression inhibitor is complementary to the target region, for example, and preferably has perfect complementarity.
  • the nucleic acid molecule is an oligonucleotide that is complementary to the target region that is part of the base sequence of the SNORA23 gene shown in SEQ ID NO: 1 and is 12-20 bases in length, or Including pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the term “complementary to the target region” means either or both of the case where it is complementary to the target region on the SNORA23 gene and the case where it is complementary to the base of the region on the RNA corresponding to the target region. including.
  • Such an oligonucleotide (for example, an antisense oligonucleotide) is, for example, 12 to 20 bases, preferably 13 to 20 bases, more preferably 14 to 20 bases, particularly preferably 15 to 18 bases in length. Due to the length of the oligonucleotide as described above, binding to the nuclear non-translated RNA SNORA23 gene and suppression of nuclear non-translated RNA expression (for example, knockdown) can be performed more effectively.
  • target region for example, a region consisting of a sequence of 12 to 20 bases in the region from position 1 to position 35, position 71 to position 100, position 131 to position 170 of SEQ ID NO: 1 can be selected. .
  • nucleotide sequence of the SNOR23 gene expression inhibitor oligonucleotide examples include the following sequences: gatagaact atgca (SEQ ID NO: 2); gccaggtggta gagt (SEQ ID NO: 3); tggcccagtgg tagat (SEQ ID NO: 4).
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 targets the 19th to 33rd region from the 5 ′ terminal site of the SNORA23 gene base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a sequence complementary to the base sequence of the region It can be an antisense oligonucleotide.
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 targets the 151st to 165th region from the 5 'end of the nucleotide sequence of the SNORA23 gene shown in SEQ ID NO: 1, and has a sequence complementary to the nucleotide sequence of the region It can be an antisense oligonucleotide.
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 targets the 153rd to 167th region from the 5 ′ end site of the base sequence of the SNORA23 gene shown in SEQ ID NO: 1, and has a sequence complementary to the base sequence of the region It can be a sense oligonucleotide.
  • Each base sequence of SEQ ID NOs: 2 to 4 is represented in the 5 ′ to 3 ′ direction (5 ′ ⁇ 3 ′), and is a reverse complementary sequence to each target region sequence in SEQ ID NO: 1.
  • SNOR23 gene expression inhibitory activity (knockdown activity) can be measured by a known method (for example, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)).
  • qRT-PCR quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • oligonucleotide includes an oligonucleotide in which naturally occurring DNA or RNA is chemically modified. Such modifications alter the activity of the oligonucleotide. For example, it increases affinity for target nucleic acids, increases resistance to nucleases, and alters the pharmacokinetics or tissue distribution of oligonucleotides. Increasing the affinity of the oligonucleotide for its target may allow the use of shorter oligonucleotides.
  • the oligonucleotide of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof comprises one or more nucleotides containing a sugar modifying moiety.
  • the present invention includes oligonucleotides as described below and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the oligonucleotide of the present invention contains at least one sugar-modified nucleoside at any position.
  • This sugar-modified nucleoside has a predetermined bridge between the 2-position and 4-position of the sugar ring.
  • the sugar-modified nucleoside in the present invention will be described below.
  • the sugar-modified nucleoside in the present invention has a nucleoside structure represented by the following formula (I):
  • Base may have one or more purine-9-yl groups optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group, or may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group 2
  • a divalent group represented by R 1 is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group
  • the aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain one or more of the optional substituents and may contain a hetero atom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or an amino-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 1 is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group
  • nucleoside structure represented by the formula (I) is
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a carbon number that may form a branch or a ring.
  • Ar 1 is an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a hetero atom, and more preferably R 1 is hydrogen An atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and more preferably, R 1 is a hydrogen atom or a methyl group.
  • m is an integer from 0 to 2; and in formula (I ′′), n is an integer from 0 to 1. That is, 2 ′ position, 3 ′ position, 4 ′ position. , And the ring containing the bridge is a 5-membered to 7-membered ring.
  • X is an oxygen atom, a sulfur atom, an amino group, or a methylene group.
  • X is an oxygen atom or an amino group.
  • X is an amino group or a methylene group. In some cases, it may be substituted with a lower alkyl group.
  • the nucleoside structure represented by the above formula (I) is a structure represented by the above formula (I ′), and in this formula (I ′), m is 0, and R 1 is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group.
  • Such a nucleoside structure is also referred to as amide-bridged nucleic acid, amide BNA (Bridged Nucleic Acid), or AmNA.
  • nucleoside structure represented by the above formula (I) examples include the following formula (II) in addition to the above formulas (I ′) and (I ′′):
  • R 13 and R 14 are as described above.
  • R 13 and R 14 are hydrogen atoms, 2 ′, 4′-BNA or LNA (Locked Nucleic Acid) (in this specification, “2 ′, 4′-BNA / LNA” or simply (Also referred to as “LNA”).
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the “Base” is a purine base (ie, purin-9-yl group) or a pyrimidine base (ie, 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group). These bases are a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and 1 to carbon atoms. It may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group consisting of 6 linear alkylamino groups and halogen atoms.
  • Base examples include adenylyl group, guaninyl group, cytosynyl group, urasilyl group, and thyminyl group, 6-aminopurin-9-yl group, 2,6-diaminopurin-9-yl group, 2 -Amino-6-chloropurin-9-yl group, 2-amino-6-fluoropurin-9-yl group, 2-amino-6-bromopurin-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurine- 9-yl group, 6-amino-2-methoxypurin-9-yl group, 6-amino-2-chloropurin-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl group, 2,6 -Dimethoxypurin-9-yl group, 2,6-dichloropurin-9-yl group, 6-mercaptopurin-9-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-d
  • Base has the following structural formula from the viewpoint of introduction into nucleic acid medicine:
  • a thyminyl group, a cytosynyl group, an adenylyl group, a guaninyl group, a 5-methylcytosinyl group and a urasilyl group 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidine- 1-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, 6-aminopurin-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group, 4 -Amino-5-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group and 2-oxo-4-hydroxy-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group are preferred, 2-Oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl and thyminyl groups are preferred. Further, in the synthesis of the oligonucleotide, it is preferable that
  • Oligonucleotides containing at least one sugar-modified nucleoside structure as described above can be obtained using, for example, sugar-modified nucleoside compounds, for example, WO 2011/052436, JP-A No. 2014-043462, and International Publication No. 2014/2014 / Can be synthesized using methods such as those described in US Pat.
  • sugar-modified nucleoside compounds include compounds represented by the following formula (III) or salts thereof:
  • Base may have one or more purine-9-yl groups optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group, or may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group 2
  • a divalent group represented by R 1 is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group
  • the aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain one or more of the optional substituents and may contain a hetero atom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or an amino-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 13 and R 14 are each independently a hydrogen atom; a hydroxyl group; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring; A group selected from the group consisting of: an alkoxy group of 7; an amino group; and an amino group protected with a protecting group for nu
  • a silyl group selected from the ⁇ group
  • a phosphate group optionally having one or more substituents, a phosphate group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, -P (R 24 ) R 25 [wherein R 24 and R 25 are each Independently, a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis
  • a sugar-modified nucleotide can be easily prepared from the sugar-modified nucleoside as described above.
  • triphosphorylation can be easily performed according to the method described in M. Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., 2008, vol.36, No.13, pp.4257-65.
  • Nuclear non-translated RNA is one of non-coding RNAs and refers to RNA that exists in the nucleus and functions without being translated into protein.
  • Such nuclear non-translated RNA nucleolar small molecule RNA (snoRNA)
  • snoRNA nucleolar small molecule RNA
  • the snoRNA is localized in the nucleolus in the nucleus, forms a complex with the protein (nuclear small ribonucleic acid protein (snoRNP)), and can catalyze the modification of the RNA molecule.
  • the snoRNA is mainly divided into two types, boxC / D and boxH / ACA, depending on the sequence.
  • the sequence information of snoRNA can be obtained from a gene database (for example, GenBank by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), snOPY of Miyazaki University, etc.).
  • SNORA23 is a nucleolar small molecule RNA identified as "ACA23 snoRNA” or "small nucleolar RNA, H / ACA box 23".
  • the nucleotide sequence information of the human SNORA23 gene is GenBank accession number: AJ609438 ("Homo sapience ACA23 snoRNA gene"), NCBI reference sequence accession number: NR_002962 (Homo sapiens small nucleoRNA, NOHA23SRNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNORNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23, SNARNA23,
  • nucleotide modification known in the art other than the above sugar modification can be used for the antisense oligonucleotide of the present invention.
  • Known modifications of nucleotides include phosphate modification and nucleobase modification. Such nucleic acid modification can be performed based on a method known in the art.
  • Examples of phosphoric acid modifications include phosphodiester bonds, S-oligos (phosphorothioates), D-oligos (phosphodiesters), M-oligos (methyl phosphonates), boranophosphates, etc. possessed by natural nucleic acids.
  • S-oligo (phosphorothioate) has a PS skeleton in which the oxygen atom of the phosphate group of the phosphodiester bond between nucleosides is replaced with a sulfur atom. This modification is incorporated into the oligonucleotide according to known methods.
  • An antisense oligonucleotide having one or more of these modifications in the oligonucleotide is called S-oligo type (phosphorothioate type).
  • nucleobase modification examples include 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, 5-propynylcytosine and the like.
  • the position and number of sugar-modified nucleosides are not particularly limited and can be appropriately designed according to the purpose.
  • Two or more sugar-modified nucleosides include, for example, the same as each other or different from each other.
  • the oligonucleotide of the present invention (especially in the case of a single-stranded oligonucleotide) is preferably a gapmer.
  • a gapmer is an oligonucleotide comprising a central “gap” and regions on both sides of the gap, two wings, that is, a “5 ′ wing” on the 5 ′ side and a “3 ′ wing” on the 3 ′ side. means.
  • the gap region can be 6-10 bases long and the wing region can be 3-5 bases long.
  • the gap is made up of natural nucleosides and the wing can contain at least one modified nucleotide.
  • the oligonucleotide of the present invention contains at least one, preferably 1 to 5, more preferably 2 to 3, sugar-modified nucleosides in “5 ′ wing” and / or “3 ′ wing”.
  • the gapmer consists of a 6-10 base gap region, a 3-5 base 5 ′ wing, and a 3-5 base 3 ′ wing, where the gap region is between the 5 ′ wing and the 3 ′ wing.
  • the 5 ′ wing and the 3 ′ wing may contain at least one nucleoside structure represented by the above formula (I).
  • phosphoric acid modification, base modification, etc. may be included.
  • the type, number, and position of the modification in one wing may be the same as or different from the type, number, and position of the modification in the other wing.
  • gapmers examples include 3-8-3-1, 3-9-3-1, 3-10-2-1, 3-10-3, 5-10-5, and the like.
  • the 8 bases of the gap are natural nucleosides (DNA)
  • the 5 ′ wing (3 bases from the 5 ′ end) is a sugar-modified nucleoside
  • the 3 ′ wing 3 bases from the center side among 3 bases from the 3 ′ end are sugar-modified nucleosides
  • the last 1 base (3 ′ terminal base) is a natural nucleoside (DNA).
  • 3-8-3-1 is preferred.
  • the oligonucleotide of the present invention can be synthesized by a conventional method using the sugar-modified nucleoside and the natural nucleoside as described above.
  • a commercially available automatic nucleic acid synthesizer for example, Applied Biosystems, Gene Design Co., Ltd.). Etc.
  • Examples of the synthesis method include a solid phase synthesis method using phosphoramidite and a solid phase synthesis method using hydrogen phosphonate. For example, it is disclosed in Tetrahedron Letters, 1981, vol. 22. pp.1859-1862, International Publication No. 2011/052436, and the like.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be incorporated into cells by administration alone without using a delivery device.
  • Non-nuclear untranslated RNA or snoRNA antisense oligonucleotides, such as SNORA23, are produced in vivo due to nuclease resistance and in vivo stability when made using, for example, 2 ′, 4′-BNA / LNA.
  • SNOR23 is a highly metastatic cancer cell (for example, a highly metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell (for example, a Suit2-HLMC cell and MIA PaCa2- cell established according to “In vivo selection of a highly metastatic PDAC cell line” in the following Examples).
  • HLMC cells highly metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma
  • SNOR23 gene expression and the degree of expression suppression can be measured by a known method (for example, qRT-PCR).
  • SNORA23 may be involved in tumor cell proliferation and cancer cell (malignant tumor cell) invasiveness and metastatic potential.
  • SNORA23 expression suppression suppresses tumor cell growth suppression (decrease in tumor formation ability), suppression of cancer cell (malignant tumor cell) seeding (decrease in invasiveness), and reduction of metastasis (reduction in metastasis ability). Can occur. Tumor cell growth, invasion and metastasis can be determined based on the procedures described in the examples below.
  • anti-tumor refers to tumor cell growth suppression (decrease in tumor formation ability), cancer cell (malignant tumor cell) dissemination suppression (invasion reduction) and metastasis reduction (metastasis ability reduction). Exhibit at least one effect, preferably all these effects.
  • the expression of snoRNA (SNARA23) specifically highly expressed in cancer can be suppressed in vivo.
  • the antitumor agent of the present invention is an antisense oligonucleotide, such expression suppression can be carried out by single administration without using a delivery device.
  • the SNORA23 gene expression inhibitor can suppress the expression of the SYNE2 gene.
  • SYNE2 gene is “Homo sapiens spectrin repeat containing nuclear envelope protein 2 (SYNE2), RefSeqGene on chromosome 14" (GenBank accession number: NG_011756); (GenBank accession number: NM_015180); “Homo sapiens spectrin repeat containing, nuclear envelope 2 (SYNE2), transcript variant 2, ⁇ mRNA ”(GenBank accession number: NM_182910). Is possible.
  • protein amino acid sequence information can be obtained from “nesprin-2 isoform 1 [Homo sapiens]” (GenBank registration number: NP_055995) and “nesprin-2 isoform 2 [Homo sapiens]” (GenBank registration number: NP_878914). is there. Variant 1 and variant 2 may have different transcription start sites. SYNE2 may also be referred to as EDMD5, NUA, NUANCE, Nesp2, Nesprin-2, SYNE-2, TROPH.
  • SYN2, variant 2, mRNA (GenBank accession number: NM — 182910) described in the following examples is shown in SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 9 The nucleotide sequence of SYN2, variant 2, mRNA (GenBank accession number: NM — 182910) described in the following examples is shown in SEQ ID NO: 8
  • the corresponding amino acid sequence (GenBank accession number: NP — 878914) is shown in SEQ ID NO: 9.
  • the present invention also provides an antitumor agent comprising a SYNE2 gene expression inhibitor.
  • the SYNE2 gene expression inhibitor includes a nucleic acid molecule capable of binding to the SYNE2 gene and having an activity of suppressing the SYNE2 gene expression.
  • nucleic acid molecules include siRNA, DNA / RNA hybrid or chimeric polynucleotide, antisense oligonucleotide and the like as described above.
  • binding to the SYNE2 gene includes direct binding to the SYNE2 gene and binding of the SYNE2 gene to mRNA or mRNA precursor.
  • the nucleic acid molecule that can bind to the SYNE2 gene and has an activity of suppressing the expression of the SYNE2 gene is an siRNA of the SYNE2 gene.
  • SYNE2 siRNA is available from various suppliers (for example, Thermo Fisher Scientific). As an example, siRNA manufactured by Thermo Fisher Scientific has an siRNA ID number: s23328.
  • the antitumor agent of the present invention is a SNORA23 gene expression inhibitor (for example, a nucleic acid molecule capable of binding to SNORA23 and having the activity of suppressing the expression of SNOR23 gene, a SNORA23 antisense oligonucleotide, etc.) or a SYNE2 gene expression inhibitor (for example, , A nucleic acid molecule capable of binding to the SYNE2 gene and having an activity of suppressing the expression of the SYNE2 gene, siRNA of the SYNE2 gene, and the like.
  • the antitumor agent may contain both of these.
  • the antitumor agent of the present invention can be formulated to produce a pharmaceutical composition.
  • the antitumor agent and the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by administration methods known in the art. They can be administered in a variety of ways depending on the local or systemic treatment or the area to be treated.
  • the present invention further provides a method for treating a tumor or cancer disease, comprising administering an effective amount of the antitumor agent to a subject in need thereof.
  • treatment includes all medically acceptable types of prophylactic and / or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate, or prevent a disease (in the present invention a tumor or cancer disease). It shall be.
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, and more preferably a human individual.
  • a subject can be a subject suffering from or at risk of suffering from a tumor or cancer disease.
  • the antitumor agent of the present invention is used for tumors having invasive or metastatic potential.
  • the antitumor agent of the present invention can be used for treatment of various cancers: for example, brain tumor, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, stomach cancer, appendix cancer, colon cancer, liver cancer, gallbladder cancer , Bile duct cancer, pancreatic cancer, adrenal cancer, gastrointestinal stromal tumor, mesothelioma (pleura, peritoneum, pericardium, etc.), head and neck cancer, laryngeal cancer, oral cancer, gingival cancer, tongue cancer, buccal mucosa cancer, salivary gland cancer , Sinus cancer, thyroid cancer, kidney cancer, lung cancer, osteosarcoma, prostate cancer, testicular cancer (testicular cancer), renal cell cancer, bladder cancer, rhab
  • the antitumor agent of the present invention can be applied medically as a therapeutic agent that inhibits the progression of cancer in patients with intractable cancer such as pancreatic cancer, lung cancer, and peritoneal dissemination (ovarian cancer / gastric cancer) and prolongs survival.
  • the antitumor agent of the present invention is used for the treatment of pancreatic cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer or gastric cancer.
  • the “effective amount” is an amount that reduces the onset of the target disease, reduces symptoms, or prevents progression, and preferably is an amount that prevents the onset of the target disease or cures the target disease. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like, or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig. Such test methods are well known to those skilled in the art.
  • the specific dose of medication to be administered depends on various conditions related to the subject requiring treatment, such as severity of symptoms, general health of the subject, age, weight, subject sex, diet, method of administration, timing and frequency. It can be determined in consideration of combination drugs, therapeutic response, compliance with therapy, and the like.
  • the administration method may be, for example, topical (including eye drops, intravaginal, rectal, intranasal, transdermal), oral, or parenteral.
  • Parenteral administration includes intravenous injection or infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, pulmonary administration by inhalation or inhalation, intrathecal administration, intraventricular administration, and the like.
  • preparations such as transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids, powders and the like can be used.
  • Oral administration agents include powders, granules, suspensions or solutions dissolved in water or non-aqueous media, capsules, powders, tablets and the like.
  • parenteral, intrathecal, or intraventricular administration agent examples include sterile aqueous solutions containing buffers, diluents, and other appropriate additives.
  • the medicament of the present invention is an antitumor agent of the present invention, or a SNORA23 gene expression inhibitor (for example, a nucleic acid molecule capable of binding to the SNORA23 gene and having an activity of suppressing the SNORA23 gene expression, a SNORA23 antisense oligonucleotide, etc.)
  • a SNORA23 gene expression inhibitor for example, a nucleic acid molecule capable of binding to the SNORA23 gene and having an activity of suppressing the SNORA23 gene expression, a SNORA23 antisense oligonucleotide, etc.
  • An excipient for example, a binder, a wetting agent, a disintegrating agent, a lubricant suitable for the dosage form in an effective amount of a SYNE2 expression inhibitor (for example, a nucleic acid molecule capable of binding to SYN2 and having an activity of suppressing the expression of SYN2).
  • Various pharmaceutical additives such as a bulking agent and a
  • Excipients include lactose, sucrose, glucose, starch, calcium carbonate, crystalline cellulose and the like.
  • binder include methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, gelatin, and polyvinyl pyrrolidone.
  • disintegrant include carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, starch, sodium alginate, agar powder, or sodium lauryl sulfate.
  • examples of the lubricant include talc, magnesium stearate or macrogol. As a suppository base, cocoa butter, macrogol, methylcellulose or the like can be used.
  • solubilizers when preparing as liquid or emulsion or suspension injections, commonly used solubilizers, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, isotonic agents, etc. are added as appropriate. May be. In the case of oral administration, flavoring agents, fragrances and the like may be added.
  • SNORA23 can be a biomarker for detecting invasion or metastasis of the above-mentioned tumor or cancer. SNORA23 in the blood sample is used as such a biomarker.
  • SNORA23 as a biomarker, characterized by measuring SNORA23 in a blood sample in order to detect tumor invasion or metastasis.
  • a method for detecting tumor invasion or metastasis comprising the step of measuring SNORA23 in a blood sample may also be provided.
  • a blood sample collected from a subject can be used as a blood sample for measuring SNORA23.
  • the blood sample includes whole blood, serum, plasma and the like.
  • Measurement of SNORA23 in a blood sample is performed, for example, by extracting SNORA23 RNA from a blood sample (for example, extraction using high pure RNA isolation kit (Roche Diagnostics GmbH)) and measuring the RNA amount by a known method (eg, qRT-PCR). ).
