JP6233903B2 - 架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。より詳細には、一本鎖ＲＮＡに対する高い結合親和性およびヌクレアーゼに対する高い耐性を有する架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。

核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマー、ｓｉＲＮＡなどがある。このうち、アンチセンス法は、疾病に関わるｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより、病原ＲＮＡの翻訳過程を阻害し、疾病の治療や予防を行う手法である。ｓｉＲＮＡもこれに類似しており、生体に投与した二重鎖ＲＮＡによりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する。一方、アンチジーン法は、病原ＲＮＡを転写するＤＮＡ部位に対応する三重鎖形成オリゴヌクレオチドを外部から導入することによりＤＮＡからＲＮＡへの転写を抑制する。また、アプタマーは、短い核酸分子（オリゴヌクレオチド）であるため、疾病の原因となるタンパク質などの生体成分と結合することにより機能を発揮する。

こうした核酸医薬の素材として、種々の人工核酸が開発されているが、未だ切札となるべき分子が存在しない。例えば、これまでに開発されてきた核酸医薬の素材として、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）、２’，４’−ＢＮＡ（bridged nucleic acid）／ＬＮＡ（locked nucleic acid）（特許文献１〜３および非特許文献１〜４参照）などがある。Ｓ−オリゴは、サイトメガロウイルスに対するアンチセンス医薬品として、既に米国で上市されている。これは、高いヌクレアーゼ耐性を有するものの、標的核酸鎖への結合親和性が低いという難点を有しており、改善が必要である。これまでに開発されている２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡは、いずれも標的核酸鎖への結合親和性が高く、これからの核酸医薬の素材として最も期待される分子である。しかし、ヌクレアーゼへの耐性が十分ではなく、生体内での安定性という点で改良の余地を残している。

さらに、近年では、以下の式ａおよび式ｂに示すようなヌクレオシド構造を有するオリゴヌクレオチド：

についても当該素材に応用することが提案されている（特許文献４）。

しかし、上記式ａおよび式ｂに示すような構造のベースとなるヌクレオシド自体の製造には、非常に煩雑な工程を要する。このため、このようなオリゴヌクレオチドと同等またはそれ以上の性能を有し、かつ工業的な生産効率が一層優れたオリゴヌクレオチドの開発が所望されている。

国際公開第９８／３９３５２号 国際公開第２００５／０２１５７０号 国際公開第２００３／０６８７９５号 国際公開第２００９／００６４７８号

C.Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁 Y.Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁 K.Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁 S.M.A.Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁 M.Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁 S.Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁

本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けにくく、標的のｍＲＮＡに対する高い結合親和性および特異性を有し、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス法や核酸医薬用の新規な分子であって、生産性に優れた当該分子を提供することにある。

本発明は、以下の式Ｉで表される化合物またはその塩：

（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；そして
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表す）である。

１つの実施形態では、上記式Ｉにおいて、上記Ｂａｓｅは、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。

１つの実施形態では、上記式Ｉにおいて、上記Ｂａｓｅは、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。

１つ実施形態では、上記式Ｉにおいて、Ｒ^６およびＲ^７はともに水素原子である。

本発明はまた、以下の式ＩＩで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：

（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、そして
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表す）である。

１つの実施形態では、上記式ＩＩにおいて、Ｒ^６およびＲ^７はともに水素原子である。

本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の製造方法であって、
以下の式Ｉで表される化合物またはその薬理学上許容される塩：

（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；そして
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表す）
を用いてオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する、方法である。

本発明によれば、新規な２’，４’−架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供される。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する一本鎖ＲＮＡに対する結合親和性と、ＬＮＡを上回るヌクレアーゼ耐性とを有する。特に、一本鎖ＲＮＡに対して、Ｓ−オリゴよりも非常に強い結合親和性を有するため、核酸医薬への応用が期待される。本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、従来と比較して、より簡便な反応プロセスを通じて製造することができるため、工業的な生産効率を一層高めることも可能である。

５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドについて、一本鎖オリゴＲＮＡ標的鎖に対して形成した二重鎖ハイブリッドが解離するＴ_ｍ曲線を示すグラフである。 ５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。 実施例７で行ったマウスへのオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ投与における標的ｍＲＮＡのノックダウン効率の結果を示すグラフである。 実施例７で行ったマウスへのオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ投与における肝毒性の結果を示すグラフである。 実施例８で行った種々の濃度のオリゴヌクレオチドを用いたＮＭｕＬｉ細胞における相対Ｐｔｅｎ ｍＲＮＡ発現レベルの結果を示すグラフである。

まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６〜１０の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３〜１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６〜１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３〜１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４−アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。

本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。

本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。

本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」などが挙げられる。

より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２−トリクロロエチル基などが挙げられる。１〜３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。

「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基または２−プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。

本明細書において、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ^４がＯＲ^４ａそしてＲ^５がＮＲ^５ａとして表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式−Ｐ（ＯＣ_２Ｈ_４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）で表される基、または式−Ｐ（ＯＣＨ_３）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。

本明細書において、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものをいう。

本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。

本明細書において、用語「その塩」とは、本発明の式ＩまたはＩＩで表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。

本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」としては、本発明の式ＩＩで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。

以下、本発明について詳述する。

本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドまたはその塩（好ましくは薬理学上許容される塩）（以下、特に明記しない限り、用語「２’，４’−架橋型ヌクレオシド」は、２’，４’−架橋型ヌクレオシドそれ自体、２’，４’−架橋型ヌクレオシドの塩、２’，４’−架橋型ヌクレオシドの薬理学上許容される塩を包含して言う）は、以下の式Ｉ：

（式中、
「Ｂａｓｅ」は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基（好ましくは、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から９のアリール基）、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；そして
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表す）で表される構造を有する。

上記式Ｉにおいて、「Ｂａｓｅ」は、プリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。

上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。

中でも、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：

でそれぞれ表される、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）が好適であり、特に、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基が保護基により保護されていることが好ましい。

さらに上記式（Ｉ）において、Ｒ^６およびＲ^７の組合せの１つの例としては、Ｒ^６およびＲ^７がともに水素原子である場合が挙げられる。あるいは、Ｒ^６およびＲ^７の組合せの他の例としては、クリンコビッチ反応で用いる直鎖または分岐鎖状のグリニャール試薬の種類や添加するアルケンの種類に応じて作成可能なものであって、例えば、式（Ｉ）が以下：

