本明細書において、用語「炭素数1から6の直鎖アルキル基」は、炭素数1〜6の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基、n−ペンチル基、またはn−ヘキシル基をいう。
本明細書において、用語「炭素数1から6の直鎖アルコキシ基」は、炭素数1〜6の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、n−プロピルオキシ基などが挙げられる。
本明細書において、用語「炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数1〜6の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、n−プロピルチオ基などが挙げられる。
本明細書において、用語「炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数1〜6の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を1つまたは2つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基」は、炭素数1〜7の任意の直鎖アルキル基、炭素数3〜7の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数3〜7の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数1〜7の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、およびn−ヘプチル基が挙げられ、炭素数3〜7の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、tert−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数3〜7の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基」は、炭素数2〜7の任意の直鎖アルケニル基、炭素数3〜7の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数3〜7の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数2〜7の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、1−プロペニル基、2−プロペニル基、1−ブテニル基、2−ブテニル基、1−ペンテニル基、2−ペンテニル基、3−ペンテニル基、4−ペンテニル基、1−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数3〜7の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、1−メチル−1−プロペニル基、1−メチル−2−プロペニル基、2−メチル−1−プロペニル基、2−メチル−2−プロペニル基、1−メチル−2−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数3〜7の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数6〜12の任意の芳香族炭化水素および環構造にヘテロ原子(窒素原子、酸素原子、または硫黄原子)を含む炭素数3〜12の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数6〜12の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数3〜12の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、3−フェニルプロピル基、2−フェニルプロピル基、4−フェニルブチル基、2−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、2−ピリジルエチル基、1−ピリジルエチル基、3−チエニルプロピル基などが挙げられる。
本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、3−メチルノナノイル基、8−メチルノナノイル基、3−エチルオクタノイル基、3,7−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、1−メチルペンタデカノイル基、14−メチルペンタデカノイル基、13,13−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、15−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、1−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基;スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基;クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基;メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基;(E)−2−メチル−2−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基;2−ブロモベンゾイル基、4−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基;2,4,6−トリメチルベンゾイル基、4−トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基;4−アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基;2−カルボキシベンゾイル基、3−カルボキシベンゾイル基、4−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基;4−ニトロベンゾイル基、2−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基;2−(メトキシカルボニル)ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基;4−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−t−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基;ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような1〜2個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、1〜3個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された1〜3個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」などが挙げられる。
より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−2−イル基、3−ブロモテトラヒドロピラン−2−イル基、4−メトキシテトラヒドロピラン−4−イル基、テトラヒドロチオピラン−4−イル基、4−メトキシテトラヒドロチオピラン−4−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−2−イル基、テトラヒドロチオフラン−2−イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、1,1−ジメチル−1−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、t−ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、2−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、2,2,2−トリクロロエトキシメチル基、ビス(2−クロロエトキシ)メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、1−エトキシエチル基、1−(イソプロポキシ)エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、2,2,2−トリクロロエチル基などが挙げられる。1〜3個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、9−アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された1〜3個のアリール基で置換されたメチル基」としては、4−メチルベンジル基、2,4,6−トリメチルベンジル基、3,4,5−トリメチルベンジル基、4−メトキシベンジル基、4−メトキシフェニルジフェニルメチル基、4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル基、2−ニトロベンジル基、4−ニトロベンジル基、4−クロロベンジル基、4−ブロモベンジル基、4−シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、4−クロロフェニル基、2−フロロフェニル基、4−メトキシフェニル基、4−ニトロフェニル基、2,4−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル基、2−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、4−メトキシベンジルオキシカルボニル基、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、2−ニトロベンジルオキシカルボニル基、4−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、1〜3個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された1〜3個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、p−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはtert−ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「1〜3個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、2−クロロフェニル基、4−クロロフェニル基または2−プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、2−シアノエチル基、2,2,2−トリクロロエチル基、ベンジル基、2−クロロフェニル基または4−クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。
本明細書において、用語「人工ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。
本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で2〜50個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体;リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体;末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体;プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
本明細書において、用語「その塩」とは、本発明の式IまたはIIで表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩;アンモニウム塩のような無機塩、t−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩;フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩;および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」としては、本発明の式IIIまたは式IVで表されるヌクレオシド構造を少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩;アンモニウム塩のような無機塩、t−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩;フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩;および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
上記式Iまたは式IIにおいて、Baseは、プリン塩基(すなわち、プリン−9−イル基)またはピリミジン塩基(すなわち、2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基)である。これらの塩基は、水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
上記の塩基(Base)の具体例としては、6−アミノプリン−9−イル基(アデニニル基)、2,6−ジアミノプリン−9−イル基、2−アミノ−6−クロロプリン−9−イル基、2−アミノ−6−フルオロプリン−9−イル基、2−アミノ−6−ブロモプリン−9−イル基、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル基(グアニニル基)、6−アミノ−2−メトキシプリン−9−イル基、6−アミノ−2−クロロプリン−9−イル基、6−アミノ−2−フルオロプリン−9−イル基、2,6−ジメトキシプリン−9−イル基、2,6−ジクロロプリン−9−イル基、6−メルカプトプリン−9−イル基、2−オキソ−4−アミノ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(シトシニル基)、4−アミノ−2−オキソ−5−フルオロ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、4−アミノ−2−オキソ−5−クロロ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−メトキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−メルカプト−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(ウラシリル基)、2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(チミニル基)、および4−アミノ−5−メチル−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基が挙げられる。
でそれぞれ表される、2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(チミニル基)、2−オキソ−4−アミノ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(シトシニル基)、6−アミノプリン−9−イル基(アデニニル基)、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル基(グアニニル基)、4−アミノ−5−メチル−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、および2−オキソ−4−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(ウラシリル基)が好適であり、特に、2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(チミニル基)が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基が保護基により保護されていることが好ましい。
上記式Iまたは式IIにおいて、mは、0から2の整数であり;そしてnは、0から1の整数である。すなわち、2’位、3’位、4’位、および架橋部を含む環は、5員環〜7員環である。
上記式IIにおいて、Xは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基である。好適には、Xは、酸素原子またはアミノ基である。なお、Xがアミノ基またはメチレン基である場合、低級アルキル基で置換されていてもよい。
本発明の新規2’,4’−架橋型人工ヌクレオシドは、従来の2’,4’−BNA/LNAの架橋構造にアミド結合が導入されている。具体的には、糖部の2’位のアミノ基と4’位から伸長したカルボニル基との間にアミド結合が形成されている。このように、構造的に揺らぎが少なくかつ親水性に優れるアミド結合を有するため、ヌクレオシドの糖部の構造が、架橋により固定化されている。
本発明の2’,4’−架橋型人工ヌクレオシドから、2’,4’−架橋型人工ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、三リン酸化は、非特許文献5に記載の方法に従って容易に行われ得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも1つ有する。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。
このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチド類縁体(アンチセンス分子)は、上述のようにアミド結合により固定された構造を有するため、各種ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。例えば、mRNAと安定な二重鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害し、あるいはゲノム中の二重鎖DNAとの間で三重鎖を形成してmRNAへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。また、アミド結合を有することから、生体適合性が高いことも期待され、さらにタンパク質などの生体成分を認識するためのアプタマーとしての機能も期待できる。
これらのことから、本発明の2’,4’−架橋型人工ヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品(アンチセンス分子)としての有用性が期待される。
特に、アンチセンス法では、相補センス鎖RNAに対する結合親和性および生体内DNA分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずDNA二重鎖に近い形と、DNA−RNA二重鎖やRNA二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なRNA鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の2’,4’−架橋型人工ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のRNA鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。本発明の2’,4’−架橋型人工ヌクレオシドでは、アミド結合を有するため、糖部架橋に親水性を付与し、より安定化され得る。さらに、糖部架橋のアミド結合の存在は、生体酵素に認識されにくくし、ヌクレアーゼ耐性に大きく寄与していると考えられる。
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。
以下、本発明の2’,4’−架橋型人工ヌクレオシドおよびその類縁体の合成を、実施例に基づいてさらに詳しく説明する。