  • the amount of SNOR23 in the blood sample can be related to the presence or progression of tumor invasion or metastasis.
  • An increase in the amount of SNOR23 in the blood sample can be an indicator of increased tumor invasion or progression of metastasis. For example, by measuring the amount of SNORA23 in a blood sample over time, the increase in tumor invasion or the progress of metastasis can be monitored. An increase in the amount of SNORA23 over time may indicate that tumor invasion or metastasis is progressing.
  • biomarkers can also be used for monitoring the anti-tumor effect of administration of anti-tumor agents to cancer patients.
  • Base is a 5-methylcytosinyl group (mC: 5-methylcytosine), a thyminyl group (T: thymine), an adeninyl group (A: adenine) or a guaninyl group (G: guanine).)
  • Base is a 5-methylcytosinyl group (mC: 5-methylcytosine), a thyminyl group (T: thymine), an adeninyl group (A: adenine) or a guaninyl group (G: guanine), and Me is a methyl group. .
  • the DMTr group was removed by acid treatment, followed by base treatment to cut out the target product from the solid phase carrier. After neutralization with dilute acid, the solvent was distilled off, and the resulting crude product was purified by gel filtration column chromatography and reverse phase HPLC to obtain the desired product.
  • Cell line Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell lines (AsPC-1, MIA PaCa-2, PANC-1, CFPAC-1, Hs766T, SW1990, BxPC-3, CAPAN-1, CAPAN-2, Suite-2, KP-2 And KP-3) were purchased from the American Type Culture Collection or the Health Science Research Resources Bank. H48N cell line, KP-1N cell and HPC-3 cell provided by Dr. H. Iguchi (National Hospital Organization Kyushu Cancer Center) and Dr. Takahiro Yasoshima (Sapporo Medical University) It was. NPDE cells were obtained from DS Pharma Biomedical. The HPDE cell line was provided by Dr.
  • Suit2-luc cells or MIA PaCa2-luc cells (1 ⁇ 10 6 cells per mouse (in 50 ⁇ l PBS) were transplanted into the pancreatic tail of nude mice. After 3-6 weeks, metastatic nodules in the liver were collected, digested with type I collagenase (Roche), and subjected to in vitro cancer cell isolation and culture. Subsequently, the cultured cancer cells were transplanted again into the pancreatic tail of nude mice. This process was repeated 5 times to establish a high liver metastatic cell line. These were termed Suite2-HLMC and MIA PaCa2-HLMC.
  • RNA samples were extracted from the cells. The quality of the RNA samples was assessed using the Experion RNA Analysis Kit and an automated electrophoresis system (Bio-Rad Laboratories) according to the manufacturer's protocol. Biotinylated cRNA was prepared from 0.5 ⁇ g total RNA using Ambion WT Expression Kit (Thermo Fisher Scientific) and hybridized with the Human Gene 2.1 ST Array strip. Array slides were washed and stained and scanned in the GeneAtlas System (Affymetrix) for 16 hours at 45 ° C. Microarray data analysis was performed using GeneSpring GX 13.1 software (Digital Biology).
  • RNA was extracted using a high pure RNA isolation kit (Roche Diagnostics GmbH).
  • qRT-PCR quantitative reverse transcription polymerase chain reaction: qRT-PCR
  • RNA isolation kit Roche Diagnostics GmbH
  • One-step qRT-PCR was performed as described previously (Fujita-Sato S et al., Cancer Res 2015; 75: 2851-62) using the LightCycler480 II System (Roche Diagnostics GmbH) with the primer set QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription PCR Kit (stock) Company Qiagen).
  • EmGFP green fluorescent protein
  • a cDNA fragment was excised from the cloning vector with a BamHI / HindIII restriction enzyme and inserted between the restriction sites of BAMHI and HindIII of pBApo-CMV Neo plasmid (Takara Bio) to construct a SNORA23 expression plasmid.
  • Human SYN2 artificially synthesized cDNA (codon optimized sequence from position 891 to position 2180 of SEQ ID NO: 8) was commissioned to Eurofin to recognize restriction enzymes BamHI at the 5 'end and HindIII at the 3' end.
  • a cloning vector containing a nucleotide sequence added (SEQ ID NO: 12 (corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 13).
  • a cDNA fragment was excised from the cloning vector with a BamHI / HindIII restriction enzyme, A SYNE2 expression plasmid was constructed by inserting the restriction site between BamHI and HindIII of pBApo-CMV Neo plasmid (Takara Bio) Mock pDNA (a plasmid not containing an open reading frame such as SNORA23 or SYNE2) as a control Tran in It was carried out transfection.
  • Fluorescently labeled LNA probes are 5 ′-[Alexa488]-[amino linker] -GAAacttatgmCAmCa-3 ′ (SEQ ID NO: 14) and 5′-mCTACaccacamCAGa- [amino linker]-[Alexa647] -3 ′ (SEQ ID NO: 15) ( Uppercase letters: LNA; lowercase letters: DNA; mC: 5′-methylcytosine; Gene Design Co., Ltd.), which are 17 to 30 and 32 from the 5 ′ terminal site of the base sequence of SNORA23 shown in SEQ ID NO: 1, respectively. Designed to target the ⁇ 45th adjacent sequence region. After 16 hours, the intracellular SNORA23 signal was observed with a C2 confocal laser microscope (Nikon Corporation).
  • the upper surface of the filter (pore size: 8.0 ⁇ m) was coated with matrigel (20 ⁇ g / well, BD Biosciences).
  • matrigel 20 ⁇ g / well, BD Biosciences.
  • ASO transfection 48 hours after transfection or 72 hours after transfection when transfection with pDNA expression plasmid, cells are placed in the upper chamber at a density of 2.5 ⁇ 10 4 cells / well. And incubated for 48 hours (MIA PaCa2 cells and MIA PaCa2-HLMC cells) or 72 hours (Suit2 cells and Suite2-HLMC cells). Cells that migrated to the lower side of the filter were fixed, stained with hematoxylin-eosin, and then counted under an Eclipse 55i light microscope (Nikon Corporation).
  • SNORA23 ASO or control ASO was administered subcutaneously (sc) to the mouse neck once a week for 3 weeks (10 mg / kg body weight).
  • D-luciferin 100 mg / kg
  • the bioluminescence signal luciferase activity
  • Tumor growth in the mouse body was also evaluated. Mice were euthanized on day 28, their pancreas and liver were removed, and the level of tumor invasion and liver metastasis was quantified by IVIS imaging.
  • Tumor tissue samples were collected from xenograft tumor-bearing mice, cut to 5 ⁇ m thickness, and fixed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C. for 15 minutes. Sections were stained with hematoxylin and eosin and analyzed for tumor invasion.
  • Proteomics analysis Proteomic data was obtained as follows and subjected to analysis using a spectrum counting method or a label-free quantification method.
  • the remaining solution (50 ⁇ l) was diluted with 50 ⁇ l of water and digested with lysyl endopeptidase (registered trademark) (2 ⁇ g, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. for 4 hours. After adding 100 ⁇ l of water, the sample was further digested with trypsin (2 ⁇ g, Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C. for 4 hours. To block cysteine / cystine residues, the digest was treated with 0.625 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (Thermo Fisher Scientific) for 30 minutes at 37 ° C.
  • lysyl endopeptidase registered trademark
  • trypsin 2 ⁇ g, Thermo Fisher Scientific
  • the peptide was eluted with a linear gradient of 5% to 40% B for 100 minutes, 40% to 95% B for 1 minute at a flow rate of 250 nL / min, and maintained in 95% B for 9 minutes.
  • Collision induced dissociation (CID) spectra were automatically acquired in a data dependent scan mode with a dynamic exclusion option.
  • Full MS spectra were obtained using an Orbitrap in the mass / charge (m / z) range of 300-2000 (with a resolution of 60,000 at m / z 400).
  • the 12 strongest precursor ions in the full MS spectrum (minimum ion count threshold 1,000) were selected for subsequent ion capture MS / MS analysis (automatic gain control (AGC) mode).
  • AGC was set to 1 ⁇ 10 6 for full MS and 1 ⁇ 10 4 for CID MS / MS.
  • the normalized collision energy value was set to 35%.
  • the lock mass function was enabled to minimize mass during the analysis.
  • the raw file was processed by ProteomeDiscovere 1.4 (Thermo Fisher Scientific) using MASCOT algorithm (ver. 2.4.1) against IPI human database version 3.1.6. Trypsin was selected as the enzyme used, the allowable number of Missed Cleavage was set to 2, and carbamidomethylation for cysteine was selected as a fixed modification. Oxidized methionine and acetylation to the N-terminus were investigated as variable modifications.
  • the precursor mass tolerance was 10 ppm, and the tolerance for MS / MS ions was 0.8 Da.
  • FDR false discovery rate
  • Example 1 Detection of SNORA23 RNA overexpression in a PDAC cell line with a metastatic phenotype Highly metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells (Suit2-HLMC and MIA PaCa2-HLMC) were established.
  • the Suite2-HLMC cell line and MIA PaCa2-HLMC cell line produced liver metastases at a higher rate in all five mice (100%), whereas each parent cell line produced liver metastases at 5 There were 2 mice (40%) out of 5 and 0 out of 5 (0%).
  • FIG. 1-1 a is a schematic diagram showing a gene in which mRNA and untranslated RNA in the HLMC cell (“HLMC”) are twice or more that of the parent cell (“WT”) in Suite2 and MIA PaCa2 cancer cells. It is.
  • Fig. 1-1 a 8 genes (6 genes + SNORA23 RNA and CEA mRNA) are present in Suite2-HLMC cells, and 6 genes (4 genes + SNORA23 RNA and CEA mRNA) are present in MIA PaCa2-HLMC cells. Up-regulated more than twice their respective parental cells. Among these genes, carcinoembryonic antigen (CEA) and SNORA23 were commonly up-regulated in both the Suite2-HMLC and MIA PaCa2-HMLC cell lines.
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • the primer sets used are: (SNORA23) forward: 5′-TCATGCGGCCAAAGAGTAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 16) reverse: 5′-GGCCAGTGGTTAGATGTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 17) (18S rRNA) forward: 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 ′ (SEQ ID NO: 18) reverse: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
  • FIG. 1-1 show highly metastatic PDAC cells (“HLMC”) when the parent cell (“WT”) is 1 for each of Suite 2 and MIA PaCa 2 obtained by measurement by qRT-PCR. ) Of CEA mRNA (FIG. 1b) and SNORA23 RNA (FIG. 1c).
  • D SNOR23 expression in various pancreatic cancer cell lines, normal pancreatic ductal epithelial (NPDE) cells, and cancer-associated fibroblasts (CAF) was measured by qRT-PCR.
  • NPDE normal pancreatic ductal epithelial
  • CAF cancer-associated fibroblasts
  • pancreatic cancer (PDAC) cell lines (AsPC-1, MIA PaCa-2, PANC-1, CFPAC-1, Hs766T, SW1990, BxPC-3, CAPAN-1, CAPAN-2). , Suite-2, H48N, KP-2, KP-3, KP-1N, and HPC-3), non-cancerous immortalized human pancreatic ductal epithelial (HPDE) cells, normal pancreatic ductal epithelial (NPDE) cells, and three types of 2 is a graph showing the relative expression level of SNORA23 RNA in cancer-related fibroblasts (CAF-1, CAF-2, CAF-3). SNORA23 RNA expression was normalized with 18S rRNA.
  • PDAC pancreatic cancer
  • the SNORA23 expression level in PDAC cells was significantly higher than that in NPDE cells and CAF (15 to 62 times).
  • Expression levels in immortalized human pancreatic ductal epithelial (HPDE) cell lines were similar to several PDAC cell lines with low levels of SNORA23 expression.
  • qRT-PCR analysis shows that SNORA23 RNA is of moderate to high expression level in 15 pancreatic cancer cell lines and medium expression level in non-cancerous immortalized pancreatic ductal epithelial cells (HPDE), whereas normal human pancreatic duct epithelium. It was demonstrated that cells (NPDE) or three types of cancer-associated fibroblasts (CAF-1, CAF-2, CAF-3) were at a low expression level.
  • 1-2e shows Alexa- of parental cells (“WT”), highly metastatic PDAC cells (“HLMC”) and SNORA23 knockdown cells (“HLMC-SN-KD”) for each of Suite 2 and MIA PaCa2.
  • WT parental cells
  • HLMC highly metastatic PDAC cells
  • HLMC-SN-KD SNORA23 knockdown cells
  • SNORA23 signal was higher in Suite2 cells and MIA PaCa2 cells (“WT” and “HLMC”) than in NPDE cells (both “FITC” and “Alexa-647” were not observed for fluorescence).
  • WT MIA PaCa2-HLMC cells
  • HLMC MIA PaCa2-HLMC cells
  • WT parent cell line
  • the fluorescence signal disappeared in the Sweet2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells transfected with SNORA23 ASO (fluorescence was observed in “HLMC” (particularly in the merged image), whereas in “HLMC-SN-KD”, fluorescence was lost. Is not observed). This confirmed the specificity of the SNORA23 signal.
  • Example 2 Detection of SNOR23 overexpression in PDAC patients and inverse correlation with disease-free survival
  • FIG. 2b shows the survival curves of disease-free survival rate (DFS) and overall survival rate (OS) for each PDAC patient group with high and low expression of SNORA23 prepared according to the Kaplan-Meier method.
  • Example 3 Design of SNORA23 antisense oligonucleotide and study of RNA expression by SNORA23 knockdown
  • ASO antisense oligonucleotide
  • SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5) and ASO # 2 (SEQ ID NO: 6) are the 19th to 33rd regions and the 151st to 165th regions from the 5 'end of the nucleotide sequence of the SNORA23 gene shown in SEQ ID NO: 1. Designed to target each of the regions.
  • Each base sequence of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is represented in the 5 'to 3' direction (5 ' ⁇ 3'), and is a reverse complementary sequence to each target region sequence in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of the control ASO (SEQ ID NO: 20) was designed to bind to the firefly luciferase gene base sequence that has no homology with mammalian cell mRNA and not to alter the gene expression of mammalian cells.
  • FIG. 3 shows the transfection with SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5) (“SN-ASO # 1”) and SNORA23 ASO # 2 (SEQ ID NO: 6) with respect to Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the relative expression level of RNA by qRT-PCR analysis when transfection (“SN-ASO # 2”) and transfection (“Ctrl”) in control ASO (SEQ ID NO: 20) are performed, respectively. is there. The RNA expression level was expressed as a relative value with the expression level of transfection (“Ctrl”) in control ASO as 1.
  • SNORA23 ASO # 1 SEQ ID NO: 5
  • SNORA23 ASO # 2 SEQ ID NO: 6
  • FIG. 4a shows representative images of Matrigel invasion assay of HLMC cells (“HLMC”) and parent cells (“WT”) and a graph showing the number of infiltrating cells for Suite2 and MIA PaCa2. Scale bar: 100 ⁇ m. The image shows that more infiltrated cells were observed in “HLMC” than “WT” in both Suite2 and MIA PaCa2.
  • the number of infiltrating cells was significantly increased in Suite2-HLMC and MIA PaCa2-HLMC compared to their parent cell lines (both P ⁇ 0.0001).
  • FIG. 4b shows the Matrigel invasion assay of Suite2-HLMC and MIA PaCa2-HLMC cells 48 hours after either transfection with SNORA23ASO (“SN-KD”) or control ASO (“Ctrl”). And a graph showing the number of infiltrating cells. Scale bar: 100 ⁇ m.
  • SN-KD SNORA23ASO
  • Ctrl control ASO
  • FIG. 4c shows representative images of Matrigel invasion assay of Suite2 cells and MIA PaCa2 cells 72 hours after either SNORA23 pDNA transfection (“SN-OE”) or mock pDNA transfection (“Mock”). And a graph showing the number of infiltrating cells. Scale bar: 100 ⁇ m. In the image, it is shown that a larger number of infiltrating cells were observed in “SNORA23-OE” compared to “Mock” in both Suite2 and MIA PaCa2.
  • the number of cells infiltrating Matrigel was significantly increased in both Suite 2 cells and MIA PaCa 2 cells (“SN-OE”) overexpressing SNORA23 compared to mock pDNA transfected cells (“Mock”) (both P ⁇ 0.0001).
  • Example 5 Involvement of SNORA23 in anchorage-dependent survival in PDAC
  • the cells of (a) to (c) of Example 4 above were used for anchorage-dependent cell proliferation (assay using CCK-8) and anchorage-independent cell proliferation (soft agar colony formation assay). evaluated.
  • HLMC HLMC cells
  • WT parent cells
  • FIG. 5a is a graph showing the time course of cell proliferation in an anchorage-dependent cell proliferation assay for Sweet2 and MIA PaCa2 and their HLMC cells (“HLMC”: squares) and their parent cells (“WT”: diamonds). It is. As a result, there was no difference between the Suit2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells and their parent cells in anchorage-dependent proliferation.
  • FIG. 5b is a graph showing representative images of the soft agar colony formation assay and the number of colonies formed for Sweet2 and MIA PaCa2 for their HLMC cells (“HLMC”) and their parent cells (“WT”). It shows. The image shows that for both Suite2 and MIA PaCa2, “HLMC” formed a larger number of colonies compared to “WT”.
  • FIG. 5c is an anchorage dependence for transfection with SNORA23ASO (“SN-KD”: square) and transfection with control ASO (“Ctrl”: diamond) for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC. It is a graph which shows the time-dependent change of the cell proliferation in a sex cell proliferation assay. In FIG. 5c, ** P ⁇ 0.01, + P ⁇ 0.001.
  • Anchorage-dependent proliferation was significantly suppressed in MIA PaCa2-HLMC cells treated with SNORA23 knockdown compared to controls, but no difference was clearly seen in Suite2-HLMC cells.
  • FIG. 5d shows a soft agar colony formation assay for Sweet2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC for their transfection with SNORA23ASO (“SN-KD”) and control ASO (“Ctrl”).
  • SN-KD SNORA23ASO
  • Ctrl control ASO
  • FIG. 5e is a scaffold-dependent cell proliferation assay for Sweet2 cells and MIA PaCa2 for transfection with SNORA23 pDNA (“SN-OE”: square) and mock pDNA transfection (“Ctrl”: diamond). It is a graph which shows a time-dependent change of cell proliferation.
  • the anchorage-dependent growth was significantly suppressed compared to the mock control in Suite2 cells and MIA PaCa2 cells transfected with SNORA23 pDNA. * P ⁇ 0.01.
  • FIG. 5f shows representative images of soft agar colony formation assays for Sweet2 cells and MIA PaCa2 and their transfection with SNARA23 pDNA (“SN-OE”) and mock pDNA transfection (“Mock”) and their An enlarged image is shown.
  • FIG. 5g shows the total number of colonies and large colonies (greater than 1 mm in diameter) for Sweet2 cells and MIA PaCa2 for their SNORA23 pDNA transfection (“SN-OE”) and mock pDNA transfection (“Mock”).
  • Example 6 Effect of SNORA23 knockdown on spheroid formation of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells
  • SNORA23 ASO # 1 SEQ ID NO: 5
  • SNORA-KD control ASO (SEQ ID NO: 20) for transfection
  • LGR5-KD leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5
  • siRNA Thermo Fisher Scientific, siRNA ID: s16275
  • LGR5-KD leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5
  • LGR5-KD leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5
  • siRNA Thermo Fisher Scientific, siRNA ID: s16275
  • LGR5-KD leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5
  • FIG. 6 shows (a) transfection with SNORA23ASO (SNORA-KD: square) and control ASO transfection (Ctrl: diamond) and (b) LGR5 siRNA for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells. It is a graph which shows the spheroid formation fluctuation
  • the spheroid formation value was expressed as a relative value where the amount of the first day (D1) was 1.
  • spheroid formation was significantly suppressed by knockdown of SNORA23 in Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells. This suppression level was greater than the suppression level due to LGR5 knockdown.
  • Example 7 Inhibition of SNORA23 expression in tumor tissue after SNORA23 targeting ASO treatment
  • MIA PaCa2-HLMC cells into which SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5) has been introduced ex vivo are transplanted into the flank of nude mice, and one week later, SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5) or A solution of control ASO (SEQ ID NO: 20) (10 mg / kg BW) was injected subcutaneously once a week for 2 weeks. Tumor tissue was excised from the mice and removed for qRT-PCR analysis for SNOR23 expression at various time points.
  • FIG. 7 shows the first week (“1 week”) and the second week (“2 weeks”) in which ASO ex vivo transplantation (“ASO ( ⁇ )”) and ASO ex vivo transplantation (“ASO (+) ex vivo”) were performed.
