WO2014046212A1 - グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド - Google Patents

グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド Download PDF

Info

Publication number
WO2014046212A1
WO2014046212A1 PCT/JP2013/075370 JP2013075370W WO2014046212A1 WO 2014046212 A1 WO2014046212 A1 WO 2014046212A1 JP 2013075370 W JP2013075370 W JP 2013075370W WO 2014046212 A1 WO2014046212 A1 WO 2014046212A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
amino
carbon atoms
nucleic acid
oxo
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/075370
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
聡 小比賀
悠太朗 壽
玲子 脇
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Priority to EP13838365.8A priority Critical patent/EP2899197B1/en
Priority to IN2238DEN2015 priority patent/IN2015DN02238A/en
Priority to CN201380057335.0A priority patent/CN104768964B/zh
Priority to CA2885719A priority patent/CA2885719C/en
Priority to US14/428,646 priority patent/US10377789B2/en
Priority to ES13838365.8T priority patent/ES2622716T3/es
Priority to KR1020157010144A priority patent/KR101707437B1/ko
Priority to JP2014536921A priority patent/JP6048982B2/ja
Publication of WO2014046212A1 publication Critical patent/WO2014046212A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to artificial nucleosides and oligonucleotides, and more particularly to artificial nucleosides and oligonucleotides having a guanidine bridge.
  • an antisense method an anti-gene method, a method using an aptamer, a method using siRNA, etc. as a method for treating a disease with a nucleic acid drug.
  • the antisense method introduces an oligonucleotide (antisense strand) complementary to the mRNA involved in the disease from the outside to form a double strand, thereby inhibiting the translation process of the pathogenic RNA and treating the disease.
  • the method using siRNA is also similar to the antisense method, in which translation from mRNA to protein is inhibited by double-stranded RNA administered to a living body.
  • the antigene method suppresses transcription from DNA to RNA by introducing from the outside a triplex-forming oligonucleotide corresponding to a DNA site that transcribes pathogenic RNA.
  • aptamers are short nucleic acid molecules (oligonucleotides), they function by binding to biological components such as proteins that cause disease.
  • S-oligo phosphorothioate type oligonucleotide
  • BNA bridged nucleic acid
  • LNA 4′-locked nucleic acid
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule for oligonucleotides having high binding affinity and specificity for a target nucleic acid and exhibiting high nuclease resistance.
  • the inventors of the present invention show that an oligonucleotide containing a nucleic acid in which guanidine is introduced into a 2 ′, 4′-BNA / LNA cross-linked structure has a high binding affinity and specificity for DNA, and exhibits a high nuclease resistance.
  • the present invention was completed.
  • the present invention relates to a compound represented by the following formula I or II or a salt thereof:
  • B 1 represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more optional substituents selected from ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a protecting group for an amino group, or
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, a branch or a ring
  • An acyl group optionally having one or more optional substituents, a silyl group optionally having one or more optional substituents selected from the ⁇ group, and any arbitrary selected from the ⁇ group
  • B 1 is a 6-aminopurin-9-yl group, a 2,6-diaminopurin-9-yl group, 2-amino-6-chloropurine-9. -Yl group, 2-amino-6-fluoropurin-9-yl group, 2-amino-6-bromopurin-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group, 6-amino- 2-methoxypurin-9-yl group, 6-amino-2-chloropurin-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl group, 2,6-dimethoxypurin-9-yl group, 2,6-dichloropurin-9-yl group, 6-mercaptopurin-9-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, 4-amino-2-oxo- 5-Fluoro-1,2-dihydr
  • B 1 is a 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group.
  • the present invention also provides an oligonucleotide containing at least one nucleoside structure represented by the following formula I 'or II' or a pharmacologically acceptable salt thereof:
  • B 1 represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more optional substituents selected from ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 , and R 13 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an amino group protecting group, or
  • R 14 represents a hydrogen atom; and R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis, a carbon atom which may form a branch or a ring 1
  • an alkyl group having 7 to 7 carbon atoms an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, may have one or more optional substituents selected from the ⁇ group and include a hetero atom
  • B 1 is a 6-aminopurin-9-yl group, a 2,6-diaminopurin-9-yl group, a 2-amino-6-chloropurine -9-yl group, 2-amino-6-fluoropurin-9-yl group, 2-amino-6-bromopurin-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group, 6- Amino-2-methoxypurin-9-yl group, 6-amino-2-chloropurin-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl group, 2,6-dimethoxypurin-9-yl Group, 2,6-dichloropurin-9-yl group, 6-mercaptopurin-9-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, 4-amino-2- Oxo-5-fluoro-1,2-d
  • B 1 is a 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group.
  • an oligonucleotide nucleic acid molecule that has high binding affinity and specificity for a target nucleic acid and exhibits high nuclease resistance.
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time in the proportion of unreacted oligonucleotides when various oligonucleotides having the sequence 5′-d (TTTTTTTTTX) -3 ′ were treated with 3′-exonuclease.
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time in the ratio of unreacted oligonucleotides when various oligonucleotides having the sequence 5′-d (TTTTTTTX) -3 ′ were treated with 3′-exonuclease.
  • FIG. 5 is micrographs showing the dynamics of Compound 57 in HuH-7 cells, and are enlarged photographs (A to D) of the regions indicated by the arrows in FIG. 4B with respect to FIGS.
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, An n-butyl group, an n-pentyl group, or an n-hexyl group.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group and the like can be mentioned.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group, and an n-propylthio group.
  • a linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or any one of the same or different carbon atoms having 1 to 6 carbon atoms. Includes amino groups having two chain alkyl groups. Examples thereof include a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, a methylethylamino group, and a diethylamino group.
  • an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring refers to any linear alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, carbon having the same or different branched chain. It includes any branched alkyl group having 3 to 7 carbon atoms, any cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms, and combinations thereof having 4 to 7 carbon atoms.
  • arbitrary linear alkyl groups having 1 to 7 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, and n-heptyl group.
  • any branched chain alkyl group having 3 to 7 carbon atoms having the same or different branched chain includes isopropyl group, isobutyl group, tert-butyl group, isopentyl group and the like, and having 3 to 7 carbon atoms
  • Arbitrary cyclic alkyl groups include a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and the like.
  • an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring means any straight chain alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, any branch having 2 to 7 carbon atoms. It includes a chain alkenyl group, any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms, and combinations thereof having 4 to 7 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms include isopropenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl -2-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-butenyl group, etc., and any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms includes a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • aryl group which may contain a hetero atom refers to any aromatic hydrocarbon compound having 6 to 12 carbon atoms composed of only hydrocarbon, and any 6 to 12 carbon atoms.
  • any heteroaromatic compound in which one or more carbon atoms constituting the ring structure are substituted with the same or different hetero atoms for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom is included.
  • Examples of the aromatic hydrocarbon compound having 6 to 12 carbon atoms composed only of a hydrocarbon include a phenyl group, a naphthyl group, an indenyl group, an azulenyl group, and the like
  • examples of the heteroaromatic compound include a pyridine ring, pyrroline. Ring, quinoline ring, indoline ring, imidazoline ring, furin ring, thiophene ring and the like.
  • Examples of the pyridine ring include a pyrimidine ring, a piperidine ring, a quinoline ring, and an acridine ring.
  • aralkyl group having a heteroaryl moiety which may contain a heteroatom refers to any aromatic hydrocarbon compound having 5 to 12 carbon atoms composed of only hydrocarbons, and 5 carbon atoms. Any heteroaromatic group in which one or more carbon atoms constituting the ring structure are substituted with the same or different heteroatoms (for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom) includes compounds.
  • aralkyl group having a heteroaryl moiety which may contain a hetero atom examples include benzyl group, phenethyl group, naphthylmethyl group, 3-phenylpropyl group, 2-phenylpropyl group, 4-phenylbutyl group 2-phenylbutyl group, pyridylmethyl group, indolylmethyl group, furylmethyl group, thienylmethyl group, pyrrolylmethyl group, 2-pyridylethyl group, 1-pyridylethyl group, 3-thienylpropyl group and the like.
  • examples of the term “acyl group” include aliphatic acyl groups and aromatic acyl groups.
  • examples of the aliphatic acyl group include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, pentanoyl group, pivaloyl group, valeryl group, isovaleryl group, octanoyl group, nonanoyl group, decanoyl group, 3-methylnonanoyl group, 8-methylnonanoyl group, 3-ethyloctanoyl group, 3,7-dimethyloctanoyl group, undecanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, tetradecanoyl group, pentadecanoyl group, hexadecanoyl group, 1-methylpentadecanoyl group, 14-methylpentadecanoyl group, 13,13-
  • aromatic acyl group examples include arylcarbonyl groups such as benzoyl group, ⁇ -naphthoyl group and ⁇ -naphthoyl group; halogenoarylcarbonyl groups such as 2-bromobenzoyl group and 4-chlorobenzoyl group; 2 , 4,6-trimethylbenzoyl group, arylcarbonyl group substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms such as 4-toluoyl group; substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms such as 4-anisoyl group A carboxylated arylcarbonyl group such as a 2-carboxybenzoyl group, a 3-carboxybenzoyl group and a 4-carboxybenzoyl group; a nitrated arylcarbonyl group such as a 4-nitrobenzoyl group and a 2-nitrobenzoyl group ; From 1 carbon atom such as 2- (methoxycarbonyl
  • sil group examples include trimethylsilyl group, triethylsilyl group, isopropyldimethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, methyldiisopropylsilyl group, methyldi-t-butylsilyl group, and triisopropylsilyl group.
  • a silyl group substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms such as diphenylmethylsilyl group, butyldiphenylbutylsilyl group, diphenylisopropylsilyl group, phenyldiisopropylsilyl group, Examples thereof include a silyl group substituted with three substituted alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • protecting group for amino group for nucleic acid synthesis refers to an amino group, a hydroxyl group, a phosphate group, or a mercapto group stably during nucleic acid synthesis. If it can protect, it will not be restrict
  • a protecting group that is stable under acidic or neutral conditions and can be cleaved by chemical methods such as hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, and photolysis.
  • a protecting group include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms; an acyl group; a tetrahydropyranyl group or a tetrahydrothiopyranyl group; a tetrahydrofuranyl group or a tetrahydrothiofuranyl group.
  • examples of the tetrahydropyranyl group or tetrahydrothiopyranyl group include a tetrahydropyran-2-yl group, a 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, a 4-methoxytetrahydropyran-4-yl group, a tetrahydro Examples include a thiopyran-4-yl group and a 4-methoxytetrahydrothiopyran-4-yl group.
  • examples of the tetrahydrofuranyl group or the tetrahydrothiofuranyl group include a tetrahydrofuran-2-yl group and a tetrahydrothiofuran-2-yl group.
  • Examples of the methyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include methoxymethyl group, 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl group, ethoxymethyl group, propoxymethyl group, isopropoxymethyl group, butoxymethyl group, Examples thereof include a t-butoxymethyl group.
  • Examples of the methyl group substituted with a C 1-6 alkoxy group substituted with a C 1-6 alkoxy group include a 2-methoxyethoxymethyl group.
  • Examples of the methyl group substituted with a C 1-6 alkoxy group substituted with a halogen atom include 2,2,2-trichloroethoxymethyl group, bis (2-chloroethoxy) methyl group, and the like.
  • Examples of the ethyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include 1-ethoxyethyl group and 1- (isopropoxy) ethyl group.
  • Examples of the ethyl group substituted with a halogen atom include a 2,2,2-trichloroethyl group.
  • Examples of the methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups include benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, ⁇ -naphthyldiphenylmethyl group, 9-anne. Examples include a thrylmethyl group.
  • “Methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom and / or a cyano group” includes 4-methyl Benzyl group, 2,4,6-trimethylbenzyl group, 3,4,5-trimethylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, 4,4′-dimethoxytriphenylmethyl group, 2- Examples thereof include a nitrobenzyl group, a 4-nitrobenzyl group, a 4-chlorobenzyl group, a 4-bromobenzyl group, and a 4-cyanobenzyl group.
  • Examples of the carbonyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, and an isobutoxycarbonyl group.
  • Examples of the “halogen atom, aryl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms and / or a nitro group” include a 4-chlorophenyl group, a 2-fluorophenyl group, a 4-methoxyphenyl group, a 4-nitrophenyl group, Examples include 2,4-dinitrophenyl group.
  • Examples of the “carbonyl group substituted with a C 1-6 alkoxy group substituted with a halogen atom and / or a silyl group substituted with 3 C 1-6 alkyl groups” include 2,2,2- Examples thereof include a trichloroethoxycarbonyl group and a 2-trimethylsilylethoxycarbonyl group.
  • Examples of the alkenyloxycarbonyl group include a vinyloxycarbonyl group and an aryloxycarbonyl group.
  • aralkyloxycarbonyl group optionally substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms and / or an aryl group substituted with a nitro group examples include benzyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 3, 4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl group, 2-nitrobenzyloxycarbonyl group, 4-nitrobenzyloxycarbonyl group and the like can be mentioned.
  • Examples of the “protecting group for hydroxyl group in nucleic acid synthesis” include, for example, an aliphatic acyl group; an aromatic acyl group; a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups; an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; To 6 alkoxy groups, methyl groups substituted with 1 to 3 aryl groups substituted with halogen atoms and / or cyano groups; or silyl groups.
  • Examples of the protecting group for the “hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” include an aliphatic acyl group; an aromatic acyl group; a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups; a halogen atom, and one carbon atom.
  • Examples of the “protecting group for the amino group for nucleic acid synthesis” include an acyl group and a benzoyl group.
  • Examples of the “protecting group” of the “phosphate group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and / or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a cyano group; An aralkyl group; an aralkyl group substituted with a nitro group and / or an aryl group substituted with a halogen atom; an aryl group substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or a nitro group; a 2-cyanoethyl group; 2,2,2-trichloroethyl group; benzyl group; 2-chlorophenyl group; or 4-chlorophenyl group.
  • Examples of the “protecting group” of the “mercapto group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis” include an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, and a benzoyl
  • —P (R 4 ) R 5 wherein R 4 and R 5 are each independently a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • the group that R 4 can represent as OR 4a and R 5 as NR 5a can be referred to as a “phosphoramidite group”.
  • the phosphoramidite group include a group represented by the formula —P (OC 2 H 4 CN) (N (iPr) 2 ) or a formula —P (OCH 3 ) (N (iPr) 2 ).
  • iPr represents an isopropyl group.
  • the terms “artificial nucleoside” and “nucleoside analog” refer to a non-natural type of “nucleoside” in which a purine or pyrimidine base and a sugar are linked (ie, not a natural nucleoside and And nucleosides that can be produced only on a synthetic basis, and aromatic heterocycles and aromatic hydrocarbon rings other than purine and pyrimidine that can be substituted with purine or pyrimidine bases (eg, pyridone, hydroxybenzene, aminopyridine) And the like, but not particularly limited) and a sugar.
  • purine or pyrimidine base and a sugar are linked (ie, not a natural nucleoside and And nucleosides that can be produced only on a synthetic basis, and aromatic heterocycles and aromatic hydrocarbon rings other than purine and pyrimidine that can be substituted with purine or pyrimidine bases (eg, pyridone, hydroxybenzene, aminopyridine) And the like,
  • oligonucleotide refers to an “oligonucleotide” in which 2 to 50 identical or different “nucleosides” or “nucleoside analogs” are linked by phosphodiester bonds.
