ES2622716T3 - Oligonucleótido y nucleósido artificial en puente con guanidina - Google Patents
Oligonucleótido y nucleósido artificial en puente con guanidina Download PDFInfo
- Publication number
- ES2622716T3 ES2622716T3 ES13838365.8T ES13838365T ES2622716T3 ES 2622716 T3 ES2622716 T3 ES 2622716T3 ES 13838365 T ES13838365 T ES 13838365T ES 2622716 T3 ES2622716 T3 ES 2622716T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- group
- amino
- nucleic acid
- compound
- oxo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
Abstract
Un compuesto representado por la fórmula I o II a continuación o una sal del mismo:**Fórmula** (en donde B1 representa un grupo purina-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1-ilo que puede tener uno cualquiera o más sustituyentes seleccionados de un grupo α, en donde el grupo α consiste en un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la síntesis del ácido nucleico, un grupo alquilo lineal C1 a C6, un grupo alcoxi lineal C1 a C6, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la síntesis del ácido nucleico, un grupo alquiltio lineal C1 a C6, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal C1 a C6, un grupo amino protegido por un grupo protector en la síntesis del ácido nucleico, y un átomo de halógeno; R1, R12, y R13 cada uno independientemente representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, o**Fórmula** y R2 y R3 cada uno independientemente representan un átomo de hidrógeno, un grupo protector para un grupo hidroxilo en la síntesis del ácido nucleico, un grupo alquilo C1 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o más sustituyentes seleccionados del grupo α y que puede tener un heteroátomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o más sustituyentes seleccionados del grupo α y que puede ser un heteroátomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o más sustituyentes seleccionados del grupo α, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o más sustituyentes seleccionados del grupo α, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o más sustituyentes seleccionados del grupo α, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la síntesis del ácido nucleico, o -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la síntesis del ácido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la síntesis del ácido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi C1 a C5, un grupo alquiltio C1 a C5, un grupo cianoalcoxi C1 a C6, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo C1 a C6)).
Description
DESCRIPCION
Oligonucleotido y nucleosido artificial en puente con guanidina Campo tecnico
La presente invencion se refiere a nucleosidos y oligonucleotidos artificiales, y se refiere mas espedficamente a 5 nucleosidos y oligonucleotidos artificiales en puente con guanidina.
Antecedentes de la tecnica
Ejemplos de metodos para tratar enfermedades utilizando farmacos de acido nucleico incluyen terapias antisentido, terapias antigenicas, terapias basadas en aptameros, terapias basadas en ARNip, y similares. De estos, las terapias antisentido son aproximaciones para tratar o prevenir enfermedades, que implican la inhibicion de un proceso de 10 traduccion de ARN patogenos introduciendo externamente oligonucleotidos (hebras antisentido) que son complementarios a ARNm asociados a enfermedades para formar hebras dobles. Las terapias basadas en ARNpi son similares a las terapias antisentido, implicando la inhibicion de la traduccion de ARNm a protemas mediante la administracion de ARN de doble hebra en un cuerpo vivo. Mientras tanto, las terapias antigenicas suprimen la transcripcion de ADN a ARN introduciendo externamente oligonucleotidos formadores de triplex correspondientes a 15 sitios de ADN que han de transcribirse en ARN patogenos. Dado que los aptameros son moleculas de acido nucleico cortas (oligonucleotidos), funcionan como unidos a componentes biologicos tales como protemas asociadas a la enfermedad.
Aunque se han desarrollado diversos acidos nucleicos artificiales como materiales para tales farmacos de acido nucleico, todavfa no se ha encontrado ninguna molecula ideal. Ejemplos de los materiales desarrollados para 20 farmacos de acido nucleico hasta la fecha incluyen oligonucleotido (S-oligo) de fosforotioato (S-PO3), acido nucleico 2',4'- en puente (BNA)/acido nucleico 2',4'- bloqueado (LNA) (Documentos de patente 1 a 4 y Documentos no de patente 1 a 4), y similares. S-oligo esta comercialmente disponible en los Estados Unidos como un farmaco antisentido para citomegalovirus. S-oligo tiene una alta resistencia a la nucleasa, pero es problematica y necesita mejoras en cuanto a que su afinidad de union a las hebras de acido nucleico diana es baja. 2',4'-BNA/LNA 25 desarrollado hasta la fecha tiene una alta afinidad de union a las hebras de acido nucleico diana, y proporciona las moleculas mas prometedoras como los materiales para los futuros farmacos de acido nucleico. Sin embargo, todavfa hay margen de mejora en que la resistencia a la nucleasa no es suficiente y la estabilidad en un cuerpo vivo es pobre.
Lista de citas bibliograficas 30 Literatura de Patentes
Literatura de Patente 1: WO 98/39352 Literatura de Patente 2: WO 2005/021570 Literatura de Patente 3: WO 2003/068795 Literatura de Patente 4: WO 2011/052436 35 Literatura de No Patente
Literatura de No Patente 1: C. Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 10, pp.5633-5638 Literatura de No Patente 2: Y. Hari et al., Bioorg. Med. Chem., 2006, Vol. 14, pp.1029-1038 Literatura de No Patente 3: K. Miyashita et al., Chem. Commun., 2007, pp.3765-3767 Literatura de No Patente 4: S.M.A. Rahman et al, J. Am. Chem. Soc., 2008, Vol., 130, No. 14, pp.4886-4896 40 Literatura de No Patente 5: M. Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., 2008, Vol. 36, No. 13, pp.4257-4265 Literatura de No Patente 6: S. Obika et al., Bioorg. Med. Chem., 2001, Vol. 9, pp.1001-1011
En J. Synth. Org. Chem., 57, 11, 1999, 969-980, Takeshi Imanishi describe la smtesis y el analisis conformacional de diversos analogos de nucleosidos bidclicos. Estos se introdujeron en oligonucleotidos para proporcionar candidatos para moleculas antisentido/antigenico.
5
10
15
20
25
30
La WO 03/068795, tambien en nombre de Takeshi Imanishsi, describe un analogo de nucleosido para producir un analogo de oligonucleotido con potencial de uso en el metodo antisentido y para producir un intermedio.
Kazuyuki Miyashita, en Chem. Commun, 2007, 3765-3767, describe oligonucleotidos modificados con un analogo de BNA, concretamente 2',4'-BNANC[N-Me]. Estos muestran alta afinidad de ARN y la selectividad y resistencia a la degradacion de nucleasa.
La WO 2011/052436, en nombre de la Universidad de Osaka, describe un nucleosido artificial que tiene un enlace amida en una estructura en puente con 2',4'-BNA/LNA, que tiene una fuerte afinidad de union para un ARN de hebra unica y resistencia a la nucleasa.
Masaru Nishida, en Chem Comun., 2010, 46, 5283-5285 describe la introduccion de un nuevo acido nucleico en puente que lleva estructura de urea ciclica en un oligonucleotido. El producto mostro habilidad de hibridacion selectiva y cierta resistencia a la degradacion de nucleasa.
Como se ha discutido anteriormente, se necesita una mejora adicional en la provision de farmacos antisentido en particular para mejorar la resistencia a las nucleasas y la estabilidad en el cuerpo.
Resumen de la invencion
Problemas a resolver por la invencion
Es un objeto de la presente invencion proporcionar una molecula de acido nucleico para un oligonucleotido que tiene una alta afinidad de union y una alta especificidad a un acido nucleico diana y que muestra una alta resistencia a nucleasa.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores realizaron la presente invencion basandose en el hallazgo de que un oligonucleotido que contiene un acido nucleico obtenido introduciendo guanidina en una estructura de puente de 2',4'-BNA/LNA 20 tiene particularmente una alta afinidad de union y una alta especificidad a los ADN y muestra una alta resistencia de la nucleasa.
La presente invencion proporciona un compuesto representado por la formula I o II a continuacion o una sal del mismo:
(en donde Bi representa un grupo purina-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1-ilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados de un grupo a, en donde el grupo a consiste en un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo lineal Ci a C6, un grupo alcoxi lineal Ci a C6, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquiltio lineal Ci a C6, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal Ci a C6, un grupo amino protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, y un atomo de halogeno;
5
10
15
20
25
30
R1, R12 y R13 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, o
y
R2 y R3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, o -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi Ci a C5, un grupo alquiltio Ci a C5, un grupo cianoalcoxi Ci a Ca, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca)).
En una realizacion, en la formula I o II anterior, Bi representa un grupo a-aminopurina-9-ilo, un grupo 2,6- diaminopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-cloropurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2-amino- a-bromopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-hidroxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-metoxipurina-9-ilo, un grupo 6- amino-2-cloropurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2,6-dimetoxipurina-9-ilo, un grupo 2,6- dicloropurina-9-ilo, un grupo 6-mercaptopurina-9-ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 4- amino-2-oxo-5-fluoro-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-cloro-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-metoxi-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-mercapto-i, 2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4- hidroxi-i,2-dlhidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, o un grupo 4-amino-5- metil-2-oxo-i,2-dihidropirimidina-i-ilo.
En una realizacion, en la formula I o II anterior, Bi representa un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2-dihidropirimidina- i-ilo.
La presente invencion tambien proporciona un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II' a continuacion o una sal farmacologicamente aceptable del mismo:
5
10
15
20
25
(en donde Bi representa un grupo purina-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1-ilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados de un grupo a, en donde el grupo a consiste en un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo lineal C1 a Ca, un grupo alcoxi lineal Ci a Ca, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquiltio lineal C1 a Ca, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal C1 a Ca, un grupo amino protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, y un atomo de halogeno;
R1, R12, y R13 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, o
R14 representa un atomo de hidrogeno; y
R2 y R3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo C1 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, o -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi C1 a C5, un grupo alquiltio C1 a C5, un grupo cianoalcoxi C1 a Ca, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo C1 a Ca)).
En una realizacion, en la formula I' o II' anterior, B1 representa un grupo a-aminopurina-9-ilo, un grupo 2,6- diaminopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-cloropurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2-amino- a-bromopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-hidroxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-metoxipurina-9-ilo, un grupo 65
5
10
15
20
25
30
35
40
45
amino-2-cloropurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2,6-dimetoxipurina-9-ilo, un grupo 2,6- dicloropurina-9-ilo, un grupo 6- mercaptopurina-9-ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-1,2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 4- amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidina- 1-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-cloro-1,2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-metoxi-1, 2-dihidropirimidina- 1-ilo, un grupo 2-oxo-4-mercapto-1,2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4- hidroxi-1,2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-1,2-dihidropirimidina-1-ilo, o un grupo 4-amino-5- metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1-ilo.
En una realizacion, en la formula I' o II' anterior, Bi representa un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metiM,2-dihidropirimidina- 1-ilo.
Efectos de la invencion
La presente invencion puede proporcionar una molecula de acido nucleico para un oligonucleotido que tiene una elevada afinidad de union y una alta especificidad para un acido nucleico diana y que muestra una alta resistencia a la nucleasa.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un grafico que muestra un cambio en el tiempo en el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar cuando diversos oligonucleotidos que tienen la secuencia 5'-d(TTTTTTTTXT)-3' se trataron con 3' exonucleasa.
La figura 2 es un grafico que muestra un cambio en el tiempo en el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar cuando se trataron diversos oligonucleotidos que tienen la secuencia 5'-d(TTTTTTTTX)-3' con 3' exonucleasa.
La figura 3 es un grafico que muestra las curvas de Tm de un analogo de oligonucleotido que contiene un acido nucleico artificial en puente con guanidina y un oligonucleotido que contiene un LNA, con respecto a las hebras diana de ADN que tienen una cadena totalmente complementaria (coincidencia completa) y hebras diana de ADN que tienen apareamiento erroneo de base unica (apareamiento erroneo).
La figura 4 muestra microfotograffas de penetracion celular del compuesto 57 (A a D) y del compuesto 61 (E a H) en celulas HuH-7: donde A y E son imagenes de contraste de fase; B y F son imagenes de fluorescencia utilizando Alexa Fluor 488 (oligonucleotidos); C y G son imagenes de fluorescencia de Hoechst 33342 (nucleos); y D y H son imagenes de fluorescencia utilizando LysoTracker (lisosomas).
La figura 5 muestra microfotograffas de penetracion celular del compuesto 57 en celulas HuH-7, mostrando fotograffas (A a D) obtenidas agrandando la region indicada por la flecha en la figura 4B, en las Figs. 4A a 4D.
Modos para llevar a cabo la invencion
En lo sucesivo, se definiran los terminos utilizados en esta memoria descriptiva.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo alquilo lineal Ci a C6" se refiere a cualquier grupo alquilo lineal con 1 a 6 atomos de carbono, y ejemplos espedficos de los mismos incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n- propilo, un grupo n-butilo, un grupo n-pentilo y un grupo n-hexilo.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo alcoxi lineal C1 a C6" abarca un grupo alcoxi que tiene cualquier grupo alquilo lineal que tiene de 1 a 6 atomos de carbono. Ejemplos de los mismos incluyen un grupo metoxi, un grupo etoxi y un grupo n-propoxi.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo alquiltio lineal C1 a C6" abarca un grupo alquiltio que tiene cualquier grupo alquilo lineal con 1 a 6 atomos de carbono. Ejemplos de los mismos incluyen un grupo metiltio, un grupo etiltio y un grupo n-propiltio.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo alquilamino lineal C1 a C6" abarca un grupo amino que tiene uno cualquiera del grupo alquilo lineal con 1 a 6 atomos de carbono o cualquiera de dos grupos alquilo lineales identicos o diferentes con 1 a 6 atomos de carbono. Ejemplos de los mismos incluyen un grupo metilamino, un grupo dimetilamino, un grupo etilamino, un grupo metiletilamino y un grupo dietilamino.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo alquilo C1 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo" abarca cualquier grupo alquilo lineal con 1 a 7 atomos de carbono, cualquier grupo alquilo ramificado con 3 a 7 atomos de carbono que tiene cadenas ramificadas identicas o diferentes, cualquier grupo alquilo dclico con 3 a 7 atomos de carbono y cualquier combinacion de los mismos con 4 a 7 atomos de carbono. Ejemplos de cualquier grupo alquilo lineal con 1 a 7 atomos de carbono incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo n-butilo, un grupo n-pentilo, un grupo n-hexilo y un grupo n-heptilo. Ejemplos de cualquier grupo alquilo ramificado con 3 a 7 atomos de carbono que tienen cadenas ramificadas identicas o diferentes incluyen un grupo isopropilo, un grupo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
isobutilo, un grupo ferf-butilo y un grupo isopentilo. Ejemplos de cualquier grupo alquilo dclico con 3 a 7 atomos de carbono incluyen un grupo ciclobutilo, un grupo ciclopentilo y un grupo ciclohexilo.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo" abarca cualquier grupo alquenilo lineal con 2 a 7 atomos de carbono, cualquier grupo alquenilo ramificado con 2 a 7 atomos de carbono, cualquier grupo alquenilo dclico con 3 a 7 atomos de carbono, y cualquier combinacion de los mismos con 4 a 7 atomos de carbono. Ejemplos de cualquier grupo alquenilo lineal con 2 a 7 atomos de carbono incluyen un grupo etenilo, un grupo 1-propenilo, un grupo 2-propenilo, un grupo 1 -butenilo, un grupo 2-butenilo, un grupo 1- pentenilo, un grupo 2-pentenilo, un grupo 3-pentenilo, un grupo 4-pentenilo y un grupo 1-hexenilo. Ejemplos de cualquier grupo alquenilo ramificado con 3 a 7 atomos de carbono incluyen un grupo isopropenilo, un grupo 1-metil- 1-propenilo, un grupo 1-metil-2-propenilo, un grupo 2-metil-1-propenilo, un grupo 2-metil-2-propenilo, y un grupo 1- metil-2-butenilo. Ejemplos de cualquier grupo alquenilo dclico con 3 a 7 atomos de carbono incluyen un grupo ciclobutenilo, un grupo ciclopentenilo y un grupo ciclohexenilo.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo arilo que puede tener un heteroatomo" abarca cualquier compuesto hidrocarburo aromatico con 6 a 12 atomos de carbono que consiste solo en hidrocarburo, y cualquier compuesto heteroaromatico que tenga cualquier estructura de anillo con 6 a 12 atomos de carbono en el que uno o mas atomos de carbono que forman la estructura de anillo estan sustituidos con heteroatomos identicos o diferentes (por ejemplo, un atomo de nitrogeno, un atomo de oxfgeno o un atomo de azufre). Ejemplos del compuesto de hidrocarburo aromatico con 6 a 12 atomos de carbono que consiste solo en hidrocarburo incluyen un grupo fenilo, un grupo naftilo, un grupo indenilo y un grupo azulenilo. Ejemplos del compuesto heteroaromatico incluyen un anillo de piridina, un anillo de pirrolina, un anillo de quinolina, un anillo de indolina, un anillo de imidazolina, un anillo de purina y un anillo de tiofeno. Ejemplos del anillo de piridina incluyen un anillo de pirimidina, un anillo de piperidina, un anillo de quinolina y un anillo de acridina.
