WO2022250072A1 - 心疾患治療薬 - Google Patents

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WO2022250072A1
WO2022250072A1 PCT/JP2022/021330 JP2022021330W WO2022250072A1 WO 2022250072 A1 WO2022250072 A1 WO 2022250072A1 JP 2022021330 W JP2022021330 W JP 2022021330W WO 2022250072 A1 WO2022250072 A1 WO 2022250072A1
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WO
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carbon atoms
nucleic acid
hydrogen atom
linear
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PCT/JP2022/021330
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English (en)
French (fr)
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由依 宮阪
アジャヤラム セレスタ
幸介 千葉
峻哲 川野邊
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ルクサナバイオテク株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic drug for heart disease containing an oligonucleotide having a nucleoside with a specific modification, an antisense oligonucleotide containing the oligonucleotide to enhance the cardiac function, a method for producing the same, and the like.
  • Antisense oligonucleotides exert their effects by hybridizing to target nucleic acid sequences and suppressing gene expression itself.
  • Various artificial nucleic acids have been developed and introduced with the aim of improving the nuclease resistance of antisense oligonucleotides (ASO) and improving their binding affinity and specificity to target nucleic acids, and various formulations have been launched.
  • ASO antisense oligonucleotides
  • Patent Document 1 the ASOs that have been developed so far tend to accumulate in specific organs such as the liver and kidneys due to the characteristics of the ASO itself or the characteristics of the artificial nucleic acid. It is known that the desired effect cannot be exhibited, and the applications and target diseases are limited.
  • Non-Patent Document 1 For the purpose of treating heart diseases caused by specific gene mutations such as muscular dystrophy, attempts have been made to exert the effects of ASO on the heart by, for example, binding fatty acids as ligands to ASO ( Non-Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide an ASO or the like that is excellent in terms of production and cost and that can exert an effect on the heart without binding specific substances such as fatty acids.
  • an antisense oligonucleotide (ASO) having a modified nucleoside in which guanidine is introduced into the bridge between the 2' and 4' sugar moieties of the nucleotide has been found to be effective against the heart, where conventional ASO is difficult to exert its effect.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • the present inventors have found that the ASO having the modified nucleoside can exhibit an effect, and obtained the idea that the use of the ASO having the modified nucleoside as a therapeutic agent will lead to the treatment of heart disease. Based on this idea, the present inventors have made further intensive studies and completed the present invention.
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • a therapeutic drug for heart disease comprising an oligonucleotide having one or more nucleosides represented by [2] The therapeutic agent of [1], wherein R 12 is any branched chain alkyl group of 3 to 7 carbon atoms having the same or different branched chains.
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 , and R 13 each independently represent a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group, and R 14 is , representing a hydrogen atom)
  • a drug for enhancing the function of an antisense oligonucleotide in the heart comprising an oligonucleotide having one or more nucleosides represented by: [7] The potentiator of [6], wherein R 12 is any branched chain alkyl group of 3 to 7 carbon atoms with the same or different branched chains.
  • a method for producing a therapeutic drug for heart disease comprising the step of synthesizing the oligonucleotide according to any one of [1] to [5].
  • a method for designing an antisense oligonucleotide with enhanced function, wherein at least one nucleoside constituting the oligonucleotide is represented by the following formula I or II:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 , and R 13 each independently represent a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group, and R 14 is , representing a hydrogen atom)
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 , and R 13 each independently represent a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group, and R 14 is , representing a hydrogen atom)
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • a method for enhancing the function of an antisense oligonucleotide in a mammalian heart comprising administering an oligonucleotide having one or more nucleosides represented by: [15] The enhancement method according to [14], wherein the antisense oligonucleotide function enhancement in the mammalian heart is dystrophin production promotion in the mammalian heart.
  • the present invention enables the production of ASO that can exert its effect even on the heart.
  • the ASO is suitable as a therapeutic drug for heart disease, particularly heart disease caused by gene mutation, and is excellent in terms of production and cost.
  • the ASO may also exert effects on the heart, thus enhancing the function of ASO in the heart.
  • the ASO can promote the production of (truncated) dystrophin by exon skipping, for example, in patients with Duchenne muscular dystrophy for the reasons described above.
  • FIG. 1 shows the amount of RNA (MALAT1) in each organ after single intravenous administration of antisense oligonucleotides to normal mice.
  • FIG. 2 shows the amount of RNA (MALAT1) in the liver after a single intravenous administration of antisense oligonucleotides with different modifications to normal mice.
  • FIG. 3 shows the amount of RNA (MALAT1) in the heart after a single intravenous administration of antisense oligonucleotides with different modifications to normal mice.
  • FIG. 4 shows the results of exon skipping assays using splicing control oligonucleotides (SSO) containing LNA or GuNA(t-Bu) modifications.
  • SSO splicing control oligonucleotides
  • the present invention provides an antisense oligonucleotide having a modified nucleoside in which guanidine is introduced into the bridge between the 2' and 4' sugar moieties of nucleotides (hereinafter also referred to as "guanidine-bridged nucleoside").
  • ASO is an invention that was completed based on the discovery that it can also exert an effect on the heart. In one aspect, the effects of the nucleotides in liver and muscle prior to the ASO of the present invention may be preserved.
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 , and R 13 each independently represent a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group, and R 14 is , representing a hydrogen atom
  • Oligonucleotides having one or more nucleosides i.e., guanidine-bridged nucleosides
  • this A therapeutic drug for heart disease hereinafter sometimes referred to as "therapeutic drug of the present invention
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, or n-hexyl group.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples include methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group and the like.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group and an n-propylthio group.
  • linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, which may be the same or different.
  • Amino groups with two chain alkyl groups are included. Examples thereof include methylamino group, dimethylamino group, ethylamino group, methylethylamino group and diethylamino group.
  • any straight chain alkyl group having 1 to 7 carbon atoms includes methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, and n-heptyl groups.
  • Optional branched chain alkyl groups of 3 to 7 carbon atoms having the same or different branched chains include isopropyl, isobutyl, tert-butyl, isopentyl groups and the like, and
  • Optional cyclic alkyl groups include cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like.
  • halogen atom includes, for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • protecting group for amino group for nucleic acid synthesis "hydroxyl group protected by protecting group for nucleic acid synthesis”, “mercapto group protected by protecting group for nucleic acid synthesis”, “protecting group for nucleic acid synthesis”
  • protecting group for nucleic acid synthesis The term “protecting group” described in “protected amino group” is not particularly limited as long as it can stably protect an amino group, a hydroxyl group, or a mercapto group during nucleic acid synthesis. Specifically, it refers to protective groups that are stable under acidic or neutral conditions and cleavable by chemical methods such as hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, and photolysis.
  • Examples of such protecting groups include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms; alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms; acyl groups; tetrahydropyranyl groups or tetrahydrothiopyranyl groups; a silyl group; a methyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; a methyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; a methyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; a methyl group substituted with a substituted alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; an ethyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; an ethyl group substituted with a halogen atom; and an aryl group having 1 to 3 a substituted methyl group; an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a methyl group substitute
  • the tetrahydropyranyl group or tetrahydrothiopyranyl group includes a tetrahydropyran-2-yl group, a 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, a 4-methoxytetrahydropyran-4-yl group and a tetrahydropyranyl group.
  • a tetrahydrofuranyl group or a tetrahydrothiofuranyl group includes a tetrahydrofuran-2-yl group and a tetrahydrothiofuran-2-yl group.
  • Examples of the methyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include a methoxymethyl group, 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl group, ethoxymethyl group, propoxymethyl group, isopropoxymethyl group, butoxymethyl group, A t-butoxymethyl group and the like can be mentioned.