(実施例1)ヌクレオシド類縁体:2’−アミノ−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−N,4’−C−オキソメチレンチミジン(化合物16:amideNH)の合成
(1)化合物2の合成
窒素気流下、化合物1(14.7g,36.8mmol)のジクロロメタン溶液(80mL)にトリエチルアミン(15.1mL,110mmol)を加え、氷冷下ジメチルアミノピリジン(0.90g,7.36mmol)、tert−ブチルジフェニルシリルクロリド(15.1mL,58.9mmol)を加えて還流した。なお、化合物1は、Koshkin, A. A.ら、Tetrahedron,1998年,54巻,pp.3607-3630およびSingh, S. K.ら、Chem. Commun.,1998年,pp.455-456に従って調製し得る。20時間後、水を加え、塩化メチレンで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=9:1(v/v))により精製し、化合物2(20.4g:収率85.9%)を油状物質として得た。
得られた化合物2の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 +84.8 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr): 1457, 1372, 1105, 1025cm-1;1H-NMR (270MHz, CDCl3):δ1.03 (9H, s), 1.29 (6H, s), 3.62, 3.73 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.03, 4.08 (2H, AB, J = 11.3 Hz), 4.20 (1H, d, J = 5.1 Hz), 4.45, 4.55 (2H, AB, J = 11.9 Hz), 4.49, 4.66 (2H, AB, J = 12.2 Hz), 4.58 (1H, dd, J = 5.1 Hz, 4.1 Hz), 5.76 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.21-7.70 (20H, m);13C-NMR (75.45MHz, CDCl3):δ19.9, 26.9, 27.2, 27.5, 65.3, 72.6, 73.0, 74.2, 78.8, 80.2, 88.2, 104.8, 113.8, 128.2, 128.2, 128.3, 128.3, 128.8, 128.9, 130.1, 133.9, 134.1, 135.4, 136.3, 136.4, 138.5, 138.7;MS(FAB):m/z 661 (MNa+):計算値 C39H46O6Si:C, 73.32; H, 7.26,実測値 C, 73.44; H, 7.32。
(2)化合物4の合成
上記(1)で得た化合物2(1.00g,1.57mmol)の0.1%(v/v)濃硫酸酢酸溶液(1.11mL)に、無水硫酸(1.78mL,18.8mmol)を加えて撹拌した。3.5時間後、飽和重曹水に反応液を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物3の粗成績体(1.07g)を油状物質として得、続くチミン導入に用いた。
窒素気流下、化合物3の粗成績体のアセトニトリル溶液(5mL)にチミン(297mg,2.36mmol)を加え、40℃の油浴中で溶解させた後、室温にてN,O−ビストリメチルシリルアセトアミド(1.34mL,5.50mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(0.28mL,1.57mmol)を加えて1時間還流撹拌した。飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=10:1→1:1(v/v))により精製し、化合物4(367mg:収率49%(2工程))を白色アモルファスとして得た。
得られた化合物4の物性データは、以下のとおりであった:融点:55〜59℃; [α]D 24 -11.7 (c 0.800, CHCl3);IR (KBr):1747, 1693, 1232, 1113 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.04 (9H, s), 1.52 (3H, s), 1.96 (3H, s), 3.71, 3.76 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.94, (2H, AB, J = 10.8 Hz), 4.41 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.54, 4.58 (2H, AB, J = 12.6 Hz), 4.54, 4.58 (2H, AB, J = 12.6 Hz), 5.38 (1H, t, J = 6.0 Hz), 6.16 (1H, d, J = 6.0 Hz), 7.18-7.63 (20H, m), 7.87 (1H,s);13C-NMR (75.45MHz, CDCl3):δ12.0, 19.2, 20.6, 26.9, 63.8, 72.2, 73.7, 74.6, 74.9, 77.7, 85.5, 87.9, 111.3, 127.6, 127.7, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.6, 129.7, 129.9, 132.6, 132.9, 135.5, 135.7, 135.7, 137.2, 137.5, 150.4, 163.6, 170.2;MS(FAB):m/z 749 (MH+), 計算値 C43H48N2O8Si: C, 68.96; H, 6.46; N, 3.74. 実測値 C, 68.92; H, 6.45; N, 3.74。
(3)化合物5の合成
上記(2)で得た化合物4(326mg,0.435mmol)のテトラヒドロフラン溶液(2.4mL)に40%(v/v)メチルアミン溶液(1.1mL,13mmol)を加え、室温にて30分間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1(v/v))により精製し、化合物5(312mg:収率100%)を白色アモルファスとして得た。
得られた化合物5の物性データは、以下のとおりであった:融点:61〜63℃;[α]D 25 -12.2 (c 0.750, CHCl3);IR (KBr): 3403, 3175, 1688, 1468, 1272, 1113 cm-1;1H-NMR (270MHz, CDCl3):δ1.06 (9H, s), 1.60 (3H, s), 3.54, 3.63 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.64 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.73, 3.83 (2H, AB, J =10.5 Hz), 4.31 (1H, d, J = 4.9 Hz,) 4.41 (1H, ddd, J = 4.9 Hz, 4.9 Hz, 10.8 Hz), 4.50 (2H,s), 4.67, 4.73 (2H, AB, J = 11.1 Hz), 5.95 (1H, d, J = 4.9 Hz), 7.21-7.66 (20H, m), 8.12 (1H,s);13C-NMR (67.80MHz, CDCl3):δ12.1, 19.1, 26.8, 64.2, 72.2, 73.8, 74.2, 74.5, 77.2, 78.5, 88.1, 90.9, 110.9, 127.7, 127.8, 127.9, 128.0, 128.1, 128.2, 128.6, 130.0, 132.2, 132.2, 135.6, 135.7, 136.5, 137.2, 150.3, 163.4;MS(FAB): m/z 707 (MH+). 計算値 C41H46N2O7Si: C, 69.66; H, 6.56; N, 3.96. 実測値 C, 69.59; H, 6.59; N, 3.93。
(4)化合物6の合成
窒素気流下、上記(3)で得た化合物5(262mg,0.37mmol)のジクロロメタン溶液(7mL)に、ジメチルアミノピリジン(181mg,1.48mmol)を加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホニルクロリド(0.12mL,1.11mmol)を加え、緩やかに室温条件とした後、1時間撹拌した。飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物6(248mg:収率97%)を白色アモルファスとして得た。
得られた化合物6の物性データは、以下のとおりであった:融点:51〜54℃;[α]D 26 -33.5 (c 1.000, CHCl3);IR (KBr): 1667, 1650, 1563, 1482, 1112 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.03 (9H, s), 1.99 (3H, s), 3.29, 3.34 (2H, AB, J = 10.8 Hz), 3.68, 3.82 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.31 (1H, d, J =3.9 Hz), 4.32, 4.38 (2H, AB, J =12 Hz), 4.60, 4.81 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 5.50 (1H, dd, J =6.3, 3.9 Hz), 6.23 (1H, d, J = 6.3 Hz), 7.08-7.66 (21H, m);13C-NMR (75.45MHz, CDCl3):δ14.0, 18.9, 26.7, 64.0, 69.4, 73.4, 84.0, 87.1, 88.7, 89.9, 119.0, 127.4, 127.6, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.4, 128.5, 129.8, 129.8, 130.1, 131.9, 132.3, 135.3, 135.5, 136.4, 137.0, 159.2, 172.3;MS(FAB): m/z 689 (MH+), 計算値 C41H44N2O6Si: C, 71.48; H, 6.44; N, 4.07. 実測値 C, 71.38; H, 6.49; N, 4.08。
(5)化合物7の合成
上記(4)で得た化合物6(510mg,0.74mmol)のテトラヒドロフラン溶液(11mL)に1N水酸化ナトリウム水溶液(1.90mL)を加え、室温にて11.5時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液で中和後、溶媒留去ジクロロメタンで抽出し、飽和重曹水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1(v/v))により精製し、化合物7(524mg:収率100%)を白色アモルファスとして得た。
得られた化合物7の物性データは、以下のとおりであった:融点:67〜70℃;[α]D 26 +24.5 (c 0.840, CHCl3);IR (KBr): 3347, 3184, 1690, 1471 cm-1;1H-NMR (270MHz, CDCl3):δ1.02 (9H, s), 1.65 (3H, s), 3.48, 3.70 (2H, AB, J = 10.3 Hz), 3.50 (1H, d, J = 7.0 Hz), 3.62, 3.76 (2H, AB, J =10.8 Hz), 4.22 (1H, d, J = 7.0 Hz,) 4.51, 4.78 (2H, AB, J = 7.6 Hz), 4.54 (1H, d, J =11.6 Hz), 4.69 (1H, ddd, J = 5.1, 7.0, 7.6 Hz), 6.15 (1H, d, J = 5.1 Hz), 7.29-7.64 (20H, m), 8.10 (1H,s);13C-NMR (67.80MHz, CDCl3):δ12.0, 18.8, 26.5, 63.9, 69.7, 72.6, 73.6, 75.3, 81.9, 85.3, 85.5, 109.5, 127.5, 127.6, 127.8, 128.0, 128.2, 128.5, 129.5, 129.6, 132.4, 135.4, 135.5, 136.8, 137.2, 137.9, 151.1, 164.3;MS(FAB): m/z 707 (MH+), 計算値 C41H46N2O7Si: C, 69.66; H, 6.56; N, 3.96. 実測値 C, 69.42; H, 6.54; N, 3.97。
(6)化合物9の合成
窒素気流下、上記(5)で得た化合物7(2.86g,4.10mmol)のジクロロメタン溶液(40mL)に、氷冷下、ピリジン(1.65mL,20.5mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(1.37mL,8.20mmol)を加え、氷冷条件で1時間撹拌した。水を加えて酸無水物を分解させた後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体を黄色油状物質として得、フラッシュクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=3:1→2:1(v/v))により簡易精製し、化合物8の粗成績体を淡黄色アモルファスとして得た。
次いで、窒素気流下、化合物8(1.96g,2.34mmol)のジメチルホルムアミド溶液(80mL)にアジ化ナトリウム(0.23g,3.60mmol)を加えて撹拌した。48時間後、溶媒留去し、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=3:1)により精製し、化合物9(1.71g:収率66%(2工程))を白色アモルファスとして得た。
得られた化合物9の物性データは、以下のとおりであった:融点:53〜56℃;[α]D 27 -32.7 (c 0.840, CHCl3);IR (KBr): 3175, 2109, 1686, 1268, 1111 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ0.99 (9H, s), 1.58 (3H, s), 3.63, 3.69 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.91 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 7.2 Hz, 5.4 Hz), 4.23 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.47, 4.53 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.57, 4.75 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.03 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.23-7.60 (20H, m), 8.70 (1H,s);13C-NMR (75.45MHz, CDCl3):δ12.1, 19.1, 26.9, 64.0, 64.6, 72.4, 73.8, 74.6, 79.5, 85.2, 87.9, 111.3, 127.7, 127.7, 127.8, 128.0, 128.2, 128.4, 128.7, 129.7, 129.9, 132.5, 132.8, 135.1, 135.5, 135.7, 136.8, 136.9, 150.2, 163.4;MS(FAB): m/z 732 (MH+), 計算値 C41H45N5O6Si: C, 67.28; H, 6.20; N, 9.57. 実測値 C, 67.25; H, 6.27; N, 9.45。
(7)化合物10の合成
窒素気流下、上記(6)で得た化合物9(1.10g,1.50mmol)のテトラヒドロフラン溶液(30mL)に1Nテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液(2.20mL,2.20mmol)を加え、12.5時間撹拌した。溶媒留去後、水および酢酸エチルを順次加え、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=10:1(v/v)→酢酸エチルのみ)により精製し、化合物10(682.2mg:収率92%)を白色アモルファスとして得た。
得られた化合物10の物性データは、以下のとおりであった:融点:41〜45℃;[α]D 25 +13.3 (c 0.950, CHCl3);IR (KBr): 3435, 2113, 1694, 1459, 1268, 1097 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.63 (3H, s), 2.09 (1H, br), 3.73 (1H, s), 4.04 (1H, t, J = 6.3 Hz), 4.39 (1H, d, J = 6.3 Hz), 4.51, 4.55 (2H, AB, J = 10.2 Hz), 4.56, 4.91 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.18 (1H, d, J = 6.3 Hz), 7.26-7.44 (10H, m), 8.50 (1H,s);13C-NMR (75.45Hz, CDCl3):δ12.2, 63.4, 64.9, 71.8, 73.8, 74.8, 79.4, 86.4, 87.5, 111.5, 127.7, 128.2, 128.2, 128.6, 128.7, 128.8, 135.2, 136.5, 137.0, 150.3, 163.5;MS(FAB): m/z 494 (MH+), 高分解能MS(FAB): 計算値 C25H28N5O6 (MH+): 494.2040. 実測値 494.2045。
(8)化合物11の合成
窒素気流下、上記(7)で得た化合物10(0.20g,0.40mmol)のジメチルホルムアミド溶液(3.1mL)に、粉末モレキュラーシーブス4Å(0.31g)および二クロム酸ピリジニウム(1.50g,4.00mmol)を順次加え、室温条件で撹拌した。4.5時間後、水を加えて数分間撹拌した後、酢酸(2mL)を加え、さらに1時間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、セライトでろ過し、酢酸エチルで抽出した。有機層を0.4Mシュウ酸水溶液(30mL)および0.3Mシュウ酸アンモニウム水溶液(30mL)で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去し、化合物11(0.20g:収率100%)を淡黄色固体として得た。
得られた化合物11の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.64 (3H, s), 3.83 (1H, dd, J = 8.4, 5.4 Hz), 3.84, 4.12 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.45 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.59, 4.65 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.75, 4.82 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 5.89 (1H, br), 6.54 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.28-7.44 (10H, m), 7.99 (1H, s), 9.31 (1H, br);MS(FAB): m/z 508 (MH+),高分解能MS(FAB): 計算値 C25H25N5O7 (MH+): 508.1832. 実測値 508.1825。
