WO2022181807A1 - ＲＥＳＴ ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド - Google Patents

ＲＥＳＴ ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド Download PDF

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正仁 下條
聡 小比賀
啓士朗 三島
美紗 吉田
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国立大学法人大阪大学
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Definitions

  • the present invention provides an oligonucleotide that skips the N exon in pre-mRNA processing of the transcription repressor REST (RE1-silencing transcription factor), or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a pharmaceutical comprising the same. Regarding the composition.
  • SCLC small cell lung cancer
  • ASO antisense nucleic acid medicine
  • SRRM4 Serine/Arginine Repetitive Matrix 4
  • the transcriptional repressor REST In the pathology of SCLC, the transcriptional repressor REST, a tumor suppressor, is decreased and the REST isoform (sREST) is abnormally expressed. Splicing of the transcriptional repressor REST is activated by SRRM4. It has been reported that the transcriptional repressor REST is a master molecule of nervous system genes and a tumor suppressor.
  • SRRM4 antisense oligonucleotide suppresses SRRM4 and exhibits anti-tumor effects, while promoting alterations in the splicing of the tumor suppressor REST, and the resulting increase in REST expression is associated with cancer. thought to induce cell death. Furthermore, regarding sREST that is abnormally expressed in SCLC, it has been revealed that SCLC cell death can be induced by directly promoting a splicing change that causes REST to be expressed from sREST (non-patent document 1).
  • the present invention is intended to solve the above problems, and its object is to provide oligonucleotides or pharmacologically acceptable salts thereof capable of appropriately inducing skipping of the N exon of REST, and pharmaceuticals containing the same.
  • the object is to provide a composition.
  • the present invention provides an oligo containing a nucleotide sequence complementary to a continuous sequence of at least 12 bases in the target region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and inducing N exon skipping in processing of human REST pre-mRNA.
  • a nucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof is provided.
  • the length of the oligonucleotide is 12-35 bases.
  • the oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof has a nucleoside structure represented by the following formula (I):
  • Base is a purin-9-yl group optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group, or optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group 2 -oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, wherein the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon linear alkoxy group of number 1 to 6, mercapto group, mercapto group protected by protecting group for nucleic acid synthesis, linear alkylthio group of 1 to 6 carbon atoms, amino group, linear alkylamino group of 1 to 6 carbon atoms , an amino group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, and a halogen atom, A is:
  • R 1 is selected from a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, and the ⁇ group an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a heteroatom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12 carbon atoms which may optionally contain a heteroatom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom; optionally substituted with an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom, and optionally branched or forming a ring; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms; or an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon
  • R 17 , R 18 and R 19 each independently form a hydrogen atom, a branch or a ring an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an amino group-protecting group, or
  • R 13 and R 14 each independently represents a hydrogen atom; a hydroxyl group; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may be branched or forming a ring; A group selected from the group consisting of an alkoxy group of 7; an amino group; and an amino group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis; m is an integer from 0 to 2; n is an integer from 0 to 1; R 10 is a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an amino-protecting group, or
  • the linkages between nucleotides that make up the oligonucleotide contain phosphorothioate.
  • the base sequence of the above oligonucleotide comprises any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3-11 and SEQ ID NOs: 40-49.
  • nucleoside structure represented by formula (I) above is
  • the present invention is further a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition is a cancer therapeutic.
  • the cancer therapeutic agent is used to treat at least one cancer selected from the group consisting of small cell lung cancer, prostate cancer and breast cancer.
  • the pharmaceutical composition is a therapeutic agent for heart failure.
  • the present invention further provides a method for treating cancer or heart failure in a mammal, which comprises administering to the mammal an effective amount of the oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the present invention is further the above oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof for use in treating cancer or heart failure.
  • the present invention is further the oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof for the production of a therapeutic drug for cancer or heart failure.
  • N exon skipping can be induced in the processing of REST pre-mRNA.
  • it can exhibit anti-tumor effects in vivo. This will be useful for the development of pharmaceutical compositions for the treatment or prevention of diseases involving REST processing (splicing) (for example, cancer such as small cell lung cancer, or heart failure).
  • FIG. 2 is a graph showing the expression ratio of sREST to REST (sREST/REST) when added to SCLC cells in primary screening for various antisense oligonucleotides.
  • FIG. 2 is a graph showing the expression ratio of sREST to REST (sREST/REST) for various antisense oligonucleotides when added to prostate cancer cells.
  • A is a photograph of the results of RT-PCR showing altered splicing (N exon skipping) by an oligonucleotide (SSO) targeting REST
  • B is a graph showing the results of evaluation of cell viability.
  • FIG. 10 is a graph showing that N exon skipping of REST-targeting oligonucleotides (SSO) is concentration dependent.
  • FIG. 2 shows the positional relationship of REST-targeting oligonucleotides (SSO) in REST pre-mRNA (upper panel) and the concentration dependence of N exon skipping of SSO (lower panel).
  • the base sequence in the figure is shown as SEQ ID NO:50.
  • REST-targeting oligonucleotides (specifically, AmNA[+23/+40] (hereinafter sometimes referred to as AmNA_2340) and AmNA[+27/+44] (hereinafter referred to as AmNA_2744) ) in REST pre-mRNA (upper diagram), and a graph (lower diagram) showing the concentration dependence of N exon skipping of SSO.
  • SSO SSO
  • AmNA_2340 AmNA[+27/+44]
  • AmNA_2744 AmNA[+27/+44]
  • the base sequence in the figure is SEQ ID NO: 51. show.
  • NCs that do not change splicing are preferable, we decided to use NCs whose relative exon skipping activity is closest to 1 (NC3) as NCs in the future.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of quantifying relative exon skipping activity from the photographs of FIG. 10.
  • the results of SSO analysis are summarized based on FIGS. 8, 10 and 11.
  • Photographs of RT-PCR results showing the positional relationship of REST-targeting oligonucleotides (SSO) in REST pre-mRNA (upper diagram), and changes in splicing (N exon skipping) due to SSO, and relative comparisons from the photographs. It is a graph (lower figure) of the results of quantification of exon skipping activity.
  • FIG. 2 shows the positional relationship of REST-targeting oligonucleotides (SSO) in REST pre-mRNA (top), and a graph of the results of quantifying relative SRRM4 expression levels by SSO (bottom).
  • alkyl group having 1 to 3 carbon atoms includes any alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group.
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms includes any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group and n-hexyl group.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples include methyloxy group, ethyloxy group, n-propyloxy group and the like.
  • a straight or branched chain alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having any straight or branched chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples include methyloxy group, ethyloxy group, n-propyloxy group, isopropyloxy group, n-butyloxy group, isobutyloxy group, tert-butyloxy group, n-pentyloxy group and isopentyloxy group.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group and an n-propylthio group.
  • a straight or branched chain alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having any straight or branched chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples include methylthio, ethylthio, n-propylthio, isopropylthio, n-butylthio, isobutylthio, tert-butylthio, n-pentylthio and isopentylthio groups.
  • cyanoalkoxy group having 1 to 6 carbon atoms refers to a group in which at least one hydrogen atom constituting the linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is substituted with a cyano group.
  • linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms refers to a group in which one or two hydrogen atoms constituting an amino group are substituted with a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. encompasses Examples thereof include methylamino group, dimethylamino group, ethylamino group, methylethylamino group and diethylamino group.
  • linear or branched chain alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms means that one or two of the hydrogen atoms constituting the amino group are any linear or branched chain having 1 to 6 carbon atoms. Includes groups substituted with chain alkyl groups.
  • Examples include methylamino group, dimethylamino group, ethylamino group, methylethylamino group, diethylamino group, n-propylamino group, di-n-propylamino group, isopropylamino group and diisopropylamino group.
  • any straight chain alkyl group having 1 to 7 carbon atoms includes methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, and n-heptyl groups.
  • Optional branched alkyl groups having 3 to 7 carbon atoms include isopropyl group, isobutyl group, tert-butyl group, isopentyl group and the like, and optional cyclic alkyl groups having 3 to 7 carbon atoms are A cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group and the like can be mentioned.
  • alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms means any linear alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, any branched alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms, Chain alkenyl groups and any cyclic alkenyl groups having 3 to 7 carbon atoms are included. It may simply be referred to as a "lower alkenyl group”.
  • any linear alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms includes ethenyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 1-pentenyl group, 2-pentenyl group, 3-pentenyl group, 4-pentenyl group, 1-hexenyl group and the like
  • arbitrary branched alkenyl groups having 3 to 7 carbon atoms include isopropenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl -2-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-butenyl group and the like
  • any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms includes a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • any linear alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms includes methoxy, ethoxy, n-propoxy, n-butyroxy, n-pentyloxy, n-hexyloxy, and n-heptyloxy groups.
  • any branched chain alkoxy group having 3 to 7 carbon atoms includes isopropoxy group, isobutyloxy group, tert-butyloxy group, isopentyloxy group and the like, and any cyclic group having 3 to 7 carbon atoms.
  • Alkoxy groups include a cyclobutyloxy group, a cyclopentyloxy group, a cyclohexyloxy group, and the like.
  • an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom refers to any aryl group having 6 to 12 carbon atoms, which is composed only of hydrocarbons, and Any heteroaryl group having 3 to 12 carbon atoms in which at least one carbon atom constituting the ring structure is replaced with a heteroatom (e.g., nitrogen atom, oxygen atom, sulfur atom, and combinations thereof) do.
  • a heteroatom e.g., nitrogen atom, oxygen atom, sulfur atom, and combinations thereof
  • the aryl group having 6 to 12 carbon atoms includes phenyl group, naphthyl group, indenyl group, azulenyl group and the like, and the arbitrary heteroaryl group having 3 to 12 carbon atoms includes pyridyl group, pyrrolyl group, quinolyl group, indolyl group, imidazolyl group, furyl group, thienyl group and the like.
  • aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom examples include a benzyl group, a phenethyl group, a naphthylmethyl group, a 3-phenylpropyl group, 2 -phenylpropyl group, 4-phenylbutyl group, 2-phenylbutyl group, pyridylmethyl group, indolylmethyl group, furylmethyl group, thienylmethyl group, pyrrolylmethyl group, 2-pyridylethyl group, 1-pyridylethyl group, 3 -thienylpropyl group and the like.
  • acyl group examples include aliphatic acyl groups and aromatic acyl groups.
  • examples of aliphatic acyl groups include formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pentanoyl, pivaloyl, valeryl, isovaleryl, octanoyl, nonanoyl, decanoyl, 3-methylnonanoyl group, 8-methylnonanoyl group, 3-ethyloctanoyl group, 3,7-dimethyloctanoyl group, undecanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, tetradecanoyl group, pentadecanoyl group, hexadecanoyl group, 1-methylpentadecanoyl group, 14-methylpentadecanoyl group, 13,13-dimethyltetradecanoyl group,
  • aromatic acyl groups include arylcarbonyl groups such as benzoyl group, ⁇ -naphthoyl group and ⁇ -naphthoyl group; 2-bromobenzoyl group and halogenoarylcarbonyl group such as 4-chlorobenzoyl group; , 4,6-trimethylbenzoyl group, lower alkylated arylcarbonyl group such as 4-toluoyl group; lower alkoxylated arylcarbonyl group such as 4-anisoyl group; 2-carboxybenzoyl group, 3-carboxybenzoyl group, 4 -carboxylated arylcarbonyl group such as carboxybenzoyl group; nitrated arylcarbonyl group such as 4-nitrobenzoyl group and 2-nitrobenzoyl group; lower alkoxycarbonylated arylcarbonyl group such as 2-(methoxycarbonyl)benzoyl group group; an arylated aryl group
  • sil group examples include a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, an isopropyldimethylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, a methyldiisopropylsilyl group, a methyldi-t-butylsilyl group, and a triisopropylsilyl group.
  • tri-lower alkylsilyl groups such as; tri-lower alkylsilyl groups substituted with 1 to 2 aryl groups such as diphenylmethylsilyl group, butyldiphenylbutylsilyl group, diphenylisopropylsilyl group and phenyldiisopropylsilyl group; mentioned.
  • Trimethylsilyl group, triethylsilyl group, triisopropylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group and t-butyldiphenylsilyl group are preferred, and trimethylsilyl group is more preferred.
  • halogen atom includes, for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • a fluorine atom or a chlorine atom is preferred.
  • halide ion includes, for example, fluoride ion, chloride ion, bromide ion, or iodide ion. Fluoride ions or chloride ions are preferred.
  • protecting group for amino group for nucleic acid synthesis As used herein, the terms “protecting group for amino group for nucleic acid synthesis”, “protecting group for hydroxyl group for nucleic acid synthesis”, “hydroxyl group protected by protecting group for nucleic acid synthesis”, “protecting group for nucleic acid synthesis”
  • the “protecting group” of "phosphate group” and “mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis” is a group capable of stably protecting an amino group, hydroxyl group, phosphoric acid group or mercapto group during nucleic acid synthesis. If so, it is not particularly limited. Specifically, it refers to protective groups that are stable under acidic or neutral conditions and cleavable by chemical methods such as hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, and photolysis.
  • Such protecting groups include, for example, lower alkyl groups, lower alkenyl groups, acyl groups, tetrahydropyranyl or tetrahydrothiopyranyl groups, tetrahydrofuranyl or tetrahydrothiofuranyl groups, silyl groups, lower alkoxymethyl groups, lower alkoxy lower alkoxymethyl group, halogeno lower alkoxymethyl group, lower alkoxylated ethyl group, halogenated ethyl group, methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups, "lower alkyl group, lower alkoxy group, halogen atom or cyano A methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups substituted on an aryl ring with a group", a lower alkoxycarbonyl group, an "aryl group substituted with a halogen atom, a lower alkoxy group or a nitro group", a "halogen atom or A lower alkoxycarbonyl group substitute
  • the tetrahydropyranyl group or tetrahydrothiopyranyl group includes a tetrahydropyran-2-yl group, a 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, a 4-methoxytetrahydropyran-4-yl group and a tetrahydropyranyl group.
  • a tetrahydrofuranyl group or a tetrahydrothiofuranyl group includes a tetrahydrofuran-2-yl group and a tetrahydrothiofuran-2-yl group.
  • the lower alkoxymethyl group includes methoxymethyl group, 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl group, ethoxymethyl group, propoxymethyl group, isopropoxymethyl group, butoxymethyl group, t-butoxymethyl group and the like.