  • ASO ex vivo transplantation (“ASO ( ⁇ )”)
  • ASO (+) ex vivo transplantation (“ASO (+) ex vivo”)
  • the expression level of SNOR23 RNA was expressed as a relative expression level with 1 before ASO transplantation (ASO ( ⁇ )).
  • * P ⁇ 0.05 (in each case n 3).
  • the SNOR23 RNA expression level in the tumor tissue was significantly higher in the first week after the ASO ex vivo transplantation and in the second and third weeks after the subcutaneous injection than before the ASO transplantation. Decreased (P ⁇ 0.05).
  • Example 8 Inoculation of mouse PDAC and suppression of liver metastasis by SNORA23 targeting ASO
  • SNORA23 ASO # 1 SEQ ID NO: 5
  • control ASO SEQ ID NO: 20
  • FIG. 8a is measured by IVIS imaging of SNORA23 ASO-treated mice (“SN-KD”: square) and control mice (“Ctrl”: rhombus) for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells. It is the typical image which shows the graph which shows the daily change of the amount of luciferase signals of a mouse
  • tumor volume increase (increased luciferase activity) assessed by IVIS imaging was observed in Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells treated by ex vivo transfection with SNORA23 ASO # 1.
  • FIG. 8 b shows the tumor tissue collected from SNORA23 ASO-treated mice (“SN-KD”) and control mice (“Ctrl”) for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells, respectively, after matoxylin and eosin staining. It is the phase-contrast micrograph and enlarged photograph of a sample.
  • the scale bar in the phase contrast micrograph represents 500 ⁇ m (double line), and the scale bar in the enlarged photograph represents 100 ⁇ m (single line).
  • pancreas and liver were removed from the euthanized mouse, and the pancreas and liver were subjected to luciferase activity measurement using IVIS Imaging System to quantify the level of tumor invasion and liver metastasis.
  • FIG. 8c is a representative diagram showing signal distribution by IVIS imaging of liver and pancreas excised from a mouse treated with SNORA23 ASO # 1 (SN-KD) and a control mouse (Ctrl) for MIA PaCa2-HLMC cells. It is a graph which shows an image and the measured amount of luciferase signals (photons / second). The images show that SNORA23 ASO-treated mice (“SN-KD”) showed reduced luciferase signal activity in the adjacent pancreas and distant liver compared to control mice (“Ctrl”).
  • MIA PaCa2-HLMC tumor luciferase activity
  • SNORA23-ASO SNORA23-ASO treated mice compared to control mice in both adjacent pancreas and distant liver.
  • Example 9 Gene and protein expression profiling in PDAC cells treated with SNORA23 knockdown To identify the downstream factors of SNORA23, SNORA23 knockdown was performed (transfected with SNORA23ASO (ASO # 1: SEQ ID NO: 5)) or not (transfected with control ASO (SEQ ID NO: 20)), Suite2- CDNA microarray analysis was performed on HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells.
  • FIG. 9 shows the cDNAs of Suit2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells when transfection with SNORA23ASO (“SN-KD”) and transfection with control ASO (“Ctrl”) were performed, respectively.
  • a heat map (A) for microarray analysis and a heat map (B) for proteomic analysis are shown.
  • 12 genes SNORA23, PRKDC, BUB1, PUPN12, GPR126, LGR5, WWC2, HS2ST1, ZCCHC11, PEAK1, IPO7, HMGCS2
  • 6 types Genes CDKN1A, LAMB3, LAMC2, FAM25C, AGO2, and MYO1B were up-regulated (A in FIG. 9).
  • proteomic data was analyzed using a spectrum counting method and a label-free quantification method usually used for screening purposes.
  • FIG. 10 shows the results of examining the number of proteins up-regulated and the number of proteins down-regulated by SNORA23 knockdown in Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells using a spectrum counting method and a label-free quantification method. It is a schematic diagram which shows.
  • FIG. 11 shows, for Proteomics data analyzed using label-free quantification, transfection with SNORA23ASO (“SN-KD”) and control ASO for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells.
  • the heat map at the time of performing each of (“Ctrl") is shown.
  • SYNE2 SYNE2 / nesprin-2
  • PCDH11X protocadherin-11 X-linked protein
  • Example 10 Verification of SNORA23-regulated mRNA and protein
  • SNORA23 knock by qRT-PCR using 2 SNORA23ASOs ASO # 1: SEQ ID NO: 5 and ASO # 2: SEQ ID NO: 6
  • ASO # 1 SEQ ID NO: 5
  • ASO # 2 SEQ ID NO: 6
  • Changes in mRNA expression due to down were examined.
  • FIG. 12 shows transfection of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells with their parent cells (WT), SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5), and control ASO. (“Ctrl ASO”) and Western blot of SYNE2 and the relative expression level of protein when untreated.
  • FIG. 13 shows the transfection (“SN-”) of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells in the case of their parent cells (WT) and untreated (HLMC), and SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5).
  • ASO # 1 "), SNORA23 ASO # 2 (SEQ ID NO: 6) transfection (" SN-ASO # 2 "), control ASO transfection (" Ctrl ASO "), and untreated It is a graph which shows the mRNA relative expression level of SYNE2 in the case of.
  • * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 (relative to control ASO: n 4).
  • SYNE2 protein was significantly increased 2-fold in HLMC type cells compared to parental cells (FIG. 12), but mRNA expression did not change according to protein expression (FIG. 13).
  • SNOR23 knockdown decreased SYNNE2 expression by 50% and 40% in Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells, respectively (FIG. 12), accompanied by suppression of mRNA expression (FIG. 13).
  • Example 11 Effect of SYNE2 expression on infiltration and anchorage-independent growth of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells
  • A For Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells, transfection with SYNE2 siRNA (Thermo Fisher Scientific, siRNA ID: s23328) ("SYNE2-siRNA”) and control siRNA (Thermo Fisher Scientific) Fick, negative control # 1) transfections (“Ctrl”)) were examined by matrigel invasion assay.
  • the siRNA used for transfection had a final concentration of 20 nM.
  • FIG. 14A shows matrigels of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells 48 hours after either transfection with SYNE2 siRNA (“SYNE2-siRNA”) or transfection with control siRNA (“Ctrl”).
  • SYNE2 siRNA SYNE2 siRNA
  • Ctrl control siRNA
  • SYNE2 siRNA SYNE2 siRNA
  • Ctrl control siRNA
  • FIG. 14B shows SNORA23 ASO and SYNE2 pDNA transfection (“SNORA-ASO + SYNE2-pDNA”), SNORA23 ASO and mock pDNA transfection (“SNORA-ASO + Mock”), and control ASO and mock pDNA transfection (“Ctrl-ASO + Mock”). ”) Representative images of Matrigel invasion assay of Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells 48 hours after any of the above, and a graph showing the number of infiltrating cells.
  • FIG. 14C shows the softness obtained when transfection with SYN2 siRNA (“SYNE2-siRNA”) and transfection with control siRNA (“Ctrl”) were performed on Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells.
  • SYNE2-siRNA SYN2 siRNA
  • Ctrl control siRNA
  • SYNE2-siRNA SYNE2 siRNA
  • FIG. 14D shows the results of transfection with SYN2 siRNA (SYNE2-KD; square) and transfection with control siRNA (Ctrl: diamond) for Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells.
  • 3 is a graph showing fluctuations in spheroid formation from day 1 (D1) to day 4 (D4). The spheroid formation value was expressed as a relative value where the amount of the first day (D1) was 1.
  • Spheroid formation was reduced to about 14% and 30% of control by SYN2 siRNA (SYNE2 knockdown) in Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells (both P ⁇ 0.001 (Day 4); FIG. 14D). )
  • FIG. 14E shows SNORA23 ASO and SYNE2 pDNA transfection (“SYNE-OE + SN-KD”), SNORA23 ASO and mock pDNA transfection (“SN-KD”), and Suite2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells, and It is a graph which shows the spheroid formation fluctuation
  • the spheroid formation value was expressed as a relative value where the amount of the first day (D1) was 1.
  • Spheroid formation is suppressed by SNORA23 knockdown (“SN-KD”) when both SYNE2 expression plasmid and SNORA23 ASO are transfected in Sweet2-HLMC cells and MIA PaCa2-HLMC cells (“SYNE-OE + SN-KD”) Fully recovered to the level of the control (“Ctrl”) (FIG. 14E).
  • Example 11 Verification of SNORA23 knockdown with additional SNORA23 ASO
  • SNORA23 silencing an antisense oligonucleotide SNORA23 ASO # 3 of the following sequence was designed:
  • SNORA23 ASO # 3 (SEQ ID NO: 7) was designed to target the 153rd to 167th region from the 5 'end of the base sequence of the SNORA23 gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 7 is represented in the 5 'to 3' direction (5 ' ⁇ 3'), and is a reverse complementary sequence to each target region sequence in SEQ ID NO: 1.
  • transfection with control ASO SEQ ID NO: 20
  • MIA PaCa2-HLMC cells By qRT-PCR analysis, MIA PaCa2-HLMC cells, Suite2-HLMC cells, Hs766T cells and S2-013 cells (obtained from Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University) for SNORA23 ASO # 3 (SEQ ID NO: 7) SNOR23 RNA expression and SYNE2 mRNA expression when each cell line was transfected were verified.
  • FIG. 15 shows MIA PaCa2-HLMC cell, Suite2-HLMC cell, Hs766T cell, and S2-013 cell line transfection with SNORA23 ASO # 3 (“SN-ASO # 3”) and control ASO. It is a graph which shows SNORA23 RNA expression (A) and SYNE2 mRNA expression (B) at the time of performing each of transfection (“Ctrl”). The RNA expression level was expressed as a relative value with the expression level of transfection (“Ctrl”) in control ASO as 1. In FIG. 15, * P ⁇ 0.05.
  • FIG. 16 shows transfection of SNORA23 ASO # 3 ( ⁇ : “SN-ASO # 3”) and transfection with control ASO (diamonds: each cell line of CAPAN-2 cells, Hs766T cells, and S2-013 cells). It is a graph which shows a time-dependent change of the cell proliferation (A) and spheroid formation (B) in an anchorage dependence cell proliferation assay at the time of performing each of "Ctrl”).
  • A cell proliferation
  • B spheroid formation
  • FIG. 17 shows the transfection of SNORA23, ASO # 3 ((A) “SNORA23 # 153” or (B) “AN” in each cell line of MIA PaCa2-HLMC cells, Suite2-HLMC cells, Hs766T cells, and S2-013 cells.
  • -ASO # 3 ") 48 hours after transfection with control ASO (“ Ctrl ") (MIA PaCa2-HLMC cells and Hs766T cells) or 72 hours after (Suit2-HLMC cells) And S2-013 cells) is a graph showing a representative image (A) and the number of infiltrating cells (B) of the matrigel invasion assay.
  • Hs766T cells and S2-013 cells showed many infiltrating cells with “Ctrl”, whereas “SNORA23 # 153” hardly observed any infiltrating cells, and MIA PaCa2-HLMC cells and Suite2 -HLMC cells showed many infiltrating cells with "Ctrl”, but with "SNORA23 # 153" only a reduced number of infiltrating cells were observed.
  • Example 12 Reduction of SNOR23 concentration in blood by SNORA23 ASO
  • Suit2-HLMC cells or MIA PaCa2-HLMC cells were transplanted into the subcapsular region of the spleen of nude mice, and the following day, SNORA23 ASO # 1 (SEQ ID NO: 5) or control ASO (SEQ ID NO: 20) was given to the mice at 10 mg / kg
  • Subcutaneous administration was performed at the body weight, and then further subcutaneous administration was performed once a week (10 mg / kg body weight each time) 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks after the first administration.
  • mice administered with SNORA23 ASO # 1 subcutaneously are also referred to as “SNOR23 ASO subcutaneously administered mice”, and mice administered with control ASO subcutaneously are also referred to as “control mice”.
  • mice administered with control ASO subcutaneously are also referred to as “control mice”.
  • Three, four or five dose mice were sacrificed one week after the last dose, so blood samples from mice three weeks, four weeks or five weeks after the start of subcutaneous administration and Spleen, pancreas and liver tumor tissue samples were collected. Total RNA was extracted from each sample collected using a high pure RNA isolation kit (Roche Diagnostics GmbH).
  • the expression levels of SNORA23 and CEA in the blood samples at 4 and 5 weeks after the start of subcutaneous administration, and 3 weeks after the start of subcutaneous administration were compared with the primer sets described above (SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 for SNORA23; SEQ ID NO: 17 for SYNE2). 21 and SEQ ID NO: 22; for CEA, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19) were used to measure by qRT-PCR.
  • FIG. 18 shows the qRT-PCR measurement results.
  • “Ctrl” is “control mouse”
  • “SN KD” is “SNORA23 ASO subcutaneously administered mouse”
  • “3w”, “4w” and “5w” are 3 weeks after the start of subcutaneous administration, respectively. After, 4 weeks and 5 weeks later are shown. For each result, the results after 3 weeks, 4 weeks, and 5 weeks are shown in order from the left (however, the results in the blood samples show the results after 4 weeks and 5 weeks in order from the left) ).
  • SNORA23 RNA in the blood sample of the control mouse increases with the progression of such a tumor, and in the mouse administered with SNORA23 ASO subcutaneously, where such tumor growth and metastasis were not observed, The amount of SNORA23 RNA was hardly seen. Therefore, SNORA23 RNA in the blood sample can be used as a tumor biomarker.
  • Example 13 Correlation between SNOR23 expression level in pancreatic cancer patients and prognosis of pancreatic cancer patients
  • SNOR23 expression in clinical specimens PDAC tissue
  • n 133: normal pancreatic cancer excluding IMPN / MCN-related cancer
  • FIG. 20 shows the respective survival curves of disease-free survival rate (DFS) and overall survival rate (OS) for each PDAC patient group with high and low expression of SNORA23 prepared according to the Kaplan-Meier method.
  • the present invention can contribute to the development of therapeutic agents based on nucleic acids that can inhibit cancer invasion or metastasis. Furthermore, the present invention is useful for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of various cancers including refractory cancers.

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Abstract

ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤を含む抗腫瘍剤が開示される。ＳＮＯＲＡ２３発現抑制剤は、以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造： （式中ＢａｓeおよびＡは所定の置換基または構造である）を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であり得る。ＳＹＮＥ２遺伝子発現抑制剤を含む抗腫瘍剤もまた開示される。腫瘍の浸潤または転移を検出するため、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３を測定することを特徴とする、ＳＮＯＲＡ２３のバイオマーカーとしての使用もまた開示される。

Description

癌浸潤または転移阻害核酸薬および癌バイオマーカー
　本発明は、癌浸潤または転移を阻害し得る核酸および当該核酸を含む抗癌剤に関する。
　膵癌または膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、浸潤性で転移能が高く、予後が不良である。古より病理学的検討によって、癌細胞の悪性度および予後不良に、核および核小体の異型度が関与することが知られている。
　核内に存在する非翻訳ＲＮＡである核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、リボソームやリボソームＲＮＡの合成および代謝を制御するハウスキーピング因子として考えられてきたが、近年、癌特異的に異常発現するｓｎｏＲＮＡの報告がなされている。このようなｓｎｏＲＮＡとして、例えば、ＳＮＯＲＡ４２（非特許文献１）、ＳＮＯＲＡ５５（非特許文献２）、ｈ５ｓｎ２（非特許文献３）、ＳＮＯＲＤ４４（非特許文献４）およびＳＮＯＲＤ５０Ａ／Ｂ（非特許文献５）が報告されている。
　癌の治療において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの利用）、アンチセンス法などが核酸利用0などの核酸を利用した標的遺伝子発現抑制が試みられている。アンチセンス法においては、種々の人工核酸が利用されている。例えば、アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ：特許文献１）を用いたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の癌治療への応用が試みられている（非特許文献６）。
国際公開第２０１１／０５２４３６号
Mei YPら、Oncogene 2012;31:2794-804 Crea Fら、Mol Oncol 2016;10:693-703 Chang LSら、Biochem Biophys Res Commun 2002;299:196-200 Appaiah HNら、Breast Cancer Res 2011;13:R86 Siprashvili Zら、Nat Genet 2016;48:53-8 Shinkai Kら、Int J Cancer 2016;139:433-45
　しかし、核内非翻訳ＲＮＡであるｓｎｏＲＮＡを標的遺伝子とする場合、生体内でｓｎｏＲＮＡの発現を抑制可能な核酸剤は未だ確立されていない。そして、ＰＤＡＣのような癌の浸潤および転移を解消するために有効な治療剤が求められている。
　したがって、本発明は、核内非翻訳ＲＮＡの発現を生体内で抑制可能な核酸剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、癌の浸潤および転移に関与するｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を含む抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
