CN104768964A - 具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸 - Google Patents

具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐含有式I或II所示的化合物或其盐、以及至少1个式I'或II'所示的核苷结构。根据本发明，能够提供一种对于靶核酸具有高结合亲和性和特异性、且显示高的核酸酶抗性的寡核苷酸用的核酸分子。

Description

具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸
技术领域
本发明涉及人工核苷和寡核苷酸，更详细而言涉及具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸。
背景技术
作为利用核酸药物的疾病治疗法，有反义法、反义基因法、使用适配子的方法、使用siRNA的方法等。其中，反义法是从外部导入与疾病相关的mRNA互补的寡核苷酸(反义链)，形成双链，从而阻碍病原RNA的翻译过程，进行疾病治疗或预防的方法。使用siRNA的方法也与反义法类似，通过在生物体中投与的双链RNA，阻碍从mRNA向蛋白质的翻译。另一方面，反义基因法通过从外部导入对应于转录病原RNA的DNA部位的三链形成寡核苷酸，抑制从DNA向RNA的转录。另外，因为适配子是短核酸分子(寡核苷酸)，所以通过与作为疾病原因的蛋白质等生物体成分结合而发挥功能。
作为这样的核酸药物的原料，开发出了各种人工核酸，但还不存在最理想的分子。例如，作为目前为止所开发出来的核酸药物的原料，有磷硫酰(phosphorothioate：S-PO3)型寡核苷酸(S-oligo)、2',4'-桥连(架桥)核酸(bridged nucleic acid)(BNA)/2',4'-锁核酸(locked nucleicacid)(LNA)(参照专利文献1～4和非专利文献1～4)等。作为对巨细胞病毒的反义医药品，S-oligo已经在美国上市。虽然S-oligo具有高的核酸酶抗性，但是具有与靶核酸链的结合亲和性低的难点，需要进行改进。目前为止所开发的2',4'-BNA/LNA与靶核酸链的结合亲和性都高，是作为今后的核酸药物的原料最为期待的分子。但是，对核酸酶的抗性不够，在生物体内的稳定性方面存在改善的余地。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第98/39352号
专利文献2：国际公开第2005/021570号
专利文献3：国际公开第2003/068795号
专利文献4：国际公开第2011/052436号
非专利文献
非专利文献1：C.Wahlestedt等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000年，97卷，10号，5633-5638页
非专利文献2：Y.Hari等、Bioorg.Med.Chem.，2006年，14卷，1029-1038页
非专利文献3：K.Miyashita等、Chem.Commun.，2007年，3765-3767页
非专利文献4：S.M.A.Rahman等、J.Am.Chem.Soc.，2008年，130卷，14号，4886-4896页
非专利文献5：M.Kuwahara等、Nucleic Acids Res.，2008年，36卷，13号，4257-4265页
非专利文献6：S.Obika等、Bioorg.Med.Chem.，2001年，9卷，1001-1011页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种对于靶核酸具有高的结合亲和性和特异性，显示高的核酸酶抗性的寡核苷酸用的核酸分子。
用于解决课题的技术方案
本发明的发明人发现含有在2',4'-BNA/LNA的桥连结构中导入了胍的核酸的寡核苷酸，对于DNA具有特别高的结合亲和性和特异性，且显示高的核酸酶抗性，从而完成了本发明。
本发明提供一种由以下的式I或II表示化合物或其盐，
(式I或II中，
B1表示具有1个以上选自α群中的任意取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，在此，该α群包括羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基所保护的氨基和卤原子；
R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
并且，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基、具有可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基所保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、和/或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基]。)
在一个实施方式中,在所述式I或II中，所述B1为6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基或4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。
在一个实施方式中，在所述式I或II中，所述B1为2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基。
本发明还提供一种寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其含有至少1个下述的式I'或II'所示的核苷结构：
(式中，
B1表示可以具有1个以上选自α群中的任意取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，在此，该α群包括羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基所保护的氨基和卤原子；
R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
而且R14表示氢原子；并且，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基、具有可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基所保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、和/或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基]。)
在一个实施方式中，在所述式I'或II'中，所述B1为6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基或4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。
在一个实施方式中，在所述式I'或II'中，所述B1为2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基。
发明效果
根据本发明，能够提供一种对于靶核酸具有高的结合亲和性和特异性、且显示高的核酸酶抗性的寡核苷酸用的核酸分子。
附图说明
图1为表示用3'-核酸外切酶对5'-d(TTTTTTTTXT)-3'的序列的各种寡核苷酸进行处理时的未反应的寡核苷酸的比例的经时变化的图表。
图2为表示用3'-核酸外切酶对5'-d(TTTTTTTTX)-3'的序列的各种寡核苷酸进行处理时的未反应的寡核苷酸的比例的经时变化的图表。
图3为表示含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物和含有LNA的寡核苷酸分别对于具有完全互补序列的DNA靶链(完全匹配型，full-match)和具有1个碱基错配的DNA靶链(错配型，mismatch)的Tm曲线的图表。
图4为表示化合物57(A～D)和化合物61(E～H)的HuH-7细胞内的动态的显微镜照片，A、E为相位差图像；B、F为Alexa Fluor 488(寡核苷酸)的荧光图像；C、G为Hoechst 33342(核)的荧光图像；D、H为LysoTracker(溶酶体)的荧光图像。
图5为表示化合物57的HuH-7细胞内的动态的显微镜照片，是对于图4A～D将图4B的箭头所示的区域进行了放大的照片(A～D)。
具体实施方式
首先，定义本说明书中所使用的术语。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷基”指的是碳原子数1～6的任意的直链烷基，具体指甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基或正己基。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷氧基”包括具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷氧基。例如，可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基等。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷硫基”包括具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷硫基。例如，可以列举甲硫基、乙硫基、正丙硫基等。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷基氨基”包括具有1个碳原子数1～6的任意的直链烷基的氨基、或者具有2个碳原子数1～6相同或不同的任意的直链烷基的氨基。例如，可以列举甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、甲基乙基氨基、二乙基氨基等。
在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基”包括碳原子数1～7的任意的直链烷基、具有相同或不同支链的碳原子数3～7的任意的支链烷基、碳原子数3～7的任意的环状烷基和碳原子数4～7的它们的组合。例如，作为碳原子数1～7的任意的直链烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基和正庚基，作为具有相同或不同的支链的碳原子数3～7的任意的支链烷基，可以列举异丙基、异丁基、叔丁基、异戊基等，并且，作为碳原子数3～7的任意的环状烷基，可以列举环丁基、环戊基、环己基等。
在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基”包括碳原子数2～7的任意的直链烯基、碳原子数2～7的任意的支链烯基、碳原子数3～7的任意的环状烯基和碳原子数4～7的它们的组合。例如，作为碳原子数2～7的任意的直链烯基，可以列举乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基等，作为碳原子数3～7的任意的支链烯基，可以列举异丙烯基、1-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-2-丁烯基等，而且，作为碳原子数3～7的任意的环状烯基，可以列举环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。