En esta memoria descriptiva, el termino "grupo aralquilo que tiene una unidad estructural heteroarilo que puede tener un heteroatomo" abarca cualquier compuesto hidrocarburo aromatico con 5 a 12 atomos de carbono que consiste solo en hidrocarburo, y cualquier compuesto heteroaromatico que tenga cualquier estructura de anillo con 5 a 12 atomos de carbono en los que uno o mas atomos de carbono que forman la estructura de anillo estan sustituidos con heteroatomos identicos o diferentes (por ejemplo, atomo de nitrogeno, atomo de oxfgeno o atomo de azufre). Ejemplos del termino "grupo aralquilo que tiene una unidad estructural heteroarilo que puede tener un heteroatomo" incluyen un grupo bencilo, un grupo fenetilo, un grupo naftilmetilo, un grupo 3-fenilpropilo, un grupo 2-fenilpropilo, un grupo 4-fenilbutilo, un grupo 2-fenilbutilo, un grupo piridilmetilo, un grupo indolilmetilo, un grupo furilmetilo, un grupo tienilmetilo, un grupo pirrolilmetilo, un grupo 2-piridiletilo, un grupo 1 -piridiletilo y un grupo 3-tienilpropilo.
En esta memoria descriptiva, los ejemplos del termino "grupo acilo" incluyen un grupo acilo alifatico y un grupo acilo aromatico. Ejemplos espedficos del grupo acilo alifatico incluyen: grupos alquilcarbonilo tales como un grupo formilo, un grupo acetilo, un grupo propionilo, un grupo butirilo, un grupo isobutirilo, un grupo pentanoilo, un grupo pivaloilo, un grupo valerilo, un grupo isovalerilo, un grupo isovalerilo, un grupo octanoflo, un grupo nonanoflo, un grupo decanoflo, un grupo 3-metilnonanoflo, un grupo 8-metilnonanoflo, un grupo 3-etiloctanoflo, un grupo 3,7- dimetiloctanoflo, un grupo undecanoflo, un grupo dodecanoflo, un grupo tridecanoflo, un grupo tetradecanoflo, un grupo pentadecanoflo, un grupo hexadecanoflo, un grupo 1-metilpentadecanoMo, un grupo 14-metilpentadecanoMo, un grupo 13,13-dimetiltetradecanoMo, un grupo heptadecanoflo, un grupo 15-metilhexadecanoflo, un grupo octadecanoflo, un grupo 1-metilheptadecanoMo, un grupo nonadecanoflo, un grupo eicosanoflo y un grupo heneicosanoflo; grupos alquilcarbonilo carboxilados tales como un grupo succinilo, un grupo glutarilo y un grupo adipoilo; grupos carbonilo sustituidos con un grupo alquilo C1 a C6 sustituido con un atomo de halogeno tal como un grupo cloroacetilo, un grupo dicloroacetilo, un grupo tricloroacetilo, y un grupo trifluoroacetilo; grupos alcoxialquilcarbonilo C1 a C6 tales como un grupo metoxiacetilo; y grupos alquilcarbonilo insaturados tales como un grupo (E)-2-metil-2-butenoflo. Ejemplos del grupo acilo aromatico incluyen: grupos arilcarbonilo tales como un grupo benzoilo, un grupo a-naftoflo y un grupo a-naftoflo; grupos halogenoarilcarbonilo tales como un grupo 2- bromobenzoflo y un grupo 4-clorobenzoflo; grupos arilcarbonilo sustituidos con un grupo alquilo C1 a C6 tal como un grupo 2,4,6-trimetilbenzoilo y un grupo 4-toluoilo; grupos arilcarbonilo sustituidos con un grupo alcoxi C1 a C6 tal como un grupo 4-anisoflo; grupos arilcarbonilo carboxilados tales como un grupo 2-carboxibenzoilo, un grupo 3- carboxibenzoilo y un grupo 4-carboxibenzoilo; grupos arilcarbonilo nitrados tales como un grupo 4-nitrobenzoilo y un grupo 2-nitrobenzoilo; grupos arilcarbonilo carbonilados sustituidos con un grupo alcoxi C1 a C6 tal como un grupo 2- (metoxicarbonil) benzoilo; y grupos arilcarbonilo arilados tales como un grupo 4-fenilbenzoilo.
En esta memoria descriptiva, los ejemplos del termino "grupo sililo" incluyen: grupos sililo sustituidos con tres grupos alquilo C1 a C6 tales como un grupo trimetilsililo, un grupo trietilsililo, un grupo isopropildimetilsililo, un grupo f- butildimetilsililo, un grupo metildiisopropilsililo, un grupo metil di-f-butilsililo, y un grupo triisopropilsililo; y grupos sililo sustituidos con tres grupos alquilo C1 a C6 sustituidos con uno o dos grupos arilo tales como un grupo difenilmetilsililo, un grupo butildifenilbutilsililo, un grupo difenilisopropilsililo y un grupo fenildisopropilsililo.
En esta memoria descriptiva, los ejemplos del termino "atomo de halogeno" incluyen un atomo de fluor, un atomo de cloro, un atomo de bromo y un atomo de yodo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En esta memoria descriptiva, no hay ninguna limitacion en el termino "grupo protector" en "un grupo protector para un grupo amino en la smtesis del acido nucleico", "un grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico", "un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico", "un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico", y "un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico", siempre que pueda proteger de manera estable un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato o un grupo mercapto en la smtesis del acido nucleico. Espedficamente, el grupo protector se refiere a aquellos que son estables en condiciones acidas o neutras y se pueden erscindir por metodos qmmicos tales como hidrogenolisis, hidrolisis, electrolisis y fotolisis. Ejemplos del grupo protector incluyen: un grupo alquilo Ci a C6; un grupo alquenilo Ci a C6; un grupo acilo; un grupo tetrahidropiranilo y un grupo tetrahidrotiopiranilo; un grupo tetrahidrofuranilo y un grupo tetrahidrotiofuranilo; un grupo sililo; un grupo metilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a C6; un grupo metilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a C6 sustituido con un grupo alcoxi Ci a C6; un grupo metilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a C6 sustituido con un atomo de halogeno; un grupo etilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a C6; un grupo etilo sustituido con un atomo de halogeno; un grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo; un grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca, un grupo alcoxi Ci a Ca, un atomo de halogeno, y/o un grupo ciano; un grupo carbonilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca; un grupo arilo sustituido con un atomo de halogeno, un grupo alcoxi Ci a Ca, y/o un grupo nitro; un grupo carbonilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca sustituido con un grupo sililo sustituido con un atomo de halogeno y/o tres grupos alquilo Ci a Ca; un grupo alqueniloxicarbonilo; y un grupo aralquiloxicarbonilo que puede estar sustituido con un grupo arilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca y/o un grupo nitro.
Ejemplos mas espedficos del grupo tetrahidropiranilo o del grupo tetrahidrotiopiranilo incluyen un grupo tetrahidropiran-2-ilo, un grupo 3-bromotetrahidropiran-2-ilo, un grupo 4-metoxitetrahidropiran-4-ilo, un grupo tetrahidrotiopiran-4-ilo, y un grupo 4-metoxitetrahidrotiopiran-4-ilo. Ejemplos del grupo tetrahidrofuranilo o del grupo tetrahidrotiofuranilo incluyen un grupo tetrahidrofuran-2-ilo y un grupo tetrahidrotiofuran-2-ilo. Ejemplos del grupo metilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca incluyen un grupo metoximetilo, un grupo i,i-dimetil-i-metoximetilo, un grupo etoximetilo, un grupo propoximetilo, un grupo isopropoximetilo, un grupo butoximetilo y un grupo t- butoximetilo. Ejemplos del grupo metilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca incluyen un grupo 2-metoxietoximetilo. Ejemplos del grupo metilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca sustituido con un atomo de halogeno incluyen un grupo 2,2,2-tricloroetoximetilo, un grupo bis (2-cloroetoxi) metilo. Ejemplos del grupo etilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca incluyen un grupo i-etoxietilo y un grupo i- (isopropoxi) etilo. Ejemplos del grupo etilo sustituido con un atomo de halogeno incluyen un grupo 2,2,2-tricloroetilo. Ejemplos del grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo incluyen un grupo bencilo, un grupo a-naftilmetilo, un grupo p- naftilmetilo, un grupo difenilmetilo, un grupo trifenilmetilo, un grupo a-naftildifenilmetilo y un grupo 9-antrilmetilo. Ejemplos del "grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo sustituidos con un grupo alquilo Ci a Ca, un grupo alcoxi Ci a Ca, un atomo de halogeno y/o un grupo ciano" incluyen un grupo 4-metilbencilo, un grupo 2,4,a- trimetilbencilo, un grupo 3,4,5-trimetilbencilo, un grupo 4-metoxibencilo, un grupo 4-metoxifenildifenilmetilo, un grupo 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo, un grupo 2-nitrobencilo, un grupo 4-nitrobencilo, un grupo 4-clorobencilo, un grupo 4- bromobencilo y un grupo 4-cianobencilo. Ejemplos del grupo carbonilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca incluyen un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un grupo t-butoxicarbonilo y un grupo isobutoxicarbonilo. Ejemplos del "grupo arilo sustituido con un atomo de halogeno, un grupo alcoxi Ci a Ca y/o un grupo nitro" incluyen un grupo 4-clorofenilo, un grupo 2-fluorofenilo, un grupo 4-metoxifenilo, un grupo 4-nitrofenilo, y un grupo 2,4- dinitrofenilo. Ejemplos del "grupo carbonilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca sustituido con un grupo sililo sustituido con un atomo de halogeno y/o tres grupos alquilo Ci a Ca" incluyen un grupo 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo y un grupo 2-trimetilsililetoxicarbonilo. Ejemplos del grupo alqueniloxicarbonilo incluyen un grupo viniloxicarbonilo y un grupo ariloxicarbonilo. Ejemplos del "grupo aralquiloxicarbonilo que puede estar sustituido con un grupo arilo sustituido con un grupo alcoxi Ci a Ca y/o un grupo nitro" incluyen un grupo benciloxicarbonilo, un grupo 4- metoxibenciloxicarbonilo, un grupo 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, un grupo 2-nitrobenciloxicarbonilo y un grupo 4- nitrobenciloxicarbonilo.
Ejemplos del "grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico" incluyen un grupo acilo alifatico; un grupo acilo aromatico; un grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo; un grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca, un grupo alcoxi Ci a Ca, un atomo de halogeno, y/o un grupo ciano; y un grupo sililo. Ejemplos del grupo protector en el "grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico" incluyen: un grupo acilo alifatico; un grupo acilo aromatico; un grupo metilo sustituido con uno a tres grupos arilo; un grupo arilo sustituido con un atomo de halogeno, un grupo alcoxi Ci a Ca, y/o un grupo nitro; un grupo alquilo Ci a Ca; y un grupo alquenilo Ci a Ca. Ejemplos del "grupo protector para un grupo amino en la smtesis del acido nucleico" incluyen un grupo acilo y un grupo benzoilo. Ejemplos del "grupo protector" en el "grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico" incluyen: un grupo alquilo Ci a Ca sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca y/o un grupo ciano; un grupo aralquilo; un grupo aralquilo sustituido con un grupo arilo sustituido con un grupo nitro y/o un atomo de halogeno; un grupo arilo sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca, un atomo de halogeno, o un grupo nitro; un grupo 2-cianoetilo; un grupo2,2,2-tricloroetilo; un grupo bencilo; un grupo 2-clorofenilo; y un grupo 4-clorofenilo. Ejemplos del "grupo protector" en el "grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico" incluyen un grupo acilo alifatico, un grupo acilo aromatico, y un grupo benzoilo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En esta memoria descriptiva, entre los grupos representados por -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi Ci a C5, un grupo alquiltio Ci a Ca, un grupo cianoalcoxi Ci a Ca, o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca), grupos en los cuales R4 se puede representar por OR4a y R5 se puede representar por NR5a se denominan como "grupo fosforamidito". Ejemplos del grupo fosforamidita incluyen un grupo representado por la formula -P (OC2H4CN)(N(iPr)2) y un grupo representado por la formula -P(OCH3)(N (iPr) 2). En estas formulas, iPr representa un grupo isopropilo.
En esta memoria descriptiva, los terminos “nucleosido artificial” y “analogo de nucleosido” se refieren a un nucleosido de origen no natural en el cual una base de purina o pirimidina esta unida a un azucar (esto es, un nucleosido que no es un nucleosido de origen natural y que solo se puede producir artificialmente), y un nucleosido en el cual un anillo heteroaromatico o un anillo de hidrocarburo aromatico que no es ni purina ni pirimidina y que se puede utilizar en lugar de una base de purina o pirimidina (por ejemplo, no hay limitacion particular, pero sus ejemplos incluyen piridona, hidroxibenceno y aminopiridina) esta unido a un azucar.
En esta memoria descriptiva, los terminos "oligonucleotido artificial" y "analogo de oligonucleotido" se refieren a un derivado de origen no natural de "oligonucleotido" en los cuales 2 a 50 "nucleosidos" o "analogos de nucleosidos" identicos o diferentes estan unidos entre sf a traves de enlace fosfodiester. Ejemplos de tales analogos incluyen: un derivado de azucar en los cuales se modifica la unidad estructural de azucar; un derivado de tioato en los cuales la unidad estructural de diester de fosfato es tioato; un ester en los cuales la unidad estructural fosfato terminal esta esterificado; una amida en los cuales el grupo amino de la base de purina esta amidado; y un derivado de azucar en los cuales se modifica la unidad estructural de azucar.
En esta memoria descriptiva, el termino "una sal de un compuesto representado por la formula I o II" se refiere a una sal de un compuesto representado por la formula I o II de la presente invencion. Ejemplos de dicha sal incluyen: sales metalicas tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio, sales de potasio y sales de litio), sales de metales alcalinoterreos (por ejemplo, sales de calcio y sales de magnesio), sales de aluminio, sales de hierro, sales de zinc, sales de cobre, sales de mquel y sales de cobalto del compuesto representado por la formula I o II; sales de amina tales como sales inorganicas (por ejemplo, sales de amonio) y sales organicas (por ejemplo, sales de f-octilamina, sales de dibencilamina, sales de morfolina, sales de glucosamina, sales de ester de alquilo de fenilglicina, sales de etilendiamina, sales de N-metilglucamina, sales de guanidina, sales de dietilamina, sales de trietilamina, sales de diciclohexilamina, sales de N,N'-dibenciletilendiamina, sales de cloroprocama, sales de procama, sales de dietanolamina, sales de N-bencil-fenetilamina, sales de piperazina, sales de tetrametilamonio, y sales de tris (hidroximetil) aminometano) del compuesto representado por la formula I o II; sales de acidos inorganicos tales como hidrohaluros (por ejemplo, fluorhidrato, clorhidrato, bromhidrato y yodhidrato), nitrato, perclorato, sulfato y fosfato del compuesto representado por la formula I o II; sales de acidos organicos tales como alcanosulfonato con 1 a a atomos de carbono (por ejemplo metanosulfonato, trifluorometanosulfonato y etanosulfonato), arilsulfonato (por ejemplo, bencenosulfonato y p-toluenosulfonato), acetato, malato, fumarato, succinato, citrato, tartrato, oxalato y maleato del compuesto representado por la formula I o II; y sales de aminoacidos tales como sales de glicina, sales de lisina, sales de arginina, sales de ornitina, glutamato y aspartato del compuesto representado por la formula I o II.