　本発明は、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤を含む、抗腫瘍剤を提供する。
　１つの実施形態では、上記ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤は、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子と結合し得、該ＳＮＯＲＡ２３遺伝子の発現を抑制する活性を有する核酸分子を含む。
　１つの実施形態では、上記核酸分子は、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の一部である標的領域に相補的な配列でありかつ１２～２０塩基の長さであるオリゴヌクレオチド、またはその薬理学上許容される塩を含む。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、糖修飾部分を含む１個または２個以上のヌクレオチドを含む。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、
以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
を少なくとも１つ含み、
　ここで、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ａは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で表される二価の基であり、
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
　ｍは、０から２の整数であり；
　ｎは、０から１の整数であり；
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基である。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
で表される構造である。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、上記式（Ｉ’）で表される構造であり、そして該式（Ｉ’）において、上記ｍは０であり、そして上記Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、６～１０塩基のギャップ領域、３～５塩基の５’ウイングおよび３～５塩基の３’ウイングからなるギャップマーであり、
　該ギャップ領域が、該５’ウイングと該３’ウイングの間に位置づけられ、そして
　該５’ウイングおよび該３’ウイングは、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を含む。
　１つの実施形態では、上記ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤はＳＹＮＥ２の発現を抑制する。
　本発明はまた、ＳＹＮＥ２発現抑制剤を含む、抗腫瘍剤を提供する。
　１つの実施形態では、上記ＳＹＮＥ２発現抑制剤は、ＳＹＮＥ２と結合し得、該ＳＹＮＥ２の発現を抑制する活性を有する核酸分子を含む。
　１つの実施形態では、上記抗腫瘍剤は、浸潤性または転移能のある腫瘍に対して用いられる抗腫瘍剤である。
　１つの実施形態では、上記抗腫瘍剤は、膵癌、肝癌、肺癌、卵巣癌または胃癌の治療または予防に用いられる抗腫瘍剤である。
　本発明はさらに、上記抗腫瘍剤を含有する医薬組成物を提供する。
　本発明はなおさらに、癌浸潤または転移を検出するため、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３を測定することを特徴とする、ＳＮＯＲＡ２３のバイオマーカーとしての使用を提供する。
　本発明によれば、核内非翻訳ＲＮＡの発現抑制が可能となる。本発明によって、核内非翻訳ＲＮＡであるｓｎｏＲＮＡの生体内における発現の抑制が可能となる。さらに、本発明によれば、癌の浸潤または転移に関与するｓｎｏＲＮＡの発現が抑制でき、その抗腫瘍効果に基づく治療剤を提供することができる。
Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２癌細胞のＨＬＭＣ細胞および親細胞について、ｍＲＮＡおよび非翻訳ＲＮＡのｃＤＮＡマイクロアレイ解析の結果を示す図（図１ａ）、ならびにｑＲＴ－ＰＣＲによるＣＥＡ　ｍＲＮＡ（図１ｂ）およびＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ（図１ｃ）の相対的発現量を示すグラフ；ならびに種々の膵癌細胞株、正常膵管上皮（ＮＰＤＥ）細胞、および癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）におけるＳＮＯＲＡ２３発現量を示すグラフ（図１ｄ）である。 Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２癌細胞のＨＬＭＣ細胞および親細胞ならびにＳＮＯＲＡ２３ノックダウン細胞を蛍光標識プローブでトランスフェクトしたもの標識蛍光顕微鏡画像である。 ｑＲＴ－ＰＣＲ解析によるＰＤＡＣならびに正常な肝臓組織および膵臓組織におけるＳＮＯＲＡ２３の相対的発現についての箱ひげ図（ボックスプロット）である。 カプラン・メイヤー法に従って作成した、ＳＮＯＲＡ２３高発現および低発現の各ＰＤＡＣ患者群についての無病生存率および全生存率のそれぞれの生存曲線を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃１」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃２でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃２」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のｑＲＴ－ＰＣＲ解析によるＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２について、ＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）および親細胞（「ＷＴ」）のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像ならびに浸潤細胞数を示すグラフである。 ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のいずれかから４８時間後のＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像ならびに浸潤細胞数を示すグラフである。 ＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）およびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」）のいずれかから７２時間後のＳｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像ならびに浸潤細胞数を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」：四角）とその親細胞（「ＷＴ」：菱形）についての、足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖の経時変化を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）とその親細胞（「ＷＴ」）についての軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像および形成されたコロニー数を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣにつき、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」：四角）とコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」：菱形）についての、足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖の経時変化を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣにつき、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）とコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）についての、軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像および形成されたコロニー数を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」：四角）とモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」：菱形）についての、足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖の経時変化を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）とモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」）についての軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像およびその拡大画像である。 Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）とモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」）についての全コロニーの数および大コロニー（１ｍｍを超える直径を有する）の数を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、（ａ）ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（ＳＮＯＲＡ－ＫＤ：四角）およびコントロールＡＳＯのトランスフェクション（Ｃｔｒｌ：菱形）ならびに（ｂ）ＬＧＲ５　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（ＬＧＲ５－ＫＤ：四角）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（Ｃｔｒｌ：菱形）についての、１日目（Ｄ１）～４日目（Ｄ４）におけるスフェロイド形成変動を示すグラフである。 ＡＳＯ移植前（「ＡＳＯ（－）」）、ＡＳＯエクスビボ移植（「ＡＳＯ（＋）エクスビボ」）を行った１週目（「１週」）および２週目（「２週」）、ならびにさらに皮下注射（「エクスビボ＋皮下注射」）を行ってから２週目（「２週」）および３週目（「３週」）の腫瘍組織におけるＳＮＯＲＡ２３ ＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１で処理したマウス（「ＳＮ－ＫＤ」：四角）と、それらのコントロールマウス（「Ｃｔｒｌ」：菱形）とについての、ＩＶＩＳ画像化により測定したマウス全身のルシフェラーゼシグナル量の経日変化を示すグラフおよびシグナル分布を示す代表的な画像である。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１で処理したマウス（「ＳＮ－ＫＤ」）と、コントロールマウス（「Ｃｔｒｌ」）とからそれぞれ採取した腫瘍組織のマトキシリンおよびエオシン染色後の試料の位相差顕微鏡写真および拡大写真である。 ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１で処理したマウス（ＳＮ－ＫＤ）と、コントロールマウス（Ｃｔｒｌ）とから切除した肝臓および膵臓のＩＶＩＳ画像化によるシグナル分布を示す代表的な画像および測定したルシフェラーゼシグナル量（フォトン／秒）を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のｃＤＮＡマイクロアレイ解析のヒートマップ（Ａ）およびプロテオミクス解析のヒートマップ（Ｂ）を示す。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞においてＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによりアップレギュレートされたタンパク質数およびダウンレギュレートされたタンパク質数について、スペクトルカウント法およびラベルフリー定量法を用いて調べた結果を示す模式図である。 ラベルフリー定量法を用いて分析したプロテオミクスデータに関して、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のヒートマップを示す。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらの親細胞（ＷＴ）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ　ＡＳＯ」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ　ＡＳＯ」）および未処理の場合のそれぞれを行った場合のＳＹＮＥ２のウェスタンブロット、ならびにタンパク質の相対的発現量を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらの親細胞（ＷＴ）および未処理（ＨＬＭＣ）の場合、ならびにＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃１」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃２でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃２」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ　ＡＳＯ」）および未処理の場合のそれぞれを行った場合のＳＹＮＥ２のｍＲＮＡ相対的発現量を示すグラフである。 ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のいずれかから４８時間後のＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。 ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋ＳＹＮＥ２－ｐＤＮＡ」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」）、ならびにコントロールＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」）のいずれかから４８時間後のＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のそれぞれを行った場合の軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像と、形成されたコロニー数を示すグラフとを示す。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（ＳＹＮＥ２－ＫＤ；四角）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（Ｃｔｒｌ：菱形）のそれぞれを行った場合についての、１日目（Ｄ１）～４日目（Ｄ４）におけるスフェロイド形成変動を示すグラフである。 Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（ＳＹＮＥ－ＯＥ＋ＳＮ－ＫＤ）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（ＳＮ－ＫＤ）、ならびにコントロールＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（Ｃｔｒｌ）のそれぞれを行った場合についての、１日目（Ｄ１）～４日目（Ｄ４）におけるスフェロイド形成変動を示すグラフである。 ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃３」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現（Ａ）およびＳＹＮＥ２　ｍＲＮＡ発現（Ｂ）を示すグラフである。 ＣＡＰＡＮ－２細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３のトランスフェクション（×：「ＳＮ－ＡＳＯ＃３」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（菱形：「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合の足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖（Ａ）およびスフェロイド形成（Ｂ）の経時変化を示すグラフである。 ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株において、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３のトランスフェクション（（Ａ）「ＳＮＯＲＡ２３　＃１５３」または（Ｂ）「ＡＮ－ＡＳＯ＃３」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のトランスフェクションの４８時間後（ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞およびＨｓ７６６Ｔ細胞）または７２時間後（Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＳ２－０１３細胞）の細胞のmatrigel浸潤アッセイの代表的な画像（Ａ）および浸潤細胞数（Ｂ）を示すグラフである。 ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスおよびコントロールマウスのそれぞれにつき、ＡＳＯ皮下投与を開始してから４週間後および５週間後における血液試料中のＳＮＯＲＡ２３およびＣＥＡの発現レベル、ならびにＡＳＯ皮下投与を開始してから３週間後、４週間後および５週間後における脾臓、膵臓、肝臓の腫瘍組織試料中のＳＮＯＲＡ２３、ＳＹＮＥ２およびＣＥＡの発現レベルを示すグラフである。 ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスおよびコントロールマウスのそれぞれにつき、ＡＳＯ皮下投与を開始してから３週間後、４週間後および５週間後における脾臓および肝臓の腫瘍組織の写真である。 カプラン・メイヤー法に従って作成した、ＳＮＯＲＡ２３高発現および低発現の各ＰＤＡＣ患者群についての無病生存率および全生存率のそれぞれの生存曲線を示すグラフである。
　まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、またはｎ－ヘキシル基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ－プロピルオキシ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ－ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ－ブチルチオ基、ｎ－ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６のシアノアルコキシ基」は、上記炭素数１から６の直鎖アルコキシ基を構成する少なくとも１つの水素原子がシアノ基で置換された基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の直鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ｎ－プロピルアミノ基、ジｎ－プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３から７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３から７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基、および炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基を包含する。単に、「低級アルコキシ基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｎ－ブチロキシ、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、およびｎ－ヘプチルオキシ基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基としては、イソプロポキシ基、イソブチロキシ基、ｔｅｒｔ－ブチロキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基としては、シクロブチロキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６から１２の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６から１２のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２－ピリジルエチル基、１－ピリジルエチル基、３－チエニルプロピル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３－メチルノナノイル基、８－メチルノナノイル基、３－エチルオクタノイル基、３，７－ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１－メチルペンタデカノイル基、１４－メチルペンタデカノイル基、１３，１３－ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５－メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１－メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）－２－メチル－２－ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２－ブロモベンゾイル基、４－クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６－トリメチルベンゾイル基、４－トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４－アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２－カルボキシベンゾイル基、３－カルボキシベンゾイル基、４－カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４－ニトロベンゾイル基、２－ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２－（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４－フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
　本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ－ｔ－ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１～２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
　本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
　本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」、「シアノ基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、「１～４個のニトロ基で置換されたベンゼンスルホニル基」などが挙げられる。
　より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン－２－イル基、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロピラン－４－イル基、テトラヒドロチオピラン－４－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン－２－イル基、テトラヒドロチオフラン－２－イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２－メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２－トリクロロエトキシメチル基、ビス（２－クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１－エトキシエチル基、１－（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２－トリクロロエチル基などが挙げられる。１～３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基、９－アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基、２－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基、４－シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４－クロロフェニル基、２－フロロフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－ニトロフェニル基、２，４－ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４－メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンジルオキシカルボニル基、４－ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。「シアノ基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、シアノエトキシカルボニル基などが挙げられる。「１～４個のニトロ基で置換されたベンゼンスルホニル基」としては、２－ニトロベンゼンスルホニル基、２，４－ジニトロベンゼンスルホニル基などが挙げられる。
　「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２－クロロフェニル基、４－クロロフェニル基または２－プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２－シアノエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、ベンジル基、２－クロロフェニル基または４－クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」を構成する保護基は１つまたはそれ以上であり得る。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。
　本明細書において、－Ｐ（Ｒ２４）Ｒ２５［式中、Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ２４が－ＯＲ２４ａそしてＲ２５が－Ｎ（Ｒ２５ａ）２として表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式－Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式－Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
　本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合した「ヌクレオシド」を含む。天然型のヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」ともいう。修飾された非天然型のヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」ともいい、特に糖部分が修飾されたヌクレオチドを「糖修飾ヌクレオシド」という。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。
　本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合または他の結合で２～５０個結合した「ヌクレオチド」のポリマーであり、天然型のものと非天然型のものを含む。非天然型の「オリゴヌクレオチド」としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
　本明細書において、用語「その塩」とは、後述の式（ＩＩ）で表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
　本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」とは、本発明の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩であって、本発明のオリゴヌクレオチドの生理学的におよび製薬上許容される塩、すなわち、当該オリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
　以下、本発明について詳述する。
　本発明は、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤を含む、抗腫瘍剤を提供する。本発明の１つの実施形態では、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤は、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子と結合し得、該ＳＮＯＲＡ２３の発現を抑制する活性を有する核酸分子を含む。本明細書において、「ＳＮＯＲＡ２３遺伝子との結合」とは、例えば、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子への直接結合、およびＳＮＯＲＡ２３遺伝子より発現したＲＮＡへの結合が挙げられる。「ＳＮＯＲＡ２３遺伝子と結合し得、該ＳＮＯＲＡ２３の発現を抑制する活性」とは、例えば、発現抑制剤が、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子より発現したノンコーディングＲＮＡであるＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡに結合し、次いで当該ＲＮＡをＲＮａｓｅ Ｈの働きにより分解した結果、ＳＮＯＲＡ２３の発現ＲＮＡ量が抑制されることを包含する。
　ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。結合の熱安定性の指標である２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔｍ）は特に限定されない。２本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）は、例えば、下記のように決定され得る：緩衝液（８．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，２．６８ｍＭ　ＫＣｌ，１．４７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．２）中で、オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとを等モル混合し、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成させる。２本鎖核酸の温度を２０℃から９５℃まで０．５℃／分の速度で加温していき、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）の温度（Ｔ）による変化を測定し、この測定結果よりｄＡ／ｄＴ　ｖｓ　Ｔのグラフを描き、ｄＡ／ｄＴの値が最も大きくなる温度、つまりＡのＴによる変化が最も大きくなる温度を、２本鎖核酸のＴｍとする。融解温度（Ｔｍ）は、例えば、４０℃以上であり、好ましくは５０℃以上である。
　本明細書においては「相補的」とは、異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が２本鎖核酸を形成することができる対合関係にあることをいう。好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有するが、当該２本鎖核酸を形成し得、発現抑制効果作用を有する限り、１もしくは数個のミスマッチを有し得る。１もしくは数個のミスマッチとは、オリゴヌクレオチドの長さに依存し得るが、１～４個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１または２個のミスマッチを意味している。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列に対して完全に（１００％）相補性を有するものである。
　このように、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子と結合し得、かつ該ＳＮＯＲＡ２３遺伝子の発現を抑制する活性を有する核酸分子として、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドもしくはキメラオリゴヌクレオチド、アプタマーなどが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とは、標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡと結合し得、当該標的遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そしてその標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡの配列に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）とは、通常２１～２３塩基対からなる低分子二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象に関与しており、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制し得る。ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ：小ヘアピンＲＮＡもしくはｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ：短ヘアピンＲＮＡ）とは、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。また、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、特開２００３－２１９８９３号公報）は、２本鎖の一方がＤＮＡで、他方がＲＮＡであるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであっても、同じ鎖の一部がＤＮＡで、他の部分がＲＮＡであるＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。このような２本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは１９～２５塩基対、より好ましくは１９～２３塩基対、さらに好ましくは１９～２１塩基対の長さである。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの場合は、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるものが好ましく、また、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラの場合は、二本鎖オリゴヌクレオチドの上流側の一部がＲＮＡであるものが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドは、公知の化学合成法に従って、任意の配列を有するものとして作製され得る。アプタマーとは、特定の分子と特異的に結合する核酸分子またはペプチドを総称していい、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもよい。
　ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤は、配列番号１の任意の一部である標的領域と結合し得る。上記標的領域は、ヒトＳＮＯＲＡ２３において、特に、ＳＮＯＲＡ２３の発現を抑制する活性またはノックダウン活性に関連する領域であることが好ましい。標的領域は、例えば、１２～２５塩基長、好ましくは１２～２３塩基長、より好ましくは１３～２３塩基長、より好ましくは１４～２３塩基長、特に好ましくは１５～２３塩基長、特に好ましくは１５～２０塩基長の領域であり得る。核酸分子またはオリゴヌクレオチドが「標的領域と結合」とは、当該核酸分子またはオリゴヌクレオチドが標的領域全体と必ずしも２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成する必要はなく、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子の発現を抑制する活性またはノックダウン活性を発揮する限り、標的領域の一部である領域と２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成するものであってもよい。ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤の核酸分子は、例えば、標的領域と相補的であり、好ましくは完全な相補性を有する。
　本発明の１つの実施形態では、核酸分子は、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の一部である標的領域に相補的でありかつ１２～２０塩基の長さであるオリゴヌクレオチド、またはその薬理学上許容される塩を含む。この「標的領域に相補的」とは、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子上の標的領域に相補的である場合、および、当該標的領域に対応するＲＮＡ上の領域の塩基と相補的である場合の両方またはいずれか一方を含む。このようなオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、例えば１２～２０塩基、好ましくは１３～２０塩基、より好ましくは１４～２０塩基、特に好ましくは１５～１８塩基の長さである。オリゴヌクレオチドが上記のような長さであることにより、核内非翻訳ＲＮＡであるＳＮＯＲＡ２３遺伝子への結合および核内非翻訳ＲＮＡ発現抑制（例えば、ノックダウン）をより効果的に行い得る。
　標的領域として、例えば、配列番号１の１位から３５位まで、７１位から１００位まで、１３１位から１７０位までの領域の中の１２～２０塩基の連続した配列からなる領域が選択され得る。
　ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤のオリゴヌクレオチドの塩基配列としては、例えば、下記の配列が挙げられる：
ｇａｔｇａａａｃｃｔ　ａｔｇｃａ（配列番号２）；
ｇｃｃａｇｔｇｇｔａ　ｇａｔｇｔ（配列番号３）；
ｔｇｇｃｃａｇｔｇｇ　ｔａｇａｔ（配列番号４）。
　配列番号２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の５’末端部位から１９番目～３３番目の領域を標的とし、当該領域の塩基配列に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。配列番号３のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の５’末端部位から１５１番目～１６５番目の領域を標的とし、当該領域の塩基配列に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。配列番号４のオリゴヌクレオチドは配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の５’末端部位から１５３番目～１６７番目の領域を標的とし、当該領域の塩基配列に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。配列番号２～４の各塩基配列は５’から３’方向（５’→３’）で表したものであり、配列番号１中の各標的領域配列に対する逆相補配列である。
　ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制活性（ノックダウン活性）は、公知の方法（例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ））により測定することが可能である。
　本発明において「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更する。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更する。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
　１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、糖修飾部分を含む１個または２個以上のヌクレオチドを含む。本発明は、下述するようなオリゴヌクレオチドおよびその薬理学上許容され得る塩を包含する。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含む。この糖修飾ヌクレオシドは、その糖環の２位と４位との間で所定の架橋を有する。本発明における糖修飾ヌクレオシドについて、以下に説明する。
　本発明における糖修飾ヌクレオシドは、以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（ここで、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ａは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で表される二価の基であり、
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
　ｍは、０から２の整数であり；
　ｎは、０から１の整数であり；
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
　該オリゴヌクレオチドが、核内非翻訳ＲＮＡに結合して発現を抑制し得、該核内非翻訳ＲＮＡの配列に相補的であり、そして１２～２０塩基の長さである。）
を含む。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される構造である。式（Ｉ’）および（Ｉ”）中のＢａｓｅ、Ｒ１、Ｘ、ｍおよびｎは、上述したとおりである。
　式（Ｉ’）および（Ｉ”）において、Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基である。より好適には、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Ｒ１は、水素原子またはメチル基である。
　式（Ｉ’）において、ｍは、０から２の整数であり；そして式（Ｉ”）において、ｎは、０から１の整数である。すなわち、２’位、３’位、４’位、および架橋部を含む環は、５員環～７員環である。
　式（Ｉ”）において、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基である。好適には、Ｘは、酸素原子またはアミノ基である。なお、Ｘがアミノ基またはメチレン基である場合、低級アルキル基で置換されていてもよい。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、上記式（Ｉ’）で表される構造であり、そしてこの式（Ｉ’）において、ｍは０であり、そしてＲ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。このようなヌクレオシド構造を、アミド架橋型核酸、アミドＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、またはＡｍＮＡともいう。
　式（Ｉ’）および（Ｉ”）にてそれぞれ表される化合物においては、糖部の２’位のアミノ基と４’位から伸長したカルボニル基との間にアミド結合が形成されている。このように、構造的に揺らぎが少なくかつ親水性に優れるアミド結合を有するため、ヌクレオシドの糖部の構造が、架橋により固定化されている。
　上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造としては、上記式（Ｉ’）および（Ｉ”）に加えて、例えば、以下の式（ＩＩ）が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式（ＩＩ）中、Ｂａｓｅ、Ｒ１３およびＲ１４は上述したとおりである。ここで、Ｒ１３およびＲ１４がともに水素原子である場合、２’，４’－ＢＮＡまたはＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）（本明細書においては、「２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ」または単に「ＬＮＡ」ともいう）と称される核酸に該当する。
　上記「Ｂａｓｅ」は、プリン塩基（すなわち、プリン－９－イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
　上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、アデニニル基、グアニニル基、シトシニル基、ウラシリル基、およびチミニル基、ならびに６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が挙げられる。
　中でも、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
でそれぞれ表される基（すなわち、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基およびウラシリル基）、ならびに２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、６－アミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が好適であり、特に、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基およびチミニル基が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基およびアミノ基が保護基により保護されていることが好ましい。
　上記のような糖修飾ヌクレオシド構造を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドは、例えば、糖修飾ヌクレオシド化合物を用いて、例えば、国際公開第２０１１／０５２４３６号、特開２０１４－０４３４６２号公報および国際公開第２０１４／０４６２１２号に記載されるような方法を用いて合成することができる。
　糖修飾ヌクレオシド化合物の例としては、以下の式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（ここで、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ａは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
で表される二価の基であり、
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
　ｍは、０から２の整数であり；
　ｎは、０から１の整数であり；
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
　Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ２４）Ｒ２５［式中、Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）
が挙げられる。
　上記のような糖修飾ヌクレオシドから、糖修飾ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、三リン酸化は、M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008，vol.36, No.13，pp.4257－65に記載の方法に従って容易に行われ得る。
　核内非翻訳ＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡの１つであり、核内に存在し、タンパク質へ翻訳されずに機能するＲＮＡをいう。このような核内非翻訳ＲＮＡである核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、リボソームＲＮＡおよびその他のＲＮＡの化学修飾（例えば、メチル化、シュードウリジン化）を導く小さなＲＮＡ分子の一群である。ｓｎｏＲＮＡは核内の核小体に局在し、タンパク質と複合体（核小体低分子リボ核酸蛋白質（ｓｎｏＲＮＰ））を形成し、ＲＮＡ分子の修飾を触媒し得る。ｓｎｏＲＮＡは、その配列によって主にｂｏｘＣ／ＤとｂｏｘＨ／ＡＣＡの２種に分けられている。ｓｎｏＲＮＡの配列情報は遺伝子データベース（例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によるＧｅｎＢａｎｋ、国立大学法人宮崎大学のｓｎＯＰＹ等）から入手可能である。
　ＳＮＯＲＡ２３は、「ＡＣＡ２３　ｓｎｏＲＮＡ」または「ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅｏｌａｒ　ＲＮＡ，Ｈ／ＡＣＡ　ｂｏｘ　２３」として同定された核小体小分子ＲＮＡである。ヒトＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＪ６０９４３８（「Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｃｅ　ＡＣＡ２３　ｓｎｏＲＮＡ　ｇｅｎｅ」）、ＮＣＢＩ参照配列登録番号：ＮＲ＿００２９６２（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅｏｌａｒ　ＲＮＡ，　Ｈ／ＡＣＡ　ｂｏｘ　２３（ＳＮＯＲＡ２３），ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅｏｌａｒ　ＲＮＡ）により入手可能であり、配列表の配列番号１に示した通りである。
　上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、リン酸修飾、核酸塩基修飾が知られている。このような核酸修飾は、当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
　リン酸修飾としては、例えば、天然の核酸が有するリン酸ジエステル結合、Ｓ－オリゴ（ホスホロチオエート）、Ｄ－オリゴ（ホスホジエステル）、Ｍ－オリゴ（メチルフォスフォネイト）、ボラノホスフェート等が挙げられる。Ｓ－オリゴ（ホスホロチオエート）は、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のリン酸基部の酸素原子が硫黄原子で置換されたＰＳ骨格を有する。この修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。この修飾をオリゴヌクレオチド中に１もしくは複数もつアンチセンスオリゴヌクレオチドをＳ－オリゴ型（ホスホロチオエート型）という。
　核酸塩基修飾としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
　本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、糖修飾ヌクレオシドの位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、互いに同じものを含むか、または異なるものを含む。
　本発明のオリゴヌクレオチド（特に１本鎖オリゴヌクレオチドの場合）は、ギャップマーであることが好ましい。ギャップマーとは、中心領域となる「ギャップ」と該ギャップの両側の領域、２つのウイング、すなわち、５’側の「５’ウイング」および３’側の「３’ウイング」を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ギャップ領域は６～１０塩基長、そしてウイング領域は３～５塩基長であり得る。ギャップは、天然ヌクレオシドから構成されており、ウイングには、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが含まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、「５’ウイング」および／または「３’ウイング」に、糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは１～５、さらに好ましくは２～３含む。１つの実施形態では、ギャップマーは、６～１０塩基のギャップ領域、３～５塩基の５’ウイングおよび３～５塩基の３’ウイングからなり、ギャップ領域が５’ウイングと３’ウイングの間に位置づけられ、５’ウイングおよび３’ウイングは、少なくとも１つの上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を含み得る。さらに、リン酸修飾、塩基修飾などを含んでいてもよい。一方のウイング内の修飾の種類、数、位置は、他方のウイングにおける修飾の種類、数、位置と同じであってもまたは異なっていてもよい。
　このようなギャップマーとしては、例えば、３－８－３－１、３－９－３－１、３－１０－２－１、３－１０－３、５－１０－５などが挙げられる。例えば、３－８－３－１の表記の場合、ギャップの８塩基が天然ヌクレオシド（ＤＮＡ）であり、５’ウイング（５’末端から３塩基）が糖修飾ヌクレオシドであり、そして３’ウイング（３’末端から３塩基）のうち中心側からの３塩基が糖修飾ヌクレオシドであり、最後の１塩基（３’末端塩基）が天然ヌクレオシド（ＤＮＡ）である。配列に依存し得るが、３－８－３－１が好ましい。
　上述したＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤のオリゴヌクレオチド、すなわち、配列番号２～４のそれぞれについて、糖修飾ヌクレオシドにＡｍＮＡを用いて３－８－３－１のギャップマーを作製した場合、下記のように表され得る：
Ｇ＾Ａ＾Ｔ＾ｇ＾ａ＾ａ＾ａ＾ｃ＾ｃ＾ｔ＾ａ＾Ｔ＾Ｇ＾ｍＣ＾ａ（配列番号５）
Ｇ＾ｍＣ＾ｍＣ＾ａ＾ｇ＾ｔ＾ｇ＾ｇ＾ｔ＾ａ＾ｇ＾Ａ＾Ｔ＾Ｇ＾ｔ（配列番号６）
Ｔ＾Ｇ＾Ｇ＾ｃ＾ｃ＾ａ＾ｇ＾ｔ＾ｇ＾ｇ＾ｔ＾Ａ＾Ｇ＾Ａ＾ｔ（配列番号７）
（上記の大文字はＡｍＮＡであり、小文字はＤＮＡであり、「＾」はホスホロチオエート結合を示す。なおｍＣは５－メチルシトシンである）。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、上述したような糖修飾ヌクレオシドおよび天然ヌクレオシドを用いて、常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、株式会社ジーンデザイン製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Tetrahedron Letters，1981, vol. 22. pp.1859－1862、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に開示されている。
　本発明の１本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、デリバリーデバイスを用いることなく単体での投与により、細胞内に取り込まれ得る。ＳＮＯＲＡ２３のような核内非翻訳ＲＮＡまたはｓｎｏＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡを用いて作製された場合、ヌクレアーゼ耐性および生体内での安定性により、インビボでの核内非翻訳ＲＮＡまたはｓｎｏＲＮＡの発現抑制を達成し得、ＡｍＮＡを用いて作製された場合、ヌクレアーゼ（３’－エキソヌクレアーゼ）に対する分解耐性能を有し、よりＲＮＡ特異的であり、生体内での発現抑制効率および安全性の向上を示し得、インビボでの核内非翻訳ＲＮＡまたはｓｎｏＲＮＡの発現抑制を達成し得る。
　ＳＮＯＲＡ２３は、高転移性癌細胞（例えば、高転移性膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞（例えば、下記実施例の「高転移性ＰＤＡＣ細胞株のインビボ選択」に従って樹立したＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞））において特異的に高発現される。ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現および発現抑制の程度は、上述したように、公知の方法（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ）により測定することが可能である。ＳＮＯＲＡ２３は腫瘍細胞の増殖、ならびに癌細胞（悪性腫瘍細胞）の浸潤性および転移能に関与し得る。ＳＮＯＲＡ２３の発現抑制（例えば、ノックダウン）により、腫瘍細胞の増殖抑制（腫瘍形成能の低下）、癌細胞（悪性腫瘍細胞）の播種抑制（浸潤性低下）および転移の減少（転移能低下）が生じ得る。腫瘍細胞増殖、浸潤および転移については、下記の実施例に記載の手順に基づいて決定し得る。本明細書において、「抗腫瘍」とは、腫瘍細胞の増殖抑制（腫瘍形成能の低下）、癌細胞（悪性腫瘍細胞）の播種抑制（浸潤性低下）および転移の減少（転移能低下）の少なくとも１つの効果を示し、好ましくはこれらの全ての効果を示す。
　本発明の抗腫瘍剤によれば、生体内において、癌に特異的に高発現するｓｎｏＲＮＡ（ＳＮＡＲＡ２３）の発現が抑制され得る。本発明の抗腫瘍剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、デリバリーデバイスを用いることなく単体投与により、そのような発現抑制を実施し得る。
　本発明の抗腫瘍剤によれば、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤は、ＳＹＮＥ２遺伝子の発現を抑制し得る。ＳＹＮＥ２遺伝子は、「Homo sapiens spectrin repeat containing nuclear envelope protein 2 (SYNE2), RefSeqGene on chromosome 14」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＧ＿０１１７５６）；「Homo sapiens spectrin repeat containing nuclear envelope protein 2 (SYNE2), transcript variant 1, mRNA」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１５１８０）；「Homo sapiens spectrin repeat containing, nuclear envelope 2 (SYNE2), transcript variant 2, mRNA」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１８２９１０）として同定され、その塩基配列情報は当該登録番号により入手可能である。また、タンパク質のアミノ酸配列情報は、「nesprin-2 isoform 1 [Homo sapiens]」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０５５９９５）および「nesprin-2 isoform 2 [Homo sapiens]」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿８７８９１４）により入手可能である。Variant１と、variant２とは、転写開始部位が異なり得る。ＳＹＮＥ２は、別にＥＤＭＤ５、ＮＵＡ、ＮＵＡＮＣＥ、Ｎｅｓｐ２、Ｎｅｓｐｒｉｎ－２、ＳＹＮＥ－２、ＴＲＯＰＨとも称され得る。下記の実施例に記載のＳＹＮＥ２、variant 2, mRNA（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１８２９１０）の塩基配列を配列番号８に示し、対応するアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿８７８９１４）を配列番号９に示す。
　本発明は、ＳＹＮＥ２遺伝子発現抑制剤を含む抗腫瘍剤もまた提供する。１つの実施形態では、ＳＹＮＥ２遺伝子発現抑制剤は、ＳＹＮＥ２遺伝子と結合し得、かつ該ＳＹＮＥ２遺伝子発現を抑制する活性を有する核酸分子を含む。このような核酸分子としては、上述したようなｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドもしくはキメラポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。本明細書において、「ＳＹＮＥ２遺伝子との結合」は、ＳＹＮＥ２遺伝子への直接結合、およびＳＹＮＥ２遺伝子のｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体への結合を包含する。
　１つの実施形態では、ＳＹＮＥ２遺伝子と結合し得、該ＳＹＮＥ２遺伝子の発現を抑制する活性を有する核酸分子は、ＳＹＮＥ２遺伝子のｓｉＲＮＡである。ＳＹＮＥ２のｓｉＲＮＡは、種々の供給会社（例えば、サーモフィッシャー・サイエンティフィック）より入手可能であり、一例として、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製のｓｉＲＮＡ　ＩＤ番号：ｓ２３３２８のｓｉＲＮＡが挙げられる。
　本発明の抗腫瘍剤は、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤（例えば、ＳＮＯＲＡ２３と結合し得、該ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現を抑制する活性を有する核酸分子、ＳＮＯＲＡ２３アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）またはＳＹＮＥ２遺伝子発現抑制剤（例えば、ＳＹＮＥ２遺伝子と結合し得、該ＳＹＮＥ２遺伝子の発現を抑制する活性を有する核酸分子、ＳＹＮＥ２遺伝子のｓｉＲＮＡなど）を含有する。上記抗腫瘍剤は、これらの両方を含有してもよい。本発明の抗腫瘍剤は製剤化されて、医薬組成物を製造し得る。
　また、本発明の抗腫瘍剤および医薬組成物は、当該分野で公知の投与方法により投与され得る。これらは、局所的あるいは全身的な処置、または処置すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。
　本発明は、前記抗腫瘍剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、腫瘍または癌疾患を処置するための方法もさらに提供する。用語「処置」は、疾患（本発明においては腫瘍または癌疾患）の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的および／または治療的介入を包含するものとする。
　本発明の方法において、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は、腫瘍または癌疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象であり得る。
　本発明の抗腫瘍剤によれば、腫瘍形成、浸潤および転移の抑制効果が示され得る。１つの実施形態としては、本発明の抗腫瘍剤は、浸潤性または転移能のある腫瘍に対して用いられる。本発明の抗腫瘍剤は、種々の癌の処置に用いられ得る：例えば、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫（胸膜、腹膜、心膜など）、頭頚部癌、喉頭癌、口腔癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍（睾丸がん）、腎細胞癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、肛門癌など。本発明の抗腫瘍剤は、例えば、膵癌、肺癌、腹膜播種（卵巣癌・胃癌）のような難治癌患者の癌の進展を阻害し、生存期間の延長をもたらす治療薬として医療応用できる。１つの実施形態としては、本発明の抗腫瘍剤は、膵癌、肝癌、肺癌、卵巣癌または胃癌の処置に用いられる。
　「有効量」とは、対象疾患の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量であり、好ましくは、対象疾患の発症を予防し、または対象疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。このような量は、培養細胞などを用いたインビトロ試験、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができる。このような試験法は当業者にはよく知られている。
　投与する医薬の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の方法、時期および頻度、併用医薬、治療反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
　投与の方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、または、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
　本発明の抗腫瘍剤を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
　経口投与用剤としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
　非経口、髄腔内、または、脳室内投与用剤としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
　本発明の医薬は、本発明の抗腫瘍剤、またはＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤（例えば、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子と結合し得、該ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現を抑制する活性を有する核酸分子、ＳＮＯＲＡ２３アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）もしくはＳＹＮＥ２発現抑制剤（例えば、ＳＹＮＥ２と結合し得、該ＳＹＮＥ２の発現を抑制する活性を有する核酸分子）の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
　賦形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムまたは結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンまたはポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末またはラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムまたはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴールまたはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤または乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加してもよい。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えてもよい。
　ＳＮＯＲＡ２３は、上記の腫瘍または癌の浸潤または転移を検出するためのバイオマーカーとなり得る。血液試料中のＳＮＯＲＡ２３が、このようなバイオマーカーとして用いられる。
　本発明によれば、腫瘍の浸潤または転移を検出するため、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３を測定することを特徴とする、ＳＮＯＲＡ２３のバイオマーカーとしての使用がさらに提供される。本発明によれば、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３を測定する工程を含む、腫瘍の浸潤または転移を検出する方法もまた提供され得る。
　ＳＮＯＲＡ２３を測定する血液試料として、対象から採取した血液試料を用いることができる。血液試料は、全血、血清、血漿などが挙げられる。血液試料中のＳＮＯＲＡ２３の測定は、例えば、血液試料からＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡを抽出し（例えば、high pure RNA isolation kit（Roche Diagnostics GmbH）を用いて抽出）、ＲＮＡ量を公知の方法（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって測定することでなされ得る。
　血液試料中のＳＮＯＲＡ２３量は、腫瘍の浸潤または転移の存在または進行と関連し得る。血液試料中のＳＮＯＲＡ２３量の増大は、腫瘍の浸潤の増大または転移の進行の指標となり得る。例えば、経時的に血液試料中のＳＮＯＲＡ２３量を測定することにより、腫瘍の浸潤の増大または転移の進行をモニタリングすることができる。経時的なＳＮＯＲＡ２３量の増大が、腫瘍の浸潤または転移が進行していることを表し得る。このようなバイオマーカーは、癌患者への抗腫瘍剤の投与の抗腫瘍効果のモニタリングにも用いられ得る。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　本実施例において用いた材料および手法について以下に説明する。