  • Lower alkoxylated lower alkoxymethyl groups include 2-methoxyethoxymethyl groups and the like.
  • Halogeno lower alkoxymethyl groups include 2,2,2-trichloroethoxymethyl groups and bis(2-chloroethoxy)methyl groups.
  • the lower alkoxylated ethyl group includes 1-ethoxyethyl group, 1-(isopropoxy)ethyl group and the like. Examples of halogenated ethyl groups include 2,2,2-trichloroethyl groups.
  • the methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups includes a benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, ⁇ -naphthyldiphenylmethyl group, 9-an thrylmethyl group and the like.
  • a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups whose aryl ring is substituted with a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a halogen atom or a cyano group includes a 4-methylbenzyl group, a 2,4,6- trimethylbenzyl group, 3,4,5-trimethylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group, 2-nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group , 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 4-cyanobenzyl group and the like.
  • lower alkoxycarbonyl groups include methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl and isobutoxycarbonyl groups.
  • the "aryl group substituted with a halogen atom, a lower alkoxy group or a nitro group” includes a 4-chlorophenyl group, a 2-fluorophenyl group, a 4-methoxyphenyl group, a 4-nitrophenyl group and a 2,4-dinitrophenyl group. etc.
  • lower alkoxycarbonyl group substituted with a halogen atom or a tri-lower alkylsilyl group includes a 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group and a 2-trimethylsilylethoxycarbonyl group.
  • alkenyloxycarbonyl groups include vinyloxycarbonyl groups and aryloxycarbonyl groups.
  • the "aralkyloxycarbonyl group optionally substituted on the aryl ring with a lower alkoxy or nitro group” includes a benzyloxycarbonyl group, a 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, a 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl group, a 2-nitro benzyloxycarbonyl group, 4-nitrobenzyloxycarbonyl group and the like.
  • Examples of the "lower alkoxycarbonyl group substituted with a cyano group” include a cyanoethoxycarbonyl group and the like.
  • the "benzenesulfonyl group substituted with 1 to 4 nitro groups” includes a 2-nitrobenzenesulfonyl group, a 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group and the like.
  • the "hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis” preferably includes an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups, "lower alkyl, lower alkoxy, halogen, cyano a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups in which the aryl ring is substituted with a group, or a silyl group, more preferably an acetyl group, a benzoyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzoyl group, a dimethoxy trityl group, monomethoxytrityl group or tert-butyldiphenylsilyl group.
  • the protecting group for the "hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, a "methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups", a "halogen an aryl group substituted with an atom, a lower alkoxy group or a nitro group, a lower alkyl group or a lower alkenyl group, more preferably a benzoyl group, a benzyl group, a 2-chlorophenyl group, a 4-chlorophenyl group or a 2- It is a propenyl group.
  • the “amino group-protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably an acyl group, more preferably a benzoyl group.
  • the "protecting group” of the "phosphate group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a cyano group, an aralkyl group, a "nitro group or a halogen atom an aralkyl group substituted with an aryl ring” or an "aryl group substituted with a lower alkyl group, a halogen atom, or a nitro group", more preferably a 2-cyanoethyl group or a 2,2,2-trichloroethyl group , benzyl group, 2-chlorophenyl group or 4-chlorophenyl group.
  • protecting groups constituting "a phosphate group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis".
  • the "protecting group” of the "mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis” is preferably an aliphatic acyl group or an aromatic acyl group, more preferably a benzoyl group.
  • the "amino group-protecting group" for the R 10 group includes an acetyl group, a tertiary butoxycarbonyl (Boc) group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, and the like.
  • —P(R 24 )R 25 [wherein R 24 and R 25 are each independently a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, a protecting group for nucleic acid synthesis A mercapto group, an amino group, a straight or branched chain alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a straight or branched chain alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, a cyanoalkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or carbon representing a linear or branched alkylamino group of numbers 1 to 6], the group in which R 24 can be represented as —OR 24a and R 25 can be represented as —N(R 25a ) 2 is represented by “ phosphoramidite group”.
  • the phosphoramidite group is preferably a group represented by the formula -P(OC 2 H 4 CN)(N(iPr) 2 ), or a group represented by the formula -P(OCH 3 )(N(iPr) 2 ) and the group represented by
  • iPr represents an isopropyl group.
  • nucleoside includes “nucleosides” in which a purine or pyrimidine base and a sugar are attached, as well as aromatic heterocycles and aromatic hydrocarbon rings other than purines and pyrimidines that substitute for a purine or pyrimidine base. Includes “nucleosides” that are possible and sugar-linked. Natural nucleosides are also called “natural nucleosides”. Modified non-natural nucleosides are also referred to as “modified nucleosides”, and nucleotides with modified sugar moieties are particularly referred to as “sugar-modified nucleosides”. "Nucleotide” means a compound in which a phosphate group is attached to the sugar of a nucleoside.
  • oligonucleotide refers to a polymer of “nucleotides” in which from 2 to 50 identical or different “nucleosides” are linked by phosphodiester or other linkages, naturally occurring and non-naturally occurring. Including those of type.
  • the non-natural "oligonucleotide” preferably includes a sugar derivative with a modified sugar moiety; a thioate derivative with a thioated phosphodiester moiety; an ester with an esterified terminal phosphate moiety; Examples include amides in which the amino group on the base is amidated, and more preferably sugar derivatives in which the sugar moiety is modified.
  • a salt thereof refers to a salt of the compound represented by formula (II) described below.
  • Such salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, Metal salts such as nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts , guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benz
  • the term "pharmacologically acceptable salt thereof” refers to a salt of an oligonucleotide containing at least one nucleoside structure represented by formula (I) shown below, wherein the oligonucleotide according to the present invention ie, salts that retain the desired biological activity of the oligonucleotide and do not impart undesired toxicological effects therein.
  • Such salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, Metal salts such as nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts , guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris Amine
  • oligonucleotide oligonucleotide
  • the oligonucleotide of the present invention has the activity of inducing N exon skipping in the processing of REST pre-mRNA (REST pre-mRNA).
  • REST pre-mRNA REST pre-mRNA
  • Such oligonucleotides may be pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the nucleotide sequence information of the human REST gene is available from NCBI Reference Sequence: NG_029447.1 Homo sapiens RE1 silencing transcription factor (REST), RefSeqGene on chromosome 4.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing corresponds to positions 24740 to 24789 of the human REST gene and spans the entire length of the N exon.
  • the N exon is located between exons 3 and 4.
  • the term "activity to induce N exon skipping in processing of REST pre-mRNA” means, for example, that an oligonucleotide binds to REST pre-mRNA, and then during processing of the pre-mRNA, Inducing skipping of the N exon, which promotes expression of REST and/or suppresses expression of the mutant sREST.
  • the oligonucleotide is an antisense oligonucleotide (ASO) to the REST mRNA or pre-mRNA.
  • This oligonucleotide is also called “splicing control oligonucleotide (SSO)" because it has the activity of inducing N exon skipping and thereby controls REST and sREST expression by pre-mRNA splicing.
  • SSO splicing control oligonucleotide
  • the activity of inducing N exon skipping can be determined by measuring the expression levels and expression ratios of REST and sREST by known methods (eg, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)). Oligonucleotides with N exon skipping activity can be concentration dependent, e.g. Activity can be determined by measuring the ratio (sREST/REST), or the ratio of REST to the "sum of REST and sREST" ("% exclusion") based on band intensity. The higher the skipping induction activity, the lower the "sREST/REST” and the higher the "%exclusion".
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • “sREST/REST” is lower than when no antisense oligonucleotide is added (control), and when “sREST/REST” in the control is set to 1 (in other words, oligonucleotide "sREST/REST” is divided by the “sREST/REST” of the control), for example, 0.8 or less, preferably 0.7 or less, more preferably 0.6 or less, even more preferably 0.4 or less, and 0.2 It may be below.
  • the "relative exon skipping activity” can be calculated by dividing the "% exclusion” of the oligonucleotide by the "% exclusion” of the control.
  • the “relative exon skipping activity” is, for example, 1.2 or higher, preferably 1.4 or higher, more preferably 1.6 or higher, still more preferably 1.8 or higher, even if it is 2.0 or higher. good.
  • an oligonucleotide "binds" to a REST pre-mRNA means that multiple different single-stranded oligonucleotides or nucleic acids can form two or more strands of nucleic acid due to nucleobase complementarity. Say. Preferably, it refers to the ability to form a double-stranded nucleic acid.
  • the melting temperature (T m ) of a double-stranded or higher-stranded nucleic acid which is an index of thermal stability of binding, is not particularly limited.
  • the melting temperature ( Tm ) of double - stranded nucleic acids can be determined, for example, as follows: , The oligonucleotide and the target RNA are mixed in equimolar amounts, heated at 95° C. for 5 minutes, then slowly cooled to room temperature for annealing to form a double-stranded nucleic acid.
  • the change in absorbance (A) at 260 nm with temperature (T) was measured when the double-stranded nucleic acid was heated from 20°C to 95°C at a heating rate of 0.5°C/min.
  • T is prepared, and the temperature at which the value of dA/dT in this graph becomes the largest, that is, the temperature at which the change in A due to T is the largest is taken as the Tm of the double-stranded nucleic acid.
  • the melting temperature (T m ) is, for example, 40° C. or higher, preferably 50° C. or higher.
  • complementary means that two different single-stranded oligonucleotides or nucleic acids are in a pairing relationship that allows them to form a double-stranded nucleic acid.
  • the base sequences of the double-strand forming regions are completely complementary, but have one or several mismatches as long as they can form the double-stranded nucleic acid and have N exon skipping action.
  • One or several mismatches means 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 mismatches, depending on the length of the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide of the present invention is preferably 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of the base sequence of the region forming the double strand or complete (100%) complementarity.
  • Antisense oligonucleotides (ASO) that target REST genes are examples of oligonucleotides that have the activity of inducing N exon skipping in the processing (splicing) of REST mRNA precursors.
  • Antisense oligonucleotides (ASOs) are capable of binding to target gene RNA (e.g., mRNA or pre-mRNA)/DNA, and have the activity of regulating the expression of the target gene (including splicing regulation), Refers to a single-stranded oligonucleotide that is complementary to the RNA (eg, mRNA or pre-mRNA)/DNA sequence of its target gene.
  • Antisense oligonucleotides (ASO) in the present invention are "splicing control oligonucleotides (SSO)" in that they can regulate splicing of target genes.
  • the oligonucleotide of the present invention can bind to a target region that is at least part of SEQ ID NO:1. Oligonucleotides of the invention may also bind to a target region that is at least part of SEQ ID NO:38 or 39.
  • the sequences represented by SEQ ID NOs: 38 and 39 are both partial regions of SEQ ID NO: 1.
  • a given "target region” refers to a region of the pre-mRNA shown in any of SEQ ID NOs: 1, 38 and 39, for example.
  • the target region is preferably a region associated with the activity of inducing N exon skipping in REST.
  • the target region is, for example, at least 12 bases long, e.g.
  • a nucleic acid molecule or oligonucleotide "binds to a target region” means that the nucleic acid molecule or oligonucleotide does not necessarily form two or more strands (preferably double strands) with the entire target region, and the REST mRNA precursor It may form two or more strands (preferably two strands) with a region that is part of the target region, as long as it exhibits the activity of inducing skipping of the N exon in the processing of .
  • the oligonucleotide having the activity of inducing skipping of the N exon of the REST pre-mRNA is, for example, complementary to the nucleotide sequence of the target region, which is at least part of SEQ ID NO: 1, and preferably has complete complementarity.
  • Oligonucleotides e.g., antisense oligonucleotides
  • Oligonucleotides of the invention are at least 12 bases long, e.g. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35 bases long. When the oligonucleotide has the above length, it can more effectively bind to the REST pre-mRNA and induce skipping of the N exon.
  • Oligonucleotides for example, antisense oligonucleotides of the present invention are oligonucleotides that have the activity of inducing N exon skipping of REST pre-mRNA, and are, for example, It includes a sequence that is complementary to at least 12 bases.
  • the oligonucleotide need not be entirely complementary to the target region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a portion of the oligonucleotide may be a peripheral region (e.g., the 5' end and/or 3' end of the target region). 1-5 base extensions) (shown in SEQ ID NO: 2). The same is true for SEQ ID NOs:38 and 39.
  • the design of the sequences of antisense oligonucleotides, such as the oligonucleotides (e.g., antisense oligonucleotides) of the present invention, based on the selected target region can be performed by methods commonly used by those skilled in the art.
  • base sequences of antisense oligonucleotides include the sequences shown below (shown in the 5′ ⁇ 3′ direction) (the numbers in [] indicate the sequence targeted by the oligonucleotide, human REST
  • the position of both ends of the sequence of SEQ ID NO: 1 in the pre-mRNA is represented by the base number at the 5' end of the sequence of SEQ ID NO: 1 being 1 and the number of bases in the direction of the 3' end being + (plus).
  • the number of bases deviating from the end of the sequence of 1 is represented by a - (minus) value, and when simply represented by a numerical value of -, it is the number of bases from the 5' end. is the number of bases from the end.):
  • aatggtatccatacccca (SEQ ID NO: 3) [+1/+18] accaaatggtatccatac (SEQ ID NO: 4) [+5/+22] taaatattaccaaatggt (SEQ ID NO: 5) [+13/+30] agtaaatattaccaaatg (SEQ ID NO: 6) [+15/+32] ctctagtaaatattacca (SEQ ID NO: 7) [+19/+36] cacactctagtaaattatt (SEQ ID NO: 8) [+23/+40] agatcacactctagtaaa (SEQ ID NO: 9) [+27/+44] atctagatcacactctag (SEQ ID NO: 10) [+31/+48] acccatctagatcacact (SEQ ID NO: 11) [+35/-2(3')]
  • Atcacactctagtaaattatt (SEQ ID NO: 40) [+23/+42] cacactctagtaaatattac (SEQ ID NO: 41) [+21/+40] cactctagtaaattatt (SEQ ID NO: 42) [+23/+38] cacactctagtaaata (SEQ ID NO: 43) [+25/+40] ctagatcacactctagtaaa (SEQ ID NO: 44) [+27/+46] agatcacactctagtaaata (SEQ ID NO: 45) [+25/+44] atcacactctagtaaa (SEQ ID NO: 46) [+27/+42] agatcacactctagta (SEQ ID NO: 47) [+29/+44] agatcacactctagtaaattatt (SEQ ID NO: 48) [+23/+44] gatcacactctagtaaat (SEQ ID
  • the added base is complementary to the base of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 (showing the base sequence of the target region and the adjacent region) adjacent to the target region (SEQ ID NO: 1) of the sequence to which the base is added. It can be a base.