；ならびに

で表すことのできる組合せが挙げられる。

本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造の６’位に、例えば、スピロシクロプロパン基が導入されていることにより、後述するオリゴヌクレオチドにおける酵素耐性能が向上する。また、このようなシクロプロパン基における環のひずみは、糖部のコンホメーションに直接的に影響を及ぼすものである。このため、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、得られたオリゴヌクレオチドに対し、当該影響によるｓｓＲＮＡとの結合親和性をも一層向上させ得る。さらに、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、その合成において、架橋構造の６’位へのスピロシクロプロパン基の導入に、公知の反応（クリンコビッチ反応）が容易に利用され得る。スピロシクロプロパン基の少なくとも１部が置換された、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドも同様である。このため、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、６’位にメチル基、メトキシメチル基などの他の置換基を導入する従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡと比較しても一層効率的に合成することができる。

本発明において、オリゴヌクレオチド（２’，４’−架橋型人工ヌクレオチド）は、このような２’，４’−架橋型ヌクレオシドを用いて調製することができる。例えば、三リン酸化は、非特許文献５に記載の方法に従って容易に行われ得る。

本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、以下の式ＩＩで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含む：

（式中、「Ｂａｓｅ」、Ｒ^６、およびＲ^７は、上記式Ｉで定義されるものと同様である）。

本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。

このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチド類縁体（アンチセンス分子）は、従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを用いる場合と比較して、酵素耐性能が飛躍的に向上する。また、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵するｓｓＲＮＡ結合親和性を有する。

これらのことから、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子）としての有用性が期待される。

特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。

本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１：２’，４’−架橋型ヌクレオシドの合成（１）：スピロシクロプロパンＢＮＡ−Ｔ（ｓｃｐＢＮＡ−Ｔ）アミダイトブロックの合成）

（１）化合物２の合成

窒素気流下、化合物１（７．３８ｇ，１８．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）に、デス−マーチンペルヨージナン（９．４１ｇ，２２．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４０分間撹拌した。反応終了後、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和重曹水（２：１（ｖ／ｖ））を０℃にて添加し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、ジエチルエーテルを添加し、水と飽和食塩水とで洗浄した。次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物２（７．６１ｇ，定量的）を無色油状物質として得た。

得られた化合物２の物性データを表１に示す。

（２）化合物３の合成

上記で得られた化合物２（７．６１ｇ，１９．１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１０ｍｍＬ）に、リン酸二水素ナトリウム（０．２Ｍ水溶液, ２０ｍＬ，３．８２ｍｍｏｌ）と過酸化水素水（３０重量％，２．３ｍＬ，２１．０ｍｍｏｌ）を添加した。これに亜塩素酸（０．７５Ｍ水溶液，３８ｍＬ，２８．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した後、室温で１時間撹拌した。次いで、反応溶液に亜硫酸ナトリウム（４．８ｇ，１９．１ｍｍｏｌ）を０℃にて添加し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して化合物３（７．６１ｇ，９６％）を白色固体として得た。

得られた化合物３の物性データを表２に示す。

（３）化合物４の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物３（７．６１ｇ，１８．４ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）に、重曹（１５．４ｇ，１８４ｍｍｏｌ）とヨードメタン（２．８６ｍＬ，４５．９ｍｍｏｌ）と添加し、２０時間撹拌した。反応終了後、これに飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液と水とを添加し、ジエチルエーテルで抽出した。水と飽和食塩水とで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して、化合物４（７．３５ｇ，９３％）を白色固体として得た。

得られた化合物４の物性データを表３に示す。

（４）化合物５の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物４（５００ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（１４ｍＬ）にオルトチタン酸テトライソプロピル（０．３５ｍＬ，１．１７ｍｍｏｌ）とエチルマグネシウムブロミド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，５．８３ｍＬ，５．８３ｍｍｏｌ）を０℃にて添加し、室温で１８時間撹拌した。反応終了後、これに飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、１０分間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物５（０．４４２ｇ，８９％）を赤色ペースト状物質として得た。

得られた化合物５の物性データを表４に示す。

（５）化合物６の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物５（２．５５ｇ，５．９９ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（２．０９ｍＬ，１８．０ｍｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（２．７５ｍＬ，１２．０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。次いで、これに飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出後、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１５（ｖ／ｖ）→１：５（ｖ／ｖ））により精製し、化合物６（２．９２ｇ，９０％）を黄色油状物質として得た。

得られた化合物６の物性データを表５に示す。

（６）化合物７の合成

上記で得られた化合物６（８．０４ｇ，１４．９ｍｍｏｌ）の酢酸溶液）１７．０ｍＬ，０．３０ｍｏｌ）に無水酢酸（２８．２ｍＬ，０．３０ｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（３．２０ｍＬ，４４．７ｍｍｏｌ）とを添加し、室温で５時間撹拌した。これに飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出後、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物７（９．４３ｇ，粗生成物）を赤褐色油状物質として得た。この化合物７を、精製することなく即座に次の反応に用いた。

（７）化合物８の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物７（９．４３ｇ，粗生成物）の無水アセトニトリル溶液（１４０ｍＬ）にチミン（５．６３ｇ，４４．６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（２５％アセトニトリル溶液，１８．２ｍＬ，７４．３ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４．０３ｍＬ，２２．３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、８０℃で２時間撹拌した。反応終了後、これに飽和重曹水を０℃にて添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物８（８．２６ｇ）を赤褐色油状物質として得た。

得られた化合物８の物性データを表６に示す。

（８）化合物９の合成

上記で得られた化合物８（８．２６ｇ，粗生成物）のテトラヒドロフラン溶液（１５０ｍＬ）にメチルアミン（４０％水溶液，３０．４ｍＬ，０．７３ｍｏｌ）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応終了後、テトラヒドロフランを減圧留去した。酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物９（７．５０ｇ）を黄色泡状物質として得た。

得られた化合物９の物性データを表７に示す。

（９）化合物１０の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物９（７．５０ｇ，粗生成物）の無水ピリジン溶液（１２０ｍＬ）にメタンスルホニルクロリド（１．４３ｍＬ，１８．５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応終了後、これに水を添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル：ヘキサン＝１：５（ｖ／ｖ）)により精製し、化合物１０（７．３９ｇ，４工程）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物１０の物性データを表８に示す。

