JP7190794B2 - 核酸医薬及び多分岐脂質の複合体 - Google Patents
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Description
(1-1)標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに
式:
(式中、
A11は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式:
で示される基であり、
A1~A10及びA16~A19は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
A1及びA2又はA16及びA17は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、A1を構成するいずれかの炭素原子とA2を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、A16を構成するいずれかの炭素原子とA17を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Y1~Y7は、それぞれ独立して単結合又はOであり、
X1、X3及びX6は、それぞれ独立してNR1C(=O)、C(=O)NR1、R2C(=O)NR1又はNR1C(=O)R2であり、
X2、X4、X5及びX7は、それぞれ独立して単結合、NR3C(=O)、C(=O)NR3、R4C(=O)NR3、NR3C(=O)R4又はS-Sであり、
R2及びR4は、それぞれ独立してO又はNR5であり、
R1、R3及びR5は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
A12は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
A13~A15、A20及びA21は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
m、n、p、q、r、s及びtは、それぞれ独立して1又は2である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。)
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体。
(1-2)該脂質が、
A1~A5及びY1~Y5が、単結合であり、
A6~A10が、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
X1~X5が、NHC(=O)であり、
m、n、p、q及びrが、1である、(1-1)記載の複合体。
(1-3)A11及びA13が、炭素数が6~30のアルキルである(1-1)又は(1-2)記載の複合体。
(1-4)該脂質が、オリゴヌクレオチドの3’末端及び/又は5’末端に結合している、(1-1)~(1-3)いずれかに記載の複合体。
(1-5)該リンカーが、
式:
(式中、
L0はオリゴヌクレオチドに結合し、L6は脂質に結合する。
L0は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
L1は、式:
(式中、
Zは、それぞれ独立してO又はSであり、
R6は、それぞれ独立してヒドロキシ、アルキル又はアルキルオキシである)で示される基であり、
L2及びL4は、それぞれ独立して単結合又は置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレンであり、
L3は、それぞれ独立して単結合、C(=O)NR7(R7は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである)、NR8C(=O)(R8は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はR8はL2のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい)又はS-Sであり、
L5は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレン、C(=O)NR9、NR9C(=O)、NR9、O又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
R9は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
uは、1又は2であり、
L6は、単結合又はアミノ酸リンカーである)
で示される基である、(1-1)~(1-4)いずれかに記載の複合体。
(1-6)式(C-1)~(C-7)のいずれかで示される複合体。
(式中、
OLは、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドであり、
5’は、該オリゴヌクレオチドの5’末端に結合することを意味し、
3’は、該オリゴヌクレオチドの3’末端に結合することを意味し、
Z1-1は、O又はSであり、
L0-1は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
L5-1は、単結合、NH又はOであり、
L6-1は、単結合又はアミノ酸リンカーであり、
LIは、式(LI-1)~(LI-9)のいずれかで示される脂質である。
(式中、
A1-1は、単結合又はメチレンであり、
A2-1は、炭素数が1~4の直鎖状のアルキレンであり、
A11-1は、炭素数が7~23の直鎖又は分枝状のアルキルであり、
A12-1は、炭素数が3~23の直鎖若しくは分枝状のアルキル若しくはアルケニル、脂溶性物質を含む基又は式:
で示される基である。)、
(式中、A13-1、A14-1及びA15-1は、炭素数が9~13の直鎖状のアルキルである。)、
(式中、
A20-1及びA21-1は、炭素数が13の直鎖状アルキルであり、
A12-2は、炭素数が15の直鎖状アルキル又は脂溶性物質を含む基である。)
(式中、
A11-2は、炭素数が15の直鎖状アルキルであり、
A12-3は、アミノで置換されている炭素数が1~4の直鎖状アルキルである。)
(式中、
A20-2及びA21-2は、炭素数が13の直鎖状アルキルであり、
A12-4は、アミノで置換されている炭素数が4の直鎖状アルキルである。)
(式中、A11-3及びA12-5は、炭素数が15の直鎖状アルキルである。)
(式中、
A11-4は、炭素数が14の直鎖状アルキルであり、
A12-6は、炭素数が6~12の直鎖状アルキルである。)
(1-7)(1-1)~(1-6)いずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
L2が、置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレンであり、
L3が、NR8C(=O)(R8は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである)であり、
L4が、単結合であり、
L5が、単結合、NR9又はOであり、
uが、1であり、
L6が、単結合である、(1-5)記載の複合体。
(1-9)該リンカーが、
L0が、単結合であり、
L2~L5が、単結合であり、
L6が、単結合である、
uが1である、(1-5)記載の複合体。
(1-10)該リンカーが、
L0が、単結合であり、