En esta memoria descriptiva, el termino "una sal farmacologicamente aceptable de un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II'” se refiere a una sal de un analogo de oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representado por la formula I' o II' de la presente invencion. Ejemplos de tales sales incluyen: sales metalicas tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio, sales de potasio y sales de litio), sales de metales alcalinoterreos (por ejemplo, sales de calcio y sales de magnesio), sales de aluminio, sales de hierro, sales de zinc, sales de cobre, sales de mquel y sales de cobalto de un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II'; sales de amina tales como sales inorganicas (por ejemplo, sales de amonio) y sales organicas (por ejemplo, sales de f-octilamina, sales de dibencilamina, sales de morfolina, sales de glucosamina, sales de ester de alquilo de fenilglicina, sales de etilendiamina, sales de N-metilglucamina, sales de guanidina, sales de dietilamina, sales de trietilamina, sales de diciclohexilamina, sales de N,N'-dibenciletilendiamina, sales de cloroprocama, sales de procama, sales de dietanolamina, sales de N-bencil-fenetilamina, sales de piperazina, sales de tetrametilamonio y sales de tris (hidroximetil) aminometano) de un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II'; sales de acidos inorganicos tales como hidrohaluros (por ejemplo, fluorhidrato, clorhidrato, bromhidrato e yodhidrato), nitrato, perclorato, sulfato y fosfato de un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II'; sales de acido organico tales como sulfonato sustituido con alcano con 1 a a atomos de carbono (por ejemplo, metanosulfonato, trifluorometanosulfonato y etanosulfonato), arilsulfonato (por ejemplo, bencenosulfonato y p-toluenosulfonato), acetato, malato, fumarato, succinato, citrato, tartrato, oxalato, y maleato de un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II'; y sales de aminoacidos tales como sales de glicina, sales de lisina, sales de arginina, sales de ornitina, glutamato y aspartato de un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II'.
5
10
15
20
25
A continuacion, se describira en detalle la presente invencion.
De acuerdo con la presente invencion, los nucleosidos y nucleotidos artificiales 2',4' en puente, o sus sales, tienen las estructuras representadas por la formula I o II a continuacion:
(en donde B1 representa un grupo purina-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dimdropmmidma-1-ilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados de un grupo a, en donde el grupo a consiste en un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo lineal Ci a Ca, un grupo alcoxi lineal Ci a Ca, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquiltio lineal Ci a Ca, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal Ci a Ca, un grupo amino protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, y un atomo de halogeno;
R1, R12, y R13 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, o
[Producto qufmico 6]
O
y, R2 y R3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener a heteroatomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, o -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi Ci a C5, un grupo alquiltio Ci a C5, un grupo cianoalcoxi Ci a Ca, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca)).
En la formula I o II anterior, Bi representa una base de purina (esto es, grupo purina-9-ilo) o una base de pirimidina (esto es, grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1 -ilo). Estas bases pueden tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados de un grupo a que consiste en un grupo hidroxilo, un grupo alquilo lineal Ci a Ca, un grupo alcoxi lineal Ci a Ca, un grupo mercapto, un grupo alquiltio lineal Ci a Ca, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal Ci a 5 Ca, y un atomo de halogeno.
Ejemplos espedficos de la base (Bi) incluyen un grupo a-aminopurina-9-ilo (grupo adeninilo), un grupo 2,6- diaminopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-cloropurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2-amino- a-bromopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-hidroxipurina-9-ilo (grupo guaninilo), un grupo 6-amino-2-metoxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-cloropurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2,6-dimetoxipurina-9-ilo, un 10 grupo 2,6-dicloropurina-9-ilo, un grupo a-mercaptopurina-9-ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-i,2-dihidropirimidina-i-ilo (grupo citosinilo), un grupo 4-amino-2-oxo-5-fluoro-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-cloro-i,2- dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-metoxi-i,2-dihidropirimidina-l-ilo, un grupo 2-oxo-4-mercapto-i, 2- dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-i,2-dihidropirimidina-i-ilo (grupo uracililo), un grupo 2-oxo-4-hidroxi- 5-metil-i,2-dihidropirimidina-i-ilo (grupo timinilo), y un grupo 4-amino-5-metil-2-oxo-i,2-dihidropirimidina-i-ilo.
15 De estos, con el fin de una aplicacion segura y eficaz a farmacos de acido nucleico, Bi es preferiblemente uno de los compuestos que tienen las formulas estructurales representadas de la siguiente manera:
tal como un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2-dihidropirimidina-i-ilo (grupo timinilo), un grupo 2-oxo-4-amino-i,2- dihidropirimidina-i-ilo (grupo citosinilo), un grupo 6-aminopurina-9-ilo (grupo adeninilo), un grupo 2-amino-620 hidroxipurina-9-il (grupo guaninilo), un grupo 4-amino-5-metil-2-oxo-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, y un grupo 2-oxo-4- hidroxi-i,2-dihidropirimidina-i-ilo (grupo uracililo), y se prefiere particularmente un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2- dihidropirimidina-i-ilo (grupo timinilo). Durante la smtesis de los oligonucleotidos, el grupo hidroxilo es preferiblemente protegido por el grupo protector.
En la formula I o II anterior, Ri, Ri2, y Ri3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un 25 grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, o
y preferiblemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo metilo. Ejemplos del "grupo protector para un grupo amino" incluyen un grupo acetilo, un grupo ferf-butoxicarbonilo (Boc), y un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc).
30 En la formula I o II anterior, R2 y R3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a Ci2 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a Ci2 que puede tener uno cualquiera o mas
35 sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes
seleccionados del grupo a, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, o - P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi Ci a C5, un grupo alquiltio 5 Ci a C5, un grupo cianoalcoxi Ci a Ca, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca).
El nucleosido artificial 2',4' en puente de la presente invencion se obtiene introduciendo guanidina en una estructura de puente de 2',4'-BNA/LNA. Dado que la guanidina tiene carga electrica positiva, por ejemplo, se espera que la capacidad para formar una hebra doble con el acido nucleico diana sea mejorada debido a la mejora en la supresion de la repulsion anionica (interaccion electrostatica) en la unidad estructural fosfato diester y efecto de hidratacion y 10 que se mejora la resistencia enzimatica.
Un nucleotido artificial 2',4' en puente se puede preparar facilmente a partir del nucleosido artificial 2',4' en puente de la presente invencion. Por ejemplo, el nucleotido artificial 2',4' en puente puede ser facilmente trifosforilado de acuerdo con el metodo descrito en el Documento No Patente 5.
El oligonucleotido o una sal farmacologicamente aceptable del mismo de la presente invencion contiene al menos 15 una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II' a continuacion:
(en donde B1, R2, y R3 son como se definen para las anteriores formulas I y II).
En la formula I' o II' anterior, R1, R12, y R13 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, o
y preferiblemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo metilo, y R14 representa un atomo de hidrogeno.
El oligonucleotido de la presente invencion tiene al menos una estructura de nucleosido descrita anteriormente en una posicion apropiada. No hay una limitacion particular en el numero y la posicion de las estructuras de nucleosidos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
descritas anteriormente contenidas en un oligonucleotido, y se pueden disenar segun sea apropiado de acuerdo con el proposito. A medida que aumenta el numero de estructuras, el oligonucleotido tiene una mayor afinidad de union y una mayor especificidad al acido nucleico diana, muestra mayores velocidades en la formacion de dobles hebras y triples hebras, y muestra una mayor resistencia a las nucleasas. En esta memoria descriptiva, las estructuras de nucleosidos descritas anteriormente contenidas en el nucleosido artificial 2',4' en puente de la presente invencion y el oligonucleotido de la presente invencion se pueden denominar colectivamente como un "acido nucleico artificial en puente con guanidina" o un "acido nucleico en puente con guanidina".
El oligonucleotido que contiene dicha estructura de nucleosido y un analogo del mismo tiene una estructura fija debido a un puente de la unidad estructural de azucar y, de este modo, son resistentes a ser degradados por diversas nucleasas, y pueden permanecer en un cuerpo vivo durante un largo periodo de tiempo despues de la administracion. Ademas, dicho oligonucleotido o un analogo del mismo, con la accion electrostatica de la guanidina cationica existente en el puente de la unidad estructural de azucar del mismo, por ejemplo, forma un duplex estable con un ARNm para inhibir la biosmtesis de la protema patogena, o forma un triplex con un duplex de ADN en el genoma para inhibir la transcripcion en un ARNm. Tambien, permite suprimir la proliferacion de un virus que ha infectado un cuerpo vivo.
De acuerdo con lo anterior, se espera que el oligonucleotido y un analogo del mismo sintetizado a partir del nucleosido artificial 2',4' en puente de acuerdo con la presente invencion sean utiles como productos farmaceuticos (moleculas antisentido, etc.) para tratar enfermedades mediante la inhibicion de la accion de un gen espedfico, tal como un agente antitumoral o un agente antiviral.
En particular, en las terapias antisentido, tanto la afinidad de union a ARN de hebra de sentido directo complementario como la resistencia a desoxirribonucleasa in vivo son necesarias. Se sabe que, por lo general, un acido nucleico en forma de una hebra unica tiene constantemente una fluctuacion estructural de una unidad estructural de azucar entre la forma cercana a una unidad estructural de azucar en un duplex de ADN y la forma cercana a una unidad estructural de azucar en un fragmento de ADN-ARN duplex o un ARN duplex. Cuando un acido nucleico monocatenario forma una hebra doble con la hebra de ARN complementario, se fija la estructura de la unidad estructural de azucar. El nucleosido artificial 2',4' en puente de la presente invencion forma facilmente una hebra doble con una hebra diana de ARN y puede permanecer estable, porque la unidad estructural de azucar se ha fijado de antemano en el estado de formacion de una doble hebra. Tambien se sabe que un acido nucleico bicatenario se estabiliza con agua hidratada con una estructura en forma de cadena denominada red de moleculas de agua. Puesto que el nucleosido artificial 2',4' en puente de la presente invencion contiene guanidina, por ejemplo, se espera que la capacidad de formacion de doble hebra se mejore debido a la interaccion electrostatica y al efecto de hidratacion y que se mejore la resistencia enzimatica. Ademas, se espera que, cuando se introduce guanidina en el puente, se fijan las posiciones de los cationes y se potencian la interaccion electrostatica y el efecto de hidratacion. Se espera que el nucleosido artificial 2',4' en puente de la presente invencion pueda ser tomado mas eficientemente en celulas y pueda hibridarse mas eficientemente con acidos nucleicos diana, en comparacion con acidos nucleicos de origen natural y acidos nucleicos artificiales conocidos convencionalmente, debido a que el nucleosido artificial 2',4' en puente tiene carga electrica positiva derivada de grupos guanidinio en la molecula. De acuerdo con lo anterior, se espera que el efecto antisentido se mejore y que el tiempo de retencion en el cuerpo sea mas largo, y, de este modo, se puede reducir la cantidad de dosificacion para mejorar los efectos secundarios y reducir los costes.
El oligonucleotido y un analogo del mismo de la presente invencion se pueden formular en una preparacion parenteral o una preparacion liposomica, mediante la adicion de una sustancia auxiliar usualmente utilizada en el campo tecnico de formulaciones farmaceuticas, tal como un vehuculo, un aglutinante, un antiseptico, un estabilizante de oxidacion, un desintegrante, un lubricante y un corrector. Tambien, por ejemplo, es posible preparar una preparacion topica tal como una solucion, una crema y un unguento, mediante la adicion de un portador farmaceutico usualmente usado en este campo tecnico.
Ejemplos
En lo sucesivo, la smtesis del nucleosido artificial 2',4' en puente y un analogo del mismo de la presente invencion se describira con mas detalle a modo de ejemplos.
En los siguientes ejemplos, los espectros de resonancia magnetica nuclear de hidrogeno (1H-RMN) se midieron con un JNM-ECS400 (400 MHz) (fabricado por JEOL Ltd.) utilizando tetrametilsilano (0.00 ppm), cloroformo-d (7.26 ppm), y metanol-d4 (3.30 ppm), como patron interno. Los patrones de division se expresaron de manera que el singlete, el doblete, el triplete, el multiplete, el cuarteto AB y el doblete de dobletes se abreviaron respectivamente como s, d, t, m, AB y dd. Los espectros de resonancia magnetica nuclear de carbono (13C-RMN) se midieron con un JNM-ECS400 (100 MHz) utilizando cloroformo-d (77.0 ppm) y metanol-d4 (49.0 ppm) como patron interno. La medicion de resonancia magnetica nuclear de fosforo (31P-RMn) se realizo con un JNM-ECS400 (161.8 MHz) (fabricado por JEOL Ltd.) utilizando una solucion de acido fosforico-oxido de deuterio al 5% (0.00 ppm) como estandar externo. La espectrometna de masas (FAB-MS) se realizo con un JMS-600, un JMS-700, y un JMS-D300 (fabricado por JEOL Ltd.). La cromatograffa en silica gel se realizo utilizando un absorbente PSQ-100B (ave. 0.110
mm) (fabricado por Fuji Silysia producto qmmico Ltd.), y se realizo una cromatograffa de silica gel instantanea utilizando un absorbente PSQ-60B (ave. 0.060 mm) (fabricado por Fuji Silysia Producto qmmico Ltd.). La cromatograffa Kquida de alta resolucion (HPLC) se realizo utilizando un Shimadzu LC-10ATvp, un Shimadzu SPD- 10Avp, y un Shimadzu CTO-10vp (fabricado por Shimadzu Corporation). En la HPLC, se utilizo una columna analttica 5 Waters XBridge™ OST C18 2.5 |im (4.6 x 50 mm), y una columna preparativa utilizada fue Waters XBridge™ OST
C18 2.5 |im (10 x 50 mm). La medicion de Tm se realizo utilizando un Shimadzu UV-1650B y un Shimadzu UV- 1650PC (fabricado por Shimadzu Corporation). La medicion de MALDI-TOF-MS se realizo utilizando un Daltonics (marca registrada) Autoflex II TOF/TOF (fabricado por Bruker).
Se utilizaron cloruro de metileno, dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo y piridina como 10 solventes de reaccion y bases despues de secar sobre hidruro de calcio y de destilar. Como los otros reactivos, los comercialmente disponibles se utilizaron tal cual, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplo 1: Smtesis de analogo de nucleosido (Compuesto 8)
5
10
15
20
25
30
El compuesto 1 se sintetizo en 15 etapas a partir de D-glucosa de acuerdo con el metodo descrito en Chem. Commun. (Nishida, M. et al., 2010, vol. 46, p. 5283-5285).
Se adiciono cloruro de mquel (36 mg, 0.28 mmol) a 50 mL de una solucion de metanol que contiene el compuesto 1 obtenido (2.00 mg, 3.86 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, y se adiciono ademas a esta borohidruro de sodio (600 mg, 15.4 mmol) a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 10 minutos. Despues la mezcla se filtro a traves de celite, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (metanol) para obtener el compuesto 2 (1.47 g, 81%) como un amorfo de color blanco (Etapa a).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 2 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.60 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.61, 2.93 (2H, AB, J = 14.0 Hz), 3.54, 3.61 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.70 (1H, t, J = 6.0 Hz, 9.0 Hz), 4.19 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.58, 4.61 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.65, 4.81 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.89 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.307.43 (10H, m), 7.53 (1H, d, J = 1.0 Hz).