  • a non-natural derivative include, for example, sugar derivatives with modified sugar moieties; thioate derivatives with phosphonate diester moieties thioester derivatives; ester forms with terminal phosphate moieties esterified; amino groups on purine bases Amides obtained by amidation and sugar derivatives with modified sugar moieties.
  • salt of a compound represented by Formula I or II refers to a salt of a compound represented by Formula I or II of the present invention.
  • examples of such salts include sodium salts, potassium salts, alkali metal salts such as lithium salts, calcium earth salts, alkaline earth metal salts such as magnesium salts, and aluminum salts of the compounds represented by formula I or II.
  • Metal salts such as iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts of compounds of formula I or II, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholines Salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt , Diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylami Amine salts such as organic salts such as salts, piperazine salts, tetramethylammonium salts, tris (hydroxymethyl) aminomethane salts; hydrofluoric acid salts, hydrochlorides, hydrogen bromides of compounds of formula I or II
  • the term “pharmacologically acceptable salt of an oligonucleotide containing at least one nucleoside structure represented by the formula I ′ or II ′” refers to the formula I ′ or II ′ of the present invention.
  • Alkaline earth metal salts such as, aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, metal salts such as cobalt salts; oligos containing at least one nucleoside structure represented by formula I ′ or II ′
  • Inorganic salts such as ammonium salt of nucleotide, t-octylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine Salt, dicyclohexylamine salt, N, N′-di Amine salts such as organic salts such as benzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris (hydroxy
  • Organic acid salts such as glycine salts, lysine salts, arginine salts, ornithine salts, glutamate salts, aspartates of oligonucleotides containing at least one nucleoside structure represented by the formula I ′ or II ′ Can be mentioned.
  • amino acid salts such as glycine salts, lysine salts, arginine salts, ornithine salts, glutamate salts, aspartates of oligonucleotides containing at least one nucleoside structure represented by the formula I ′ or II ′ Can be mentioned.
  • the 2 ', 4'-bridged artificial nucleoside and nucleotide or salt thereof of the present invention is represented by the following formula I or II:
  • B 1 represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more optional substituents selected from ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a protecting group for an amino group, or
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, a branch or a ring
  • An acyl group optionally having one or more optional substituents, a silyl group optionally having one or more optional substituents selected from the ⁇ group, and any arbitrary selected from the ⁇ group
  • B 1 is a purine base (ie, purin-9-yl group) or a pyrimidine base (ie, 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group).
  • bases are a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and 1 to carbon atoms. It may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group consisting of 6 linear alkylamino groups and halogen atoms.
  • the above base (B 1 ) include 6-aminopurin-9-yl group (adenylyl group), 2,6-diaminopurin-9-yl group, 2-amino-6-chloropurine-9- Yl group, 2-amino-6-fluoropurin-9-yl group, 2-amino-6-bromopurine-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group (guaninyl group), 6 -Amino-2-methoxypurin-9-yl group, 6-amino-2-chloropurin-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl group, 2,6-dimethoxypurine-9- Yl group, 2,6-dichloropurin-9-yl group, 6-mercaptopurin-9-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (cytosynyl group), 4 -Amin
  • B 1 is represented by the following structural formula from the viewpoint of application to a safe and effective nucleic acid drug:
  • 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (thyminyl group), 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidine-1 -Yl group (cytosynyl group), 6-aminopurin-9-yl group (adenylyl group), 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group (guaninyl group), 4-amino-5-methyl-2-
  • the oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group and the 2-oxo-4-hydroxy-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group are preferred, and in particular, the 2-oxo-4 A -hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (thyminyl group) is preferred.
  • the hydroxyl group is protected by a protecting group.
  • R 1 , R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, an amino group protecting group, Or
  • amino-protecting group examples include acetyl group, tertiary butoxycarbonyl (Boc) group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group and the like.
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, a branch Or an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a ring, one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group and having 3 or more hetero atoms.
  • guanidine is introduced into the crosslinked structure of 2', 4'-BNA / LNA. Since guanidine has a positive charge, for example, the anion repulsion suppression (electrostatic interaction) of the phosphodiester moiety and the enhancement of hydration effect improve the ability to form double strands on the target nucleic acid and improve the enzyme resistance. Be expected.
  • a 2 ', 4'-bridged artificial nucleotide can be easily prepared from the 2', 4'-bridged artificial nucleoside of the present invention.
  • triphosphorylation of 2 ′, 4′-bridged artificial nucleotide can be easily performed according to the method described in Non-Patent Document 5.
  • the oligonucleotide of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof contains at least one nucleoside structure represented by the following formula I ′ or II ′:
  • R 1 , R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, and protection of an amino group Group, or
  • R 14 represents a hydrogen atom.
  • the oligonucleotide of the present invention has at least one nucleoside structure at any position.
  • the number and position of the nucleoside structures contained in one oligonucleotide are not particularly limited and can be appropriately designed depending on the purpose. The higher the number, the higher the oligonucleotide has higher binding affinity and specificity for the target nucleic acid, the faster the duplex and triplex formation rate, and the higher the nuclease resistance.
  • the 2 ′, 4′-bridged artificial nucleoside of the present invention and the nucleoside structure contained in the oligonucleotide of the present invention are collectively referred to as “guanidine-bridged artificial nucleic acid” or “guanidine-bridged nucleic acid”. Is also referred to.
  • Such an oligonucleotide containing a nucleoside structure and its analogs have a structure fixed by cross-linking of the sugar moiety as described above, and thus are difficult to be decomposed by various nucleases, and are produced for a long time after administration to a living body. Can exist in the body. Furthermore, via the electrostatic action caused by cationic guanidine present on the cross-links of the sugar moiety, for example, it inhibits the biosynthesis of pathogenic proteins by forming stable duplexes with mRNA, or in the genome. It forms a triplex with the double-stranded DNA and inhibits transcription to mRNA. It is also possible to suppress the growth of the infected virus.
  • oligonucleotides synthesized using the 2 ′, 4′-bridged artificial nucleoside of the present invention and analogs thereof function as specific genes including antitumor agents and antiviral agents. It is expected to be useful as a pharmaceutical (such as an antisense molecule) that inhibits and treats diseases.
  • both binding affinity to complementary sense strand RNA and resistance to in vivo DNA-degrading enzyme are required.
  • the structure of the sugar part is constantly fluctuating between a shape close to a DNA duplex and a shape close to a DNA-RNA duplex or an RNA duplex. It has been known. When a single-stranded nucleic acid forms a double strand with a complementary RNA strand, its sugar structure is fixed.
  • the sugar moiety is fixed in advance to form a double strand, it is easy to form a double strand with the target RNA strand, It can exist stably. It is also known that nucleic acid duplexes are stabilized by hydrated water connected like a chain of water molecules. Since the 2 ', 4'-bridged artificial nucleoside of the present invention has guanidine, it is expected to improve the ability to form double chains by electrostatic interaction and hydration effect, and to improve enzyme resistance. Furthermore, by introducing guanidine into the cross-linked portion, the position of the cation is fixed, and electrostatic interaction and hydration effect are expected to be enhanced.
  • the 2 ′, 4′-bridged artificial nucleoside of the present invention has a positive charge derived from a guanidinium group in the molecule, it can be incorporated into cells more efficiently than natural nucleic acids or conventionally known artificial nucleic acids. It is also expected to improve the hybridization rate to the target nucleic acid. These are expected to enhance the antisense effect and increase the remaining time in the body, and can reduce side effects and costs by reducing the dose.
  • the oligonucleotide of the present invention and analogs thereof include, for example, adjuvants commonly used in the pharmaceutical formulation technical field such as excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrants, lubricants, and flavoring agents. It can mix
  • a topical preparation such as a solution, cream, ointment and the like can be prepared by blending a pharmaceutical carrier usually used in the art.
  • the hydrogen nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) spectrum is JNM-ECS400 type (400 MHz) manufactured by JEOL Ltd., using tetramethylsilane (0.00 ppm), chloroform-d (7.26 ppm). , Methanol-d 4 (3.30 ppm) was measured as an internal standard.
  • Methanol-d 4 (3.30 ppm) was measured as an internal standard.
  • singlet, doublet, triplet, multiplet, AB quartet, and double quartet are abbreviated as s, d, t, m, AB, and dd, respectively.
  • Carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectra were measured using JNM-ECS400 (100 MHz) with chloroform-d (77.0 ppm) and methanol-d 4 (49.0 ppm) as internal standards.
  • Phosphorus nuclear magnetic resonance ( 31 P-NMR) was measured using a JNM-ECS400 type (161.8 MHz) manufactured by JEOL Ltd. with 5% phosphoric acid-heavy aqueous solution (0.00 ppm) as an external standard.
  • Mass spectrometry (FAB-MS) was measured using JMS-600, JMS-700, and JMS-D300 manufactured by JEOL Ltd.
  • the adsorbent for silica gel chromatography is PSQ-100B (ave.
  • Tm measurement was performed using SHIMADZU UV-1650B and SHIMADZU UV-1650PC manufactured by Shimadzu Corporation.
  • MALDI-TOF-MS was measured using a Daltonics (registered trademark) Autoflex II TOF / TOF manufactured by Bruker.
  • Compound 1 was synthesized from D-glucose in 15 steps according to the method described in Nishida, M. et al., Chem. Commun., 2010, Vol. 46, p.5283-5285.
  • Nickel chloride (36 mg, 0.28 mmol) was added to 50 mL of a methanol solution of the obtained compound 1 (2.00 mg, 3.86 mmol) under a nitrogen stream, and then sodium borohydride (600 mg, 15.5 mmol) at 0 ° C. 4 mmol) was added and stirred at room temperature for 10 minutes. After filtration through celite, the solvent was distilled off to obtain a crude product. The obtained crude product was purified by silica gel column chromatography (methanol) to obtain compound 2 (1.47 g, 81%) as a white amorphous (step a).
  • Triethylamine (0.68 mL, 4.93 mmol) was added to 12 mL of a dichloromethane solution of the compound 5 (551 mg, 1.12 mmol) obtained above at room temperature under a nitrogen stream, and then acetic anhydride (0 .23 mL, 2.47 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was quenched by adding saturated aqueous sodium hydrogen carbonate at 0 ° C., and then the reaction solution was extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with water and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. Subsequently, the solvent was distilled off to obtain a crude product.
  • Example 2 Synthesis and purification of oligonucleotide analogs Using compound 8 obtained in Example 1, oligonucleotide analogs (compounds 9 to 13: shown in Table 1 below) were converted into DNA / RNA oligonucleotides. The synthesis was performed by an automatic synthesizer nS-8 (manufactured by Gene Design Co., Ltd.) using a 0.2 ⁇ mol scale CPG carrier. The coupling time of the acetonitrile solution of Compound 8 (0.1 M) was 16 minutes, and the other conditions were the same as those for natural DNA synthesis. As the activator, 5-ethylthio-1H-tetrazole (0.5M) was used.
  • the synthesized oligonucleotide was cleaved from the CPG carrier using 28% aqueous ammonia solution, and then the protecting group at the base part was removed at 55 ° C. for 12 hours.
  • the obtained crude product was purified by a reverse phase simple column (Sep-Pak @ Plus C18 Environmental Cartridges, Waters) and further subjected to reverse phase HPLC purification.
  • an oligonucleotide containing a natural nucleoside (compound 14: Table 2 below, SEQ ID NO: 1), and urea-bridged artificial nucleic acid 2 ′, 4′-BNA / LNA (5-methyl-2 ′
  • Oligonucleotide analogues (compounds 15 to 18: Table 3 below) containing -O, 4'-C-methyleneuridine (synthesized according to Non-Patent Document 6) were similarly synthesized according to standard phosphoramidite protocols. And purified.
  • Example 3 Measurement of Melting Temperature (Tm) Various Oligonucleotides Obtained in Example 2 (Compounds 9 to 12 of Oligonucleotide Analogs Manufactured Using Compound 8, Oligonucleotide Compounds Containing Natural Nucleosides) 14 and oligonucleotide analogue compounds 15 to 18 containing urea-bridged artificial nucleic acid and the target strand (5′-AGCAAAAAACGC-3 ′: SEQ ID NO: 2) were annealed to form a duplex. Subsequently, the hybridization ability of the oligonucleotide was examined by measuring the Tm value, which is the temperature at which 50% of the duplex is dissociated.
  • Tm value is the temperature at which 50% of the duplex is dissociated.
  • a sample solution (130 ⁇ L) containing NaCl 100 mM, sodium phosphate buffer (pH 7.2) 10 mM, oligonucleotide 4 ⁇ M, and target strand 4 ⁇ M was heated in a boiling water bath, and then cooled to room temperature over 10 hours. did.
  • a nitrogen stream was passed through the cell chamber of a spectrophotometer (Shimadzu, UV-1650PC) to prevent condensation, and the sample solution was gradually cooled to 5 ° C. and kept at 5 ° C. for 5 minutes, and measurement was started. The temperature was gradually raised to 90 ° C. at a rate of 0.5 ° C.
  • the duplex forming ability was almost the same as that of natural DNA.
  • the Tm value increased as the ratio of artificial nucleic acid introduced into the oligonucleotide increased. Accordingly, the nucleotide analogs of the present invention are considered useful for the synthesis of oligonucleotides suitable for antisense methods.
  • Tm measurement was performed under a low salt concentration condition (a solution having the same composition as the above sample solution except that NaCl is not included) in which the effect of the cation is more apparent.
  • a low salt concentration condition a solution having the same composition as the above sample solution except that NaCl is not included
  • Tm values of urea-crosslinked artificial nucleic acids were also measured. The results are shown in Table 3.
  • Compound 19 was obtained according to the procedure for preparing Compound 7 described in Shrestha, A.R., et al., J. Org. Chem., 2011, Vol. 76, p.9891-9899. Under a nitrogen stream, compound 19 (2.86 g, 4.10 mmol) in dichloromethane (40 mL) was added to pyridine (1.65 mL, 20.5 mmol) and trifluoromethanesulfonic anhydride (1.37 mL, under ice cooling). 8.20 mmol) was added, and the mixture was stirred for 1 hour under ice-cooling conditions.
  • N, N′-di- (tert-butoxycarbonyl) thiourea (30.4 mg, 0.11 mmol), diisopropylethylamine (9 ⁇ L) was added to 1 mL of a dichloromethane solution of the compound 21 (50 mg, 0.071 mmol) obtained under a nitrogen stream. , 0.035 mmol) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (21 mg, 0.11 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • N, N-diisopropylammonium tetrazolide (39 mg, 0.23 mmol) and 2-cyanoethyl N, N, N ′, N were added to 2 mL of an acetonitrile solution of the compound 27 (141 mg, 0.17 mmol) under a nitrogen stream.
  • '-Tetraisopropylphosphorodiamidite (73 ⁇ L, 0.23 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Subsequently, the reaction solution was quenched by adding water at 0 ° C. and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with water and saturated brine, and dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 5 Synthesis and Purification of Oligonucleotide Analogs Using compound 28 obtained in Example 4, 10-mer oligonucleotide analogs (compounds 29 to 32: shown in Table 4 below) were converted into DNA / RNA. The synthesis was performed using a 0.2 ⁇ mol scale CPG carrier by an oligonucleotide automatic synthesizer nS-8 (manufactured by Gene Design). The coupling time of the acetonitrile solution (0.1 M) of compound 28 was 8 minutes, and the other conditions were the same as those for natural DNA synthesis. As the activator, 5- [3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl] -1H-tetrazole (0.25M) was used.
  • the synthesized oligonucleotide was cut out from the CPG carrier using a 28% aqueous ammonia solution.
  • the obtained crude products of compounds 29 to 31 were purified by a reverse phase simple column (Sep-Pak @ Plus C18 Environmental Cartridges, Waters), and then treated with 50% trifluoroacetic acid (TFA) for 24 hours. Later reverse phase HPLC purification was performed.
  • the obtained crude product of compound 32 was purified by a reverse phase simple column (Sep-Pak @ Plus C18 Environmental Cartridges, Waters) and further subjected to reverse phase HPLC purification.