L3が、NR8C(=O)(R8はL2のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成している)であり、
L5が、C(=O)NR9又はOであり、
uが、1であり、
L6が、単結合である、(1-5)記載の複合体。
(1-11)リンカーが、
L0が単結合又はヌクレオチドリンカーであり、
L2及びL4が、置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレンであり、
L3が、NHC(=O)又はS-Sであり、
L5がOであり、
uが、1である、(1-5)記載の複合体。
(1-12)リンカーが、
L2及びL4が、置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレンであり、
L3が、NR8C(=O)(R8は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである)であり、
L5が、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
uが、1であり、
L6が、アミノ酸リンカーである、(1-5)記載の複合体。
(2-1)第1の鎖が、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第2の鎖が、該第1の鎖にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、前記標的遺伝子の発現抑制活性を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
第1の鎖及び/又は第2の鎖に
式:
(式中、
X1’又はX2’は、それぞれ独立して単結合、NR1’C(=O)、C(=O)NR1’、R2’C(=O)NR1’又はNR1’C(=O)R2’であり、
R2’は、O又はNR3’であり、
R1’又はR3’は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
A1’又はA2’は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
p’又はq’は、それぞれ独立して0~4の整数である。
ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルの置換基は、ハロゲン、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基又は非芳香族複素環式基であり、該置換基はα’群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
α’群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。)
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体。
(2-2)該脂質が、
式:
(式中、A1’、A2’、p’又はq’は、請求項1と同意義である。)
で示される基である、(2-1)記載の複合体。
(2-3)A1’又はA2’が、それぞれ独立して炭素数が6~30のアルキルである(2-1)又は(2-2)記載の複合体。
(2-4)該脂質が、第2の鎖に結合している、(2-1)~(2-3)いずれかに記載の複合体。
(2-5)該脂質が、オリゴヌクレオチドの3’末端及び/又は5’末端に結合している、(2-4)記載の複合体。
(2-6)該リンカーが、
(式中、
L1’はオリゴヌクレオチドに結合し、L5’は脂質に結合する。
L1’は、C(=O)NH、NHC(=O)、NHC(=O)NH、
(式中、Z’はO又はSであり、R4’は、アルキル又はアルキルオキシである)であり、
L2’は、それぞれ独立して芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレン又は芳香族環であり、
L3’は、それぞれ独立して単結合、C(=O)NR5’(R5’は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである)又はNR6’C(=O)(R6’は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はR6’はL2’のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい)であり、
L4’は、それぞれ独立して単結合又は芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレン若しくは芳香族環であり、
L5’は、単結合、C(=O)NH、NHC(=O)、NH又はOであり、
r’は、0~2の整数である)
である、(2-1)~(2-5)記載の複合体。
(2-7)(2-1)~(2-6)いずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Forth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)、Current Protocols Essential Laboratory Techniques, Current Protocols (2012)に記載された方法等が挙げられる。
「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオシドが複数個結合したヌクレオチドを意味する。
(式中、BX1は、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。)
「天然のRNAヌクレオシド」とは、以下を意味する。
(式中、BX2は、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。)
また、例えば、以下の糖の4’位と2’位との間の架橋構造が挙げられる。
4’-(CR7’R8’)m’-O-2’、4’-(CR7’R8’)m’-S-2’、4’-(CR7’R8’)m’-O-C(=O)-2’、4’-(CR7’R8’)m’-NR9’-O-(CR7’R8’)m1’-2’、4’-(CR7’R8’)m1’-C(=O)-NR9’-2’、4’-(CR7’R8’)m2’-C(=O)-NR9’-Y4’-2’、4’-(CR7’R8’)m1-SO2-NR9’-2’、又は
であり、
ここで、
Y4’は、O、S、NH又はCH2であり、
R7’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R8’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R9’は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の芳香族複素環アルキル又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環アルキルであり、
Y1’はCR10’又はNであり、
Y2’はCR11’又はNであり、
Y3’はCR12’又はNであり、
R10’、R11’及びR12’はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のアルキルオキシ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル、置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル又は置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイルであり、