A continuacion, se adiciono una solucion en diclorometano (4 mL) que contiene isocianato de 9- fluorenilmetoxicarbonil (350 mg, 1.23 mmol) a 10 mL de solucion en diclorometano que contiene el compuesto 2 obtenido (576 mg, 1.23 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a 0°C, durante 15 minutos. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando agua a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (cloroformo: metanol = 80:1) para obtener el compuesto 3 (638 mg, 69%) como un solido de color blanco (Etapa b).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 3 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CDCh) 8: 1.57 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.57, 3.69 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.65 (1H, t, J = 7.5 Hz), 3.91, 4.24 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.16 (1H, d, J = 7.5Hz), 4.22 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.53 (2H, s), 4.68, 4.77 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.88 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.19-7.44 (15H, m), 7.55 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.12 (1H, s), 8.29 (1H, s), 9.98 (1H, s).
A continuacion, se adiciono 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida clorhidrato (103 mg, 0.54 mmol) a 5 mL de solucion en diclorometano que contiene el compuesto 3 obtenido (335 mg, 0.45 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 6 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando agua a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por
10
15
20
25
30
35
40
cromatograffa de columna en silica gel (cloroformo: metanol = 80:1) para obtener el compuesto 4 (268 mg, 83%) como un solido de color blanco amarillento (Etapa c).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 4 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.35 (3H, s),
3.11, 3.45 (2H, AB, J = 13.5 Hz), 3.69, 3.83 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.28 (2H, d, J = 6.5 Hz), 4.30 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.32 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.38 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.48, 4.71 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.51, 4.57 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.91 (1H, s), 7.23-7.85 (19H, m).
Se adiciono dietilamina (2 mL) a 8 mL de solucion en diclorometano que contiene el compuesto 4 obtenido (971 mg, 1.36 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 5 horas. A continuacion, despues de que el solvente se evaporo completamente, el producto obtenido se lavo con hexano para obtener el compuesto 5 (609 mg, 91%) como un solido de color blanco (Etapa d).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto obtenido 5 fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.37 (3H, s),
3.12, 3.46 (2H, AB, J = 14.0 Hz), 3.60, 3.86 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.25 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.44 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.50, 4.71 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.51, 4.59 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.89 (1H, s), 7.24-7.80 (10H, m), 7.89 (1H, s).
(2) Smtesis del compuesto 8
Se adiciono trietilamina (0.68 mL, 4.93 mmol) a 12 mL de solucion en diclorometano que contiene el compuesto 5 obtenido (551 mg, 1.12 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno a temperatura ambiente, y se adiciono ademas a este anhffdrido acetico (0.23 mL, 2.47 mmol) a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 2 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando solucion saturada de bicarbonato de sodio al ffquido de reaccion a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. Se adiciono carbonato de potasio (400 mg, 2.89 mmol) a 10 mL de solucion de isopropanol que contiene el producto obtenido en bruto (616 mg), despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 6 dfas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando agua a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. Se adiciono hidroxido de paladio sobre carbono (1.40 g) a 10 mL de solucion de isopropanol que contiene el producto obtenido en bruto (517 mg) en un flujo de gas de hidrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 26 horas. El solvente del filtrado obtenido filtrando el ffquido de reaccion se evaporo completamente para obtener el compuesto 6 (319 mg, 80%) como un solido de color blanco (Etapa e).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 6 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.87 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.21 (3H, s), 3.45, 3.54 (2H, AB, J = 14.5 Hz), 3.71, 3.86 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.23 (1H, d, J = 6.5 Hz),
4.61 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.85 (1H, s), 8.10 (1H, d, J = 1.0 Hz).
A continuacion, se adiciono cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (630 mg, 1.86 mmol) a 7 mL de solucion de piridina que contiene el compuesto 6 obtenido (219 mg, 0.62 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 20 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando solucion saturada de bicarbonato de sodio al ffquido de reaccion a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa de silica gel (cloroformo: metanol = 40: 1 ^-5:1) para obtener el compuesto 7 (267 mg, 66%) como un amorfo de color blanco (Etapa f).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 7 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.87 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.21 (3H, s), 3.45, 3.54 (2H, AB, J = 14.5 Hz), 3.71, 3.86 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.23 (1H, d, J = 6.5 Hz),
4.61 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.85 (1H, s), 8.10 (1H, d, J = 1.0 Hz).
Se adiciono diisopropiletilamina (146 mL, 0.84 mmol) a 2 mL de solucion en diclorometano que contiene el compuesto 7 obtenido (131 mg, 0.21 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, y se adiciono ademas a esta 2-cianoetil diisopropilclorofosforamidita (96 |iL, 0.43 mmol) a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 14 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando solucion saturada 5 de bicarbonato de sodio al ftquido de reaccion a 0°C, el ftquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico mediante reprecipitacion utilizando diclorometano y hexano para obtener el compuesto 8 (110 mg, 61%) como un amorfo de color blanco (Etapa g).
10 Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 8 obtenido fueron los siguientes: 31P-RMN (CDC13) 6: 149.94, 151.37.
Ejemplo 2: Smtesis y purificacion de analogo de oligonucleotido
Utilizando el compuesto 8 obtenido en el ejemplo 1, analogos de oligonucleotido (compuestos 9 a 13: mostrados en la Tabla 1, a continuacion) se sintetizaron mediante un sintetizador nS-8 de oligonucleotido ADN/ARN automatizado 15 (fabricado por Gene Design Inc.) con un soporte CPG de escala 0.2 |imol. El tiempo de acoplamiento de solucion de acetonitrilo (0.1M) que contiene el compuesto 8 se fijo en 16 minutos, y las otras condiciones fueron como las de la smtesis del ADN de origen natural. El activador utilizado fue 5-etiltio-1H-tetrazol (0.5M). Despues de que los oligonucleotidos sintetizados se cortaron del soporte CPG utilizando una solucion acuosa de amomaco al 28%, los grupos protectores de las unidades estructurales base se eliminaron a 55°C, durante 12 horas. El producto en bruto 20 obtenido se purifico utilizando una columna corta de fase reversa (Sep-Pak@Plus C18 Environmental Cartridges, Waters) y se purifico adicionalmente por HPLC de fase reversa.
Los analogos de oligonucleotidos sintetizados (Compuestos 9 a 13) se purificaron y se determinaron sus purezas mediante HPLC de fase reversa siguiendo las condiciones siguientes.
Fase movil
25 Solucion (A): solucion reguladora de acetato de trietilamonio 0.1 M, pH 7.0
Solucion (B): solucion reguladora de acetato de trietilamonio 0.1M: acetonitrilo = 1:1, pH 7.0 Gradiente:
MeCN analftico al 5-9% (30 min), MeCN preparativo al 5-9% (30 min): Compuesto 9 MeCN analftico al 4-8% (30 min), MeCN preparativo al 4-8% (30 min): Compuesto 10 30 MeCN analftico al 3-7% (30 min), MeCN preparativo al 3-7% (30 min): Compuesto 11 MeCN analftico al 4-8% (30 min), MeCN preparativo al 4-8% (30 min): Compuesto 12 MeCN analftico al 7-11% (30 min), MeCN preparativo al 7-11% (30 min): Compuesto 13 Columnas utilizadas:
Analytical Waters XBridge™ OST C18 2.5 |im (4.6 x 50 mm)
35 Preparative Waters XBridge™ OST C18 2.5 |im (10 x 50 mm)
Velocidad de flujo:
Analftica 1.0 mL/min Preparativa 4.5 mL/min Temperatura de la columna: 50°C 40 Deteccion: UV (254 nm)
Los pesos moleculares de los analogos de oligonucleotidos sintetizados (Compuestos 9 a 13) se determinaron por espectrometna de masas de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF-MS). La Tabla 1 muestra los resultados.
5
10
15
20
25
Tabla 1
- Oligonucleotido * 1
- Rendimiento (%) Espectrometna de masa de tiempo de vuelo
- Calculado (M-H-) Medido (M-H-)
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 9)
- 15 3701.50 3700.64
- 5' -d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 10)
- 9 3770.56 3770.61
- 5' -d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 11)
- 7 3839.62 3838.94
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 12)
- 10 3770.56 3770.37
- 5'-d(TTTTTTTTT)-3' (Compuesto 13)
- 14 3048.02 3048.11
*1 T: Acido nucleico en puente con Guanidina
Se observo que los oligonucleotidos previstos se obtuvieron porque, como se desprende de la Tabla 1, los resultados de la medicion del peso molecular por espectrometna de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) coincidfan bien con los valores teoricos.
A efectos de comparacion, un oligonucleotido que contiene un nucleosido nativo (compuesto 14: Tabla 2 a continuacion, SEQ ID NO: 1) y analogos de oligonucleotidos que contienen un acido nucleico artificial en puente con urea 2',4'-BNA/LNA (5-metil-2'-O,4'-C-metilenuridina (sintetizada de acuerdo con el Documento No Patente 6) (compuestos 15 a 18: Tabla 3 a continuacion) tambien se sintetizaron y purificaron de una manera similar de acuerdo con el protocolo estandar de fosforamidita.
Ejemplo 3: Medicion de la temperatura de fusion (Tm)
Despues de cada uno de los diversos oligonucleotidos obtenidos en el ejemplo 2 (compuestos 9 a 12, analogos de oligonucleotidos producidos utilizando el compuesto 8, compuesto 14, un oligonucleotido que contiene un nucleosido nativo y los compuestos 15 a 18, analogos de oligonucleotidos que contienen un acido nucleico artificial en puente con urea) se hibrido a una hebra diana (5'-AGCAAAAAACGC-3': SEQ. ID. NO: 2) para formar un duplex, se midio su valor Tm, una temperatura a la que se disocia el 50% de los duplex, para determinar la capacidad del oligonucleotido para la hidridacion.
Espedficamente, se calento una solucion de muestra (130 |iL) que contiene NaCl 100 mM, solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), oligonucleotidos 4 |iM y hebras diana 4 |iM, en un bano de agua en ebullicion, y despues se enfrio a temperatura ambiente durante 10 horas. Se hizo pasar un flujo de gas de nitrogeno a traves de una camara de celda de un espectrofotometro (Shimadzu, UV-1650PC) con el fin de evitar la condensacion de rodo y la solucion de muestra se enfrio gradualmente a 5°C y se mantuvo a 5°C, durante 5 minutos, despues de lo cual se inicio la medicion. La temperatura se elevo gradualmente a 90°C a una velocidad de 0.5°C/min, y la absorcion de ultravioleta se midio a 260 nm a intervalos de 0.1°C. Observese que se utilizo una celda con una tapa para evitar que la concentracion se cambie por un aumento de la temperatura. La Tabla 2 muestra los resultados en valores de Tm y diferencias en los valores de Tm por unidad de modificacion. Un valor de Tm mas alto indica una capacidad de formacion de duplex mas alta.
Tabla 2
- Oligonucleotido*1
- Tm (ATm/Modificacion de la unidad) (°C)*2
- ARN
- ADN
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 14)
- 48 50
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 9)
- 47 (-1.0) 49 (-1.0)
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 10)
- 48 (+0.0) 48 (-1.0)
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 11)
- 49 (+0.3) 46 (-1.3)
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 12)
- 45 (-1.5) 47 (-1.5)
- *1 T: Acido nucleico en puente con Guanidina *2 Secuencia de hebra diana :5'-(AGCAAAAAACGC)-3'
- *2 Condiciones: Solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), 4 |iM, 0.5°C/min. (260 nm)
- NaCl 100 mM, Oligonucleotido
Como se desprende de la Tabla 2, contrariamente a la prediccion de que la capacidad de formacion de duplex se mejorara por los efectos de las estructuras de puente y los cationes, la capacidad de formacion de duplex fue sustancialmente la misma que la del ADN nativo. Tambien, se observo que el valor de Tm aumentaba a medida que 5 aumentaba la relacion de acidos nucleicos artificiales introducidos en un oligonucleotido. De acuerdo con lo anterior, parece que los analogos de nucleotidos de la presente invencion son utiles en la smtesis de los oligonucleotidos apropiados para las terapias antisentido.
Con el fin de estudiar adicionalmente el efecto de los cationes en las porciones de puente, la medicion de Tm se realizo en una condicion de baja concentracion de sal para desarrollar el efecto de los cationes mas (utilizando una 10 solucion que tema las mismas composiciones que las de la solucion de muestra, pero libre de NaCl). A efectos de comparacion, la medicion de Tm se realizo tambien sobre los acidos nucleicos artificiales en puente con urea (compuestos 15 a 18). La Tabla 3 muestra los resultados.
Tabla 3
- Oligonucleotido*1
- Tm(°C)*2
- ARN
- ADN
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 14)
- 33 38
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 9)
- 34 39
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 10)
- 34 39
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 11)
- 38 39
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 12)
- 32 33
- 5' -d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 15)
- 34 37
- 5' -d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 16)
- 37 30
- 5'-d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 17)
- 40 28
- 5' -d(GCGTTTTTTGCT)-3' (Compuesto 18)
- 36 29
*1 T: Acido nucleico en puente con Guanidina T: Acido nucleico en puente con Urea *2 Hebra diana (Secuencia :5'-(AGCAAAAAACGC)-3'
*2 Condiciones: Solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), sin NaCl, Oligonucleotido 4 |iM, 0.5°C/min. (260 nm)
15 Como se desprende claramente de la Tabla 3, no se observo tanta diferencia en los valores de Tm cuando se dirigio ARN. Por otra parte, cuando se dirigio ADN, en el caso de los acidos nucleicos artificiales en puente con urea, el valor de Tm disminuyo a medida que aumentaba la relacion de acidos nucleicos artificiales introducidos a un oligonucleotido, mientras que en el caso de que se introdujeran los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina, no se observo tal cafda en el valor de Tm. De acuerdo con lo anterior, se indico que los cationes en las 20 porciones de puente afectan a la estabilizacion del duplex con ADN.
Ejemplo 4: Smtesis de analogo de nucleosidos (compuesto 28)
T&DPSQ
TBDP&O
TBDPSO
TBDPSO
BocHN
H&ac
□Bn MH
NL , NBm
WHBoc
UtiOL
Mv -NBoc
NHBdc
NHBOC
[Proclucto quimico 14]
N Hua"
(1) Sintesis del compuesto 20
El Compuesto 19 se obtuvo de acuerdo con el procedimiento de preparacion del compuesto 7 descrito en J. Org. Chem. (Shrestha, A.R. et al., 2011, vol. 76, p. 9891-9899). Se adicionaron piridina (1.65 mL, 20.5 mmol) y anlffdrido trifluorometanosulfonico (1.37 mL, 8.20 mmol) a una solucion en diclorometano (40 mL) que contiene el compuesto 19 (2.86 g, 4.10 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno enfriado con hielo, despues de lo cual se agito la mezcla 5 durante 1 hora en condicion de enfriamiento con hielo. Despues de que el acido se descompuso adicionando agua, se llevo a cabo la extraccion con diclorometano, y la capa organica se seco sobre sulfato de sodio anhidro. Despues de evaporar el solvente, se obtuvo un producto en bruto como un aceite de color amarillo y se purifico simplemente por cromatograffa instantanea (n-hexano: acetato de etilo = 3:1 ^ 2:1) para obtener un producto en bruto como un amorfo de color amarillo claro. Posteriormente, se adiciono azida de sodio (0.23 g, 3.60 mmol) a una solucion de 10 dimetilformamida (80 mL) que contiene el producto en bruto (1.96 g, 2.34 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito. Despues de 48 horas, el solvente se evaporo y se adiciono agua, se realizo la extraccion con diclorometano y la capa organica se lavo con solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. Despues de evaporar el solvente, el producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa en columna instantanea (n-hexano: acetato de etilo = 3:1) para obtener el compuesto 20 (1.71 g, 66%) como amorfo de 15 color blanco (Etapa a).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 20 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (300MHz, CDCh) 8: 0.99 (9H, s), 1.58 (3H, s), 3.63, 3.69 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.91 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 7.2 Hz, 5.4 Hz), 4.23 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.47, 4.53 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.57, 4.75 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.03 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.23-7.60 (20H, m), 8.70 (1H,s).