(9)化合物13の合成
上記(8)で得た化合物11(389.7mg,0.77mmol)を水:テトラヒドロフラン=1:3の混合溶液(5mL)に溶解し、トリブチルホスフィン(0.96mL,3.85mmol)を加えて室温下撹拌した。3.5時間後、溶媒留去したものをメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。溶媒留去後、化合物12の粗成績体(380mg)を油状物質として得、続く閉環反応に用いた。
窒素気流下、化合物12のDMF溶液(11mL)に、氷冷下、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(221mg,1.16mmol)を加え、21.5時間室温下撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1(v/v)→酢酸エチルのみ)により精製し、化合物13(191.3mg:収率54%(2工程))を油状物質として得た。
得られた化合物13の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 +62.1 (c 0.400, CHCl3);IR (KBr): 3186, 1692, 1469, 1455, 1272, 1112 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.61 (3H, s), 3.96, 4.11 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.13 (1H, s), 4.22 (1H, s), 4.56 (2H, s), 4.60, 4.67 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 5.45 (1H, s), 6.58 (1H, br), 7.21-7.56 (10H, m), 7.57 (1H, s), 9.24 (1H, br);13C-NMR (67.80Hz, CDCl3): 12.3, 58.4, 63.0, 72.4, 74.0, 78.3, 86.2, 86.6, 110.9, 127.8, 127.8, 128.1, 128.3, 128.5, 128.6, 135.1, 136.2, 137.4, 142.0, 150.5, 163.8, 174.3;MS(FAB): m/z 464 (MH+)。
(10)化合物14の合成
窒素気流下、上記(9)で得た化合物13(101mg,0.22mmol)のテトラヒドロフラン溶液(2.2mL)に20%(v/v)水酸化パラジウムカーボン(100mg)を加え、水素気流下、3時間撹拌した。熱時ろ過を行い、温メタノール(150mL)で洗浄後、溶媒留去し、粗成績体を得た。メタノールで再結晶を行い、化合物14(57.2mg:収率93%)を白色固体として得た。
得られた化合物14の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 +31.6 (c 0.700, CH3OH);IR (KBr): 3255, 2925, 2852, 1692, 1466, 1231, 1065 cm-1;1H-NMR (300MHz, CD3OD):δ1.89 (3H, s), 3.88, 4.04 (2H, AB, J = 12.9 Hz), 4.12 (1H, s), 4.30 (1H, s), 5.38 (1H, s), 7.86 (1H, s)。
(11)化合物15の合成
窒素気流下、上記(10)で得た化合物14(27.3mg,0.10mmol)の無水ピリジン溶液(0.8mL)に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(48.8mg,0.14mmol)を加え、3時間撹拌した。飽和重曹水を加えて数分間撹拌し、溶媒留去した後、飽和重曹水/酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=10:1(v/v)→酢酸エチルのみ)により精製し、化合物15(47.6mg:収率85%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物15の物性データは、以下のとおりであった:融点:79〜81℃;IR (KBr): 3342, 3063, 2928, 1690, 1509, 1270, 1253,1177, 1035 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.66 (3H, s), 3.61, 3.92 (2H, AB, J = 12.8 Hz), 3.78 (6H, s), 4.26 (1H, s), 4.46 (1H, s), 5.42 (1H, s), 6.86-7.45 (13H, m), 7.78 (1H,s);MS(FAB): m/z 586 (MH+)。
(12)化合物16の合成
窒素気流下、上記(11)で得た化合物15(100mg,0.17mmol)の無水アセトニトリル−テトラヒドロフラン溶液(3:1(v/v))(2.0mL)に、N,N−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(22.2mg,0.13mmol)、2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(54.0μL,0.17mmol)を加えて撹拌した。1.5時間後、飽和重曹水を加えて数分間撹拌した後、水/酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール:トリエチルアミン=50:1:1(v/v/v))により精製し、粗成績体を得た。得られた粗成績体をジクロロメタンに溶解し、n−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物16(29.4mg,22%)を白色粉体として得た。
得られた化合物16の物性データは、以下のとおりであった:融点:110〜112℃ (CH2Cl2);31P-NMR (202.35MHz, CDCl3):δ149.74, 150.12;MS(FAB): m/z 786 (MH+), 高分解能MS(FAB): 計算値 C41H49N5O9 (MH+): 786.3268. 実測値 786.3266。
(実施例2)オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例1で得た化合物16を含有する10merのオリゴヌクレオチド類縁体(化合物17〜20:以下の表1に示す)を、ExpediteTM 8909(ABI社製)により0.2μmolスケールで合成した。ただし、標準的なホスホロアミダイトプロトコルにおけるキャッピングの工程を省いた。また、化合物16(アミダイトユニット)は、テトラヒドロフランに溶解して用いた。なお、表1において、化合物16はXと表記する。アミダイトユニット(化合物16)と5’−末端の水酸基とのカップリング時間は、1.5分(標準条件)から20分に延長した。5’−末端がDMTr基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、0.05M炭酸カリウムのメタノール溶液で処理し、5%(w/v)塩酸で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体をゲルろ過カラムNAPTM 10Column(GE Health Care社製)により粗精製した後、逆相HPLC(SHIMADZU LC−10ATVP,SHIMADZU SPD−10AVP,SHIMADZU CTO−10VP、分取カラムとしてWatersXTerra(登録商標)(10mm×50mm))により精製した。
合成したオリゴヌクレオチド類縁体(化合物17〜20)の純度は、逆相HPLC(WatersXTerra(登録商標)MS C18 2.5μm,4.6mm×50mm))により確認した(条件:0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー(pH7.0)中、1mL/分で30分の7→13%(v/v)アセトニトリルのグラジエント)。また、分子量は、MALDI−TOF−MASS測定により決定した。結果を表1に示す。
また、比較のために、天然型のオリゴヌクレオチド(化合物21)を含有するオリゴヌクレオチド(以下の表2に示す)、および公知の2’,4’−BNA/LNA(5−メチル−2’−O,4’−C−メチレンウリジン:非特許文献6に従って合成)を含有するオリゴヌクレオチド類縁体(化合物22〜24:以下の表2に示す)も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。なお、表2において、2’,4’−BNA/LNAはYと表記する。
(実施例3)融解温度(Tm)の測定
上記実施例2で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物17〜19および21〜24(アンチセンス鎖)とセンス鎖(3’−AAAAAAAAAA−5’)とをアニーリング処理した後、Tm値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。Tm値とは、二重鎖核酸の50%解離温度であり、この値が高いほど、核酸二重鎖が高い結合力を有する。
NaCl 100mM、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)10mM、アンチセンス鎖4μM、およびセンス鎖4μMを含むサンプル溶液(130μL)を沸騰水浴で加熱した後、10時間かけて室温まで冷却した。分光光度計(Shimadzu,UV−1650PC)のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を5℃まで徐々に冷却し、さらに20分間10℃に保った後、測定を開始した。温度は85℃まで毎分0.5℃ずつ上昇させ、0.1℃間隔で260nmにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表2に示す。
表2から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖DNAに対する親和性に比較して一本鎖RNAに対する親和性が高く、その親和性は、公知の2’,4’−BNA/LNAと同等であった。また、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Tm値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、2’,4’−BNA/LNAと同様に、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
(実施例4)ヌクレオシド類縁体:2’−アミノ−2’−デオキシ−2’−N,4’−C−オキソメチレンアデノシン(化合物34)の合成
(1)化合物28の合成
窒素気流下、化合物26(500mg,0.68mmol)を水:テトラヒドロフラン=1:3(v/v)の溶液(4.5mL)に溶解し、トリブチルホスフィン(0.85mL,3.42mmol)を加えて室温にて8時間撹拌した。溶媒留去後、残渣をメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。溶媒留去後、粗成績体27を油状物質として得、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1→2:1(v/v))により簡易精製した後、次の反応に用いた。
窒素気流下、粗成績体27のジクロロメタン溶液(6mL)に、ピリジン(0.16mL,2.05mmol)を加えた。氷冷後、トリフルオロ酢酸無水物(0.10mL,0.75mL)を加え、0.5時間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1→2:1(v/v))により精製し、化合物28(341.4mg:収率62%(2工程))を白色泡状物質として得た。
得られた化合物28の物性データは、以下のとおりであった:IR (KBr): 3185, 2961, 1713, 1211, 1158, 1094 cm-1;1H-NMR (300MHz, CDCl3):δ1.04 (9H, s), 1.59 (3H, s), 3.54, 3.78 (2H, AB, J = 10 Hz), 3.65, 4.02 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 4.28 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.55, 4.71 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.58, 4.63 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.94 (1H, dd, J = 5.5 Hz, 8 Hz), 6.22 (1H, d, J = 8 Hz), 7.19-7.84 (20H, m), 8.68 (1H, s);13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3):δ12.1, 19.1, 27.0, 55.9, 63.7, 73.0, 75.4, 79.6, 85.0, 88.2, 112.1, 115.4, 127.7, 127.8, 128.1, 128.1, 128.2, 128.5, 128.7, 129.8, 151.1, 157.8, 163.9;MS(FAB): m/z 802 (MH+), 高分解能MS(FAB):計算値 C43H47F3N3O7Si (MH): 802.3135. 実測値 802.3143。
(2)化合物29の合成
窒素気流下、上記(1)で得た化合物28(103mg,0.13mmol)のジクロロエタン溶液(2.5mL)にN6−ベンゾイルアデニン(80.4mg,0.34mmol)およびN,O−ビストリメチルシリルアセトアミド(246μL,1.01mmol)を加え、透明になるまで加熱撹拌した。反応液を常温まで戻し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(16.3μL,0.09mmol)を加えて3.5時間還流撹拌した。次いで、飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水、次いで重曹水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1→3:1(v/v))により精製し、化合物29(90.3mg:収率77%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物29の物性データは、以下のとおりであった:IR (KBr): 3402, 3246, 3068, 2931, 2858, 1722, 1638, 1218, 1105 cm-1;1H-NMR (300 MHz, CDCl3) :δ1.06 (9H, s), 3.54, 3.83 (2H, AB, J = 10 Hz), 3.78, 4.10 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.44 (1H, d, J = 6 Hz), 4.51, 4.66 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.54, 4.76 (2H, AB, J = 11 Hz), 5.29 (1H, dd, J = 6 Hz, 7.5 Hz), 6.11 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.16-8.02 (25H, m), 8.26 (1H, s), 8.70 (1H, s);13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3):δ19.1, 26.9, 56.4, 63.4, 72.0, 73.8, 75.5, 79.7, 86.1, 89.1, 122.9, 127.8, 128.0, 128.2, 128.3, 128.6, 128.7, 128.8, 129.9, 130.0, 132.3, 132.6, 132.6, 133.6, 135.5, 135.7, 136.3, 136.9, 141.1, 149.5, 151.7, 152.6, 157.1, 164.6;MS(FAB): m/z 915 (MH+), 高分解能MS(FAB):計算値 C50H50F3N6O6Si (MH):915.3513. 実測値 915.3537。
(3)化合物30の合成
窒素気流下、上記(2)で得た化合物29(40mg,0.044mmol)のテトラヒドロフラン溶液(1.0mL)にフッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(1Mテトラヒドロフラン溶液,49μL,0.049mmol)を加えて室温にて15分間撹拌した。溶媒留去後、水を加えて酢酸エチルで3回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(2g,n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1→2:3)により精製し、化合物30(25.5mg:収率86%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物30の物性データは、以下のとおりであった:[α] D 26 -15.9 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr): 3395, 2928, 3271, 1722, 1613, 1216, 1184 cm-1;1H-NMR (300 MHz, CDCl3):δ1.60 (1H, s), 3.24 (1H, s), 3.40, 3.47 (2H, AB, J = 10 Hz), 3.78, 3.91 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.33 (2H, s), 4.52, 4.62 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.89 (1H, d, J = 6.0 Hz), 5.41 (1H, d, J = 6.0 Hz), 6.33 (1H, s), 7.12-7.71 (13H, m), 8.02 (2H, d, J = 7.5 Hz), 8.25 (1H, s), 8.68 (1H, s), 9.44 (1H, s);MS(FAB): m/z 677 (MH+), 高分解能MS(FAB):計算値 C34H32F3N6O6 (MH): 677.2335. 実測値 677.2349。
(4)化合物31の合成
窒素気流下、上記(3)で得た化合物30(213mg,0.315mmol)をジメチルホルムアミド(1.5mL)に溶解し、ピリジニウムジクロマート(872mg,3.15mmol)、モレキュラーシーブス4Åを300mg加えて、室温にて17時間撹拌した。水を加え、さらに酢酸(1.5mL)を加えて撹拌した後、酢酸エチルで希釈し、セライトろ過を行った。酢酸エチルで抽出し、有機層をシュウ酸緩衝液で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成績体31を白色固体として得た(169mg:収率78%)。