  • 2-methoxyethoxymethyl group etc. are mentioned as a methyl group substituted with the C1-C6 alkoxy group substituted with the C1-C6 alkoxy group.
  • Examples of the methyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a halogen atom include a 2,2,2-trichloroethoxymethyl group and a bis(2-chloroethoxy)methyl group.
  • Examples of the ethyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include a 1-ethoxyethyl group and a 1-(isopropoxy)ethyl group.
  • Ethyl groups substituted with halogen atoms include 2,2,2-trichloroethyl groups and the like.
  • the methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups includes a benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, ⁇ -naphthyldiphenylmethyl group, 9-an thrylmethyl group and the like.
  • a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom and/or a cyano group 4-methyl benzyl group, 2,4,6-trimethylbenzyl group, 3,4,5-trimethylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group, 2- nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group, 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 4-cyanobenzyl group and the like.
  • a carbonyl group substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, an isobutoxycarbonyl group and the like.
  • the "aryl group substituted with a halogen atom, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms and/or a nitro group” includes a 4-chlorophenyl group, a 2-fluorophenyl group, a 4-methoxyphenyl group, a 4-nitrophenyl group, 2,4-dinitrophenyl group and the like.
  • a carbonyl group substituted with a halogen atom, a cyano group and/or a silyl group substituted with 3 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms and substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms 2, 2,2-trichloroethoxycarbonyl group, 2-cyanoethoxycarbonyl group, 2-trimethylsilylethoxycarbonyl group and the like.
  • alkenyloxycarbonyl groups include vinyloxycarbonyl groups and aryloxycarbonyl groups.
  • aralkyloxycarbonyl group optionally substituted with an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms and/or an aryl group substituted with a nitro group examples include a benzyloxycarbonyl group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl group, 2-nitrobenzyloxycarbonyl group, 4-nitrobenzyloxycarbonyl group and the like.
  • Examples of protective groups for "a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis” include an aliphatic acyl group; an aromatic acyl group; a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups; a halogen atom and 1 carbon atom. aryl groups substituted with 6 to 6 alkoxy groups and/or nitro groups; alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms; or alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms; Examples of the “amino group-protecting group for nucleic acid synthesis” include an acyl group and a benzoyl group. Examples of the “protecting group” of the "mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis” include an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, and a benzoyl group.
  • oligonucleotides shall also include pharmacologically acceptable salts of oligonucleotides.
  • the salts include alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts and cobalt salts.
  • metal salts such as salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts, guanidine salts, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris(hydroxymethyl) Amine salts such as organic salts such as aminomethane salts; Halohydrogenates such as hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, nitrates, perchlorates, Inorganic acid salts such as
  • guanidine-bridged nucleoside may be at any position of the oligonucleotide contained in the therapeutic agent of the present invention, for example, at the 5' end or the 3' end.
  • nucleosides other than guanidine-bridged nucleosides constituting oligonucleotides contained in the therapeutic agent of the present invention include nucleosides represented by the following formula IV.
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • a mercapto group a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, a linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, and a halogen atom
  • R 8 is a hydrogen atom
  • R 9 is a hydrogen atom, a halogen atom, or a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 8 and R 9 together have the following formula:
  • R 21 is selected from a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and the above ⁇ group an aryl group having 3 to 10 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a heteroatom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12 carbon atoms which may optionally contain a heteroatom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 22 and R 23 are each independently a hydrogen atom; optionally substituted with an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom, and optionally branched or forming a ring; an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; or an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms
  • examples of the crosslinked nucleoside include nucleosides having the following structural formula.
  • R is a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, a hetero atom an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain , an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group, more preferably R is a hydrogen atom or a methyl group.
  • Base The definition is the same as in Formula IV above.
  • Nucleosides constituting oligonucleotides contained in the therapeutic agent of the present invention may be natural nucleosides, and examples of such natural nucleosides include adenosine, N6-methyladenosine, guanosine, uridine, 5-methyluridine, Cytidine, deoxyadenosine, N6-methyl-2'-deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, deoxyuridine, deoxycytidine, 5-methyl-2'-deoxycytidine and the like.
  • the length of the oligonucleotide contained in the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it has antisense activity, but it is typically 10 to 50 nucleotides long, preferably 10 to 30 nucleotides long, more preferably 10 to 30 nucleotides long. is 13-30 nucleotides long, more preferably 15-20 nucleotides long.
  • modifications other than bridging between the 2' and 4' positions may be further applied.
  • modifications include, for example, phosphorothioate modification, 2'-O-methoxyethyl modification of the sugar moiety, 2'-O-methyl modification of the sugar moiety, 2' fluoro modification of the sugar moiety, methylation of Base (base moiety) or Examples include, but are not limited to, acetylation, Base substitution, and the like.
  • Base it is preferable to substitute with one capable of forming a base pair with the base of the target of Base before substitution (ie, forming a base pair with the Base).
  • the base pair may be not only a Watson-Crick base pair but also a Hoogsteen base pair or a Wobble base pair.
  • the oligonucleotide contained in the therapeutic agent of the present invention is a target mRNA (in this specification, mRNA includes pre-mRNA.) function ( post-transcriptional modification, translation, etc.) (hereinafter sometimes referred to as “suppressive ASO"), or enhance the function (hereinafter referred to as “enhanced ASO”).
  • suppressive ASO post-transcriptional modification, translation, etc.
  • Inhibitory ASOs typically form a double-stranded region with a target mRNA, and the double-stranded region is cleaved by ribonuclease H (RNase H), thereby suppressing the function of the target mRNA.
  • RNase H ribonuclease H
  • enhanced ASO typically forms a double-stranded region with a splicing promoting sequence of pre-mRNA as a splicing control oligonucleotide (SSO) to mask the sequence and skip splicing.
  • SSO splicing control oligonucleotide
  • the function of the mRNA can be enhanced by forming a double-stranded region with the binding sequence of the enzyme that degrades the mRNA contained in the target mRNA to mask the sequence and suppress the degradation of the mRNA.
  • the function of inhibitory ASO and the function of enhancing ASO are also collectively referred to as "function of ASO" or "antisense activity”.
  • the ASO of the present invention can suppress or enhance the function of target mRNA, thereby controlling gene expression.
  • the term "gene expression” is used to include at least "production of a functional protein encoded by the target mRNA", but it also includes “production of target mRNA". Used in the sense of including. Therefore, the suppression of gene expression means not only the reduction in the amount of functional protein encoded by the gene in cells, but also the reduction of mRNA transcribed from the gene by administration of the ASO of the present invention. It may also include decreasing its abundance in a cell.
  • the enhancement of gene expression means not only that the administration of the ASO of the present invention increases the abundance in cells of the functional protein encoded by the gene, but also that the mRNA transcribed from the gene may also include increasing the abundance of in cells.
  • the inhibitory ASO is preferably a gapmer-type oligonucleotide.
  • the term "gapmer-type oligonucleotide” means a plurality of (eg, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or more) nucleotides recognized by RNase H.
  • ap region is at least one modified to confer resistance to ribonucleases (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more) nucleotides (herein, the 3′ external region is referred to as the “3′ wing region” and the 5′ external region as the “5′ (sometimes referred to as "wing regions”).
  • ribonucleases e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more
  • the 3′ external region is referred to as the “3′ wing region” and the 5′ external region as the “5′ (sometimes referred to as "wing regions”).
  • At least one nucleoside constituting each of the 3' wing region and the 5' wing region is preferably a bridging nucleoside.