  • the oligonucleotides of the present invention include both oligonucleotides containing natural DNA (unmodified oligonucleotides) and oligonucleotides containing chemically modified DNA. Such modifications may alter the activity of the oligonucleotide, eg, increase its affinity for a target nucleic acid, or increase its resistance to nucleases. Increasing the affinity of the oligonucleotide for its target may allow the use of shorter oligonucleotides.
  • the oligonucleotide according to the present invention may contain at least one sugar-modified nucleoside at any position.
  • the ratio of the number of sugar-modified nucleotides to all nucleosides constituting the oligonucleotide is, for example, 30% or more, preferably 40% or more, and more preferably 50% or more.
  • the sugar-modified nucleoside has a bridging moiety between the 2' and 4' positions of the sugar ring, eg, as described below.
  • the oligonucleotide of the present invention contains at least one nucleoside structure represented by the following formula (I) as a sugar-modified nucleoside:
  • Base is a purin-9-yl group optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group, or optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group 2 -oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, wherein the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon linear alkoxy group of number 1 to 6, mercapto group, mercapto group protected by protecting group for nucleic acid synthesis, linear alkylthio group of 1 to 6 carbon atoms, amino group, linear alkylamino group of 1 to 6 carbon atoms , an amino group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, and a halogen atom,
  • A is:
  • R 1 is selected from a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, and the ⁇ group an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a heteroatom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12 carbon atoms which may optionally contain a heteroatom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom; optionally substituted with an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom, and optionally branched or forming a ring; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms; or an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon
  • R 17 , R 18 and R 19 each independently form a hydrogen atom, a branch or a ring an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an amino group-protecting group, or
  • R 13 and R 14 each independently represents a hydrogen atom; a hydroxyl group; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may be branched or forming a ring; A group selected from the group consisting of an alkoxy group of 7; an amino group; and an amino group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis; m is an integer from 0 to 2; n is an integer from 0 to 1; R 10 is a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an amino-protecting group, or
  • R 15 and R 16 are each independently a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group. ,or
  • X is an oxygen atom, a sulfur atom, or an amino group
  • Y is an oxygen atom or a sulfur atom.
  • nucleoside structure represented by formula (I) above is
  • R 1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, or may form a branch or a ring.
  • It is an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents selected from the group and which may contain a heteroatom.
  • R 1 is a hydrogen atom, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, phenyl group, or benzyl group, and even more preferably R 1 is a hydrogen atom or a methyl group. be.
  • n is an integer from 0 to 1.
  • the ring including the 2'-positions, 3'-positions, 4'-positions, and the bridging moiety may constitute a 5- to 7-membered ring.
  • X is an oxygen atom, a sulfur atom, an amino group, or a methylene group.
  • X is an oxygen atom or an amino group.
  • X when X is an amino group or a methylene group, it may be substituted with a lower alkyl group.
  • the nucleoside structure represented by formula (I) above is a structure represented by formula (I-1) above, and in formula (I-1) m is 0; and R 1 is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group.
  • Nucleoside structures represented by formula (I) above include, in addition to formulas (I-1) and (I-2) above, for example, the following (I-3) to (I-7):
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 and p are As described above with respect to formula (I).
  • Formula (I-7) is referred to as 2',4'-BNA or LNA (Locked Nucleic Acid) (also referred to herein as "2',4'-BNA/LNA” or "LNA”). (for example, both R 13 and R 14 are hydrogen atoms).
  • Formula (I-3) has a structure in which a spirocyclopropane group is introduced at the 6' position of the 2',4'-BNA/LNA crosslinked portion, and is also referred to as spirocyclopropane crosslinked nucleic acid (spcBNA).
  • Formula (I-4) has a structure in which guanidine is introduced into the crosslinked portion of 2',4'-BNA/LNA, and is also called guanidine-bridged nucleic acid (GuNA).
  • Base is a purine base (ie, purine-9-yl group) or a pyrimidine base (ie, 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group).
  • bases include a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and a 6 linear alkylamino groups and one or more optional substituents selected from the ⁇ group consisting of halogen atoms.
  • Base examples include an adenynyl group, a guanynyl group, a cytosinyl group, a uracilyl group, a thyminyl group, a 6-aminopurin-9-yl group, a 2,6-diaminopurin-9-yl group, a 2 -amino-6-chloropurin-9-yl group, 2-amino-6-fluoropurin-9-yl group, 2-amino-6-bromopurin-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurine- 9-yl group, 6-amino-2-methoxypurin-9-yl group, 6-amino-2-chloropurin-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl group, 2,6 -dimethoxypurin-9-yl group, 2,6-dichloropurin-9-yl group, 6-mercaptopurin-9-yl group
  • Base has the following structural formula from the perspective of introduction into nucleic acid medicine:
  • thyminyl group cytosinyl group, adenynyl group, guanynyl group, 5-methylcytosinyl group and uracilyl group
  • 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl and thyminyl groups are preferred
  • the oligonucleotide according to the present invention has a nucleoside structure represented by the above formula (I-4), formula (I-4-1) or formula (I-4-2) as a sugar-modified nucleoside.
  • these nucleoside structures represented by formula (I-4) or formula (I-4-1) or formula (I-4-2) are represented by formula (I-4) or formula (I-4- 1) or is held electrically neutral by a pharmaceutically acceptable anion not represented in formula (I-4-2) (which can be represented as, for example, Z 1 ⁇ ).
  • examples of such anions include halide ions (eg, chloride ions), phosphate ions, and the like.
  • a sugar-modified nucleoside compound for example, WO 2011/052436, JP 2014-043462, WO 2014/ 046212 and WO2015/125783.
  • sugar-modified nucleoside compounds include compounds represented by the following formula (II) or salts thereof:
  • Base is a purin-9-yl group optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group, or optionally having one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group 2 -oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, wherein the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon linear alkoxy group of number 1 to 6, mercapto group, mercapto group protected by protecting group for nucleic acid synthesis, linear alkylthio group of 1 to 6 carbon atoms, amino group, linear alkylamino group of 1 to 6 carbon atoms , an amino group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, and a halogen atom,
  • A is:
  • R 1 is selected from a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, and the ⁇ group an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a heteroatom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12 carbon atoms which may optionally contain a heteroatom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom; optionally substituted with an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom, and optionally branched or forming a ring; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms; or an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon
  • R 17 , R 18 and R 19 each independently form a hydrogen atom, a branch or a ring an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an amino group-protecting group, or
  • R 13 and R 14 each independently represents a hydrogen atom; a hydroxyl group; an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may be branched or forming a ring; A group selected from the group consisting of an alkoxy group of 7; an amino group; and an amino group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis; m is an integer from 0 to 2; n is an integer from 0 to 1;
  • R 10 is a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an amino-protecting group, or
  • R 15 and R 16 are each independently a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group. ,or
  • R 22 and R 23 are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis, or a C 1-7 group which may form a branch or ring.
  • Sugar-modified nucleotides can be easily prepared from the above sugar-modified nucleosides.
  • triphosphorylation can be readily performed according to the method described in M. Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., 2008, vol.36, No.13, pp.4257-65.
  • Phosphate modifications include, for example, phosphodiester bonds of natural nucleic acids, S-oligo (phosphorothioate), D-oligo (phosphodiester), M-oligo (methylphosphonate), boranophosphate, and the like.
  • S-oligo(phosphorothioates) have a PS backbone in which the oxygen atoms in the phosphate groups of the internucleoside phosphodiester linkages are replaced by sulfur atoms. This modification is incorporated into the oligonucleotide according to known methods.
  • An antisense oligonucleotide having one or more such modifications in the oligonucleotide is also called an S-oligo type (phosphorothioate type).
  • Nucleobase modifications include, for example, 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, 5-propynylcytosine and the like.
  • the position and number of sugar-modified nucleosides are not particularly limited, and can be appropriately designed according to the purpose. Two or more sugar-modified nucleosides include, for example, the same or different from each other. Oligonucleotides can be designed with sugar-modified and unmodified nucleosides alternating. For oligonucleotides of the invention, it is preferred that a region consisting of 1-3 residues of unmodified nucleosides is followed by sugar-modified nucleosides. This makes the RNA to which the oligonucleotide binds difficult to be cleaved via RNase H.
  • nucleoside structure represented by formula (I) above is
  • R 1 is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group).
  • the oligonucleotide of the present invention comprises a base sequence represented by any of the base sequences of SEQ ID NOS: 3-11 and SEQ ID NOS: 40-49, and at least one of the bases is the above sugar.
  • Oligonucleotides that are modified nucleosides include, for example, those shown below:
  • the numbers in [] indicate the target sequence of the oligonucleotide, with the 5′ terminal base of the sequence of SEQ ID NO: 1 in human REST pre-mRNA being 1, 3 It is represented by the positions of both ends when the number of bases in the direction of the 'terminal side is regarded as + (plus).
  • the number of bases deviating from the end of the sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by a - (minus) value, and when simply represented by a numerical value of -, it is the number of bases from the 5' end, and is described as (3') together with the - value. In case, it is the number of bases from the 3' end.
  • Oligonucleotides in the present invention can be synthesized by conventional methods using sugar-modified nucleosides and natural nucleosides as described above. can be easily synthesized by manufacturing, etc.). Synthetic methods include a solid-phase synthesis method using phosphoramidite, a solid-phase synthesis method using hydrogenphosphonate, and the like. For example, disclosed in Tetrahedron Letters, 1981, vol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the above oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful, for example, for treating or preventing diseases involving REST processing (splicing).
  • Target diseases of the pharmaceutical composition of the present invention include, for example, cancer diseases and heart failure.
  • Cancer diseases associated with REST processing include, for example, SRRM4-mediated cancers (eg, small cell lung cancer, prostate cancer (eg, castration-resistant prostate cancer (CRPC)), breast cancer). Such cancer diseases may originate from neuroendocrine cells.
  • the present invention encompasses a therapeutic agent for cancer containing the above oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the present invention also includes a therapeutic agent for heart failure containing the above oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the administration method and formulation of the pharmaceutical composition of the present invention or the drug for treating cancer or the drug for treating heart failure may be any administration method and formulation known in the art. Available.
  • compositions, etc. of the present invention can be administered locally or systemically or by various methods depending on the region to be treated.
  • Methods of administration may be, for example, topical (including, for example, eye drops, intravaginal, intrarectal, intranasal and transdermal), oral, or parenteral.
  • Parenteral administration includes intravenous injection or infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, pulmonary administration through the respiratory tract by inhalation or inhalation, and the like.
  • formulations such as transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids, and powders can be used.
  • compositions for oral administration include powders, granules, suspensions or solutions dissolved in water or non-aqueous media, capsules, powders, tablets and the like.
  • compositions for parenteral administration include sterile aqueous solutions containing buffers, diluents and other suitable additives.
  • the pharmaceutical composition, etc. of the present invention contains an effective amount of the above-mentioned oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof and excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, and diluents suitable for the dosage form. It can be obtained by mixing various pharmaceutical additives such as, if necessary. In the case of an injection, it may be sterilized with an appropriate carrier to form a preparation.
  • the present invention provides a method of inducing N exon skipping during REST processing.
  • the present invention also provides methods for the treatment or prevention of diseases involving REST processing. In one embodiment, these methods are used to treat or prevent the target diseases described above. These methods comprise administering to an individual the oligonucleotides described above or pharmacologically acceptable salts thereof.
  • "Individuals" are preferably mammals, more preferably humans, monkeys, dogs, cats, rats and mice, and even more preferably humans. In these methods, the administration method and dosage form are not limited as long as an effective dose of the oligonucleotide of the present invention is administered.
  • the effective dose depends on the individual to be administered, it can be arbitrarily determined according to the individual's sex, age, body weight, symptoms, etc., as well as the administration method, route, frequency, and the like.
  • the administration method and the like are as described above.
  • Example 1 Antisense oligonucleotide synthesis
  • Oligonucleotides related to the present invention were synthesized by the method described in Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981), International Publication No. 2011/052436, and the like. Based on the design in Example 1, an oligonucleotide containing an amide BNA (AmNA) represented by the following formula was synthesized with reference to the method described in WO 2011/052436:
  • AmNA amide BNA
  • Base is a 5-methylcytosinyl group, thyminyl group, adenynyl group or guanynyl group, and Me is a methyl group.
  • An 18-mer oligonucleotide containing amide BNA (AmNA) was synthesized on a 0.2 ⁇ mol scale using an automatic nucleic acid synthesizer (nS-8 type, manufactured by Gene Design Co., Ltd.). Chain length extension was performed using standard phosphoramidite protocols (solid support: CPG resin, sulfurization for phosphorothioated (PS) backbone formation was performed using DDT (3H-1,2-benzodisiol-3-one, 1, 1-dioxide), etc.) to obtain an oligonucleotide in which the hydroxyl group at the terminal 5'-position was protected with a DMTr (dimethoxytrityl) group and the 3'-position was supported on a solid phase.
  • DMTr dimethyl methoxytrityl
  • the desired product was cleaved from the solid phase carrier by base treatment. After neutralization with dilute acid, the solvent was distilled off, and the resulting crude product was purified by gel filtration column chromatography and reversed-phase HPLC to obtain the desired product.
  • Antisense oligonucleotides were designed to target the pre-mRNA of the human REST gene (NCBI Reference Sequence: NG_029447.1 Homo sapiens RE1 silencing transcription factor (REST), RefSeqGene on chromosome 4.).
  • the reverse sequences (CG, GGA, GCA) of CG, TCC, and TGC that express toxicity in antisense were excluded.
  • regions such as loop structures that are easily accessible to antisense oligonucleotides were selected.
  • Blast was used to allow human application based on the results evaluated in mice.
  • the regions of REST pre-mRNA that are highly homologous to humans and mice were selected.
  • 18 candidate sequences were selected.
  • An oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the candidate sequence selected as described above was designed as an antisense oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotides were 18-mers in length, and the 5' end was designed to alternate artificial nucleic acids and DNA as artificial nucleic acids (AmNA) containing sugar-modified nucleosides.
  • AmNA artificial nucleic acids
  • the numerical value in [] indicates the target sequence of the oligonucleotide, and the 5' terminal base of the sequence of SEQ ID NO: 1 in human REST pre-mRNA is 1, and the 3' It is represented by the position of both ends when the number of bases in the terminal side direction is regarded as + (plus).