　（オリゴヌクレオチド合成）
　オリゴヌクレオチドは、既報（特許文献１）に準じて合成した。
　具体的には、下記の２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド（蛍光標識ＬＮＡプローブ、ＬＮＡ含有アンチセンスオリゴヌクレオチド）の合成は、株式会社ジーンデザインに委託した。本実施例で使用した２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡの構造を、以下の式（ａ）に示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、Ｂａｓｅは５－メチルシトシニル基（ｍＣ：５－メチルシトシン）、チミニル基（Ｔ：チミン）、アデニニル基（Ａ：アデニン）またはグアニニル基（Ｇ：グアニン）である。）
　下記のアミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）含有オリゴヌクレオチド（ＡｍＮＡ含有アンチセンスオリゴヌクレオチド）の合成は、特許文献１に記載の方法を参照して行った。本実施例で使用したＡｍＮＡの構造を、以下の式（ｂ）に示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、Ｂａｓｅは、５－メチルシトシニル基（ｍＣ：５－メチルシトシン）、チミニル基（Ｔ：チミン）、アデニニル基（Ａ：アデニン）またはグアニニル基（Ｇ：グアニン）であり、Ｍｅはメチル基である。）
　２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡまたはＡｍＮＡを含有する１４ｍｅｒ～２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（ｎＳ－８型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイトプロトコール（固相担体：ＣＰＧレジン、硫化はＤＤＴ（３Ｈ－１，２－Ｂｅｎｚｏｄｉｔｈｉｏｌｅ－３－ｏｎｅ，１，１－ｄｉｏｘｉｄｅ）等を使用）にて実施し、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基で保護され、かつ３’位が固相に担持されたオリゴヌクレオチドを得た。続いて、酸処理により、ＤＭＴｒ基を除去した後、塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した。希酸にて中和後、溶媒を留去し、得られた粗生成物をゲルろ過カラムクロマト、逆相ＨＰＬＣにて精製することにより目的物を得た。
　本実施例で使用した２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡまたはＡｍＮＡの架橋構造、ならびに得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ　ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）により確認した。
　（細胞株）
　ヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞株（ＡｓＰＣ－１、ＭＩＡ　ＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＣＦＰＡＣ－１、Ｈｓ７６６Ｔ、ＳＷ１９９０、ＢｘＰＣ－３、ＣＡＰＡＮ－１、ＣＡＰＡＮ－２、Ｓｕｉｔ－２、ＫＰ－２およびＫＰ－３）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）またはヒューマンサイエンス研究資源バンク（Health Science Research Resources Bank）から購入した。Ｈ４８Ｎ細胞株、ＫＰ－１Ｎ細胞およびＨＰＣ－３細胞をDr. H. Iguchi（独立行政法人国立病院機構九州がんセンター）およびDr. Takahiro Yasoshima（北海道公立大学法人札幌医科大学）のそれぞれから提供いただいた。ＮＰＤＥ細胞をＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。ＨＰＤＥ細胞株をDr. Ming-Sound Tsao（トロント大学）より提供を受けた。３つのヒトＣＡＦ細胞株（ＣＡＦ－１／－２／－３）は既報に従って入手した（Cui Lら, PLoS One 2010;5:e12121）。高転移性のＰＤＡＣ細胞（Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ）を下記の「高転移性ＰＤＡＣ細胞株のインビボ選択」に説明した通りに樹立した。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿空気中３７℃にてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ナカライテスク株式会社）（１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Gibco-Life Technologies)、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充）中で培養した。
　（高転移性ＰＤＡＣ細胞株のインビボ選択）
　Ｓｕｉｔ２－ｌｕｃ細胞またはＭＩＡ　ＰａＣａ２－ｌｕｃ細胞（マウス当たり１×１０６細胞（５０μｌ　ＰＢＳ中））をヌードマウスの膵尾部に移植した。３～６週後、肝臓中の転移結節を採取し、Ｉ型コラゲナーゼ（ロシェ）で消化し、そしてインビトロでの癌細胞の単離および培養に供した。続いて、培養した癌細胞を再度ヌードマウスの膵尾部に移植した。このプロセスを５回繰り返し、高肝転移性細胞株を樹立した。これらを、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣと称した。
　（患者検体）
　膵臓組織検体をＰＤＡＣ（ｎ＝１３３）、ＩＰＭＮ（ｎ＝１６）およびＭＣＮ（ｎ＝１）を罹患する患者から得た。正常な膵臓（ｎ＝８）および肝臓（ｎ＝３）組織検体を、２００４年から２００８年までに国立研究開発法人国立がん研究センターで膵臓の外科的切除を受けた中から腫瘍、炎症のいずれも有さない被検体から得た。ＩＶ期疾患である全患者の診断は、傍大動脈リンパ節関与に基づいた。検体の使用は、国立研究開発法人国立がん研究センターの臨床研究の倫理審査委員会の指針に従って全ての患者から許可を受けた。
　（ｃＤＮＡマイクロアレイ）
　ＲＮＡ試料を細胞から抽出した。ＲＮＡ試料の品質をExperion RNA Analysis Kitおよび自動電気泳動システム（Bio-Rad Laboratories）を製造会社のプロトコルに従って用いて評価した。ビオチン化ｃＲＮＡをAmbion WT Expression Kit（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて０．５μｇ総ＲＮＡから調製し、Human Gene 2.1 ST Arrayストリップとハイブリダイズさせた。Arrayスライドを洗浄して染色し、そして４５℃にて１６時間GeneAtlas System（アフィメトリクス）中で走査した。マイクロアレイデータ解析をGeneSpring GX 13.1ソフトウェア（Digital Biology）を用いて行った。
　（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応：ｑＲＴ－ＰＣＲ）
　総ＲＮＡをhigh pure RNA isolation kit（Roche Diagnostics GmbH）を用いて抽出した。ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲを、既報（Fujita-Sato Sら、Cancer Res 2015；75：2851-62）の通り、LightCycler480 II System（Roche Diagnostics GmbH）で、プライマーセットと共にQuantiTect SYBR Green Reverse Transcription PCR Kit（株式会社キアゲン）を用いて行った。
　（ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡおよびｐＤＮＡのトランスフェクション）
　細胞を６ウェルまたは２４ウェルのプレート中に７０％コンフルエンスで播種した。１６時間後、細胞を以下の分析のためにLipofectamin RNAiMaxまたはLipofectamin 2000試薬（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて、以下でトランスフェクトした：その両端に２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡまたはＡｍＮＡを配置したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、またはＳＮＯＲＡ２３またはＳＹＮＥ２発現プラスミド（ｐＤＮＡ）（ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡおよびｐＤＮＡについては最終濃度２０ｎＭで用いた）。
　３’ＵＴＲ領域にＳＮＯＲＡ２３配列を有する緑色蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）の人工合成ｃＤＮＡをタカラバイオ社に合成委託し、その５’末端にＢａｍＨＩおよび３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識塩基配列が付加されたもの（この塩基配列を配列番号１０に示す。配列番号１０の１位～７２３位がＥｍＧＦＰ（対応アミノ酸配列を配列番号１１に示す）、７３０位～９１８位がＳＮＯＲＡ２３である。）を含むクローニングベクターの形態で入手した。クローニングベクターからｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切り出し、pBApo-CMV Neo plasmid（タカラバイオ）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの制限部位の間に挿入して、ＳＮＯＲＡ２３発現プラスミドを構築した。ヒトＳＹＮＥ２の人工合成ｃＤＮＡ（配列番号８の８９１位～２１８０位の塩基配列をコドン最適化した配列）をＥｕｒｏｆｉｎ社に合成委託し、その５’末端にＢａｍＨＩおよび３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識塩基配列が付加されたもの（配列番号１２（対応アミノ酸配列を配列番号１３に示す）を含むクローニングベクターの形態で入手した。同様に、クローニングベクターからｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切り出し、pBApo-CMV Neo plasmid（タカラバイオ）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの制限部位の間に挿入して、ＳＹＮＥ２発現プラスミドを構築した。コントロールとして、モックｐＤＮＡ（ＳＮＯＲＡ２３やＳＹＮＥ２等のオープンリーディングフレームを含まないプラスミド）でのトランスフェクションを行った。
　（細胞内ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ検出のための共焦点レーザ顕微鏡観察）
　ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡの細胞内局在を調べるために、細胞をLipofectamine RNAiMaxおよび下記の２つの蛍光標識ＬＮＡプローブ（２０ｎＭ）を用いてトランスフェクトした。蛍光標識ＬＮＡプローブは、５’－［Ａｌｅｘａ４８８］－［アミノリンカー］－ＧＡＡａｃｃｔａｔｇｍＣＡｍＣａ－３’（配列番号１４）および５’－ｍＣＴＡｃｃａｇａｃａｍＣＡＧａ－［アミノリンカー］－［Ａｌｅｘａ６４７］－３’（配列番号１５）（大文字：ＬＮＡ；小文字：ＤＮＡ；ｍＣ：５’－メチルシトシン；ジーンデザイン株式会社）であり、これらはそれぞれ、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３の塩基配列の５’末端部位から１７～３０番目および３２～４５番目の隣接する配列領域を標的とするように設計したものである。１６時間後、細胞内ＳＮＯＲＡ２３シグナルをＣ２共焦点レーザ顕微鏡（株式会社ニコン）によって観察した。
　（足場依存性細胞増殖アッセイ）
　細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、増殖率をCell Counting kit-8（ＣＣＫ－８；株式会社同仁化学研究所）を用いて決定した。簡単には、１０μｌのＣＣＫ－８溶液を各ウェルに添加した後、２時間インキュベートした。反応液の４５０ｎｍ（参照６００ｎｍ）での吸光度をGloMax-Multi+（プロメガ株式会社）で測定した。
　（軟寒天コロニー形成アッセイ）
　足場非依存性細胞増殖を以下に記載のように軟寒天コロニー形成アッセイにより評価した。
　予め温めておいた０．７５ｍｌの２×ＤＭＥＭ（２０％ＦＢＳ、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、および２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する）および０．７５ｍｌの融解した１．２％アガロースゲル溶液を混合し、６ウェルプレートのウェルに移した。簡単には、示したＡＳＯでトランスフェクトした細胞（１×１０４細胞／ウェル）を０．７５ｍｌの２×ＤＭＥＭ（０．６％寒天、および２０％ＦＢＳ、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、および２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）の上層に混合した。３週間後、培養した細胞をクリスタルバイオレット（シグマアルドリッチ）で染色し、コロニーの数を計数した。
　（スフェロイド形成アッセイ）
　足場非依存性細胞増殖をスフェロイド形成アッセイにより評価した。５×１０４細胞／ｍｌの細胞懸濁液をUltra-Low Attachment Surface 96ウェルプレート（カタログ番号３４７４．コーニング）上に１００μｌ／ウェルで播種した。細胞を加湿インキュベータ中５％ＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。スフェロイド増殖を上記のようにＣＣＫ－８キットを用いて４日間毎日モニタリングした。
　（細胞浸潤アッセイ）
　若干の変更を加えた以外は既報（Cui Lら、PLoS One 2010;5:e12121）通りにＰＤＡＣ細胞の浸潤性を評価した。
　フィルター（孔サイズ：８．０μｍ）の上部表面をmatrigel（２０μｇ／ウェル，BD Biosciences）でコーティングした。ＡＳＯトランスフェクションを行う場合はそのトランスフェクションから４８時間後またはｐＤＮＡ発現プラスミドでのトランスフェクションを行う場合はトランスフェクションから７２時間後、細胞を上部チャンバー中に２．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、４８時間（ＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞）または７２時間（Ｓｕｉｔ２細胞およびＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞）インキュベートした。フィルターの下側に移動した細胞を固定し、ヘマトキシリン－エオシンで染色し、次いでEclipse 55i光学顕微鏡（株式会社ニコン）下で計数した。
　（動物処理）
　全ての動物実験を国立大学法人九州大学の動物実験委員会により認可されたプロトコルに従って行った。雌の６週齢無胸線ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ－ｎｕ）を日本チャールズリバー株式会社から購入し、実験開始前１週間、馴化させた。外科的手順は、動物の苦痛を最小限にするためにイソフルラン麻酔下で行った。
　Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、Lipofectamine RNAiMAX（インビトロジェン）を製造会社のプロトコルに従って用いてＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）またはコントロールＡＳＯ（配列番号１８）（下記実施例３の表１：最終濃度２０ｎＭ）でトランスフェクトした。４８時間後、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣにつき１×１０５細胞またはＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣにつき２×１０５細胞にて細胞を懸濁し、ヌードマウスの脾臓の被膜下領域に移植した（各群につきｎ＝５）。１週間後、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯまたはコントロールＡＳＯを、３週間の間、週に一度でマウス頸部に皮下（ｓ．ｃ．）投与した（１０ｍｇ／ｋｇ体重）。イソフルラン麻酔下でＤ－ルシフェリン（１００ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射後、４週まで、週に一度でIVIS Imaging System（パーキンエルマー）を用いてマウス全身の生物発光シグナル（ルシフェラーゼ活性）を測定し（「ＩＶＩＳ画像化」ともいう）、マウス体内における腫瘍増殖を評価した。マウスを２８日目に安楽死させ、その膵臓および肝臓を摘出し、ＩＶＩＳ画像化により腫瘍の浸潤および肝転移のレベルを定量した。
　（組織化学）
　腫瘍組織試料を異種移植腫瘍保有マウスから採取し、５μｍ厚に切断し、４％パラホルムアルデヒドで４℃にて１５分間固定した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、腫瘍浸潤の状態を解析した。
　（統計学的解析）
　JMP Pro 12.2.0ソフトウェア（SAS Institute）を用いて統計学的解析を行った。平均値±標準偏差として結果を示す。スチューデントｔ検定またはマン・ホイットニーＵ検定を用いて２群間の差を統計学的に解析した。ピアソンのχ２検定を適用してＳＮＯＲＡ２３発現と臨床病理学的パラメーターとの間の相関を解析した。カプラン・マイヤー法によって生存曲線を作成し、ログランク検定を用いて解析した。Ｐ値が０．０５未満であるとき統計学的に有意であるとした。
　（ウェスタンブロット解析）　培養細胞をＳＤＳ緩衝液（６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５％グリセロール、２％ＳＤＳ）中に採取した。抽出タンパク質試料（１５μｇ）を、既報（Shinkai Kら、Int J Cancer 2016;139:433-45）通りに、ＮｕＰＡＧＥドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動ゲル（Invitrogen）上で電気泳動し、二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、以下の一次抗体を用いてウェスタンブロット解析に供した：（標的、供給会社、カタログ番号、力価の順に示す）ＳＹＮＥ２、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、２５２６５－１－ＡＰ、１：１０００；ＩＰＯ７、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、ＳＣ－１３４９１３、１：１０００；ＬＧＲ５、Ａｂｃａｍ、ａｂ７５７３２、１：１０００；ｐ２１／Ｃｉｐ、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５６４３１、１：１０００；ＰＤＣＨ１１Ｘ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、２００７０－１－ＡＰ、１：１０００。
　（プロテオミクス解析）
　プロテオミクスデータを下記のようにして得、スペクトルカウント法またはラベルフリー定量法を用いて解析に供した。
　２％ＳＤＳ、７Ｍ尿素、および１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）からなる２００μｌ溶液に細胞（２×１０６）を溶解し、次いでBioruptor（Diagenode社）を用いて超音波処理（５回処理。各回３０秒で間に３０秒）に供した。試料を等容量の水で希釈し、再度超音波処理に供した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（バイオ・ラッド）を用いて決定した。タンパク質試料（２００μｇ）をメタノール－クロロホルム沈降に供した。生じたペレットを消化緩衝液（０．５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム：７Ｍ水酸化グアニジンを含有する）中に溶解し、次いで５６℃にて３０分間加熱した。各試料を等容量の水で希釈し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイを用いて決定した。
　残りの溶液（５０μｌ）を５０μｌの水で希釈し、リシルエンドペプチダーゼ（登録商標）（２μｇ，和光純薬工業株式会社）により３７℃にて４時間消化に供した。１００μｌの水を添加後、試料をトリプシン（２μｇ，サーモフィッシャー・サイエンティフィック）で３７℃にて４時間さらに消化した。システイン／シスチン残基をブロックするために、消化物を０．６２５ｍＭ　トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）で３７℃にて３０分間処理し、次いで３．１２５ｍＭ　２－ヨードアセトアミド（シグマアルドリッチ）で室温にて３０分間アルキル化し、２．５ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（シグマアルドリッチ）で反応停止した。
　得られたペプチドを、ナノnanoLC装置（Advance LC，Michrom BioResources社）およびＨＴＣ－ＰＡＬオートサンプラー（CTC Analytics）と連結したLTQ Orbitrap Velos Pro質量分析計（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）からなるシステムを用いてナノスケール液体クロマトグラフィー（ナノＬＣ）－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ペプチド分離を、３μｍ　Ｃ１８Ｌ－column（化学物質評価研究機構）を充填したヒューズドシリカキャピラリー（内径０．１ｍｍ；長さ１５ｃｍ；先端内径０．０５ｍｍ）を用いて行った。移動相は０．１％ギ酸／２％アセトニトリル（Ａ）および０．１％ギ酸／９０％アセトニトリル（Ｂ）であった。ペプチドを２５０ｎＬ／分の流速にてリニアグラジエント５％～４０％Ｂで１００分、４０％～９５％Ｂで１分間溶出し、９５％Ｂ中で９分間維持した。衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルを動的排除オプションによるデータ依存スキャンモードで自動取得した。フルＭＳスペクトルを３００～２０００の質量／電荷（ｍ／ｚ）範囲でOrbitrapを用いて得た（ｍ／ｚ４００で６０，０００の分解能であった）。フルＭＳスペクトル中の１２の最も強い前駆イオン（最小イオンカウント閾値１，０００）を引き続くイオン捕捉ＭＳ／ＭＳ分析（自動利得制御（ＡＧＣ）モード）のために選択した。ＡＧＣをフルＭＳについて１×１０６、ＣＩＤ　ＭＳ／ＭＳについて１×１０４に設定した。正規化した衝突エネルギー値を３５％に設定した。分析の間質量を最小化するようにロック質量関数を有効にした。生ファイルを、IPI human database version 3.1.6に対してＭＡＳＣＯＴアルゴリズム（ｖｅｒ．２．４．１）を用いてProteomeDiscovere 1.4（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）によって加工処理した。使用酵素としてトリプシンを選択し、切れ残り（Missed Cleavage）の許容数を２に設定し、固定修飾としてシステインに対するカルバミドメチル化を選択した。Ｎ末端に対する酸化したメチオニンおよびアセチル化を変動修飾として調査した。前駆体質量許容差は１０ｐｐｍであり、ＭＳ／ＭＳイオンの許容差は０．８Ｄａであった。ＦＤＲ（false discovery rate） をPercolatorアルゴリズムによって決定した（ｑ値＜０．０１）。
　（実施例１：転移性表現型のＰＤＡＣ細胞株におけるＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡの過剰発現の検出）
　高転移性の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞（Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ）を樹立した。Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞株およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞株は５匹全てのマウス（１００％）においてより高い割合で肝臓転移を生じたのに対し、それぞれの親細胞株では肝転移が生じたのは５匹のうち２匹のマウス（４０％）および５匹のうち０匹（０％）であった。
（ａ）肝転移の原因となる要因を同定するために、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞およびそれらの親細胞株中のｍＲＮＡおよび非翻訳ＲＮＡのｃＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
　図１－１のａは、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２癌細胞について、ＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）中のｍＲＮＡおよび非翻訳ＲＮＡが親細胞（「ＷＴ」）の２倍以上であった遺伝子を表す模式図である。
　図１－１のａに示されるように、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞においては８遺伝子（６遺伝子＋ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡおよびＣＥＡ　ｍＲＮＡ）、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞においては６遺伝子（４遺伝子＋ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡおよびＣＥＡ　ｍＲＮＡ）が、それらのそれぞれの親細胞の２倍以上にアップレギュレートされた。また、これらの遺伝子の中で癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＳＮＯＲＡ２３が、Ｓｕｉｔ２－ＨＭＬＣ　およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＭＬＣ細胞株の両方において共通にアップレギュレートされた。
（ｂ，ｃ）ＣＥＡ　ｍＲＮＡおよびＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析によって、マイクロアレイ解析の結果を検証した。
　ｑＲＴ－ＰＣＲ解析によるＳＮＯＲＡ２３の発現測定に関して、用いたプライマーセットは下記である：
（ＳＮＯＲＡ２３）
フォワード：
５’－ＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣ－３’（配列番号１６）
リバース：
５’－ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣ－３’（配列番号１７）
（１８Ｓ　ｒＲＮＡ）
フォワード：
５’－ＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴ－３’（配列番号１８）
リバース：
５’－ＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧ－３’（配列番号１９）
　図１－１のｂおよびｃは、ｑＲＴ－ＰＣＲによる測定により得られた、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２の各々について、親細胞（「ＷＴ」）を１とした場合の高転移性ＰＤＡＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）のＣＥＡ　ｍＲＮＡ（図１ｂ）およびＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ（図１ｃ）の相対的発現量を示すグラフである。
　図１－１のｂおよびｃに示されるように、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析により、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、ＣＥＡおよびＳＮＯＲＡ２３ともに、それらの親細胞よりも発現がアップレギュレートされたことが確認された（ＣＥＡについては、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞は６．７４倍であり、およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞は２．６９倍；ＳＮＯＲＡ２３については、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞は１．６３倍であり、およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞は１．７２倍）。
（ｄ）ｑＲＴ－ＰＣＲによって、種々の膵癌細胞株、正常膵管上皮（ＮＰＤＥ）細胞、および癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）におけるＳＮＯＲＡ２３発現を測定した。
　図１－１のｄは、１５種の膵癌（ＰＤＡＣ）細胞株（ＡｓＰＣ－１、ＭＩＡ　ＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＣＦＰＡＣ－１、Ｈｓ７６６Ｔ、ＳＷ１９９０、ＢｘＰＣ－３、ＣＡＰＡＮ－１、ＣＡＰＡＮ－２、Ｓｕｉｔ－２、Ｈ４８Ｎ、ＫＰ－２、ＫＰ－３、ＫＰ－１Ｎ、およびＨＰＣ－３）、非癌性不死化ヒト膵管上皮（ＨＰＤＥ）細胞、正常膵管上皮（ＮＰＤＥ）細胞、および３種の癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ－１、ＣＡＦ－２、ＣＡＦ－３）におけるＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現を１８Ｓ　ｒＲＮＡによって正規化した。
　図１－１のｄに示されるように、ＰＤＡＣ細胞におけるＳＮＯＲＡ２３発現レベルはＮＰＤＥ細胞およびＣＡＦにおけるよりも有意に高かった（１５～６２倍）。不死化ヒト膵管上皮（ＨＰＤＥ）細胞株中の発現レベルは、低いレベルのＳＮＯＲＡ２３発現を伴ういくつかのＰＤＡＣ細胞株と同様であった。
　したがって、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析は、ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡが、１５種の膵癌細胞株で中～高発現レベル、非癌性不死化膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ）で中発現レベルであるのに対し、正常ヒト膵管上皮細胞（ＮＰＤＥ）または３種の癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ－１、ＣＡＦ－２、ＣＡＦ－３）では微発現レベルであることを実証した。
（ｅ）ＳＮＯＲＡ２３の細胞下局在を調べるために、ＳＮＯＲＡ２３に結合する蛍光標識プローブをＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、それらの親細胞および、ならびにＮＰＤＥ細胞にトランスフェクトした。ＳＮＯＲＡ２３シグナルを正確に検出するために、ＳＮＯＲＡ２３中の近接する配列にそれぞれ結合する２種の蛍光標識２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡプローブを用いた（それぞれＡｌｅｘａ－４８８およびＡｌｅｘａ－６４７で標識した。共に存在すれば、より多くのＳＮＯＲＡ２３特異的シグナルが示される）。Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３をノックダウンした細胞（ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（下記実施例３参照）でトランスフェクトした細胞）にも同様に２種の蛍光標識プローブをトランスフェクトした。
　図１－２のｅは、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２の各々について親細胞（「ＷＴ」）、高転移性ＰＤＡＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）およびＳＮＯＲＡ２３ノックダウン細胞（「ＨＬＭＣ－ＳＮ－ＫＤ」）のＡｌｅｘａ－４８８標識蛍光顕微鏡画像（「Ａｌｅｘａ－４８８」）、Ａｌｅｘａ－６４７標識蛍光顕微鏡画像（「Ａｌｅｘａ－６４７」）、およびそれらの合併画像（「合併」）、ならびにＮＰＤＥ細胞のＡｌｅｘａ－４８８標識蛍光顕微鏡画像（「Ａｌｅｘａ－４８８」）、Ａｌｅｘａ－６４７標識蛍光顕微鏡画像（「Ａｌｅｘａ－６４７」）および位相差顕微鏡画像、そして破線による四角部分に、ＭＩＡ　ＰａＣａ２の親細胞（「ＷＴ」）および高転移性ＰＤＡＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）の合併画像中の破断線四角部の拡大画像として、位相差顕微鏡画像および蛍光合併画像を示す。スケールバー：１００μｍ。
　ＳＮＯＲＡ２３シグナルは、ＮＰＤＥ細胞（「ＦＩＴＣ」および「Ａｌｅｘａ－６４７」のいずれも蛍光が観察されなかった）よりも、Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞で高かった（「ＷＴ」および「ＨＬＭＣ」）。Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）で、それらの親細胞株（「ＷＴ」）に比較してより強い核局在ＳＮＯＲＡ２３シグナルが観察された。ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯでトランスフェクトしたＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞では蛍光シグナルが消失した（「ＨＬＭＣ」では蛍光が観察されるのに対し（特に合併画像）、「ＨＬＭＣ－ＳＮ－ＫＤ」では蛍光が観察されない）。これによってＳＮＯＲＡ２３シグナルの特異性が確認された。
　（実施例２：ＰＤＡＣ患者におけるＳＮＯＲＡ２３過剰発現の検出および無病生存率との逆相関）