  • the enhanced ASO preferably has at least one nucleoside modified to impart resistance to RNase.
  • Such ASOs may be those in which all nucleoside residues are modified, or those in which some nucleoside residues are modified (ie, Mixmer-type oligonucleotides).
  • a bridged nucleoside is preferred as such a modified nucleoside.
  • can also exert an effect on the heart means that at least the function of target mRNA in the heart can be suppressed or enhanced compared to oligonucleotides that do not have guanidine-bridged nucleosides. Also, “the effect of a nucleotide can be maintained” means that the function of ASO is maintained or improved compared to an oligonucleotide having no guanidine-bridged nucleoside.
  • treatment includes alleviation or improvement of symptoms, progression of disease or symptoms, or prevention, delay, or cessation of manifestation of symptoms.
  • Target diseases of the therapeutic agent of the present invention include, for example, overexpression or overaccumulation of the protein encoded by the ASO target mRNA of the present invention, or deletion or reduction of the protein encoded by the ASO target mRNA of the present invention. underlying heart disease.
  • the target of the ASO of the present invention is a splicing-promoting sequence within an exon, and introduction of the ASO during the splicing reaction inhibits the function of the splicing-promoting sequence, induces exon skipping, and eliminates the exon sequence.
  • cardiomyopathy idiopathic cardiomyopathy, specific cardiomyopathy
  • Specific cardiomyopathies include, for example, ischemic myocardial disease, inflammatory myocardial disease, metabolic myocardial disease, and systemic myocardial disease.
  • Becker type (BMD) muscular dystrophy For example, in the case of Duchenne muscular dystrophy, the ASO of the present invention targets the splicing promoting sequence of the pre-mRNA transcribed from the dystrophin gene (DMD gene).
  • DMD gene dystrophin gene
  • an effective amount of the ASO of the present invention may be used alone, or may be formulated as a pharmaceutical composition together with any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier (formulated are also referred to as therapeutic agents).
  • a pharmaceutically acceptable carrier formulated are also referred to as therapeutic agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrance agents such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium hydrogen sulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspending agents such as methyl cellulose and polyvinyl pyrrolid, dispersing agents such as surfactants, water, Examples include, but are not limited to, diluents such as physiological saline, base waxes, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention may further contain a reagent for nucleic acid introduction.
  • the nucleic acid introduction reagent includes calcium chloride, calcium enrichment reagent, atelocollagen; liposome; nanoparticle; Cationic lipids such as (ethyleneimine) (PEI) and the like can be used.
  • the therapeutic agent of the present invention may also be a pharmaceutical composition in which the ASO of the present invention is encapsulated in liposomes.
  • Liposomes are closed microscopic vesicles having an internal phase surrounded by one or more lipid bilayers, and can typically hold water-soluble substances in the internal phase and fat-soluble substances within the lipid bilayers.
  • the ASOs of the present invention may be retained within the liposome internal phase or within the lipid bilayer.
  • the liposomes used in the present invention may be single-layered or multi-layered, and the particle size can be appropriately selected within the range of, for example, 10 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm. Considering deliverability to the target tissue, the particle size is, for example, 200 nm or less, preferably 100 nm or less.
  • Methods for encapsulating water-soluble compounds such as oligonucleotides in liposomes include lipid film method (vortex method), reverse phase evaporation method, surfactant removal method, freeze-thaw method, remote loading method and the like. is not limited to, and any known method can be selected as appropriate.
  • the medicament of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals (e.g. humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, dogs, cats, monkeys). is possible, but parenteral administration is preferred. Accordingly, there is also provided a method of treating heart disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of the ASO of the present invention.
  • mammals e.g. humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, dogs, cats, monkeys.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous
  • aqueous and non-aqueous There are isotonic sterile injectable solutions, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats, tonicity agents and the like.
  • aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives, and the like.
  • the formulation can be enclosed in a container such as an ampoule or a vial in units of unit doses or multiple doses.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in such a manner that they can be dissolved or suspended in an appropriate sterile vehicle just prior to use.
  • Other formulations suitable for parenteral administration can include sprays and the like.
  • the content of the ASO of the present invention in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.1 to 100% by weight of the entire pharmaceutical composition.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the purpose of administration, administration method, type of target disease, severity, and conditions of administration target (sex, age, body weight, etc.).
  • a single dose of the ASO of the present invention is generally 0.01 mg/kg to 1000 mg/kg, and in the case of topical administration, it is preferably 0.001 mg/body to 100 mg/body. It is desirable to administer such doses 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.
  • the therapeutic drug of the present invention can also be used in combination with, for example, a therapeutic drug for heart disease that is already on the market.
  • These concomitant drugs can be formulated together with the medicament of the present invention and administered as a single preparation, or can be formulated separately from the medicament of the present invention and administered as the same drug as the medicament of the present invention. Alternatively, they can be administered simultaneously or staggered by different routes.
  • the dose of these concomitant drugs may be the amount usually used when the drug is administered alone, or the dose can be reduced from the amount usually used.
  • one or more oligonucleotides having guanidine-bridged nucleosides of the present invention are provided.
  • enhancement of the function of ASO means that the function of the ASO of the present invention is a modified nucleoside (hereinafter referred to as (Also called "guanidine-bridged nucleoside").
  • oligonucleotides having a guanidine-bridged nucleoside of the present invention e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or dystrophin production-enhancing agents, including those above.
  • the dystrophin production-enhancing drug of the present invention contains an ASO that targets the splicing-enhancing sequence in the pre-mRNA of the dystrophin gene in patients with Duchenne muscular dystrophy.
  • the ASO inhibits the function of the splicing-promoting sequence, induces exon skipping, and produces new mRNA in which the exon sequence has disappeared, thereby promoting the production of truncated dystrophin in the heart. be.
  • the ASO function-enhancing drug (e.g., dystrophin production-enhancing drug) of the present invention may be ASO alone, or may be formulated as a pharmaceutical composition together with any carrier, e.g., a pharmaceutically acceptable carrier. good too.
  • the function-enhancing drug is orally or parenterally administered to mammals (e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, dogs, cats, monkeys). parenteral administration is preferred. Therefore, a method for enhancing the function of ASO in the heart of a mammal (eg, a method for promoting dystrophin production), which comprises administering the ASO of the present invention to a mammal, is also provided.
  • Therapeutic drug for heart disease is fully incorporated for the specific structure of ASO contained in the ASO function-enhancing drug (eg, dystrophin production promoter) of the present invention.
  • a method for producing a therapeutic agent of the present invention comprising a step of synthesizing an oligonucleotide having a guanidine-bridged nucleoside of the present invention (hereinafter referred to as “this (sometimes referred to as the “process of the invention”) is provided.
  • the method for synthesizing oligonucleotides in the production method of the present invention is not particularly limited, and known methods can be adopted. Examples of such known methods include chemical synthesis methods such as the phosphoramidite method and the H-phosphonate method. In the chemical synthesis method, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used. Moreover, the amidite method is generally used for the chemical synthesis method.
  • the amidite is not particularly limited, and may be prepared by a known method (eg, the method described in WO 2014/046212), or a commercially available amidite may be used.
  • the present invention provides the following: A method for designing an antisense oligonucleotide with enhanced function, wherein at least one nucleoside constituting the oligonucleotide is represented by the following formula I or II:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R 1 , R 12 , and R 13 each independently represent a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or an amino group-protecting group, and R 14 is , representing a hydrogen atom)
  • substitution means substituting an oligonucleoside that constitutes a nucleotide that is the target (design source) of the design method of the present invention with an oligonucleoside represented by formula I or II above. Moreover, as long as the oligonucleoside after substitution has the same structure as the oligonucleoside represented by the above formula I or II, the oligonucleoside represented by the above formula I or II may be partially substituted.