  • the molecular weight of the synthesized oligonucleotide analogues was determined by MALDI-TOF-MASS measurement. The results are shown in Table 4.
  • oligonucleotides containing natural nucleosides were similarly synthesized and purified according to a standard phosphoramidite protocol.
  • Example 6 Measurement of Melting Temperature (Tm)
  • Tm Melting Temperature
  • a sample solution (130 ⁇ L) containing NaCl 100 mM, sodium phosphate buffer (pH 7.2) 10 mM, oligonucleotide 4 ⁇ M, and target strand 4 ⁇ M was heated in a boiling water bath, and then cooled to room temperature over 10 hours. did.
  • a nitrogen stream was passed through the cell chamber of a spectrophotometer (Shimadzu, UV-1650PC) to prevent condensation, and the sample solution was gradually cooled to 0 ° C. and kept at 0 ° C. for another 5 minutes, and measurement was started. The temperature was gradually raised to 80 ° C. at a rate of 0.5 ° C.
  • Table 5 shows the hybridization ability of oligonucleotide analogues containing various numbers of guanidine-crosslinked artificial nucleic acids to poly A in terms of Tm values and Tm values per modification unit.
  • Table 6 shows the Tm value of the hybridization ability of oligonucleotides containing guanidine-crosslinked artificial nucleic acids and oligonucleotides containing natural nucleosides to various target strands.
  • the oligonucleotide containing the guanidine-bridged artificial nucleic acid was excellent not only in the ability to form a complex with RNA but also in the ability to form a complex with DNA.
  • the Tm value increased as the ratio of artificial nucleic acid introduced into the oligonucleotide increased. Therefore, the guanidine cross-linked artificial nucleic acid of the present invention is considered useful for the synthesis of oligonucleotides suitable for the antisense method.
  • oligonucleotide containing the guanidine cross-linked artificial nucleic acid also had mismatch recognition ability. Oligonucleotides containing guanidine cross-linked artificial nucleic acids were superior in ability to form a complex to a desired target strand (ie, poly A), compared to oligonucleotides containing natural nucleosides. For this reason, it was found that an oligonucleotide containing a guanidine cross-linked artificial nucleic acid has no fear of forming a complex in a non-sequence-specific manner.
  • Example 7 Evaluation of duplex-forming ability of oligonucleotide analogs Using compound 28 obtained in Example 4, 9-mer oligonucleotide analogs composed of various bases (compound 34: in Table 7 below) Is synthesized in the same manner as in Example 5 except that the synthesized oligonucleotide was cut out from the CPG carrier using 28% aqueous ammonia solution and then the protecting group at the base part was removed at 55 ° C. for 12 hours. And purified. For comparison, oligonucleotides containing natural nucleosides (compound 35: shown in Table 7 below) were similarly synthesized and purified according to standard phosphoramidite protocols.
  • a Tm value that is the temperature at which 50% of the duplex is dissociated was measured to determine the hybridization ability of the oligonucleotide.
  • Annealing to the target strand and measurement of the Tm value were performed in the same manner as in Example 6. Table 7 shows the results of the Tm value.
  • the oligonucleotide (compound 34) containing a guanidine-bridged artificial nucleic acid is both RNA and DNA as in the case of the poly-T sequence.
  • the double-strand forming ability was excellent.
  • a 15-mer oligonucleotide analog (compound 36: the above “X” is a guanidine-crosslinked artificial nucleic acid, and C underlined is 2′-deoxy 5-methyl Citidine (also shown in Table 8 below) was prepared by cleaving the synthesized oligonucleotide from the CPG carrier using a 28% aqueous ammonia solution, and then removing the protecting group at the base portion at 55 ° C. for 12 hours. was synthesized and purified in the same manner as in Example 5.
  • an oligonucleotide containing a natural nucleoside (compound 37: “X” above is a natural nucleoside, and C underlined is 2′-deoxy 5-methylcytidine. (Also shown in Table 8) was similarly synthesized and purified according to standard phosphoramidite protocols.
  • a target DNA duplex containing the target strand 5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGAGCGC-3 '(SEQ ID NO: 6) and its complementary strand 5'-GCGTCTCTCTTZTCTTTTTGCC-3' (SEQ ID NO: 7) was prepared as follows.
  • Y and Z are combinations capable of forming a base pair, and are as follows: Y is A and Z is T; Y is T and Z is A; Y Is G and Z is C; or Y is C and Z is G.
  • each oligonucleotide was annealed with the target duplex to form a triplex, and then the Tm value, the temperature at which 50% of the triplex was dissociated, was measured. Nucleotide hybridization ability was examined.
  • a sample solution (130 ⁇ L) containing sodium cacodylate buffer (pH 6.8) 10 mM, KCl 100 mM, and MgCl 2 50 mM, oligonucleotide 1.89 ⁇ M, and target duplex 1.89 ⁇ M in a boiling water bath. After heating, it was cooled to room temperature over 10 hours. A nitrogen stream was passed through the cell chamber of a spectrophotometer (Shimadzu, UV-1650PC) to prevent condensation, and the sample solution was gradually cooled to 5 ° C. and kept at 5 ° C. for another 20 minutes, and measurement was started. The temperature was gradually raised to 90 ° C. at a rate of 0.5 ° C.
  • the oligonucleotide (compound 36) containing a guanidine-bridged artificial nucleic acid has excellent triplex forming ability for a desired target duplex (Y is A and Z is T). It was.
  • oligonucleotide analogues produced using the nucleoside analogue of Example 1 (Compound 8), wherein X is a guanidine-bridged artificial nucleic acid
  • Oligonucleotide analog prepared using the nucleoside analog of Example 4 (Compound 28), wherein X is a guanidine-bridged artificial nucleic acid (ie, “Compound 32”);
  • X is LNA-T (thymine LNA) (Product made by Gene Design Co., Ltd .: Compound 38); an oligonucleotide in which X is DNA-T (thymine DNA) (10-mer oligo dT, or “compound 33”); and X in S-oligo (sulfurized instead of oxidizing agent) Except for using D-1,4-dithiothreitol (DDTT, manufactured by ChemGene) as an agent.
  • DDTT D-1,4-dithiothreitol
  • nuclease resistance was performed as follows. 3'-exonuclease (Crotalus admanteus venom phosphodiesterase: CAVP, manufactured by Pharmacia Biotech) was added to 100 ⁇ L of a buffer solution containing any of various oligonucleotides (750 pmol) [50 mM Tris ⁇ HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2 ]. .175 ⁇ g was added and mixed, and incubated at 37 ° C., and a part of the reaction solution was taken out at regular intervals after the start of the reaction. The extracted reaction solution was heated at 90 ° C.
  • the HPLC conditions are as follows: gradient 6-12% MeCN (15 minutes); flow rate 0.8 mL / min; column temperature 50 ° C.
  • the remaining amount of oligonucleotide was calculated as a percentage (%) of unreacted oligonucleotide and plotted against the reaction time. The results are shown in FIG.
  • FIG. 1 is a graph showing changes over time in the proportion of unreacted oligonucleotides when various oligonucleotides having the sequence 5'-d (TTTTTTTTXT) -3 'were treated with 3'-exonuclease.
  • the vertical axis in FIG. 1 indicates the ratio (%) of unreacted oligonucleotide to nuclease treatment, and the horizontal axis indicates nuclease treatment time (minutes).
  • oligonucleotide containing natural nucleoside (compound 33); circle, oligonucleotide containing LNA (compound 38); triangle, oligonucleotide containing guanidine cross-linked artificial nucleic acid ( Compound 32); x, oligonucleotide containing guanidine cross-linked artificial nucleic acid (compound 13); and inverted triangle, oligonucleotide containing S-oligo (compound 39).
  • oligonucleotide (compound 40) is an oligonucleotide analog in which the 5′-d (TTTTTTTTTX) -3 ′ sequence X is a guanidine-bridged artificial nucleic acid. ) was prepared as follows.
  • 3'-exonuclease (Crotalus admanteus venom phosphodiesterase: CAVP, manufactured by Pharmacia Biotech) (0.2 ⁇ g) was added to 40 ⁇ L of a buffer solution containing Compound 32 (3330 pmol) [50 mM Tris ⁇ HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2 ]. And mixed and incubated at 37 ° C. for 3 hours. Subsequently, the enzyme was inactivated by heating at 90 ° C. for 2 minutes, and then purified by HPLC.
  • the molecular weight measurement value (2743.07) by time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) showed a good agreement with the theoretical value (274.83). It was confirmed that was obtained.
  • oligonucleotide having a sequence of 5'-d (TTTTTTTT) -3 'where X is LNA (manufactured by Gene Design Co., Ltd .: Compound 41) was used for comparison.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in the proportion of unreacted oligonucleotides when various oligonucleotides having the sequence 5'-d (TTTTTTTTX) -3 'were treated with 3'-exonuclease.
  • the vertical axis in FIG. 2 indicates the ratio (%) of the unreacted oligonucleotide to the nuclease treatment, and the horizontal axis indicates the nuclease treatment time (minutes).
  • the symbols in FIG. 2 represent the following: circle, oligonucleotide containing LNA (compound 41); and triangle, oligonucleotide containing guanidine bridged artificial nucleic acid (compound 40).
  • Example 11 Measurement of Melting Temperature (Tm) of Oligonucleotide Analogs
  • Compound 33 naturally oligonucleotide consisting of 10-mer oligo dT described in Table 9 below; Compounds 29-31, 42 and 43 (Compound 28) Oligonucleotide analogs containing guanidine cross-linked nucleic acids); and compounds 44 to 48 (oligonucleotides containing LNA-T) after annealing to 10-mer poly A to form complexes.
  • Tm value is the temperature at which 50% of the DNA dissociates.
  • Compounds 29-31, 42 and 43 were synthesized and purified as described in Example 5, except that TFA 75% was used instead of TFA 50% for TFA treatment after purification using a reverse phase simple column.
  • Compounds 44 to 48 are manufactured by Gene Design Co., Ltd.
  • Example 6 For complex formation and Tm measurement, Example 6 was used except that a sample solution (130 ⁇ L) containing 200 mM KCl, 20 mM potassium cacodylate buffer (pH 6.8), 4 ⁇ M oligonucleotide, and 4 ⁇ M target strand was used. As well as. The results are shown in Table 9. Table 9 shows the Tm value of the ability of oligonucleotide analogues containing different numbers of guanidine-crosslinked artificial nucleic acids to hybridize to poly A compared to natural oligonucleotides and oligonucleotides containing different numbers of LNAs. It is expressed as a difference in Tm value per modification unit.
  • the oligonucleotide analog containing the guanidine-crosslinked artificial nucleic acid showed sufficiently high binding affinity compared to the natural oligonucleotide. Furthermore, when the number of introduced artificial nucleic acids is 3 residues or less, the oligonucleotide analog containing the guanidine cross-linked artificial nucleic acid had a Tm value similar to that of the oligonucleotide containing LNA, but the guanidine cross-linked type It was revealed that oligonucleotides introduced with 5 residues of artificial nucleic acid showed higher binding affinity than when 5 residues of LNA were introduced.
  • oligonucleotides containing guanidine cross-linked artificial nucleic acids have a very high binding affinity and much higher binding affinity than natural oligonucleotides and oligonucleotides containing LNA. It became.
  • FIG. 3 shows a DNA target strand having a completely complementary sequence (full match type) and a DNA target strand having a single base mismatch (mismatch type) of an oligonucleotide analog containing guanidine cross-linked artificial nucleic acid and an oligonucleotide containing LNA. Tm curves for each are shown.
  • the vertical axis in FIG. 3 represents absorbance at 260 nm, and the horizontal axis represents temperature (° C.).
  • Mismatch type (thin single line) and full match type (thin single broken line) of oligonucleotide analogs (compound 43) containing guanidine cross-linked artificial nucleic acid and mismatch type (thick single line) of oligonucleotide (compound 48) containing LNA The results for the full match type (thick single dashed line) are shown.
  • the oligonucleotide analog (compound 43) containing the guanidine-bridged artificial nucleic acid has a sufficiently low Tm value for the mismatched target strand compared to the Tm value for the full-matched target strand.
  • the decrease was comparable to that of the oligonucleotide containing LNA (Compound 48). From this, it became clear that the oligonucleotide containing the guanidine cross-linked artificial nucleic acid has a very high binding affinity with the target strand without impairing the target base recognition ability.
  • Example 13 Evaluation of intracellular dynamics of guanidine cross-linked artificial nucleic acid (hereinafter sometimes referred to as GuNA) (1) Synthesis and identification of fluorescently labeled GuNA modified oligonucleotide (F-GuNA-ODN) First, Example Using the compound 28 obtained in Step 4, the natural nucleoside, and the amidite body for fluorescent modification described later, an oligonucleotide analog by a DNA / RNA oligonucleotide automatic synthesizer nS-8 (manufactured by Gene Design Co., Ltd.) was synthesized. The synthesized oligonucleotide analogue is a compound that becomes a precursor (compound 49) of compounds 53 to 57 shown in Table 10. The structure of this precursor (compound 49) is shown below.
  • a precursor compound 49
  • Table 10 The structure of this precursor (compound 49) is shown below.
  • thymidine amidite (model number: T111081) and thymidine CPG solid phase support (model number: T361010)
  • CapA model number: L840020-06
  • CapB model number: L850020-06
  • oxidizing agent model number: L860020-06
  • SAFC registered trademark
  • Proligo registered trademark
  • the activator used was 0.25M 5-ethylthio-1H-tetrazole / dry acetonitrile (manufacturer code: 30-3140-52, manufactured by Glen Research).
  • the coupling time of the acetonitrile solution of compound 28 (0.1 M) was 20 minutes, and when compound 28 was introduced into the oligonucleotide continuously for 3 bases, double coupling was performed only at the 3rd base.
  • the other conditions were the same as those for natural DNA synthesis.
  • the amidite body Thiol-Modifier C6 SS (manufacturer code: 10-1936-90, Glen Research) having the structural formula shown below is added to the 5 ′ end side of the oligonucleotide by a DNA automatic synthesizer, By terminating the protecting group dimethoxytrityl group (DMTr group) without deprotecting, a precursor (compound 49) of fluorescently labeled modified oligonucleotide analogs (compounds 53 to 57) was obtained. It has been confirmed that the disulfide bond of the amidite body Thiol-Modifier C6 SS has sufficient resistance against 75% TFA.
  • DMTr group dimethoxytrityl group
  • an oligonucleotide analog compound containing urea-crosslinked artificial nucleic acid 2 ′, 4′-BNA / LNA (5-methyl-2′-O, 4′-C-methyleneuridine instead of compound 28) 58 to 61 (shown in Table 10 below) (manufactured by Gene Design Co., Ltd.) was purchased and used. The structure of the precursor (compound 50) of this oligonucleotide analog is shown below.
  • the obtained precursor (Compound 49) was cut out from the CPG carrier using 28% aqueous ammonia solution, ammonia was removed using a NAP-10 column (code number: 17-0854-01, GE Healthcare), and RP-HPLC And lyophilized. RP-HPLC was performed under the conditions shown below using Shimadzu LC-10AT VP , Shimadzu SPD-10A VP , and Shimadzu CTO-10 VP .
  • Mobile phase solution A 0.1 M triethylammonium acetate buffer, pH 7.0 Solution B 80% acetonitrile / 0.1M triethylammonium acetate buffer gradient: B liquid concentration: 0-100% (80 minutes)
  • an SH group is generated by reduction, and a purified precursor (compound 51) is a precursor (compound) of Alexa Fluor 488 C5 maleimide (product code: A-10254, manufactured by Life Technologies) whose structural formula is shown below. 51) was added in an amount of 10 equivalents and reacted overnight at room temperature to bind the SH group and maleimide (Nucleic Acids Research, 36, 2764-2776, 2008).
  • the cultivation was continued for 12 hours, and then the cultured HuH-7 cells were mixed with Hanks balanced salt solution (HBSS, product number: 14025-092, Life technologies).
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • the product was washed once with a Hoechst 33342 (product number: H3570, Life technologies) and LysoTracker (registered trademark) Red DND-99 (catalog number: L-7528, Life technologies) according to the protocol. Nuclei and lysosomes were stained.
  • Alexa Fluor 488 Ex 470/40 nm, DM 495 nm, BA 535/50 nm (GFP-B, manufactured by Keyence Corporation), 5 seconds Hoechst 33342: Ex 360/40 nm, DM 400 nm, BA 460/50 nm (DAPI-B, stock) (Manufactured by Keyence Corporation), 2 seconds LysoTracker (registered trademark) Red DND-99: Ex 540/25 nm, DM 565 nm, BA 605/55 nm (TRITC, manufactured by Keyence Corporation), 1.2 seconds
  • FIG. 4 shows micrographs showing the kinetics of Compound 57 (AD) and Compound 61 (EH) in HuH-7 cells.
  • B and F fluorescence images of Alexa Fluor 488 (oligonucleotide)
  • C and G are fluorescence images of Hoechst 33342 (nuclear)
  • D and H are fluorescence images of LysoTracker (lysosome) ( Scale bar 50 ⁇ m).
  • FIG. 4B micrographs showing the kinetics of Compound 57 in HuH-7 cells, and enlarged images (A to D) of the regions indicated by arrows in FIG. 4B with respect to FIGS. 4A to 4D, are shown in FIG.
  • the added oligonucleotide does not exist in the nucleus, accumulates in the vesicles in the cytoplasm, and also exists in the lysosome. It became clear that he was doing.
  • the artificial nucleoside and oligonucleotide having a guanidine bridge of the present invention can overcome these drawbacks and contribute to the medicinal use of nucleic acids.
  • an oligonucleotide nucleic acid molecule that has high binding affinity and specificity for a target nucleic acid and exhibits high nuclease resistance.
  • Such a nucleic acid molecule greatly contributes as a material for nucleic acid pharmaceuticals used in antisense methods, antigene methods, methods using aptamers, methods using siRNA and the like that are expected as new treatments and prevention methods for diseases. Can do.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)