（１０）化合物１１の合成

上記で得られた化合物１０（３．１９ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン−エタノール溶液（１５０ｍＬ，３：２（ｖ／ｖ）) に水酸化ナトリウム（４Ｍ，水溶液，６０ｍＬ，０．２３ｍｏｌ）を添加し、７０℃で８時間撹拌した。反応終了後、塩酸で中和し、溶媒を減圧留去した。酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水と水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物１１（２．７１ｇ，粗生成物）を白色固体として得た。

得られた化合物１１の物性データを表９に示す。

（１１）化合物１２の合成

窒素気流下、化合物１１（２．７１ｇ，粗生成物）の無水ピリジン溶液（５０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸無水物（３．６５ｍＬ，２２．３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。さらに、これにトリフルオロ酢酸無水物（０．７３ｍＬ，４．４５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。次いで、これに水を添加し、酢酸エチルで抽出後、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物１２（４．１２ｇ，粗生成物）を褐色泡状固体として得た。この化合物１２を、精製することなく即座に次の反応に用いた。

（１２）化合物１３の合成（Ａ）

上記で得られた化合物１２（４．１２ｇ，粗生成物）のテトラヒドロフラン溶液（２５０ｍＬ）にテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，１３．９ｍＬ，１３．９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：３（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１３（７１０ｍｇ，３２％，３工程）を黄色泡状固体として得た。

上記合成（Ａ）で得られた化合物１３の物性データを表１０に示す。

（１２）−２ 化合物１３の合成（Ｂ）

「上記化合物１３の合成（Ａ）」に代えて、「合成（Ｂ）」として、化合物１０から新たに化合物１７を経由して化合物１３を以下のようにして合成した。

窒素気流下、化合物１０（４５９ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（２５ｍＬ）にテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，０．６７ｍＬ，０．６７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５時間撹拌した。反応終了後、水を添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（(クロロホルム：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ）→２０：１（ｖ／ｖ）)により精製し、化合物１７（２９０ｍｇ，９１％）を白色固体として得た。

得られた化合物１７の物性データを表１１に示す。

次いで、化合物１７（１．６２ｇ，３．４０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３５ｍＬ）に、炭酸カリウム（１．１ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を添加し、９０℃で２０時間撹拌した。反応終了後、水を添加し、ジエチルエーテルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１３（１．２３ｇ，７７％）を白色固体として得た。

上記合成（Ｂ）で得られた化合物１３の物性データを表１２に示す。

（１３）化合物１４の合成

水素気流下、上記で得られた化合物１３（３５０ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に２０％水酸化パラジウム／炭素（パラジウム２０％，１７０ｍｇ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応混合物をろ過した後、溶媒を減圧留去し、化合物１４（２３０ｍｇ，粗生成物）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物１４の物性データを表１３に示す。

（１４）化合物１５の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物１４（１３０ｍｇ，粗生成物）の無水ピリジン溶液（１５ｍＬ）に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８９２ｍｇ，２．６３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１４時間撹拌した。これに水を添加し、ジクロロメタンで抽出後、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％トリエチルアミン含有クロロホルム：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１５（１６０ｍｇ，６０％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物１５の物性データを表１４に示す。

（１５）化合物１６の合成

窒素気流下、上記で得られた化合物１５（３０．０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４．８μＬ，０．２０ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（２２．３μＬ，０．１０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％トリエチルアミン含有酢酸エチル：ヘキサン＝２：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１６（２４ｍｇ，６０％（ｓｃｐＢＮＡ−Ｔアミダイトブロック））を白色泡状固体として得た。

得られた化合物１６の物性データを表１５に示す。

（実施例２）オリゴヌクレオチドの合成および精製
実施例１で得られた化合物１６（アミダイトブロック）、ならびにｄＧ（ｉＢｕ）、ｄＣ（Ｂｚ）およびＴのホスホロアミダイト（いずれもシグマ−アルドリッチ社製）を、それぞれ０．１Ｍの無水アセトニトリル溶液として調製し、ｎＳ−８ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（株式会社ジーンデザイン製オリゴヌクレオチド合成装置）を用いて、当該分野において公知のホスホロアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチド（５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ）−３’、５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＴＸＴＧＣＴ）−３’、５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ）−３’、５’−ｄ（ＧＣＧＸＴＸＴＸＴＧＣＴ）−３’ 、５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＸＸＴＧＣＴ）−３’および５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’）の合成を行った（ここで、Ｘは実施例１で得られた化合物１６（アミダイトブロック）に相当する）。

当該合成において、合成スケールは０．２μｍｏｌであり、かつトリチルオン条件下で行った。活性化剤にはＡｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（シグマ−アルドリッチ社製０．２５Ｍアセトニトリル溶液）を用いた。縮合時間は化合物１６を用いた合成では８分間、他の天然のアミダイトブロックを用いた合成では３２秒間とした。合成完了後、２８％のアンモニア水で室温下にて、１．５時間処理し、カラム担体からの切り出しを行い、引き続いて５５℃にて１２時間静置することにより、塩基部およびリン酸ジエステル部の脱保護を行った。次いで、簡易逆相カラム（ウォーターズ社製Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。

なお、このＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。

カラムにウォーターズ社製Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）ＭＳ Ｃ_１８ ２．５μｍｏｌ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ，１０ｍｍ×５０ｍｍ）を用い、移動相のＡ液として０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７．０）、およびＢ液として０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液：アセトニトリル＝１：１（ｖ／ｖ）を調製し、Ｂ液の濃度について６〜１２％（３０分間）のグラジエントを行った。分析は１ｍＬ／分で行い、分取は３ｍＬ／分で行った。検出ＵＶは２５４ｎｍであった。

さらに、上記化合物１６（アミダイトブロック）に代えて、Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９７年，３８，ｐｐ．８７３５−８７３８に記載の方法を用いて合成した２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（架橋結合部分の６’位にスピロシクロプロパン基を有していないこと以外は、上記実施例１で得られた化合物１６と同様の構造を有する）を用い、上記と同様にしてオリゴヌクレオチドを合成した。

また、上記化合物１６（アミダイトブロック）に代えて、天然チミジン（シグマ−アルドリッチ社製）を用いて、上記と同様にしてオリゴヌクレオチドを合成した。

（実施例３）オリゴヌクレオチドの組成の確認と定量
実施例２で得られたオリゴヌクレオチドの組成をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定により決定した。当該測定にあたり、まず、３−ヒドロキシピコリン酸水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とクエン酸二アンモニウム水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）と１：１の容量比で混合したマトリックス（１μＬ）を測定プレート上で乾燥させ、乾燥したマトリックス上に水に溶解したオリゴヌクレオチド（５０μＭ，１μＬ）を載せて乾燥させ、その後測定を行った。分子量の測定をネガティブリフレクターモードで行い、オリゴチミジル酸（７ｍｅｒ、１５ｍｅｒおよび２３ｍｅｒ）を外部標準として用いた。また、合成したオリゴヌクレオチドの定量を、吸光度測定装置（島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−１８００）を用いて２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定することで行った。