在本说明书中，术语“可以含有杂原子的芳基”包括仅由烃构成的碳原子数6～12的任意的芳香族烃化合物、和在碳原子数6～12的任意的环结构中构成该环结构的1个以上的碳原子被相同种类或不同种类的杂原子(例如氮原子、氧原子或硫原子)取代的任意的杂芳香族化合物。作为仅由烃构成的碳原子数6～12的芳香族烃化合物，可以列举苯基、萘基、茚基、薁基等，而且，作为该杂芳香族化合物，可以列举吡啶环、吡咯环、喹啉环、吲哚环、咪唑啉环、嘌呤环、噻吩环等。作为吡啶环，例如可以列举嘧啶环、哌啶环、喹啉环、吖啶环。
在本说明书中，术语“具有可以含有杂原子的杂芳基部分的芳烷基”包括仅由烃构成的碳原子数5～12的任意的芳香族烃化合物、和在碳原子数5～12的任意的环结构中构成该环结构的1个以上的碳原子被相同种类或不同种类的杂原子(例如氮原子、氧原子或硫原子)取代的任意的杂芳香族化合物。作为术语“具有可以含有杂原子的杂芳基部分的芳烷基”的例子，可以列举苄基、苯乙基、萘甲基、3-苯基丙基、2-苯基丙基、4-苯基丁基、2-苯基丁基、吡啶基甲基、吲哚基甲基、呋喃基甲基、噻吩基甲基、吡咯基甲基、2-吡啶基乙基、1-吡啶基乙基、3-噻吩基丙基等。
在本说明书中，作为术语“酰基”的例子，可以列举脂肪族酰基和芳香族酰基。具体而言，作为脂肪族酰基的例子，可以列举甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基(pentanoyl group)、叔戊酰基(pivaloyl group)、戊酰基(valeryl group)、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、3-甲基壬酰基、8-甲基壬酰基、3-乙基辛酰基、3,7-二甲基辛酰基、十一碳酰基、十二碳酰基、十三碳酰基、十四碳酰基、十五碳酰基、十六碳酰基、1-甲基十五碳酰基、14-甲基十五碳酰基、13,13-二甲基十四碳酰基、十七碳酰基、15-甲基十六碳酰基、十八碳酰基、1-甲基十七碳酰基、十九碳酰基、二十碳酰基和二十一碳酰基这样的烷基羰基；琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基这样的羧基化烷基羰基；氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基这样的被取代有卤原子的碳原子数1～6的烷基取代的羰基；甲氧基乙酰基这样的碳原子数1～6的烷氧基烷基羰基；(E)-2-甲基-2-丁烯酰基这样的不饱和烃基羰基。另外，作为芳香族酰基的例子，可以列举苯甲酰基、α-萘甲酰基、β-萘甲酰基这样的芳基羰基；2-溴苯甲酰基、4-氯苯甲酰基这样的卤代芳基羰基；2,4,6-三甲基苯甲酰基、4-甲苯酰基这样的被碳原子数1～6的烷基取代的芳基羰基；4-甲氧苯甲酰基这样的被碳原子数1～6的烷氧基取代的芳基羰基；2-羧基苯甲酰基、3-羧基苯甲酰基、4-羧基苯甲酰基等的羧基化芳基羰基；4-硝基苯甲酰基、2-硝基苯甲酰基这样的硝基化芳基羰基；2-(甲氧基碳酰基)苯甲酰基这样的被碳原子数1～6的烷氧基取代的羰基化芳基羰基；4-苯基苯甲酰基这样的芳基化芳基羰基等。
在本说明书中，作为术语“甲硅烷基”的例子，可以列举三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基这样的被碳原子数1～6的3个烷基取代的甲硅烷基；二苯基甲基甲硅烷基、丁基二苯基丁基甲硅烷基、二苯基异丙基甲硅烷基、苯基二异丙基甲硅烷基这样的被取代有1～2个芳基的碳原子数1～6的3个烷基取代的甲硅烷基等。
在本说明书中，作为术语“卤原子”，例如可以列举氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
在本说明书中，“核酸合成的氨基的保护基”、“核酸合成的羟基的保护基”、“由核酸合成的保护基所保护的羟基”、“由核酸合成的保护基所保护的磷酸基”和“由核酸合成的保护基所保护的巯基”中所记载的术语“保护基”，只要在核酸合成时稳定，能够保护氨基、羟基、磷酸基或巯基就没有特别限制。具体是指在酸性或中性条件下稳定，可以通过氢解、水解、电解和光解这样的化学方法开裂的保护基。作为这样的保护基，例如可以列举碳原子数1～6的烷基；碳原子数1～6的烯基；酰基；四氢吡喃基或四氢噻喃基；四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基；甲硅烷基；由碳原子数1～6的烷氧基所取代的甲基；由取代有碳原子数1～6的烷氧基的碳原子数1～6的烷氧基所取代的甲基；由取代有卤原子的碳原子数1～6的烷氧基所取代的甲基；由碳原子数1～6的烷氧基所取代的乙基；由卤原子所取代的乙基；由1～3个芳基所取代的甲基；由取代有碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、卤原子和/或氰基的1～3个的芳基所取代的甲基；由碳原子数1～6的烷氧基所取代的羰基；由卤原子、碳原子数1～6的烷氧基和/或硝基所取代的芳基；由卤原子和/或取代有碳原子数1～6的3个烷基的甲硅烷基所取代的碳原子数1～6的烷氧基取代的羰基；烯氧基羰基；可以由碳原子数1～6的烷氧基和/或取代有硝基的芳基所取代的芳烷氧基羰基等。
进一步具体而言，作为四氢吡喃基或四氢噻喃基，可以列举四氢吡喃-2-基、3-溴四氢吡喃-2-基、4-甲氧基四氢吡喃-4-基、四氢噻喃-4-基、4-甲氧基四氢噻喃-4-基等。作为四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基，可以列举四氢呋喃-2-基、四氢硫代呋喃-2-基。作为由碳原子数1～6的烷氧基所取代的甲基，可以列举甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基、叔丁氧基甲基等。作为由取代有碳原子数1～6的烷氧基的碳原子数1～6的烷氧基所取代的甲基，可以列举2-甲氧基乙氧基甲基等。作为由取代有卤原子的碳原子数1～6的烷氧基所取代的甲基，可以列举2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基等。作为由碳原子数1～6的烷氧基所取代的乙基，可以列举1-乙氧基乙基、1-(异丙氧基)乙基等。作为由卤原子取代的乙基，可以列举2,2,2-三氯乙基等。作为由1～3个芳基所取代的甲基，可以列举苄基、α-萘甲基、β-萘甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、9-蒽甲基等。作为“由取代有碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、卤原子和/或氰基的1～3个芳基所取代的甲基”，可以列举4-甲基苄基、2,4,6-三甲基苄基、3,4,5-三甲基苄基、4-甲氧基苄基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、4,4'-二甲氧基三苯基甲基、2-硝基苄基、4-硝基苄基、4-氯苄基、4-溴苄基、4-氰基苄基等。作为由碳原子数1～6的烷氧基所取代的羰基，可以列举甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、异丁氧基羰基等。作为“由卤原子、碳原子数1～6的烷氧基和/或硝基所取代的芳基”，可以列举4-氯苯基、2-氯苯基、4-甲氧基苯基、4-硝基苯基、2,4-二硝基苯基等。作为“由卤原子和/或取代有3个碳原子数1～6的烷基的甲硅烷基所取代的碳原子数1～6的烷氧基取代的羰基，可以列举2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基等。作为烯氧基羰基，可以列举乙烯氧基羰基、芳氧基羰基等。作为“可以由碳原子1～6的烷氧基和/或取代有硝基的芳基所取代的芳烷氧基羰基”，可以列举苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基等。
作为“核酸合成的羟基的保护基”，例如可以列举脂肪族酰基；芳香族酰基；由1～3个芳基所取代的甲基；由取代有碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、卤原子和/或氰基的1～3个芳基所取代的甲基；或甲硅烷基。作为“由核酸合成的保护基所保护的羟基”的保护基，例如可以列举脂肪族酰基；芳香族酰基；由1～3个芳基所取代的甲基；由卤原子、碳原子数1～6的烷氧基和/或硝基所取代的芳基；碳原子数1～6的烷基；或碳原子数1～6的烯基。作为“核酸合成的氨基的保护基”，例如可以列举酰基、苯甲酰基。作为“由核酸合成的保护基所保护的磷酸基”的“保护基”，例如可以列举碳原子数1～6的烷基和/或由氰基所取代的碳原子数1～6的烷基；芳烷基；由取代有硝基和/或卤原子的芳基所取代的芳烷基；由碳原子数1～6的烷基、卤原子或硝基取代的芳基；2-氰基乙基；2,2,2-三氯乙基；苄基；2-氯苯基；或4-氯苯基。作为“由核酸合成的保护基所保护的巯基”的“保护基”，例如可以列举脂肪族酰基或芳香族酰基、苯甲酰基。
在本说明书中，在-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基]所示的基团中，R4可表示为OR4a且R5可表示为NR5a的基团称为“亚磷酰胺基”(phosphoramidite group)。作为亚磷酰胺基，例如可以列举式-P(OC2H4CN)(N(iPr)2)所示的基团、或式-P(OCH3)(N(iPr)2)所示的基团。在此，iPr表示异丙基。
在本说明书中，术语“人工核苷”和“核苷类似物”指的是嘌呤或嘧啶碱基与糖结合得到的“核苷”中的非天然型核苷(即，不是天然的核苷，且仅能够人工制造的核苷)、以及嘌呤和嘧啶以外的可以与嘌呤或嘧啶碱基代用的芳香族杂环和芳香族烃环(例如可以列举吡啶酮、羟基苯、氨基吡啶等，没有特别限定)与糖结合得到的核苷类似物。
在本说明书中，术语“人工寡核苷酸”和“寡核苷酸类似物”指的是2～50个相同或不同的“核苷”或“核苷类似物”通过磷酸二酯键结合得到的“寡核苷酸”的非天然型衍生物。作为那样的类似物，例如可以列举糖部分被修饰的糖衍生物；磷酸二酯部分被硫酯化的硫酯衍生物；末端的磷酸部分被酯化的酯体；嘌呤碱基上的氨基被酰胺化的酰胺体、糖部分被修饰的糖衍生物。
在本说明书中，术语“式I或II所示的化合物的盐”是指本发明的式I或式II所示的化合物的盐。作为这样的盐，例如可以列举式I或II所示的化合物的钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐，钙盐、镁盐这样的碱土金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等的金属盐；式I或II所示的化合物的铵盐这样的无机盐，叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等的胺盐；式I或II所示的化合物的氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等的无机酸盐；式I或II所示的化合物的甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的碳原子数1～6的烷烃磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等的有机酸盐；以及式I或II所示的化合物的甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。