  • Example 1 Design and Synthesis of Antisense Oligonucleotides for Evaluation
  • antisense oligonucleotides shown in Table 1 below were designed. 5 is 5-methylcytosine, Ln is LNA, Am is AmNA, Sc is scpBNA, Gu is GuNA (t-Bu), ⁇ indicates a phosphorothioate bond.
  • Antisense oligonucleotides were synthesized using an automatic nucleic acid synthesizer (nS-8 type, manufactured by Gene Design Co., Ltd.). Chain length extension used the standard phosphoramidite method. Sulfurization for phosphorothioate conversion uses DDTT (((dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione), etc., and the activator is 0.25 M Activator 42 (registered trademark) (catalog No. L031100, Sigma-Aldrich) and extended coupling time to 30 min.
  • DDTT ((dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione)
  • Example 2 Changes in systemic kinetics after single intravenous administration of antisense oligonucleotide to normal mice Japan SLC Co., Ltd.) was used. Animals are kept in open racks under an environment of temperature: 22-26°C, humidity: 40-65%, lighting time: 7:00-19:00 (12 hours), and all animals are fed with food and water. were given ad libitum.
  • antisense oligonucleotides administered intravenous in order to evaluate systemic kinetics.
  • a single injection was administered through the tail vein using a G injection needle.
  • Four sequences shown in Table 1 were used as antisense oligonucleotides.
  • PBS was administered as a control group.
  • An autopsy was performed 72 hours after a single intravenous administration of each antisense and PBS.
  • the animals were anesthetized with isoflurane inhalation anesthesia (concentration of anesthesia: 1.5-3.0%).
  • concentration of anesthesia 1.5-3.0%.
  • the abdomen was opened, and 0.15 mL of blood was collected from the retro-abdominal vena cava using a syringe containing EDTA-2K and a 23G injection needle, and temporarily stored under ice temperature.
  • the chest was opened, and 0.4 mL of blood was collected from the heart using a syringe containing 10,000 units/10 mL heparin sodium injection and a 23G needle, and temporarily stored under ice temperature.
  • Each blood sample was subjected to hematology and blood biochemistry tests. Thereafter, the abdominal aorta was dissected and exsanguinated to death. Liver, heart, muscle, and femoral skeletal muscle were excised. After measuring the weight of the organ, the excised organ was frozen in liquid nitrogen and stored at -60°C or lower.
  • RNA was extracted from the excised organs using an RNA extraction reagent (Sigma-Aldrich Japan, Tripure Isolation Reagent).
  • a reverse transcription reaction was performed using a reverse transcription reaction reagent (TOYOBO, ReverTra Ace qPCR RT kit). The reaction conditions were 37°C, 15 minutes ⁇ 98°C, 5 minutes.
  • a PCR amplification reaction was performed using a nucleic acid amplification reaction reagent (TOYOBO, THUNDERBIRD (registered trademark) Probe qPCR Mix).
  • the nucleic acid amplification reaction was carried out by temperature cycling of 92°C for 60 seconds ⁇ [(95°C for 15 seconds ⁇ 60°C for 60 seconds) x 45 cycles].
  • GPDH mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • MALAT1 RNA MALAT1 RNA relative to the amount of GAPDH mRNA was evaluated.
  • the amount of RNA by each antisense oligonucleotide was shown as a relative value when the amount of RNA in the PBS-administered group (shown as CT in the drawing) was set to 1.
  • the primer set used is as follows: (Primer set for MALAT1 detection) TaqMan Gene Expression Assay Mm01227912_s1_4351370 (ThermoFisher Scientific) (Primer set for GAPDH detection) TaqMan Gene Expression Assay Mm99999915_g1_4448490 (ThermoFisher Scientific)
  • Example 3 Examination of ASO functions due to differences in nucleoside modification using normal mice
  • antisense oligonucleotides shown in Table 2 below were obtained.
  • 5 is 5-methylcytosine
  • Ln LNA
  • Am is AmNA
  • Sc is scpBNA
  • Gu GuNA (t-Bu)
  • ⁇ indicates a phosphorothioate bond.
  • Each obtained antisense oligonucleotide was administered to BALB/cCrSlc (female, 8 weeks old, Japan SLC Co., Ltd.) by the same method as in Example 2, and then the liver and heart were excised.
  • the same method as in Example 2 was used to evaluate the amount of MALAT1 RNA relative to the amount of GAPDH mRNA.
  • the amount of RNA by each antisense oligonucleotide was shown as a relative value when the amount of RNA in the PBS-administered group (indicated as Vehicle in the drawings) was set to 1.
  • Example 4 Exon Skipping Assay Using SSO Containing GuNA(t-Bu) Modifications
  • SSO splicing control oligonucleotides shown in Table 3 below were obtained.
  • Ln is LNA
  • Om is 2′-O-methyl (2′-OMe)
  • Am is AmNA
  • Sc is scpBNA
  • Gu is GuNA (t-Bu)
  • ⁇ indicates a phosphorothioate bond.
  • Each obtained SSO was prepared with Lipofectamine (registered trademark) 3000 (ThermoFisher SCIENTIFIC) to a final concentration of 150 nM, and placed in a 96-well plate (Sumitomo Bakelite) at a density of 2.0 x 103 cells/well. and added to C2C12 cells (obtained from the European Collection of Authenticated Cell Cultures) that had been previously induced to differentiate using AdipoInducer Reagent (Takara Bio Inc.). The plates were incubated at 37°C for 96 hours. After that, the cells were collected and RNA extraction was performed in the same manner as in Example 2.
  • Lipofectamine registered trademark
  • 3000 ThermoFisher SCIENTIFIC
  • RNA was used as a template.
  • a primary reverse transcription reaction was performed using a reverse transcription reaction reagent (Promega, Access RT-PCR System). The reaction conditions were temperature cycling of 45° C. for 45 minutes ⁇ 95° C. for 2 minutes ⁇ [(94° C. 30 seconds ⁇ 58° C. 60 seconds ⁇ 72° C. 120 seconds) ⁇ 30 cycles].
  • secondary nucleic acid amplification was carried out in the same manner as in the primary reverse transcription reaction. Amplification products were electrophoresed on an agarose gel and quantitative analysis was performed for exon 23 skipping.
  • the primer sets used are as follows.
  • the present invention enables the production of ASO that can exert its effect even on the heart.
  • the ASO is suitable as a therapeutic drug for heart disease, particularly heart disease caused by gene mutation, and is excellent in terms of production and cost.
  • ASO can also exert its effect on the heart, it is also useful as an agent for enhancing the function of ASO in the heart.

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Abstract

本発明は、下記式IまたはII： （式ＩまたはＩＩ中、　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す） で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドを含む、心疾患の治療薬を提供する。

Description

心疾患治療薬
　本発明は、特定の修飾が付されたヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを含む心疾患の治療薬、該オリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの心臓における機能増強薬、およびそれらの製造方法等に関する。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となる核酸配列にハイブリダイズして遺伝子発現自体を抑制することで作用を発現する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のヌクレアーゼ耐性の向上や、標的核酸への結合親和性、特異性などの改善を目的として様々な人工核酸が開発・導入され、様々な製剤が上市されるようになった（例えば、特許文献１）。しかしながらこれまで開発されてきたＡＳＯは、ＡＳＯ自体の特性あるいは人工核酸の特性から、肝臓や腎臓などの特定の臓器に集積する傾向がありこれらの臓器においては効果を示すものの、例えば、心臓においては所望する効果を発揮することができないことが知られており、使用用途や対象疾患が限られていた。
　最近、筋ジストロフィー等の特定の遺伝子変異に起因する心疾患の治療目的で、例えば、ＡＳＯにリガンドとしての脂肪酸を結合させる等の方法により、心臓においてＡＳＯの効果を発揮させる試みが為されている（非特許文献１）。
国際公開第２０１４／０４６２１２
Nucleic Acids Res. 2019 Jul 9; 47(12): 6029-6044.