得られた結果を表１６に示す。

（実施例４）融解温度（Ｔ_ｍ）の測定
本実施例では、５’−（ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ）−３’の配列（配列番号１）を有する一本鎖オリゴＤＮＡおよび一本鎖オリゴＲＮＡの標的鎖（それぞれ、実施例１と同様に、ホスホロアミダイト法に従って合成した）について、実施例２の各種オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能（結合親和性）を調べた。

各種オリゴヌクレオチドと標的鎖とをアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、Ｔ_ｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。形成された二重鎖のＴ_ｍ値を測定した。

具体的には、各オリゴヌクレオチド（終濃度４μＭ）および塩化ナトリウム（終濃度１００ｍＭ）のリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．２，１３０μＬ）を沸騰水中に浴し、室温までゆっくり冷却した。測定装置は、ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−１８００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（株式会社島津製作所製）を用い、窒素気流下、測定溶液を５℃まで冷却し測定を開始した。０．５℃／分の速度で９０℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をプロットした。Ｔ_ｍ値は中線法により算出し、独立した３回の測定における平均値とした。

表１７は、一本鎖オリゴＤＮＡを標的鎖とした場合の結果を示し、表１８は、一本鎖オリゴＲＮＡを標的鎖とした場合の結果を示す。いずれとも、二重鎖の５０％が解離する温度であるＴ_ｍ値、および修飾単位あたりのＴ_ｍ値差（化合物１６（アミダイトブロック）を用いた場合および２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを用いた場合）を示す。

表１７および１８から明らかなように、化合物１６（アミダイトブロック）を含むオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドと比較して、一本鎖オリゴＤＮＡおよび一本鎖オリゴＲＮＡの両方に対してＴ_ｍ値が高く、高い結合親和性を示した。特に一本鎖オリゴＲＮＡに対しては、化合物１６（アミダイトブロック）を含むオリゴヌクレオチドは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する高い結合親和性を示した。

図１は、５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドについて、一本鎖オリゴＲＮＡ標的鎖に対して形成した二重鎖ハイブリッドが解離するＴ_ｍ曲線を示す。図１の縦軸は、２６０ｎｍの吸光度を表し、横軸は、温度（℃）を表す。

図１からもまた、化合物１６（アミダイトブロック）を含むオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴＲＮＡに対して、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する高い結合親和性を示すことが明らかとなった。

（実施例５）ヌクレアーゼ耐性能の評価
５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’の配列のＸとして実施例１の化合物１６（アミダイトブロック）；２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（Ｔ）；および天然チミジンをそれぞれ用いた１０ｍｅｒの各種オリゴヌクレオチドを、以下のようにして調製した。すなわち、オリゴの合成に、原料のヌクレオシドのホスホロアミダイトを０．１Ｍの無水アセトニトリル溶液として調整し、ｎＳ−８ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（株式会社ジーンデザイン製オリゴヌクレオチド合成装置）を用いて通常のホスホロアミダイト法に従って行った。当該合成において、合成スケールは１．０μｍｏｌであり、かつトリチルオン条件下で行った。活性化剤にはＡｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（シグマ−アルドリッチ社製０．２５Ｍアセトニトリル溶液）を用いた。縮合時間は化合物１６を用いた合成では１０分間、他の天然のアミダイトブロックを用いた合成では４０秒間とした。合成完了後、カラム担体をマイクロチューブに移し、２８％のアンモニア水中で５５℃にて、一晩静置し、カラム担体からの切り出しと、塩基部およびリン酸ジエステル部の脱保護とを行った。次いで、簡易逆相カラム（ウォーターズ社製Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。ＨＰＬＣの条件は、カラムにウォーターズ社製Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）ＭＳ Ｃ_１８ ２．５μｍｏｌ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ，１０ｍｍ×５０ｍｍ）を用い、移動相のＡ液として０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７．０）、およびＢ液として０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液：アセトニトリル＝１：１（ｖ／ｖ）を調製し、Ｂ液の濃度について６〜１２％（３０分間）のグラジエントを行った。分析は１ｍＬ／分で行い、分取は３ｍＬ／分で行った。検出ＵＶは２６０ｎｍであった。

ヌクレアーゼ耐性の評価は、以下のように行った。各種オリゴヌクレオチド（終濃度４μＭ）および塩化マグネシウム（終濃度１０ｍＭ）のトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０，１００μＬ）に３’−エキソヌクレアーゼ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ Ａｄｍａｎｔｅｕｓ Ｖｅｎｏｍ Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ：ＣＡＶＰ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１μｇ／ｍＬとなるように加え３７℃で静置した。反応開始から２．５、５、１０、２０、４０、８０分後に反応液から２０μＬずつ取り、９０℃下で２．５分間静置させることで酵素を失活させ、原料オリゴヌクレオチドの残量を逆相ＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣの条件は、カラムにＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）ＭＳ Ｃ_１８ ２．５μｍｏｌ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）を用い、移動相のＡ液を０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７．０）、Ｂ液を０．１Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液：アセトニトリル＝１：１（ｖ／ｖ）で調製し、Ｂ液濃度６−１２％（２０分）のグラジエントで行った。分析を１ｍＬ／分の流速で行い、２６０ｎｍのＵＶで検出した。

１０ｍｅｒと９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの残量を未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）として算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図２に示す。

図２は、５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。図１の縦軸は、ヌクレアーゼ処理に対して未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）を示し、横軸は、ヌクレアーゼ処理時間（分）を示す。図２の記号は以下を表す：菱形、実施例１の化合物１６（アミダイトブロック）を含有するオリゴヌクレオチド；四角、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド；および三角、天然チミジンを含有するオリゴヌクレオチド。

図２から明らかなように、化合物１６（アミダイトブロック）を含有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理の８０分後でも６０％以上が未反応のまま残存しており、分解されにくかった。これに対し、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドおよび天然チミジンを含有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理の２０分後にはほぼ分解された。このように、化合物１６（アミダイトブロック）を含有するオリゴヌクレオチドは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドに比較して、はるかに高い酵素耐性能を有することが示された。