  • the number of bases deviating from the end of the sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by a - (minus) value, and when simply represented by a numerical value of -, it is the number of bases from the 5' end, and is described as (3') together with the - value. In case, it is the number of bases from the 3' end.
  • Phosphorothioate refers to a structure in which the oxygen atom of the phosphate group in the phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom (the group corresponding to the phosphate group is called a phosphorothioate group).
  • an oligonucleotide in which all phosphate groups of the oligonucleotide are replaced with phosphorothioate groups is particularly referred to as an S-oligonucleotide.
  • Example 3 Evaluation of antisense oligonucleotide splicing control (N exon skipping) effect in SCLC cells
  • STC1 human SCLC cells
  • test oligonucleotide 1.0 nmol
  • STC1 cells 1.0 ⁇ 10 6 cells
  • Sterile water was used as a control (mock).
  • SRRM4 which is aberrantly expressed in SCLC cells, is also expressed in endocrine prostate cancer (NEPC). Therefore, in order to further expand the indication, we evaluated a prostate cancer cell line (VCaP) that has been confirmed to express SRRM4.
  • test oligonucleotides were introduced by the lipofection method. After 48 hours, the cells were collected and analyzed according to standard methods. The sREST/REST expression ratio was determined in the same manner as in Example 3, and the splicing control (N exon skipping) effect of these antisense oligonucleotides was evaluated.
  • splicing control (N exon skipping) effect by oligonucleotides was confirmed not only in SCLC cells but also in VCaP cells.
  • Antisense oligonucleotides for which splicing control effects have been confirmed are referred to as splicing control oligonucleotides (SSO).
  • SSO splicing control oligonucleotide
  • AmNA_[+31/+48] 0.1, 1.0, 2.0 nmol
  • control AmNA_26 were introduced into H146 cells (1.0 ⁇ 10 6 cells) by electroporation, and the cells were harvested after 96 hours.
  • control AmNA_26 (0.1, 1.0 nmol) did not change the REST band in H146 cells (1.0 ⁇ 10 6 cells), but AmNA_[+31/+48] reduced sREST. and the intensity of the REST band increased (Fig. 3A).
  • Example 6 Concentration-dependent evaluation of REST splicing control of splicing control oligonucleotides (SSO)
  • SSO splicing control oligonucleotides
  • test oligonucleotides 2.5 nM, 5 nM, 10 nM
  • VCaP cells 1.0 ⁇ 10 6 cells
  • Example 7 Concentration-dependent evaluation of REST splicing control of splicing control oligonucleotide (SSO) 2
  • SSO splicing control oligonucleotide
  • test oligonucleotides 2.5 nM, 5 nM, 10 nM
  • VCaP cells 1.0 ⁇ 10 5 cells
  • Example 8 Concentration-dependent evaluation of REST splicing regulation of splicing control oligonucleotides (AmNA[+23/+40] and AmNA[+27/+44])
  • AmNA[+23/+40] and AmNA[+27/+44] which were shown to have high relative exon skipping activity in Example 7, the splicing control effect was verified by finely varying the concentrations.
  • the above SSO was added to prostate cancer cells (VCaP) at various concentrations, and the expression of REST and sREST in vitro was examined by RT-PCR to determine "% exclusion" and determine the splicing control (N exon skipping) effect. evaluated.
  • Test oligonucleotides (0.1 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM) were introduced into VCaP cells (1.0 x 10 5 cells) by the lipofection method. Analysis was performed based on Sterile water was used as a control (mock).
  • Example 9 EC50 analysis of splicing control oligonucleotides (AmNA[+23/+40] and AmNA[+27/+44])
  • AmNA_2340 AmNA[+27/+44]
  • AmNA_2744 AmNA[+27/+44]
  • Test oligonucleotides (0.1 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM) were introduced into VCaP cells (1.0 x 10 5 cells) by the lipofection method. Analysis was performed based on The 'relative exon skipping activity' at each concentration was calculated, plotted on a graph and curve regression was performed.
  • Example 10 Optimization study of splicing control oligonucleotide (SSO)) Based on AmNA[+23/+40] (AmNA_2340) and AmNA[+27/+44] (AmNA_2744), which were shown to have high relative exon skipping activity in Example 7, the sequence length was changed, AmNA We examined the optimization of SSO by exchanging the positions of natural nucleic acids and/or changing the number of introduced AmNAs.
  • Fig. 8 shows an overview of the sequence length of the SSO that was studied. In addition, SSO as a negative control was also examined. Four scrambled sequences were designed (Table 1) without changing the ATGC ratio of AmNA [+35/-2] and the rate of artificial nucleic acid introduction (for each base).
  • the above SSO was added to prostate cancer cells (VCaP) at a concentration of 1.0 nM, and the expression of REST and sREST in vitro was examined by RT-PCR to determine "% exclusion” and splicing control (N exon skipping) effect. evaluated. Sterilized water was used as a control (mock), and NC3 was used as a control (NC).
  • Example 11 REST splicing control evaluation of splicing control oligonucleotides (SSO) in 22Rv1 cells
  • AmNA[+23/+40] AmNA_2340
  • AmNA[+27/+44] AmNA_2744
  • AmNA[+21/+40] AmNA_2140
  • AmNA[ +23/+44] was verified whether it has similar splicing regulatory effects in different cell types.
  • the cells used in this example are 22Rv1, a human prostate cancer epithelial cell line derived from serially grown xenografts in mice.
  • the above SSO was added to prostate cancer cells (22Rv1) at a concentration of 1.0 nM, and the expression of REST and sREST in vitro was examined by RT-PCR to determine "% exclusion” and splicing control (N exon skipping) effect. evaluated.
  • 22Rv1 cells (1.0 ⁇ 10 5 cells) were transfected with the test oligonucleotide (1.0 nM) by lipofection, and 48 hours later, the cells were collected and analyzed according to standard methods. Sterilized water was used as a control (mock), and NC3 was used as a control (NC).
  • Example 12 Verification of the effect of splicing control oligonucleotide (SSO) on SRRM4 gene expression
  • SSO splicing control oligonucleotide
  • the SRRM4 gene has an RE1 sequence whose expression is controlled by REST, and high expression of REST suppresses SRRM4 gene expression.
  • the SRRM4 protein is a protein that controls the splicing of REST pre-mRNA, and it is known that the SRRM4 protein highly expresses sREST in SCLC (Fig. 15).
  • test oligonucleotide 1.0 nM
  • 22Rv1 cells 1.0 ⁇ 10 5 cells
  • a control no SSO added
  • the expression level of SRRM4 mRNA was measured. Sterilized water was used as a control (mock), and NC3 was used as a control (NC).
  • Example 13 Evaluation of antitumor effect in vivo
  • AmNA_2140 which has a high splicing effect and an SRRM4 mRNA expression-suppressing effect, exerts an antitumor effect in vivo.
  • Physiological saline was used as a control.
  • SCLC cells (cell culture) Cell lines were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). SCLC cells (H146, H209) were cultured as floating cells, and prostate cancer cells (VCaP, 22Rv1) as adherent cells.
  • the medium was RPMI-1640 (containing 4,500 mg/l glucose, L-glutamine, phenol red, HEPES, sodium pyruvate: Ref 187-02705: LOT ESH7003) and FBS (Gibco TM fetal bovine serum, qualified, Brazil: Ref 10270106: LOT 42F0288K) was added to 10%.
  • the inside of the incubator was 37°C and 5% CO 2 .
  • the cell lines used are as follows. SCLC cell lines: H146 (HTB-173), H209 (HTB-172), prostate cancer cell lines: VCaP (CRL-2876), 22Rv1 (CRL-2505)
  • SRRM4 expression analysis by qRT-PCR 0.5 ⁇ 10 6 cells were seeded in 6-well plates with 1750 ⁇ l of RPMI-1640 24 hours before transfection. 7.5 ⁇ l/well of Lipofectamine TM 3000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and 250 ⁇ l of a complex solution of SRRM4-ASO and Lipofectamine TM 3000 Reagent prepared according to the package insert for other items were added to each well. For 24-well plates, 0.1 ⁇ 10 6 cells were seeded with 450 ⁇ l of RPMI-1640 24 hours before transfection.
  • Lipofectamine TM 3000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added to each well at 1.5 ⁇ L/well, and 50 ⁇ L of the complex solution obtained according to the package insert for other items was added to each well.
  • 5.0 ⁇ 10 4 cells were seeded in 100 ⁇ l of RPMI-1640 in 96-well plates 24 hours before transfection.
  • 0.3 ⁇ l/well of Lipofectamine TM 3000 manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • 10 ⁇ l of a complex solution of SRRM4-ASO and Lipofectamine TM 3000 prepared according to the manufacturer's instructions were added to each well.
  • Total RNA extraction/cDNA synthesis Total RNA was extracted using RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) according to the package insert. Total RNA was quantified spectrophotometrically at 260 nm, adjusted with RNase-free water to 100 ng/16 ⁇ l, then 4 ⁇ l of SuperScript VILO (manufactured by Thermo Fischer Scientific) was added for reverse transcription (42°C, 60 minutes). ) was implemented.
  • Quantitative PCR was performed using StepOnePlus TM Real-Time PCR Systems (Thermo Fisher Scientific). A master mix was prepared using TaqMan TM Fast Advanced Master Mix (manufactured by Thermo Fisher Scientific). For SRRM4, each primer was prepared at 10 pmol in a 20 ⁇ l reaction. ⁇ -actin was prepared according to the package insert of TaqMan TM ⁇ -Actin Detection Reagents (manufactured by Thermo Fisher Scientific). 1/100 of the cDNA obtained from the reverse transcription reaction was analyzed by qRT-PCR. The reaction conditions were 40 cycles of 95° C. for 20 seconds, 95° C. for 3 seconds, and 60° C. for 30 seconds.
  • RNA expression analysis by RT-PCR method 1/10 of the cDNA obtained from the RT reaction was amplified using Hot Start Taq DNA polymerase (New England Biolabs). The reaction conditions were 95°C for 30 seconds, 95°C for 15 seconds, 58°C for 15 seconds, and 68°C for 30 seconds for 20 cycles for ⁇ -actin, 35 cycles for REST and sREST, followed by 2 cycles at 68°C. minutes. Each primer was prepared at 5 pmol each in a 25 ⁇ L reaction solution. PCR products were subjected to electrophoresis using 5% Mini-PROTEAN TBE Precast Gels (BIO RAD). As the electrophoresis buffer, 10 ⁇ Tris-Borate-EDTA Buffer (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was diluted 0.5 times and used.
  • Mini-PROTEAN Tetra System (BIO RAD) was used as the electrophoresis apparatus.
  • the I Bright FL1500 Imaging System was used for gel photography and band quantification. A value representing the brightness of the band per unit area was quantified from the image using the function of the I Bright FL1500 Imaging System, and the REST value with respect to the sum of the sREST and REST values was used as an evaluation index. This value is shown in Figure 3B as %exclusion.
  • the primer sequences were as follows: REST For. Primer: 5'-gaacgcccatataaatgtgaa-3' (SEQ ID NO: 33); REST Rev.
  • Primer 5'-tttgaagttgcttctatctgctgt-3' (SEQ ID NO: 34); ⁇ -actin For.Primer: 5′-ggccgtcttccctccatcg-3′ (SEQ ID NO: 35); ⁇ -actin Rev. Primer: 5′-ccagttggtgacgatgccgtgc-3′ (SEQ ID NO: 36)
  • Example 9 The data obtained in Example 9 were introduced into graphing software GraphPad Prism, curve regression was performed by 4 Parameter Logistic ( 4PL ), and EC50 was calculated.
  • the present invention is useful, for example, in the production of pharmaceuticals for treating cancer.