20 (2) Smtesis de los compuestos 24 y 25
Se adiciono cloruro de nickel (11 mg, 0.085 mmol) a 8 mL de solucion de metanol que contiene el compuesto 20 obtenido (622 mg, 0.85 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, y se adiciono ademas a esta borohidruro de sodio (64 mg, 1.7 mmol) enfriado con hielo, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 10 25 minutos. Despues el lfquido de reaccion se filtro, el solvente se evaporo completamente y se adiciono agua, y se realizo la extraccion con acetato de etilo. A continuacion, la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio, y el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (acetato de etilo: trietilamina = 200:1) para obtener el compuesto 21 (456 mg, 76%) como un solido de color blanco (Etapa b).
30 Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 21 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CDCh) 8: 1.04 (9H, s),
I. 63 (3H, d, J = 1.5 Hz), 3.59, 3.66 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.67 (1H, dd, J = 5.5 Hz, 9.0 Hz), 3.79, 3.99 (2H, AB, J =
II. 0 Hz), 4.06 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.55, 4.58 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.67, 4.76 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.81 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.19-7.61 (21H, m), 7.95 (1H, s).
Se adicionaron W,W’-di-(terf-butoxicarbonil)tiourea (30.4 mg, 0.11 mmol), diisopropiletilamina (9 |iL, 0.035 mmol), 135 etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida clorhidrato (21 mg, 0.11 mmol) a 1 mL de solucion en diclorometano que
contiene el compuesto 21 obtenido (50 mg, 0.071 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 3 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo
5
10
15
20
25
30
35
40
adicionando agua a 0°C, el Kquido de reaccion se extrajo con diclorometano, la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio, y el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa de columna en s^lica gel (hexano: acetato de etilo = 4:1) para obtener el compuesto 22 (58 mg, 86%) como un solido de color blanco (Etapa c).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 22 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CDCh) 8: 1.04 (9H, s), 1.42 (9H, s), 1.46(9H, s), 1.72 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.57, 3.96 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.73, 3.78 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.25 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.57, 4.65 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.59, 4.61 (2H, AB, J = 9.0 Hz), 4.89 (1H, q, J = 8.0 Hz), 5.98 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.20-7.69 (22H, m), 8.93 (1H, d, J = 8.0 Hz), 11.34 (1H,s).
Se adiciono fluoruro de tetra-n-butilamonio (0.14 mL, 0.14 mmol) a 1 mL de solucion de tetrahidrofurano que contiene el compuesto 22 obtenido (106 mg, 0.11 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 4.5 horas. A continuacion, el solvente se evaporo completamente, y el producto obtenido en bruto se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (hexano: acetato de etilo = 1:1) para obtener el compuesto 23 (80 mg, cuantitativo) como un solido de color blanco (Etapa d).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 23 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CDCh) 8: 1.42 (9H, s),
I. 50 (9H, s), 1.75 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.05 (1H, dd, J = 3.5 Hz, 9.0 Hz), 3.57, 3.62 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.68 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 9.0 Hz), 3.84 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 3.5 Hz), 4.35 (1H, d, J = 7.5 Hz), 4.51, 4.72 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.58, 4.62 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.87 (1H, q, J = 7.5 Hz), 6.07 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.26-7.52 (11H, m), 7.88 (1H, s), 9.05 (1H, d, J = 7.5 Hz), 11.39 (1H,s).
Se adiciono piridina (0.29 mL, 3.59 mmol) a 12 mL de solucion en diclorometano que contiene el compuesto 23 obtenido (850 mg, 1.20 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, y se adiciono ademas a esta anhffdrido trifluorometanosulfonico (0.3 mL, 1.78 mmol) a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a 0°C, durante 3 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando solucion saturada de bicarbonato de sodio al lfquido de reaccion a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. A continuacion, se adicionaron 2 mL de trietilamina a 8 mL de solucion en diclorometano que contiene el producto en bruto en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 27 horas. A continuacion, el solvente se evaporo completamente y el producto obtenido en bruto se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (hexano: acetato de etilo = 1:1) para obtener el compuesto 24 (644 mg, 77%) como un amorfo de color blanco amarillento (Etapa e).
A continuacion, se adiciono acido clorhffdrico al 35% (0.3 mL) a 1 mL de solucion de tetrahidrofurano que contiene el compuesto 24 (57 mg, 0.082 mmol), despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 40 minutos. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando solucion saturada de bicarbonato de sodio al lfquido de reaccion a 0°C, el lfquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener el compuesto 25 (44 mg, cuantitativo) como un solido de color blanco (Etapa e').
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 25 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.54 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.53, 3.70 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.90, 3.97 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.16 (1H, s), 4.60, 4.66 (2H, AB, J =
II. 5 Hz), 4.62 (2H, s), 4.78 (1H, s), 5.66 (1H, s), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.50 (1H, d, J = 1.0 Hz).
(2) Smtesis del compuesto 28
Se adiciono hidroxido de paladio sobre carbono (900 mg) a 10 mL de solucion de metanol que contiene el compuesto 24 obtenido (644 mg, 0.93 mmol) en un flujo de gas de hidrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito
5
10
15
20
25
30
35
40
a temperatura ambiente, durante 14 horas. A continuacion, el solvente del filtrado obtenido filtrando el ffquido de reaccion se evaporo completamente para obtener un producto en bruto del compuesto 26 (Etapa f).
A continuacion, se adiciono cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (469 mg, 1.38 mmol) a 7 mL de solucion de piridina que contiene el producto en bruto (354 mg) del compuesto 26 en un flujo de gas de nitrogeno a 0°C, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 12 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando solucion saturada de bicarbonato de sodio al ffquido de reaccion a 0°C, el ffquido de reaccion se extrajo con diclorometano, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre sulfato de sodio anhidro. A continuacion, el solvente se evaporo completamente para obtener un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (hexano: acetato de etilo = 1:1) para obtener el compuesto 27 (442 mg, 58%) como un solido de color blanco (Etapa g).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 27 obtenido fueron los siguientes: 1H-RMN (CD3OD) 8: 1.42 (18H, s), 1.49 (3H, s), 3.39-3.55 (4H, m), 3.73 (6H, s), 4.39 (1H, s), 4.57 (1H, s), 5.51 (1H, s), 6.83 (4H, d, J = 9.0 Hz), 7.177.44 (m, 9H), 7.77 (1H, s).
Se adicionaron tetracoluro de N,N-diisopropil amonio (39 mg, 0.23 mmol) y 2-cianoetil N,N,N',N-tetraisopropil fosforamidita (73 |iL, 0.23 mmol) a 2 mL de solucion de acetonitrilo que contiene el compuesto 27 obtenido (141 mg, 0.17 mmol) en un flujo de gas de nitrogeno, despues de lo cual la mezcla se agito a temperatura ambiente, durante 3 horas. A continuacion, despues de que la reaccion se inactivo adicionando agua al ffquido de reaccion a 0°C, se realizo la extraccion con acetato de etilo, y la capa organica se lavo con agua y solucion salina saturada y se seco sobre Na2SO4. El solvente se evaporo completamente, y el producto obtenido en bruto se purifico por cromatograffa de columna en silica gel (hexano: acetato de etilo = 3:2) para obtener el compuesto 28 (148 mg, 86%) como un amorfo de color blanco (Etapa h).
Los datos de propiedades ffsicas del compuesto 28 obtenido fueron los siguientes: 31P-RMN (CDCh) 8: 148.78, 149.48, 149.78.
Ejemplo 5: Smtesis y purificacion de analogos de oligonucleotidos
Utilizando el compuesto 28 obtenido en el ejemplo 4, 10 mer de analogos de oligonucleotido (compuestos 29 a 32: mostrados en la Tabla 4 a continuacion) se sintetizaron mediante un sintetizador nS-8 de oligonucleotido ADN/ARN automatizado (fabricado por Gene Design Inc.) con un soporte CPG de escala 0.2 |imol. El tiempo de acoplamiento de solucion de acetonitrilo (0.1M) que contiene el compuesto 28 se fijo en 8 minutos, y las otras condiciones fueron como las de la smtesis del ADN nativo. El activador utilizado fue 5-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]-1H-tetrazol (0.25M). Los oligonucleotidos sintetizados se cortaron del soporte CPG utilizando una solucion acuosa de amomaco al 28%. Los productos en bruto de los compuestos 29 a 31 obtenidos se purificaron utilizando una columna corta de fase reversa (Sep-Pak@Plus C18 Environmental Cartridges, Waters) y luego se trataron con acido trifluoroacetico (TFA) al 50%, durante 24 horas, y se purificaron ademas por HPLC de fase reversa. El producto en bruto del compuesto 32 obtenido se purifico utilizando una columna corta de fase reversa (Sep-Pak@Plus C18 Environmental Cartridges, Waters) y se purifico adicionalmente por HPLC de fase reversa.
Los analogos de oligonucleotido sintetizados (compuestos 29 a 32) se purificaron y se determinaron sus purezas como en el ejemplo 2.
Los pesos moleculares de los analogos de oligonucleotidos sintetizados (Compuestos 29 a 32) se determinaron mediante medicion MALDI-TOF-MASS. La Tabla 4 muestra los resultados.
Tabla 4
- Oligonucleotido*1
- Rendimiento (%) Espectrometna de masas de tiempo de vuelo
- Calculado (M-H-)
- Medido (M-H-)
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 9 3048.02 3048.84
- 5'-d(TTTTtTtTTT)-3' (Compuesto 30)
- 7 3117.09 3117.57
- 5'-d(TTtTtTtTTT)-3' (Compuesto 31)
- 3 3186.16 3186.50
- 5'-d(TTTTTTTTtT)-3' (Compuesto 32)
- 2 3048.02 3047.85
- *1 t: Acido nucleico en puente con Guanidina
5
10
15
20
25
A efectos de comparacion, un oligonucleotido que contiene un nucleosido nativo (compuesto 33: mostrado en la Tabla 5 a continuacion) tambien se sintetizo y purifico de una manera similar de acuerdo con el protocolo de estandar de fosforamidita.
Ejemplo 6: Medicion de la temperature de fusion (Tm)
Despues de cada uno de los diversos oligonucleotidos (compuestos 29 a 31, analogos de oligonucleotidos producidos utilizando el compuesto 28; y compuesto 33, un oligonucleotido que contiene un nucleosido nativo) obtenido en el ejemplo 5 se hibrido a cualquiera de las hebras diana (10 mer de poly A y SEQ ID NO: 3 a 5) mostrados en las Tablas 5 y 6 a continuacion para formar un complejo, se midio su valor de Tm, una temperatura a la que se disocia el 50% de los complejos, para determinar la capacidad del oligonucleotido para la hibridacion .
Espedficamente, se calento una solucion de muestra (130 |iL) que contiene NaCl 100 mM, solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), oligonucleotidos 4 |iM y hebras diana 4 |iM en un bano de agua en ebullicion, y despues se enfrio a temperatura ambiente durante 10 horas. Se hizo pasar un flujo de gas nitrogeno a traves de una camara de celda de un espectrofotometro (Shimadzu, UV-1650PC) con el fin de evitar la condensacion de rodo, y la solucion de muestra se enfrio gradualmente a 0°C y se mantuvo a 0°C, durante 5 minutos, despues de lo cual se inicio la medicion. La temperatura se elevo gradualmente a 80°C a una velocidad de 0.5°C/min, y la se midio la absorcion ultravioleta a 260 nm a intervalos de 0.1°C. Observese que se utilizo una celda con tapa con el fin de evitar que la concentracion se cambie por un aumento de la temperatura. La tabla 5 muestra, en terminos de valores de Tm y diferencias en los valores de Tm por unidad de modificacion, las capacidades de los diversos analogos de oligonucleotido que contiene un numero diferente de acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina para hibridar a poly A. La Tabla 6 muestra, en terminos de valores de Tm, las capacidades del analogo de nucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina y el oligonucleotido que contiene el nucleosido nativo para hibridar a diversas hebras diana.
Tabla 5
- Oligonucleotido*1
- Tm (ATm/Modificacion de la unidad) (°C)*2
- ARN
- ADN
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 33)
- 19 20
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 24 (+5.0) 24 (+4.0)
- 5'-d(TTTTtTtTTT)-3' (Compuesto 30)
- 30 (+5.5) 36 (+8.0)
- 5'-d(TTtTtTtTTT)-3' (Compuesto 31)
- 40 (+7.0) 50 (+10.0)
*1 t: Acido nucleico en puente con Guanidina *2 Hebra diana (Secuencia :5'-(AAAAAAAAAA)-3'
*2 Condiciones: Solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), NaCl 100 mM, Oligonucleotido 4 |iM, 0.5°C/min. (260 nm)
Tabla 6
- Oligonucleotido*1
- Hebra diana Tm(°C)*2
- ARN
- ADN
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 5'-(AAAAAAAAAA)-3' 24 24
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 5'-(AAAAAGAAAA)-3' 17 10
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 5'-(AAAAACAAAA)-3' 10 10
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 5'-(AAAAATAAAA)-3' 12 10
5
10
15
20
25
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 33)
- 5'-(AAAAAAAAAA)-3' 19 20
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 33)
- 5'-(AAAAAGAAAA)-3' 13 <10
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 33)
- 5'-(AAAAACAAAA)-3' <10 <10
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 33)
- 5'-(AAAAATAAAA)-3' <10 <10
- *1 T: Acido nucleico en puente con Guanidina *2 Condiciones: Solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), NaCl 100 mM, Oligonucleotido 4 |iM, 0.5°C/min. (260 nm)
Como se desprende de la Tabla 5, los oligonucleotidos que contienen los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina teman excelentes capacidades de formacion de complejos no solo con respecto al ARN, sino tambien con respecto al ADN. Tambien, se observo que el valor de Tm aumentaba a medida que aumentaba la relacion de acidos nucleicos artificiales introducidos en un oligonucleotido. De acuerdo con lo anterior, parece que los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina de la presente invencion son utiles en la smtesis de los oligonucleotidos apropiados para las terapias antisentido.
Como se desprende de la Tabla 6, el oligonucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina tema capacidad de reconocimiento de apareamiento erroneo. Los oligonucleotidos que contienen los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina teman capacidades de formacion de complejos mas excelentes con respecto a las hebras diana deseables (esto es, poly A) que el oligonucleotido que contiene el nucleosido nativo. De acuerdo con lo anterior, se observo que los oligonucleotidos que contienen los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina no teman ningun riesgo de formar complejos de una manera no espedfica de la secuencia.
Ejemplo 7: Evaluacion de la capacidad de formacion de doble hebra de analogos de oligonucleotidos
Utilizando el compuesto 28 obtenido en el ejemplo 4, 9 mer de analogo de oligonucleotido que contiene diversas bases (compuesto 34: mostrado en la Tabla 7 a continuacion) se sintetizaron y purificaron como en el ejemplo 5, excepto que, despues el oligonucleotido sintetizado se corto del soporte CPG utilizando una solucion acuosa de amomaco al 28%, el grupo protector de la unidad estructural base se elimino a 55°C, durante 12 horas. A efectos de comparacion, un oligonucleotido que contiene un nucleosido nativo (compuesto 35: mostrados en la Tabla 7 a continuacion) tambien se sintetizo y purifico de una manera similar de acuerdo con el protocolo de estandar de fosforamidita.
Despues de que cada uno de los oligonucleotidos de los compuestos 34 y 35 se hibrido a una hebra diana 5'- GTGATATGC-3' para formar un duplex, se midio su valor de Tm, una temperatura a la que se disociaron el 50% de duplex, para determinar la capacidad del oligonucleotido para la hibridacion. La hibridacion a la hebra diana y la medicion de los valores de Tm se realizaron como en el ejemplo 6. La Tabla 7 muestra los resultados de los valores de Tm.