得られた化合物31の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 -43.8 (c 1.000, CHCl3);IR (KBr): 3256, 3061, 2923, 2871, 1725, 1613, 1584, 1218, 1173 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ3.76, 3.97 (2H, AB, J = 10.6 Hz), 4.41, 4.60 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.44, 4.54 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.63 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.19 (1H, dd, J = 6.5 Hz, 8.7 Hz), 6.40 (1H, d, J = 6.5 Hz), 7.17-7.58 (13H, m), 7.99 (2H, d, J = 7.8 Hz), 8.37 (1H, s), 8.56 (1H, s), 9.57 (1H, s);13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3):δ55.8, 70.4, 73.8, 75.3, 78.7, 87.7, 90.4, 116.7, 122.6, 127.9, 128.2, 128.4, 128.6, 128.7, 133.0, 135.8, 136.6, 141.9, 149.5, 151.8, 157.4, 165.2。
(5)化合物33の合成
窒素気流下、上記(4)で得た化合物31(1.09g,1.58mmol)をメタノール(15mL)に溶解し、28%(v/v)アンモニア水(10mL)を加えて室温にて19時間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチル/水で抽出し、水層を回収して溶媒留去した。得られた粉末状の組成績体32をアセトニトリルと共沸後、次の反応に用いた。
粗成績体32(766mg,1.56mmol)をジメチルホルムアミド(20mL)に溶解し、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(299mg,1.87mmol)を加え、室温にて16時間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=20:1(v/v))により精製し、白色固体33(185mg:収率25%(2工程))を得た。
得られた化合物33の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ3.94, 4.07 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.31 (1H, s), 4.43, 4.54 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.48 (1H, s), 4.63, 4.72 (2H, AB, J = 12 Hz), 5.61 (2H, s), 5.85 (1H, s), 6.01 (1H, s), 7.00-7.52 (10H, m), 8.15 (1H, s), 8.32 (1H, s)。
(6)化合物34の合成
窒素気流下、上記(5)で得た化合物33(33.6mg,0.071mmol)をエタノール(1mL)に溶解し、20%水酸化パラジウムカーボン(33mg)、シクロへキセン(1mL)を加え、窒素気流下、4時間加熱還流した。反応液を自然ろ過し、温メタノールで洗浄後、溶媒留去した。得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)により精製し、白色固体34(18.7mg:収率90%)を得た。
得られた化合物34の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ3.82, 3.98 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.34 (1H, s), 4.40 (1H, s), 5.76 (1H, s), 8.12 (1H, s), 8.26 (1H, s)。
(実施例5)ヌクレオシド類縁体:2’−アミノ−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−N,4’−C−オキソエチレンチミジン(化合物51:amide6NH)の合成
(1)化合物35の合成
窒素気流下、化合物1(6.03g,15.1mmol)の無水ジクロロメタン溶液(150mL)に、ジメチルスルホキシド(13.0mL,181mmol)、トリエチルアミン(8.50mL,60.2mmol)、および三酸化硫黄ピリジン錯体(9.60g,60.2mmol)を加え、室温にて4時間撹拌した。反応液に水を加えてクエンチし、ジエチルエーテルで希釈して3回抽出した。有機層を回収し、水で3回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物35の粗成績体(4.29g)を得た。
(2)化合物36の合成
窒素気流下、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド(11.5g,32.3mmol)の無水テトラヒドロフラン懸濁液(30mL)に、0℃にてn−ブチルリチウム(1.6Mのn−ヘキサン溶液,27.0mL,43.1mmol)を滴下し、室温にて1時間撹拌した。反応液に、上記(1)で得た化合物35の粗成績体の無水テトラヒドロフラン溶液(100mL)を滴下し、室温にて12時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチし、ジエチルエーテルで3回抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(8.91g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(150g,n−ヘキサン:酢酸エチル=5:1(v/v))により精製し、化合物36(3.22g:収率54%(2工程))を無色油状物質として得た。
得られた化合物36の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.27 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 3.30, 3.32 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.24 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.50, 4.39 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.55-4.59 (m, 2H), 4.75 (AB, J = 12.5 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 17.5 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.18 (dd, J = 11.0, 17.5 Hz, 1H), 7.20-7.38 (m, 10H)。
(3)化合物37の合成
窒素気流下、上記(2)で得た化合物36(4.36g,11.0mmol)の無水テトラヒドロフラン溶液(150mL)にボラビシクロノナン(0.5Mテトラヒドロフラン溶液,66mL,33.0mmol)を滴下し、室温にて19時間撹拌した。反応液に水を加えてクエンチし、水酸化ナトリウム水溶液(3M,23.0mL,70.4mmol)、35%(v/v)過酸化水素水(6.0mL,70.4mmol)を加え、室温にて0.5時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルで3回抽出し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(7.43g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100g,n−ヘキサン:酢酸エチル=3:1(v/v))により精製し、化合物37(3.96g:収率87%)を無色油状物質として得た。
得られた化合物37の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.32 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.77 (ddd, J = 4.0, 6.5, 15.5 Hz, 1H), 2.50 (ddd, J = 4.0, 8.5, 15.5 Hz, 1H), 2.85 (s, 1H), 3.29, 3.53 (AB, J = 10.0 Hz, 2H), 3.72-3.85 (m, 2H), 4.11 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.42, 4.50 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.53, 4.76 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.64 (dd, J = 4.0, 5.5 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.23-7.33 (m, 10H)。
(4)化合物38の合成
窒素気流下、上記(3)で得られた化合物37(3.96g,9.56mmol)のジクロロメタン溶液(100mL)にN,N−ジメチル−4−アミノピリジン(350mg,2.87mmol)およびトリエチルアミン(4.0mL,28.7mmol)を加え、0℃にてtert−ブチルジフェニルクロロシラン(4.0mL,15.3mmol)を滴下し、反応液を室温にて16時間撹拌した。反応液に水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで3回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(8.82g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(200g,n−ヘキサン:酢酸エチル=10:1(v/v))により精製し、化合物38(6.28g:定量的)を無色油状物質として得た。
得られた化合物38の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 +16.3 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3068, 3031, 2932, 2857, 1454, 1428, 1382, 1209 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ0.99 (s, 9H), 1.28 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.85 (ddd, J = 7.0, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.43 (ddd, J = 5.0, 6.5, 14.5 Hz, 1H), 3.28, 3.69 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.83-3.94 (AB, m, 2H), 4.20 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.33, 4.46 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 4.58 (dd, J = 3.5, 5.5 Hz, 1H), 4.52, 4.73 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 5.74 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.17-7.68 (m, 20H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ19.2, 26.3, 26.7, 26.9, 35.0, 59.9, 68.1, 72.5, 73.5, 78.0, 79.4, 86.8, 104.3, 113.1, 127.7, 127.7, 127.7, 127.9, 127.9, 128.4, 128.4, 129.6, 134.0, 134.0, 135.7, 138.2, 138.3;MS (FAB): m/z 675 (M+Na+), 高分解能MS(FAB):計算値 C40H48O6SiNa (M+Na+):675.3118. 実測値:675.3115。
(5)化合物39の合成
窒素気流下、上記(4)で得た化合物38(5.86g,8.98mmol)の酢酸溶液(30mL)に無水酢酸(10mL,108mmol)、0.1%(w/v)硫酸(4.0mL,酢酸溶液)を滴下し、室温にて2時間撹拌した。反応液に0℃にて飽和重曹水を加えてクエンチし、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和重曹水で1回、水で1回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(6.18g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(200g,n−ヘキサン:酢酸エチル=5:1(v/v))により精製し、化合物39(5.67g:収率91%)を無色油状物質として得た。
得られた化合物39の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 24 -16.3 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3069, 3031, 2931, 2857, 1748, 1428, 1369, 1219 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.01 (s, 9H), 1.82 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.96-2.13 (m, 2H), 3.37, 3.49 (AB, J = 10.0 Hz, 2H), 3.79-3.92 (m, 2H), 4.34-4.42 (m, 3H), 4.45, 4.56 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 5.27 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 6.01 (s, 1H), 7.20-7.67 (m, 20H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ19.2, 20.7, 21.1, 26.9, 35.9, 59.9, 73.3, 73.6, 74.8, 78.2, 86.8, 97.8, 127.5, 127.6, 127.7, 127.8, 127.9, 128.4, 128.5, 129.6, 134.0, 134.0, 135.7, 138.0, 138.3, 169.5, 169.8;MS (FAB): m/z 719 (M+Na+), 高分解能MS(FAB):計算値 C41H48O8SiNa (M+Na+):719.3016. 実測値:719.2999。
(6)化合物40の合成
窒素気流下、上記(5)で得た化合物39(5.57g,8.00mmol)の無水アセトニトリル溶液(20mL)にチミン(1.41g,11.2mmol)を加え、N,O−ビストリメチルシリルアセトアミド(6.8mL,28.0mmol)を滴下し、1.5時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却し、0℃にてトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(1.9mL,10.4mmol)を滴下し、3.5時間加熱還流した。反応液に0℃にて飽和重曹水を加えてクエンチし、酢酸エチルで希釈して3回抽出した。有機層を水で1回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(5.71g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(150g,n−ヘキサン:酢酸エチル=3:2(v/v))により精製し、化合物40(5.14g:収率84%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物40の物性データは、以下のとおりであった:融点 45-48℃;[α]D 25 +10.2 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3172, 3068, 2930, 2857, 1747, 1693, 1470, 1372, 1234 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.01 (s, 9H), 1.48 (s, 3H), 1.76-1.83 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.03-2.11 (m, 1H), 3.41, 3.89 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.71-3.83 (m, 2H), 4.35 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.39, 4.44 (AB, J = 9.5 Hz, 2H), 4.38, 4.57 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.35 (dd, J = 5.0, 6.5 Hz, 1H), 6.08 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.20-7.41 (m, 16H), 7.49 (s, 1H), 7.60-7.65 (m, 4H), 7.83 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.1, 19.2, 20.9, 27.0, 35.2, 59.4, 73.2, 73.5, 74.4, 75.4, 77.6, 86.2, 87.5, 111.3, 127.7, 127.8, 128.0, 128.1, 128.6, 128.7, 129.8, 133.6, 133.6, 135.6, 135.8, 137.5, 137.6, 150.4, 163.7, 170.2。
(7)化合物41の合成
上記(6)で得た化合物40(5.04g,6.61mmol)のメタノール溶液(10mL)に、炭酸カリウム(450mg,3.30mmol)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、水を加えて酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(4.76g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100g,n−ヘキサン:酢酸エチル=4:3(v/v))により精製し、化合物41(4.54g:収率95%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物41の物性データは、以下のとおりであった:融点 62-64℃;[α]D 26 -10.3 (c 1.00, CHCl3); IR (KBr):3423, 3179, 3066, 2928, 2856, 1695, 1471, 1428, 1270 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.06 (s, 9H), 1.56 (s, 3H), 1.77 (ddd, J = 6.5, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.14 (dt, J = 5.0, 14.5 Hz, 1H), 2.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.45, 3.85 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.73-3.88 (AB, m, 2H), 3.85 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.46, 4.49 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.56, 4.63 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 5.82 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.22-7.65 (m, 21H), 8.12 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.2, 19.2, 27.0, 35.5, 59.5, 73.6, 74.2, 74.7, 75.2, 79.5, 87.2, 88.6, 111.1, 127.6, 127.8, 127.8, 128.1, 128.2, 128.4, 128.7, 128.7, 129.8, 129.8, 133.6, 135.6, 136.0, 137.2, 137.5, 150.9, 163.8。