（実施例６：２’，４’−架橋型ヌクレオシドの合成（２）：スピロシクロプロパンＢＮＡ−^ｍＣ（ｓｃｐＢＮＡ−^ｍＣ）アミダイトブロックの合成）

（１）化合物１８の合成

アルゴン気流下、実施例１で得られた化合物１５（１６７ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２ｍＬ）にクロロトリエチルシラン（０．２４ｍＬ，１．３９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ））で精製し、化合物１８（１８８ｍｇ，９５％）を黄色泡状固体として得た。

得られた化合物１８の物性データを表１９に示す。

（２）化合物１９の合成

アルゴン気流下、化合物１８（９６９ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．７９ｍＬ，２０．１ｍｍｏｌ）、および１，２，４−トリアゾール（１．３９ｇ，２０．１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１５ｍＬ）に、塩化ホスホリル（０．３８ｍＬ，４．０３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。室温で２時間撹拌した後、反応溶液に飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去して化合物１９（１．０６ｇ，７７％）を得た。化合物１９については精製することなく、直ちに次の反応に用いた。

（３）化合物２０の合成

化合物１９（１．０６ｇ）の１，４−ジオキサン溶液（１０ｍＬ）に、アンモニア水溶液（２８重量％，１．２６ｍＬ，６７．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３０：１（ｖ／ｖ））で精製し、化合物２０（９５８ｍｇ，９８％，２工程）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物２０の物性データを表２０に示す。

（４）化合物２１の合成

アルゴン気流下、化合物２０（９０２ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１３ｍＬ）に塩化ベンゾイル（０．２２ｍＬ，１．９０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１（ｖ／ｖ））で精製し、化合物２１（８６１ｍｇ，８３％）を黄色泡状固体として得た。

得られた化合物２１の物性データを表２１に示す。

（５）化合物２２の合成

化合物２１（７０１ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（８ｍＬ）にテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，２．５８ｍＬ，２．５８ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１０分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２２（５２８ｍｇ，８８％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物２２の物性データを表２２に示す。

（６）化合物２３の合成

アルゴン気流下、化合物２２（５２８ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｍＬ，２．２６ｍｍｏｌ）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（０．２５ｍＬ，１．１３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％トリエチルアミン含有ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）) で精製し、化合物２３（５２９ｍｇ，７８％：ｓｃｐＢＮＡ−^ｍＣアミダイトブロック）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物２３の物性データを表２３に示す。

（実施例７：動物実験）
（１）動物実験用オリゴヌクレオチドの設計および合成
標的遺伝子としてmouse phosphatase and tensin homolog (Pten) mRNAを選択し（NCBI参照番号：NM_008960.2）、全８２２９塩基中の６０塩基目から７３塩基目に相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。なお、配列は既報配列を使用した（Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2012, 1, e47）。

オリゴヌクレオチドの合成に関し、まず比較のために、表２４に示すようなすべてのリンケージをホスホロチオエート化した２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）を作製した。一方、実施例１で得られたｓｃｐＢＮＡ−Ｔアミダイトブロック（化合物１６）および実施例６で得られたｓｃｐＢＮＡ−^ｍＣアミダイトブロック（化合物２３）を用い、ｓｃｐＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）を作製した。これらのオリゴヌクレオチドの作製は、株式会社ジーンデザインによる受諾合成を通じて行った。作製したオリゴヌクレオチドは、ナトリウムフォーム化されかつエンドトキシンフリーのｉｎ ｖｉｖｏグレードであった。

（２）融解温度（Ｔ_ｍ）の測定
上記で得られたオリゴヌクレオチド１および２の相補鎖ＲＮＡ（5’-agcugcagccauga-3’（配列番号２））との結合親和性を以下のようにして評価した。

リン酸緩衝液（10mM NaH₂PO₄-10mM Na₂HPO₄, 100mM NaCl, pH7.0）に、最終濃度が２μＭとなるようにオリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２を別々に添加し、各オリゴヌクレオチド溶液を調製した。当該溶液を、４℃〜９５℃の温度域で０．５℃／分ごとに昇温させ、２６０ｎｍにおける吸光度をそれぞれモニターした。Ｔ_ｍ値を中線法により算出し、独立した３回の測定における平均値とした。結果を、オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２の質量分析結果とともに、表２４に示す。

表２４に示すように、オリゴヌクレオチド１（２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ搭載オリゴヌクレオチド）と、オリゴヌクレオチド２（ｓｃｐＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド）とのＴ_ｍ値には大きな相違が見られず、これらのオリゴヌクレオチド１および２における結合親和性がほぼ同等であったことがわかる。

（３）投与実験
被験動物として７週齢のマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（雄）（日本ＳＬＣ社）を購入し、１週間馴化させた。その後、これらのマウスに対して、生理食塩水に溶解したオリゴヌクレオチド１（３５ｍｇ／ｋｇ）、オリゴヌクレオチド２（３５ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水を全用量２００μＬにて腹腔内投与した（投与群Ｎ＝４）。７２時間後、マウスをイソフルラン麻酔下にて解剖し、下大静脈より採血した後、ＰＢＳで心臓灌流を行った。その後、肝臓を摘出し、RNA later（登録商標）Stabilization Solution (Thermo Fisher Scientific, AM7021) 下で４℃保存した。

次いで、上記にて保存した肝臓から切片を一部取り出し、QuickGene RNA tissue kit SII（和光純薬工業株式会社製RT-S2)のＬＲＴ（２−メルカプトエタノール含有）５００μＬを添加し、ステンレス球１粒を加え、ホモジナイズした（TAITEC社製μＴ−１２, 回転速度: 2,000rpm, ３分間)。その後、室温で12,000rpmにて３分間遠心し、上清３８５μＬを回収した。キットのＳＲＴ１７５μＬを添加し、ボルテックスにて１５秒間混合し、スピンダウンした。その後、特級エタノール１４０μＬを添加し、ボルテックスにてさらに１分間混合し、スピンダウンした。こうして得られた全量を、ＲＮＡ自動抽出器 (和光純薬工業株式会社製QuickGene-800) にセットし、total RNAを抽出した。

次いで、total RNA２μｇに対し逆転写反応を行った。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, 4368813) を用い、当該製品のプロトコルに従ってｃＤＮＡを作製した。