　しかしながら、リガンドを結合させる該方法は、製造面において手間がかかり、またコスト面でも課題が残るものであった。したがって、本発明の課題は、脂肪酸等の特定の物質を結合させることなく心臓において効果を発揮することのできる、製造およびコスト面において優れたＡＳＯなどを提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた。その結果、驚くべきことにヌクレオチドの糖部の２’位と４’位との架橋にグアニジンを導入した修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、従来のＡＳＯでは効果が発揮し難い心臓でも効果を発揮し得ることを見出し、該修飾ヌクレオシドを有するＡＳＯを治療薬として用いることで心疾患の治療につながるとの着想を得た。かかる着想に基づき本発明者らはさらに鋭意検討し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は以下の通りである。
［１］
　下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドを含む、心疾患の治療薬。
［２］
　Ｒ１２が、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基である、［１］に記載の治療薬。
［３］
　Ｒ１が、水素原子、または分岐もしくは環を形成していてもよい炭素数１から３のアルキル基であり、Ｒ１３が、水素原子である、［１］または［２］に記載の治療薬。
［４］
　Ｒ１２が、ｔｅｒｔ－ブチル基である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の治療薬。
［５］
　前記心疾患が、心筋症である、［１］～［４］のいずれか一つに記載の治療薬。
［６］
　下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドを含む、心臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能増強薬。
［７］
　Ｒ１２が同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基である、［６］に記載の増強薬。
［８］
　Ｒ１が、水素原子、または分岐もしくは環を形成していてもよい炭素数１から３のアルキル基であり、Ｒ１３が、水素原子である、［６］または［７］に記載の増強薬。
［９］
　Ｒ１２が、ｔｅｒｔ－ブチル基である、［６］～［８］のいずれか一つに記載の増強薬。
［１０］
　心臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能増強薬が、心臓におけるジストロフィン産生促進薬である、［６］～［９］のいずれか一つに記載の増強薬。
［１１］
　［１］～［５］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む、心疾患の治療薬の製造方法。
［１２］
　機能の増強したアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオシドを、下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるオリゴヌクレオシドに置換することを含む、設計方法。
［１３］
　哺乳動物に対し、下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、哺乳動物の心疾患の治療方法。
［１４］
　哺乳動物に対し、下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドを投与することを含む、哺乳動物の心臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能増強方法。
［１５］
　哺乳動物の心臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能増強が、哺乳動物の心臓におけるジストロフィン産生促進である、［１４］に記載の増強方法。
　本発明により、心臓でも効果を発揮し得るＡＳＯの製造が可能となる。また、該ＡＳＯは、心疾患、特に遺伝子の変異に起因する心疾患の治療薬として適しており、製造およびコスト面からも優れている。さらに、該ＡＳＯは、心臓でも効果を発揮し得るため、心臓においてＡＳＯの機能を増強し得うる。また、該ＡＳＯは、上記のような理由から、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者において、エクソンスキッピングにより、（短縮型）ジストロフィンの産生を促進し得る。
図１は、正常マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した時の各臓器におけるＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１）の量を示す。 図２は、正常マウスに修飾の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した時の肝臓におけるＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１）の量を示す。 図３は、正常マウスに修飾の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した時の心臓におけるＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１）の量を示す。 図４は、LNA修飾またはＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を含むスプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）を用いたエクソンスキッピングアッセイの結果を示す。
１．心疾患の治療薬
　本発明は、ヌクレオチドの糖部の２’位と４’位との架橋にグアニジンを導入した修飾ヌクレオシド（以下、「グアニジン架橋型ヌクレオシド」ともいう。）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、心臓でも効果を発揮し得ることを見出したことに基づいて完成した発明である。一態様において、本発明のＡＳＯ従来の肝臓や筋肉における該ヌクレオチドの効果は維持され得る。
　具体的には、本発明により、下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるヌクレオシド（すなわち、グアニジン架橋型ヌクレオシド）を１以上（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）有するオリゴヌクレオチド（以下、「本発明のＡＳＯ」と称することがある。）を含む、心疾患の治療薬（以下、「本発明の治療薬」と称することがある。）が提供される。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、またはｎ－ヘキシル基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を１つあるいは炭素数１から６の同一のまたは異なる任意の直鎖アルキル基を２つ有するアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の環状アルキル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基が挙げられ、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。
　本明細書において、「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」、「核酸合成の保護基で保護されたアミノ基」内に記載される用語「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基；炭素数１から６のアルケニル基；アシル基；テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基；テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基；シリル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；ハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたエチル基；ハロゲン原子で置換されたエチル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基；ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基；ハロゲン原子、シアノ基および／または炭素数１から６の３個のアルキル基で置換されたシリル基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基；アルケニルオキシカルボニル基；炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基で置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基；などが挙げられる。
　より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン－２－イル基、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロピラン－４－イル基、テトラヒドロチオピラン－４－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン－２－イル基、テトラヒドロチオフラン－２－イル基が挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、メトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、２－メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、２，２，２－トリクロロエトキシメチル基、ビス（２－クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたエチル基としては、１－エトキシエチル基、１－（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されたエチル基としては、２，２，２－トリクロロエチル基などが挙げられる。１から３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基、９－アンスリルメチル基などが挙げられる。「炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基、２－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基、４－シアノベンジル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４－クロロフェニル基、２－フロロフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－ニトロフェニル基、２，４－ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、シアノ基および／または３個の炭素数１から６のアルキル基で置換されたシリル基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基」としては、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、2－シアノエトキシカルボニル基、２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基で置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、４－メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンジルオキシカルボニル基、４－ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、例えば、脂肪族アシル基；芳香族アシル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基；炭素数１から６のアルキル基；または炭素数１から６のアルケニル基；が挙げられる。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、例えば、アシル基、ベンゾイル基が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、例えば、脂肪族アシル基または芳香族アシル基、ベンゾイル基が挙げられる。