(8)化合物42の合成
窒素気流下、上記(7)で得た化合物41(3.26g,4.52mmol)の無水ジクロロメタン溶液(40mL)にトリエチルアミン(6.3mL,45.2mmol)および塩化メタンスルホニル(0.70mL,9.04mmol)を加え、0℃にて1.5時間撹拌した。0℃にて飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を水で1回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(3.80g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100g,n−ヘキサン:酢酸エチル=4:3(v/v))により精製し、化合物42(3.29g:収率91%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物42の物性データは、以下のとおりであった:融点 57-62℃;[α]D 22 +214.8 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr): 3168, 3068, 3031, 2932, 2857, 1694, 1471, 1361, 1178 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.02 (s, 9H), 1.44 (s, 3H), 1.85 (ddd, J = 6.5, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.10 (dt, J = 5.0, 14.5 Hz, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.44, 3.95 (AB, J = 6.5 Hz, 2H), 3.70-3.86 (m, 2H), 4.33 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.37, 4.42 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.45, 4.83 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 5.26 (dd, J = 3.0, 5.0 Hz, 1H), 6.01 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.18-7.63 (m, 21H), 8.29 (s, 1H);13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3):δ11.9, 19.1, 26.8, 35.1, 38.8, 59.1, 72.6, 73.4, 73.8, 75.7, 80.3, 86.7, 87.8, 111.2, 127.6, 127.6, 127.7, 128.1, 128.3, 128.4, 128.6, 129.7, 129.7, 133.3, 133.4, 135.3, 135.5, 137.1, 137.2, 150.5, 163.5。
(9)化合物43の合成
上記(8)で得た化合物42(3.16g,3.95mmol)のエタノール溶液(40mL)に水酸化ナトリウム水溶液(1M,12mL,12.0mmol)を滴下し、室温にて12時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチし、酢酸エチルで3回抽出した。水で1回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(2.72g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100g,n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1(v/v))で精製し、化合物43(2.55g:収率89%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物43の物性データは、以下のとおりであった:融点 56-58℃;[α]D 26 +43.5 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3357, 3181, 3068, 3031, 2929, 2856, 1695, 1472, 1428, 1281 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.02 (s, 9H), 1.71 (d, J = 1.5 Hz, 3H), 1.83-1.98 (m, 2H), 3.55, 3.94 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.70-3.86 (m, 2H), 3.96 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.28 (ddd, J = 3.0, 4.0, 9.0 Hz, 1H), 4.45, 4.70 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.49, 4.53 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.93 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.22-7.63 (m, 20H), 7.48 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.4, 19.2, 27.0, 35.3, 59.7, 72.8, 73.1, 73.8, 74.8, 83.9, 84.8, 85.2, 109.4, 127.8, 128.0, 128.1, 128.5, 128.8, 129.9, 133.6, 135.6, 136.8, 137.5, 137.7, 150.8, 164.1。
(10)化合物44の合成
窒素気流下、上記(9)で得た化合物43(2.07g,2.87mmol)の無水ジクロロメタン溶液(30mL)に無水ピリジン(1.9mL,17.2mmol)を加え、0℃にてトリフルオロメタンスルホン酸無水物(1.4mL,8.60mmol)を滴下し、0.5時間撹拌した。0℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を水で1回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(2.56g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100g,n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1)により精製し、化合物44(2.03g:収率83%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物44の物性データは、以下のとおりであった:融点 37-40℃;[α]D 25 +37.1 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3190, 3069, 2930, 2858, 1695, 1455, 1426, 1245, 1215, 1143 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.02 (s, 9H), 1.68 (s, 3H), 1.81-1.94 (m, 2H), 3.36, 3.69 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.72-3.86 (m, 2H), 4.38, 4.43 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 4.48, 4.72 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 5.35 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 6.20 (d, J =4.5 Hz, 1H), 7.19-7.63 (m, 21H), 8.81 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.4, 19.2, 26.9, 34.2, 59.2, 71.4, 73.5, 73.7, 80.7, 81.7, 84.6, 87.7, 111.1, 127.8, 128.1, 128.2, 128.5, 128.7, 129.9, 129.9, 133.5, 135.6, 136.7, 137.3, 150.1, 163.4;MS (FAB): m/z 853 (M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C43H48N2O9F3SiS (M+H+):853.2802. 実測値:853.2813。
(11)化合物45の合成
窒素気流下、上記(10)で得た化合物44(2.03g,2.38mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(20mL)にアジ化ナトリウム(464mg,7.14mmol)を加え、室温にて13時間撹拌した。反応液に水を加えてジエチルエーテルで3回抽出し、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(2.20g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(150g,n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1(v/v))により精製し、化合物45(1.80g:定量的)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物45の物性データは、以下のとおりであった:融点 46-49℃;[α]D 25 -5.1 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr): 3179, 3068, 2929, 2857, 2109, 1694, 1470, 1428, 1268 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.02 (s, 9H), 1.56 (s, 3H), 1.77 (ddd, J = 6.5, 8.0, 14.5 Hz, 1H), 2.15 (dt, J = 5.0, 14.5 Hz, 1H), 3.44, 3.91 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 3.70-3.85 (m, 2H), 3.97 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.28 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.42, 4.48 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.48, 4.78 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.99 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.20-7.63 (m, 20H), 7.49 (s, 1H), 8.66 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.2, 19.2, 27.0, 35.4, 59.4, 65.3, 73.6, 73.6, 74.4, 79.2, 86.1, 87.7, 111.2, 127.7, 127.8, 128.2, 128.3, 128.4, 128.6, 128.8, 129.8, 128.9, 133.6, 135.4, 135.7, 137.0, 137.3, 150.3, 163.6;MS (FAB): m/z 746 (M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C42H48N5O6Si (M+H+):746.3374. 実測値:746.3404。
(12)化合物46の合成
窒素気流下、上記(11)で得た化合物45(1.78g,2.39mmol)の無水テトラヒドロフラン溶液(20mL)にフッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(1Mテトラヒドロフラン溶液,2.6mL,2.60mmol)を滴下し、室温にて17時間撹拌した。反応液に水を加えて酢酸エチルで3回抽出し、有機層を飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(2.20g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(75g,n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1(v/v))により精製し、化合物46(1.22g:定量的)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物46の物性データは、以下のとおりであった:融点 45-50℃;[α]D 25 +10.2 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3441, 3181, 3063, 2927, 2108, 1693, 1469, 1455, 1267 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.56 (s, 3H), 1.66 (br, 1H), 1.76 (dt, J = 6.0, 15.0 Hz, 1H), 2.21 (dt, J = 6.0, 15.0 Hz, 1H), 3.44, 3.82 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.75 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.47, 4.53 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.55, 4.83 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 6.10 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.22-7.38 (m, 10H), 7.44 (s, 1H), 8.34 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.2, 34.9, 58.3, 65.0, 73.4, 73.8, 74.6, 79.6, 86.4, 87.9, 111.5, 127.8, 128.2, 128.4, 128.5, 128.7, 128.8, 135.4, 136.9, 137.1, 150.5, 163.8;MS (FAB): m/z 508 (M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C26H30N5O6 (M+H+):508.2196. 実測値:508.2204。
(13)化合物47の合成
窒素気流下、上記(12)で得た化合物46(1.22g,2.40mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(20mL)に粉末状のモレキュラーシーブス4Å(3.0g)および二クロム酸ピリジニウム(10.9g,28.8mmol)を加え、室温にて12時間撹拌した。反応液に酢酸(5.0mL)および水を加え、酢酸エチルで希釈してセライトろ過した。ろ液を酢酸エチルで3回抽出し、有機層をシュウ酸水溶液(0.4M,200mL)で1回、シュウ酸アンモニウム水溶液(0.2M,200mL)で1回、次いで飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(3.20g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(75g,n−ヘキサン:酢酸エチル:酢酸=50:50:1(v/v/v))により精製し、化合物47(1.18g:収率94%)を白色泡状物質として得た。
得られた化合物47の物性データは、以下のとおりであった:融点 78-81℃;[α]D 25 -29.4 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr):3510, 3179, 3033, 2929, 2108, 1705, 1470, 1455, 1269, 1213 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.56 (s, 3H), 2.71, 2.88 (AB, J = 16.5 Hz, 2H), 3.77, 3.94 (AB, J = 10.0 Hz, 2H), 3.99 (dd, J = 5.5, 7.0 Hz, 2H), 4.37 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.53, 4.61 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 4.49, 4.88 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 6.22 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.20-7.48 (m, 11H), 9.65 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.1, 38.0, 65.0, 73.8, 74.0, 75.3, 80.3, 85.3, 86.4, 111.7, 127.8, 128.1, 128.2, 128.5, 128.5, 128.9, 135.6, 136.8, 137.0, 150.1, 164.4, 175.1;MS (FAB): m/z 522 (M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C26H28N5O7 (M+H+):522.1989. 実測値:522.1979。
(14)化合物48の合成
上記(13)で得た化合物47(241mg,0.462mmol)のテトラヒドロフラン/水(5:1(v/v))溶液(241mg,0.462mmol,6mL)にトリメチルホスフィン(1Mトルエン溶液,0.55mL,0.550mmol)を滴下し、室温にて24時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(293mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(10g,クロロホルム:メタノール=30:1(v/v))により精製し、化合物48(106mg:収率43%)を白色粉末として得た。