Tabla 7
- Oligonucleotido*1
- Tm(°C)*2
- ARN
- ADN
- 5'-d(GCATATCAC)-3' (Compuesto 35)
- 32 35
- 5'-d(GCAtATCAC)-3' (Compuesto 34)
- 40 44
*11: Acido nucleico en puente con Guanidina *2 Hebra diana (Secuencia: 5'-(GTGATATGC)-3'
*2 Condiciones: Solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.2), NaCl 100 mM, Oligonucleotido 4 |iM, 0.5°C/min. (260 nm)
5
10
15
20
25
30
35
Como se desprende de la Tabla 7, tambien en el caso de disenar la secuencia para contener diversas bases, el oligonucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 34) tema excelentes capacidades de formacion de duplex con respecto tanto al ARN Y ADN como en el caso de la secuencia poly T.
Ejemplo 8: Evaluacion de la capacidad de formacion de triplex de analogo de oligonucleotidos
[Producto qinmico 18]
5 “ — T T T T TCI'X' T CT C TC T - 3 f;
5 • ~ G GC AAAAAG AX AG AG AG AC GO ----------
3 ' -CCGTTTTTCTSTCTCTCTGCG-i- ™
Utilizando el compuesto 28 obtenido en el ejemplo 4, 15 mer de analogo de oligonucleotido (compuesto 36: en donde "X" es un acido nucleico artificial en puente con guanidina y el C subrayado es 2'-desoxi 5-metilcitidina, vease la Tabla 8 a continuacion) se sintetizo y purifico como en el ejemplo 5, excepto que, despues de que el oligonucleotido sintetizado se corto del soporte CPG utilizando a solucion acuosa de amomaco al 28%, el grupo protector de la unidad estructural base se elimino a 55°C, durante 12 horas. A efectos de comparacion, un oligonucleotido que contiene un nucleosido nativo (compuesto 37: donde "X" es un nucleosido nativo, y el C subrayado es 2'-desoxi 5-metilcitidina, vease la Tabla 8 a continuacion) tambien se sintetizo y purifico de una manera similar de acuerdo con el protocolo de estandar de fosforamidita.
Se preparo un duplex de ADN objetivo que contiene una hebra diana 5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGACGC-3' (Numero de secuencia 6) y su hebra complementaria 5'-GCGTCTCTCTZTCTTTTTGCC-3' (Numero de secuencia 7) de la siguiente manera. 5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGACGC-[espaciador C18]-GCGTCTCTCTZTCTTT TTGCC-3' (hebra obtenida por la union del extremo 3' de la hebra del oligonucleotido de SEQ. ID. NO: 6 y el extremo 5' de la hebra del oligonucleotido de SEQ. ID. NO: 7 mediante un [espaciador C18] como un enlazante) se sintetizo y purifico de acuerdo con el protocolo de estandar de fosforamidita, excepto que se utilizaron 18-O-dimetoxitritilhexaetilenglicol y 1-[(2-cianoetil)-(A/,W-diisopropil)]-fosforamidita (fabricado por Glen Research) para la smtesis de las porciones enlazantes, de manera que se obtuvo un duplex de ADN diana deseado. En la formula, Y y Z se refieren a una combinacion que puede formar un par de bases, y son de la siguiente manera: Y es A, y Z es T; Y es T, y Z es A; Y es G, y Z es C; o Y es C, y Z es G.
Despues de que cada uno de los oligonucleotidos de los compuestos 36 y 37 se hibrido a un duplex diana para formar un triplex, se midio su valor Tm, una temperatura a la que se disociaron el 50% de triplex, para determinar la capacidad del oligonucleotido para la hibridacion.
Espedficamente, una solucion de muestra (130 |iL) que contiene solucion reguladora de cacodilato de sodio 10 mM (pH 6.8), KCl 100 mM, MgCh 50 mM, oligonucleotidos 1.89 |iM, y duplex diana 1.89 |iM se calento en un bano de agua hirviendo, y despues se enfno a temperatura ambiente durante 10 horas. Se hizo pasar un flujo de gas de nitrogeno a traves de una camara de celda de un espectrofotometro (Shimadzu, UV-1650PC) con el fin de evitar la condensacion de rodo, y la solucion de muestra se enfno gradualmente a 5°C y se mantuvo a 5°C, durante 20 minutos, despues de lo cual se inicio la medicion. La temperatura se elevo gradualmente a 90°C a una velocidad de 0.5°C/min, y se midio la absorcion ultravioleta a 260 nm a intervalos de 0.1°C. Observese que se utilizo una celda con tapa con el fin de evitar la concentracion se cambie por un aumento de la temperatura. La Tabla 8 muestra los resultados de los valores de Tm. Un valor de Tm mas alto indica una capacidad de formacion de triplex mas alta.
Tabla 8
- Oligonucleotido*1
- Tm(°C)*2
- Combinacion YZ Diana
- AT
- TA GC CG
- 5'-d(TTTTTCTTTCTCTCT)-3' (Compuesto 37)
- 44 20 23 29
- 5'-d(TTTTTCTtTCTCTCT)-3' (Compuesto 36)
- 54 17 38 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
*11: Acido nucleico en puente con Guanidina *1 C:2'-desoxi-5-metilcistisina
*2 Condiciones: Solucion reguladora de cocadilato de sodio 10 mM (pH 6.8), KCl 100 mM, y 50 mM MgCh, Oligonucleotido 1.89 |iM, 0.5 °C/min. (260 nm)
Como se desprende claramente de la Tabla 8, el oligonucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 36) tema excelentes capacidades de formacion de triplex con respecto a un duplex diana deseable (Y es A y Z es T).
Ejemplo 9: Evaluacion de la resistencia a nucleasa de los analogos de oligonucleotidos
En este ejemplo, se prepararon 10 mer de diversos oligonucleotidos donde X de la secuencia 5'-d(TTTTTTTTXT)-3' fueron los siguientes. Es decir, se prepararon los siguientes diversos oligonucleotidos: un analogo de oligonucleotido producido utilizando el analogo de nucleosido (compuesto 8) del ejemplo 1, donde X era un acido nucleico artificial en puente con guanidina (esto es, "compuesto 13"); un analogo de oligonucleotido producido utilizando el analogo de nucleosido (compuesto 28) del ejemplo 4, donde X era un acido nucleico artificial en puente con guanidina (esto es, "compuesto 32"); un oligonucleotido donde X era un LNA-T (LNA de timina) (compuesto 38, fabricado por Gene Design Inc.); un oligonucleotido donde X era un ADN-T (ADN de timina) (10 mer de oligo dT, esto es, "compuesto 33"); y un oligonucleotido sintetizado y purificado de acuerdo con el protocolo de estandar de fosforamidita, donde X era un oligo S (sintetizado y purificado de acuerdo con el protocolo de smtesis de fosforotioato estandar, excepto que se utilizo D-1,4-ditiotreitol (DDTT, fabricado por ChemGene) en lugar de un agente oxidante como agente sulfurante (compuesto 39: utilizado como control positivo).
La resistencia a la nucleasa se evaluo de la siguiente manera. Es decir, se adicionaron 0.175 |ig de 3' exonucleasa (Crotalus admanteus venom fosfodiesterasa: CAVP, fabricada por Pharmacia Biotech) y se mezclaron con 100 |iL de solucion reguladora (TrisHCl 50 mM (pH 8.0), MgCh 10 mM) que contiene cada uno de diversos oligonucleotidos (750 pmol), despues de lo cual la mezcla se incubo a 37°C, y parte del lfquido de reaccion se extrajo a intervalos iguales despues del inicio de la reaccion. El lfquido reaccionado extrafdo se calento a 90 °C durante 2 minutos para desactivar la enzima y la cantidad restante de oligonucleotidos se determino por HPLC. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: gradiente 6-12% de MeCN (15 min); velocidad de flujo 0.8 mL/min; y temperatura de la columna de 50°C. La cantidad restante de oligonucleotidos se calculo como el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar (%) y se represento graficamente frente al tiempo de reaccion. La figura 1 muestra los resultados.
La figura 1 es un grafico que muestra un cambio en el tiempo en el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar cuando diversos oligonucleotidos que tienen la secuencia 5'-d(TTTTTTTTXT)-3' se trataron con 3' exonucleasa. En la figura 1, el eje vertical indica el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar (%) al tratamiento con nucleasa, y el eje horizontal indica el tiempo de tratamiento con nucleasa (min). Los sfmbolos de la figura 1 son los siguientes: cuadrangulo representa un oligonucleotido que contiene un nucleosido de origen natural (compuesto 33); cfrculo representa un oligonucleotido que contiene un LNA (compuesto 38); triangulo representa un oligonucleotido que contiene un acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 32); x representa un oligonucleotido que contiene un acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 13); y el triangulo invertido representa un oligonucleotido que contiene un S-oligo (compuesto 39).
Como se desprende claramente de la figura 1, 50% o mas del compuesto 13 se dejo sin reaccionar incluso despues del tratamiento con nucleasa durante 20 minutos, esto es, fue resistente a degradarse. El compuesto 32 tema un porcentaje mas bajo de oligonucleotidos que quedaban sin reaccionar que el del compuesto 13. Sin embargo, el compuesto 32 fue resistente a ser degradado comparado con el compuesto 38 (oligonucleotido que contiene LNA) que se degrado casi completamente despues del tratamiento con nucleasa durante 10 minutos.
Ejemplo 10: Evaluacion de la resistencia a la nucleasa del analogo de oligonucleotido
En este ejemplo, se prepararon 9 mer de oligonucleotido (compuesto 40) donde X de la secuencia 5'- d(TTTTTTTTX)-3' era un acido nucleico artificial en puente con guanidina de la siguiente manera.
Es decir, se adiciono 3' exonucleasa (Crotalus admanteus venom fosfodiesterasa: CAVP, fabricada por Pharmacia Biotech) (0.2 |ig) y se mezclaron con 40 |iL de solucion reguladora (Tris.HCl 50 mM (pH 8.0), MgCh 10 mM) que contiene el compuesto 32 (3330 pmol), despues de lo cual la mezcla se incubo a 37°C durante 3 horas. A continuacion, se realizo el calentamiento a 90°C durante 2 minutos para desactivar la enzima, y se realizo la purificacion por HPLC. Se observo que el oligonucleotido deseado se obtuvo debido a que el valor de medicion del peso molecular (2743.07) del oligonucleotido obtenido por espectrometna de masas de tiempo de vuelo (MALDI- TOF-MS) coincidfa bien con el valor teorico (2743.83).
5
10
15
20
25
30
35
A efectos de comparacion, se utilizo un oligonucleotido donde X de la secuencia 5'-d(TTTTTTTTX)-3' fue un LNA (fabricado por Gene Design Inc.: Compuesto 41).
La resistencia a la nucleasa se evaluo como en el ejemplo 9, excepto que se adicionaron 0.08 |ig de 3' exonucleasa a 100 |iL de solucion reguladora que contiene cada uno de diversos oligonucleotidos (750 pmol). La figura 2 muestra los resultados.
La figura 2 es un grafico que muestra un cambio en el tiempo en el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar cuando se trataron diversos oligonucleotidos que tienen la secuencia 5'-d(TTTTTTTTX)-3' con 3' exonucleasa. En la figura 2, el eje vertical indica el porcentaje de oligonucleotidos sin reaccionar (%) al tratamiento con nucleasa, y el eje horizontal indica el tiempo de tratamiento con nucleasa (min). Los sfmbolos de la figura 2 son los siguientes: cfrculo representa un oligonucleotido que contiene un LNA (compuesto 41); y el triangulo representa un oligonucleotido que contiene un acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 40).
Como se desprende de la figura 2, el 80% del compuesto 40 (oligonucleotido que contiene acido nucleico artificial en puente con guanidina) se dejo sin reaccionar incluso despues del tratamiento con nucleasa durante 20 minutos. Por otra parte, casi no habfa oligonucleotido sin reaccionar del compuesto 41 (oligonucleotido que contiene LNA) despues del tratamiento con nucleasa durante 20 minutos. De esta manera, un oligonucleotido que contiene un acido nucleico artificial unido a guanidina de anillo de 5 miembros en el extremo 3', como en el analogo de nucleosido en puente con guanidina (compuesto 28) en el ejemplo 4, mostro una resistencia a las nucleasas extremadamente alta.
Ejemplo 11: Medicion de la temperatura de fusion (Tm) de los analogos de oligonucleotidos
Despues cada uno del compuesto 33 (oligonucleotido nativo que contiene 10 mer de oligo dT); compuesto 29 a 31, 42 y 43 (analogos de oligonucleotidos que contienen acidos nucleicos en puente con guanidina del compuesto 28); y los compuestos 44 a 48 (oligonucleotidos que contienen LNA-T) mostrados en la Tabla 9 a continuacion se hibridaron a 10 mer de poly A para formar un complejo, se midio su valor de Tm, una temperatura a la que se disocia el 50% de complejos, para determinar la capacidad del oligonucleotido para la hibridacion.
Los compuestos 29 a 31, 42 y 43 se sintetizaron y purificaron como en el ejemplo 5, excepto que se uso TFA al 75% en lugar de TFA al 50% en el tratamiento con tFA despues de la purificacion utilizando una columna corta de fase reversa. Los compuestos 44 a 48 fueron fabricados por Gene Design Inc.
La formacion de los complejos y la medicion de los valores de Tm se realizaron como en el ejemplo 6, excepto que una solucion de muestra (130 |iL) que contiene KCl 200 mM, solucion reguladora de cacodilato de potasio 20 mM (pH 6.8), oligonucleotidos 4 |iM, y hebras diana 4 |iM. La Tabla 9 muestra los resultados. La Tabla 9 muestra los resultados de comparacion entre el oligonucleotido nativo y los diversos oligonucleotidos que contienen un numero diferente de LNA, en terminos de valores de Tm y diferencias en los valores de Tm por unidad de modificacion, las capacidades de los diversos analogos de oligonucleotidos que contienen un numero diferente de acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina para la hibridacion con poly A.
Tabla 9
- Oligonucleotido*1
- Tm (ATm/Modificacion de la unidad) (°C)*2
- ARN
- ADN
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 33)
- 22 25
- 5'-d(TTTTtTTTTT)-3' (Compuesto 29)
- 27 (+5.0) 30 (+5.0)
- 5'-d(TTTTtTtTTT)-3' (Compuesto 30)
- 33 (+5.5) 42 (+8.5)
- 5'-d(TTtTtTtTTT)-3' (Compuesto 31)
- 44 (+7.3) 57 (+10.7)
- 5'-d(TTTtttTTTT)-3' (Compuesto 42)
- 44 (+7.3) 55 (+10.0)
- 5'-d(tTtTtTtTtT)-3' (Compuesto 43)
- 66 (+8.8) 79 (+10.8)
- 5'-d(TTTT7TTTTT )-3' (Compuesto 44)
- 28 (+6.0) 25 (+0.0)
- 5'-d(TTTT7TTTTT)-3' (Compuesto 45)
- 34 (+6.0) 31 (+3.0)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
- 5'-d(TTTT7TTTTT)-3' (Compuesto 46)
- 43 (+7.0) 40 (+5.0)
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 47)
- 42 (+6.7) 35 (+3.3)
- 5'-d(TTTTTTTTTT)-3' (Compuesto 48)
- 50 (+5.6) 48 (+4.6)
- *11: Acido nucleico en puente con Guanidina T:LNA *2 Hebra diana Secuencia: 5'-(AAAAAAAAAA)-3' *2 Condiciones: Solucion reguladora de cocadilato de sodio 20 mM (pH 6.8)
- KCl 200 mM,
- Oligonucleotido 4 |iM, 0.5°C/min. (260 nm)
Como se desprende de la Tabla 9, cuando se dirigio ARN, los analogos de oligonucleotidos que contienen los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina teman afinidades de union suficientemente altas en comparacion con el oligonucleotido nativo. Ademas, cuando el numero de acidos nucleicos artificiales introducidos era de 3 residuos o menos, los analogos de oligonucleotidos que contienen los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina teman los valores de Tm similares a los de los oligonucleotidos que contienen los LNA, pero el oligonucleotido en el cual fueron introducidos 5 residuos de acido nucleico artificial en puente con guanidina mostraron afinidades de union mas altas que aquellas en las que se introdujeron 5 residuos de LNA. La comparacion de los incrementos en los valores de Tm por residuo mostro claramente que, cuando se introdujo el LNA, un aumento en los valores de Tm fue de 6 a 7°C independientemente del numero introducido, mientras que cuando se introdujo el acido nucleico artificial en puente con guanidina, un aumento en los valores de Tm por residuo se hizo mayor a medida que aumentaba el numero introducido. De acuerdo con lo anterior, se indico que las estructuras de puente afectan de forma aditiva a la afinidad de union, mientras que los cationes derivados de guanidina afectan sinergicamente a la afinidad de union. Tambien se observo que cuando se dirigio el ADN, los oligonucleotidos que contienen los acidos nucleicos artificiales en puente con guanidina mostraban una afinidad de union extremadamente alta y teman una afinidad de union extremadamente superior que los del oligonucleotido nativo y los oligonucleotidos que contienen los LNA.