　本明細書において、オリゴヌクレオチドには、薬理学上許容されるオリゴヌクレオチドの塩も含まれるものとする。該塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような炭素数１から６のアルカンで置換されたスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げられる。
　上述のグアニジン架橋型ヌクレオシドは、本発明の治療薬に含まれるオリゴヌクレオチドのいずれの位置にあってもよく、例えば、５’末端、あるいは３’末端でもよい。
　本発明の治療薬に含まれるオリゴヌクレオチドを構成するグアニジン架橋型ヌクレオシド以外のヌクレオシドとしては、例えば、下記式ＩＶで表されるヌクレオシドなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、そして
　Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子、または炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基である。）
　また、Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　（式中、
　Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、前記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
　Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
　Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、－（ＣＨ２）ｑ－［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
　Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
　Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
　Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
　Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　ｍは０から２の整数であり；
　ｎは０から１の整数であり；
　ｐは０から１の整数であり；
　Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
　Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す。）を構成してもよく、かかる構成を有するヌクレオシドを架橋型ヌクレオシドと称することがある。
　より具体的には、上記架橋型ヌクレオシドとして、例えば、下記構造式を有するヌクレオシドなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（式中、Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。好ましくは、Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、より好ましくは、Ｒは、水素原子またはメチル基である。Ｂａｓｅの定義は、上記式ＩＶにおける定義と同一である。）
　本発明の治療薬に含まれるオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシドは、天然型のヌクレオシドであってもよく、かかる天然型のヌクレオシドとしては、アデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、グアノシン、ウリジン、５－メチルウリジン、シチジン、デオキシアデノシン、Ｎ６－メチル－２’－デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。
　本発明の治療薬に含まれるオリゴヌクレオチドの長さは、アンチセンス活性を有する限り特に限定されないが、典型的には１０～５０ヌクレオチド長であり、好ましくは１０～３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１３～３０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは１５～２０ヌクレオチド長である。
　本発明の治療薬に含まれるオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシドにおいて、２’位と４’位との架橋以外の修飾を、さらに施してもよい。かかる修飾としては、例えば、ホスホロチオエート修飾、糖部の２’－Ｏ－メトキシエチル修飾、糖部の２’－Ｏ－メチル修飾、糖部の２’フルオロ修飾、Ｂａｓｅ（塩基部）のメチル化またはアセチル化、Ｂａｓｅの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂａｓｅを置換する場合には、置換する前のＢａｓｅの標的の（すなわち、該Ｂａｓｅと塩基対を形成する）塩基と、塩基対を形成できるものに置換することが好ましい。前記塩基対は、ワトソンクリック型塩基対だけでなく、フーグスティーン型塩基対やゆらぎ塩基対（Wobble base pair）であってもよい。
　本発明の治療薬に含まれるオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を含む標的ｍＲＮＡ（本明細書において、ｍＲＮＡには、ｐｒｅ－ｍＲＮＡも含まれるものとする。）の機能（転写後修飾、翻訳など）を抑制するもの（以下、「抑制型ＡＳＯ」と称することがある。）であってもよく、該機能を亢進するもの（以下、「亢進型ＡＳＯ」と称することがある。）であってもよい。抑制型ＡＳＯは、典型的には、標的ｍＲＮＡと二本鎖領域を形成し、該二本鎖領域がリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により切断されることで、標的ｍＲＮＡの機能を抑制することができる（このようなＡＳＯの機能を抑制型ＡＳＯの機能とも称する）。一方で亢進型ＡＳＯは、典型的には、スプライシング制御オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）として、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシング促進配列と二本鎖領域を形成して該配列をマスクし、スプライシングをスキップさせることで、ｍＲＮＡの機能を亢進（回復）することができる（これにより、機能的なタンパク質の細胞中での存在量が上昇することとなる）（このようなＡＳＯの機能を亢進型ＡＳＯの機能とも称する）。あるいは、標的ｍＲＮＡに含まれる、該ｍＲＮＡを分解する酵素の結合配列と二本鎖領域を形成して該配列をマスクし、該ｍＲＮＡの分解を抑制することで、ｍＲＮＡの機能を亢進することができる（このようなＡＳＯの機能も亢進型ＡＳＯの機能とも称する）。本明細書において、抑制型ＡＳＯの機能と、亢進型ＡＳＯの機能を総称して、「ＡＳＯの機能」または「アンチセンス活性」とも称する。
　本発明のＡＳＯは、標的ｍＲＮＡの機能を抑制または亢進することができ、それにより遺伝子の発現を制御することができる。本明細書において「遺伝子の発現」とは、特にことわらない限り、少なくとも「標的ｍＲＮＡにコードされた機能的なタンパク質の産生」を含む意味で用いられるが、さらに「標的ｍＲＮＡの産生」をも含む意味で用いられる。したがって、遺伝子の発現抑制とは、本発明のＡＳＯの投与により、該遺伝子にコードされる機能的なタンパク質の細胞中での存在量が減少することだけでなく、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が減少することも含んでいてもよい。同様に、遺伝子の発現亢進とは、本発明のＡＳＯの投与により、該遺伝子にコードされる機能的なタンパク質の細胞中での存在量が増加することだけでなく、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が増加することも含んでいてもよい。
　抑制型ＡＳＯは、生体内での安定性および効率的なｍＲＮＡの切断の観点から、ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型オリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明において「ギャップマー型オリゴヌクレオチド」とは、ＲＮａｓｅ Ｈにより認識される複数(例：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上）のヌクレオチドを有する内部領域（本明細書において、「ギャップ領域」と称することがある。）が、リボヌクレアーゼに対する耐性を付与するように修飾された少なくとも一つ（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオチドを有する外部領域（本明細書において、３’側の外部領域を「３’ウイング領域」と、５’側の外部領域を「５’ウイング領域」と称することがある。）間に配置されるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。３’ウイング領域と５’ウイング領域の各領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドは、架橋型ヌクレオシドであることが好ましい。
　亢進型ＡＳＯは、生体内での安定性の観点から、ＲＮａｓｅに対する耐性を付与するように修飾されたヌクレオシドを少なくとも一つ有するものがよい。かかるＡＳＯは、すべてのヌクレオシド残基が修飾されたものであってもよく、一部のヌクレオシド残基が修飾されたもの（すなわち、ミックスマー（Ｍｉｘｍｅｒ）型オリゴヌクレオチド）であってもよい。かかる修飾されたヌクレオシドとしては、架橋型ヌクレオシドが好ましい。
　本明細書において、「心臓でも効果を発揮し得る」とは、グアニジン架橋型ヌクレオシドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、少なくとも心臓における標的ｍＲＮＡの機能を抑制または亢進できることを意味する。また、「ヌクレオチドの効果が維持され得る」とは、グアニジン架橋型ヌクレオシドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ＡＳＯの機能が維持されるか、向上されることを意味する。
　本発明において、「治療」には、症状の軽減や改善、病気や症状の進行、あるいは症状の顕在化の予防、遅延や停止も包含される。本発明の治療薬の対象疾患として、例えば、本発明のＡＳＯの標的ｍＲＮＡにコードされるタンパク質の過剰発現または過剰蓄積、あるいは本発明のＡＳＯの標的ｍＲＮＡにコードされるタンパク質の欠失または減少に起因する心疾患が挙げられる。また、本発明のＡＳＯの標的がエクソン内のスプライシング促進配列であり、スプライシング反応時に該ＡＳＯを導入することでスプライシング促進配列の機能が阻害されエクソンのスキッピングが誘導され、エクソンの配列が消失した新たなｍＲＮＡが産生されることで病態が改善するような心疾患も挙げられる。具体的には、例えば、心筋症（特発性心筋症、特定心筋症）等が挙げられる。特定心筋症としては、例えば、虚血性心筋疾患、炎症性心筋疾患、代謝性心筋疾患、全身性心筋疾患が挙げられ、全身性心筋疾患としては、例えば、ジストロフィン異常症（デュシェンヌ型（ＤＭＤ）／ベッカー型（ＢＭＤ）筋ジストロフィー）が挙げられる。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであれば、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ遺伝子）から転写されたｍＲＮＡ前駆体のスプライシング促進配列が本発明のＡＳＯの標的となる。