得られた化合物48の物性データは、以下のとおりであった:融点 112-114℃;[α]D 21 +78.9 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr): 3500, 3169, 3063, 2927, 1684, 1454, 1367, 1273, 1211 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.36 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.40, 2.57 (AB, J = 18.0 Hz, 2H), 3.58, 3.72 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.05 (dd, J = 3.5, 5.5 Hz, 2H), 4.24 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.54, 4.58 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 4.51, 4.65 (AB, J = 11.5 Hz, 2H), 5.76 (s, 1H), 6.86 (br, 1H), 7.24-7.35 (m, 10H), 7.92 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 9.40 (br, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ11.9, 38.6, 55.7, 68.7, 70.6, 71.9, 73.6, 83.8, 90.1, 109.6, 127.5, 127.9, 128.0, 128.2, 128.4, 128.7, 135.5, 137.0, 137.1, 150.7, 164.2, 169.6;MS (FAB):m/z 478(M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C26H28N3O6 (M+H+):478.1978. 実測値:478.1983。
(15)化合物49の合成
窒素気流下、上記(14)で得た化合物48(50mg,0.105mmol)のテトラヒドロフラン溶液(2mL)に20%(v/v)水酸化パラジウムカーボン(50mg)を加え、水素気流下、室温にて26時間撹拌した。ひだ折りろ紙によりろ過後、メタノールで洗浄後、溶媒留去した。メタノール(2mL)および20%(v/v)水酸化パラジウムカーボン(50mg)を加え、さらに水素気流下、24時間撹拌した。ひだ折りろ紙によりろ過後、メタノールで洗浄後、溶媒留去した。メタノールで再結晶を行い、化合物49(19.1mg:収率61%)を白色固体として得た。
得られた化合物49の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 23 +36.5 (c 0.200, CH3OH);IR (KBr): 3449, 3318, 3175, 3060, 2926, 2819, 1707, 1651, 1469, 1386, 1272, 1215 cm-1;1H-NMR (300 MHz, CD3OD):δ1.86 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.29, 2.46 (AB, J = 18.0 Hz, 2H), 3.69, 3.75 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 3.83 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.69 (s, 1H), 8.36 (d, J = 1.0 Hz, 1H);13C-NMR (100.53 MHz, CD3OD):δ12.5, 38.8, 60.0, 61.8, 64.4, 86.0, 91.0, 110.1, 137.8, 152.1, 166.6, 173.3;MS (FAB):m/z 298(M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C26H28N3O6 (M+H+):298.1039. 実測値:298.1044。
(16)化合物50の合成
窒素気流下、上記(15)で得た化合物49(28mg,0.094mmol)の無水ピリジン溶液(2mL)に、0℃にて4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(95.7mg,0.283mmol)を加え、室温にて3時間撹拌した。0℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(159mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5.0g,クロロホルム:メタノール=20:1)により精製し、化合物50(45.9mg:収率81%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物50の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 23 +80.7 (c 1.00, CHCl3);IR (KBr): 3562, 3341, 3062, 2933, 2838, 1704, 1657, 1608, 1509, 1465, 1253 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ1.21 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.42 (s, 2H), 3.36 (s, 2H), 3.77 (s, 6H), 3.93 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.67 (s, 1H), 6.86-7.48 (m, 13H), 7.90 (d, J = 1.0 Hz, 1H);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 12.26, 39.34, 55.72, 59.80, 64.27, 65.71, 79.46, 85.55, 88.07, 91.72, 110.64, 114.27, 128.20, 129.02, 129.46, 131.46, 136.40, 136.61, 136.90, 145.76, 152.01, 160.36, 166.56, 173.01;MS (FAB): m/z 600 (M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C26H28N3O6 (M+H+):600.2346. 実測値:600.2347。
(17)化合物51の合成
窒素気流下、上記(16)で得た化合物50(72mg,0.120mmol)の無水テトラヒドロフラン/アセトニトリル(3:1(v/v))溶液(2.0mL)に1H−テトラゾール(10.1mg,0.144mmol)、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミジド(46μL,0.14mmol)を加え、室温にて12時間撹拌した。0℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和重曹水で1回、飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(99mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(3.0g,クロロホルム:メタノール=20:1)で精製し、粗成績体(70.2mg,73%)を得た。得られた粗成績体をジクロロメタンに溶解し、n−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物51(40.1mg,42%)を白色固体として得た。
得られた化合物51の物性データは、以下のとおりであった:31P-NMR (161.83 MHz, CHCl3):δ149.13, 150.91;MS (FAB): m/z 800 (M+H+), 高分解能MS(FAB):計算値 C26H28N3O6 (M+H+):800.3424. 実測値:800.3406。
(実施例6)オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例5で得た化合物51を含有する10merのオリゴヌクレオチド類縁体(化合物52〜55:以下の表3に示す)を、ExpediteTM 8909(ABI社製)により0.2μmolスケールで合成した。ただし、標準的なホスホロアミダイトプロトコルにおけるキャッピングの工程を省いた。また、化合物51(アミダイトユニット)は、テトラヒドロフランに溶解して用いた。なお、表3において、化合物51はXと表記する。アミダイトユニット(化合物51)と5’−末端の水酸基とのカップリング時間は、1.5分(標準条件)から30分に延長した。5’−末端がDMTr基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、0.05M炭酸カリウムのメタノール溶液で処理し、5%(w/v)塩酸で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体をゲルろ過カラムNAPTM 10Column(GE Health Care社製)により粗精製した後、逆相HPLC(SHIMADZU LC−10ATVP,SHIMADZU SPD−10AVP,SHIMADZU CTO−10VP、分取カラムとしてWatersXBridgeTM OST C18 2.5μm(10mm×50mm))により精製した。
合成したオリゴヌクレオチド類縁体(化合物52〜55)の純度は、逆相HPLC(WatersXBridgeTM Shield RP18 2.5μm,4.6mm×50mm))により確認した(条件:0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー(pH7.0)中、1mL/分で30分の7→13%(v/v)アセトニトリルのグラジエント)。また、分子量は、MALDI−TOF−MASS測定により決定した。結果を表3に示す。
(実施例7)融解温度(Tm)の測定
上記実施例5で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物52〜54(アンチセンス鎖)とセンス鎖(3’−AAAAAAAAAA−5’)とをアニーリング処理した後、Tm値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
NaCl 100mM、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)10mM、アンチセンス鎖4μM、およびセンス鎖4μMを含むサンプル溶液(130μL)を沸騰水浴で加熱した後、10時間かけて室温まで冷却した。分光光度計(Shimadzu,UV−1650PC)のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を5℃まで徐々に冷却し、さらに20分間10℃に保った後、測定を開始した。温度は85℃まで毎分0.5℃ずつ上昇させ、0.1℃間隔で260nmにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表4に示す。
表4から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖DNAに対する親和性に比較して一本鎖RNAに対する親和性が高く、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Tm値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
(実施例8)ヌクレオシド類縁体:N2’−メチル−2’−アミノ−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−N,4’−C−オキソエチレンチミジン(化合物60:amide6NMe)の合成
(1)化合物56の合成
窒素気流下、化合物48(94mg,0.197mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(2.0mL)に、0℃にて1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(0.12mL,0.79mmol)およびベンジルクロロメチルエーテル(55μL,0.39mmol)を加え、0.5時間撹拌した。0℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(112mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5.0g,n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)で精製し、化合物56(101mg:収率86%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物56の物性データは、以下のとおりであった: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.43 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.45, 2.60 (AB, J = 17.5 Hz, 2H), 3.59, 3.76 (AB, J = 10.5 Hz, 2H), 3.96 (dd, J = 4.0, 5.5 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.51, 4.63 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.55, 4.60 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.69 (s, 2H), 5.43, 5.46 (AB, J = 9.5 Hz, 2H), 5.74 (s, 1H), 6.15 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.25-7.38 (m, 15H), 7.92 (d, J = 1.0 Hz, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.53, 38.68, 56.09, 70.27, 70.57, 72.27, 72.37, 73.69, 83.76, 90.53, 109.48, 127.55, 127.64, 127.71, 127.91, 128.30, 128.34, 128.58, 128.73, 133.97, 136.59, 136.88, 137.82, 150.79, 163.29, 169.26。
(2)化合物57の合成
窒素気流下、上記(1)で得た化合物56(130mg,0.218mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(2.0mL)に0℃にて水素化ナトリウム(10.4mg,0.260mmol)を加え、0.5時間撹拌した後、0℃にてヨウ化メチル(68μL,1.1mmol)を加えて2時間撹拌した。0℃にて反応液に水を加えてクエンチし、ジエチルエーテルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(139mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5.0g,n−ヘキサン:酢酸エチル=3:2)で精製し、化合物57(79.6mg,60%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物57の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.45 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.42, 2.60 (AB, J = 17.0 Hz, 2H), 3.07 (s, 3H), 3.68, 3.74 (AB, J = 12.0 Hz, 2H), 3.82 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.55, 4.60 (AB, J = 11.0 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 5.43, 5.47 (AB, J = 9.5 Hz, 2H), 4.56 (s, 2H), 5.66 (s, 1H), 7.23-7.39 (m, 15H), 7.91 (d, J = 1.0 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ12.55, 34.17, 38.77, 63.11, 68.51, 70.20, 71.19, 72.27, 72.72, 73.64, 84.24, 88.87, 109.38, 127.52, 127.66, 127.70, 127.89, 128.27, 128.30, 128.32, 128.62, 128.69, 133.93, 136.69, 136.92, 137.81,150.68, 163.35, 167.29。
(3)化合物58の合成
20%水酸化パラジウムカーボン(91.0mg)のエタノール懸濁液(2.0mL)に上記(2)で得た化合物57(79.6mg,0.130mmol)のエタノール溶液(8.0mL)とシクロヘキセン(1.3mL,13mmol)を加え、2時間加熱還流した。水酸化パラジウムカーボンをひだ折りろ紙によりろ過後、溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(2.0g,クロロホルム:メタノール=10:1)で精製し、化合物58(40.8mg:quant.)を白色粉末として得た。
得られた化合物58の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ1.77 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.21, 2.39 (AB, J = 18.0 Hz, 2H), 3.02 (s, 3H), 3.57, 3.64 (AB, J = 12.5 Hz, 2H), 3.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.60 (s, 1H), 8.18 (d, J = 1.0 Hz, 1H);13C-NMR (100 MHz, CD3OD):δ12.54, 34.92, 39.01, 61.62, 64.88, 67.70, 86.54, 89.34, 110.21, 137.46, 152.07, 166.63, 170.82。
(4)化合物59の合成
窒素気流下、上記(3)で得た化合物58(26.8mg,0.0861mmol)の無水ピリジン溶液(2.0mL)に0℃にて4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(175mg,0.567mmol)を加え、室温にて17時間撹拌した。0℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で1回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体(320mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5.0g,クロロホルム:メタノール=25:1)で精製し、化合物59(36.6mg:収率69%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物59の物性データは、以下のとおりであった:1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.29 (s, 3H), 2.44, 2.53 (AB, J = 17.5 Hz, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.33, 3.37 (AB, J = 12.0 Hz, 6H), 3.75 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.94 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.61 (s, 1H), 6.80-7.41 (m, 14H), 7.90 (s, 1H);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ11.91, 34.51, 38.54, 55.20, 62.87, 65.43, 65.98, 84.96, 86.88, 88.60, 110.39, 111.34, 127.20, 128.07, 130.10, 134.92, 135.08, 144.05, 152.35, 158.69, 164.37, 168.32。