在本说明书中，作为术语“含有至少1个式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸的药理学上可接受的盐”是指含有至少1个本发明的式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸类似物的盐。作为这样的盐，例如可以列举含有至少1个式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸的钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐，钙盐、镁盐这样的碱土金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等的金属盐；含有至少1个式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸的铵盐这样的无机盐，叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等的胺盐；含有至少1个式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸的氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸这样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等的无机酸盐；含有至少1个式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸的甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的由碳原子数1～6的烷烃所取代的磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等的有机酸盐；以及含有至少1个式I'或II'所示的核苷结构的寡核苷酸的甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。
以下，详细说明本发明。
本发明的2',4'-桥式人工核苷和核苷酸或其盐具有以下的式I或II所示的结构：
(式I或II中，
B1表示可以具有1个以上选自α群中的任意取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，在此，该α群包括羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基所保护的氨基和卤原子；
R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
并且，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基、具有可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基所保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、和/或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基])。
在上述式I或II中，B1为嘌呤碱基(即，嘌呤-9-基)或嘧啶碱基(即，2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基)。这些碱基可以具有1个以上的选自包括羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基和卤原子的α群中的任意的取代基。
作为上述的碱基(B1)的具体例，可以列举6-氨基嘌呤-9-基(腺嘌呤基)、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(鸟嘌呤基)、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胞嘧啶基)、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基(尿嘧啶基)、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胸腺嘧啶基)和4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。
其中，从安全且有效地应用于核酸药物的观点考虑，B1优选为分别由以下结构式：
表示的2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胸腺嘧啶基)、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胞嘧啶基)、6-氨基嘌呤-9-基(腺嘌呤基)、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(鸟嘌呤基)、4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基和2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基(尿嘧啶基)，特别优选2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(胸腺嘧啶基)。另外，在寡核苷酸合成时，优选羟基被保护基保护。
在上述式I或II中，R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
优选为氢原子或甲基。作为“氨基的保护基”，可以列举乙酰基、叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)等。
在上述式I或II中，R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基、具有可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基所保护的磷酸基、-P(R4)R5[式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、和/或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基]。
本发明的2',4'-桥式人工核苷在2',4'-BNA/LNA的桥结构中导入胍。由于胍具有正电荷，因此，可期待例如因磷酸二酯部分的阴离子排斥抑制(静电相互作用)和水合效果的增强而带来的对于靶核酸的双链形成能力的提高以及酶抗性能的提高。
可以由本发明的2',4'-桥式人工核苷容易地制备2',4'-桥式人工核苷酸。例如2',4'-桥式人工核苷酸的三磷酸化可依据非专利文献5中记载的方法容易地进行。
本发明的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐含有至少1个下述的式I'或II'所示的核苷结构。
(式中，B1、R2和R3与上述式I和II所定义的相同)。
在上述式I'或II'中，R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
优选为氢原子或甲基，而且R14表示氢原子。
本发明的寡核苷酸在任意位置具有至少1个上述核苷结构。1个寡核苷酸中所含有的上述核苷结构的数量和位置没有特别限定，可根据目的设计。数量越多，寡核苷酸对于靶核酸具有越高的结合亲和性和特异性，双链和三链的形成速度越快，且显示高的核酸酶抗性。在本说明书中，也将本发明的2',4'-桥式人工核苷和本发明的寡核苷酸中所含的上述核苷结构总称为“胍桥式人工核酸”或“胍桥式核酸”。
由于含有这样的核苷结构的寡核苷酸及其类似物如上所述具有通过糖部分的桥而固定的结构，因此，对于各种核苷酶都难以被分解，在向生物体投与后，能够长时间在生物体内存在。进而，通过由于糖部分的桥上存在的阳离子性胍所引起的静电作用，例如，与mRNA形成稳定的双链，阻碍作为病因的蛋白质的生物合成，或者在与基因组中的双链DNA之间形成三链，阻碍向mRNA的转录。另外，也可以抑制感染病毒的增殖。
根据这些内容，使用本发明的2',4'-桥式人工核苷合成的寡核苷酸及其类似物可以期待作为以抗肿瘤剂、抗病毒剂为代表的阻碍特定基因的机能而治疗疾病的医药品(反义分子等)的有用性。
特别在反义法中，对于互补正义链RNA的结合亲和性和对生物体内DNA分解酶的抗性这两者是必须的。一般而言，已知核酸在单链状态下，糖部分的结构不断在近似于DNA双链的形态、和近似于DNA-RNA双链或近似于RNA双链的形态之间摇摆。在单链核酸与互补的RNA链形成双链时，其糖部分结构被固定。因此，在本发明的2',4'-桥式人工核苷中，因为糖部分被预先固定为形成双链时的状态，所以容易与目标RNA链形成双链，能够稳定地存在。另外，还已知核酸双链通过被称为水分子网络的、像链一样连接的水合水而稳定化。由于本发明的2',4'-桥式人工核苷中具有胍，因此，可期待例如因静电相互作用和水合效果而带来的双链形成能力的提高以及酶抗性能的提高。进而，通过在桥连部导入胍，阳离子的位置被固定，也可期待静电相互作用和水合效果的增强。由于本发明的2',4'-桥式人工核苷中在分子中具有源自胍盐基的正电荷，因此，与天然的核酸或迄今为止已知的人工核酸相比，可提高向细胞的摄入效率，还可进一步期待对于靶核酸的杂交形成速度的提高。由此可预见到反义效果的增强和体内残留时间的增大，能够减轻因减少投与量而产生的副作用并削减成本。
本发明的寡核苷酸及其类似物，例如，能够配合赋形剂、粘合剂、防腐剂、抗氧化剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等在医药制剂技术领域中通常使用的辅助剂，制成非口服制剂或脂质体制剂。另外，例如能够配合在该技术领域一般使用的医药用载体，配制液剂、霜剂、软膏剂等局部用的制剂。
实施例
以下，基于实施例进一步详细地说明本发明的2',4'-桥式人工核苷及其类似物的合成。
在以下的实施例中，氢核磁共振(1H-NMR)谱使用日本电子株式会社制JNM-ECS400型(400MHz)，将四甲基硅烷(0.00ppm)、氯仿-d(7.26ppm)、甲醇-d4(3.30ppm)作为内标进行测定。对分裂样式而言，将单重态、二重态、三重态、多重态、AB四重态、二重四重态分别简写为s、d、t、m、AB、dd。碳核磁共振(13C-NMR)谱使用JNM-ECS400型(100MHz)，将氯仿-d(77.0ppm)、甲醇-d4(49.0ppm)作为内标进行测定。磷核磁共振(31P-NMR)使用日本电子株式会社制JNM-ECS400型(161.8MHz)，将5％磷酸-重水溶液(0.00ppm)作为外标进行测定。质谱分析(FAB-MS)使用日本电子株式会社制JMS-600型、同公司制JMS-700型、同公司制JMS-D300型进行测定。硅胶色谱的吸附剂使用Fuji Silysia Chemical Ltd.制PSQ-100B(ave.0.110mm)，快速硅胶色谱的吸附剂使用Fuji Silysia Chemical Ltd.制PSQ-60B(平均0.060mm)。高效液相色谱(HPLC)使用株式会社岛津制作所制SHIMADZULC-10ATVP、SHIMADZU SPD-10AVP、SHIMADZU CTO-10VP。HPLC分析柱使用Waters XBridgeTM OST C18 2.5μm(4.6×50mm)，分配柱使用Waters XBridgeTM OST C18 2.5μm(10×50mm)。Tm测定使用株式会社岛津制作所制SHIMADZU UV-1650B、SHIMADZUUV-1650PC进行。MALDI-TOF-MS使用Bruker公司制Daltonics(注册商标)Autoflex II TOF/TOF进行测定。
二氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、乙腈、吡啶利用氢化钙干燥后进行蒸馏，作为反应溶剂和碱使用。对于其它的试剂类，只要没有特别记载，则可以使用市售的试剂。
(实施例1)核苷类似物(化合物8)的合成
(1)化合物5的合成
依据Nishida,M.等人、Chem.Commun.、2010年、第46卷、p.5283-5285.中记载的方法由D-葡萄糖通过15工序合成化合物1。
在氮气流下，在得到的化合物1(2.00mg，3.86mmol)的甲醇溶液50mL中加入氯化镍(36mg，0.28mmol)后，以0℃加入硼氢化钠(600mg，15.4mmol)，在室温下搅拌10分钟。利用硅藻土进行过滤后，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(甲醇)进行精制，以白色无定形的形式得到化合物2(1.47g，81％)(上述工序a)。
得到的化合物2的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.60(3H,d,J＝1.0Hz),2.61,2.93(2H,AB,J＝14.0Hz),3.54,3.61(2H,AB,J＝10.0Hz),3.70(1H,t,J＝6.0Hz,9.0Hz),4.19(1H,d,J＝6.0Hz),4.58,4.61(2H,AB,J＝11.5Hz),4.65,4.81(2H,AB,J＝11.0Hz),5.89(1H,d,J＝9.0Hz),7.30-7.43(10H,m),7.53(1H,d,J＝1.0Hz)。
接着，在氮气流下，在得到的化合物2(576mg，1.23mmol)的二氯甲烷溶液10mL中以0℃加入9-芴甲氧基羰基异氰酸酯(350mg，1.23mmol)的二氯甲烷溶液(4mL)，以0℃搅拌15分钟。接着，以0℃加入水进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇＝80：1)进行精制，以白色固体的形式得到化合物3(638mg，69％)(上述工序b)。
得到的化合物3的物性数据如下：1H-NMR(CDCl3)δ:1.57(3H,d,J＝1.0Hz),3.57,3.69(2H,AB,J＝10.0Hz),3.65(1H,t,J＝7.5Hz),3.91,4.24(2H,AB,J＝12.0Hz),4.16(1H,d,J＝7.5Hz),4.22(1H,t,J＝7.0Hz),4.46(2H,d,J＝7.0Hz),4.53(2H,s),4.68,4.77(2H,AB,J＝11.0Hz),5.88(1H,d,J＝7.5Hz),7.19-7.44(15H,m),7.55(1H,d,J＝7.5Hz),7.78(1H,d,J＝8.0Hz),8.12(1H,s),8.29(1H,s),9.98(1H,s)。
接着，在氮气流下，在得到的化合物3(335mg，0.45mmol)的二氯甲烷溶液5mL中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(103mg，0.54mmol)，在室温下搅拌6小时。接着，以0℃加入水进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇＝80：1)进行精制，以黄白色固体的形式得到化合物4(268mg，83％)(上述工序c)。
得到的化合物4的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.35(3H,s),3.11,3.45(2H,AB,J＝13.5Hz),3.69,3.83(2H,AB,J＝11.0Hz),4.28(2H,d,J＝6.5Hz),4.30(1H,d,J＝6.5Hz),4.32(1H,t,J＝6.5Hz),4.38(1H,d,J＝6.5Hz),4.48,4.71(2H,AB,J＝11.5Hz),4.51,4.57(2H,AB,J＝11.0Hz),5.91(1H,s),7.23-7.85(19H,m)。
在氮气流下，在得到的化合物4(971mg，1.36mmol)的二氯甲烷溶液8mL中加入二乙胺(2mL)，在室温下搅拌5小时。接着，蒸馏除去溶剂后，用己烷清洗，由此以白色固体的形式得到化合物5(609mg，91％)(上述工序d)。
得到的化合物5的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.37(3H,s),3.12,3.46(2H,AB,J＝14.0Hz),3.60,3.86(2H,AB,J＝11.0Hz),4.25(1H,d,J＝6.5Hz),4.44(1H,d,J＝6.5Hz),4.50,4.71(2H,AB,J＝11.5Hz),4.51,4.59(2H,AB,J＝11.0Hz),5.89(1H,s),7.24-7.80(10H,m),7.89(1H,s)。
(2)化合物8的合成
在氮气流下，在上述得到的化合物5(551mg，1.12mmol)的二氯甲烷溶液12mL中在室温下加入三乙胺(0.68mL，4.93mmol)后，以0℃加入乙酸酐(0.23mL，2.47mmol)，在室温下搅拌2小时。接着，以0℃在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。在得到的粗产物(616mg)的异丙醇溶液10mL中加入碳酸钾(400mg，2.89mmol)，在室温下搅拌6天。接着，以0℃加入水进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。在氢气流下，在得到的粗产物(517mg)的异丙醇溶液10mL中加入氢氧化钯碳(1.40g)，在室温下搅拌26小时。蒸馏除去过滤反应液而得到的滤液的溶剂，由此以白色固体的形式得到化合物6(319mg，80％)(上述工序e)。
得到的化合物6的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.87(3H,d,J＝1.0Hz),2.21(3H,s),3.45,3.54(2H,AB,J＝14.5Hz),3.71,3.86(2H,AB,J＝12.0Hz),4.23(1H,d,J＝6.5Hz),4.61(1H,d,J＝6.5Hz),5.85(1H,s),8.10(1H,d,J＝1.0Hz)。
在氮气流下，在得到的化合物6(219mg，0.62mmol)的吡啶溶液7mL中以0℃加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(630mg，1.86mmol)，在室温下搅拌20小时。接着，以0℃在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶色谱(氯仿：甲醇＝40：1→5：1)进行精制，以白色无定形的形式得到化合物7(267mg，66％)(上述工序f)。
得到的化合物7的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.87(3H,d,J＝1.0Hz),2.21(3H,s),3.45,3.54(2H,AB,J＝14.5Hz),3.71,3.86(2H,AB,J＝12.0Hz),4.23(1H,d,J＝6.5Hz),4.61(1H,d,J＝6.5Hz),5.85(1H,s),8.10(1H,d,J＝1.0Hz)。
在氮气流下，在得到的化合物7(131mg，0.21mmol)的二氯甲烷溶液2mL中加入二异丙基乙胺(146μL，0.84mmol)后，以0℃加入2-氰乙基二异丙基氯代亚磷酰胺(96μL，0.43mmol)，在室温下搅拌14小时。接着，以0℃在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂得到粗产物。通过利用二氯甲烷、己烷将得到的粗产物再沉淀而进行精制，以白色无定形的形式得到化合物8(110mg，61％)(上述工序g)。
得到的化合物8的物性数据如下：31P-NMR(CDCl3)δ:149.94,151.37。
(实施例2)寡核苷酸类似物的合成和精制
使用实施例1中得到的化合物8，利用DNA/RNA寡核苷酸自动合成机nS-8(Gene Design Inc.制)，使用0.2μmol规格的CPG载体合成寡核苷酸类似物(化合物9～13：示于以下的表1)。化合物8的乙腈溶液(0.1M)的偶联时间为16分钟，除此以外，在与天然的DNA合成相同的条件下进行。活化剂使用5-乙硫基-1H-四唑(0.5M)。使用28％氨水溶液从CPG载体中提取合成的寡核苷酸后，在55℃下经12小时除去碱基部分的保护基。将得到的粗产物利用反相简易柱(Sep-Pak＠Plus C18 Environmental Cartridges，Waters公司)进行精制，进一步进行反相HPLC精制。
合成的寡核苷酸类似物(化合物9～13)的精制和纯度确认通过反相HPLC在以下的条件下进行。
流动相
A液：0.1M乙酸三乙铵缓冲液，pH7.0
B液：0.1M乙酸三乙铵缓冲液：乙腈＝1：1，pH7.0
梯度(Gradient)：
分析5-9％MeCN(30分钟)、分配(Preparative)5-9％MeCN(30分钟)：化合物9
分析4-8％MeCN(30分钟)、分配4-8％MeCN(30分钟)：化合物10
分析3-7％MeCN(30分钟)、分配3-7％MeCN(30分钟)：化合物11
分析4-8％MeCN(30分钟)、分配4-8％MeCN(30分钟)：化合物12
分析7-11％MeCN(30分钟)、分配7-11％MeCN(30分钟)：化合物13
使用柱：
分析Waters XBridgeTMOST C18 2.5μm(4.6×50mm)
分配(Preparative)Waters XBridgeTMOST C18 2.5μm(10×50mm)流速：
分析1.0mL/分钟
分配4.5mL/分钟
柱温：50℃
检测：UV(254nm)
合成的寡核苷酸类似物(化合物9～13)的分子量通过飞行时间型质谱分析(MALDI-TOF-MS)确定。将结果示于表1。
[表1]
*1 T：胍桥式核酸
由表1可知，通过飞行时间型质谱分析(MALDI-TOF-MS)的分子量测定的结果显示与理论值很好地吻合，因此，确认分别得到了目标寡核苷酸。
为了进行比较，包含含有天然型的核苷的寡核苷酸(化合物14：以下的表2、序列号1)、和含有脲桥式人工核酸2',4'-BNA/LNA(5-甲基-2'-O,4'-C-亚甲基尿苷(依据非专利文献6合成)的寡核苷酸类似物(化合物15～18：以下的表3)也依据标准的亚磷酰胺方案同样地进行合成、精制。
(实施例3)熔解温度(Tm)的测定
将实施例2中得到的各种寡核苷酸(使用化合物8制造的寡核苷酸类似物的化合物9～12、含有天然型核苷的寡核苷酸的化合物14、以及含有脲桥式人工核酸的寡核苷酸类似物的化合物15～18)和靶链(5'-AGCAAAAAACGC-3'：序列号2)进行退火处理而形成双链后，测定双链的50％解离的温度Tm值，由此，研究寡核苷酸的杂交形成能力。