Ejemplo 12: Evaluacion de la capacidad de reconocimiento de bases diana de analogos de oligonucleotidos
El analogo de oligonucleotido en el cual se introdujeron 5 residuos de acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 43) y el oligonucleotido en el cual se introdujeron 5 residuos de LNA (compuesto 48), mostrados en la Tabla 9, se evaluaron para determinar las afinidades de union con respecto a una hebra diana de ADN que tiene una secuencia completamente complementaria (coincidencia completa) y una hebra diana de ADN que tiene una desadaptacion de una sola base (apareamiento erroneo). Las secuencias de las hebras diana fueron las siguientes: coincidencia completa 5'-(AAAAAAAAAA)-3'; y apareamiento erroneo 5'-(AAAAATAAAA)-3'. Las afinidades de union se evaluaron como en el ejemplo 11 realizando un tratamiento de hibridacion para formar un complejo, y luego midiendo su valor de Tm, una temperatura a la que se disocian 50% de los complejos.
La figura 3 muestra los resultados. La figura 3 muestra curvas de Tm de un analogo de oligonucleotido que contiene un acido nucleico artificial en puente con guanidina y un oligonucleotido que contiene un LNA, con respecto a una hebra diana de ADN que tiene una secuencia totalmente complementaria (coincidencia completa) y una hebra diana de ADN que tiene un apareamiento erroneo de base unica (apareamiento erroneo). En la figura 3, el eje vertical indica la absorbancia a 260 nm, y el eje horizontal indica la temperatura (°C). La grafica muestra los resultados del analogo de oligonucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 43) con respecto al apareamiento erroneo (lmea unica delgada) y a la coincidencia completa (lmea discontinua unica delgada), y del oligonucleotido que contiene el LNA (compuesto 48) con respecto al apareamiento erroneo (lmea unica gruesa) y de coincidencia completa (lmea discontinua unica gruesa).
Como se desprende de la figura 3, el analogo de oligonucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina (compuesto 43) tema un valor de Tm suficientemente bajo con respecto a la hebra diana de apareamiento erroneo comparado con el valor de Tm con respecto a la hebra diana de coincidencia completa y la disminucion en el valor de Tm fue similar al del oligonucleotido que contiene el LNA (compuesto 48). De acuerdo con lo anterior, se observo que el oligonucleotido que contiene el acido nucleico artificial en puente con guanidina tema una afinidad de union extremadamente alta con una hebra diana, sin perjudicar la capacidad de reconocimiento de la base diana.
Ejemplo 13: Evaluacion del acido nucleico artificial en puente con guanidina (en lo sucesivo, se puede denominar como GuNA) respecto a la cinetica en celulas
(1) Smtesis e identificacion de oligonucleotidos modificados con GuNA marcados fluorescentemente (F-GuNA-ODN)
5
10
15
20
25
30
35
En primer lugar, utilizando el compuesto 28 obtenido en el ejemplo 4, un nucleosido nativo, y un amidito para la modificacion fluorescente descrito mas adelante, se sintetizo un analogo de oligonucleotido mediante un sintetizador nS-8 automatizado de oligonucleotido de ADN/ARN (fabricado por Gene Design Inc.). El analogo de oligonucleotido sintetizado es un compuesto para uso como precursor (compuesto 49) de los compuestos 53 a 57 mostrados en la Tabla 10. La estructura de este precursor (compuesto 49) se muestra a continuacion.
[Products quimico 19]
Boc
5'-DMTrO-C6-S-S-C6-Oligonudedti(:lo-3! (Compuesto49)
En la smtesis automatizada del oligonucleotido, toda la timidina amidita (numero de modelo: T111081), soporte de fase solida CPG timidina (numero de modelo: T361010), CapA (numero de modelo: L840020-06), CapB (numero de modelo: L850020-06), y un agente oxidante (numero de modelo: L860020-06) se obtuvieron a partir de los reactivos Proligo (marca registrada) SAFC (marca registrada). Se adquirio el acetonitrilo (numero de modelo: 018-14451) y la solucion de desbloqueo (numero de modelo: 042-28921) de Wako Pure Chemical Industries, Ltd. El activador utilizado fue 0.25 M de 5-etiltio-1H-tetrazol/acetonitrilo seco (codigo de fabricante: 30-3140-52, fabricado por Glen Research). El tiempo de acoplamiento de la solucion de acetonitrilo (0.1 M) que contiene el compuesto 28 se fijo a 20 minutos y, cuando el compuesto 28 se introdujo sucesivamente en el oligonucleotido para tres bases, se realizo el doble acoplamiento solamente en la tercera base. Las otras condiciones fueron como las de smtesis de ADN nativo.
Con respecto a la modificacion fluorescente, cuando se introdujo amidita como agente fluorescente en el oligonucleotido, el agente fluorescente se puede hidrolizar durante el tratamiento subsiguiente con acido trifluoroacetico al 75% (TFA). De este modo, se adiciono amidita Thiol-Modifer C6 S-S (codigo de fabricante: 101936-90, Glen Research) representada por la formula estructural a continuacion, mediante un sintetizador automatico de ADN en el extremo 5' del oligonucleotido y se termino el procesamiento sin desproteccion del grupo protector, esto es, el grupo dimetoxitritilo (grupo DMTr), de manera que se obtuvo un precursor (compuesto 49) de analogos de oligonucleotidos modificados marcados con fluorescencia (compuestos 53 a 57). Se sabe que el enlace disulfuro del amidito Thiol-Modifer C6 S-S es suficientemente resistente al 75% de TFA.
[Products qufmico 20]
NC
A efectos de comparacion, se adquirieron y utilizaron analogos de oligonucleotido (compuestos 58 a 61: mostrados en la Tabla 10 a continuacion) (fabricado por Gene Design Inc.) que contiene un acido nucleico artificial en puente con urea 2',4'-BNA/LNA (5-metil-2'-O,4'-C-metilenuridina) en lugar del compuesto 28. La estructura de este precursor (compuesto 50) de los analogos de oligonucleotidos se muestra a continuacion.
[Producto qmmico 21]
5'-HO-C6-S-S-C6-Oligonucleotido-3' (Compuesto 50)
El precursor obtenido (compuesto 49) se extrajo del soporte de CPG utilizando una solucion acuosa de amoniaco al 28%, se separo amoniaco de la misma utilizando una columna NAP-10 (numero de codigo: 17-0854-01, GE Healthcare) y el material resultante se purifico mediante RP-HPLC y se liofilizo. La RP-HPLC se realizo utilizando un Shimadzu lC-10ATvp, un Shimadzu SPD-10Avp, y un Shimadzu cTO-10vp siguiendo las condiciones que se indican a continuacion.
5
10
15
20
25
30
Fase movil
Solucion (A): solucion reguladora de acetato de trietilamonio 0.1 M, pH 7.0
Solucion (B): acetonitrilo al 80%/solucion reguladora de acetato de trietilamonio 0.1 M
Gradiente:
Concentracion solucion (B): 0-100% (80 min)
Columnas utilizadas:
Waters XBridge™ OST C18 2.5 |im (10 x 50 mm numero de producto: 186003954)
Velocidad de flujo: 3.0 mL/min Temperatura de la columna: 50°C Deteccion: UV (254 nm)
A continuacion, se adiciono acido trifluoroacetico al 75%, el grupo Boc y el grupo DMTr se separaron del precursor asf purificado (Compuesto 49) realizando el tratamiento a temperatura ambiente, durante 6 horas y se elimino un acido trifluoroacetico utilizando una columna NAP-10, de manera que se obtuvo un precursor liofilizado y desprotegido (compuesto 50).
De acuerdo con el protocolo del Thiol-Modifer C6 S-S, se adiciono solucion reguladora DTT/TE 100 mM (pH 7.0) al precursor desprotegido (compuesto 50) y el enlace disulfuro se redujo a temperatura ambiente durante 2 horas, de manera que se produjo un grupo SH. El precursor obtenido despues de la reduccion (compuesto 51) se purifico mediante RP-HpLC (Solucion (B): acetonitrilo al 50%/solucion reguladora de acetato de trietilamonio 0.1 M, Gradiente: concentracion de solucion (B) 0-50%/25 min), y se obtiene. A continuacion, se muestra la estructura del precursor obtenido despues de la reduccion (compuesto 51).
[Producto qmmico 22]
5'-HS-C6-Oligonucleotido-3' (Compuesto 51)
El grupo SH se produjo a traves de la reduccion como se ha descrito anteriormente, y despues se adiciono Alexa Fluor 488 C5 maleimida (codigo del producto: A-10254, fabricado por Life technologies) representada por la formula estructural al precursor purificado (compuesto 51) En una cantidad de 10 equivalentes con respecto al precursor (compuesto 51), despues de lo cual la mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante la noche, de modo que el grupo SH se unio a la maleimida (Nucleic Acids Research, 36, 2764-2777, 2008).
Posteriormente, la purificacion se realizo mediante RP-HPLC (Solucion (B): acetonitrilo al 50%/solucion reguladora de acetato de trietilamonio 0.1 M, Gradiente: concentracion de solucion (B) 0-50%/25 min), de manera que se obtuvieron los analogos de oligonucleotido modificado marcado con fluorescencia (compuesto 52: compuestos 53 a 61). De estos, los compuestos 54 a 57 eran oligonucleotidos modificados con GuNA marcados con fluorescencia (F-
5
10
GuNA-ODN). A continuacion, se muestra la estructura del analogo de oligonucleotido modificado marcado con fluorescencia obtenido (compuesto 52).
Los analogos de oligonucleotidos modificados marcados con fluorescencia sintetizados (compuestos 53 a 61) se purificaron y se determinaron sus purezas como en el ejemplo 2.
La espectrometna de masas de los analogos de oligonucleotidos modificados marcados con fluorescencia sintetizados (Compuestos 53 a 61) se realizo con un MALDI-TOF-MS (SpiralTOF JMS-S3000, JEOL). La Tabla 10 muestra los resultados.
Tabla 10
- Oligonucleotido * 1 Rendimiento (%) Espectrometna de masa de tiempo de vuelo
- Calculado (M-H-) Medido (M-H-)
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 53) 16 3873.84 3874.55
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 54) 11 3942.91 3943.78
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 55) 19 4081.04 4080.66
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 56) 16 4081.04 4080.90
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 57) 8 4288.23 4287.31
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 58) *2 3901.85 3902.53
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 59) *2 3957.87 3955.85
- 5'-d(FSTT
- TTTTTTTT)-3' (Compuesto 60) *2 3957.87 3957.19
- 5'-d(FST7TT7TT7TT)-3' (Compuesto 61)
- *2 4041.90 4040.82
*11: GuNA *1 7:2',4'-BNA/LNA S:thiol F: Alexa Fluor 488 *2 No medido
(2) Introduccion de oligonucleotidos modificados con GUNA marcados con fluorescencia F-GuNA-ODN en celulas de hepatoma humano (HuH-7) y observacion de la cinetica en las celulas
En primer lugar, como una preparacion, la parte de vidrio de una placa de fondo de vidrio (codigo de modelo: 3970035, Iwaki) para la observacion celular se recubrio con colageno mediante la aplicacion de 1 mL de 100 |ig/mL de colageno/acido clortndrico (pH 3.0) (Cellmatrix Type IC, fabricado por Nitta Gelatin Inc.).
Despues de dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos, se retiro el colageno de la misma y se lavo la placa una vez con solucion salina estandarizada con fosfato y despues se seco a temperatura ambiente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
durante 1 hora. A continuacion, se sembraron en placas 4.5 x 105 celulas HuH-7 (adquiridas de JCRB Cell Bank (numero de celula: JCRB0403)) y se cultivaron durante la noche en un medio libre de rojo de fenol al 10% de FBS/DMEM (numero de producto: 08490-05, fabricado por Nacalai Tesque, Inc.) (5% de CO2) y, a continuacion, se adicionaron cada uno de los analogos de oligonucleotidos modificados marcados con fluorescencia (compuestos 53 a 61) obtenidos en (1) a una concentracion de 500 nM.
Despues de adicionar los analogos de oligonucleotidos modificados marcados con fluorescencia (compuestos 53 a 61), el cultivo se continuo durante otras 12 horas, despues de lo cual las celulas HuH-7 cultivadas se lavaron una vez con una solucion de sal equilibrada de Hanks (HBSS, numero de producto 14025-092, fabricado por Life Technologies), y los nucleos y los lisosomas se tineron utilizando Hoechst 33342 (numero de producto: H3570, fabricado por tecnologfas Life) y LysoTracker (marca registrada) Red DND-99 (numero de catalogo: L-7528, fabricado por Life technologies) segun el protocolo. Posteriormente, se adicionaron 2 mL de solucion salina balanceada de Hanks y se adquirieron imagenes de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia de incidente (BZ-9000, fabricado por Keyence Corporation). Una lente objetiva utilizada era una lente de contraste de fase 40x (S Plan Fluor, fabricada por Nikon Corporation).
El conjunto de filtros de deteccion y el tiempo de exposicion de cada agente fluorescente son los siguientes.
Alexa Fluor 488: Ex 470/40 nm, DM 495 nm, BA 535/50 nm (GFP-B, fabricado por Keyence Corporation), 5 segundos
Hoechst 33342: Ex 360/40 nm, DM 400 nm, BA 460/50 nm (DAPI-B, fabricado por Keyence Corporation), 2 segundos
LysoTracker (marca comercial registrada) Red DND-99: Ex 540/25 nm, DM 565 nm, BA 605/55 nm (TRITC, fabricado por Keyence Corporation), 1.2 segundos
Como resultado de la introduccion de los analogos de oligonucleotidos modificados marcados con fluorescencia (compuestos 53 a 61) a las celulas HuH-7, se observo emision de fluorescencia particularmente intensa en las celulas cuando dos tipos de oligonucleotidos se adicionaron, esto es, el compuesto 57 en el cual se introdujeron 6 residuos del compuesto 28 y el compuesto 61 en el cual se introdujeron 6 residuos de 2',4'-BNA/lNa. En comparacion con estos, los otros oligonucleotidos teman un nivel mas bajo de emision de fluorescencia. La figura 4 muestra microfotograffas de cinetica del compuesto 57 (A a D) y del compuesto 61 (E a H) en celulas HuH-7: donde Ay E son imagenes de contraste de fase; B y F son imagenes de fluorescencia utilizando Alexa Fluor 488 (oligonucleotidos); C y G son imagenes de fluorescencia de Hoechst 33342 (nucleos); y D y H son imagenes de fluorescencia utilizando LysoTracker (lisosomas) (barra de escala 50 |im). Cuando se utilizo el oligonucleotido del compuesto 57 en el cual se introdujeron 6 residuos del compuesto 28, se observo intensa emision de fluorescencia (figura 4B). Por otra parte, cuando se utilizo el oligonucleotido del compuesto 61 en el cual se introdujeron 6 residuos de 2',4'-BNA/LNA, se observo en cierta medida la emision de fluorescencia, pero su nivel fue inferior al del compuesto 57 utilizando el compuesto 28 (figura 4F). La razon de esto parece ser que, en el caso del compuesto 57, se introdujeron 6 residuos del compuesto 28, y, de este modo, se mejoro la eficiencia de introduccion a las celulas y se cambio la carga electrica de todo el oligonucleotido de manera que se mejoro la eficiencia de adsorcion a las superficies de las celulas. Por otra parte, parece que, en el caso del compuesto 61, se introdujeron 6 residuos de 2',4'-BNA/LNA, y, de este modo, se mejoro la eficiencia de introduccion a las celulas, pero la carga electrica no se cambio y la eficiencia de adsorcion a las superficies de las celulas no fue mejorada, de manera que el nivel de emision de fluorescencia fue menor que el del compuesto 57.