(5)化合物60の合成
上記(4)で得た化合物59(116mg,0.189mmol)を、ピリジン、トルエンで共沸した後、窒素気流下、無水ジクロロメタン溶液(1.9mL)とし、N−エチルジイソプロピルアミン(0.20mL,1.13mmol)を加えた。その後、0℃にて2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(85μL,0.378mmol)を加え、室温にて6時間撹拌した。飽和重曹水を加えてしばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン=30:1:0.05)により精製し、白色泡状固体を得た。得られた白色泡状固体をジクロロメタンに溶解し、n−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物60(70mg:収率45%)を白色粉体として得た。
得られた化合物60の物性データは、以下のとおりであった:131P-NMR (161.83 MHz, CDCl3):δ148.84, 149.97。
(実施例9)ヌクレオシド類縁体:N2’−メチル−2’−アミノ−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−N,4’−C−オキソメチレンチミジン(化合物65:amideNMe)の合成
(1)化合物61の合成
窒素気流下、化合物13(30mg,0.065mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(0.7mL)に溶解し、氷冷下、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン(38.6μL,0.259mmol)を加え、15分間撹拌した後、ベンジルクロロメチルエーテル(17.7μL,0.129mmol)を加え、氷冷下、30分間撹拌した。メタノールを加え、撹拌した後、溶媒留去し、酢酸エチルで希釈した。水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=3:1→1:1)により精製し、化合物61(31mg:収率82%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物61の物性データは、以下のとおりであった:[α]D + 61.6 (c 0.700, CHCl3, 26℃). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.62 (3H, s), 3.95, 4.10 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.11 (1H, s), 4.22 (1H, s), 4.52, 4.56 (2H, AB, J = 13.5 Hz), 4.59, 4.64 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.72, 4.69 (2H, AB, J = 13 Hz), 5.43 (1H, s), 5.43, 5.48 (2H, AB, J = 9.5 Hz), 7.54-7.20 (15H, m), 7.54 (1H, s). 13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3):δ12.92, 58.47, 63.06, 70.26, 72.31, 72.42, 73.98, 78.72, 86.37, 86.58, 109.99, 127.68, 127.72, 127.75, 128.09, 128.29, 128.31, 128.52, 128.54, 133.93, 136.27, 137.40,137.76, 150.63, 163.15, 172.57。
(2)化合物62の合成
窒素気流下、上記(1)で得た化合物61(30mg,0.051mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(0.5mL)に溶かし、氷冷下、水素化ナトリウムを加え、30分間撹拌した。氷冷下、ヨウ化メチル(15.9μL,0.255mmol)を加え、撹拌しながら緩やかに室温まで上昇させた。30分後、水を加え10分間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=3:1→1:1)により精製し、化合物62(26.1mg:収率86%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物62の物性データは、以下のとおりであった:[α]D + 39.0 (c 0.350, CHCl3, 23℃). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.65 (3H, s), 2.96 (3H, s), 3.95, 4.10 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.01 (1H, s), 4.06 (1H, s), 4.50, 4.59 (2H, AB, J = 12 Hz), 4.59, 4.63 (2H, AB, J = 11 Hz), 4.70 (2H, s), 5.40 (1H, s), 5.44, 5.48 (2H, AB, J = 9.5 Hz), 7.19-7.39 (15H, m), 7.52 (1H, s). 13C-NMR (100.53 MHz, CDCl3):δ 12.92, 28.39, 63.23, 64.52, 70.24, 72.26, 72.54, 73.84, 78.06, 84.42, 87.09, 109.94, 127.58, 127.62, 127.65, 127.70, 127.99, 128.24, 128.27, 128.48, 128.50, 133.78, 136.39, 137.41, 137.72, 150.52, 163.09, 170.93。
(3)化合物63の合成
窒素気流下、上記(2)で得た化合物62(130mg,0.218mmol)をテトラヒドロフラン(2mL)に溶解し、20%水酸化パラジウムカーボン(130mg)を加え、水素気流下、室温にて1時間撹拌した。反応液を自然ろ過し、温メタノールで洗浄した後、溶媒留去した。得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)により精製し、化合物63(61.7mg:収率95%)を白色固体として得た。
得られた化合物63の物性データは、以下のとおりであった:[α]D + 63.7 (c 0.900, CHCl3, 26℃). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6):δ1.77 (3H, s), 2.88 (3H, s), 3.67, 3.84 (2H, AB, J = 12.5 Hz), 4.03 (1H, s), 4.12 (1H, s), 5.28 (1H, s), 5.38 (1H, s), 5.90 (1H, s), 7.73 (1H, s), 11.44 (1H, s). 13C-NMR (100.53 MHz, CD3OD):δ12.64, 28.65, 55.75, 68.53, 72.85, 85.48, 89.99, 110.93, 137.24, 151.96, 166.45, 174.14。
(4)化合物64の合成
窒素気流下、ピリジンで共沸した上記(3)で得た化合物63(61.7mg,0.208mmol)を無水ピリジン(2mL)に溶かし、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(106mg,0.311mmol)を加え、室温下3時間撹拌した。飽和重曹水を加えてしばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン=20:1:0.05)により精製し、化合物64(113mg:収率90%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物63の物性データは、以下のとおりであった:[α]D + 2.0 (c 0.300, CHCl3, 25℃). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.66 (3H, s), 2.97 (3H, s), 3.62, 3.90 (2H, AB, J = 12.5 Hz), 3.77 (6H, s), 4.13 (1H, s), 4.42 (1H, s), 5.40 (1H, s), 6.82-6.85 (4H, m), 7.21-7.34 (7H, m), 7.43 (2H, d, J = 8 Hz), 7.77 (1H, s), 9.45 (1H, s)。
(5)化合物65の合成
窒素気流下、ピリジン、トルエンで共沸した上記(4)で得た化合物64(1.18g,1.97mmol)を無水アセトニトリル/テトラヒドロフラン(3:1)(23mL)に溶解し、N,N−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(253mg,1.48mmol)、2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト(752μL,2.37mmol)を加え、室温下5時間撹拌した。飽和重曹水を加えてしばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン=30:1:0.05)により精製し、白色泡状固体を得た。得られた白色泡状固体をジクロロメタンに溶解し、n−ヘキサンへの添加により再沈殿を行い、化合物65(1.53g:収率97%)を白色粉体として得た。
得られた化合物65の物性データは、以下のとおりであった:31P-NMR (161.83 MHz, CDCl3):δ150.43, 150.59。
(実施例10)オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例9で得た化合物65を含有する10merのオリゴヌクレオチド類縁体(化合物66〜69:以下の表5に示す)を、ExpediteTM 8909(ABI社製)により0.2μmolスケールで合成した。また、化合物65(アミダイトユニット)は、アセトニトリルに溶解して用いた。なお、表5において、化合物65はXと表記する。アミダイトユニット(化合物65)と5’−末端の水酸基とのカップリング時間は、1.5分(標準条件)から5分に延長した。5’−末端がDMTr基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、飽和アンモニア水で処理し、5%(w/v)塩酸で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体をゲルろ過カラムNAPTM 10Column(GE Health Care社製)により粗精製した後、逆相HPLC(SHIMADZU LC−10ATVP,SHIMADZU SPD−10AVP,SHIMADZU CTO−10VP、分取カラムとしてWatersXBridgeTM OST C18 2.5μm(10mm×50mm))により精製した。
合成したオリゴヌクレオチド類縁体(化合物66〜69)の純度は、逆相HPLC(WatersXBridgeTM Shield RP18 2.5μm,4.6mm×50mm))確認した(条件:0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー(pH7.0)中、1mL/分で30分の7→13%(v/v)アセトニトリルのグラジエント)。また、分子量は、MALDI−TOF−MASS測定により決定した。結果を表5に示す。
(実施例11)融解温度(Tm)の測定
上記実施例10で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物66〜68(アンチセンス鎖)とセンス鎖(3’−AAAAAAAAAA−5’)とをアニーリング処理した後、Tm値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
NaCl 100mM、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)10mM、アンチセンス鎖4μM、およびセンス鎖4μMを含むサンプル溶液(130μL)を沸騰水浴で加熱した後、10時間かけて室温まで冷却した。分光光度計(Shimadzu,UV−1650PC)のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を5℃まで徐々に冷却し、さらに20分間10℃に保った後、測定を開始した。温度は85℃まで毎分0.5℃ずつ上昇させ、0.1℃間隔で260nmにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表6に示す。
表6から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖DNAに対する親和性に比較して一本鎖RNAに対する親和性が高く、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Tm値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、2’,4’−BNA/LNAと同様に、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
(実施例12)ヌクレアーゼ耐性の評価
上記実施例2で合成した化合物20(amideNH)、実施例6で合成した化合物55(amide6NH)および実施例10で合成した化合物69(amideNMe)の各オリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチドを3’側から分解するエキソヌクレアーゼに対する耐性を検討した。従来の2’,4’−BNA/LNAおよびNC(NH)(2’,4’−BNANC(NH):架橋構造に窒素原子が含まれ得るがアミドではない構造)をコントロールとした。
750pmolのオリゴヌクレオチドを含むバッファー溶液(65μL)を37℃にて5分間保持した後、0.175mg/mLの蛇毒ホスホジエステラーゼ(Crotalus admanteus venom phosphodiesterase (CAVP):Pharmacia Biotech社)を含むバッファー溶液(35μL)を混合した。オリゴヌクレオチドの分解をHPLC(SHIMADZU LC−20AD,SPD−20A,CTO−20A,SIL−20AC、分析カラムとしてWatersXBridgeTM Shield RP18 2.5μm(4.6mm×50mm))によって経時的に測定した。用いたバッファーの組成(終濃度)は、Tris HCl(pH8.0)50mM、MgCl2 10mMであり、測定前に十分に脱気した。HPLCによる定量条件は、以下に示すとおりである。
[HPLC定量条件]
移動相:A液 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー,pH7.0
B液 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー:アセトニトリル=1:1(v/v),pH7.0
グラジエント:5→11.4%(v/v)B液(16分)
使用カラム:WatersXBridgeTM Shield RP18 2.5μm(4.6mm×50mm)
流速:0.8mL/分
カラム温度:50℃
検出:UV(268nm)
結果を図1に示す。図1中、「残存オリゴヌクレオチド(%)」とは、0時点における未分解オリゴヌクレオチド(10mer)に対する、測定時点における未分解オリゴヌクレオチド(10mer)の残存率を示す。
図1から、化合物20(amideNH)、化合物55(amide6NH)および化合物69(amideNMe)は、従来の2’,4’−BNA/LNAを含むオリゴヌクレオチドを大きく上回る酵素耐性を有することがわかった。
(実施例13)オリゴヌクレオチドの血清(FBS)中における安定性の評価
1nmolのオリゴヌクレオチド(5’−(XTXTXTXTXT)−3’、実施例9で得た化合物65を実施例10の方法に従い配列中のXの箇所に導入したもの)を10μLの25%FBSに混合し、さらに滅菌水を加えて全量を25μLに調製した。この溶液を37℃にて所定時間インキュベートした後、所定時間ごとに5μLずつ計りとり、90℃に熱した後、氷冷し、FBS中の核酸分解酵素を失活させた。このサンプルは、HPLCによる解析まで−80℃にて保存した。HPLC解析のために、滅菌水を加えて全量を200μLに調整し、オリゴヌクレオチドの分解をHPLC(SHIMADZU LC−20AD,SPD−20A,CTO−20A,SIL−20AC)によって経時的に測定した。用いたバッファーの組成(終濃度)は、Tris HCl(pH8.0)50mM、MgCl2 10mMであり、測定前に十分に脱気した。なお、比較検討のためにXが天然のDNA−Tの配列およびXがLNA−Tの配列についても同様の操作で実験を行なった。
[HPLC定量条件]
移動相:A液 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー,pH7.0
B液 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー:アセトニトリル=1:1,pH7.0
グラジエント:10→26%(v/v)B液(16分)
使用カラム:WatersXBridgeTM Shield RP18 2.5μm(4.6mm×50mm)
流速:0.8mL/分
カラム温度:50℃
検出:UV(268nm)
結果を表7に示す。表7中、「残存オリゴヌクレオチド(%)」とは、0時点における未分解オリゴヌクレオチド(10mer)に対する、測定時点における未分解オリゴヌクレオチド(10mer)の残存率を示す。
表7から明らかなように、本発明の化合物65を導入したオリゴヌクレオチドは、天然DNAからなるオリゴヌクレオチドやLNA修飾したオリゴヌクレオチドに比べて、血清中での安定性がはるかに高く、in vivoでの優れた効果が期待できる。
(実施例14)ヌクレオシド類縁体:N2’−メチル−2’−アミノ−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−N,4’−C−オキソメチレン−4−(1,2,4,−トリアゾール−1−イル)チミジン(化合物70:チミジンアナログのトリアゾリル体、5-メチルシトシンアナログ等価体)の合成
窒素気流下、ピリジン、トルエンで共沸した1,2,4−トリアゾール(306mg,4.43mmol)を無水アセトニトリル(10mL)に溶解し、氷冷下、塩化ホスホリル(94μL,1.01mmol)を加え、10分間激しく撹拌した。続いてトリエチルアミン(700μL,5.04mmol)を加え、1時間激しく撹拌した。氷冷下、化合物65(100mg,0.125mmol)を無水アセトニトリル(2mL)に溶解し、反応液に加え、室温にて2時間激しく撹拌した。飽和重曹水を加えて撹拌した後酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)により精製し、化合物70(90.4mg:収率85%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物70の物性データは、以下のとおりであった:31P-NMR (161.83 MHz, CDCl3):δ150.9, 149.6。