具体而言，将含有NaCl 100mM、磷酸钠缓冲液(pH7.2)10mM、寡核苷酸4μM和靶链4μM的样品溶液(130μL)在沸腾水浴中加热后，经10小时冷却至室温。在分光光度计(Shimadzu，UV-1650PC)的比色皿室内，为了防止结露而流通氮气流，将样品溶液缓慢冷却至5℃，进一步在5℃保持5分钟，然后开始测定。以每分钟0.5℃的比例使温度缓慢上升至90℃，每上升0.1℃测定260nm的紫外部吸收。另外，为了防止因温度上升引起的浓度变化，比色皿使用带盖的比色皿。将结果以Tm值和每修饰单位的Tm值差示于表2。Tm值越高，表示双链形成能力越高。
[表2]
*1 T：胍桥式核酸
*2 靶链序列：5’-(AGCAAAAAACGC)-3’
*2 条件：10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2),100mM NaCl,4μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
由表2可知，与通过桥结构和阳离子的效果使双链形成能力提高这样的预想相反，双链形成能力与天然的DNA基本为同等程度。另外，人工核酸向寡核苷酸的导入比例越多，越发现Tm值的上升。因此，可以认为本发明的核苷酸类似物对于适于反义法的寡核苷酸的合成有用。
为了详细研究桥连部的阳离子所带来的效果，在更容易表现阳离子效果的低盐浓度条件(使用除不含NaCl以外与上述样品溶液相同组成的溶液)下进行Tm测定。作为比较对象，还测定脲桥式人工核酸(化合物15～18)的Tm值。将结果示于表3。
[表3]
*1 T：胍桥式核酸、T：脲桥式核酸
*2 靶链序列：5'-(AGCAAAAAACGC)-3'
*2 条件：10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2),无NaCl,4μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
由表3可知，将RNA作为靶时的Tm值几乎未发现差异。另一方面，在将DNA作为靶时，在脲桥式人工核酸的情况下，随着人工核酸导入数的增加，Tm值降低，与此相对，在导入胍桥式人工核酸的情况下，未发现这样的Tm值的降低。由此表明，桥连部的阳离子对与DNA的双链的稳定化带来影响。
(实施例4)核苷类似物(化合物28)的合成
(1)化合物20的合成
依据Shrestha,A.R.等人、J.Org.Chem.、2011年、第76卷、p.9891-9899中记载的化合物7的制备步骤获得化合物19。在氮气流下，在化合物19(2.86g，4.10mmol)的二氯甲烷溶液(40mL)中，在冰冷下加入吡啶(1.65mL，20.5mmol)和三氟甲磺酸酐(1.37mL，8.20mmol)，在冰冷条件下搅拌1小时。加入水破坏酸后，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥有机层。蒸馏除去溶剂后，以黄色油状物质的形式得到粗产物，利用快速色谱(正己烷：乙酸乙酯＝3：1→2：1)进行简易精制，以淡黄色无定形的形式得到粗产物。接着，在氮气流下，在粗产物(1.96g，2.34mmol)的二甲基甲酰胺溶液(80mL)中加入叠氮化钠(0.23g，3.60mmol)并搅拌。48小时后，蒸馏除去溶剂后，加入水，用二氯甲烷萃取，用饱和食盐水清洗有机层后，用无水硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂后，将得到的粗产物利用快速柱色谱(正己烷：乙酸乙酯＝3：1)进行精制，以白色无定形的形式得到化合物20(1.71g，66％)(上述工序a)。
得到的化合物20的物性数据如下：1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ:0.99(9H,s),1.58(3H,s),3.63,3.69(2H,AB,J＝10.5Hz),3.69,3.91(2H,AB,J＝10.5Hz),3.91(1H,dd,J＝7.2Hz,5.4Hz),4.23(1H,d,J＝5.4Hz),4.47,4.53(2H,AB,J＝11.4Hz),4.57,4.75(2H,AB,J＝11.4Hz),6.03(1H,d,J＝7.2Hz),7.23-7.60(20H,m),8.70(1H,s)。
(2)化合物24和25的合成
在氮气流下，在得到的化合物20(622mg，0.85mmol)的甲醇溶液8mL中加入氯化镍(11mg，0.085mmol)，在冰冷下加入硼氢化钠(64mg，1.7mmol)，在室温下搅拌10分钟。过滤反应液并蒸馏除去溶剂后，加入水并用乙酸乙酯萃取。接着，用水和饱和食盐水清洗有机层，用硫酸钠干燥并蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(乙酸乙酯：三乙胺＝200：1)进行精制，以白色固体的形式得到化合物21(456mg，76％)(上述工序b)。
得到的化合物21的物性数据如下：1H-NMR(CDCl3)δ:1.04(9H,s),1.63(3H,d,J＝1.5Hz),3.59,3.66(2H,AB,J＝10.0Hz),3.67(1H,dd,J＝5.5Hz,9.0Hz),3.79,3.99(2H,AB,J＝11.0Hz),4.06(1H,d,J＝5.5Hz),4.55,4.58(2H,AB,J＝11.0Hz),4.67,4.76(2H,AB,J＝11.0Hz),5.81(1H,d,J＝9.0Hz),7.19-7.61(21H,m),7.95(1H,s)。
在氮气流下，在得到的化合物21(50mg，0.071mmol)的二氯甲烷溶液1mL中加入N,N'-二(叔丁氧基羰基)硫脲(30.4mg，0.11mmol)、二异丙基乙胺(9μL，0.035mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(21mg，0.11mmol)，在室温下搅拌3小时。接着，以0℃加入水进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用硫酸钠干燥，蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝4：1)进行精制，以白色固体的形式得到化合物22(58mg，86％)(上述工序c)。
得到的化合物22的物性数据如下：1H-NMR(CDCl3)δ:1.04
(9H,s),1.42(9H,s),1.46(9H,s),1.72(3H,d,J＝1.0Hz),3.57,3.96(2H,AB,J＝10.0Hz),3.73,3.78(2H,AB,J＝11.0Hz),4.25(1H,d,J＝8.0Hz),4.57,4.65(2H,AB,J＝11.0Hz),4.59,4.61(2H,AB,J＝9.0Hz),4.89(1H,q,J＝8.0Hz),5.98(1H,d,J＝8.0Hz),7.20-7.69(22H,m),8.93(1H,d,J＝8.0Hz),11.34(1H,s)。
在氮气流下，在得到的化合物22(106mg，0.11mmol)的四氢呋喃溶液1mL中加入四正丁基氟化铵(0.14mL，0.14mmol)，在室温下搅拌4.5小时。接着，将蒸馏除去溶剂而得到的粗产物利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行精制，以白色固体的形式得到化合物23(80mg，定量)(上述工序d)。
得到的化合物23的物性数据如下：1H-NMR(CDCl3)δ:1.42(9H,s),1.50(9H,s),1.75(3H,d,J＝1.0Hz),2.05(1H,dd,J＝3.5Hz,9.0Hz),3.57,3.62(2H,AB,J＝10.0Hz),3.68(1H,dd,J＝11.0Hz,9.0Hz),3.84(1H,dd,J＝11.0Hz,3.5Hz),4.35(1H,d,J＝7.5Hz),4.51,4.72(2H,AB,J＝11.0Hz),4.58,4.62(2H,AB,J＝11.5Hz),4.87(1H,q,J＝7.5Hz),6.07(1H,d,J＝7.5Hz),7.26-7.52(11H,m),7.88(1H,s),9.05(1H,d,J＝7.5Hz),11.39(1H,s)。
在氮气流下，在得到的化合物23(850mg，1.20mmol)的二氯甲烷溶液12mL中加入吡啶(0.29mL，3.59mmol)，以0℃加入三氟甲磺酸酐(0.3mL，1.78mmol)，以0℃搅拌3小时。接着，以0℃在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂得到粗产物。在氮气流下，在粗产物的二氯甲烷溶液8mL中加入三乙胺2mL，在室温下搅拌27小时。接着，将蒸馏除去溶剂而得到的粗产物利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行精制，以黄白色无定形的形式得到化合物24(644mg，77％)(上述工序e)。
在化合物24(57mg，0.082mmol)的四氢呋喃溶液1mL中加入35％盐酸(0.3mL)，在室温下搅拌40分钟。接着，以0℃在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂，由此以白色固体的形式得到化合物25(44mg，定量)(上述工序e')。
得到的化合物25的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.54(3H,d,J＝1.0Hz),3.53,3.70(2H,AB,J＝10.0Hz),3.90,3.97(2H,AB,J＝11.0Hz),4.16(1H,s),4.60,4.66(2H,AB,J＝11.5Hz),4.62(2H,s),4.78(1H,s),5.66(1H,s),7.27-7.38(m,10H),7.50(1H,d,J＝1.0Hz)。
(2)化合物28的合成
在氢气流下，在上述得到的化合物24(644mg，0.93mmol)的甲醇溶液10mL中加入氢氧化钯碳(900mg)，在室温下搅拌14小时。接着，蒸馏除去过滤反应液而得到的滤液的溶剂，由此得到化合物26的粗产物(上述工序f)。
在氮气流下，在化合物26的粗产物(354mg)的吡啶溶液7mL中以0℃加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(469mg，1.38mmol)，在室温下搅拌12小时。接着，以0℃在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液进行骤冷后，用二氯甲烷萃取反应液，用水和饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠干燥。接着，蒸馏除去溶剂得到粗产物。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行精制，以白色固体的形式得到化合物27(442mg，58％)(上述工序g)。
得到的化合物27的物性数据如下：1H-NMR(CD3OD)δ:1.42(18H,s),1.49(3H,s),3.39-3.55(4H,m),3.73(6H,s),4.39(1H,s),4.57(1H,s),5.51(1H,s),6.83(4H,d,J＝9.0Hz),7.17-7.44(m,9H),7.77(1H,s)。