m’は、1~4の整数であり、
m1’は、0~3の整数であり、
m2’は、0又は1である。
α’群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。
ここで、
R7’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R8’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R9’は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
m’は、1~4の整数であり、
m1’は、0~2の整数である。
4’-(CH2)m’-O-2’(m’は1~4の整数)の中で、特に好ましくは4’-CH2-O-2’(LNA、Locked nucleic acid)である。具体例及びその調製方法は、国際公開第98/39352号、国際公開第2003/068795号、国際公開第2005/021570号等に記載されている。
4’-C(=O)-NR9’-2’(R9’は、水素原子又はアルキルである)の中で、特に好ましくは4’-C(=O)-NCH3-2’である。具体例及びその調製方法は、国際公開第2011/052436号に記載されている。
国際公開第98/39352号、国際公開第99/014226号、国際公開2000/056748、国際公開第2005/021570号、国際公開第2003/068795号、国際公開第2011/052436号、国際公開第2004/016749号、国際公開第2005/083124号、国際公開2007/143315号、国際公開第2009/071680号、国際公開2014/112463号、国際公開2014/126229号等。
さらに、「非芳香族炭素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
単環の非芳香族炭素環式基としては、炭素数3~16が好ましく、より好ましくは炭素数3~12、さらに好ましくは炭素数4~8である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。
2環以上の非芳香族炭素環式基としては、例えば、インダニル、インデニル、アセナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
2環以上の芳香族複素環式基は、単環又は2環以上の芳香族複素環式基に、「芳香族炭素環式基」及び/又は「非芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
単環の芳香族複素環式基としては、5~8員が好ましく、より好ましくは5員又は6員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。
2環の芳香族複素環式基としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。
3環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。
2環以上の非芳香族複素環式基は、単環又は2環以上の非芳香族複素環式基に、「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び/又は「芳香族複素環式基」におけるそれぞれの環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族複素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
単環の非芳香族複素環式基としては、3~8員が好ましく、より好ましくは5員又は6員である。例えば、ジオキサニル、チイラニル、オキシラニル、オキセタニル、オキサチオラニル、アゼチジニル、チアニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジニル、ヘキサヒドロアゼピニル、テトラヒドロジアゼピニル、テトラヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキソラニル、ジオキサジニル、アジリジニル、ジオキソリニル、オキセパニル、チオラニル、チイニル、チアジニル等が挙げられる。
2環以上の非芳香族複素環式基としては、例えば、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル等が挙げられる。
「モノアルキルアミノ」とは、「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子1個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ等が挙げられる。好ましくは、メチルアミノ、エチルアミノが挙げられる。
「ジアルキルアミノ」とは、「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子2個と置き換わった基を意味する。2個のアルキルは、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、N,N-ジイソプロピルアミノ、N-メチル-N-エチルアミノ、N-イソプロピル-N-エチルアミノ等が挙げられる。好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノが挙げられる。
等が挙げられる。
「芳香族炭素環アルキル」の好ましい態様としては、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルが挙げられる。
等が挙げられる。
等が挙げられる。
等が挙げられる。
β群:ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
「非芳香族複素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次のγ群から選択される1以上の基と結合していてもよい。
γ群:ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
本発明の複合体は、
標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに
式:
(式中、
A11は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式:
で示される基であり、
A1~A10及びA16~A19は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
A1及びA2又はA16及びA17は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、A1を構成するいずれかの炭素原子とA2を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、A16を構成するいずれかの炭素原子とA17を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Y1~Y7は、それぞれ独立して単結合又はOであり、
X1、X3及びX6は、それぞれ独立してNR1C(=O)、C(=O)NR1、R2C(=O)NR1又はNR1C(=O)R2であり、