Abstract

　本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、式ＩまたはＩＩで表される化合物またはその塩、ならびに式Ｉ'またはＩＩ'で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有する。本発明によれば、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子が提供される。

Description

グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド
　本発明は、人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドに関し、より詳細には、グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドに関する。
　核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマーを用いる方法、ｓｉＲＮＡを用いる方法などがある。このうち、アンチセンス法は、疾病に関わるｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより、病原ＲＮＡの翻訳過程を阻害し、疾病の治療や予防を行う手法である。ｓｉＲＮＡを用いる方法もアンチセンス法に類似しており、生体に投与した二重鎖ＲＮＡによりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する。一方、アンチジーン法は、病原ＲＮＡを転写するＤＮＡ部位に対応する三重鎖形成オリゴヌクレオチドを外部から導入することによりＤＮＡからＲＮＡへの転写を抑制する。また、アプタマーは、短い核酸分子（オリゴヌクレオチド）であるため、疾病の原因となるタンパク質などの生体成分と結合することにより機能を発揮する。
　こうした核酸医薬の素材として、種々の人工核酸が開発されているが、未だ切札となるべき分子が存在しない。例えば、これまでに開発されてきた核酸医薬の素材として、ホスホロチオエート（Phosphorothioate：Ｓ－ＰＯ３）型オリゴヌクレオチド（Ｓ－オリゴ）、２’，４’－ブリッジド（架橋）核酸（bridged nucleic acid）（ＢＮＡ）／２’，４’－ロックト核酸（locked nucleic acid）（ＬＮＡ）（特許文献１から４および非特許文献１から４）などがある。Ｓ－オリゴは、サイトメガロウイルスに対するアンチセンス医薬品として、既に米国で上市されている。これは、高いヌクレアーゼ耐性を有するものの、標的核酸鎖との結合親和性が低いという難点を有しており、改善が必要である。これまでに開発されている２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡは、いずれも標的核酸鎖との結合親和性が高く、これからの核酸医薬の素材として最も期待される分子である。しかしながら、ヌクレアーゼに対する耐性が十分ではなく、生体内での安定性という点で改良の余地がある。
国際公開第９８／３９３５２号 国際公開第２００５／０２１５７０号 国際公開第２００３／０６８７９５号 国際公開第２０１１／０５２４３６号
C. Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁 Y. Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁 K. Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁 S.M.A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁 M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁 S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁
　本発明は、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にグアニジンを導入した核酸を含むオリゴヌクレオチドが、特にＤＮＡに対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すことを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、以下の式ＩまたはＩＩで表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂ１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
を表し；そして
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）を提供する。
　１つの実施態様では、上記式ＩまたはＩＩにおいて、上記Ｂ１は、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である。
　１つの実施態様では、上記式ＩまたはＩＩにおいて、上記Ｂ１は、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である。
　本発明はまた、以下の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　（式中、
　Ｂ１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表し；そして
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）を提供する。
　１つの実施態様では、上記式Ｉ’またはＩＩ’において、上記Ｂ１は、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である。
　１つの実施態様では、上記式Ｉ’またはＩＩ’において、上記Ｂ１は、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である。
　本発明によれば、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子を提供することができる。
５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）－３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’－エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。 ５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）－３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’－エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。 グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体およびＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドの、完全相補配列を有するＤＮＡ標的鎖（フルマッチ型）および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡ標的鎖（ミスマッチ型）のそれぞれに対するＴｍ曲線を示すグラフである。 化合物５７（Ａ～Ｄ）および化合物６１（Ｅ～Ｈ）のＨｕＨ－７細胞内の動態を示す顕微鏡写真であり、Ａ，Ｅは位相差像; Ｂ，ＦはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　(オリゴヌクレオチド)の蛍光像; Ｃ，ＧはＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２ (核) の蛍光像; Ｄ，ＨはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（リソソーム）の蛍光像である。 化合物５７のＨｕＨ－７細胞内の動態を示す顕微鏡写真であって、図４Ａ～Ｄについて図４Ｂの矢印で示す領域について拡大した写真（Ａ～Ｄ）である。
　まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、またはｎ－ヘキシル基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を１つあるいは炭素数１から６の同一のまたは異なる任意の直鎖アルキル基を２つ有するアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の環状アルキル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基が挙げられ、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数２から７の任意の分岐鎖アルケニル基、炭素数３から７の任意の環状アルケニル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。例えば、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよいアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６から１２の任意の芳香族炭化水素化合物、および炭素数６から１２の任意の環構造のうち、当該環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６から１２の芳香族炭化水素化合物としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該複素芳香族化合物としては、ピリジン環、ピロリン環、キノリン環、インドリン環、イミダゾリン環、フリン環、チオフェン環などが挙げられる。ピリジン環としては、例えば、ピリミジン環、ピペリジン環、キノリン環、アクリジン環が挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよいヘテロアリール部分を有するアラルキル基」は、炭化水素のみで構成された炭素数５から１２の任意の芳香族炭化水素化合物、および炭素数５から１２の任意の環構造のうち、当該環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された任意の複素芳香族化合物を包含する。用語「ヘテロ原子を含んでいてもよいヘテロアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２－ピリジルエチル基、１－ピリジルエチル基、３－チエニルプロピル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３－メチルノナノイル基、８－メチルノナノイル基、３－エチルオクタノイル基、３，７－ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１－メチルペンタデカノイル基、１４－メチルペンタデカノイル基、１３，１３－ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５－メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１－メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルキル基で置換されたカルボニル基；メトキシアセチル基のような炭素数１から６のアルコキシアルキルカルボニル基；（Ｅ）－２－メチル－２－ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２－ブロモベンゾイル基、４－クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６－トリメチルベンゾイル基、４－トルオイル基のような炭素数１から６のアルキル基で置換されたアリールカルボニル基；４－アニソイル基のような炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたアリールカルボニル基；２－カルボキシベンゾイル基、３－カルボキシベンゾイル基、４－カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４－ニトロベンゾイル基、２－ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２－（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル化アリールカルボニル基；４－フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ－ｔ－ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ炭素数１から６のアルキル基で置換されたシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１から２個のアリール基で置換された炭素数１から６の３つのアルキル基で置換されたシリル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。
　本明細書において、「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、および「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」内に記載される用語「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基；炭素数１から６のアルケニル基；アシル基；テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基；テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基；シリル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；ハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたエチル基；ハロゲン原子で置換されたエチル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基；ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基；ハロゲン原子および／または炭素数１から６の３個のアルキル基で置換されたシリル基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基；アルケニルオキシカルボニル基；炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基で置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基；などが挙げられる。
　より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン－２－イル基、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロピラン－４－イル基、テトラヒドロチオピラン－４－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン－２－イル基、テトラヒドロチオフラン－２－イル基が挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、メトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、２－メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、２，２，２－トリクロロエトキシメチル基、ビス（２－クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたエチル基としては、１－エトキシエチル基、１－（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されたエチル基としては、２，２，２－トリクロロエチル基などが挙げられる。１から３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基、９－アンスリルメチル基などが挙げられる。「炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基、２－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基、４－シアノベンジル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４－クロロフェニル基、２－フロロフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－ニトロフェニル基、２，４－ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子およびまたは３個の炭素数１から６のアルキル基で置換されたシリル基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基」としては、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基で置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４－メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンジルオキシカルボニル基、４－ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　「核酸合成の水酸基の保護基」としては、例えば、脂肪族アシル基；芳香族アシル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基；またはシリル基；が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、例えば、脂肪族アシル基；芳香族アシル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基；炭素数１から６のアルキル基；または炭素数１から６のアルケニル基；が挙げられる。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、例えば、アシル基、ベンゾイル基が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基および／またはシアノ基で置換された炭素数１から６のアルキル基；アラルキル基；ニトロ基および／またはハロゲン原子で置換されたアリール基で置換されたアラルキル基；炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基；２－シアノエチル基；２，２，２－トリクロロエチル基；ベンジル基；２－クロロフェニル基；または４－クロロフェニル基；が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、例えば、脂肪族アシル基または芳香族アシル基、ベンゾイル基が挙げられる。
　本明細書において、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ４がＯＲ４ａそしてＲ５がＮＲ５ａとして表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、例えば、式－Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式－Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
　本明細書において、用語「人工ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの（すなわち、天然のヌクレオシドではなく、かつ人為的にのみ製造することができるヌクレオシド）、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なもの（例えば、ピリドン、ヒドロキシベンゼン、アミノピリジンなどが挙げられるが、特に限定されない）と糖とが結合したものいう。
　本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で２から５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、例えば、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
　本明細書において、用語「式ＩまたはＩＩで表される化合物の塩」とは、本発明の式ＩまたはＩＩで表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、式ＩまたはＩＩで表される化合物のナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；式ＩまたはＩＩで表される化合物のアンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；式ＩまたはＩＩで表される化合物のフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；式ＩまたはＩＩで表される化合物のメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような炭素数１から６のアルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、式ＩまたはＩＩで表される化合物のグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
　本明細書において、用語「式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドの薬理学上許容される塩」としては、本発明の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、例えば、式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのアンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような炭素数１から６のアルカンで置換されたスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
　以下、本発明について詳述する。
　本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドまたはその塩は、以下の式ＩまたはＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂ１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
を表し；そして
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）で表される構造を有する。
　上記式ＩまたはＩＩにおいて、Ｂ１は、プリン塩基（すなわち、プリン－９－イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
　上記の塩基（Ｂ１）の具体例としては、６－アミノプリン－９－イル基（アデニニル基）、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基（グアニニル基）、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（シトシニル基）、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（ウラシリル基）、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（チミニル基）、および４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が挙げられる。
　中でも、Ｂ１は、安全で効果的な核酸医薬への応用という観点から、以下の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　でそれぞれ表される、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（チミニル基）、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（シトシニル基）、６－アミノプリン－９－イル基（アデニニル基）、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基（グアニニル基）、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（ウラシリル基）が好適であり、特に、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（チミニル基）が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基が保護基により保護されていることが好ましい。
　上記式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
を表し、好ましくは、水素原子またはメチル基である。「アミノ基の保護基」としては、アセチル基、第三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などが挙げられる。
　上記式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す。
　本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドは、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にグアニジンが導入されている。グアニジンは正の電荷を有するため、例えば、リン酸ジエステル部のアニオン反発抑制（静電相互作用）および水和効果の増強による標的核酸に対する二重鎖形成能の向上、ならびに酵素耐性能の向上が期待される。
　本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドから、２’，４’－架橋型人工ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、２’，４’－架橋型人工ヌクレオチドの三リン酸化は、非特許文献５に記載の方法に従って容易に行われ得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、以下の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　（式中、Ｂ１、Ｒ２、およびＲ３は、上記式ＩおよびＩＩについて定義されるものと同様である）。
　上記式Ｉ’またはＩＩ’において、Ｒ１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
を表し、好ましくは、水素原子またはメチル基であり、そしてＲ１４は、水素原子を表す。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。１つのオリゴヌクレオチドに含有される上記ヌクレオシド構造の数および位置は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。数が多いほど、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、二重鎖および三重鎖の形成速度が速く、高いヌクレアーゼ耐性を示す。本明細書中では、本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシド、および本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる上記ヌクレオシド構造を総称して、「グアニジン架橋型人工核酸」または「グアニジン架橋型核酸」とも称する。
　このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチドおよびその類縁体は、上述のように糖部の架橋により固定された構造を有するため、各種ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。さらに、糖部の架橋上に存在するカチオン性グアニジンに起因する静電作用を介して、例えば、ｍＲＮＡと安定な二重鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害し、あるいはゲノム中の二重鎖ＤＮＡとの間で三重鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。
　これらのことから、本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチドおよびその類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子など）としての有用性が期待される。
　特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドでは、グアニジンを有するため、例えば、静電相互作用および水和効果による二重鎖形成能の向上、ならびに酵素耐性能の向上が期待される。さらに、グアニジンを架橋部に導入することによりカチオンの位置が固定され、静電相互作用および水和効果の増強も期待される。本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドでは、分子中にグアニジニウム基由来の正電荷を有するため、天然の核酸やこれまでに知られている人工核酸に比べて、細胞への取り込み効率が向上でき、さらに標的核酸に対するハイブリッド形成速度の向上もまた期待される。これらによりアンチセンス効果の増強および体内残存時間の増大が見込まれ、投与量を減らすことによる副作用の軽減とコストの削減が可能である。
　本発明のオリゴヌクレオチドおよびその類縁体は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。
　以下、本発明の２’，４’－架橋型人工ヌクレオシドおよびその類縁体の合成を、実施例に基づいてさらに詳しく説明する。
　以下の実施例では、水素核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトルは日本電子株式会社製ＪＮＭ－ＥＣＳ４００型（４００ＭＨｚ）を用い、テトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）、クロロホルム－ｄ（７．２６ｐｐｍ）、メタノール－ｄ４（３．３０ｐｐｍ）を内部標準として測定した。分裂様式は一重項，二重項，三重項，多重項，ＡＢ四重項，二重四重項をそれぞれｓ，ｄ，ｔ，ｍ，ＡＢ，ｄｄと略した。炭素核磁気共鳴（１３Ｃ－ＮＭＲ）スペクトルはＪＮＭ－ＥＣＳ４００型（１００ＭＨｚ）を用い、クロロホルム－ｄ（７７．０ｐｐｍ）、メタノール－ｄ４（４９．０ｐｐｍ）を内部標準として測定した。リン核磁気共鳴（３１Ｐ－ＮＭＲ）は、日本電子株式会社製ＪＮＭ－ＥＣＳ４００型（１６１．８ＭＨｚ）を用い、５％リン酸－重水溶液（０．００ｐｐｍ）を外部標準として測定した。質量分析（ＦＡＢ－ＭＳ）は日本電子株式会社製ＪＭＳ－６００型、同ＪＭＳ－７００型、同ＪＭＳ－Ｄ３００型を用いて測定した。シリカゲルクロマトグラフィーの吸着剤は富士シリシア化学株式会社製ＰＳＱ－１００Ｂ（ａｖｅ．０．１１０ｍｍ）を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーの吸着剤は富士シリシア化学富士株式会社製ＰＳＱ－６０Ｂ（平均０．０６０ｍｍ）を用いた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は株式会社島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＬＣ－１０ＡＴＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＰＤ－１０ＡＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＣＴＯ－１０ＶＰを用いた。ＨＰＬＣ分析カラムにはＷａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ　ＯＳＴ　Ｃ１８　２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）を、分取カラムにはＷａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ　ＯＳＴ　Ｃ１８　２．５μｍ　（１０×５０ｍｍ）を用いた。Ｔｍ測定は株式会社島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＵＶ－１６５０Ｂ、　ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＵＶ－１６５０ＰＣ　を用いて行った。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳはＢｒｕｋｅｒ社製Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（登録商標）Ａｕｔｏｆｌｅｘ　II　ＴＯＦ／ＴＯＦを用いて測定した。
　塩化メチレン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ピリジンはカルシウムヒドリドで乾燥した後に、蒸留し反応溶媒および塩基として使用した。その他の試薬類については、特に記載のない限り、市販のものをそのまま使用した。
　（実施例１）ヌクレオシド類縁体（化合物８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（１）化合物５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　Nishida, M.ら、Chem. Commun.、2010年、第46巻,p.5283-5285.に記載の方法に従い、Ｄ－グルコースから１５工程で化合物１を合成した。
　得られた化合物１（２．００ｍｇ，３．８６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液５０ｍＬに窒素気流下、塩化ニッケル（３６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を加えた後、０℃にて水素化ホウ素ナトリウム（６００ｍｇ，１５．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間撹拌した。セライトで濾過を行った後に溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール）により精製し、化合物２（１．４７ｇ，８１％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ａ）。
　得られた化合物２の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CD3OD) δ : 1.60 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.61, 2.93 (2H, AB, J = 14.0 Hz), 3.54, 3.61 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.70 (1H, t, J = 6.0 Hz, 9.0 Hz), 4.19 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.58, 4.61 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.65, 4.81 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.89 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.30-7.43 (10H, m), 7.53 (1H, d, J = 1.0 Hz)。
　次いで、得られた化合物２（５７６ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１０ｍＬに、窒素気流下、０℃にて９－フルオレニルメトキシカルボニルイソシアナート（３５０ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４ｍＬ）を加えて０℃にて１５分間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８０：１）により精製し、化合物３（６３８ｍｇ，６９％）を白色固体として得た（上記工程ｂ）。