在氮气流下，在得到的化合物27(141mg，0.17mmol)的乙腈溶液2mL中加入N,N-二异丙基铵四氮唑(N,N-diisopropyl ammoniumtetrazolide)(39mg，0.23mmol)和2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(73μL，0.23mmol)，在室温下搅拌3小时。接着，以0℃在反应液中加入水进行骤冷后，用乙酸乙酯萃取，用水和饱和食盐水清洗有机层，用Na2SO4干燥。将蒸馏除去溶剂而得到的粗产物利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝3：2)进行精制，以白色无定形的形式得到化合物28(148mg，86％)(上述工序h)。
得到的化合物28的物性数据如下：31P-NMR(CDCl3)δ:148.78,149.48,149.78。
(实施例5)寡核苷酸类似物的合成和精制
使用实施例4中得到的化合物28，利用DNA/RNA寡核苷酸自动合成机nS-8(Gene Design Inc.制)，使用0.2μmol规格的CPG载体合成10mer的寡核苷酸类似物(化合物29～32：示于以下的表4)。化合物28的乙腈溶液(0.1M)的偶联时间为8分钟，除此以外，在与天然的DNA合成相同的条件下进行。活化剂使用5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(0.25M)。使用28％氨水溶液从CPG载体中提取合成的寡核苷酸。对于得到的化合物29～31的粗产物，利用反相简易柱(Sep-Pak＠Plus C18 Environmental Cartridges，Waters公司)进行精制，接着用三氟乙酸(TFA)50％处理24小时，然后进行反相HPLC精制。对于得到的化合物32的粗产物，利用反相简易柱(Sep-Pak＠Plus C18 Environmental Cartridges，Waters公司)进行精制，进一步进行反相HPLC精制。
合成的寡核苷酸类似物(化合物29～32)的精制和纯度确认与实施例2同样地进行。
合成的寡核苷酸类似物(化合物29～32)的分子量通过MALDI-TOF-MASS测定来确定。将结果示于表4。
[表4]
*1t：胍桥式核苷
为了进行比较，含有天然型的核苷的寡核苷酸(化合物33：示于以下的表5)也按照标准的亚磷酰胺方案同样地进行合成、精制。
(实施例6)熔解温度(Tm)的测定
将实施例5中得到的各种寡核苷酸(使用化合物28制造的寡核苷酸类似物的化合物29～31、以及含有天然型核苷的寡核苷酸的化合物33)和以下的表5和表6中记载的靶链(10mer的PolyA和序列号3～5)进行退火处理而形成复合物后，测定复合物的50％解离的温度Tm值，由此，研究寡核苷酸的杂交形成能力。
具体而言，将含有NaCl 100mM、磷酸钠缓冲液(pH7.2)10mM、寡核苷酸4μM和靶链4μM的样品溶液(130μL)在沸腾水浴中加热后，经10小时冷却至室温。在分光光度计(Shimadzu，UV-1650PC)的比色皿室内，为了防止结露而流通氮气流，将样品溶液缓慢冷却至0℃，进一步在0℃保持5分钟，然后开始测定。以每分钟0.5℃的比例使温度缓慢上升至80℃，每上升0.1℃测定260nm的紫外部吸收。另外，为了防止因温度上升引起的浓度变化，比色皿使用带盖的比色皿。表5以m值和每修饰单位的Tm值差表示含有各种数量的胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物对于PolyA的杂交形成能力。表6以Tm值表示含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物和含有天然型核苷的寡核苷酸对于各种靶链的杂交形成能力。
[表5]
*1 t：胍桥式核酸
*2 靶链序列：5’-(AAAAAAAAAA)-3’
*2 条件：10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2),100mM NaCl,4μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
[表6]
*1 t：胍桥式核酸
*2 条件：10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2),100mM NaCl,4μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
由表5可知，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸不仅对于RNA的复合物形成能力优异，而且对于DNA的复合物形成能力也优异。另外，人工核酸向寡核苷酸的导入比例越多，越发现Tm值的上升。因此，可以认为本发明的胍桥式人工核酸对于适于反义法的寡核苷酸的合成有用。
由表6可知，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸也具有错配识别能力。含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸与含有天然型核苷的寡核苷酸相比，与期望的靶链(即，PolyA)形成复合物的能力也优异。因此，可知含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸不会序列非特异性地形成复合物。
(实施例7)寡核苷酸类似物的双链形成能力的评价
使用实施例4中得到的化合物28，对于由各种碱基构成的9mer的寡核苷酸类似物(化合物34：示于以下的表7)，使用28％氨水溶液从CPG载体中提取合成的寡核苷酸，之后在55℃下经12小时除去碱基部分的保护基，除此以外，与实施例5同样地进行合成和精制。为了进行比较，含有天然型的核苷的寡核苷酸(化合物35：示于以下的表7)也按照标准的亚磷酰胺方案同样地进行合成、精制。
对于化合物34和35的寡核苷酸，将各寡核苷酸与靶链5'-GTGATATGC-3'进行退火处理而形成双链后，测定双链的50％解离的温度Tm值，由此，研究寡核苷酸的杂交形成能力。与实施例6同样地进行对靶链的退火和Tm值的测定。将Tm值的结果示于表7。
[表7]
*1 t：胍桥式核酸
*2 靶链序列：5’-(GTGATATGC)-3’
*2 条件：10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2),100mM NaCl,4μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
由表7可知，在设计为由各种碱基构成的序列的情况下，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸(化合物34)也与polyT序列的情况同样地对于RNA和DNA两者的双链形成能力优异。
(实施例8)寡核苷酸类似物的三链形成能力的评价
使用实施例4中得到的化合物28，对于15mer的寡核苷酸类似物(化合物36：上述“X”为胍桥式人工核酸，带有下划线的C为2'-脱氧-5-甲基胞啶。也示于以下的表8)，使用28％氨水溶液从CPG载体中提取合成的寡核苷酸，之后在55℃下经12小时除去碱基部分的保护基，除此以外，与实施例5同样地进行合成和精制。为了进行比较，含有天然型的核苷的寡核苷酸(化合物37：上述“X”为天然型的核苷，带有下划线的C为2'-脱氧-5-甲基胞啶。也示于以下的表8)也按照标准的亚磷酰胺方案同样地进行合成、精制。
含有靶链5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGACGC-3'(序列号6)及其互补链的5'-GCGTCTCTCTZTCTTTTTGCC-3'(序列号7)的靶DNA双链如下制备。对于5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGACGC-“C18-间隔序列”-GCGTCTCTCTZTCTTTTTGCC-3'(利用作为连接的“C18间隔序列”将序列号6的寡核苷酸链的3'末端和序列号7的寡核苷酸链的5'末端连接而成的链)，除了连接部的合成使用18-O-二甲氧基三苯甲基六甘醇和1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research公司制)以外，按照标准的亚磷酰胺方案进行合成、精制，得到目标靶DNA双链。在此，Y和Z是可形成碱基对的组合，如下所述：Y为A，且Z为T；Y为T，且Z为A；Y为G，且Z为C；另外，Y为C，且Z为G。
对于化合物36和37的寡核苷酸，将各寡核苷酸与靶双链进行退火处理而形成三链后，测定三链的50％解离的温度Tm值，由此，研究寡核苷酸的杂交形成能力。
具体而言，将含有二甲胂酸钠缓冲液(pH6.8)10mM、KCl 100mM、MgCl250mM、寡核苷酸1.89μM和靶双链1.89μM的样品溶液(130μL)在沸腾水浴中加热后，经10小时冷却至室温。在分光光度计(Shimadzu，UV-1650PC)的比色皿室内，为了防止结露而流通氮气流，将样品溶液缓慢冷却至5℃，进一步在5℃保持20分钟，然后开始测定。以每分钟0.5℃的比例使温度缓慢上升至90℃，每上升0.1℃测定260nm的紫外部吸收。另外，为了防止因温度上升引起的浓度变化，比色皿使用带盖的比色皿。将Tm值的结果示于表8。Tm值越高，三链形成能力越高。
[表8]
*1 t：胍桥式核酸
*1 C：2’-脱氧-5-甲基胞啶
*2 条件：10mM二甲胂酸钠缓冲液(pH 6.8),100mM KCl,50mM MgCl2,1.89μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
由表8可知，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸(化合物36)对于期望的靶双链(Y为A且Z为T)的三链形成能力优异。
(实施例9)寡核苷酸类似物的核酸酶抗性的评价
制备5'-d(TTTTTTTTXT)-3'序列的X分别如下所示的10mer的各种寡核苷酸。即，制备以下的各种寡核苷酸：使用实施例1的核苷类似物(化合物8)制造的X为胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物(即“化合物13”)；使用实施例4的核苷类似物(化合物28)制造的X为胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物(即“化合物32”)；X为LNA-T(胸腺嘧啶LNA)的寡核苷酸(Gene Design Inc.制：化合物38)；X为DNA-T(胸腺嘧啶DNA)的寡核苷酸(10mer的OligodT、即“化合物33”)；以及X使用S-Oligo(除了使用作为硫化剂的D-1,4-二硫苏糖醇(DDTT、ChemGene公司制)代替氧化剂以外，按照标准的硫代磷酸酯合成的方案进行合成和精制)按照标准的亚磷酰胺方案进行合成、精制而得到寡核苷酸(化合物39：用作阳性对照)。
核酸酶抗性的评价如下进行。在含有各种寡核苷酸(750pmol)的任一者的缓冲液100μL[50mM Tris·HCl(pH8.0)、10mM MgCl2]中添加混合3'-核酸外切酶(Crotalus admanteus venomphosphodiesterase：CAVP、Pharmacia Biotech公司制)0.175μg，在37℃下培养，反应开始后每一定时间取出反应液的一部分。将取出的反应液在90℃下加热2分钟使酶失活，通过HPLC将寡核苷酸的剩余量定量。HPLC条件如下所述：梯度6-12％MeCN(15分钟)；流速0.8mL/分钟；柱温50℃。将寡核苷酸的剩余量作为未反应的寡核苷酸的比例(％)算出，相对于反应时间进行绘图。将结果示于图1。