その後、上記ｃＤＮＡを３０倍に希釈してｃＤＮＡ溶液を調製し、標的遺伝子Ptenに対するreal-time PCRを行った。Ptenの発現量解析は、ハウスキーピング遺伝子Gapdhの発現量に対する相対発現量として評価した。この反応には、TaqMan（登録商標）Fast Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific, 4352042）およびTaqMan probe（Thermo Fisher Scientific, Pten: Mm00477208_m1, Gapdh: Mm99999915_g1）を用い、当該製品のプロトコルに従って行った。

さらに、上記マウスの下大静脈から採血した血液サンプルから血清を以下のようにして分離した。

血液凝固促進剤および血清分離剤の入ったチューブ（BD，365967）に採血した血液サンプルを添加し、5,000rpmで、４℃下にて２０分間遠心した。血清を回収し、以降の血液検査に使用した。

当該血清について、肝毒性の指標ＧＯＴ（ＡＳＴ）値およびＧＰＴ（ＡＬＴ）値をトランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製431-30901）を用いて算出した。基質酵素液と発色試液とを等量で混合し、基質発色液とした。基質発色液１００μＬを９６ウェルプレートに分注し、３７℃で５分間加温した。その後、当該発色液に上記で得られた血清２μＬを添加し、３７℃で２０分間加温し、反応停止液２００μＬを添加し、プレートリーダー（Molecular Device社製SpectraMax M5e）を用いて５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から当該製品に付属のプロトコルに従って検量線法によりＡＳＴ／ＡＬＴ値を算出した。

得られた結果を図３および図４に示す。

図３に示すように、肝臓内に発現するPten mRNAの発現量を定量した結果、オリゴヌクレオチド１および２のいずれを投与しても高いノックダウン効率（６０％〜７０％）を示し、ｓｃｐＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）は、２’，４’−ＬＮＡ／ＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）と同等のアンチセンス活性を示すことがわかる。

これに対し、図４に示すように、２’，４’−ＬＮＡ／ＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）の投与群では、ＡＳＴ／ＡＬＴ値は１００／３０Ｋａｒｍｅｎを超えた値となり、毒性が認められた。ｓｃｐＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）の投与群では、ＡＳＴ／ＡＬＴ値がオリゴヌクレオチド１のものと比較して、その半分程度にまで値が減少し、肝毒性は認められなかった。

（実施例８：ｉｎ ｖｉｔｒｏアンチセンス活性評価）
（１）細胞へのアンチセンス核酸の導入および細胞破砕液の作製
マウス肝臓がん由来細胞株ＮＭｕＬｉを９６ウェルプレートに２．５×１０^３cells/wellの細胞数で播種し、２４時間培養した。当該プレートに付属のプロトコルに従って、実施例７で得られたオリゴヌクレオチド１または２と、Lipofectamine 2000とをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中でコンプレックスを形成させ、各ウェルの１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（抗生物質を含有せず）１００μＬに、５０μＬのコンプレックスを添加した。２４時間後、ウェルから培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、Lysis Solution ４９．７μＬとgDNA Remover０．３μＬの混合液（SuperPrep^TM, 東洋紡製, SCQ-101)５０μＬ／ウェルを添加し、軽く振盪した後、５分間室温にてインキュベートした。次いで、Stop Solution ９．５μＬおよびRNase Inhibitor ０．５μＬの混合液（SuperPrep^TM, 東洋紡製, SCQ-101)１０μＬ/ウェルを添加し、軽く振盪した後２分間室温にてインキュベートして、細胞破砕液を得た。

その後、８μＬの5×RT Master Mixと、２４μＬのNuclease-free Waterの混合液（SuperPrep^TM, 東洋紡製, SCQ-101）３２μＬに対し、上記で調製した細胞破砕液８μＬを添加した。３７℃にて１５分→５０℃にて５分→９８℃にて５分→４℃にて１０分の順に温度をかけて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を作製した。次いで、得られたｃＤＮＡ溶液を３０倍に希釈し、標的遺伝子Ｐｔｅｎに対するreal-time PCRを行った。Ｐｔｅｎの発現量解析は、ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈの発現量に対する相対発現量として評価した。反応には、TaqMan（登録商標）Fast Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific, 4352042）および、TaqMan probe（Thermo Fisher Scientific, Ｐｔｅｎ: Mm00477208_m1, Ｇａｐｄｈ: Mm99999915_g1) を用い、当該製品のプロトコルに従って反応を行った。

また、濃度の対数に対してＰｔｅｎ ｍＲＮＡの相対残存量をプロットし、グラフソフトウエア（株式会社ヒューリンクス製Igor Pro）を用いてフィッティングを行い(Sigmoid mode)、ＩＣ_５０を算出した。

オリゴヌクレオチド１および２を、それぞれ０．２５ｎＭから２００ｎＭまでの濃度（各濃度についてＮ＝４）で導入した結果を図５に示す。さらに、上記より算出したＩＣ_５０の結果を表２５に示す。

図５および表２５から明らかなように、ＩＣ_５０の値は、オリゴヌクレオチド１に比べてオリゴヌクレオチド２が幾分高い値を示していたが、ＮＭｕＬｉ細胞におけるPten mRNA発現レベルは、オリゴヌクレオチド１および２の間で実質的な差異が見出せなかったことがわかる。このことから、ｓｃｐＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても２’，４’−ＬＮＡ／ＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）と同等のアンチセンス活性を示すことがわかる。

これまで、高いアンチセンス活性を保持する２’，４’−ＬＮＡ／ＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチドを投与した場合には、肝毒性も高い値を示すケースが多く報告されてきた。しかし、上記実施例７および８の結果によれば、ｓｃｐＢＮＡ搭載オリゴヌクレオチドを投与すると、高いアンチセンス活性を維持しながら、肝毒性を発現しない結果が得られており、これにより、本発明のオリゴヌクレオチドが核酸医薬品化に向けた新たな架橋型人工核酸アナログの開発に有用であることがわかる。

（実施例９：２’，４’−架橋型ヌクレオシドの合成（３）：スピロシクロプロパンＢＮＡ−Ａ（ｓｃｐＢＮＡ−Ａ）アミダイトブロックの合成）

（１）化合物２４の合成

窒素気流下、実施例１で得られた化合物７（６．１４ｇ）の無水アセトニトリル（７０ｍＬ）溶液に、Ｎ^６−ベンゾイルアデニン（２．５８ｇ，１０．８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（５．６５ｍＬ，２３．１ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、１０分間撹拌した。次いで、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（２．７８ｍＬ，１５．４ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、８０℃にて２２時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ））により精製して、化合物２４（２．９１ｇ，５０％（２工程））を白色泡状固体として得た。