　得られた化合物３の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CDCl3) δ : 1.57 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.57, 3.69 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.65 (1H, t, J = 7.5 Hz), 3.91, 4.24 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.16 (1H, d, J = 7.5Hz), 4.22 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.53 (2H, s), 4.68, 4.77 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.88 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.19-7.44 (15H, m), 7.55 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.12 (1H, s), 8.29 (1H, s), 9.98 (1H, s)。
　次いで、得られた化合物３（３３５ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液５ｍＬに、窒素気流下、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０３ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて６時間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８０：１）により精製し、化合物４（２６８ｍｇ，８３％）を黄白色固体として得た（上記工程ｃ）。
　得られた化合物４の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CD3OD) δ : 1.35 (3H, s), 3.11, 3.45 (2H, AB, J = 13.5 Hz), 3.69, 3.83 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.28 (2H, d, J = 6.5 Hz), 4.30 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.32 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.38 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.48, 4.71 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.51, 4.57 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.91 (1H, s), 7.23-7.85 (19H, m)。
　得られた化合物４（９７１ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液８ｍＬに、窒素気流下、ジエチルアミン（２ｍＬ）を加え室温にて５時間撹拌した。次いで、溶媒留去した後、ヘキサンで洗浄することで化合物５（６０９ｍｇ，９１％）を白色固体として得た（上記工程ｄ）。
　得られた化合物５の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CD3OD) δ : 1.37 (3H, s), 3.12, 3.46 (2H, AB, J = 14.0 Hz), 3.60, 3.86 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.25 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.44 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.50, 4.71 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.51, 4.59 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.89 (1H, s), 7.24-7.80 (10H, m), 7.89 (1H, s)。
　（２）化合物８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記で得られた化合物５（５５１ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１２ｍＬに、窒素気流下、室温にてトリエチルアミン（０．６８ｍＬ，４．９３ｍｍｏｌ）を加えた後に、０℃にて無水酢酸（０．２３ｍＬ，２．４７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体（６１６ｍｇ）のイソプロパノール溶液１０ｍＬに炭酸カリウム（４００ｍｇ，２．８９ｍｍｏｌ）を加えて室温にて６日間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体（５１７ｍｇ）のイソプロパノール溶液１０ｍＬに、水素気流下、水酸化パラジウムカーボン（１．４０ｇ）を加えて室温にて２６時間撹拌した。反応液を濾過して得られたろ液の溶媒を留去することで化合物６（３１９ｍｇ，８０％）を白色固体として得た（上記工程ｅ）。
　得られた化合物６の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CD3OD) δ : 1.87 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.21 (3H, s), 3.45, 3.54 (2H, AB, J = 14.5 Hz), 3.71, 3.86 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.23 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.61 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.85 (1H, s), 8.10 (1H, d, J = 1.0 Hz)。
　得られた化合物６（２１９ｍｇ，０．６２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液７ｍＬに、窒素気流下、０℃にて４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（６３０ｍｇ，１．８６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２０時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１→５：１）により精製し、化合物７（２６７ｍｇ，６６％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ｆ）。
　得られた化合物７の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CD3OD) δ : 1.87 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.21 (3H, s), 3.45, 3.54 (2H, AB, J = 14.5 Hz), 3.71, 3.86 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.23 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.61 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.85 (1H, s), 8.10 (1H, d, J = 1.0 Hz)。
　得られた化合物７（１３１ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液２ｍＬに、窒素気流下、ジイソプロピルエチルアミン（１４６μＬ，０．８４ｍｍｏｌ）を加えた後、０℃にて２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト（９６μＬ，０．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１４時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をジクロロメタン、ヘキサンにより再沈殿を行うことで精製し、化合物８（１１０ｍｇ，６１％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ｇ）。
　得られた化合物８の物性データは、以下のとおりであった：31P-NMR (CDCl3) δ : 149.94, 151.37。
　（実施例２）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
　実施例１で得られた化合物８を用いて、オリゴヌクレオチド類縁体（化合物９から１３：以下の表１に示す）を、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド自動合成機ｎＳ－８（株式会社ジーンデザイン製）により０．２μｍｏｌスケールのＣＰＧ担体を用いて合成した。化合物８のアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）のカップリング時間は１６分間で行い、それ以外は天然のＤＮＡ合成と同条件にて行った。活性化剤は５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（０．５Ｍ）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドは２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した後に、５５℃にて１２時間かけて塩基部の保護基を除去した。得られた粗成績体を逆相簡易カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ＠Ｐｌｕｓ　Ｃ１８　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ，　Ｗａｔｅｒｓ社）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣ精製を行った。
　合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物９から１３）の精製および純度確認は逆相ＨＰＬＣにより以下の条件で行った。
移動相
　Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０
　Ｂ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：アセトニトリル＝１：１，ｐＨ７．０
グラジエント：
　分析５－９％ＭｅＣＮ（３０分）、分取５－９％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物９
　分析４－８％ＭｅＣＮ（３０分）、分取４－８％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１０
　分析３－７％ＭｅＣＮ（３０分）、分取３－７％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１１
　分析４－８％ＭｅＣＮ（３０分）、分取４－８％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１２
　分析７－１１％ＭｅＣＮ（３０分）、分取７－１１％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１３
使用カラム：
　分析　Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅＴＭＯＳＴ　Ｃ１８　２．５　μｍ（４．６×５０ｍｍ）
　分取　Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ　ＯＳＴ　Ｃ１８　２．５　μｍ（１０×５０ｍｍ）
流速：
　分析　１．０ｍＬ／分
　分取　４．５ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
　合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物９から１３）の分子量は、飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）により決定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１から明らかなように、飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS）による分子量測定の結果が理論値とよい一致を示したことから、それぞれ目的とするオリゴヌクレオチドが得られたことを確認した。
　比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物１４：以下の表２、配列番号１）、およびウレア架橋型人工核酸２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ（５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジン（非特許文献６に従って合成）を含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物１５から１８：以下の表３）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し、精製した。
　（実施例３）融解温度（Ｔｍ）の測定
　実施例２で得られた各種オリゴヌクレオチド（化合物８を用いて製造したオリゴヌクレオチド類縁体の化合物９から１２、天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの化合物１４、およびウレア架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体の化合物１５から１８）と標的鎖（５’－ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ－３’：配列番号２）とをアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、二重鎖の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。
　具体的には、ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、オリゴヌクレオチド４μＭ、および標的鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ－１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに５分間５℃に保った後、測定を開始した。９０℃まで毎分０．５℃の割合で温度を緩やかに上昇させ、０．１℃上昇する毎に２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果をＴｍ値および修飾単位あたりのＴｍ値差にて表２に示す。Ｔｍ値が高いほど、二重鎖形成能が高いことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表２から明らかなように、架橋構造およびカチオンの効果により二重鎖形成能が向上するという予想に反して、二重鎖形成能は天然のＤＮＡとほぼ同程度であった。また、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
　架橋部のカチオンによる効果を精査するべく、よりカチオンの効果が表れやすい低塩濃度条件（ＮａＣｌを含まないこと以外は上記サンプル溶液と同じ組成の溶液を使用）でのＴｍ測定を行った。比較対象として、ウレア架橋型人工核酸（化合物１５から１８）のＴｍ値も測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表３から明らかなように、ＲＮＡを標的とする場合のＴｍ値にはあまり差がみられなかった。一方、ＤＮＡを標的とする場合、ウレア架橋型人工核酸の場合は人工核酸の導入数を増やすにつれてＴｍ値が低下するのに対して、グアニジン架橋型人工核酸を導入した場合にはそのようなＴｍ値の低下が見られなかった。このことから、架橋部のカチオンはＤＮＡとの二重鎖の安定化に影響を与えることが示唆された。
　（実施例４）ヌクレオシド類縁体（化合物２８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　（１）化合物２０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　化合物１９をShrestha, A.R.ら、J. Org. Chem.、2011年、第76巻, p.9891-9899に記載の化合物７の調製手順に従って入手した。窒素気流下、化合物１９（２．８６ｇ，４．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）に、氷冷下にてピリジン（１．６５ｍＬ，２０．５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．３７ｍＬ，８．２０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷条件で１時間撹拌した。水を加えて酸を潰した後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体を黄色油状物質として得、フラッシュクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→２：１）により簡易精製し、粗成績体を淡黄色アモルファスとして得た。続いて、窒素気流下、粗成績体（１．９６ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）にアジ化ナトリウム（０．２３ｇ，３．６０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。４８時間後、溶媒留去した後水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により精製し、化合物２０（１．７１ｇ，６６％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ａ）。
　得られた化合物２０の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ : 0.99 (9H, s), 1.58 (3H, s), 3.63, 3.69 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.91 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 7.2 Hz, 5.4 Hz), 4.23 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.47, 4.53 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.57, 4.75 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.03 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.23-7.60 (20H, m), 8.70 (1H,s)。
　（２）化合物２４および２５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　得られた化合物２０（６２２ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液８ｍＬに、窒素気流下、塩化ニッケル（１１ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下にて水素化ホウ素ナトリウム（６４ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）を加え室温にて１０分撹拌した。反応液をろ過して溶媒留去した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。次いで、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒留去し粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トリエチルアミン＝２００：１）により精製し、化合物２１（４５６ｍｇ，７６％）を白色固体として得た（上記工程ｂ）。
　得られた化合物２１の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CDCl3) δ : 1.04 (9H, s), 1.63 (3H, d, J = 1.5 Hz), 3.59, 3.66 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.67 (1H, dd, J = 5.5 Hz, 9.0 Hz), 3.79, 3.99 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.06 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.55, 4.58 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.67, 4.76 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.81 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.19-7.61 (21H, m), 7.95 (1H, s)。
　得られた化合物２１（５０ｍｇ，０．０７１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１ｍＬに、窒素気流下、Ｎ，Ｎ’－ジ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）チオウレア（３０．４ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（９μＬ，０．０３５ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加え室温にて３時間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒留去し粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）により精製し、化合物２２（５８ｍｇ，８６％）を白色固体として得た（上記工程ｃ）。
　得られた化合物２２の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CDCl3) δ : 1.04
(9H, s), 1.42 (9H, s), 1.46(9H, s), 1.72 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.57, 3.96 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.73, 3.78 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.25 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.57, 4.65 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.59, 4.61 (2H, AB, J = 9.0 Hz), 4.89 (1H, q, J = 8.0 Hz), 5.98 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.20-7.69 (22H, m), 8.93 (1H, d, J = 8.0 Hz), 11.34 (1H,s)。
　得られた化合物２２（１０６ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液１ｍＬに、窒素気流下、フッ化テトラｎ－ブチルアンモニウム（０．１４ｍＬ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え室温にて４．５時間撹拌した。次いで、溶媒留去し得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２３（８０ｍｇ，定量）を白色固体として得た（上記工程ｄ）。
　得られた化合物２３の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CDCl3) δ : 1.42 (9H, s), 1.50 (9H, s), 1.75 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.05 (1H, dd, J = 3.5 Hz, 9.0 Hz), 3.57, 3.62 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.68 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 9.0 Hz), 3.84 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 3.5 Hz), 4.35 (1H, d, J = 7.5 Hz), 4.51, 4.72 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.58, 4.62 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.87 (1H, q, J = 7.5 Hz), 6.07 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.26-7.52 (11H, m), 7.88 (1H, s), 9.05 (1H, d, J = 7.5 Hz), 11.39 (1H,s)。
　得られた化合物２３（８５０ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１２ｍＬに、窒素気流下、ピリジン（０．２９ｍＬ，３．５９ｍｍｏｌ）を加え、０℃にてトリフロオロメタンスルホン酸無水物（０．３ｍＬ，１．７８ｍｍｏｌ）を加えて０℃にて３時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。窒素気流下、粗成績体のジクロロメタン溶液８ｍＬにトリエチルアミン２ｍＬを加えて、室温にて２７時間撹拌した。次いで、溶媒留去し得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２４（６４４ｍｇ，７７％）を黄白色アモルファスとして得た（上記工程ｅ）。
　化合物２４（５７ｍｇ，０．０８２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液１ｍＬに、３５％塩酸（０．３ｍＬ）を加え、室温にて４０分間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重層水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去することで化合物２５（４４ｍｇ，定量）を白色固体として得た（上記工程ｅ’）。
　得られた化合物２５の物性データは、以下のとおりであった：H-NMR (CD3OD) δ : 1.54 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.53, 3.70 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.90, 3.97 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.16 (1H, s), 4.60, 4.66 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.62 (2H, s), 4.78 (1H, s), 5.66 (1H, s), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.50 (1H, d, J = 1.0 Hz)。
　（２）化合物２８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　上記で得られた化合物２４（６４４ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液１０ｍＬに、水素気流下、水酸化パラジウムカーボン（９００ｍｇ）を加え、室温にて１４時間撹拌した。次いで、反応液を濾過して得られたろ液の溶媒を留去することで、化合物２６の粗成績体を得た（上記工程ｆ）。
　化合物２６の粗成績体（３５４ｍｇ）のピリジン溶液７ｍＬに、窒素気流下、０℃にて４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（４６９ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１２時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２７（４４２ｍｇ，５８％）を白色固体として得た（上記工程ｇ）。
　得られた化合物２７の物性データは、以下のとおりであった：1H-NMR (CD3OD) δ : 1.42 (18H, s), 1.49 (3H, s), 3.39-3.55 (4H, m), 3.73 (6H, s), 4.39 (1H, s), 4.57 (1H, s), 5.51 (1H, s), 6.83 (4H, d, J = 9.0 Hz), 7.17-7.44 (m, 9H), 7.77 (1H, s)。
　得られた化合物２７（１４１ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液２ｍＬに、窒素気流下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（３９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）と２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７３μＬ，０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に水を加えてクエンチした後酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去して得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）により精製し、化合物２８（１４８ｍｇ，８６％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ｈ）。
　得られた化合物２８の物性データは、以下のとおりであった：31P-NMR (CDCl3) δ : 148.78, 149.48, 149.78。
　（実施例５）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
　実施例４で得られた化合物２８を用いて、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２９から３２：以下の表４に示す）を、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド自動合成機ｎＳ－８（株式会社ジーンデザイン製）により０．２μｍｏｌスケールのＣＰＧ担体を用いて合成した。化合物２８のアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）のカップリング時間は８分間で行い、それ以外は天然のＤＮＡ合成と同条件にて行った。活性化剤は５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾール（０．２５Ｍ）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドは２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した。得られた化合物２９から３１の粗成績体については、逆相簡易カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ＠Ｐｌｕｓ　Ｃ１８　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ，　Ｗａｔｅｒｓ社）により精製し、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５０％で２４時間処理した後に逆相ＨＰＬＣ精製を行った。得られた化合物３２の粗成績体については、逆相簡易カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ＠Ｐｌｕｓ　Ｃ１８　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ，　Ｗａｔｅｒｓ社）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣ精製を行った。
　合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２９から３２）の精製および純度確認は実施例２と同様に行った。
　合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２９から３２）の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳ測定により決定した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３３：以下の表５に示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。
　（実施例６）融解温度（Ｔｍ）の測定
　実施例５で得られた各種オリゴヌクレオチド（化合物２８を用いて製造したオリゴヌクレオチド類縁体の化合物２９から３１、および天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの化合物３３）と以下の表５および６に記載の標的鎖（１０ｍｅｒのポリＡおよび配列番号３～５）とをアニーリング処理して複合体を形成させた後、複合体の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。
　具体的には、ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、オリゴヌクレオチド４μＭ、および標的鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ－１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を０℃まで徐々に冷却し、さらに５分間０℃に保った後、測定を開始した。８０℃まで毎分０．５℃の割合で温度を緩やかに上昇させ、０．１℃上昇する毎に２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。表５は、種々の数のグアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体のポリＡに対するハイブリッド形成能をＴｍ値および修飾単位あたりのＴｍ値差にて表す。表６は、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体および天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの種々の標的鎖に対するハイブリッド形成能をＴｍ値にて表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　表５から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドはＲＮＡに対する複合体形成能のみならずＤＮＡに対する複合体形成能も優れていた。また、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のグアニジン架橋型人工核酸は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。