图1为表示用3'-核酸外切酶对5'-d(TTTTTTTTXT)-3'的序列的各种寡核苷酸进行处理时的未反应的寡核苷酸的比例的经时变化的图表。图1的纵轴表示对于核酸酶处理未反应的寡核苷酸的比例(％)，横轴表示核酸酶处理时间(分钟)。图1的符号表示如下：矩形，含有天然型核苷的寡核苷酸(化合物33)；圆，含有LNA的寡核苷酸(化合物38)；三角，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸(化合物32)；×，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸(化合物13)；倒三角，含有S-Oligo的寡核苷酸(化合物39)。
由图1可知，化合物13即使在核酸酶处理的20分钟后，仍有50％以上未反应而残留，不易被分解。化合物32未反应的寡核苷酸的残留比例比化合物13低。但是，化合物32与在核酸酶处理的10分钟后基本分解的化合物38(含有LNA的寡核苷酸)相比，不易分解。
(实施例10)寡核苷酸类似物的核酸酶抗性的评价
如下制备5'-d(TTTTTTTTX)-3'的序列的X为胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物9mer的寡核苷酸(化合物40)。
在含有化合物32(3330pmol)的缓冲液40μL[50mM Tris·HCl(pH8.0)、10mM MgCl2]中添加混合3'-核酸外切酶(Crotalusadmanteus venom phosphodiesterase：CAVP、Pharmacia Biotech公司制)0.2μg，在37℃下培养3小时。接着，在90℃下加热2分钟使酶失活后，通过HPLC进行精制。对于得到的寡核苷酸，通过飞行时间型质谱分析(MALDI-TOF-MS)的分子量测定值(2743.07)显示与理论值(2743.83)很好地吻合，因此，可以确认得到了目标寡核苷酸。
将5'-d(TTTTTTTTX)-3'的序列的X为LNA的寡核苷酸(GeneDesign Inc.制：化合物41)用于比较。
关于核酸酶抗性的评价，在含有各种寡核苷酸(750pmol)的任一者的缓冲液100μL中添加3'-核酸外切酶0.08μg，除此以外，与实施例9同样地进行。将结果示于图2。
图2为表示用3'-核酸外切酶对5'-d(TTTTTTTTX)-3'的序列的各种寡核苷酸进行处理时的未反应的寡核苷酸的比例的经时变化的图表。图2的纵轴表示对于核酸酶处理未反应的寡核苷酸的比例(％)，横轴表示核酸酶处理时间(分钟)。图2的符号表示如下：圆，含有LNA的寡核苷酸(化合物41)；三角，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸(化合物40)。
由图2可知，化合物40(含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸)即使在核酸酶处理的20分钟后，仍有80％以上未反应而残留。与此相对，化合物41(含有LNA的寡核苷酸)在核酸酶处理的20分钟后，几乎没有残留未反应的寡核苷酸。如上所述，实施例4的胍桥式核苷类似物(化合物28)这样的在3'末端含有五元环胍桥式人工核酸的寡核苷酸显示极高的核酸酶抗性。
(实施例11)寡核苷酸类似物的熔解温度(Tm)的测定
对于以下的表9中记载的化合物33(由10mer的OligodT构成的天然型寡核苷酸)；化合物29～31、42和43(含有化合物28的胍桥式核酸的寡核苷酸类似物)；以及化合物44～48(含有LNA-T的寡核苷酸)，对10mer的PolyA进行退火处理而形成复合物后，测定复合物的50％解离的温度Tm值，由此，研究寡核苷酸的杂交形成能力。
对化合物29～31、42和43而言，利用反相简易柱的精制后的TFA处理使用TFA75％代替TFA50％，除此以外，如实施例5中记载那样进行合成和精制。化合物44～48为Gene Design Inc.制。
关于复合物形成和Tm值的测定，使用含有KCl 200mM、二甲胂酸钾缓冲液(pH6.8)20mM、寡核苷酸4μM和靶链4μM的样品溶液(130μL)，除此以外，与实施例6同样地进行。将结果示于表9。表9以m值和每修饰单位的Tm值差表示与天然型寡核苷酸和含有各种数量的LNA的寡核苷酸相比，含有各种数量的胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物对于PolyA的杂交形成能力。
[表9]
*1 t：胍桥式核酸T:LNA
*2 靶链序列：5’-(AAAAAAAAAA)-3’
*2 条件：20mM二甲胂酸钾缓冲液(pH 6.8),200mM KCl,4μM寡核苷酸,0.5℃/分钟(260nm)
由表9可知，在将RNA作为靶的情况下，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物与天然型寡核苷酸相比，显示足够高的结合亲和性。并且，可知在人工核酸的导入数为3个残基以下的情况下，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物与含有LNA的寡核苷酸为通过同等程度的Tm值，但导入了5个残基的胍桥式人工核酸的寡核苷酸与导入了5个残基LNA的情况相比，显示较高的结合亲和性。比较每1个残基的Tm值的上升，可知在导入了LNA的情况下，不论导入数，Tm值的上升均为6℃～7℃，另一方面，在导入了胍桥式人工核酸的情况下，随着导入数增加，每1个残基的Tm值的上升增大。由此表明，由桥连结构对结合亲和性带来的影响是叠加的，而由源自胍的阳离子对结合亲和性带来的影响是协同的。另外，可知在将DNA作为靶的情况下，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸显示极高的结合亲和性，具有远高于天然型寡核苷酸或含有LNA的寡核苷酸的结合亲和性。
(实施例12)寡核苷酸类似物的靶碱基识别能力的评价
对于表9的导入了5个残基的胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物(化合物43)和导入了5个残基的LNA的寡核苷酸(化合物48)，评价分别对于具有完全互补序列的DNA靶链(完全匹配型)和具有1个碱基错配的DNA靶链(错配型)的结合亲和性。靶链的序列为，完全匹配型：5'-(AAAAAAAAAA)-3'、错配型：5'-(AAAAATAAAA)-3'。结合亲和性通过与实施例11同样地进行退火处理而形成复合物后测定复合物的50％解离的温度Tm值来评价。
将结果示于图3。图3表示含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物和含有LNA的寡核苷酸分别对于具有完全互补序列的DNA靶链(完全匹配型)和具有1个碱基错配的DNA靶链(错配型)的Tm曲线。图3的纵轴表示260nm的吸光度，横轴表示温度(℃)。分别表示含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物(化合物43)对于错配型(细单线)和完全匹配型(细单虚线)、以及含有LNA的寡核苷酸(化合物48)对于错配型(粗单线)和完全匹配型(粗单虚线)的结果。
由图3可知，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸类似物(化合物43)对于错配型靶链的Tm值比对于完全匹配型靶链的Tm值低很多，其Tm值的下降与含有LNA的寡核苷酸(化合物48)的情况为同等程度。由此可知，含有胍桥式人工核酸的寡核苷酸不会损害靶碱基识别能力，与靶链具有非常高的结合亲和性。
(实施例13)有关胍桥式人工核酸(以下，有时称为GuNA)的细胞内动态的评价
(1)荧光标记GuNA修饰寡核苷酸(F-GuNA-ODN)的合成和鉴定
首先，使用实施例4中得到的化合物28、天然型核苷和后述的用于荧光修饰的酰胺体(amidite)并利用DNA/RNA寡核苷酸自动合成机nS-8(Gene Design Inc.制)合成寡核苷酸类似物。合成的寡核苷酸类似物是成为表10所示的化合物53～57的前体(化合物49)的化合物。该前体(化合物49)的结构如下。
在寡核苷酸的自动合成中，胸苷酰胺体(thymidine amidite)(型号：T111081)和胸苷CPG固相载体(型号：T361010)、CapA(型号：L840020-06)、CapB(型号：L850020-06)、氧化剂(型号：L860020-06)均由SAFC(注册商标)、Proligo(注册商标)、Reagents获得。乙腈(型号：018-14451)和解封闭溶液(型号：042-28921)由和光纯药工业株式会社购入。活化剂使用0.25M 5-乙硫基-1H-四唑/无水乙腈(制造商代码：30-3140-52，Glen Research公司制)。化合物28的乙腈溶液(0.1M)的偶联时间为20分钟，另外，在将化合物28以3碱基连续的方式导入寡核苷酸的情况下，仅第3个碱基进行了双偶联。除此以外，在与天然的DNA合成相同条件下进行。
另外，对于荧光修饰，在使用荧光剂的酰胺体导入寡核苷酸的情况下，在之后的利用75％三氟乙酸(TFA)的处理时，荧光剂可能发生水解。因此，首先，利用DNA自动合成机将如下结构式所示的酰胺体Thiol-Modifer C6S-S(制造商代码：10-1936-90，Glen Research)附加于寡核苷酸的5'末端侧，且不将保护基二甲氧基三苯甲基(DMTr基)脱保护而结束，由此得到荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物53～57)的前体(化合物49)。另外，确认了酰胺体Thiol-Modifer C6S-S的二硫键对于75％TFA具有充分的耐性。
为了进行比较，购入并使用含有脲桥式人工核酸2',4'-BNA/LNA(5-甲基-2'-O,4'-C-亚甲基尿苷的寡核苷酸类似物(化合物58～61：示于以下的表10)(Gene Design Inc.制)代替化合物28。该寡核苷酸类似物的前体(化合物50)的结构如下。
5′-HO-C6-S-S-C6-寡核苷酸-3′   (化合物50)
使用28％氨水溶液从CPG载体中提取所得到的前体(化合物49)，使用NAP-10柱(代码编号：17-0854-01，GE Healthcare)除去氨，通过RP-HPLC进行精制，并进行冷冻干燥。RP-HPLC使用ShimadzuLC-10ATVP，ShimadzuSPD-10AVP,ShimadzuCTO-10VP在以下所示的条件下进行。
流动相
A液：0.1M乙酸三乙铵缓冲液，pH7.0
B液80％乙腈/0.1M乙酸三乙基铵缓冲液
梯度：
B液浓度:0-100％(80分钟)
使用柱：
Waters XBridgeTM OST C18 2.5μm(10×50mm产品编号：186003954)
流速：3.0mL/分钟
柱温：50℃
检测：UV(254nm)
接着，添加75％三氟乙酸，在室温下处理6小时，由此由如上精制获得的前体(化合物49)进行Boc基和DMTr基的脱保护，然后，利用NAP-10柱除去三氟乙酸，进行冷冻干燥，得到脱保护了的前体(化合物50)。