(実施例15)ヌクレオシド類縁体:N−メチル−3’−O−[2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−アミノオキソメチレン−5−メチルウリジン(化合物81:amideNC−NMe)の合成
(1)化合物71の合成
化合物8(3gm,4.24mmol)のジクロロメタン溶液(15mL)にピリジン(1.5mL,8.48mmol)とトリフルオロメタンスルホン酸無水物(0.7mL,2.828mmol)を0℃にて混合し、氷冷下40分間撹拌した。氷冷水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた化合物71(4.64g)を続く反応に用いた。
(2)化合物72の合成
上記(1)で得た化合物71のアセトニトリル溶液(20mL)に、N−ヒドロキシフタルイミド(4.5mg,27.66mmol)と1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン(4.2mL,27.66mmol)を加え、室温にて24時間撹拌した。ジクロロメタンで希釈し、水を加えた後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、化合物72(2.88g:収率79%(2工程))を白色泡状固体として得た。
得られた化合物72の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 = + 43.0 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3188, 3067, 2934, 2862, 1791, 1730, 1692, 1465, 1427, 1421, 1366, 1267, 1189, 1106, 973 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):dH 1.08 (9H, s), 1.38 (3H, s), 3.65 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.02 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.09 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.22 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.48 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.52 (1H, d, J = 5.2 Hz), 4.55 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.73 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.85 (1H, dd, J = 3.2 Hz, 2.8 Hz), 5.13 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.40 (1H, d, J = 3.2 Hz), 7.16-7.86 (26H, m)。
(3)化合物73の合成
上記(2)で得た化合物72(2.88g,3.38mmol)のテトラヒドロフラン溶液(15mL)にトリエチルアミントリヒドロフルオリド(5.6mL,33.8mmol)を加え、70℃にて18時間還流した。氷冷下、反応液に氷冷水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和重曹水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)で精製し、化合物73(1.89g:収率91%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物73の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 25 = + 39.1 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3504, 3181, 3062, 2881, 1789, 1733, 1689, 1466, 1375, 1272, 1187, 1105, 1057, 974 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3):dH 1.36 (3H, s), 3.84 (1H, d, J = 10.4 Hz), 3.92 (1H, d, J = 7.2 Hz), 3.96 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.12 (1H, d, J = 7.2 Hz), 4.49 ( 1H, d, J = 11.2 Hz), 4.54 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.63 (1H, d, J = 6 Hz), 4.74 (1H, d, J = 12 Hz), 4.93 (1H, dd, J = 6 Hz, 1.6 Hz), 5.16 (1H, d, J = 11.6 Hz), 6.35 (1H, d, J = 1.2 Hz), 7.15-7.87 (15H, m), 7.92 (1H, br s)。
(4)化合物74の合成
上記(3)で得た化合物73のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(20mL)にモレキュラーシーブス4Å(2g)を加え、10分間撹拌した。反応液に重クロム酸ピリジニウム(11.6g,30.8mmol)を加え、室温にて16時間撹拌した。反応液に氷冷水、酢酸(2mL)を加えて撹拌した。生成物を酢酸エチルで抽出し、カラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1→酢酸エチル:メタノール=10:1)で精製し、化合物74(1.44g:収率75%)を白色泡状固体として得た。
得られた化合物74の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 26 = + 23.9 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3178, 3066, 3032, 2873, 1790, 1736, 1468, 1376, 1275, 1187, 1125, 967 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):dH 1.59 (3H, s), 3.90 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.11 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.59 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.63 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.68 (1H, d, J = 4.4 Hz), 4.91 (1H, d, J = 11.2 Hz), 5.05 (1H, t, J = 5.6 Hz) 5.27 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.70 (1H, d, J = 6.4 Hz), 7.32- 7.86 (16 H, m), 8.75 (1H, br s)。
(5)化合物75の合成
上記(4)で得た化合物74(400mg,0.636mmol)のエタノール溶液(2mL)に、ヒドラジン一水和物(0.04mL,1.02mmol)を加え、室温にて10分間撹拌した。反応液を溶媒留去し、酢酸エチルを加えた。残査をろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した後、溶媒を留去し、得られた化合物75(380mg)を続く反応に用いた。
(6)化合物76の合成
上記(5)で得た化合物75(380mg,0.763mmol)のメタノール溶液(5mL)にホルマリン(37wt%inH2O,0.08mL,0.840mmol)を加えた。反応液を室温にて2時間撹拌した後、溶媒留去した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィーで(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1→1:2)で精製し、得られた化合物76(250mg:収率65%(2工程))を白色固体として得た。
得られた化合物76の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 26 = - 29.3 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3172, 3064, 2944, 2872, 1699, 1469, 1366, 1274, 1127, 1070, 916 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):dH 1.56 (3H, s), 3.84 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.14 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.64-4.79 (6H, m), 5.11 (1H, dd, J = 4.6 Hz, 3.2 Hz), 6.59 (1H, d, J = 6.8 Hz), 7.28-7.64 (11H, m)。
(7)化合物77の合成
上記(6)で得た化合物76(250mg,0.491mmol)のメタノール溶液にp−トルエンスルホン酸ピリジニウム(1M,4.9mL,4.91mmol),シアノ水素化ほう素ナトリウム(62mg,0.982mmol)を加え、0oCにて10分間撹拌した。反応液を室温に昇温し、さらに2時間撹拌した。溶媒を留去し、得られた生成物を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水とで洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた化合物77(235mg)を続く反応に用いた。
(8)化合物78の合成
上記(7)で得た化合物77(235mg,0.459mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(4mL)溶液に1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(105.5mg,0.551mmol)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(74.5mg,0.551mmol)を加え、室温にて1日撹拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水とで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィーで(n−ヘキサン:酢酸エチル=4:1→1:1)で精製し、化合物78(190mg:収率80%(2工程))を白色固体として得た。
得られた化合物78の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 26 = + 62.3 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3164, 3029, 2926, 2878, 1698, 1456, 1392, 1362, 1274, 1215, 1155, 1094, 1065, 983 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3):dH 1.42 (3H, s), 3.25 (3H, s), 3.95 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.25 (1H, d, J = 11.6 Hz), 4.34 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.56 (1H, d, J = 10.8 Hz), 4.59-4.64 (3H, m), 4.73 (1H, d, J = 10.8 Hz), 6.08 (1H, s), 7.23-7.37 (10 H, m), 7.62 (1H, d, J = 1.6 Hz)。
(9)化合物79の合成
上記(8)で得た化合物78(190mg,0.385mmol)のエタノール:クロロホルム=5:1(5mL)溶液に水酸化パラジウムカーボン(190mg)を加え、撹拌した。反応容器内を水素ガスで数回置換し、水素気流下、室温にて一晩撹拌した。溶液をろ過後、溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1→酢酸エチルのみ)で精製し、化合物79(105mg:収率90%)を白色固体として得た。
得られた化合物79の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 26 = + 14.9 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3444, 3226, 3070, 2941, 1678, 1469, 1412, 1281, 1199, 1078,988 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CD3OD):dH 1.88 (3H, s), 3.25 (3H, s), 3.90 (1H, d, J = 12.8 Hz), 4.22 (1H, d, J = 12.8 Hz), 4.55 (1H, J = 3.6 Hz), 4.73 (1H, J = 3.6 Hz), 6.08 (1H, s), 7.98 (1H, d, J = 1.2 Hz)。
(10)化合物80の合成
上記(9)で得た化合物79(50mg,0.159mmol)のピリジン溶液(3mL)に4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(65mg,0.191mmol)とトリエチルアミン(0.1mL,0.795mmol)を加え、室温にて8時間撹拌した。氷冷下、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた組成績体をカラムクロマトグラフィー(1%トリエチルアミン添加n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1→酢酸エチルのみ)で精製し、化合物80(58mg:収率60%)を淡黄色固体として得た。
得られた化合物80の物性データは、以下のとおりであった:[α]D 28 = - 21.1 (c 1.00, CHCl3);IR νmax (KBr):3339, 3189, 3062, 2926, 2850, 1693, 1608, 1509, 1464, 1395, 1253, 1177, 1080, 1033, 978 cm-1;1H-NMR (400 MHz, CDCl3):dH 1.41 (3H, s), 3.22 (3H, s), 3.72 (1H, d, J = 12 Hz), 3.78 (6H, s), 3.97 (1H, d, J = 12 Hz), 4.69 (1H, d, J = 3.6 Hz), 4.72 (1H, d, J = 3.6 Hz), 6.05 (1H, s), 6.82-6.85 (4H, m), 7.25 - 7.42 (9H, m), 7.67 (1H, s)。
(11)化合物81の合成
上記(36)で得た化合物80(50mg,0.08mmol)の無水アセトニトリル溶液に2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト(0.04mL,0.138mmol)と4,5−ジシアノイミダゾール(9.5mg,0.08mmol)を加え、室温にて7時間撹拌した。反応後、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた粗成績体をカラムクロマトグラフィー(1%トリエチルアミン添加n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1→1:1)で精製し、化合物81(46mg,70%)を白色固体として得た。
得られた化合物81の物性データは、以下のとおりであった:31P-NMR (100 MHz, CDCl3):dP 151.23, 151.82。
(実施例16)オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
上記実施例15で得た化合物81(アミダイト体)を含有する10merのオリゴヌクレオチド類縁体(化合物82〜85:以下の表8に示す)を、ExpediteTM 8909(ABI社製)により0.2μmolスケールで合成した。合成は、標準的なホスホロアミダイトプロトコルにより行い、アミダイト体81はアセトニトリルに溶解して用いた。なお、表8において、化合物81はXと表記する。アミダイトユニット(化合物81)と5’−末端の水酸基とのカップリング時間は、1.5分(標準条件)から30分に延長した。5’−末端がDMTr基により保護されかつ固相支持されたオリゴヌクレオチド類縁体を、0.05M炭酸カリウムのメタノール溶液で処理し、1.0M TEAA(トリエチルアミン−酢酸)で中和処理した後、溶媒を留去した。得られた粗成績体を、ゲルろ過カラムNAPTM 10Column(GE Health Care社製)により粗精製した後、逆相HPLC(SHIMADZU LC−10ATVP,SHIMADZU SPD−10AVP,SHIMADZU CTO−10VP,分取カラムとしてWatersXBridgeTM OST C18 2.5μm(10mm×50mm))により精製した。
合成したオリゴヌクレオチド類縁体(化合物82〜85)の純度は、逆相HPLC(WatersXBridgeTM Shield RP18 2.5μm(4.6mm×50mm)により確認した(条件:0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸バッファー(pH7.0)中、1mL/分で30分の5→14%(v/v)アセトニトリルのグラジエント)。また、分子量は、MALDI−TOF−MASS測定により決定した。結果を表8に示す。
(実施例17)融解温度(Tm)の測定
上記実施例16で合成したオリゴヌクレオチド鎖である化合物82〜84(アンチセンス鎖)とセンス鎖(3’−AAAAAAAAAA−5’)とをアニーリング処理した後、Tm値を測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
NaCl 100mM、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)10mM、アンチセンス鎖4μM、およびセンス鎖4μMを含むサンプル溶液(130μL)を沸騰水浴で加熱した後、10時間かけて室温まで冷却した。分光光度計(Shimadzu,UV−1650PC)のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を5℃まで徐々に冷却し、さらに20分間10℃に保った後、測定を開始した。温度は85℃まで毎分0.5℃ずつ上昇させ、0.1℃間隔で260nmにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果を表9に示す。
表9から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖DNAに対する親和性に比較して一本鎖RNAに対する親和性が高く、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Tm値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。