（ａ）ＰＤＡＣ罹患患者（ｎ＝１５０）（その中に、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ；ｎ＝１６）および粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ；ｎ＝１）に関連した浸潤癌を含む）から外科的に切除した臨床検体中のＳＮＯＲＡ２３発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。比較のために、正常な肝臓組織（ｎ＝３）および膵臓組織（ｎ＝８）におけるＳＮＯＲＡ２３発現もまた調べた。
　図２ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析によるＰＤＡＣ（ｎ＝１５０；ＩＭＰＮ／ＭＣＮ関連癌を含む）ならびに正常な肝臓組織（ｎ＝３）および膵臓組織（ｎ＝８）におけるＳＮＯＲＡ２３の相対的発現についての箱ひげ図（ボックスプロット）である。箱の中央の横線は中央値を示し、ひげ（箱の上下の短い横線）は範囲を示す（Ｐ＜０．００１，マン・ホイットニーＵ検定）。
　ＳＮＯＲＡ２３発現の強さは、ＰＤＡＣ組織において正常な膵臓組織および肝臓組織よりも有意に高かった（０．５３±０．４３（ＰＤＡＣ組織）対０．０４３±０．０１６（正常膵臓組織）および０．０５５±０．０１５（正常肝臓組織）、それぞれＰ＜０．００１およびＰ＝０．００４）。共通型のＰＤＡＣにおけるＳＮＯＲＡ２３のレベル（ｎ＝１３３（ＩＭＰＮ／ＭＣＮ関連癌を除いたもの），０．５２±０．３９）は、ＩＰＭＮ／ＭＣＮ関連癌のＰＤＡＣ（ｎ＝１７，０．５３±０．７３）と有意差はなかった（Ｐ＝０．１２）。
（ｂ）ＰＤＡＣ患者を、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析で決定した０．４５のカットオフ値によって、ＳＮＯＲＡ２３高発現（ｎ＝７６）またはＳＮＯＲＡ２３低発現（ｎ＝７４）のいずれかの群に振り分けた。
　ＳＮＯＲＡ２３発現の強さは、化学療法歴との相関は有意であったが、性別、齢、ＣＥＡ／ＣＡ１９－９腫瘍マーカー、腫瘍の大きさ、またはＴＮＭ（腫瘍進行度分類）およびＵＩＣＣ（国際対がん連合）の病期の臨床パラメーターとは有意に関連するものでなかった（Ｐ＝０．０３６）。病理学的パラメーターに関しては、ＳＮＯＲＡ２３発現の強さは、血管浸潤（Ｐ＝０．０１５）およびＩＰＭＮ／ＭＣＮ（Ｐ＝０．０２１）と有意に関連した。逆に、リンパ管浸潤と境界的には関連したことを除いて、ＳＮＯＲＡ２３発現のレベルと組織構造および神経または神経叢浸潤との間で相関はなかった（Ｐ＝０．０７３）。
　図２ｂは、カプラン・メイヤー法に従って作成した、ＳＮＯＲＡ２３高発現および低発現の各ＰＤＡＣ患者群について、無病生存率（ＤＦＳ）および全生存率（ＯＳ）のそれぞれの生存曲線を示す。無病生存率（ＤＦＳ）は、ＳＮＯＲＡ２３高発現のＰＤＡＣ患者において低発現の患者よりも有意に短かった（Ｐ＝０．０２１８）（生存期間の中央値：８．２ケ月（高発現）に対し１１．２ケ月（低発現）；５年生存率：１０．９％（高発現）に対し２９．２％（低発現））。他方、全生存率（ＯＳ）は２群間に有意差はなかった（Ｐ＝０．６６６；生存期間の中央値：１９．１ケ月（高発現）に対し２６．３ケ月（低発現）；５年生存率：２８．０％（高発現）に対し３７．２％（低発現））。
　（実施例３：ＳＮＯＲＡ２３アンチセンスオリゴヌクレオドの設計およびＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによるＲＮＡ発現の検討）
　ＳＮＯＲＡ２３サイレンシングのために、表１に示すようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の配列を設計した。ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）および＃２（配列番号６）は、ＡｍＮＡを両末端領域に含むギャップマーオリゴヌクレオチド（３－８－３－１）である。コントロール（配列番号２０）として、ＬＮＡを両末端領域に含むギャップマーオリゴヌクレオチド（３－８－３－１）を用いた。
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　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）およびＡＳＯ＃２（配列番号６）は、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の５’末端部位から１９番目～３３番目の領域および１５１番目～１６５番目の領域をそれぞれ標的とするように設計した。配列番号５および配列番号６の各塩基配列は５’から３’方向（５’→３’）で表したものであり、配列番号１中の各標的領域配列に対する逆相補配列である。コントロールＡＳＯの配列（配列番号２０）は、哺乳類動物細胞のｍＲＮＡとの相同性がないホタルルシフェラーゼ遺伝子塩基配列に結合し、哺乳類動物細胞の遺伝子発現を変化させないように設計した。
　ｑＲＴ－ＰＣＲ解析により、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）およびＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃２（配列番号６）に関して、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞の双方ともにこれらのいずれか一方を用いてトランスフェクトした場合のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現を検証した。
　図３は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃１」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃２（配列番号６）でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃２」）、コントロールＡＳＯ（配列番号２０）でのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のｑＲＴ－ＰＣＲ解析によるＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。ＲＮＡ発現量は、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）の発現量を１とした相対値で表した。
　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）およびＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃２（配列番号６）の両方とも、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞におけるＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現の抑制を示した。
　（実施例４：ＰＤＡＣにおける浸潤性へのＳＮＯＲＡ２３の関与）
　Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、（ａ）それらのＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）とその親細胞（「ＷＴ」）：（ｂ）それらのＨＬＭＣ細胞のＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯ（＃１（配列番号５））でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）（比較のためにコントロールＡＳＯ（配列番号２０）でトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））後の細胞；ならびに（ｃ）それらの親細胞のＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）（比較のためにモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」））後の細胞を、ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイに供した。
　図４ａは、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２について、ＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）および親細胞（「ＷＴ」）のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。スケールバー：１００μｍ。画像では、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２ともに、「ＷＴ」よりも「ＨＬＭＣ」で、より多くの浸潤細胞が観察されたことが示される。
　浸潤細胞数は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣにおいてそれらの親細胞株と比較して有意に増大した（共にＰ＜０．０００１）。
　図４ｂは、ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のいずれかから４８時間後のＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。スケールバー：１００μｍ。画像では、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣともに、「Ｃｔｒｌ」では多くの浸潤細胞が見られたのに対し、「ＳＮＯＲＡ２３－ＫＤ」では減少した数の浸潤細胞が観察されたことが示される。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌに浸潤した細胞の数は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）に比較して、ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクションにより生じたＳＮＯＲＡ２３ノックダウン（「ＳＮ－ＫＤ」）によって有意に減少した（共にＰ＝０．０００２）。
　図４ｃは、ＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）およびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」）のいずれかから７２時間後のＳｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。スケールバー：１００μｍ。画像では、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２ともに、「Ｍｏｃｋ」に比較して「ＳＮＯＲＡ２３－ＯＥ」でより多くの数の浸潤細胞が観察されたことが示される。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌに浸潤した細胞の数は、ＳＮＯＲＡ２３を過剰発現するＳｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞（「ＳＮ－ＯＥ」）において、モックｐＤＮＡトランスフェクトした細胞（「Ｍｏｃｋ」）と比較して有意に増加した（共にＰ＜０．０００１）。
　（実施例５：ＰＤＡＣにおける足場依存性生存へのＳＮＯＲＡ２３の関与）
　本実施例では、上記実施例４の（ａ）～（ｃ）の各細胞を、足場依存性細胞増殖（ＣＣＫ－８使用のアッセイ）および足場非依存性細胞増殖（軟寒天コロニー形成アッセイ）について評価した。
（ａ，ｂ）Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）とその親細胞（「ＷＴ」）。
　図５ａは、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」：四角）とその親細胞（「ＷＴ」：菱形）についての、足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖の経時変化を示すグラフである。この結果、足場依存性増殖では、Ｓｕｉｔ２－　ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞とそれらの親細胞との間で差はなかった。
　図５ｂは、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＨＬＭＣ細胞（「ＨＬＭＣ」）とその親細胞（「ＷＴ」）についての軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像と、形成されたコロニー数を示すグラフとを示す。画像では、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２ともに、「ＨＬＭＣ」は「ＷＴ」に比較してより多くの数のコロニーを形成したことが示される。
　コロニーの数は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　Ｐａｃａ２－ＨＬＭＣ細胞において、それらの親細胞株よりも有意に増大した（Ｐ＝０．０００５（Ｓｕｉｔ２）、Ｐ＝０．０２８（ＭＩＡ　Ｐａｃａ２））。
（ｃ，ｄ）Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯ（＃１（配列番号５））でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯ（配列番号２０）でのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）。
　図５ｃは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣにつき、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」：四角）とコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」：菱形）についての、足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖の経時変化を示すグラフである。図５ｃ中、＊＊Ｐ＜０．０１，＋Ｐ＜０．００１。
　足場依存性増殖は、ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンで処理したＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞でコントロールと比較して有意に抑制されたが、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞では差は明確には見られなかった。
　図５ｄは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣにつき、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）とコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）についての、軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像と、形成されたコロニー数を示すグラフとを示す。画像では、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣともに、「ＳＮ－ＫＤ」において、「Ｃｔｒｌ」に比較して減少したコロニーを形成したことが示され、特にＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣは、「ＳＮ－ＫＤ」による顕著なコロニー数減少が観察された。
　コロニーの数は、ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンを行ったＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、コントロールよりも有意に減少した（Ｐ＝０．００１７）。ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンを行ったＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞でも有意差はないものの軽度の減少は見られた。
（ｅ，ｆ，ｇ）Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）およびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」または「Ｍｏｃｋ」）。
　図５ｅは、Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」：四角）とモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」：菱形）についての、足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖の経時変化を示すグラフである。
　足場依存性増殖は、ＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでトランスフェクトしたＳｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞において、モックコントロールと比較して有意に抑制された。＊Ｐ＜０．０１。
　図５ｆは、Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）とモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」）についての軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像およびその拡大画像を示す。図５ｇは、Ｓｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２につき、それらのＳＮＯＲＡ２３　ｐＤＮＡでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＯＥ」）とモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｍｏｃｋ」）についての全コロニーの数および大コロニー（１ｍｍを超える直径を有する）の数を示すグラフを示す。
　画像では、Ｓｕｉｔ２およびＭＩＡ　ＰａＣａ２ともに、「Ｍｏｃｋ」に比較して「ＳＮＯＲＡ２３－ＯＥ」でより多くの数のコロニー形成が観察されたことが示される（図５ｆ）。コロニー総数（全コロニーの数）は、ＳＮＯＲＡ２３過剰発現（「ＳＮ－ＯＥ」）のＳｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞でモックコントロールよりも有意に減少した（共にｐ＜０．０００１）。大コロニーの数は、ＳＮＯＲＡ２３過剰発現（「ＳＮ－ＯＥ」）のＳｕｉｔ２細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞で、モックコントロールよりも有意に増大した（共にｐ＜０．０００１）。
　（実施例６：Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のスフェロイド形成に対するＳＮＯＲＡ２３ノックダウンの効果）
　Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、（ａ）ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）でのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＫＤ」）（比較のためにコントロールＡＳＯ（配列番号２０）でトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））、および（ｂ）ロイシンリッチ反復含有Ｇプロテイン結合レセプター５（ＬＧＲ５）ｓｉＲＮＡ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ｓｉＲＮＡ　ＩＤ：ｓ１６２７５）でのトランスフェクション（「ＬＧＲ５－ＫＤ」）（比較のためにコントロールｓｉＲＮＡ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ネガティブコントロール＃１）でのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のそれぞれを行った場合の足場非依存性生存能を、スフェロイド形成アッセイによって調べた。ＬＧＲ５はＰＤＡＣのstemnessマーカーとして考えられており、比較のために本実施例で使用した。トランスフェクションに用いたＡＳＯおよびｓｉＲＮＡは、最終濃度２０ｎＭであった。
　図６は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、（ａ）ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（ＳＮＯＲＡ－ＫＤ：四角）およびコントロールＡＳＯのトランスフェクション（Ｃｔｒｌ：菱形）ならびに（ｂ）ＬＧＲ５　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（ＬＧＲ５－ＫＤ：四角）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（Ｃｔｒｌ：菱形）についての、１日目（Ｄ１）～４日目（Ｄ４）におけるスフェロイド形成変動を示すグラフである。スフェロイド形成値は、１日目（Ｄ１）の量を１とした相対値で表した。図６中、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
　図６に示されるように、スフェロイド形成は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、ＳＮＯＲＡ２３のノックダウンにより有意に抑制された。この抑制レベルは、ＬＧＲ５ノックダウンによる抑制レベルより大きかった。
　（実施例７：ＳＮＯＲＡ２３ターゲティングＡＳＯ処理後の腫瘍組織におけるＳＮＯＲＡ２３発現の阻害）
　エクスビボにてＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）を導入したＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞を、ヌードマウスの側腹部に移植し、一週間後、移植後のマウスにＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）またはコントロールＡＳＯ（配列番号２０）の溶液（１０ｍｇ／ｋｇ　ＢＷ）を２週間にわたり週に一度皮下注射した。マウスから腫瘍組織を切除して取り出し、種々の時点でのＳＮＯＲＡ２３発現についてｑＲＴ－ＰＣＲ解析に供した。
　図７は、ＡＳＯ移植前（「ＡＳＯ（－）」）、ＡＳＯエクスビボ移植（「ＡＳＯ（＋）エクスビボ」）を行った１週目（「１週」）および２週目（「２週」）、ならびにさらに皮下注射（「エクスビボ＋皮下注射」）を行ってから２週目（「２週」）および３週目（「３週」）の腫瘍組織におけるＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現量を示すグラフである。ＳＮＯＲＡ２３ ＲＮＡ発現量は、ＡＳＯ移植前（ＡＳＯ（－））を１とした相対的発現量で表した。図７中、＊Ｐ＜０．０５（各々においてｎ＝３）。
　図７に示されるように、ＡＳＯエクスビボ移植を行った１週目と、さらに皮下注射を行ってから２週目および３週目で、ＡＳＯ移植前よりも腫瘍組織におけるＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現量が有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。
　（実施例８：ＳＮＯＲＡ２３ターゲティングＡＳＯによるマウスのＰＤＡＣの播種および肝転移の抑制）
　Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）またはコントロールＡＳＯ（配列番号２０）でトランスフェクトした細胞を脾臓の被膜下領域に移植したヌードマウスに、同じＡＳＯを追加して皮下投与した。このようなＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１をエクスビボ移植後に皮下投与したマウスを「ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウス」、コントロールＡＳＯをエクスビボ移植後に皮下投与したマウスを「コントロールマウス」ともいう。
（ａ）次いでイソフルラン麻酔下でＤ－ルシフェリンをマウスに皮下注射した後、IVIS Imaging Systemを用いてマウス全身の生物発光シグナル（ルシフェラーゼ活性）を測定した。
　図８ａは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウス（「ＳＮ－ＫＤ」：四角）と、コントロールマウス（「Ｃｔｒｌ」：菱形）とについての、ＩＶＩＳ画像化により測定したマウス全身のルシフェラーゼシグナル量の経日変化を示すグラフおよびシグナル分布を示す代表的な画像である。ルシフェラーゼシグナル量は、ＩＶＩＳ画像化の測定開始日を１とした場合の相対値にて表した。図８ａ中、＊Ｐ＜０．０５。画像は、測定２８日目のマウス全身のシグナル分布であり、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウス（「ＳＮ－ＫＤ」）が、コントロールマウス（「Ｃｔｒｌ」）よりもルシフェラーゼシグナルの活性が軽減されたことが示される。
　図８ａに示されるように、ＩＶＩＳ画像化により評価された腫瘍体積増大（ルシフェラーゼ活性増加）は、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１でのエクスビボのトランスフェクションで処理したＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞で、その後の３週間のＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１の毎週の皮下投与によって有意に抑制された（２８日目にて、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣに関して、２６倍（ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ）対７４５倍（コントロールＡＳＯ）、Ｐ＝０．０１８６；ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣに関して、１１９倍（ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ）対８９５倍（コントロールＡＳＯ）、Ｐ＝０．０２４）。
（ｂ）マウス全身の生物発光シグナル測定後、マウスを安楽死させて腫瘍組織試料を採取し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色に供し、腫瘍浸潤の状態を調べた。
　図８ｂは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウス（「ＳＮ－ＫＤ」）と、コントロールマウス（「Ｃｔｒｌ」）とからそれぞれ採取した腫瘍組織のマトキシリンおよびエオシン染色後の試料の位相差顕微鏡写真および拡大写真である。この位相差顕微鏡写真中のスケールバーは５００μｍ（二重線）、拡大写真中のスケールバーは１００μｍ（一重線）を表す。
　ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞ともにコントロールマウスでは脾臓の外側にかなり浸潤したのに対し、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理したマウスでは腫瘍は脾臓内に被包されたことが観察された（図８ｂ）。さらに、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウスでは、いくらかの変性した癌細胞が観察された。
（ｃ）安楽死させたマウスから膵臓および肝臓を摘出し、この膵臓および肝臓をIVIS Imaging Systemを用いたルシフェラーゼ活性測定に供し、腫瘍の浸潤および肝転移のレベルを定量した。
　図８ｃは、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１で処理したマウス（ＳＮ－ＫＤ）と、コントロールマウス（Ｃｔｒｌ）とから切除した肝臓および膵臓のＩＶＩＳ画像化によるシグナル分布を示す代表的な画像および測定したルシフェラーゼシグナル量（フォトン／秒）を示すグラフである。画像では、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウス（「ＳＮ－ＫＤ」）が、コントロールマウス（「Ｃｔｒｌ」）と比べて、隣接する膵臓および離れた肝臓におけるルシフェラーゼシグナルの活性の減少がみられたことが示される。
　図８ｃに示されるように、ＩＶＩＳ画像化によって、隣接する膵臓および離れた肝臓ともに、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ腫瘍（ルシフェラーゼ活性）が、コントロールマウスと比較してＳＮＯＲＡ２３－ＡＳＯ処理マウスで抑制されたことが示された（膵臓浸潤度：１．４±２．２×１０９フォトン／秒（ＳＮＯＲＡ２３－ＡＳＯ）対３．４±１．６×１０９フォトン／秒（コントロール），ｎ＝５，Ｐ＝０．１３５；ならびに肝転移体積：１．４±２．６×１０８フォトン／秒（ＳＮＯＲＡ２３－ＡＳＯ）対１．３±１．０×１０９フォトン／秒（コントロール），ｎ＝５，Ｐ＝０．０３７）。したがって、ＳＮＯＲＡ２３－ＡＳＯ処理により、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ腫瘍の膵臓への播種および肝臓への転移が共に抑制されたことが分かった。
　（実施例９：ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンで処理したＰＤＡＣ細胞における遺伝子およびタンパク質発現のプロファイリング）
　ＳＮＯＲＡ２３の下流因子を同定するために、ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンを行った（ＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯ（ＡＳＯ＃１：配列番号５）でトランスフェクション）または行っていない（コントロールＡＳＯ（配列番号２０）でトランスフェクション）、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
　図９は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のｃＤＮＡマイクロアレイ解析のヒートマップ（Ａ）およびプロテオミクス解析のヒートマップ（Ｂ）を示す。
　ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンは１５遺伝子（Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞）および２２６遺伝子（ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞）の発現をダウンレギュレートし、そして１２遺伝子（Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞）および８７遺伝子（ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞）の発現を２倍以上アップレギュレートした。ｃＤＮＡマイクロアレイ解析のヒートマップにより、両細胞株において共通して１２遺伝子（ＳＮＯＲＡ２３、ＰＲＫＤＣ、ＢＵＢ１、ＰＵＰＮ１２，ＧＰＲ１２６、ＬＧＲ５、ＷＷＣ２、ＨＳ２ＳＴ１、ＺＣＣＨＣ１１、ＰＥＡＫ１、ＩＰＯ７、ＨＭＧＣＳ２）がダウンレギュレートされ、６種の遺伝子（ＣＤＫＮ１Ａ、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＦＡＭ２５Ｃ、ＡＧＯ２、ＭＹＯ１Ｂ）がアップレギュレートされたことが示された（図９のＡ）。プロテオミクス解析のヒートマップにより、両細胞株において共通して１２種のタンパク質（ＡＤＩＲＦ、ＳＡＲＴ１、ＣＡＰＺＢ、ＣＣＡＲ１、ＨＰＣＡＬ１、ＳＭＣＨＤ１、ＭＳＨ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＳＹＮＥ２、ＫＲＴ１、ＭＡＰ４、ＰＨＢ２）がダウンレギュレートされ、１０種のタンパク質（ＳＱＳＴＭ１、ＲＰＦ２、ＰＣＤＨ１１Ｘ、ＮＯＭＯ１、ＧＯＴ１、ＰＩＴＲＭ１、ＰＳＭＣ６、ＭＥＴＡＰ２、ＭＡＲＳ、ＧＦＰＴ１）がアップレギュレートされたことが示された（図９のＢ）
　遺伝子オントロジー解析では、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ、細胞周期、ＥＧＦ－ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢのシグナル伝達経路がＳＮＯＲＡ２３ノックダウンにより影響を受けた。このことは、ＳＮＯＲＡ２３と、ＰＤＡＣにおける生存、増殖および浸潤の細胞機能との間に相互作用があることを支持した。
　ＳＮＯＲＡ２３の下流因子候補を選択するために、スクリーニング目的で通常用いられるスペクトルカウント法およびラベルフリー定量法を用いてプロテオミクスデータを解析した。
　図１０は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞においてＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによりアップレギュレートされたタンパク質数およびダウンレギュレートされたタンパク質数について、スペクトルカウント法およびラベルフリー定量法を用いて調べた結果を示す模式図である。
　図１１は、ラベルフリー定量法を用いて分析したプロテオミクスデータに関して、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯでのトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）およびコントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のヒートマップを示す。
　スペクトルカウント法を用いたデータ解析によれば、ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによってダウンレギュレートされたタンパク質１２種およびアップレギュレートされたタンパク質１０種が、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞株の両方で見出された（図１０）。ラベルフリー定量法を用いたデータ解析によれば、両細胞株において、ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによりダウンレギュレートされたタンパク質が６種（ＳＹＮＥ２、ＰＲＤＸ５、ＭＡＲＣＳＫＬ１、ＳＴＡＵ１、ＤＩＳ３、ＳＧＣ）であり、アップレギュレートされたタンパク質が６種（ＧＩＴ１、ＷＤＲ４３、ＬＲＲＣＣ１、ＹＫＵ８０、ＰＣＤＨ１１Ｘ、ＳＦＲＳ１０）であった（図１０および図１１）。
　スペクトルカウント法およびラベルフリー定量法の両方とも、ＳＮＯＲＡ２３の下流タンパク質候補として、ＳＹＮＥ２／ｎｅｓｐｒｉｎ－２（「ＳＹＮＥ２」）およびprotocadherin 11 X-linkedタンパク質（「ＰＣＤＨ１１Ｘ」）を示す（図１０）。