　表６から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドはミスマッチ認識能も有していた。グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドは、天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドと比べても、望ましい標的鎖（すなわち、ポリＡ）への複合体形成能が優れていた。このため、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドは、配列非特異的に複合体を形成するおそれがないことがわかった。
　（実施例７）オリゴヌクレオチド類縁体の二重鎖形成能の評価
　実施例４で得られた化合物２８を用いて、種々の塩基からなる９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物３４：以下の表７に示す）を、合成したオリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した後に、５５℃にて１２時間かけて塩基部の保護基を除去した以外は、実施例５と同様にして合成および精製した。比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３５：以下の表７に示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。
　化合物３４および３５のオリゴヌクレオチドについて、各オリゴヌクレオチドを標的鎖５’-ＧＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’とアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、二重鎖の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。標的鎖へのアニーリングおよびＴｍ値の測定を、実施例６と同様に行った。Ｔｍ値の結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表７から明らかなように、種々の塩基からなる配列に設計した場合も、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物３４）は、ポリＴ配列の場合と同様に、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に関し、二重鎖形成能が優れていた。
　（実施例８）オリゴヌクレオチド類縁体の三重鎖形成能の評価
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　実施例４で得られた化合物２８を用いて、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物３６：上記「Ｘ」がグアニジン架橋型人工核酸であり、下線を付与したＣは、２’－デオキシ５－メチルシチジンである。以下の表８にも示す）を、合成したオリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した後に、５５℃にて１２時間かけて塩基部の保護基を除去した以外は、実施例５と同様にして合成および精製した。比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３７：上記「Ｘ」が天然型のヌクレオシドであり、下線を付与したＣは、２’－デオキシ５－メチルシチジンである。以下の表８にも示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。
　標的鎖５’－ＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＹＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣ－３’（配列番号６）およびその相補鎖の５’－ＧＣＧＴＣＴＣＴＣＴＺＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣ－３’（配列番号７）を含む標的ＤＮＡ二重鎖は以下のように調製した。５’－ＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＹＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣ－「Ｃ１８－スペーサー」－ＧＣＧＴＣＴＣＴＣＴＺＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣ－３’（配列番号６のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端と配列番号７のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端とをリンカーとして「Ｃ１８スペーサー」にて連結した鎖）を、リンカー部の合成に１８－Ｏ－ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコールおよび１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト（Glen Research社製）を用いたこと以外は標準的なホスホロアミダイトプロトコルにて合成し精製し、目的の標的ＤＮＡ二重鎖を得た。ここで、ＹおよびＺは塩基対を形成し得る組合せであり、以下のとおりである：ＹがＡであり、かつＺがＴである；ＹがＴであり、かつＺがＡである；ＹがＧであり、かつＺがＣである；またはＹがＣであり、かつＺがＧである。
　化合物３６および３７のオリゴヌクレオチドについて、各オリゴヌクレオチドを標的二重鎖とアニーリング処理して三重鎖を形成させた後、三重鎖の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。
　具体的には、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１０ｍＭ、ＫＣｌ １００ｍＭ、およびＭｇＣｌ２ ５０ｍＭ、オリゴヌクレオチド１．８９μＭ、および標的二重鎖１．８９μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ－１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間５℃に保った後、測定を開始した。９０℃まで毎分０．５℃の割合で温度を緩やかに上昇させ、０．１℃上昇する毎に２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。Ｔｍ値の結果を表８に示す。Ｔｍ値が高いほど、三重鎖形成能が高い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　表８から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物３６）は、望ましい標的二重鎖（ＹがＡであり、かつＺがＴである）に対する三重鎖形成能が優れていた。
　（実施例９）オリゴヌクレオチド類縁体のヌクレアーゼ耐性の評価
　５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）－３’の配列のＸがそれぞれ以下に示す通りである、１０ｍｅｒの各種オリゴヌクレオチドを調製した。すなわち、以下の各種オリゴヌクレオチドを調製した：実施例１のヌクレオシド類縁体（化合物８）を用いて製造した、Ｘがグアニジン架橋型人工核酸であるオリゴヌクレオチド類縁体（すなわち「化合物１３」）；実施例４のヌクレオシド類縁体（化合物２８）を用いて製造した、Ｘがグアニジン架橋型人工核酸であるオリゴヌクレオチド類縁体（すなわち「化合物３２」）；ＸがＬＮＡ－Ｔ（チミンＬＮＡ）であるオリゴヌクレオチド（株式会社ジーンデザイン製：化合物３８）；ＸがＤＮＡ－Ｔ（チミンＤＮＡ）であるオリゴヌクレオチド（１０ｍｅｒのオリゴｄＴ、すなわち「化合物３３」）；およびＸにＳ－オリゴ（酸化剤の代わりに硫化剤としてＤ－１，４－ジチオトレイトール（ＤＤＴＴ、ChemGene社製）を用いたこと以外は標準的なホスホロチオアート合成のプロトコルに従い、合成および精製した）を用いて標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って合成し精製したオリゴヌクレオチド（化合物３９：陽性コントロールとして使用）。
　ヌクレアーゼ耐性の評価は、以下のように行った。各種オリゴヌクレオチド（７５０ｐｍｏｌ）のいずれかを含む緩衝液１００μＬ［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２］に、３’－エキソヌクレアーゼ（Crotalus admanteus venom phosphodiesterase：ＣＡＶＰ、Pharmacia Biotech社製）０．１７５μgを加えて混合し、３７℃でインキュベートし、反応開始後一定の時間ごとに反応液の一部を取り出した。取り出した反応液を９０℃にて２分間加熱して酵素を失活させ、オリゴヌクレオチドの残量をＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりである：グラジエント６－１２％ＭｅＣＮ（１５分）；流速０．８ｍＬ／分；カラム温度５０℃。オリゴヌクレオチドの残量を未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）として算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図１に示す。
　図１は、５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）－３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’－エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。図１の縦軸は、ヌクレアーゼ処理に対して未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）を示し、横軸は、ヌクレアーゼ処理時間（分）を示す。図１の記号は以下を表す：四角、天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３３）；丸、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３８）；三角、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物３２）；×、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物１３）；および逆三角、Ｓ－オリゴを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３９）。
　図１から明らかなように、化合物１３は、ヌクレアーゼ処理の２０分後でも５０％以上が未反応のまま残存しており、分解されにくかった。化合物３２は、化合物１３に比べると未反応のオリゴヌクレオチドの残存割合が低かった。しかし、化合物３２は、ヌクレアーゼ処理の１０分後にはほぼ分解される化合物３８（ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド）に比べると、分解されにくかった。
　（実施例１０）オリゴヌクレオチド類縁体のヌクレアーゼ耐性の評価
　５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）－３’の配列のＸがグアニジン架橋型人工核酸であるオリゴヌクレオチド類縁体である、９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（化合物４０）を、以下のように調製した。
　化合物３２（3330pmol）を含む緩衝液４０μＬ［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２］に３’－エキソヌクレアーゼ（Crotalus admanteus venom phosphodiesterase：ＣＡＶＰ、Pharmacia Biotech社製）（0.2μg）を加えて混合し、３７℃にて３時間インキュベートした。次いで、９０℃にて２分間加熱して酵素を失活させた後、ＨＰＬＣにて精製を行った。得られたオリゴヌクレオチドについて、飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS）による分子量測定値（２７４３．０７）が理論値（２７４３．８３）とよい一致を示したことから、目的とするオリゴヌクレオチドが得られたことを確認した。
　５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）－３’の配列のＸがＬＮＡであるオリゴヌクレオチド（株式会社ジーンデザイン製：化合物４１）を比較のために用いた。
　ヌクレアーゼ耐性の評価は、各種オリゴヌクレオチド（７５０ｐｍｏｌ）のいずれかを含む緩衝液１００μＬに３’－エキソヌクレアーゼ０．０８μgを添加した以外は、実施例９と同様に行った。結果を図２に示す。
　図２は、５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）－３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’－エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。図２の縦軸は、ヌクレアーゼ処理に対して未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）を示し、横軸は、ヌクレアーゼ処理時間（分）を示す。図２の記号は以下を表す：丸、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（化合物４１）；および三角、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物４０）。
　図２から明らかなように、化合物４０（グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド）は、ヌクレアーゼ処理の２０分後でも８０％が未反応のまま残存していた。これに対し、化合物４１（ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド）は、ヌクレアーゼ処理の２０分後には未反応のオリゴヌクレオチドはほとんど残っていなかった。このように、実施例４のグアニジン架橋型ヌクレオシド類縁体（化合物２８）のような５員環グアニジン架橋型人工核酸を３’末端に含有するオリゴヌクレオチドは、極めて高いヌクレアーゼ耐性能を示した。
　（実施例１１）オリゴヌクレオチド類縁体の融解温度（Ｔｍ）の測定
　以下の表９に記載する化合物３３（１０ｍｅｒのオリゴｄＴからなる天然型オリゴヌクレオチド）；化合物２９～３１、４２および４３（化合物２８のグアニジン架橋型核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体）；ならびに化合物４４～４８（ＬＮＡ－Ｔを含有するオリゴヌクレオチド）について、１０ｍｅｒのポリＡにアニーリング処理して複合体を形成させた後、複合体の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。
　化合物２９～３１、４２および４３は、逆相簡易カラムによる精製後のＴＦＡ処理にＴＦＡ５０％に代えてＴＦＡ７５％を用いたこと以外は実施例５に記載のように合成および精製した。化合物４４～４８は、株式会社ジーンデザイン製である。
　複合体形成およびＴｍ値の測定については、ＫＣｌ ２００ｍＭ、カコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＭ、オリゴヌクレオチド４μＭ、および標的鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を用いた以外は、実施例６と同様に行った。結果を表９に示す。表９は、天然型オリゴヌクレオチドおよび種々の数のＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドと比較して、種々の数のグアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体のポリＡに対するハイブリッド形成能をＴｍ値および修飾単位あたりのＴｍ値差にて表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　表９から明らかなように、ＲＮＡを標的とした場合、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体は、天然型オリゴヌクレオチドと比較して十分に高い結合親和性を示した。さらに、人工核酸の導入数が３残基以下の場合は、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体は、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドと同程度のＴｍ値であったが、グアニジン架橋型人工核酸を５残基導入したオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを５残基導入した場合よりも高い結合親和性を示すことが明らかとなった。１残基当たりのＴｍ値の上昇を比較すると、ＬＮＡを導入した場合は、導入数によらずＴｍ値の上昇は６℃から７℃である一方で、グアニジン架橋型人工核酸を導入した場合は、導入数を増やすにつれて１残基当たりのＴｍ値の上昇が大きくなることが明らかとなった。このことから、架橋構造による結合親和性への影響は相加的であるのに対し、グアニジン由来のカチオンによる結合親和性への影響は相乗的であることが示唆された。また、ＤＮＡを標的とした場合、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは極めて高い結合親和性を示し、天然型オリゴヌクレオチドやＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドよりもはるかに高い結合親和性を有することが明らかとなった。
　（実施例１２）オリゴヌクレオチド類縁体の標的塩基認識能の評価
　表９のグアニジン架橋型人工核酸が５残基導入されているオリゴヌクレオチド類縁体（化合物４３）およびＬＮＡが５残基導入されているオリゴヌクレオチド（化合物４８）について、完全相補配列を有するＤＮＡ標的鎖（フルマッチ型）および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡ標的鎖（ミスマッチ型）のそれぞれに対する結合親和性を評価した。標的鎖の配列は、フルマッチ型：５’－（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）－３’、ミスマッチ型：５’－（ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡ）－３’である。結合親和性は、実施例１１と同様に、アニーリング処理して複合体を形成させた後、複合体の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより評価した。
　結果を図３に示す。図３は、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体およびＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドの、完全相補配列を有するＤＮＡ標的鎖（フルマッチ型）および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡ標的鎖（ミスマッチ型）のそれぞれに対するＴｍ曲線を示す。図３の縦軸は、２６０ｎｍの吸光度を表し、横軸は、温度（℃）を表す。グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物４３）のミスマッチ型（細い一重線）およびフルマッチ型（細い一重破線）ならびにＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（化合物４８）のミスマッチ型（太い一重線）およびフルマッチ型（太い一重破線）に対するそれぞれの結果を示す。
　図３から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体（化合物４３）は、ミスマッチ型標的鎖に対するＴｍ値はフルマッチ型標的鎖に対するＴｍ値に比較して十分低く、そのＴｍ値の低下は、ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（化合物４８）の場合と同程度であった。このことから、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは、標的塩基認識能を損なうことなく、標的鎖との非常に高い結合親和性を有することが明らかとなった。
（実施例１３）グアニジン架橋型人工核酸（以下、ＧｕＮＡと称することがある）の細胞内動態に関する評価
（１）蛍光標識ＧｕＮＡ修飾オリゴヌクレオチド（Ｆ－ＧｕＮＡ－ＯＤＮ）の合成と同定
　まず、実施例４で得られた化合物２８、天然型ヌクレオシド、および後述の蛍光修飾のためのアミダイト体を用いて、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド自動合成機ｎＳ－８（株式会社ジーンデザイン製）により、オリゴヌクレオチド類縁体を合成した。合成したオリゴヌクレオチド類縁体は表１０に示す化合物５３から５７の前駆体（化合物４９）になる化合物である。この前駆体（化合物４９）の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　オリゴヌクレオチドの自動合成において、チミジンアミダイト体（型番：Ｔ１１１０８１）とチミジンＣＰＧ固相担体（型番：Ｔ３６１０１０）、ＣａｐＡ（型番：Ｌ８４００２０－０６）、ＣａｐＢ（型番：Ｌ８５００２０－０６）、酸化剤（型番：Ｌ８６００２０－０６）は全てＳＡＦＣ（登録商標）　Ｐｒｏｌｉｇｏ（登録商標）　Ｒｅａｇｅｎｔｓより入手した。アセトニトリル（型番：０１８－１４４５１）とデブロッキング溶液（型番：０４２－２８９２１）は和光純薬工業株式会社より購入した。活性化剤は０．２５Ｍ　５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール／ドライアセトニトリル（製造元コード：３０－３１４０－５２，Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。化合物２８のアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）のカップリング時間は２０分間で行い、また、化合物２８を３塩基連続してオリゴヌクレオチドに導入する場合、３塩基目のみダブルカップリングを行った。それ以外は天然のＤＮＡ合成と同条件にて行った。
　なお、蛍光修飾については、蛍光剤のアミダイト体を用いてオリゴヌクレオチドに導入した場合、後の７５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理時に蛍光剤が加水分解するおそれがある。そこで、まずは、構造式を以下に示すアミダイト体 Ｔｈｉｏｌ－Ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　Ｓ－Ｓ　（製造元コード：１０－１９３６－９０，　Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＤＮＡ自動合成機によりオリゴヌクレオチドの５’末端側に付加して、保護基ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）を脱保護せずに終了することにより、蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３～５７）の前駆体（化合物４９）を得た。なお、アミダイト体 Ｔｈｉｏｌ－Ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　Ｓ－Ｓのジスルフィド結合は７５％ＴＦＡに対し、十分な耐性があることが確認されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　比較のために、化合物２８に代えてウレア架橋型人工核酸２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ（５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジンを含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物５８から６１：以下の表１０に示す）（株式会社ジーンデザイン製）を購入して用いた。このオリゴヌクレオチド類縁体の前駆体（化合物５０）の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　得られた前駆体（化合物４９）を２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出し、ＮＡＰ－１０カラム（コード番号：１７－０８５４－０１，　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてアンモニアを除去し、ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥した。ＲＰ－ＨＰＬＣはＳｈｉｍａｄｚｕ　ＬＣ－１０ＡＴＶＰ，　ＳｈｉｍａｄｚｕＳＰＤ－１０ＡＶＰ,　ＳｈｉｍａｄｚｕＣＴＯ－１０ＶＰを用い、以下に示す条件で行った。
移動相
　Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０
　Ｂ液 ８０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
グラジエント：
　Ｂ液濃度: ０－１００％（８０分）
使用カラム:
Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ　ＯＳＴ　Ｃ１８　２．５μｍ（１０×５０ｍｍ　製品番号：１８６００３９５４）;
流速:
３．０ｍＬ／分
カラム温度:５０℃
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
　次に、７５％トリフルオロ酢酸を添加し、６時間室温にて処理することにより、上記のように精製された前駆体（化合物４９）からＢｏｃ基とＤＭＴｒ基の脱保護を行った後、ＮＡＰ－１０カラムでトリフルオロ酢酸を除去し、凍結乾燥して脱保護された前駆体（化合物５０）を得た。
　上記の脱保護された前駆体（化合物５０）について、Ｔｈｉｏｌ－Ｍｏｄｉｆｅｒ　Ｃ６　Ｓ－Ｓのプロトコルに従い、１００ｍＭ　ＤＴＴ／ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して２時間室温にてジスルフィド結合を還元し、ＳＨ基を生成した。得られた還元後の前駆体（化合物５１）をＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｂ液: ５０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液; グラジエント: Ｂ液濃度０－５０％／２５分) にて精製し、分取した。得られた還元後の前駆体（化合物５１）の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　上記、還元によりＳＨ基が生成され、精製された前駆体（化合物５１）に、構造式を以下に示すＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　Ｃ５　マレイミド（製品コード：Ａ－１０２５４，　Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を前駆体（化合物５１）に対して１０等量添加し、室温にて一晩反応させてＳＨ基とマレイミドを結合した（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３６，　２７６４－２７７６，　２００８)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　その後、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｂ液:５０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液; グラジエント: Ｂ液濃度０－５０％／２５分）にて精製し、蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５２：化合物５３～６１）を得た。なお、このうち、化合物５４～５７が蛍光標識ＧｕＮＡ修飾オリゴヌクレオチド（Ｆ－ＧｕＮＡ－ＯＤＮ）である。得られた蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５２）の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　合成した蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３～６１）の精製および純度確認は実施例２と同様に行った。
　合成した蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３～６１）の質量分析は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＳｐｉｒａｌＴＯＦ　ＪＭＳ－Ｓ３０００，　ＪＥＯＬ）により行った。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
（２）蛍光標識ＧｕＮＡ修飾オリゴヌクレオチドＦ－ＧｕＮＡ－ＯＤＮのヒト肝癌細胞（ＨｕＨ－７）への導入とその細胞内動態の観察
　まず、前準備として、細胞観察用のガラスボトムディッシュ（品種コード：３９７０－０３５，　Ｉｗａｋｉ）のガラス部分に１００μｇ／ｍＬコラーゲン／塩酸（ｐＨ　３．０）（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｃ，　新田ゼラチン株式会社製）を１ｍＬ添加することにより、コラーゲンコーティングを行った。
　これを室温にて３０分静置後、コラーゲンを除去し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄後、室温にて１時間乾燥した。次に、４．５×１０５個のＨｕＨ－７細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入した（細胞番号：ＪＣＲＢ０４０３））を播種し、フェノールレッド不含培地１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（製品番号：０８４９０－０５，　ナカライテスク株式会社製）下で一晩培養を行い（５％ＣＯ２）、その後、上記（１）で得られた蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３～６１）を、それぞれ５００ｎＭの濃度で添加した。
　蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３～６１）の添加後、さらに１２時間培養を続け、その後、培養されたＨｕＨ－７細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ，　製品番号：１４０２５－０９２，Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で１回洗浄し、プロトコルに従ってＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（製品番号：Ｈ３５７０，Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）　Ｒｅｄ　ＤＮＤ－９９（カタログ番号：Ｌ－７５２８，Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて核とリソソームを染色した。その後、ハンクス平衡塩類溶液を２ｍＬ添加し、落射型蛍光顕微鏡（ＢＺ－９０００，株式会社キーエンス製）を用いて蛍光像を取得した。なお、対物レンズは４０×位相差レンズ （Ｓ　Ｐｌａｎ　Ｆｌｕｏｒ，　株式会社ニコン製）を用いた。
　各蛍光剤の検出フィルターセットと露光時間を以下に示す。
Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８: Ｅｘ　４７０／４０ｎｍ，　ＤＭ　４９５ｎｍ，　ＢＡ　５３５／５０ｎｍ　（ＧＦＰ－Ｂ，　株式会社キーエンス製），　５秒
Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２：　Ｅｘ　３６０／４０ｎｍ，　ＤＭ　４００ｎｍ，　ＢＡ　４６０／５０ｎｍ　（ＤＡＰＩ－Ｂ、株式会社キーエンス製），　２秒
ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）　Ｒｅｄ　ＤＮＤ－９９：　Ｅｘ　５４０／２５　ｎｍ，　ＤＭ　５６５　ｎｍ，　ＢＡ　６０５／５５　ｎｍ　（ＴＲＩＴＣ，　株式会社キーエンス製），　１．２秒
　蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３～６１）をＨｕＨ－７細胞に導入した結果、化合物２８を６残基導入した化合物５７と２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡを６残基導入した化合物６１の２種類のオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞内において特に強い蛍光発光が観察された。その他のオリゴヌクレオチドについては、これらと比較すれば蛍光発光が弱かった。化合物５７（Ａ～Ｄ）および化合物６１（Ｅ～Ｈ）のＨｕＨ－７細胞内の動態を示す顕微鏡写真を図４に示す。Ａ，Ｅは位相差像; Ｂ，ＦはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　(オリゴヌクレオチド)の蛍光像; Ｃ，ＧはＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２ (核) の蛍光像; Ｄ，ＨはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（リソソーム）の蛍光像である（スケールバー５０μｍ）。化合物２８を６残基導入した化合物５７のオリゴヌクレオチドを用いた場合は強い蛍光発光が確認された(図４Ｂ)。これに対し、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡを６残基導入した化合物６１のオリゴヌクレオチドを用いた場合、ある程度の蛍光発光を示したものの、化合物２８を用いた化合物５７より蛍光発光が弱かった(図４Ｆ)。これは、化合物５７では、化合物２８を６残基導入することにより、細胞への導入効率が高められ、さらにオリゴヌクレオチド全体の荷電が変化して細胞表面への吸着効率が高められている結果であると考えられる。これに対し、化合物６１では２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡを６残基導入することにより、細胞への導入効率が高められているものの、荷電が変化していないため細胞表面への吸着効率が高められておらず、その分、化合物５７と比較すれば蛍光発光が弱かったと考えられる。
　次に、化合物５７のＨｕＨ－７細胞内の動態を示す顕微鏡写真であって、図４Ａ～Ｄについて図４Ｂの矢印で示す領域について拡大した写真（Ａ～Ｄ）を図５に示す。得られた蛍光発光の細胞内での局在を詳細に観察すると、添加したオリゴヌクレオチドは核内には存在せず、細胞質内の小胞内に多く蓄積しており、リソソーム内にも多数存在していることも明らかとなった。
　以上のことから、負の電荷を帯びるオリゴヌクレオチドに対し、正の電荷を帯びるグアニジノ基を付与させることによりオリゴヌクレオチド全体の電荷を変化させることは、オリゴヌクレオチド自体の細胞導入効率を向上させる有用な手法であることが証明された。
　なお、従来はドラッグデリバリーシステムを用いずに、オリゴヌクレオチドを細胞内に導入することは、酵素耐性や細胞透過性の面から困難とされていた。これらを改善するための手法としては、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格にホスホロチオエート修飾を施す手法が汎用されている。しかしながら、ホスホロチオエート修飾においては、リン原子上に生じるキラリティの問題から、生産面、安全面、薬効低下が懸念材料となっていた。今回、ホスホロチオエート修飾を施すことなく細胞内透過性を高められたことから、本発明のグアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドがこれらの欠点を克服し、核酸の医薬品化に貢献できることがわかる。
　本発明によれば、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子を提供することができる。このような核酸分子は、疾病の新たな治療法や予防法として期待されているアンチセンス法、アンチジーン法、アプタマーを用いる方法、ｓｉＲＮＡを用いる方法などに用いる核酸医薬の素材として大いに貢献することができる。