对于上述脱保护了的前体(化合物50)，依据Thiol-Modifer C6S-S的方案，添加100mM DTT/TE缓冲液(pH7.0)并在室温下将二硫键还原2小时，生成SH基。将得到的还原后的前体(化合物51)利用RP-HPLC(B液:50％乙腈/0.1M乙酸三乙铵缓冲液；梯度：B液浓度0-50％/25分钟)进行精制、分配。得到的还原后的前体(化合物51)的结构如下。
5′-HS-C6-寡核苷酸-3′   (化合物51)
在上述通过还原生成SH基并进行了精制的前体(化合物51)中，相对于前体(化合物51)添加10等量的以下结构式所示的Alexa Fluor488 C5马来酰亚胺(产品代码：A-10254，Life technologies公司制)，使其在室温下反应过夜，使SH基和马来酰亚胺结合(Nucleic AcidsResearch，36，2764-2776，2008)。
然后，利用RP-HPLC(B液：50％乙腈/0.1M乙酸三乙铵缓冲液；梯度：B液浓度0-50％/25分钟)进行精制，得到荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物52：化合物53～61)。另外，其中，化合物54～57为荧光标记GuNA修饰寡核苷酸(F-GuNA-ODN)。得到的荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物52)的结构如下。
合成的荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物53～61)的精制和纯度确认与实施例2同样地进行。
合成的荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物53～61)的质谱分析利用MALDI-TOF-MS(SpiralTOF JMS-S3000，JEOL)进行。将结果示于表10。
[表10]
*1 T：GuNA*1 T：2’,4’-BNA/LNA S：thiol F：Alexa Fluor 488
*2 未测
(2)荧光标记GuNA修饰寡核苷酸F-GuNA-ODN向人肝癌细胞(HuH-7)的导入和该细胞内动态的观察
首先，作为前期准备，在细胞观察用的玻璃底培养皿(品种代码：3970-035，Iwaki)的玻璃部分添加1mL的100μg/mL胶原/盐酸(pH 3.0)(Cellmatrix Type I-C，Nitta Gelatin Inc.制)，由此进行胶原涂布。
将其在室温下静置30分钟后，除去胶原，用磷酸缓冲生理盐水清洗1次后，在室温下干燥1小时。接着，接种4.5×105个HuH-7细胞(由JCRB Cell Bank购入(细胞编号：JCRB0403))，在不含酚红的培养基10％FBS/DMEM(产品编号：08490-05，Nacalai Tesque,Inc.制)下进行过夜培养(5％CO2)，然后，分别以500nM的浓度添加上述(1)中得到的荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物53～61)。
在添加荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物53～61)后，再持续培养12小时，然后，将经过培养的HuH-7细胞用汉克斯平衡盐溶液(HBSS，产品编号：14025-092，Life technologies公司制)清洗1次，依据方案使用Hoechst 33342(产品编号：H3570，Life technologies公司制)和Lyso Tracker(注册商标)Red DND-99(目录编号：L-7528，Life technologies公司制)将核和溶酶体染色。然后，添加2mL汉克斯平衡盐溶液，使用落射型荧光显微镜(BX-9000，Keyence Corporation制)获得荧光图像。另外，物镜使用40×相位差透镜(S Plan Fluor，株式会社尼康制)。
各荧光剂的检测滤光片组和曝光时间如下所示。
Alexa Fluor 488：Ex 470/40nm，DM 495nm，BA 535/50nm(GFP-B，Keyence Corporation制)，5秒
Hoechst 33342：Ex 360/40nm，DM 400nm，BA 460/50nm(DAPI-B、Keyence Corporation制)，2秒
Lyso Tracker(注册商标)Red DND-99：Ex 540/25nm，DM565nm，BA 605/55nm(TRITC，Keyence Corporation制)，1.2秒
将荧光标记修饰寡核苷酸类似物(化合物53～61)导入HuH-7细胞，结果，在添加导入了6个残基的化合物28的化合物57和导入了6个残基的2',4'-BNA/LNA的化合物61这2种寡核苷酸的情况下，在细胞内观察到特别强的荧光发光。对于其它的寡核苷酸，与它们相比，荧光发光较弱。将表示化合物57(A～D)和化合物61(E～H)的HuH-7细胞内的动态的显微镜照片示于图4。A、E为相位差图像，B、F为Alexa Fluor 488(寡核苷酸)的荧光图像，C、G为Hoechst 33342(核)的荧光图像，D、H为LysoTracker(溶酶体)的荧光图像(比例尺50μm)。在使用导入了6个残基的化合物28的化合物57的寡核苷酸的情况下，确认到强的荧光发光(图4B)。与此相对，在使用导入了6个残基的2',4'-BNA/LNA的化合物61的寡核苷酸的情况下，虽然显示一定程度的荧光发光，但与使用了化合物28的化合物57相比，荧光发光较弱(图4F)。可以认为这是因为：在化合物57中，通过导入6个残基的化合物28，向细胞的导入效率得到提高，并且寡核苷酸整体的电荷发生变化，使得向细胞表面的吸附效率提高的缘故。与此相对，可以认为在化合物61中，通过导入了6个残基的2',4'-BNA/LNA，向细胞的导入效率得到提高，但由于电荷未发生变化，因而向细胞表面的吸附效率未得到提高，相应地，与化合物57相比，荧光发光较弱。
接着，将化合物57的HuH-7细胞内的动态的显微镜照片、对于图4A～D将图4B的箭头所示区域进行了放大的照片(A～D)示于图5。详细地观察得到的荧光发光在细胞内的定位可知，添加的寡核苷酸不存在于核内，而是大量蓄积于细胞质内的内质网内，在溶酶体内也大量存在。
由以上可以证明，相对于带负电荷的寡核苷酸，通过赋予带正电荷的胍基来改变寡核苷酸整体的电荷，是提高寡核苷酸自身的细胞导入效率的有效的方法。
另外，从酶抗性或细胞透过性的方面考虑，在现有技术中，在不使用药物递送系统的前提下将寡核苷酸导入细胞内是非常困难的。作为用于改善这种情况的方法，广泛使用对寡核苷酸的磷酸骨架实施磷硫酰修饰的方法。然而，在磷硫酰修饰中，由于磷原子上产生的手性的问题，担心生产方面、安全方面、药效降低。现在，可以在不实施磷硫酰修饰而提高细胞内透过性，因而可知本发明的具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸克服了这些缺陷，有助于核酸的医药品化。
工业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种对于靶核酸具有高结合亲和性和特异性、且显示高的核酸酶抗性的寡核苷酸用的核酸分子。这样的核酸分子作为期待用作疾病的新的治疗方法或预防方法的反义法、反义基因法、使用适配子的方法、使用siRNA的方法等中使用的核酸医药的原料做出了很大贡献。

Claims (6)

1.一种化合物或其盐，其由以下的式I或II表示：
式I或II中，
B1表示具有1个以上选自α群中的任意取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，在此，该α群包括羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基所保护的氨基和卤原子；
R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
并且，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基、具有可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基所保护的磷酸基、-P(R4)R5，式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、和/或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于：
在所述式I或II中，所述B1为6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基或4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于：
在所述式I或II中，所述B1为2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基。
4.一种寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其含有至少1个下述的式I'或II'所示的核苷结构：
式I'或II'中，
B1表示可以具有1个以上选自α群中的任意取代基的嘌呤-9-基或2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基，在此，该α群包括羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基所保护的氨基和卤原子；
R1、R12和R13分别独立地表示氢原子、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、氨基的保护基、或
且R14表示氢原子；并且，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基、具有可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基且可以含有杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α群中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基所保护的磷酸基、-P(R4)R5，式中，R4和R5分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基所保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基所保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基、和/或由碳原子数1～6的烷基所取代的氨基。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其特征在于：
在所述式I'或II'中，所述B1为6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基或4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基。
6.根据权利要求4所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其特征在于：
在所述式I'或II'中，所述B1为2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基。
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