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Abstract

本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の塩基配列からなる標的領域中の少なくとも１２塩基の連続する配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、かつヒトREST pre-mRNAのプロセッシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば癌治療のための医薬品の製造に有用である。

Description

ＲＥＳＴ　ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド
　本発明は、転写抑制因子REST（RE1-silencing transcription factor）のmRNA前駆体（pre-mRNA）のプロセシングにおいてＮエキソンをスキッピングするオリゴヌクレオチドまたはその薬理学的に許容可能な塩、およびこれを含む医薬組成物に関する。
　多くの疾患、がんや神経変性疾患には遺伝子のスプライシング異常が報告されている。例えば、がん関連死の主な要因である肺がんのうち、小細胞肺がん(SCLC)の主たる治療方針は大きく変化しておらず、新規治療薬の開発が急務である。さらに、現在のSCLCの治療では、殺細胞性の化学療法治療薬が用いられているが、再発した場合、薬剤に対する耐性が起こり深刻な問題である。
　分子標的治療薬として、Serine/Arginine Repetitive Matrix 4（SRRM4）を標的としたアンチセンス核酸医薬（ASO）の臨床試験へむけた開発が進められている（特許文献１）。
　SCLCの病態には、腫瘍抑制因子である転写抑制因子RESTが減少し、RESTアイソフォーム（sREST）が異常発現している。転写抑制因子RESTのスプライシングはSRRM4が活性化する。転写抑制因子RESTは神経系遺伝子のマスター分子であり、かつ腫瘍抑制因子であるという報告がある。
　これまでの研究で、SRRM4アンチセンスオリゴヌクレオチド（SRRM4_ASO）は、SRRM4を抑制し抗腫瘍効果を示す中で、腫瘍抑制因子であるRESTのスプライシング変化を促進し、その結果生じるREST発現上昇が、癌細胞死を誘導していると考えられていた。さらに、SCLCで異常発現しているsRESTに関して、sRESTからRESTを発現するようなスプライシング変化を直接的に促進することで、SCLC細胞死を誘導可能であることが明らかにされている（非特許文献１）。
国際公開第２０２０／０２７２２７号
16th Annual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society (2020 Virtual Conference) September 27-30, 2020の学会要旨およびポスター
　本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、RESTのＮエキソンのスキッピングを適切に誘導し得るオリゴヌクレオチドまたはその薬理学的に許容可能な塩、およびこれを含む医薬組成物を提供することにある。
　本発明は、配列番号１の塩基配列からなる標的領域中の少なくとも１２塩基の連続する配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、かつヒトREST pre-mRNAのプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導する、オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩である。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドの長さは１２～３５塩基である。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩が、以下の式（Ｉ）で表される、ヌクレオシド構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式（Ｉ）中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ａは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表される二価の基であり、
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
　Ｒ２およびＲ３は一緒になって、－（ＣＨ２）ｑ－［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１１）Ｒ１２［式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；
　Ｒ９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　Ｒ１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
であるか、あるいは－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
である］であり；
　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
　ｍは、０から２の整数であり；
　ｎは、０から１の整数であり；
　Ｒ１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
である場合、ｐは１であり、かつＲ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 であり、あるいは
　Ｒ１０が－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９である場合、ｐは０であり；
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
　Ｙは酸素原子または硫黄原子である）
の少なくとも１つを含む。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド間の結合は、ホスホロチオエートを含む。
　１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３～１１および配列番号４０～４９のいずれかの塩基配列を含む。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（ここで、Ｒ１３およびＲ１４がともに水素原子である）；または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（ここで、ｍは０であり、そしてＲ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である）
で表される。
　本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含む、医薬組成物である。
　１つの実施形態では、上記医薬組成物は癌治療薬である。
　１つの実施形態では、上記癌治療薬は、小細胞肺癌、前立腺癌および乳癌よりなる群から選択される少なくとも１つの癌の治療に用いられる。
　１つの実施形態では、上記医薬組成物は心不全治療薬である。
　本発明はさらに、哺乳動物に対して、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における癌または心不全の治療方法である。
　本発明はさらに、癌または心不全の治療における使用のための、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩である。
　本発明はさらに、癌または心不全の治療薬の製造のための、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩である。
　本発明のオリゴヌクレオチドによれば、RESTのmRNA前駆体のプロセシングにおいてＮエキソンのスキッピングを誘導可能である。また、in vivoにおいて抗腫瘍効果を示し得る。これにより、RESTのプロセシング（スプライシング）が関与する疾患（例えば、小細胞肺癌などの癌、または心不全）の治療または予防のための医薬組成物の開発に有用となる。
種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、一次スクリーニングにおいてSCLC細胞に添加した場合のRESTに対するsRESTの発現比率（sREST/REST）を示すグラフである。 種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、前立腺癌細胞に添加した場合のRESTに対するsRESTの発現比率（sREST/REST）を示すグラフである。 Ａは、RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）によるスプライシングの変化（Ｎエキソンスキッピング）を示すＲＴ－ＰＣＲの結果の写真であり、Ｂは、細胞生存率の評価結果を示すグラフである。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）のＮエキソンスキッピングに濃度依存性があることを示すグラフである。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）のREST pre-mRNAにおける位置関係（上図）、およびSSOのＮエキソンスキッピングに濃度依存性があることを示すグラフ（下図）である。図中の塩基配列を配列番号５０で示す。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）（具体的には、AmNA[+23/+40]（以下、AmNA_2340と称することがある。）およびAmNA[+27/+44]（以下、AmNA_2744と称することがある。）のREST pre-mRNAにおける位置関係（上図）、およびSSOのＮエキソンスキッピングに濃度依存性があることを示すグラフ（下図）である。図中の塩基配列を配列番号５１で示す。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）（具体的には、AmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]）のREST pre-mRNAにおける位置関係（上図）、およびSSOのEC50(Effect Concentration 50；50%効果濃度)の解析結果のグラフ（下図）である。 実施例９のAmNA_2340およびAmNA_2744に基づくSSOの最適化検討における、SSOの配列長等の概要図。図中の塩基配列を配列番号５２で示す。 AmNA[+35/-2]のスクランブル配列からネガティブコントロール(NC)を4本設計し、これらNCによるRESTスプライシングの変化をVCaP細胞で確認した。NCはスプライシングを変化させないものが好ましいので、Relative exon skipping activityが最も1に近いもの(NC3)を今後NCとして利用することを決定した。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）によるスプライシングの変化（Ｎエキソンスキッピング）を示すＲＴ－ＰＣＲの結果の写真である。 図１０の写真から相対的なエキソンスキッピング活性を定量した結果のグラフである。 図８、図１０および１１に基づきSSO解析の結果をまとめたものである。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）のREST pre-mRNAにおける位置関係（上図）、並びにSSOによるスプライシングの変化（Ｎエキソンスキッピング）を示すＲＴ－ＰＣＲの結果の写真及び該写真から相対的なエキソンスキッピング活性を定量した結果のグラフ（下図）である。 RESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）のREST pre-mRNAにおける位置関係（上図）、およびSSOによる相対的なSRRM4の発現量を定量した結果のグラフ（下図）である。 SCLC/NEPC細胞において、SRRM4タンパク質によりRESTのＮエキソンスキッピングが制御されていること、およびRESTを標的にするオリゴヌクレオチド（SSO）がRESTのＮエキソンスキッピングを制御することを示す概略図である。 マウスを用いたin vivoでの腫瘍サイズ(N417細胞)を測定したものである。右図はマウスに腫瘍投与後23日後のマウス腫瘍の外観で、左図はマウスにSSO(AmNA2140)及び生理食塩水投与後の腫瘍サイズを経時的に記録したものである。腫瘍サイズはノギスで長径と短径を測定し、定法に従い腫瘍サイズ＝(長径×短径2)/2の式で算出した。
（用語の定義）
　まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
　本明細書において、用語「炭素数１から３のアルキル基」とは、炭素数１から３の任意のアルキル基を包含する。具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、およびイソプロピル基が挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を包含する。具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、およびｎ－ヘキシル基が挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ－プロピルオキシ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ－ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ－ブチルチオ基、ｎ－ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６のシアノアルコキシ基」は、上記炭素数１から６の直鎖アルコキシ基を構成する少なくとも１つの水素原子がシアノ基で置換された基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の直鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ｎ－プロピルアミノ基、ジｎ－プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３から７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３から７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基、および炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基を包含する。単に、「低級アルコキシ基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｎ－ブチロキシ、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、およびｎ－ヘプチルオキシ基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基としては、イソプロポキシ基、イソブチロキシ基、ｔｅｒｔ－ブチロキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基としては、シクロブチロキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６から１２の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６から１２のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２－ピリジルエチル基、１－ピリジルエチル基、３－チエニルプロピル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３－メチルノナノイル基、８－メチルノナノイル基、３－エチルオクタノイル基、３，７－ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１－メチルペンタデカノイル基、１４－メチルペンタデカノイル基、１３，１３－ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５－メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１－メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）－２－メチル－２－ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２－ブロモベンゾイル基、４－クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６－トリメチルベンゾイル基、４－トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４－アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２－カルボキシベンゾイル基、３－カルボキシベンゾイル基、４－カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４－ニトロベンゾイル基、２－ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２－（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４－フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
　本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ－ｔ－ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１～２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
　本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
　本明細書において、用語「ハロゲン化物イオン」としては、例えば、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、またはヨウ化物イオンが挙げられる。好適には、フッ化物イオンまたは塩化物イオンである。
　本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」、「シアノ基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、「１～４個のニトロ基で置換されたベンゼンスルホニル基」などが挙げられる。
　より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン－２－イル基、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロピラン－４－イル基、テトラヒドロチオピラン－４－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン－２－イル基、テトラヒドロチオフラン－２－イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２－メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２－トリクロロエトキシメチル基、ビス（２－クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１－エトキシエチル基、１－（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２－トリクロロエチル基などが挙げられる。１～３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基、９－アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基、２－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基、４－シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４－クロロフェニル基、２－フロロフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－ニトロフェニル基、２，４－ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４－メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンジルオキシカルボニル基、４－ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。「シアノ基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、シアノエトキシカルボニル基などが挙げられる。「１～４個のニトロ基で置換されたベンゼンスルホニル基」としては、２－ニトロベンゼンスルホニル基、２，４－ジニトロベンゼンスルホニル基などが挙げられる。
　「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２－クロロフェニル基、４－クロロフェニル基または２－プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２－シアノエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、ベンジル基、２－クロロフェニル基または４－クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」を構成する保護基は１つまたはそれ以上であり得る。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。
　本明細書において、Ｒ１０基に関する「アミノ基の保護基」としては、アセチル基、第三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などが挙げられる。
　本明細書において、－Ｐ（Ｒ２４）Ｒ２５［式中、Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ２４が－ＯＲ２４ａそしてＲ２５が－Ｎ（Ｒ２５ａ）２として表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式－Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式－Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
　本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」、ならびにプリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合した「ヌクレオシド」を含む。天然型のヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」ともいう。修飾された非天然型のヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」ともいい、特に糖部分が修飾されたヌクレオチドを「糖修飾ヌクレオシド」という。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。
　本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合または他の結合で２～５０個結合した「ヌクレオチド」のポリマーであり、天然型のものと非天然型のものを含む。非天然型の「オリゴヌクレオチド」としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
　本明細書において、用語「その塩」とは、後述の式（ＩＩ）で表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
　本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」とは、以下に示す式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドの塩であって、本によるオリゴヌクレオチドの生理学的におよび製薬上許容される塩、すなわち、当該オリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
（オリゴヌクレオチド）
　以下、本発明について詳述する。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、RESTのmRNA前駆体（REST pre-mRNA）のプロセシングにおいてＮエキソンのスキッピングを誘導する活性を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、その薬理学上許容される塩であってもよい。REST遺伝子について、ヒトREST遺伝子の塩基配列情報は、NCBI Reference Sequence：NG_029447.1　Homo sapiens RE1 silencing transcription factor (REST), RefSeqGene on chromosome 4.により入手可能である。配列表の配列番号１の塩基配列は、ヒトREST遺伝子の２４７４０位から２４７８９位までに該当し、Ｎエキソンの全長にわたる。Ｎエキソンは、エキソン３とエキソン４との間に位置する。