　（実施例１０：ＳＮＯＲＡ２３調節ｍＲＮＡおよびタンパク質の検証）
　図９に列挙した遺伝子に関して、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、２つのＳＮＯＲＡ２３ＡＳＯ（ＡＳＯ＃１：配列番号５およびＡＳＯ＃２：配列番号６）を用いて、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによるｍＲＮＡ発現の変化を調べた。これらの因子のうち、ＳＹＮＥ２、ｉｍｐｏｒｔｉｎ－７（ＩＰＯ－７）、ＬＧＲ５、およびサイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ（ＣＤＫＮ１Ａ）（これらについてはｑＲＴ－ＰＣＲに下記のプライマー対を用いた）のｍＲＮＡ発現について、両ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ（ＡＳＯ＃１および＃２）のトランスフェクションにより検証した：
（ＳＹＮＥ２）
フォワード：
５’－ＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＡＴＴＣ－３’（配列番号２１）
リバース：
５’－ＣＣＡＴＡＧＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣ－３’（配列番号２２）
（ＩＰＯ７　＃１）
５’－ＣＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＡＡＡ－３’ （配列番号２３）
５’－ＴＴＧＣＴＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＴＧＣ－３’ （配列番号２４）
（ＩＰＯ７　＃２）
５’－ＧＴＧＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＡＴＧＡＡ－３’ （配列番号２５）
５’－ＡＴＧＴＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣ－３’ （配列番号２６）
（ＩＰＯ７　＃３）
５’－ＴＴＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧ－３’ （配列番号２７）
５’－ＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡ－３’ （配列番号２８）
（ＬＧＲ５）
５’－ＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣ－３’ （配列番号２９）
５’－ＴＴＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＴ－３’ （配列番号３０）
（ＣＤＫＮ１Ａ）
５’－ＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧ－３’ （配列番号３１）
５’－ＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴ－３’ （配列番号３２）
　次に、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞とそれらの親細胞との間のタンパク質発現レベルの差をウェスタンブロット解析により調べた。
　図１２は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらの親細胞（ＷＴ）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）でのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ　ＡＳＯ」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ　ＡＳＯ」）および未処理の場合のそれぞれを行った場合のＳＹＮＥ２のウェスタンブロット、ならびにタンパク質の相対的発現量を示すグラフである。図１２中、＊＊Ｐ＜０．０１（ＷＴに対して：ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５（コントロールＡＳＯに対して：ｎ＝４）。
　図１３は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、それらの親細胞（ＷＴ）および未処理（ＨＬＭＣ）の場合、ならびにＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃１」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃２（配列番号６）でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃２」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ　ＡＳＯ」）および未処理の場合のそれぞれを行った場合のＳＹＮＥ２のｍＲＮＡ相対的発現量を示すグラフである。図１３中、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（コントロールＡＳＯに対して：ｎ＝４）。
　ＳＹＮＥ２タンパク質の発現は、親細胞と比較してＨＬＭＣ型細胞で２倍にて有意に増大したが（図１２）、ｍＲＮＡ発現はタンパク質発現に応じて変化したわけではなかった（図１３）。ＳＮＯＲＡ２３ノックダウンによりＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞でＳＹＮＥ２発現がそれぞれ５０％および４０％減少し（図１２）、ｍＲＮＡ発現の抑制を伴った（図１３）。
　他方、ｃＤＮＡマイクロアレイによりスクリーニングした他の候補のＬＧＲ５、ＩＰＯ－７およびＣＤＫＮ１Ａ、ならびにプロテオミクス解析により同定したＰＣＤＨ１１Ｘに関しては、ＨＬＭＣ型細胞と親細胞との間でタンパク質発現の差が検出されなかった。
　（実施例１１：Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞の浸潤および足場非依存性増殖に対するＳＹＮＥ２発現の効果）
（Ａ）Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ｓｉＲＮＡ　ＩＤ：ｓ２３３２８）でのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）およびコントロールｓｉＲＮＡ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ネガティブコントロール＃１）でのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のそれぞれを行った場合を、ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイによって調べた。トランスフェクションに用いたｓｉＲＮＡは、最終濃度２０ｎＭであった。
　図１４Ａは、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のいずれかから４８時間後のＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。画像では、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣともに、「Ｃｔｒｌ－ｓｉＲＮＡ」では多くの浸潤細胞が見られたのに対し、「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」では減少した数の浸潤細胞が観察されたことが示される。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌに浸潤した細胞の数は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、コントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）に比較して、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）によって有意に減少した（図１４Ａ；共にＰ＜０．０１）。
（Ｂ）Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ（ＡＳＯ＃１：配列番号５）およびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋ＳＹＮＥ２－ｐＤＮＡ」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」）、ならびにコントロールＡＳＯ（配列番号２０）およびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」）のそれぞれを行った場合を、ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイによって調べた。トランスフェクションに用いたＡＳＯおよびｐＤＮＡは、それぞれ最終濃度２０ｎＭであった。
　図１４Ｂは、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋ＳＹＮＥ２－ｐＤＮＡ」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」）、ならびにコントロールＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」）のいずれかから４８時間後のＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞のｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイの代表的な画像と、浸潤細胞数を示すグラフとを示す。画像では、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣともに、「Ｃｔｒｌ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」では多くの浸潤細胞が見られるのに対し「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」では減少しており、さらに、「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋ＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡ」では「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋Ｍｏｃｋ」と比較して増加したことが示される。
　ＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡおよびＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯのトランスフェクションは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ単独と比較してそれぞれ３．５倍および７．１倍浸潤細胞数を増大した（Ｐ＝０．０１０９およびＰ＜０．０００１）。ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＮＯＲＡ－ＡＳＯ＋ＳＹＮＥ２－ｐＤＮＡ」）は、コントロールＡＳＯおよびモックｐＤＮＡプラスミドでのトランスフェクトコントロールに対しては、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞においてそれぞれ１３５．３％および１８．８％であった（図１４Ｂ）。
（Ｃ）Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のそれぞれを行った場合の足場非依存性細胞増殖能を、軟寒天コロニー形成アッセイにて評価した。トランスフェクションに用いたｓｉＲＮＡは、最終濃度２０ｎＭであった。
　図１４Ｃは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のそれぞれを行った場合の軟寒天コロニー形成アッセイの代表的な画像と、形成されたコロニー数を示すグラフとを示す。画像では、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣおよびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣともに、「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」は、「Ｃｔｒｌ－ｓｉＲＮＡ」で観察されたコロニーと比較して、減少した数のコロニーを形成したことが示される。
　Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　Ｐａｃａ２－ＨＬＭＣ細胞において、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ｓｉＲＮＡ」）が、コントロールの５３．４％および２．６％に軟寒天増殖コロニー数を有意に抑制した（Ｐ＝０．０１６４およびＰ＜０．０００１；図１４Ｃ）。
（Ｄ）Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ２－ＫＤ」）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」））のそれぞれを行った場合の足場非依存性細胞増殖能を、スフェロイド形成アッセイにて評価した。トランスフェクションに用いたｓｉＲＮＡは、最終濃度２０ｎＭであった。
　図１４Ｄは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（ＳＹＮＥ２－ＫＤ；四角）およびコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション（Ｃｔｒｌ：菱形）のそれぞれを行った場合についての、１日目（Ｄ１）～４日目（Ｄ４）におけるスフェロイド形成変動を示すグラフである。スフェロイド形成値は、１日目（Ｄ１）の量を１とした相対値で表した。図１４Ｄ中、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
　スフェロイド形成は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、ＳＹＮＥ２　ｓｉＲＮＡ（ＳＹＮＥ２ノックダウン）によりコントロールの約１４％および３０％に減少した（共にＰ＜０．００１（４日目）；図１４Ｄ）
（Ｅ）Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ（ＡＳＯ＃１：配列番号５）およびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ－ＯＥ＋ＳＮ－ＫＤ」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）、ならびにコントロールＡＳＯ（配列番号２０）およびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合の足場非依存性細胞増殖能を、スフェロイド形成アッセイにて評価した。トランスフェクションに用いたＡＳＯおよびｐＤＮＡは、それぞれ最終濃度２０ｎＭであった。
　図１４Ｅは、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびＳＹＮＥ２　ｐＤＮＡのトランスフェクション（「ＳＹＮＥ－ＯＥ＋ＳＮ－ＫＤ」）、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「ＳＮ－ＫＤ」）、ならびにコントロールＡＳＯおよびモックｐＤＮＡトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合についての、１日目（Ｄ１）～４日目（Ｄ４）におけるスフェロイド形成変動を示すグラフである。スフェロイド形成値は、１日目（Ｄ１）の量を１とした相対値で表した。図１４Ｅ中、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＋＜０．００１。
　スフェロイド形成は、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞において、ＳＹＮＥ２発現プラスミドおよびＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯを共にトランスフェクトした場合（「ＳＹＮＥ－ＯＥ＋ＳＮ－ＫＤ」）、ＳＮＯＲＡ２３ノックダウン（「ＳＮ－ＫＤ」）による抑制をコントロール（「Ｃｔｒｌ」）のレベルに完全に回復した（図１４Ｅ）。
　（実施例１１：追加のＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯによるＳＮＯＲＡ２３ノックダウンの検証）
　ＳＮＯＲＡ２３サイレンシングのために、下記の配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３を設計した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３（配列番号７）は、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の５’末端部位から１５３番目～１６７番目の領域を標的とするように設計した。配列番号７の塩基配列は５’から３’方向（５’→３’）で表したものであり、配列番号１中の各標的領域配列に対する逆相補配列である。コントロールとして、コントロールＡＳＯ（配列番号２０）でのトランスフェクションを用いた。
　ｑＲＴ－ＰＣＲ解析により、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３（配列番号７）に関して、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより入手）の各細胞株にトランスフェクトした場合のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現およびＳＹＮＥ２　ｍＲＮＡ発現を検証した。
　図１５は、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株について、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３でのトランスフェクション（「ＳＮ－ＡＳＯ＃３」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現（Ａ）およびＳＹＮＥ２　ｍＲＮＡ発現（Ｂ）を示すグラフである。ＲＮＡ発現量は、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）の発現量を１とした相対値で表した。図１５中、＊Ｐ＜０．０５。
　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３でトランスフェクトした場合、いずれの細胞株でも、ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ発現およびＳＹＮＥ２　ｍＲＮＡ発現ともに抑制が見られた。
　足場依存性細胞増殖アッセイおよびスフェロイド形成アッセイにて、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３に関して、ＣＡＰＡＮ－２細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株にトランスフェクトした場合の効果を検証した。
　図１６は、ＣＡＰＡＮ－２細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株につき、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３のトランスフェクション（×：「ＳＮ－ＡＳＯ＃３」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（菱形：「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合の足場依存性細胞増殖アッセイにおける細胞増殖（Ａ）およびスフェロイド形成（Ｂ）の経時変化を示すグラフである。図１６中、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。
　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３でトランスフェクトした場合、いずれの細胞株でも、コントロールに対して増殖の抑制およびスフェロイド形成の抑制が見られた。
　matrigel浸潤アッセイにて、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３に関して、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株にトランスフェクトした場合の効果を検証した。
　図１７は、ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞の各細胞株において、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３のトランスフェクション（（Ａ）「ＳＮＯＲＡ２３　＃１５３」または（Ｂ）「ＡＮ－ＡＳＯ＃３」）、コントロールＡＳＯでのトランスフェクション（「Ｃｔｒｌ」）のそれぞれを行った場合のトランスフェクションの４８時間後（ＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞およびＨｓ７６６Ｔ細胞）または７２時間後（Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞およびＳ２－０１３細胞）の細胞のmatrigel浸潤アッセイの代表的な画像（Ａ）および浸潤細胞数（Ｂ）を示すグラフである。画像では、Ｈｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞は、「Ｃｔｒｌ」で多くの浸潤細胞が見られたのに対し、「ＳＮＯＲＡ２３　＃１５３」では浸潤細胞がほとんど観察されず、そしてＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞およびＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞は、「Ｃｔｒｌ」で多くの浸潤細胞が見られたが、「ＳＮＯＲＡ２３　＃１５３」では減少した数の浸潤細胞が観察されるのみであったことが示される。
　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃３でトランスフェクトした場合、どの細胞株でも、コントロールに対して増殖の抑制およびスフェロイド形成の抑制が見られた。膵癌細胞株であるＨｓ７６６Ｔ細胞およびＳ２－０１３細胞では顕著に増殖およびスフェロイド形成の顕著な抑制が見られ、そして高転移性ＰＤＡＣ細胞であるＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞およびＳｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞でも有意な抑制効果が観察された。
　（実施例１２：ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯによる血中ＳＮＯＲＡ２３濃度の低下）
　Ｓｕｉｔ２－ＨＬＭＣ細胞またはＭＩＡ　ＰａＣａ２－ＨＬＭＣ細胞をヌードマウスの脾臓の被膜下領域に移植し、その翌日に、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１（配列番号５）またはコントロールＡＳＯ（配列番号２０）をマウスに１０ｍｇ／ｋｇ体重にて皮下投与し、次いで、初回投与の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に、週に１回さらに皮下投与した（各回１０ｍｇ／ｋｇ体重）。このようなＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ＃１を皮下投与したマウスを「ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウス」、コントロールＡＳＯを皮下投与したマウスを「コントロールマウス」ともいう。３回投与、４回投与または５回投与のマウスを最終投与から１週間後に屠殺し、よって、皮下投与を開始してから３週間後、４週間後または５週間後のマウスから、血液試料ならびに脾臓、膵臓および肝臓の腫瘍組織試料を採取した。採取した各試料から総ＲＮＡを、high pure RNA isolation kit（Roche Diagnostics GmbH）を用いて抽出した。
　ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスおよびコントロールマウスのそれぞれにつき、皮下投与を開始してから４週間後および５週間後における血液試料中のＳＮＯＲＡ２３およびＣＥＡの発現レベル、ならびに皮下投与を開始してから３週間後、４週間後および５週間後における脾臓、膵臓、肝臓の腫瘍組織試料中のＳＮＯＲＡ２３、ＳＹＮＥ２およびＣＥＡの発現レベルを、上述のプライマーセット（ＳＮＯＲＡ２３につき、配列番号１６および配列番号１７；ＳＹＮＥ２につき、配列番号２１および配列番号２２；ＣＥＡにつき、配列番号１８および配列番号１９）を用いて、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。
　図１８は、上記ｑＲＴ－ＰＣＲ測定結果を示す。図中「Ｃｔｒｌ」は「コントロールマウス」であり、「ＳＮ　ＫＤ」は「ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウス」であり、「３ｗ」、「４ｗ」および「５ｗ」はそれぞれ皮下投与を開始してから３週間後、４週間後および５週間後を表す。各結果毎に、左から順に３週間後、４週間後および５週間後の結果が示される（但し、血液試料中の結果については、左から順に４週間後および５週間後の結果が示される）。
　脾臓、膵臓および肝臓の腫瘍組織試料中のＳＮＯＲＡ２３、ＳＹＮＥ２およびＣＥＡの発現レベルの結果より、コントロールマウスでは、初期に脾臓に存在していた原発性腫瘍が、膵臓および肝臓に転移していることが示された。これに対し、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスでは、ＳＮＯＲＡ２３、ＳＹＮＥ２およびＣＥＡのいずれも、脾臓、膵臓および肝臓の腫瘍組織試料中の発現がコントロールマウスに比べて抑制された。ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスでは、ＳＮＯＲＡ２３、ＳＹＮＥ２およびＣＥＡのいずれも、肝臓での発現が見られず、転移が抑制されたことが示された。
　血液試料中（図中では「（血中）」）の発現レベルの結果から、ＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡについては、コントロールマウスで４ｗよりも５ｗで上昇していたのに対し、ＣＥＡ　ｍＲＮＡでは４ｗよりも５ｗで減少していた。いずれともＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ処理マウスでは、発現が見られなかった。
　さらに、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスおよびコントロールマウスのそれぞれにつき、皮下投与を開始してから３週間後、４週間後および５週間後における脾臓および肝臓の腫瘍組織を目視検査した。この結果を図１９に示す。図中「Ｃｔｒｌ」は「コントロールマウス」であり、「ＳＮ　ＫＤ」は「ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウス」であり、「３ｗ」、「４ｗ」および「５ｗ」はそれぞれ３週間後、４週間後および５週間後を表す。図１９においては、「Ｃｔｒｌ」では、脾臓および膵臓ともに、「３ｗ」、「４ｗ」および「５ｗ」と順次に（すなわち経時的に）腫瘍組織が増大しているのに対し、「ＳＮ　ＫＤ」では、このような腫瘍組織の増大が抑制されたことが示される。目視検査の結果からも、脾臓の原発性腫瘍の増大および肝臓への転移がコントロールマウスでは経時的に進行しているのに対し、ＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスでは、このような腫瘍の増大および転移が見られなかった。
　以上のように、脾臓、膵臓および肝臓の腫瘍の進行がＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスで抑制された。さらに、コントロールマウスの血液試料中のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ量が、このような腫瘍の進行と共に増大しており、このような腫瘍の増大および転移が見られなかったＳＮＯＲＡ２３　ＡＳＯ皮下投与マウスでは、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡ量はほとんど見られなかった。よって、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３　ＲＮＡは、腫瘍バイオマーカーとして用いられ得る。
　（実施例１３：膵癌患者におけるＳＮＯＲＡ２３発現レベルと膵癌患者の予後との相関）
　ＰＤＡＣ罹患患者（ｎ＝１３３：ＩＭＰＮ／ＭＣＮ関連癌を除く通常型膵癌）から外科的に切除した臨床検体（ＰＤＡＣ組織）中のＳＮＯＲＡ２３発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。
　ＰＤＡＣ患者を、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析で決定した０．１３５のカットオフ値によって、ＳＮＯＲＡ２３高発現（ｎ＝１１８）またはＳＮＯＲＡ２３低発現（ｎ＝１５）のいずれかの群に振り分けた。
　図２０は、カプラン・メイヤー法に従って作成した、ＳＮＯＲＡ２３高発現および低発現の各ＰＤＡＣ患者群について、無病生存率（ＤＦＳ）および全生存率（ＯＳ）のそれぞれの生存曲線を示す。無病生存率（ＤＦＳ）は、ＳＮＯＲＡ２３高発現のＰＤＡＣ患者において低発現の患者よりも有意に短かった（Ｐ＝０．０３７）。全生存率（ＯＳ）においても、ＳＮＯＲＡ２３高発現のＰＤＡＣ患者において低発現の患者よりも有意に短かった（Ｐ＝０．０３８）。
　本発明は、癌浸潤または転移を阻害し得る核酸に基づく治療薬の開発に寄与し得る。さらに、本発明は、難治癌を含む種々の癌の治療または予防のための医薬品の製造に有用となる。

Claims (15)

  1. 　ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤を含む、抗腫瘍剤。
  2. 　前記ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現抑制剤が、ＳＮＯＲＡ２３遺伝子と結合し得、かつ該ＳＮＯＲＡ２３遺伝子発現を抑制する活性を有する核酸分子を含む、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
  3. 　前記核酸分子が、配列番号１に示されるＳＮＯＲＡ２３遺伝子の塩基配列の一部である標的領域に相補的な配列でありかつ１２～２０塩基の長さであるオリゴヌクレオチド、またはその薬理学上許容される塩を含む、請求項２に記載の抗腫瘍剤。
  4. 　前記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩が、糖修飾部分を含む１個または２個以上のヌクレオチドを含む、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
  5. 　前記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩が、
    以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     を少なくとも１つ含み、
    　ここで、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ａは、以下：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される二価の基であり、
    　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
    　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
    　ｍは、０から２の整数であり；
    　ｎは、０から１の整数であり；
    　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基である、
    請求項３または４に記載の抗腫瘍剤。
  6. 　前記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される構造である、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
  7. 　前記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造が、前記式（Ｉ’）で表される構造であり、そして該式（Ｉ’）において、前記ｍが０であり、そして前記Ｒ１が、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である、請求項６に記載の抗腫瘍剤。
  8. 　前記オリゴヌクレオチドが、６～１０塩基のギャップ領域、３～５塩基の５’ウイングおよび３～５塩基の３’ウイングからなるギャップマーであり、
    　該ギャップ領域が、該５’ウイングと該３’ウイングの間に位置づけられ、そして
    　該５’ウイングおよび該３’ウイングが、前記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を含む、
    請求項５から７のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
  9. 　前記ＳＮＯＲＡ２３発現抑制剤がＳＹＮＥ２遺伝子発現を抑制する、請求項１から８のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
  10. 　ＳＹＮＥ２発現抑制剤を含む、抗腫瘍剤。
  11. 　前記ＳＹＮＥ２発現抑制剤が、ＳＹＮＥ２遺伝子と結合し得、かつ該ＳＹＮＥ２遺伝子発現を抑制する活性を有する核酸分子を含む、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
  12. 　浸潤性または転移能のある腫瘍に対して用いられる、請求項１から１１のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
  13. 　膵癌、肝癌、肺癌、卵巣癌または胃癌の処置に用いられる、請求項１から１１のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
  14. 　請求項１から１３のいずれかに記載の抗腫瘍剤を含有する医薬組成物。
  15. 　腫瘍の浸潤または転移を検出するため、血液試料中のＳＮＯＲＡ２３を測定することを特徴とする、ＳＮＯＲＡ２３のバイオマーカーとしての使用。
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