La figura 5 muestra microfotograffas de cinetica del compuesto 57 en celulas HuH-7, mostrando fotograffas (A a D) obtenidas agrandando la region indicada por la flecha en la figura 4B, en las figuras 4A a 4D. Una observacion cercana de la localizacion de la emision de fluorescencia obtenida en las celulas mostro que los oligonucleotidos adicionados no estaban presentes dentro de los nucleos, y una gran cantidad de los mismos se acumulaba en las vesfculas de los citoplasmas y tambien estaba presente en los lisosomas.
Es decir, se demostro que el cambio de la carga electrica de todo el oligonucleotido proporcionando el grupo guanidino cargado positivamente al oligonucleotido cargado negativamente es un enfoque util para mejorar la eficacia de introduccion del oligonucleotido en las celulas.
Observese que ha sido convencionalmente diffcil introducir oligonucleotidos en celulas sin usar un sistema de administracion de farmacos en vista de la resistencia enzimatica o de la permeabilidad celular. Con el fin de resolver este problema, se utiliza generalmente un enfoque en donde se efectua la modificacion de fosforotioato en la estructura principal de fosfato de los oligonucleotidos. Sin embargo, la modificacion del fosforotioato puede disminuir la productividad, la seguridad y la accion del farmaco, debido al problema de quiralidad en los atomos de fosforo. Esta vez, fue posible mejorar la permeabilidad celular sin realizar modificacion de fosforotioato y, de este modo, se ve que los nucleosidos artificiales en puente con guanidina y los oligonucleotidos de la presente invencion superan estos inconvenientes y pueden contribuir al uso de acidos nucleicos como productos farmaceuticos.
Claims (5)
- Reivindicaciones1. Un compuesto representado por la formula I o II a continuacion o una sal del mismo:[Proclucto c|Lii'mico 1]
imagen1 (I) (II)(en donde B1 representa un grupo purina-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1-ilo que puede tener uno 5 cualquiera o mas sustituyentes seleccionados de un grupo a, en donde el grupo a consiste en un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo lineal Ci a Ca, un grupo alcoxi lineal Ci a Ca, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquiltio lineal Ci a Ca, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal Ci a Ca, un grupo amino protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, y un atomo de halogeno;10 R1, R12, y R13 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci a C7 quepuede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, oimagen2 yR2 y R3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo protector para un grupo 15 hidroxilo en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede ser un heteroatomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes 20 seleccionados del grupo a, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, o -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del 25 acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi Ci a C5, un grupo alquiltio Ci a C5, un grupo cianoalcoxi Ci a Ca, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca)). - 2. El compuesto o la sal del mismo de la reivindicacion 1, en donde, en la formula I o II, Bi representa un grupo 6- aminopurina-9-ilo, un grupo 2,6-diaminopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-cloropurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6- fluoropurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-bromopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-hidroxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino- 2-metoxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-cloropurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2,65 dimetoxipurina-9-ilo, un grupo 2,6-dicloropurina-9-ilo, un grupo 6-mercaptopurina-9-ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-i,2- dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-cloro- 1,2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-metoxi-1, 2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-mercapto-i,2- dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-1, 2-dihidropirimidina-1-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2- dihidropirimidina-1-ilo, o un grupo 4-amino-5-metil-2-oxo-1,2-dihidropirimidina-1-ilo.10 3. El compuesto o la sal del mismo de la reivindicacion 1, en donde, en la formula I o II, B1 representa un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-1,2-dihidropirimidina-1-ilo.
- 4. Un oligonucleotido que contiene al menos una de las estructuras de nucleosidos representadas por la formula I' o II' a continuacion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo:
imagen3 15 (en donde Bi representa un grupo purina-9-ilo o un grupo 2-oxo-1,2-dlhidropirimidina-1-ilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados de un grupo a, en donde el grupo aDconsiste en un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo lineal Ci a C6, un grupo alcoxi lineal Ci a C6, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquiltio lineal Ci a C6, un grupo amino, un grupo alquilamino lineal Ci a C6, un grupo 20 amino protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, y un atomo de halogeno;R1, Ri2, y Ri3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo protector para un grupo amino, oimagen4 Ri4 representa un atomo de hidrogeno; y510152025R2 y R3 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno, un grupo protector para un grupo hidroxilo en la smtesis del acido nucleico, un grupo alquilo C1 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo alquenilo C2 a C7 que puede ser ramificado o formar un anillo, un grupo arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo aralquilo que tiene una unidad estructural arilo C3 a C12 que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a y que puede tener un heteroatomo, un grupo acilo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo sililo que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato que puede tener uno cualquiera o mas sustituyentes seleccionados del grupo a, un grupo fosfato protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, o -P(R4)R5 (en donde R4 y R5 cada uno independientemente representan un grupo hidroxilo, un grupo hidroxilo protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo mercapto, un grupo mercapto protegido por un grupo protector en la smtesis del acido nucleico, un grupo amino, un grupo alcoxi Ci a C5, un grupo alquiltio Ci a C5, un grupo cianoalcoxi Ci a Ca, y/o un grupo amino sustituido con un grupo alquilo Ci a Ca)). - 5. El oligonucleotido o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo de la reivindicacion 4, en donde, en la formula I' o II', Bi representa un grupo a-aminopurina-9-ilo, un grupo 2,6-diaminopurina-9-ilo, un grupo 2-amino-a- cloropurina-9-ilo, un grupo a 2- amino-6-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2-amino-6-bromopurina-9-ilo, un grupo 2-amino- a-hidroxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-metoxipurina-9-ilo, un grupo 6-amino-2-cloropurina-9-ilo, un grupo 6-amino- 2-fluoropurina-9-ilo, un grupo 2,6-dimetoxipurina-9-ilo, un grupo 2,6-dicloropurina-9-ilo, un grupo a-mercaptopurina-9- ilo, un grupo 2-oxo-4-amino-i,2-dlhidropirimidina-i-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-fluoro-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 4-amino-2-oxo-5-cloro-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-metoxi-i, 2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-mercapto-i, 2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2-oxo-4-hidroxi-i, 2-dihidropirimidina-i-ilo, un grupo 2- oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2-dihidropirimidina-i-ilo, o un grupo 4-amino-5-metil-2-oxo-i,2-dihidropirimidina-i-ilo.
- 6. El oligonucleotido oligonucleotido o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo de la reivindicacion 4, en donde, en la formula I' o II', Bi representa un grupo 2-oxo-4-hidroxi-5-metil-i,2-dihidropirimidina-i-ilo.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012208906 | 2012-09-21 | ||
| JP2012208906 | 2012-09-21 | ||
| JP2013022360 | 2013-02-07 | ||
| JP2013022360 | 2013-02-07 | ||
| PCT/JP2013/075370 WO2014046212A1 (ja) | 2012-09-21 | 2013-09-19 | グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2622716T3 true ES2622716T3 (es) | 2017-07-07 |
Family
ID=50341516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13838365.8T Active ES2622716T3 (es) | 2012-09-21 | 2013-09-19 | Oligonucleótido y nucleósido artificial en puente con guanidina |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10377789B2 (es) |
| EP (1) | EP2899197B1 (es) |
| JP (1) | JP6048982B2 (es) |
| KR (1) | KR101707437B1 (es) |
| CN (1) | CN104768964B (es) |
| CA (1) | CA2885719C (es) |
| ES (1) | ES2622716T3 (es) |
| IN (1) | IN2015DN02238A (es) |
| WO (1) | WO2014046212A1 (es) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2957567B1 (en) | 2013-02-18 | 2019-06-05 | Shionogi & Co., Ltd. | Nucleoside and nucleotide, having nitrogen-containing hetercycle structure |
| TW201718618A (zh) * | 2015-09-18 | 2017-06-01 | 田邊三菱製藥股份有限公司 | 架橋型核酸ＧｕＮＡ，其製造方法，及中間體化合物 |
| JP6569920B2 (ja) * | 2016-01-07 | 2019-09-04 | 国立大学法人大阪大学 | α−シヌクレイン発現抑制剤 |
| WO2018155450A1 (ja) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | 国立大学法人大阪大学 | アンチセンスオリゴ核酸 |
| WO2018155451A1 (ja) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | 国立大学法人大阪大学 | 核酸化合物およびオリゴヌクレオチド |
| WO2019009298A1 (ja) * | 2017-07-05 | 2019-01-10 | 国立大学法人大阪大学 | α－シヌクレイン発現抑制剤 |
| TWI825025B (zh) | 2017-08-31 | 2023-12-11 | 日商田邊三菱製藥股份有限公司 | 包含il-33拮抗劑的子宮內膜異位症治療劑 |
| WO2019216433A1 (ja) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 日本新薬株式会社 | オリゴ核酸化合物の製造方法 |
| JP7473113B2 (ja) * | 2018-07-31 | 2024-04-23 | 国立大学法人大阪大学 | オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬 |
| US20210317459A1 (en) | 2018-09-05 | 2021-10-14 | Osaka University | Antisense oligonucleotide targeting arl4c molecule, and nucleic acid drug using antisense oligonucleotide |
| EP4275690A3 (en) | 2018-11-12 | 2023-11-22 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Crosslinked artificial nucleic acid alna |
| EP3950006A4 (en) | 2019-03-29 | 2024-06-12 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | COMPOUND, METHOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR SETTING DUX4 EXPRESSION |
| CN113646007A (zh) | 2019-03-29 | 2021-11-12 | 希森美康株式会社 | 新人工核酸、其制造方法及用途 |
| PE20220574A1 (es) | 2019-05-31 | 2022-04-20 | Aligos Therapeutics Inc | Oligonucleotidos gapmer modificados y metodos de uso |
| EP3986906A1 (en) * | 2019-06-20 | 2022-04-27 | F. Hoffmann-La Roche AG | Radiolabeled moem type oligonucleotides and process for their preparation |
| EP4151237A1 (en) | 2020-05-12 | 2023-03-22 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Compound, method and pharmaceutical composition for regulating expression of ataxin 3 |
| CN116322706A (zh) | 2020-09-25 | 2023-06-23 | 株式会社理真思 | 新人工核酸、其制造方法和用途 |
| TW202233838A (zh) | 2020-11-06 | 2022-09-01 | 日商住友製藥股份有限公司 | Ｒｐｓ２５基因之表現及／或功能調節劑 |
| EP4299744A1 (en) | 2021-02-25 | 2024-01-03 | Osaka University | Oligonucleotide for inducing n-exon skipping during rest mrna precursor processing |
| WO2022250072A1 (ja) * | 2021-05-26 | 2022-12-01 | ルクサナバイオテク株式会社 | 心疾患治療薬 |
| CA3221758A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Antisense nucleic acid |
| CN113552198B (zh) * | 2021-05-31 | 2024-03-26 | 武汉维尔博生物科技有限公司 | 一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法 |
| JPWO2023026994A1 (es) | 2021-08-21 | 2023-03-02 | ||
| WO2023093960A1 (en) * | 2021-11-26 | 2023-06-01 | Syddansk Universitet | Modified peptide-oligonucleotide conjugate |
| TW202345861A (zh) * | 2022-03-17 | 2023-12-01 | 美商艾利格斯醫療公司 | 經修飾之間隔體寡聚物及其使用方法 |
| WO2024101446A1 (ja) * | 2022-11-10 | 2024-05-16 | ルクサナバイオテク株式会社 | 架橋部にグアニジノ構造を有する修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500707A (en) * | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
| US4458066A (en) * | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US5132418A (en) * | 1980-02-29 | 1992-07-21 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4668777A (en) * | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
| US4973679A (en) * | 1981-03-27 | 1990-11-27 | University Patents, Inc. | Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates |
| US5696253A (en) * | 1994-06-30 | 1997-12-09 | The Regents Of The University Of California | Polynucleoside chain with 3'→5' guanidyl linkages |
| JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
| JP4151751B2 (ja) * | 1999-07-22 | 2008-09-17 | 第一三共株式会社 | 新規ビシクロヌクレオシド類縁体 |
| WO2003068795A1 (fr) * | 2002-02-13 | 2003-08-21 | Takeshi Imanishi | Analogues de nucleoside et derive d'oligonucleotide comprenant un analogue nucleotidique de ces composes |
| US7427672B2 (en) * | 2003-08-28 | 2008-09-23 | Takeshi Imanishi | Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type |
| WO2007026824A1 (ja) | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Osaka University | オリゴヌクレオチド類縁体 |
| AU2010312751B2 (en) * | 2009-10-29 | 2014-07-24 | Osaka University | Bridged artificial nucleoside and nucleotide |
| US9206216B2 (en) * | 2010-04-21 | 2015-12-08 | Pierce Biotechnology, Inc. | Modified nucleotides methods and kits |
| US8536323B2 (en) * | 2010-04-21 | 2013-09-17 | Pierce Biotechnology, Inc. | Modified nucleotides |
-
2013
- 2013-09-19 CN CN201380057335.0A patent/CN104768964B/zh active Active
- 2013-09-19 IN IN2238DEN2015 patent/IN2015DN02238A/en unknown
- 2013-09-19 ES ES13838365.8T patent/ES2622716T3/es active Active
- 2013-09-19 US US14/428,646 patent/US10377789B2/en active Active
- 2013-09-19 WO PCT/JP2013/075370 patent/WO2014046212A1/ja active Application Filing
- 2013-09-19 CA CA2885719A patent/CA2885719C/en active Active
- 2013-09-19 JP JP2014536921A patent/JP6048982B2/ja active Active
- 2013-09-19 KR KR1020157010144A patent/KR101707437B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-19 EP EP13838365.8A patent/EP2899197B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014046212A1 (ja) | 2014-03-27 |
| CN104768964B (zh) | 2017-03-29 |
| US20150266917A1 (en) | 2015-09-24 |
| KR20150056647A (ko) | 2015-05-26 |
| JP6048982B2 (ja) | 2016-12-21 |
| IN2015DN02238A (es) | 2015-08-21 |
| CN104768964A (zh) | 2015-07-08 |
| US10377789B2 (en) | 2019-08-13 |
| CA2885719A1 (en) | 2014-03-27 |
| KR101707437B1 (ko) | 2017-02-16 |
| EP2899197A1 (en) | 2015-07-29 |
| EP2899197A4 (en) | 2016-03-09 |
| JPWO2014046212A1 (ja) | 2016-08-18 |
| CA2885719C (en) | 2017-07-11 |
| EP2899197B1 (en) | 2017-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2622716T3 (es) | Oligonucleótido y nucleósido artificial en puente con guanidina | |
| JP7485642B2 (ja) | 治療化合物用の標的化リガンド | |
| ES2382807T3 (es) | Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación | |
| US9611479B2 (en) | Crosslinked nucleoside and nucleotide | |
| JP5669073B2 (ja) | 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド | |
| AU2023255025A1 (en) | Targeting ligands | |
| JP5030998B2 (ja) | ヌクレオシド類縁体およびそのヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチド誘導体 | |
| Kupryushkin et al. | Phosphoryl guanidines: a new type of nucleic acid analogues | |
| WO2016017422A1 (ja) | 架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチド | |
| JPWO2020158910A1 (ja) | ５’位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチド | |
| US20220127300A1 (en) | 5'-modified nucleoside and nucleotide using same | |
| WO2015125845A1 (ja) | 含窒素非芳香族複素環を含む核酸のリン酸部位修飾 | |
| WO2024101446A1 (ja) | 架橋部にグアニジノ構造を有する修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法 | |
| WO2023167094A1 (ja) | ５'位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチド | |
| OA20532A (en) | Integrin ligands and uses thereof. | |
| JP2006063054A (ja) | 含窒素二環式糖を有する新規人工核酸 |