　本明細書において、「RESTのmRNA前駆体のプロセシングにおいてＮエキソンのスキッピングを誘導する活性」とは、例えば、オリゴヌクレオチドがRESTのmRNA前駆体に結合し、次いで当該mRNA前駆体のプロセシングの際にＮエキソンのスキッピングを誘導し、これによりRESTの発現が促進され、および／または変異型であるsRESTの発現が抑制されることを包含する。オリゴヌクレオチドは、RESTのmRNAまたはmRNA前駆体に対してアンチセンスのオリゴヌクレオチド（ASO）である。このオリゴヌクレオチドは、Ｎエキソンのスキッピングを誘導する活性を有し、それによりmRNA前駆体のスプライシングによるREST発現とsREST発現とを制御するため、「スプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）」ともいう。
　Ｎエキソンのスキッピングを誘導する活性は、公知の方法（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR））により、RESTとsRESTとの発現量や発現比率を測定することで求められ得る。Ｎエキソンのスキッピング活性を有するオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の実施例３または実施例４に記載のインビトロにおけるmRNA発現の実験または同等の実験において、濃度に依存し得るが、例えば、RESTに対するsRESTの比（sREST／REST）、または「RESTとsRESTの和」に対するRESTの比率（「％exclusion」）をバンドの濃さに基づいて測定することにより活性を確認することができる。スキッピング誘導活性が高いほど「sREST／REST」は低くなり、「％exclusion」は高くなる。「sREST／REST」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド無添加の場合（コントロール）と比較して低く、コントロールでの「sREST／REST」を１とした場合（換言すれば、オリゴヌクレオチドの「sREST／REST」を、コントロールの「sREST／REST」で除する場合）、例えば０．８以下、好ましくは０．７以下、より好ましくは０．６以下、さらにより好ましくは０．４以下であり、０．２以下であってもよい。また、本明細書において、「相対的なエキソンスキッピング活性」は、オリゴヌクレオチドの「％exclusion」を、コントロールの「％exclusion」で除することで算出できる。「相対的なエキソンスキッピング活性」は、例えば１．２以上、好ましくは１．４以上、より好ましくは１．６以上、さらにより好ましくは１．８以上であり、２．０以上であってもよい。
　さらに、オリゴヌクレオチドがRESTのmRNA前駆体に「結合する」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。結合の熱安定性の指標である２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔｍ）は特に限定されない。２本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）は、例えば、下記のように決定され得る：緩衝液（8.1mM Na2HPO4，2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，pH7.2）中で、オリゴヌクレオチドと標的RNAとを等モル混合し、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成させる。２本鎖核酸の温度を２０℃から９５℃まで０．５℃／分の昇温速度で加温する際の２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）の温度（Ｔ）による変化を測定し、この測定結果よりｄＡ／ｄＴ　ｖｓ　Ｔのグラフを作成し、このグラフにおいてｄＡ／ｄＴの値が最も大きくなる温度、つまりＡのＴによる変化が最も大きくなる温度を、２本鎖核酸のＴｍとする。融解温度（Ｔｍ）は、例えば４０℃以上であり、好ましくは５０℃以上である。
　本明細書において「相補的」とは、異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が２本鎖核酸を形成することができる対合関係にあることをいう。好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有するが、当該２本鎖核酸を形成し得、Ｎエキソンのスキッピング作用を有する限り、１もしくは数個のミスマッチを有し得る。１もしくは数個のミスマッチとは、オリゴヌクレオチドの長さに依存し得るが、１～４個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１または２個のミスマッチを意味している。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列に対して８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相補性を有するか、あるいは完全に（１００％）相補性を有するものであってもよい。
　REST　mRNA前駆体のプロセシング（スプライシング）においてＮエキソンスキッピングを誘導する活性を有するオリゴヌクレオチドとしては、REST遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）とは、標的遺伝子のRNA（例えば、mRNAまたはmRNA前駆体）／DNAと結合し得、当該標的遺伝子の発現を制御（スプライシング制御を包含する）する活性を有し、その標的遺伝子のRNA（例えば、mRNAまたはmRNA前駆体）／DNAの配列に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、標的遺伝子のスプライシング制御を行うことができる点で、「スプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）」である。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１の少なくとも一部である標的領域と結合し得る。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３８または３９の少なくとも一部である標的領域と結合し得る。配列番号３８および３９で示される配列は、いずれも配列番号１の一部の領域の配列である。所定の「標的領域」とは、例えば、配列番号１、３８および３９のいずれかに示したmRNA前駆体の領域をいう。標的領域は、RESTにおいて、Ｎエキソンのスキッピングを誘導する活性に関連する領域であることが好ましい。本発明によるオリゴヌクレオチドでは、標的領域は、例えば、少なくとも１２塩基長であり、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５塩基長であるが、領域の塩基長はこれらに限定されない。核酸分子またはオリゴヌクレオチドが「標的領域と結合」とは、当該核酸分子またはオリゴヌクレオチドが標的領域全体と必ずしも２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成する必要はなく、REST　mRNA前駆体のプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導する活性を発揮する限り、標的領域の一部である領域と２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成するものであってもよい。REST　mRNA前駆体のＮエキソンのスキッピングを誘導する活性を有するオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１の少なくとも一部である標的領域のヌクレオチド配列と相補的であり、好ましくは完全な相補性を有する。
　本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、少なくとも１２塩基長であり、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５塩基長である。オリゴヌクレオチドが上記長さを有していることにより、REST　mRNA前駆体への結合およびＮエキソンのスキッピングの誘導をより効果的に行うことができる。
　本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、REST　mRNA前駆体のＮエキソンのスキッピングを誘導する活性を有するオリゴヌクレオドであって、例えば、配列番号１の塩基配列からなる標的領域における少なくとも１２塩基と相補的である配列を含む。オリゴヌクレオチドは、その全てが配列番号１の塩基配列からなる標的領域と相補的である必要はなく、例えばオリゴヌクレオチドの一部分は周辺領域（例えば、標的領域の５’末端側および／または３’末端側に１～５塩基延長した部分）（配列番号２に示す）と相補的であってもよい。配列番号３８および３９についても同様である。１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）のような、選定した標的領域に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列の設計は、当業者が通常用いる方法によって行われ得る。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列としては、例えば、以下に示す配列（５’→３’方向で示す）が挙げられる（[]内の数値は、そのオリゴヌクレオチドが標的とする配列を示し、ヒトREST　mRNA前駆体中の配列番号１の配列の５’末端の塩基を１とし、３’末端側方向への塩基数を＋（プラス）とみなした際の両端の位置により表した。なお、配列番号１の配列の末端から外れる塩基数を－（マイナス）値で表し、単に－の数値で表す場合は５’末端からの塩基数であり、－値と共に（３’）と記載する場合は３’末端からの塩基数である。）：
aatggtatccatacccca（配列番号３）[+1/+18]
accaaatggtatccatac（配列番号４）[+5/+22]
taaatattaccaaatggt（配列番号５）[+13/+30]
agtaaatattaccaaatg（配列番号６）[+15/+32]
ctctagtaaatattacca（配列番号７）[+19/+36]
cacactctagtaaatatt（配列番号８）[+23/+40]
agatcacactctagtaaa（配列番号９）[+27/+44]
atctagatcacactctag（配列番号１０）[+31/+48]
acccatctagatcacact（配列番号１１）[+35/-2(3’)]
atcacactctagtaaatatt（配列番号４０）[+23/+42]
cacactctagtaaatattac（配列番号４１）[+21/+40]
cactctagtaaatatt（配列番号４２）[+23/+38]
cacactctagtaaata（配列番号４３）[+25/+40]
ctagatcacactctagtaaa（配列番号４４）[+27/+46]
agatcacactctagtaaata（配列番号４５）[+25/+44]
atcacactctagtaaa（配列番号４６）[+27/+42]
agatcacactctagta（配列番号４７）[+29/+44]
agatcacactctagtaaatatt（配列番号４８）[+23/+44]
gatcacactctagtaaat（配列番号４９）[+26/+43]
　RESTのプロセシングにおけるＮエキソンスキッピングを誘導する活性を有する限り、上記配列の５’末端および／または３’末端にさらに１～数塩基（例えば２または３塩基）が付加または欠失されていてもよい。この付加塩基は、当該塩基が付加される配列の標的領域（配列番号１）に隣接する配列番号２（標的領域と隣接する領域との塩基配列を示す）に示される配列の塩基と相補的な塩基であり得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、天然ＤＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（非修飾オリゴヌクレオチド）および化学的に修飾されたＤＮＡを含有するオリゴヌクレオチドのいずれをも包含する。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更し得、例えば、標的核酸に対する親和性を高め得、または核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め得る。標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
　本発明によるオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含むものであってもよい。かかる糖修飾ヌクレオシドを含む場合、オリゴヌクレオチドを構成する全ヌクレオシドに対する糖修飾ヌクレオチドの数の割合は、例えば３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましく５０％以上である。この糖修飾ヌクレオシドは、その糖環の２’位と４’位との間に、例えば、以下に説明するような架橋部分を有する。
　１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドとして、以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含む：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　ここで、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ａは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
で表される二価の基であり、
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
　Ｒ２およびＲ３は一緒になって、－（ＣＨ２）ｑ－［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１１）Ｒ１２［式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し
　Ｒ９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　Ｒ１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
であるか、あるいは－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
である］であり；
　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
　ｍは、０から２の整数であり；
　ｎは、０から１の整数であり；
　Ｒ１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
である場合、ｐは１であり、かつＲ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
であり、あるいは
　Ｒ１０が－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
である］である場合、ｐは０であり；
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
　Ｙは酸素原子または硫黄原子である。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
で表される構造である。式（Ｉ－１）および（Ｉ－２）中のＢａｓｅ、Ｒ１、Ｘ、ｍおよびｎは、式（Ｉ）に関して上述したとおりである。２’位と４’位との間の架橋にアミド（－ＣＯＮＲ１－）が導入されており、このようなヌクレオシド構造を、アミド架橋型核酸、アミドBNA（Bridged Nucleic Acid）、またはAmNAともいう。
　式（Ｉ－１）および（Ｉ－２）において、Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基である。より好適には、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Ｒ１は、水素原子またはメチル基である。
　式（Ｉ－１）において、ｍは、０から２の整数であり；そして式（Ｉ－２）において、ｎは、０から１の整数である。すなわち、２’位、３’位、４’位、および架橋部分を含む環は、５員環～７員環を構成し得る。
　式（Ｉ－２）において、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基である。好適には、Ｘは、酸素原子またはアミノ基である。なお、Ｘがアミノ基またはメチレン基である場合、低級アルキル基で置換されていてもよい。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、上記式（Ｉ－１）で表される構造であり、そしてこの式（Ｉ－１）において、ｍは０であり、そしてＲ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。
　式（Ｉ－１）および（Ｉ－２）にてそれぞれ表される化合物においては、糖部の２’位のアミノ基と４’位から伸長したカルボニル基との間にアミド結合が形成されている。このように、構造的に揺らぎが少なくかつ親水性に優れるアミド結合を有するため、ヌクレオシドの糖部の構造が、架橋により固定化されている。
　上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造としては、上記式（Ｉ－１）および（Ｉ－２）に加えて、例えば、以下の（Ｉ－３）～（Ｉ－７）が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　上記の各式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびｐは、式（Ｉ）に関して上述したとおりである。式（Ｉ－７）は、2’,4’-BNAまたはLNA（Locked Nucleic Acid）（本明細書中、「2’,4’-BNA/LNA」または「LNA」とも記載する）と称されるヌクレオシド構造に該当する（一例として、Ｒ１３およびＲ１４がともに水素原子である）。式（Ｉ－３）は、2’,4’-BNA/LNAの架橋部分の６’位にスピロシクロプロパン基を導入した構造を有し、スピロシクロプロパン架橋型核酸（spcBNA）とも称される。式（Ｉ－４）は、2’,4’-BNA/LNAの架橋部分にグアニジンを導入した構造を有し、グアニジン架橋型核酸（GuNA）とも称される。なお、式（Ｉ－４）は、以下の式（Ｉ－４－１）（ｐ＝０である場合）および（Ｉ－４－２）（ｐ＝１である場合）を包含する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　上記「Ｂａｓｅ」は、プリン塩基（すなわち、プリン－９－イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
　上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、アデニニル基、グアニニル基、シトシニル基、ウラシリル基、およびチミニル基、ならびに６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が挙げられる。
　中でも、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
でそれぞれ表される基（すなわち、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基およびウラシリル基）、ならびに２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、６－アミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が好適であり、特に、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基およびチミニル基が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基およびアミノ基が保護基により保護されていることが好ましい。
　なお１つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドが、糖修飾ヌクレオシドとして上記式（Ｉ－４）あるいは式（Ｉ－４－１）または式（Ｉ－４－２）で表されるヌクレオシド構造を含む場合、これらの式（Ｉ－４）あるいは式（Ｉ－４－１）または式（Ｉ－４－２）で表されるヌクレオシド構造は、式（Ｉ－４）あるいは式（Ｉ－４－１）または式（Ｉ－４－２）内には表されていない薬学的に許容され得るアニオン（例えば、Ｚ－として表すことができる）によって電気的に中性に保持されている。このようなアニオンの例としては、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン）、リン酸イオンなどが挙げられる。
　上記のような糖修飾ヌクレオシド構造を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドは、例えば、糖修飾ヌクレオシド化合物を用いて、例えば、国際公開第２０１１／０５２４３６号、特開２０１４－０４３４６２号公報、国際公開第２０１４／０４６２１２号および国際公開第２０１５／１２５７８３号に記載されるような方法を用いて合成することができる。
　糖修飾ヌクレオシド化合物の例としては、以下の式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（ここで、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ａは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
で表される二価の基であり、
　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
　Ｒ２およびＲ３は一緒になって、－（ＣＨ２）ｑ－［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１１）Ｒ１２［式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；
　Ｒ９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　Ｒ１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
であるか、あるいは－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
である］であり；
　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
　ｍは、０から２の整数であり；
　ｎは、０から１の整数であり；
　Ｒ１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
である場合、ｐは１であり、かつＲ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
であり、あるいは
　Ｒ１０が－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
である］である場合、ｐは０であり；
　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり； 
　Ｙは酸素原子または硫黄原子であり；そして
　Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ２４）Ｒ２５［式中、Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたジアルキルアミノ基を表す］を表す）
が挙げられる。
　上記のような糖修飾ヌクレオシドから、糖修飾ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、三リン酸化は、M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008，vol.36, No.13，pp.4257－65に記載の方法に従って容易に行われ得る。
　上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾もまた利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、リン酸修飾、核酸塩基修飾が知られている。このような核酸修飾は、当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
　リン酸修飾としては、例えば、天然の核酸が有するリン酸ジエステル結合、Ｓ－オリゴ（ホスホロチオエート）、Ｄ－オリゴ（ホスホジエステル）、Ｍ－オリゴ（メチルフォスフォネイト）、ボラノホスフェート等が挙げられる。Ｓ－オリゴ（ホスホロチオエート）は、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のリン酸基部の酸素原子が硫黄原子で置換されたＰＳ骨格を有する。この修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。この修飾をオリゴヌクレオチド中に１もしくは複数もつアンチセンスオリゴヌクレオチドをＳ－オリゴ型（ホスホロチオエート型）ともいう。
　核酸塩基修飾としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