得られた化合物２４の物性データを表２６に示す。

（２）化合物２５の合成

化合物２４（２．２０ｇ，２．８８ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（７９５ｍｇ，５．７５ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で２０分間撹拌した。反応終了後、水を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２５（２．０５ｇ，９９％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物２５の物性データを表２７に示す。

（３）化合物２６の合成

化合物２５（１．０８ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液に、ジアセトキシヨードベンゼン（７２４ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシ−２−アザアダマンタン（１１．５ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ，５ｍｏｌ％）を添加し、室温で６時間撹拌した。反応終了後、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液および飽和重曹水（２：１（ｖ／ｖ））添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、化合物２６（１．０８ｇ）を黄色泡状固体として得た。この化合物２６を精製することなく、直ちに次の反応に使用した。

（４）化合物２７の合成

化合物２６（１．０８ｇ）のエタノール（１５ｍＬ）溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（７９．４ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０分間撹拌した。反応終了後、水を添加し、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水と水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２７（７７３ｍｇ，７０％，２工程，Ｒ：Ｓ＝２．６：１）を黄色泡状固体として得た。得られた化合物２７はジアステレオマーの分離が困難な混合物であったため、当該混合物のまま次の反応に使用した。

（５）化合物２８の合成

窒素気流下、化合物２７（７７３ｍｇ，１．０７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（６５３ｍｇ，５．３５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．２２ｍＬ，１．３９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、化合物２８（８６９ｍｇ，Ｒ：Ｓ＝２．６：１）を黄色泡状固体として得た。この化合物２８を精製することなく、直ちに次の反応に使用した。

（６）化合物２９の合成

化合物２８（８６９ｍｇ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，３．２１ｍＬ，３．２１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２９（９０ｍｇ，１４％，２工程）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物２９の物性データを表２８に示す。

（７）化合物３０の合成

化合物２９（６０ｍｇ，０．１０２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１ｍＬ）溶液に、メチルアミン水溶液（４０重量％，０．４２ｍＬ，５．０９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝３：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３０（４１ｍｇ，８３％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３０の物性データを表２９に示す。

（８）化合物３１の合成

化合物３０（４５０ｍｇ，０．９２７ｍｍｏｌ）のエタノール−酢酸（３０．９ｍＬ，１００：３（ｖ／ｖ））溶液に、２０％水酸化パラジウム／炭素（パラジウム２０％，１９８ｍｇ）およびギ酸アンモニウム（３．５ｇ，５５．６ｍｍｍｏｌ）を添加し、還流下で５時間加熱した。反応溶液を、ひだ折り濾紙でろ過した後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３１（１３０ｍｇ，４６％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３１の物性データを表３０に示す。

（９）化合物３２の合成

窒素気流下、化合物３１（８１．０ｍｇ，０．２６５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（２ｍＬ）溶液に、クロロトリメチルシラン（６７．０μＬ，０．５３１ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で４０分間撹拌した。次いで、塩化ベンゾイル（９２．０μＬ，０．７９５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。さらに、アンモニア水溶液（２８重量％，１．２ｍＬ，１８．６ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で３時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３０：１（ｖ／ｖ）→１０：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３２（６６ｍｇ，６１％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３２の物性データを表３１に示す。

（１０）化合物３３の合成

窒素気流下、化合物３２（１６ｍｇ，３９．０μｍｏｌ）の無水ピリジン（０．５ｍＬ）溶液に、４，４’−ジメトキシクロリド（１９．９ｍｇ，５９．０μｍｏｌ）を添加し、室温で１５時間撹拌した。その後、４，４’−ジメトキシクロリド（２３ｍｇ，６７．９μｍｏｌ）を添加し、室温で４時間撹拌した。さらに、４，４’−ジメトキシクロリド（２２３ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水と水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３３（２０ｍｇ，７２％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３３の物性データを表３２に示す。

（１１）化合物３４の合成

窒素気流下、化合物３３（５２ｍｇ，７３．１μｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３８μＬ，２１．９μｍｏｌ）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（２４μＬ，１１．０μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７６μＬ，４３．８μｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（２４μＬ，１１．０μｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。さらに、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（２４μＬ，１１．０μｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水と水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％トリエチルアミン含有酢酸エチル：ヘキサン＝２：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３４（４５ｍｇ，６７％：ｓｃｐＢＮＡ−Ａアミダイトブロック）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３４の物性データを表３３に示す。

（実施例１０：２’，４’−架橋型ヌクレオシドの合成（４）：スピロシクロプロパンＢＮＡ−Ｇ（ｓｃｐＢＮＡ−Ｇ）アミダイトブロックの合成）

（１）化合物３５の合成

窒素気流下、実施例１で得られた化合物７（７７ｍｇ，０．１３２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液に、Ｎ^２−イソブチリルグアニン（４１ｍｇ，０．１８４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（９７．０μＬ，０．３９５ｍｍｏｌ）を８０℃で添加し、２０分間撹拌した。次いで、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４８．０μＬ，０．２６３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、８０℃で１８時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン：メタノール＝２：１０：１（ｖ／ｖ／ｖ）により精製し、化合物３５（４８ｍｇ，４９％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３５の物性データを表３４に示す。

（２）化合物３６の合成

化合物３５（４８ｍｇ，６５．６ｍｍｏｌ）のメタノール（１．５ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（２７ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１時間撹拌した。反応終了後、水を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３６（４４ｍｇ，９５％）を白色泡状固体として得た。

得られた化合物３６の物性データを表３５に示す。

（３）化合物３７の合成

化合物３６（６．５ｇ，９．２３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液に、ジアセトキシヨードベンゼン（４．４６ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシ−２−アザアダマンタン（７１ｍｇ，０．４６２ｍｍｏｌ，５ｍｏｌ％）を添加し、室温で７時間撹拌した。反応終了後、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液および飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、化合物３７（７．０ｇ）を黄色泡状固体として得た。この化合物３７を精製することなく、直ちに次の反応に使用した。

（４）化合物３８の合成

化合物３７（７．０ｇ）のメタノール−ジクロロメタン（９０ｍＬ，１：２（ｖ／ｖ））溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（４８９ｍｇ，１２．９ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水と水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３０：１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物３８（５．２ｇ，８０％，２工程、Ｒ：Ｓ＝２：１）を黄色泡状固体として得た。得られた化合物３８はジアステレオマーの分離が困難な混合物であったため、当該混合物のまま次の反応に使用した。