　本発明の治療薬として、有効量の本発明のＡＳＯを単独で用いてもよいし、任意の担体、例えば医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化してもよい（製剤化したものを治療剤とも称する）。
　医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　本発明のＡＳＯの標的細胞内への導入を促進するために、本発明の治療薬は更に核酸導入用試薬を含んでいてもよい。該核酸導入用試薬としては、塩化カルシウム、Calcium enrichment試薬、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リプフェクタミン（lipofectamine）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることができる。
　また、本発明の治療薬は、本発明のＡＳＯがリポソームに封入されてなる医薬組成物であってもよい。リポソームは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明のＡＳＯはリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば１０～１０００nm、好ましくは５０～３００nmの範囲で適宜選択できる。標的組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば２００nm以下、好ましくは１００nm以下である。
　オリゴヌクレオチドのような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
　本発明の医薬は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物（例：ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、サル）に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。よって、哺乳動物に対し、本発明のＡＳＯの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における心疾患の治療方法も提供される。
　非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈内注入、局所注入（局所外用、局所塗布）、髄腔内投与、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることができる。
　医薬組成物中の本発明のＡＳＯの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％である。
　本発明の治療薬の投与量は、投与の目的、投与方法、対象疾患の種類、重篤度、投与対象の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、例えば、成人に全身投与する場合、通常、本発明のＡＳＯの一回投与量として０．０１ｍｇ／ｋｇ以上１０００ｍｇ／ｋｇ以下、局所投与する場合、０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ以上１００ｍｇ／ｂｏｄｙ以下が望ましい。かかる投与量を１～１０回、より好ましくは５～１０回投与することが望ましい。
　本発明の治療薬は、例えば既に上市されている心疾患に対する治療薬と組み合わせて用いることもできる。これらの併用薬剤（組み合わせ医薬）は、本発明の医薬とともに製剤化して単一の製剤として投与することもできるし、あるいは、本発明の医薬とは別個に製剤化して、本発明の医薬と同一もしくは別ルートで、同時もしくは時間差をおいて投与することもできる。また、これらの併用薬剤の投与量は、該薬剤を単独投与する場合に通常用いられる量であってよく、あるいは通常用いられる量より減量することもできる。
２．ＡＳＯの機能増強薬
　別の態様において、本発明により、本発明のグアニジン架橋型ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを１以上（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）含む、ＡＳＯの機能増強薬またはＡＳＯの機能が増強した薬剤が提供される。
　本明細書において、ＡＳＯの機能の増強とは、本発明のＡＳＯの機能が、本発明で用いるヌクレオチドの糖部の２’位と４’位との架橋にグアニジンを導入した修飾ヌクレオシド（以下、「グアニジン架橋型ヌクレオシド」ともいう。）を有さないＡＳＯのものと比して、向上していることを意味する。
　本発明のＡＳＯの機能増強薬としては、例えば、本発明のグアニジン架橋型ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを１以上（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）含む、ジストロフィンの産生促進薬が挙げられる。
　本発明のジストロフィンの産生促進薬は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者において、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体におけるスプライシング促進配列を標的とするＡＳＯを含む。該ＡＳＯにより、スプライシング反応時に、スプライシング促進配列の機能が阻害されエクソンのスキッピングが誘導され、エクソンの配列が消失した新たなｍＲＮＡが産生され、その結果として、心臓において短縮型ジストロフィンの産生が促進される。
　本発明のＡＳＯの機能増強薬（例：ジストロフィンの産生促進薬）は、ＡＳＯを単独で用いてもよいし、任意の担体、例えば、医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化してもよい。また、該機能増強薬は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物（例：ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、サル）に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。よって、哺乳動物に対し、本発明のＡＳＯを投与することを含む、該哺乳動物の心臓におけるＡＳＯの機能増強方法（例：ジストロフィンの産生促進方法）も提供される。
　本発明のＡＳＯの機能増強薬（例：ジストロフィンの産生促進薬）に含まれるＡＳＯの具体的な構造等の内容は、「１．心疾患の治療薬」の内容が全て援用される。
３．グアニジン架橋型ヌクレオシドを有するＡＳＯの製造方法
　別の態様において、本発明により、本発明のグアニジン架橋型ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む、本発明の治療薬の製造方法（以下、「本発明の製法」と称することがある。）が提供される。
　本発明の製法におけるオリゴヌクレオチドの合成方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。かかる公知の方法として、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法などの化学合成法が挙げられる。前記化学合成法において、市販の自動核酸合成機を使用することができる。また、前記化学合成法は、一般に、アミダイト法が使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、公知の方法（例えば、国際公開第２０１４／０４６２１２号に記載の方法）により作製してもよく、市販のアミダイトを用いてもよい。
４．機能の増強したアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法
　別の態様において、本発明により、以下：
　機能の増強したアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオシドを、下記式IまたはII：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式ＩまたはＩＩ中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
で表されるオリゴヌクレオシドに置換することを含む、設計方法
が提供される。
　本発明において「置換」とは、本発明の設計方法の対象（設計元）となるヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオシドを、上記式IまたはIIで表されるオリゴヌクレオシドへと置換することを意味する。また、置換後のオリゴヌクレオシドが上記式IまたはIIで表されるオリゴヌクレオシドと同じ構造になる限り、上記式IまたはIIで表されるオリゴヌクレオシドの一部の置換であってもよい。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：評価用のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計と合成
　ＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾の効果を検討するために、下記の表１に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。５は５－メチルシトシン、ＬｎはＬＮＡ、ＡｍはＡｍＮＡ、ＳｃはｓｃｐＢＮＡ、ＧｕはＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）、＾はホスホロチオエート結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（nS-8型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイト法を用いた。ホスホロチオエート化のための硫化はＤＤＴＴ（((dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3- thione)等を使用し、アクチベーターは0.25 M Activator 42（登録商標）（カタログ番号L031100、シグマ－アルドリッチ）を用いて、カップリング時間を３０分に延長して行った。塩基処理により固相担体からの切り出し及び脱保護を行ない、逆相HPLCおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行った。得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの純度及び構造をＬＣ－ＭＳによって確認した。
実施例２：正常マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した時の全身動態の変化
　アンチセンスオリゴヌクレオチドによる正常マウスへの単回静脈内投与試験には、BALB/cCrSlc（メス、８週齢、日本エスエルシー株式会社）を用いた。動物は、温度：２２～２６℃、湿度：４０～６５％、照明時間：７：００～１９：００（１２時間）の環境下のオープンラックにて飼育し、すべての動物は飼料及び水分を自由摂取させた。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドのマウスへの投与は、全身動態の評価をすべく、静脈内投与とした。Ｇ注射針を用いて、尾静脈より単回投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは表1に示してある４配列を用いた。コントロール群としてＰＢＳを投与した。
　各アンチセンス及び、ＰＢＳを単回静脈内投与後、７２時間後に剖検を実施した。イソフルランの吸入麻酔 (麻酔の濃度：１．５－３．０％)にて麻酔した。全身麻酔下のマウスを開腹し、腹部後大静脈よりEDTA-2Kを加えたシリンジ及び23G注射針を用いて0.15 mLを目安に採血し、氷温下にて一時保管した。その後、開胸し、心臓より1万単位/10 mLヘパリンナトリウム注を加えたシリンジ及び23G注射針を用いて0.4 mLを目安に採血し、氷温下にて一時保管した。各採血液は、血液学検査及び血液生化学検査を実施した。その後、腹部大動脈を切開し、放血死させた。肝臓、心臓、筋肉、大腿部骨格筋を摘出した。摘出した臓器は、臓器重量を測定後、液体窒素にて凍結し、-60℃以下で保管した。