　本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、糖修飾ヌクレオシドの位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、互いに同じものを含むか、または異なるものを含む。糖修飾ヌクレオシドと非修飾ヌクレオシドとを用いてこれらが交互に位置するようにオリゴヌクレオチドを設計することができる。本発明のオリゴヌクレオチドに関しては、１～３残基の非修飾ヌクレオシドからなる領域に続いて糖修飾ヌクレオシドが配置されていることが好ましい。これにより、オリゴヌクレオチドが結合するＲＮＡがRNase Hを介して切断され難くなる。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（ここで、Ｒ１３およびＲ１４がともに水素原子である）；または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（ここで、ｍは０であり、そしてＲ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である）である。
　１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、上述した配列番号３～１１および配列番号４０～４９のいずれかの塩基配列により表される塩基配列を含み、かつその塩基の少なくとも１つが上記糖修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドとして、例えば、以下に示すものが挙げられる：
AmNA[+1/+18]
A(Y)^a^T(Y)^g^G(Y)^t^A(Y)^t^5(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^c^5(Y)^a（配列番号１８）
AmNA[+5/+22]
A(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^g^G(Y)^t^A(Y)^t^5(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^c（配列番号１９）
AmNA[+13/+30]
T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^g^G(Y)^t（配列番号２０）
AmNA[+15/+32]
A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^g（配列番号２１）
AmNA[+19/+36]
5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^a（配列番号２２）
AmNA[+23/+40]
5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号２３）
AmNA[+27/+44]
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a（配列番号２４）
AmNA[+31/+48]
A(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g（配列番号２５）
AmNA[+35/-2(3’)]
A(Y)^c^5(Y)^c^A(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t（配列番号２６）
　上記の配列において、小文字＝DNA、N(Y)＝AmNA、5(Y)＝AmNA_mC、^＝ホスホロチオエート化（PS骨格）である。
AmNA[+23/+42]：
A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号５３）
AmNA[+21/+40]：
5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c（配列番号５４）
AmNA[+23/+38]：
5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号５５）
AmNA[+25/+40]：
5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a（配列番号５６）
AmNA[+27/+46]：
5(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a（配列番号５７）
AmNA[+25/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a（配列番号５８）
AmNA[+27/+42]：
A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a（配列番号５９）
AmNA[+29/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a（配列番号６０）
AmNA[+23/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号６１）
AmNA[+26/+43]：
G(Y)^a^T(Y)^c^A(Y)^c^A(Y)^c^T(Y)^c^T(Y)^a^G(Y)^t^A(Y)^a^A(Y)^t（配列番号６２）
AmNA[+27/+44]_1/3：
A(Y)^g^a^T(Y)^c^a^5(Y)^a^c^T(Y)^c^t^A(Y)^g^t^A(Y)^a^a（配列番号６３）
　上記の配列において、小文字＝DNA、N(Y)＝AmNA、5(Y)＝AmNA_mC、^＝ホスホロチオエート化（PS骨格）である。
　また、上記配列の名称においては、[]内の数値は、そのオリゴヌクレオチドが標的とする配列を示し、ヒトREST pre-mRNA中の配列番号１の配列の５’末端の塩基を１とし、３’末端側方向への塩基数を＋（プラス）とみなした際の両端の位置により表した。なお、配列番号１の配列の末端から外れる塩基数を－（マイナス）値で表し、単に－の数値で表す場合は５’末端からの塩基数であり、－値と共に（３’）と記載する場合は３’末端からの塩基数である。
　本発明におけるオリゴヌクレオチドは、上述したような糖修飾ヌクレオシドおよび天然ヌクレオシドを用いて、常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、Applied Biosystems社製、株式会社ジーンデザイン製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Tetrahedron Letters，1981, vol. 22. pp.1859－1862、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２０１４／０４６２１２号、国際公開第２０１５／１２５７８３号等に開示されている。
（医薬組成物）
　本発明の医薬組成物は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有する。本発明の医薬組成物は、例えば、RESTのプロセシング（スプライシング）が関与する疾患の治療または予防に有用である。本発明の医薬組成物の対象疾患としては、例えば、癌疾患、心不全などが挙げられる。RESTのプロセシングに関連した癌疾患として、例えば、SRRM4が関与する癌（例えば、小細胞肺癌、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC））、乳癌）が挙げられる。このような癌疾患は、神経内分泌細胞に由来し得る。さらに本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有する癌治療薬を包含する。また、本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有する心不全治療薬を包含する。
　本発明の医薬組成物または癌治療薬または心不全治療薬（以下、まとめて「医薬組成物」等ともいう）の投与方法および製剤は、当該分野で公知の投与方法および製剤であれば、いずれも利用可能である。
　本発明の医薬組成物等は、局所的あるいは全身的な治療、または治療すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（例えば、点眼、膣内、直腸内、鼻腔内および経皮を含む）、経口的、または非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による気道を介した肺投与等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物等を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
　経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
　非経口投与用組成物としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物等は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
　本発明は、RESTのプロセシングの際にＮエキソンのスキッピングを誘導する方法を提供する。本発明はまた、RESTのプロセシングが関与する疾患の治療または予防のための方法も提供する。１つの実施形態では、これらの方法は、上述の対象疾患の治療または予防に用いられる。これらの方法は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む。「個体」とは、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスであり、さらに好ましくはヒトである。これらの方法においては、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量が投与される限り、投与方法および剤型は問わない。投与有効量は、投与される個体に依存するが、個体の性別、年齢、体重、症状等、ならびに投与の方法、経路、頻度などに応じて任意に定めることができる。投与方法等は上述したとおりである。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（実施例１：アンチセンスオリゴヌクレオチド合成）
　本発明に関連するオリゴヌクレオチドを、Tetrahedron Letters 22，1859-1862(1981)、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に記載される方法によって合成した。実施例１での設計に基づき、以下の式に示されるアミドBNA（AmNA）を含むオリゴヌクレオチドに関しては、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載の方法を参照して合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（式中、Ｂａｓｅは５－メチルシトシニル基、チミニル基、アデニニル基またはグアニニル基であり、Ｍｅはメチル基である。）。
　アミドBNA（AmNA）を含有する１８マー（mer）のオリゴヌクレオチドを、核酸自動合成機（ｎＳ－８型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイトプロトコール（固相担体：ＣＰＧレジン、ホスホロチオエート化（ＰＳ）骨格形成のための硫化はＤＤＴ（３Ｈ－１，２－ベンゾジシオール－３－オン，１，１－ジオキサイド）等を使用）にて実施し、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基で保護され、かつ３’位が固相に担持されたオリゴヌクレオチドを得た。次いで、酸処理によりＤＭＴｒ基を除去した後、塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した。希酸にて中和後、溶媒を留去し、得られた粗生成物をゲルろ過カラムクロマト、逆相ＨＰＬＣにて精製することにより目的物を得た。
　本実施例で使用したAmNAの架橋部分の構造、ならびに得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（BRUKER DALTONICS社製）により確認した。
（実施例２：ヒトREST pre-mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計）
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトREST遺伝子（NCBI Reference Sequence: NG_029447.1　Homo sapiens RE1 silencing transcription factor (REST), RefSeqGene on chromosome 4.）のpre-mRNA（mRNA前駆体）を標的とするよう設計した。
　標的領域の選定のため、アンチセンスで毒性発現するＣＧ、ＴＣＣ、ＴＧＣの逆配列（ＣＧ、ＧＧＡ、ＧＣＡ）を除外した。次いで、mfold（mfold：http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）を用いた二次構造予測に基づき、ループ構造などのアンチセンスオリゴヌクレオチドがアクセスしやすい領域を選定した。次いで、Blast（BLAST：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）を用いて、マウスで評価した結果に基づいてヒトへの適用を可能にするように、REST pre-mRNAについてヒトおよびマウスでの相同性の高い領域を中心に選択した。このようにして、１８種の候補配列を選定した。
　上記のように選定した候補配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さを１８マーとし、５’末端を、糖修飾ヌクレオシドを含む人工核酸（AmNA）として人工核酸とDNAとが交互になるように設計した。
　また、特にＮエキソンのスキッピングを誘導する活性が高い２種類の候補配列（AmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]）を元に、配列長を変更、AmNAと天然核酸の位置を入れ替え、および／またはAmNAの導入数を変更することで、新たに１１種の候補配列を選定した。
　以下に、設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（５’→３’方向）を示す：
AmNA[-44/-27]：
A(Y)^a^A(Y)^c^G(Y)^g^A(Y)^a^A(Y)^t^T(Y)^g^A(Y)^c^A(Y)^t^T(Y)^t（配列番号１２）
AmNA[-32/-15]：
T(Y)^g^5(Y)^a^T(Y)^a^G(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^a^A(Y)^a^A(Y)^c^G(Y)^g（配列番号１３）
AmNA[-24/-7]：
5(Y)^a^A(Y)^t^G(Y)^g^A(Y)^a^T(Y)^g^5(Y)^a^T(Y)^a^G(Y)^t^A(Y)^g（配列番号１４）
AmNA[-20/-3]：
G(Y)^g^T(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^t^G(Y)^g^A(Y)^a^T(Y)^g^5(Y)^a^T(Y)^a（配列番号１５）
AmNA[-18/-1]：
5(Y)^t^G(Y)^g^T(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^t^G(Y)^g^A(Y)^a^T(Y)^g^5(Y)^a（配列番号１６）
AmNA[-8/+10]：
5(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^c^5(Y)^a^5(Y)^t^G(Y)^g^T(Y)^c^5(Y)^a（配列番号１７）
AmNA[+1/+18]：
A(Y)^a^T(Y)^g^G(Y)^t^A(Y)^t^5(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^c^5(Y)^a（配列番号１８）
AmNA[+5/+22]：
A(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^g^G(Y)^t^A(Y)^t^5(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^c（配列番号１９）
AmNA[+13/+30]：
T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^g^G(Y)^t（配列番号２０）
AmNA[+15/+32]：
A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^g（配列番号２１）
AmNA[+19/+36]：
5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^a（配列番号２２）
AmNA[+23/+40]：
5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号２３）
AmNA[+27/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a（配列番号２４）
AmNA[+31/+48]：
A(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g（配列番号２５）
AmNA[+35/-2(3’)]：
A(Y)^c^5(Y)^c^A(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t（配列番号２６）
AmNA[+43/-10(3’)]：
G(Y)^a^A(Y)^t^A(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^c^A(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g（配列番号２７）
AmNA[-5(3’)/-22(3’)]：
T(Y)^a^5(Y)^a^T(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^c^5(Y)^t^G(Y)^a^A(Y)^t^A(Y)^c（配列番号２８）
AmNA[-17(3’)/-34(3’)]：
G(Y)^c^A(Y)^t^A(Y)^a^G(Y)^a^G(Y)^t^A(Y)^a^T(Y)^a^5(Y)^a^T(Y)^t（配列番号２９）
AmNA[+23/+42]：
A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号５３）
AmNA[+21/+40]：
5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t^A(Y)^c（配列番号５４）
AmNA[+23/+38]：
5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号５５）
AmNA[+25/+40]：
5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a（配列番号５６）
AmNA[+27/+46]：
5(Y)^t^A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a（配列番号５７）
AmNA[+25/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a（配列番号５８）
AmNA[+27/+42]：
A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a（配列番号５９）
AmNA[+29/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a（配列番号６０）
AmNA[+23/+44]：
A(Y)^g^A(Y)^t^5(Y)^a^5(Y)^a^5(Y)^t^5(Y)^t^A(Y)^g^T(Y)^a^A(Y)^a^T(Y)^a^T(Y)^t（配列番号６１）
AmNA[+26/+43]：
G(Y)^a^T(Y)^c^A(Y)^c^A(Y)^c^T(Y)^c^T(Y)^a^G(Y)^t^A(Y)^a^A(Y)^t（配列番号６２）
AmNA[+27/+44]_1/3：
A(Y)^g^a^T(Y)^c^a^5(Y)^a^c^T(Y)^c^t^A(Y)^g^t^A(Y)^a^a（配列番号６３）
　上記配列において、小文字はDNAを表し、N(Y)はAmNAを表し、5(Y)はAmNA_mCを表し、^はホスホロチオエート化されたこと（PS骨格）を表す。
　また、上記配列の名称において、[]内の数値は、そのオリゴヌクレオチドが標的とする配列を示し、ヒトREST pre-mRNA中の配列番号１の配列の５’末端の塩基を１として、３’末端側方向への塩基数を＋（プラス）とみなした際の両端の位置により表した。なお、配列番号１の配列の末端から外れる塩基数を－（マイナス）値で表し、単に－の数値で表す場合は５’末端からの塩基数であり、－値と共に（３’）と記載する場合は３’末端からの塩基数である。
　なお、「ホスホロチオエート化」とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）としたことをいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にＳ－オリゴヌクレオチドという。
（実施例３：SCLC細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果の評価）
　実施例２で設計したうち１０種のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ヒトSCLC細胞（STC1）におけるインビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、sREST／REST発現比率を求めた。sREST／REST発現比率が低いほどＮエキソンスキップが生じていると判断し、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。
　STC1細胞（1.0×106細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（1.0nmol）をエレクトロポレーションで導入後、２４時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。コントロール（モック）として、滅菌水を使用した。
　結果を図１に示す。本結果に基づいて、スプライシング制御オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）をさらにスクリーニングした。
（実施例４：前立腺がんVCaP細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果の評価）
　SCLC細胞で異常発現しているSRRM4は内分泌性前立腺がん(NEPC)にも発現している。そこで適応をより拡大するために、SRRM4の発現が確認されている前立腺がん細胞株（VCaP）について評価した。
　VCaP細胞（1.0×106細胞）を培養２４時間後、リポフェクション法により被験オリゴヌクレオチドを導入後、４８時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。実施例３と同様にsREST／REST発現比率を求め、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。
　結果を図２に示す。例えば、オリゴヌクレオチドAmNA[+1/+18]、AmNA[+5/+22]、AmNA[+13/+30]、AmNA[+15/+32]、AmNA[+19/+36]、AmNA[+23/+40]、AmNA[+27/+44]、AmNA[+31/+48]およびAmNA[+35/-2(3’)]でsREST／REST発現比率は１より低く、Ｎエキソンスキッピング効果が確認された。
　本実施例により、オリゴヌクレオチドによるスプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果は、SCLC細胞だけでなくVCaP細胞でも確認された。スプライシング制御効果を確認したアンチセンスオリゴヌクレオチドをスプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）と称する。
（実施例５：SCLC細胞におけるスプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）のRESTスプライシング制御と細胞生存率評価）
　H146細胞（1.0×106細胞）にSSO（AmNA_[+31/+48]）（0.1、1.0、2.0nmol）およびコントロールのAmNA_26をエレクトロポレーションにより導入し、96時間後に細胞を回収した。RNAを抽出し、β-actinとRESTとの各プライマーでRT-PCR後ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりRESTとsRESTの解析を行った。
　まず、RESTスプライシングは、H146細胞（1.0×106細胞）に対してコントロールのAmNA_26（0.1、1.0nmol）ではRESTのバンドに変化はなかったが、AmNA_[+31/+48]ではsRESTが減少し、RESTのバンドの濃さが増加した（図３Ａ）。
　また細胞生存率は、H146細胞（1.0×106細胞）に対してコントロールのAmNA_26（0.1、1.0nmol）では用量増加による変化はなかったが、AmNA_[+31/+48]（2.0nmol）では細胞生存率は78.2%に低下した（図３Ｂ）。
（実施例６：スプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）のRESTスプライシング制御の濃度依存性評価）