Claims (6)

  1. 　以下の式ＩまたはＩＩで表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　（式ＩまたはＩＩ中、
    　Ｂ１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒ１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を表し；そして
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）。
  2. 　前記式ＩまたはＩＩにおいて、前記Ｂ１が、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
  3. 　前記式ＩまたはＩＩにおいて、前記Ｂ１が、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
  4. 　以下の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（式Ｉ’またはＩＩ’中、
    　Ｂ１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表し；そして
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）。
  5. 　前記式Ｉ’またはＩＩ’において、前記Ｂ１が、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  6. 　前記式Ｉ’またはＩＩ’において、前記Ｂ１が、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
PCT/JP2013/075370 2012-09-21 2013-09-19 グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド WO2014046212A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13838365.8A EP2899197B1 (en) 2012-09-21 2013-09-19 Oligonucleotide and artificial nucleoside having guanidine bridge
IN2238DEN2015 IN2015DN02238A (ja) 2012-09-21 2013-09-19
CN201380057335.0A CN104768964B (zh) 2012-09-21 2013-09-19 具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸
CA2885719A CA2885719C (en) 2012-09-21 2013-09-19 Oligonucleotide and artificial nucleoside having guanidine bridge
US14/428,646 US10377789B2 (en) 2012-09-21 2013-09-19 Oligonucleotide and artificial nucleoside having guanidine bridge
ES13838365.8T ES2622716T3 (es) 2012-09-21 2013-09-19 Oligonucleótido y nucleósido artificial en puente con guanidina
KR1020157010144A KR101707437B1 (ko) 2012-09-21 2013-09-19 구아니딘 가교를 갖는 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드
JP2014536921A JP6048982B2 (ja) 2012-09-21 2013-09-19 グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012208906 2012-09-21
JP2012-208906 2012-09-21
JP2013022360 2013-02-07
JP2013-022360 2013-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014046212A1 true WO2014046212A1 (ja) 2014-03-27