（５）化合物３９の合成

窒素気流下、化合物３８（３００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（１５６ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物（９０μＬ，０．５５ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、化合物３９（４０８ｍｇ）を黄色泡状固体として得た。この化合物３９を精製することなく、直ちに次の反応に使用した。

（６）化合物４０の合成

化合物３９（４０８ｍｇ）のテトラヒドロフラン（４ｍＬ）溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，１．２８ｍＬ，１．２８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン：メタノール＝２：７：１）により精製し、化合物４０（９ｍｇ，４％（２工程））を白色泡状固体として得た。

得られた化合物４０の物性データを表３６に示す。

（７）化合物４１の合成

化合物４０の酢酸エチル溶液に、２０％水酸化パラジウム／炭素（パラジウム２０％）を添加し、水素気流下で５時間撹拌する。反応溶液を、ひだ折り濾紙でろ過した後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）により精製し、化合物４１を適切な収率で得る。

（８）化合物４２の合成

窒素気流下、化合物４１の無水ピリジン溶液に、４，４’−ジメトキシクロリドを添加し、室温で１９時間撹拌する。飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水と水とで洗浄する。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去する。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン）により精製し、化合物４２を適切な収率で得る。

（９）化合物４３の合成

窒素気流下、化合物４２の無水アセトニトリル溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよび２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダートを添加し、室温で２時間撹拌する。飽和重曹水を添加し、酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水と水とで洗浄する。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去する。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％トリエチルアミン含有酢酸エチル：ヘキサン）により精製し、化合物４３（ｓｃｐＢＮＡ−Ｇアミダイトブロック）を適切な収率で得る。

本発明によれば、６’位にスピロシクロプロパン基を有する新規な２’，４’−架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供される。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵する一本鎖ＲＮＡに対する結合親和性と、ＬＮＡを上回るヌクレアーゼ耐性とを有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸医薬への素材として有用である。

Claims (7)

1. 以下の式Ｉで表される化合物またはその塩：
   

   

   （式中、
   Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
   Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；
   Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
   Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表し、
   該核酸合成の保護基は、
   分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
   分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
   ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、ヘナイコサノイル基、スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、メトキシアセチル基、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基、２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基、４−アニソイル基、２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基、または４−フェニルベンゾイル基；
   テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、または４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基；
   テトラヒドロフラン−２−イル基またはテトラヒドロチオフラン−２−イル基；
   トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、またはフェニルジイソプロピルシリル基；
   メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イシプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、またはｔ−ブトキシメチル基；
   ２−メトキシエトキシメチル基；
   ２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、またはビス（２−クロロエトキシ）メチル基；
   １−エトキシエチル基、または１−（イソプロポキシ）エチル基；
   ２，２，２−トリクロロエチル基；
   ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、または９−アンスリルメチル基；
   ４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、または４−シアノベンジル基；
   メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、またはイソブトキシカルボニル基；
   ４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、または２，４−ジニトロフェニル基；
   ２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、または２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基；
   ビニルオキシカルボニル基、またはアリールオキシカルボニル基；あるいは
   ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、または４−ニトロベンジルオキシカルボニル基；
   であり、そして
   該核酸合成の水酸基の保護基は、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である）。
2. 前記式Ｉにおいて、前記Ｂａｓｅが、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
3. 前記式Ｉにおいて、前記Ｂａｓｅが、以下の式：
   

   

   で表される基である、請求項１または２に記載の化合物またはその塩。
4. 前記式Ｉにおいて、Ｒ^６およびＲ^７がともに水素原子である、請求項１から３のいずれかに記載の化合物またはその塩。
5. 以下の式ＩＩで表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
   

   

   （式中、
   Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
   Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
   Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表し、そして
   該核酸合成の保護基は、
   分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
   分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
   ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、ヘナイコサノイル基、スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、メトキシアセチル基、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基、２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基、４−アニソイル基、２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基、または４−フェニルベンゾイル基；
   テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、または４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基；
   テトラヒドロフラン−２−イル基またはテトラヒドロチオフラン−２−イル基；
   トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、またはフェニルジイソプロピルシリル基；
   メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イシプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、またはｔ−ブトキシメチル基；
   ２−メトキシエトキシメチル基；
   ２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、またはビス（２−クロロエトキシ）メチル基；
   １−エトキシエチル基、または１−（イソプロポキシ）エチル基；
   ２，２，２−トリクロロエチル基；
   ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、または９−アンスリルメチル基；
   ４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、または４−シアノベンジル基；
   メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、またはイソブトキシカルボニル基；
   ４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、または２，４−ジニトロフェニル基；
   ２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、または２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基；
   ビニルオキシカルボニル基、またはアリールオキシカルボニル基；あるいは
   ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、または４−ニトロベンジルオキシカルボニル基；
   である）。
6. 前記式ＩＩにおいて、Ｒ^６およびＲ^７がともに水素原子である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
7. 請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の製造方法であって、
   以下の式Ｉで表される化合物またはその薬理学上許容される塩：
   

   

   （式中、
   Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
   Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表し；
   Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
   Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｎ−［式中、ｎは２から５の整数である］を表し、
   該核酸合成の保護基は、
   分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
   分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
   ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、ヘナイコサノイル基、スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、メトキシアセチル基、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基、２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基、４−アニソイル基、２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基、または４−フェニルベンゾイル基；
   テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、または４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基；
   テトラヒドロフラン−２−イル基またはテトラヒドロチオフラン−２−イル基；
   トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、またはフェニルジイソプロピルシリル基；
   メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イシプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、またはｔ−ブトキシメチル基；
   ２−メトキシエトキシメチル基；
   ２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、またはビス（２−クロロエトキシ）メチル基；
   １−エトキシエチル基、または１−（イソプロポキシ）エチル基；
   ２，２，２−トリクロロエチル基；
   ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、または９−アンスリルメチル基；
   ４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、または４−シアノベンジル基；
   メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、またはイソブトキシカルボニル基；
   ４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、または２，４−ジニトロフェニル基；
   ２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、または２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基；
   ビニルオキシカルボニル基、またはアリールオキシカルボニル基；あるいは
   ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、または４−ニトロベンジルオキシカルボニル基；
   であり、そして
   該核酸合成の水酸基の保護基は、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である）
   を用いてオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する、方法。

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