　摘出した臓器は、ＲＮＡ抽出試薬（シグマアルドリッチジャパン、Tripure Isolation Reagent）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。当該RNAを鋳型として、逆転写反応試薬（TOYOBO、ReverTra Ace qPCR RT kit）を用いて、逆転写反応を行った。反応条件は、３７℃　１５分→９８℃　５分で行った。さらに当該ｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅反応試薬（TOYOBO、THUNDERBIRD（登録商標） Probe qPCR Mix）を用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。核酸増幅反応は、９２℃　６０秒→［（９５℃　１５秒→６０℃　６０秒）×４５サイクル］の温度サイクリングで行った。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のマウスグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ量も同時に測定し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＭＡＬＡＴ１のＲＮＡ量を評価した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＲＮＡ量は、ＰＢＳ投与群（図面中、ＣＴと示す）のＲＮＡ量を１とした場合の相対値にて示した。
　用いるプライマーセットは下記の通りである：
（MALAT1検出用プライマーセット）
TaqMan Gene Expression Assay Mm01227912_s1_4351370（ThermoFisher Scientific社）
（GAPDH検出用プライマーセット）
TaqMan Gene Expression Assay Mm99999915_g1_4448490（ThermoFisher Scientific社）
　その結果を図１に示す。ＬＮＡ修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合、肝臓におけるＲＮＡ発現量はＰＢＳ投与群の約１５％、筋肉におけるＲＮＡ発現量はＰＢＳ投与群の約４０％まで抑制されているのに対し、心臓におけるＲＮＡ発現量は約６０％までしか抑制されていなかった。それに対し、ＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合、肝臓や筋肉におけるＲＮＡ発現量は同程度であったのに対し、心臓におけるＲＮＡ発現量は約４０％以下にまで抑制されていた。
　実施例３：正常マウスを用いたヌクレオシド修飾の違いによるASOの機能の検討
　実施例1と同様の方法により、下記の表２に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを取得した。５は５－メチルシトシン、ＬｎはＬＮＡ、ＡｍはＡｍＮＡ、ＳｃはｓｃｐＢＮＡ、ＧｕはＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）、＾はホスホロチオエート結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　取得した各アンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例２と同様の方法により、BALB/cCrSlc（メス、８週齢、日本エスエルシー株式会社）に投与した後、肝臓及び心臓を摘出した。摘出した臓器について、実施例２と同様の方法により、ＧＡＰＤＨのmRNA量に対するＭＡＬＡＴ１のＲＮＡ量を評価した。なお、各アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＲＮＡ量は、ＰＢＳ投与群（図面中、Vehicleと示す）のＲＮＡ量を１とした場合の相対値にて示した。
　その結果を図２及び３に示す。ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡ修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合、肝臓におけるＲＮＡ発現量はＰＢＳ投与群の約４０％まで抑制されていたのに対し、心臓におけるＲＮＡ発現量は約１０％までしか抑制されていなかった。それに対し、ＡｍＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、及びＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合、肝臓におけるＲＮＡ発現量は、ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡ修飾を含むASOと比して同程度あるいは多少低いもの（約３０％）であったが、心臓におけるＲＮＡ発現量は約３５％以下にまで抑制されていた。
　該結果から、各臓器、特に、心臓におけるASOの機能の増強を企図する場合、ＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を用いることが有効であることが分かった。
　実施例４：ＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を含むSSOを用いたエクソンスキッピングアッセイ
　実施例１と同様の方法により、下記の表３に示すスプライシング制御オリゴヌクレオチド（SSO）を取得した。ＬｎはＬＮＡ、Ｏｍは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、ＡｍはＡｍＮＡ、ＳｃはｓｃｐＢＮＡ、ＧｕはＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）、＾はホスホロチオエート結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　取得した各ＳＳＯを、Lipofectamine（登録商標）３０００（ThermoFisher SCIENTIFIC社）で終濃度１５０ ｎＭになるように調製し、９６ウェルのプレート（住友ベークライト社）に２．０×１０３細胞/ウェルの密度で播種し、予め AdipoInducer Reagent （タカラバイオ社）を用いて分化誘導を行ったＣ２Ｃ１２細胞（European Collection of Authenticated Cell Culturesより入手）中に添加した。該プレートを、３７℃で９６時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、実施例２と同様の方法によりＲＮＡ抽出を行った。当該ＲＮＡを鋳型として、逆転写反応試薬（プロメガ社、 Access RT-PCR System ）を用いて、１次逆転写反応を行った。反応条件は、４５℃　４５分→９５℃　２分→［（９４℃　３０秒→５８℃　６０秒→７２℃　１２０秒）×３０サイクル］の温度サイクリングで行った。さらに当該ｃＤＮＡを鋳型として、１次逆転写反応と同様に２次核酸増幅を行った。増幅産物を、アガロースゲル上で電気泳動し、エクソン２３スキッピングに関して定量解析を行った。なお、用いたプライマーセットは下記の通りである。
（１次 PCR プライマー）
Forward： CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG (配列番号１０)
Reverse： TTCTTCAGCTTGTGTCATCC （配列番号１１）
（２次 PCRプライマー）
Forward： CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC （配列番号１２）
Reverse： CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT （配列番号１３）
　その結果を図４に示す。ＬＮＡ修飾を含むＳＳＯ（ＬＸ－A５６６９）は、エクソン２３のスキッピングを約５％（平均値）の割合で誘導した。それに対し、ＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を含むSSO（ＬＸ－A６７８３、及びＬＸ－A６７８４）は、エクソン２３のスキッピングを、それぞれ約３４％（平均値）、及び約４５％（平均値）の割合で誘導した。該結果から、ＧｕＮＡ（ｔ-Ｂｕ）修飾を用いることで、エクソンスキッピングの誘導効率をより高めることができることが分かった。
　本発明により、心臓でも効果を発揮し得るＡＳＯの製造が可能となる。また、該ＡＳＯは、心疾患、特に遺伝子の変異に起因する心疾患の治療薬として適しており、製造およびコスト面からも優れている。さらに、該ＡＳＯは、心臓でも効果を発揮し得るため、心臓におけるＡＳＯの機能増強薬としても有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－０８８１３２（出願日：２０２１年５月２６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (12)

  1. 　下記式IまたはII：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式ＩまたはＩＩ中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
    で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドを含む、心疾患の治療薬。
  2. 　Ｒ１２が、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基である、請求項１に記載の治療薬。
  3. 　Ｒ１が、水素原子、または分岐もしくは環を形成していてもよい炭素数１から３のアルキル基であり、Ｒ１３が、水素原子である、請求項１または２に記載の治療薬。
  4. 　Ｒ１２が、ｔｅｒｔ－ブチル基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療薬。
  5. 　前記心疾患が、心筋症である、請求項１～４のいずれか一項に記載の治療薬。
  6. 　下記式IまたはII：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式ＩまたはＩＩ中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
    で表されるヌクレオシドを１以上有するオリゴヌクレオチドを含む、心臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能増強薬。
  7. 　Ｒ１２が同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基である、請求項６に記載の増強薬。
  8. 　Ｒ１が、水素原子、または分岐もしくは環を形成していてもよい炭素数１から３のアルキル基であり、Ｒ１３が、水素原子である、請求項６または７に記載の増強薬。
  9. 　Ｒ１２が、ｔｅｒｔ－ブチル基である、請求項６～８のいずれか一項に記載の増強薬。
  10. 　心臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能増強薬が、心臓におけるジストロフィン産生促進薬である、請求項６～９のいずれか一項に記載の増強薬。
  11. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む、心疾患の治療薬の製造方法。
  12. 　機能の増強したアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオシドを、下記式IまたはII：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式ＩまたはＩＩ中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒ１、Ｒ１２、およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基を表し、そしてＲ１４は、水素原子を表す）
    で表されるオリゴヌクレオシドに置換することを含む、設計方法。
     

     
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