　１２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、種々の濃度で前立腺癌細胞（VCaP）に添加し、インビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、sREST／REST発現比率を求め、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。
　VCaP細胞（1.0×106細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（2.5nM、5nM、10nM）をエレクトロポレーションで導入後、72時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。コントロール（モック）として、滅菌水を使用した。
　結果を図４に示す。本結果より、SSOによるＮエキソンスキッピング促進効果は濃度依存性を示したことが分かる。
（実施例７：スプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）のRESTスプライシング制御の濃度依存性評価２）
　実施例６と同様の実験を、細胞の播種数およびSSOの導入方法を変えて行った。１２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、種々の濃度で前立腺癌細胞（VCaP）に添加し、インビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、「％exclusion」を求め、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。「％exclusion」は、オリゴヌクレオチドの「RESTのバンドの濃さとsRESTのバンドの濃さの和」に対するRESTのバンドの濃さの比率である。
　VCaP細胞（1.0×105細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（2.5nM、5nM、10nM）をリポフェクション法で導入後、48時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。コントロール（モック）として、滅菌水を使用した。
　結果を図５に示す。本結果より、細胞の播種数を1/10としてもSSOによるＮエキソンスキッピング促進効果は濃度依存性を示したことが示された。Ｎエキソンスキッピング促進効果は、オリゴヌクレオチドの「％exclusion」を、コントロール（SSO無添加）の「％exclusion」で除することで算出した「相対的なエキソンスキッピング活性」で示した。
（実施例８：スプライシング制御オリゴヌクレオチド（AmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]）のRESTスプライシング制御の濃度依存性評価）
　実施例７で相対的なエキソンスキッピング活性が高いことが示されたAmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]について、さらに濃度を細かく振ってスプライシング制御効果を検証した。上記SSOについて、種々の濃度で前立腺癌細胞（VCaP）に添加し、インビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、「％exclusion」を求め、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。
　VCaP細胞（1.0×105細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM）をリポフェクション法で導入後、48時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。コントロール（モック）として、滅菌水を使用した。
　結果を図６に示す。本結果より、AmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]によるＮエキソンスキッピング促進効果は、濃度依存性を示し、また0.1nMの低濃度でも効果を発揮することが示された。Ｎエキソンスキッピング促進効果は、オリゴヌクレオチドの「％exclusion」を、コントロール（SSO無添加）の「％exclusion」で除することで算出した「相対的なエキソンスキッピング活性」で示した。
（実施例９：スプライシング制御オリゴヌクレオチド（AmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]）のEC50解析）
　実施例７で相対的なエキソンスキッピング活性が高いことが示されたAmNA[+23/+40]（AmNA_2340）およびAmNA[+27/+44]（AmNA_2744）について、EC50(50%効果濃度)を解析した。上記SSOについて、種々の濃度で前立腺癌細胞（VCaP）に添加し、インビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、「％exclusion」を求め、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。
　VCaP細胞（1.0×105細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM）をリポフェクション法で導入後、48時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。各濃度での「相対的なエキソンスキッピング活性」を算出し、グラフにプロットして、曲線回帰を行った。
　結果を図７に示す。本結果より、AmNA[+23/+40]およびAmNA[+27/+44]のEC50は、いずれも1nM以下であり、これらのSSOは低濃度で効果を発揮することが期待される。
（実施例１０：スプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）の最適化検討）
　実施例７で相対的なエキソンスキッピング活性が高いことが示されたAmNA[+23/+40]（AmNA_2340）およびAmNA[+27/+44]（AmNA_2744）を元に、配列長を変更、AmNAと天然核酸の位置を入れ替え、および／またはAmNAの導入数を変更することで、SSOの最適化を検討した。検討したSSOの配列長等の概要を図８に示す。また、ネガティブコントロールのSSOの検討も行った。AmNA[+35/-2]のATGC比及び人工核酸導入率(各塩基ごと)を変化させずにスクランブル配列を4配列設計（表１）し、VCaP細胞（1.0×105細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（10nM）をリポフェクション法で導入後、48時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。コントロール（モック）として、滅菌水を使用した。結果を図９に示す。その中で最もNTやmockと同等の活性を示す(すなわち%exclusionが1に近い)NC3を選出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　上記配列において、小文字はDNAを表し、N(Y)はAmNAを表し、5(Y)はAmNA_mCを表し、^はホスホロチオエート化されたこと（PS骨格）を表す。
　上記SSOについて、1.0nMの濃度で前立腺癌細胞（VCaP）に添加し、インビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、「％exclusion」を求め、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。コントロール（モック）として、滅菌水を、コントロール（NC）として、NC3を使用した。
　結果を図１０および１１に示す。本結果より、本実施例で用いた大部分のSSOは、1.0nMの濃度で相対的なエキソンスキッピング活性を発揮すること、およびAmNA_2340およびAmNA_2744よりも高い相対的なエキソンスキッピング活性を示すSSO（AmNA[+23/+42]（AmNA_2342）、AmNA[+21/+40]（AmNA_2140）、AmNA[+23/+44]（AmNA_2344）、AmNA[+26/+43]（AmNA_2643））が得られた。図１２に本実施例の結果をまとめた。
（実施例１１：22Rv1細胞におけるスプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）のRESTスプライシング制御評価）
　AmNA[+23/+40]（AmNA_2340）およびAmNA[+27/+44]（AmNA_2744）、ならびに実施例１０でスプライシング制御効果が示されたAmNA[+21/+40]（AmNA_2140）およびAmNA[+23/+44]（AmNA_2344）について、異なる細胞種でも同様にスプライシング制御効果を有するか否かを検証した。本実施例で用いた細胞は22Rv1であり、該細胞は、マウスで連続的に増殖した異種移植片に由来するヒト前立腺癌上皮細胞株である。上記SSOについて、1.0nMの濃度で前立腺癌細胞（22Rv1）に添加し、インビトロでのRESTおよびsRESTの発現をRT-PCR法により調べ、「％exclusion」を求め、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を評価した。
　22Rv1細胞（1.0×105細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（1.0nM）をリポフェクション法で導入後、48時間後に細胞を回収し、定法に基づいて解析を行った。コントロール（モック）として、滅菌水を、コントロール（NC）として、NC3を使用した。
　結果を図１３に示す。本結果より、AmNA_2340、AmNA_2744、AmNA_2140およびAmNA_2344はいずれも、22Rv1細胞についても高い相対的なエキソンスキッピング活性が示された。
（実施例１２：スプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）によるSRRM4の遺伝子発現への影響の検証）
　AmNA_2340、AmNA_2744、AmNA_2140およびAmNA_2344を細胞に投与することで、SRRM4の遺伝子発現に対して影響を与えるか否かを検証した。SRRM4遺伝子は、RESTが発現を制御するRE１配列を有し、RESTの高発現はSRRM4遺伝子発現を抑制する。さらに、SRRM4タンパク質は、REST pre-mRNAのスプライシングを制御するタンパク質であり、SCLCでは、SRRM4タンパク質によりsRESTが高発現することが知られている（図１５）。
　22Rv1細胞（1.0×105細胞）に対して被験オリゴヌクレオチド（1.0nM）をリポフェクション法で導入後、48時間後に細胞を回収し、RT-PCRによりコントロール（SSO無添加）と比較した相対的なSRRM4 mRNAの発現量を測定した。コントロール（モック）として、滅菌水を、コントロール（NC）として、NC3を使用した。
　結果を図１４に示す。本結果より、スプライシング制御（Ｎエキソンスキッピング）効果を有するSSOは、SRRM4 mRNAの発現を抑制し得る(AmNA_2140ではmRNA量を約30%低減させた)ことが示された。
（実施例１３：In vivoにおける抗腫瘍効果の評価）
　実施例１２で高いスプライシング効果およびSRRM4 mRNAの発現抑制効果を有するAmNA_2140について、in vivoで抗腫瘍効果を発揮するか検証した。コントロールとして、生理食塩水を使用した。腫瘍細胞をマウスに移植後（0日目）、3日目、6日目、9日目及び12日目に、体重(g)、腫瘍の長径(mm)、短径(mm)、腫瘍サイズ（体積）(mm3)を測定した。腫瘍サイズは、長径×短径2を2で除することで算出した。結果を図１６および表２に示す。それぞれ、n=1である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　図１６および表２より、AmNA_2140はin vivoにおいて抗腫瘍効果を発揮することが示された。
　本実施例で採用した手順を以下に説明する。
（細胞培養）
　細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC)より購入した。SCLC細胞（H146、H209）は浮遊細胞、前立腺がん細胞（VCaP、22Rv1）は接着細胞として培養した。培地はRPMI-1640（4,500mg/lグルコース、L-グルタミン、フェノールレッド、HEPES、ピルビン酸ナトリウム含有：Ref 187-02705：LOT ESH7003）にFBS（GibcoTMウシ胎児血清, qualified, Brazil：Ref 10270106：LOT 42F0288K）を10%となるように添加した。インキュベーター内は37℃、5%CO2とした。使用した細胞株は以下の通りである。SCLC細胞株：H146（HTB-173）、H209（HTB-172）、前立腺がん細胞株：VCaP（CRL-2876）、22Rv1（CRL-2505）
（トランスフェクション）
ASOのSCLC細胞へのトランスフェクション：
　SCLC細胞（0.5×106細胞）をNeon（登録商標）Transfection System（Thermo Fisher Scientific社製）を使用し、添付文書に従ってトランスフェクションした。エレクトロポレーションのパラメーターについては最適化の結果、パルス電圧：1200V、パルス幅：20ms、パルス数：2 pulsesを選択した。
ASOの前立腺がん細胞へのトランスフェクション：
　qRT-PCRによるSRRM4の発現解析では、トランスフェクションの24時間前に6-well plateに0.5×106細胞を1750μlのRPMI-1640で播種した。LipofectamineTM 3000（Thermo Fisher Scientific社製）が7.5μl/well、その他の項目は添付文書に従って調製したSRRM4-ASOとLipofectamineTM 3000 Reagentとの複合液250μlを各wellに添加した。24-well plateについては、トランスフェクション24時間前に0.1×106細胞を450μlのRPMI-1640で播種した。LipofectamineTM 3000（Thermo Fisher Scientific社製）が1.5μL/well、その他の項目は添付文書に従って得た複合液50μlを各wellに添加した。細胞生存率の評価では、トランスフェクションの24時間前に96-well plateに5.0×104細胞を100μlのRPMI-1640で播種した。LipofectamineTM 3000（Thermo Fisher Scientific社製）が0.3μl/well、その他の項目は製造元の指示に従って調製したSRRM4-ASOとLipofectamineTM 3000の複合液10μlを各wellに添加した。
（Total RNA抽出・cDNA合成）
　Total RNAの抽出については、RNeasy Plus Micro Kit（Qiagen）を用い、手順は添付文書に従い実施した。Total RNAを260nmで分光光度的に定量し、100ng/16μlとなるようにRNase-free waterで調整した後、SuperScript VILO（Thermo Fischer Scientific社製）を4μl加えて逆転写反応（42℃、60分間）を実施した。
（RT-qPCR法によるmRNAの発現解析）
　定量PCRについては、StepOnePlusTM Real-Time PCR Systems（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。マスターミックスについてはTaqManTM Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific社製)を使用して調製した。SRRM4については、各プライマーを20μlの反応液中に10pmolで調製した。β-actinについては、TaqManTM β-Actin Detection Reagents (Thermo Fisher Scientific社製)の添付文書に従って調製した。逆転写反応より得たcDNAの1/100をqRT-PCRで解析した。反応条件については、９５℃で２０秒、９５℃で３秒、６０℃で３０秒を４０サイクルで実施した。相対的なmRNAレベルをβ-actineで補正し、ΔＣｔ値により－ΔΔＣｔ法にて解析した。すべての実験は3回以上実施し、平均値±SDを算出した。統計的有意性をｔ検定によって算出した。PCR産物について、アガロースゲル電気泳動およびシーケンス解析を行った：
hSRRM4 For.Primer：5'-tgacaaagacttgacaccacc-3'（配列番号３０）；
hSRRM4 Rev.Primer：5'-acctgcgtcgcttgtgttt-3'（配列番号３１）；
TaqMan Probe：5'-FAM-aggtcctcatcctatagcccatcgcct-TAMRA-3'（配列番号３２）
（RT-PCR法によるmRNAの発現解析）
　RT反応で得たcDNAの1/10を、Hot Start Taq DNAポリメラーゼ（New England Biolabs社製）を用いて増幅した。反応条件については、９５℃で３０秒、９５℃で１５秒、５８℃で１５秒、６８℃で３０秒をβ-actinでは２０サイクル、RESTおよびsRESTでは３５サイクル行った後、６８℃で２分間実施した。各プライマーを２５μＬの反応液中に各５pmolとなるように調製した。PCR産物については、5％Mini-PROTEAN TBE Precast Gels（BIO RAD）を使用して電気泳動を行った。泳動バッファーについては10×Tris-Borate-EDTA Buffer(ナカライテスク株式会社製）を0.5倍に希釈して使用した。
　泳動装置には、Mini-PROTEAN Tetra System（BIO RAD）を用いた。ゲルの撮影とバンドの定量にはI Bright FL1500 Imaging Systemを使用した。単位面積あたりのバンドの輝度を表す値をI Bright FL1500 Imaging Systemの機能を使用して画像より定量し、sRESTとRESTの値の合計に対するRESTの値を評価の指標とした。この値は%exclusionとして図３Ｂに示している。また、プライマー配列は以下の通りであった：
REST For.Primer：5'-gaacgcccatataaatgtgaa-3'（配列番号３３）；
REST Rev.Primer：5'-tttgaagttgcttctatctgctgt-3'（配列番号３４）；
β-actin For.Primer：5'-ggccgtcttcccctccatcg-3'（配列番号３５）；
β-actin Rev.Primer：5'-ccagttggtgacgatgccgtgc-3'（配列番号３６）
（細胞生存率の評価）
　細胞の生存率の評価を、WST8（Cell Counting Kit-8、Dojindo）を使用し添付文書に従って実施した。細胞を７２時間培養した後、試薬を添加しInfinite M1000（Tecan）を使用して、４５０ｎｍの吸光度を分析した。アッセイを３回以上実施し、再現性を確認した。
（ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド）
　SRRM4 mRNAを標的とするアンチセンスDNAについては、株式会社ジーンデザインによって合成および精製されたものを使用した。
　配列を以下の表３に示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
（EC50解析）
　実施例９で得られたデータをグラフ作成ソフトGraphPad Prismに導入し、4 Parameter Logistic(4PL)によって曲線回帰を行い、EC50を算出した。
（in vivoにおける抗腫瘍効果評価）
　７週齢のBALB/c Slc-nu/nuヌードマウス（雄）にhSCLC細胞（N417, 1×10６細胞）をマウス背部に皮下移植し、腫瘍を形成させた。移植11日後に、マウスにSSO(AmNA_2140)を腹腔内投与した。腹腔内投与（10 mg/kg）は3日ごと、計4回行った。コントロールとして、生理食塩水を投与した。SSOの投与から12日後までマウスの腫瘍サイズについて観察を行った。得られた腫瘍サイズの経時変化をグラフ化し、生理食塩水を投与したコントロール群の腫瘍サイズの増大に対して、SSO投与群では腫瘍サイズの増大を抑える効果を確認した。
　本発明は、例えば、癌治療のための医薬品の製造に有用である。
　本出願は、日本で出願された特願2021-29327（出願日：２０２１年２月２５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　配列番号１の塩基配列からなる標的領域中の少なくとも１２塩基の連続する配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、かつヒトREST pre-mRNAのプロセッシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導する、オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  2. 　前記オリゴヌクレオチドの長さが１２～３５塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  3. 　前記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩が、以下の式（Ｉ）で表される、ヌクレオシド構造：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（Ｉ）中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ａは、以下：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される二価の基であり、
    　Ｒ１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
    　Ｒ２およびＲ３は一緒になって、－（ＣＨ２）ｑ－［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
    　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１１）Ｒ１２［式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
    　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
    　Ｒ８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；
    　Ｒ９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
    　Ｒ１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     であるか、あるいは－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９［式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     である］であり；
    　Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
    　ｍは、０から２の整数であり；
    　ｎは、０から１の整数であり；
    　Ｒ１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     である場合、ｐは１であり、かつＲ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     であり、あるいは
    　Ｒ１０が－（Ｃ＝（ＮＨＲ１７）＋）－ＮＲ１８Ｒ１９である場合、ｐは０であり；
    　Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
    　Ｙは酸素原子または硫黄原子である）
    の少なくとも１つを含む、
    　請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  4. 　前記オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド間の結合が、ホスホロチオエートを含む、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  5. 　前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号３～１１および配列番号４０～４９のいずれかの塩基配列を含む、請求項１から４に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  6. 　前記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （ここで、Ｒ１３およびＲ１４がともに水素原子である）；または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （ここで、ｍは０であり、そしてＲ１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である）
    で表される、請求項１から５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含む、医薬組成物。
  8. 　癌治療薬である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　小細胞肺癌、前立腺癌および乳癌よりなる群から選択される少なくとも１つの癌の治療に用いられる、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　心不全治療薬である、請求項７に記載の医薬組成物。
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