Family

ID=50341516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/075370 WO2014046212A1 (ja) 2012-09-21 2013-09-19 グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10377789B2 (ja)
EP (1) EP2899197B1 (ja)
JP (1) JP6048982B2 (ja)
KR (1) KR101707437B1 (ja)
CN (1) CN104768964B (ja)
CA (1) CA2885719C (ja)
ES (1) ES2622716T3 (ja)
IN (1) IN2015DN02238A (ja)
WO (1) WO2014046212A1 (ja)

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014126229A1 (ja) * 2013-02-18 2014-08-21 塩野義製薬株式会社 含窒素複素環構造を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
WO2017047816A1 (ja) * 2015-09-18 2017-03-23 田辺三菱製薬株式会社 架橋型核酸ＧｕＮＡ、その製造方法および中間体化合物
WO2017119463A1 (ja) * 2016-01-07 2017-07-13 国立大学法人大阪大学 α－シヌクレイン発現抑制剤
WO2018155450A1 (ja) 2017-02-21 2018-08-30 国立大学法人大阪大学 アンチセンスオリゴ核酸
WO2018155451A1 (ja) 2017-02-21 2018-08-30 国立大学法人大阪大学 核酸化合物およびオリゴヌクレオチド
WO2019009298A1 (ja) * 2017-07-05 2019-01-10 国立大学法人大阪大学 α－シヌクレイン発現抑制剤
WO2019045075A1 (ja) 2017-08-31 2019-03-07 田辺三菱製薬株式会社 Ｉｌ－３３アンタゴニストを含む子宮内膜症治療剤
WO2020027227A1 (ja) 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人大阪大学 オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬
WO2020050307A1 (ja) 2018-09-05 2020-03-12 国立大学法人大阪大学 Ａｒｌ４ｃを標的分子とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した核酸医薬
WO2020100826A1 (ja) 2018-11-12 2020-05-22 田辺三菱製薬株式会社 架橋型人工核酸ａｌｎａ
WO2020203880A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 田辺三菱製薬株式会社 Ｄｕｘ４の発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物
WO2021230286A1 (ja) 2020-05-12 2021-11-18 田辺三菱製薬株式会社 Ａｔａｘｉｎ ３発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物
WO2022097727A1 (ja) 2020-11-06 2022-05-12 住友ファーマ株式会社 Ｒｐｓ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤
WO2022181807A1 (ja) 2021-02-25 2022-09-01 国立大学法人大阪大学 ＲＥＳＴ ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド
WO2022250072A1 (ja) * 2021-05-26 2022-12-01 ルクサナバイオテク株式会社 心疾患治療薬
WO2022250155A1 (ja) 2021-05-28 2022-12-01 住友ファーマ株式会社 アンチセンス核酸
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
WO2024101446A1 (ja) * 2022-11-10 2024-05-16 ルクサナバイオテク株式会社 架橋部にグアニジノ構造を有する修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3099778A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Method for preparing oligonucleic acid compound
EP3967328A4 (en) 2019-03-29 2022-12-28 Sysmex Corporation NEW ARTIFICIAL NUCLEIC ACID, PROCESS FOR THEIR PRODUCTION AND ITS USE
BR112021023488A2 (pt) 2019-05-31 2022-01-18 Aligos Therapeutics Inc Oligonucleotídeos de gapmer modificados e métodos de uso
EP3986906A1 (en) * 2019-06-20 2022-04-27 F. Hoffmann-La Roche AG Radiolabeled moem type oligonucleotides and process for their preparation
WO2022065413A1 (ja) 2020-09-25 2022-03-31 株式会社理研ジェネシス 新規人工核酸、その製造方法及び用途
CN113552198B (zh) * 2021-05-31 2024-03-26 武汉维尔博生物科技有限公司 一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法
WO2023093960A1 (en) * 2021-11-26 2023-06-01 Syddansk Universitet Modified peptide-oligonucleotide conjugate
WO2023177808A1 (en) * 2022-03-17 2023-09-21 Aligos Therapeutics, Inc. Modified gapmer oligomers and methods of use thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039352A1 (fr) 1997-03-07 1998-09-11 Takeshi Imanishi Nouveaux analogues de bicyclonucleoside et d'oligonucleotide
WO2003068795A1 (fr) 2002-02-13 2003-08-21 Takeshi Imanishi Analogues de nucleoside et derive d'oligonucleotide comprenant un analogue nucleotidique de ces composes
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
WO2007026824A1 (ja) * 2005-08-31 2007-03-08 Osaka University オリゴヌクレオチド類縁体
WO2011052436A1 (ja) 2009-10-29 2011-05-05 国立大学法人大阪大学 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4500707A (en) * 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) * 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4973679A (en) * 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4668777A (en) * 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US5696253A (en) * 1994-06-30 1997-12-09 The Regents Of The University Of California Polynucleoside chain with 3'→5' guanidyl linkages
JP4151751B2 (ja) * 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US8536323B2 (en) * 2010-04-21 2013-09-17 Pierce Biotechnology, Inc. Modified nucleotides
US9206216B2 (en) * 2010-04-21 2015-12-08 Pierce Biotechnology, Inc. Modified nucleotides methods and kits

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039352A1 (fr) 1997-03-07 1998-09-11 Takeshi Imanishi Nouveaux analogues de bicyclonucleoside et d'oligonucleotide
WO2003068795A1 (fr) 2002-02-13 2003-08-21 Takeshi Imanishi Analogues de nucleoside et derive d'oligonucleotide comprenant un analogue nucleotidique de ces composes
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
WO2007026824A1 (ja) * 2005-08-31 2007-03-08 Osaka University オリゴヌクレオチド類縁体
WO2011052436A1 (ja) 2009-10-29 2011-05-05 国立大学法人大阪大学 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. WAHLESTEDT ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, no. 10, 2000, pages 5633 - 5638
K. MIYASHITA ET AL., CHEM. COMMUN., 2007, pages 3765 - 3767
KAZUYUKI MIYASHITA ET AL.: "N-METHYL SUBSTITUTED 2',4'-BNANC: A HIGHLY NUCLEASE-RESISTANT NUCLEIC ACID ANALOGUE WITH HIGH-AFFINITY RNA SELECTIVE HYBRIDIZATION PUB - CHEMICAL COMMUNICATIONS,", CHEMICAL COMMUNICATIONS, vol. 36, 28 September 2007 (2007-09-28), pages 3765 - 3767, XP055031786 *
M. KUWAHARA ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 36, no. 13, 2008, pages 4257 - 4265
MASARU NISHIDA ET AL.: "- SYNTHESIS, RNA SELECTIVE HYBRIDIZATION AND HIGH NUCLEASE RESISTANCE OF AN OLIGONUCLEOTIDE CONTAINING NOVEL BRIDGED NUCLEIC ACID WITH CYCLIC UREA STRUCTURE", CHEMICAL COMMUNICATIONS, vol. 46, no. 29, 7 August 2010 (2010-08-07), pages 5283 - 5285, XP055082026 *
MASAYASU KUWAHARA ET AL., KAGAKU KOGYO, vol. 63, no. 1, 1 January 2012 (2012-01-01), pages 42 - 48, XP008178644 *
NISHIDA, M. ET AL., CHEM. COMMUN., vol. 46, 2010, pages 5283 - 5285
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 36, 2008, pages 2764 - 2776
S. OBIKA ET AL., BIOORG. MED. CHEM., vol. 9, 2001, pages 1001 - 1011
S.M.A. RAHMAN ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, no. 14, 2008, pages 4886 - 4896
SHRESTHA, A.R. ET AL., J. ORG. CHEM., vol. 76, 2011, pages 9891 - 9899
TAKESHI IMANISHI ET AL.: "SYNTHESES AND PROPERTIES OF NOVEL CONFORMATIONALLY RESTRAINED NUCLEOSIDE ANALOGUES", J. SYNTH. ORG. CHEM., vol. 57, no. 11, November 1999 (1999-11-01), JPN., pages 969 - 980, XP008178664 *
Y. HARI ET AL., BIOORG. MED. CHEM., vol. 14, 2006, pages 1029 - 1038
YUTARO KOTOBIKI ET AL., ANTISENSE DNA/RNA KENKYUKAI IDENSHI DELIVERY KENKYUKAI ANTISENSE IDENSHI DELIVERY SYMPOSIUM 2012 YOSHISHU, 24 September 2012 (2012-09-24), pages 25, XP008178648 *

Cited By (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9315535B2 (en) 2013-02-18 2016-04-19 Shionogi & Co., Ltd. Nucleoside and nucleotide having nitrogen-containing heterocycle structure
WO2014126229A1 (ja) * 2013-02-18 2014-08-21 塩野義製薬株式会社 含窒素複素環構造を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
JP6994197B2 (ja) 2015-09-18 2022-01-14 田辺三菱製薬株式会社 架橋型核酸ＧｕＮＡ、その製造方法および中間体化合物
WO2017047816A1 (ja) * 2015-09-18 2017-03-23 田辺三菱製薬株式会社 架橋型核酸ＧｕＮＡ、その製造方法および中間体化合物
JPWO2017047816A1 (ja) * 2015-09-18 2018-07-05 田辺三菱製薬株式会社 架橋型核酸ＧｕＮＡ、その製造方法および中間体化合物
JP2022033869A (ja) * 2015-09-18 2022-03-02 田辺三菱製薬株式会社 架橋型核酸ＧｕＮＡ、その製造方法および中間体化合物
US10961269B2 (en) 2015-09-18 2021-03-30 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Bridged nucleic acid GuNA, method for producing same, and intermediate compound
EP3974436A1 (en) 2015-09-18 2022-03-30 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Crosslinked nucleic acid guna method for producing same, and intermediate compound
WO2017119463A1 (ja) * 2016-01-07 2017-07-13 国立大学法人大阪大学 α－シヌクレイン発現抑制剤
JPWO2017119463A1 (ja) * 2016-01-07 2018-11-01 国立大学法人大阪大学 α−シヌクレイン発現抑制剤
JP7138349B2 (ja) 2017-02-21 2022-09-16 国立大学法人大阪大学 核酸化合物およびオリゴヌクレオチド
US11905308B2 (en) 2017-02-21 2024-02-20 Osaka University Nucleic acid compound and oligonucleotide
JPWO2018155451A1 (ja) * 2017-02-21 2019-12-26 国立大学法人大阪大学 核酸化合物およびオリゴヌクレオチド
US11286275B2 (en) 2017-02-21 2022-03-29 Osaka University Nucleic acid compound and oligonucleotide
WO2018155451A1 (ja) 2017-02-21 2018-08-30 国立大学法人大阪大学 核酸化合物およびオリゴヌクレオチド
WO2018155450A1 (ja) 2017-02-21 2018-08-30 国立大学法人大阪大学 アンチセンスオリゴ核酸
US11261440B2 (en) 2017-02-21 2022-03-01 Osaka University Antisense oligonucleic acid
WO2019009298A1 (ja) * 2017-07-05 2019-01-10 国立大学法人大阪大学 α－シヌクレイン発現抑制剤
WO2019045075A1 (ja) 2017-08-31 2019-03-07 田辺三菱製薬株式会社 Ｉｌ－３３アンタゴニストを含む子宮内膜症治療剤
JP7473113B2 (ja) 2018-07-31 2024-04-23 国立大学法人大阪大学 オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬
JPWO2020027227A1 (ja) * 2018-07-31 2021-08-10 国立大学法人大阪大学 オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬
WO2020027227A1 (ja) 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人大阪大学 オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬
WO2020050307A1 (ja) 2018-09-05 2020-03-12 国立大学法人大阪大学 Ａｒｌ４ｃを標的分子とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した核酸医薬
JP7356448B2 (ja) 2018-11-12 2023-10-04 田辺三菱製薬株式会社 架橋型人工核酸ａｌｎａ
EP4275689A2 (en) 2018-11-12 2023-11-15 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Crosslinked artificial nucleic acid alna
JPWO2020100826A1 (ja) * 2018-11-12 2021-09-30 田辺三菱製薬株式会社 架橋型人工核酸ａｌｎａ
CN112996522A (zh) * 2018-11-12 2021-06-18 田边三菱制药株式会社 桥连型人工核酸alna
WO2020100826A1 (ja) 2018-11-12 2020-05-22 田辺三菱製薬株式会社 架橋型人工核酸ａｌｎａ
EP4275690A2 (en) 2018-11-12 2023-11-15 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Crosslinked artificial nucleic acid alna
WO2020203880A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 田辺三菱製薬株式会社 Ｄｕｘ４の発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物
WO2021230286A1 (ja) 2020-05-12 2021-11-18 田辺三菱製薬株式会社 Ａｔａｘｉｎ ３発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物
WO2022097727A1 (ja) 2020-11-06 2022-05-12 住友ファーマ株式会社 Ｒｐｓ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤
WO2022181807A1 (ja) 2021-02-25 2022-09-01 国立大学法人大阪大学 ＲＥＳＴ ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングにおけるＮエキソンのスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチド
WO2022250072A1 (ja) * 2021-05-26 2022-12-01 ルクサナバイオテク株式会社 心疾患治療薬
WO2022250155A1 (ja) 2021-05-28 2022-12-01 住友ファーマ株式会社 アンチセンス核酸
KR20240013202A (ko) 2021-05-28 2024-01-30 스미토모 파마 가부시키가이샤 안티센스 핵산
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
WO2024101446A1 (ja) * 2022-11-10 2024-05-16 ルクサナバイオテク株式会社 架橋部にグアニジノ構造を有する修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2885719A1 (en) 2014-03-27
CN104768964A (zh) 2015-07-08
KR20150056647A (ko) 2015-05-26
ES2622716T3 (es) 2017-07-07
EP2899197A1 (en) 2015-07-29
CN104768964B (zh) 2017-03-29
KR101707437B1 (ko) 2017-02-16
US20150266917A1 (en) 2015-09-24
CA2885719C (en) 2017-07-11
JP6048982B2 (ja) 2016-12-21
JPWO2014046212A1 (ja) 2016-08-18
EP2899197A4 (en) 2016-03-09
IN2015DN02238A (ja) 2015-08-21
US10377789B2 (en) 2019-08-13
EP2899197B1 (en) 2017-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6048982B2 (ja) グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド
US9611479B2 (en) Crosslinked nucleoside and nucleotide
JP7485642B2 (ja) 治療化合物用の標的化リガンド
JP5669073B2 (ja) 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド
AU2023255025A1 (en) Targeting ligands
US7427672B2 (en) Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
WO2016017422A1 (ja) 架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチド
US20220372060A1 (en) 5'-modified nucleoside and nucleotide using same
US20220127300A1 (en) 5'-modified nucleoside and nucleotide using same
US20230340008A1 (en) Bridged nucleoside and nucleotide using same
US20230011179A1 (en) Nucleoside derivative and use thereof
WO2015125845A1 (ja) 含窒素非芳香族複素環を含む核酸のリン酸部位修飾
WO2024101446A1 (ja) 架橋部にグアニジノ構造を有する修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法
US20230322840A1 (en) Bridged nucleoside and nucleotide
WO2023167094A1 (ja) ５'位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチド
WO2023149038A1 (ja) フェノキサジン誘導体およびそれを用いたドラッグデリバリーシステム製剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13838365

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14428646

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014536921

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

Ref document number: 2885719

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013838365

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013838365

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20157010144

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A