X2、X4、X5及びX7は、それぞれ独立して単結合、NR3C(=O)、C(=O)NR3、R4C(=O)NR3、NR3C(=O)R4又はS-Sであり、
R2及びR4は、それぞれ独立してO又はNR5であり、
R1、R3及びR5は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
A12及びA14は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
A13、A15、A20及びA21は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
m、n、p、q、r、s及びtは、それぞれ独立して1又は2である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。)
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体である。
「1又は数個の塩基」とは、1~10個、1~5個、1~3個又は1若しくは2個の塩基を意味している。
第2の鎖の好ましい長さは第1の鎖の長さに依存する。例えば、第1の鎖の長さに対して50%以上の長さ、60%以上の長さ、70%以上の長さ、50~100%の長さ、60~100%の長さ、70~100%の長さである。特に好ましくは第1の鎖の長さに対して50~100%の長さである。
本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、第2の鎖のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなる第1の鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、1又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。例えば、ハイブリダイズする部位が、第1の鎖の相補配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、もっとも好ましくは95%以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ここで、相同性は、例えば、Altschulら(The Journal of Molecular Biology,215,403-410(1990).)の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムBLASTを用いることにより、スコアで類似度が示される。
好ましくは、糖の2’位に置換基を有するヌクレオシド及び/又は糖の4’位と2’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである。
糖の2’位の置換基として好ましくは、F、OCH3又はOCH2CH2OCH3である。特に、OCH3が好ましい。
糖の4’位と2’位との間の架橋構造として好ましくは、4’-(CH2)m’-O-2’(m’は1~4の整数)、4’-C(=O)-NR9’-2’(R9’は、水素原子又はアルキルである)である。
式:
(式中、
A11は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式:
で示される基であり、
A1~A10及びA16~A19は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
A1及びA2又はA16及びA17は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、A1を構成するいずれかの炭素原子とA2を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、A16を構成するいずれかの炭素原子とA17を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Y1~Y7は、それぞれ独立して単結合又はOであり、
X1、X3及びX6は、それぞれ独立してNR1C(=O)、C(=O)NR1、R2C(=O)NR1又はNR1C(=O)R2であり、
X2、X4、X5及びX7は、それぞれ独立して単結合、NR3C(=O)、C(=O)NR3、R4C(=O)NR3、NR3C(=O)R4又はS-Sであり、
R2及びR4は、それぞれ独立してO又はNR5であり、
R1、R3及びR5は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
A12及びA14は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
A13、A15、A20及びA21は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
m、n、p、q、r、s及びtは、それぞれ独立して1又は2である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。)
で示される脂質である。
同様に、A16及びA17が、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、「A16を構成するいずれかの炭素原子とA17を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成している」とは、以下の右の式で表される基を意味する。
(式中、環B1又は環B2は、置換若しくは非置換の芳香族炭素環又は置換若しくは非置換の非芳香族炭素環であり、その他記号は上記と同様である。式:Y1-[A6-X1]m-A11で示される基及び式:Y2-[A7-X2]n-A12で示される基は環B1上の異なる炭素原子に結合し、さらにその他の環B1上の炭素原子に上記γ群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。式:Y6-[A18-X6]s-A20で示される基及び式:Y7-[A19-X7]t-A21で示される基は環B2上の異なる炭素原子に結合し、さらにその他の環B 2 上の炭素原子に上記γ群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。)
環B1又は環B2として特に好ましくは、フェニルである。
X2、X4、X5及びX7として特に好ましくは、単結合又はNHC(=O)である。
脂溶性物質を含む基として好ましくは、トコフェロール、葉酸又はcRGDを含む基が挙げられる。
トコフェロールを含む基とは、以下を意味する。
葉酸を含む基とは、以下を意味する。
cRGDを含む基とは、以下を意味する。
A11及びA13として特に好ましくは、非置換のアルキルである。
A12及びA14として特に好ましくは、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は脂溶性物質を含む基である。
(式中、
A1―X、A2-X、A18―X及びA19―Xは、アルキレンであり、
A11―X、A13―X、A15―X、A20―X及びA21―Xは、アルキルであり、
A12―X及びA14―Xは、置換若しくは非置換のアルキル又は脂溶性物質を含む基である。)
(式中、B1は、オリゴヌクレオチドの3’末端の塩基であり、Zaは、O又はSであり、n1又はn2は、それぞれ独立して5~29の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して10~18である。)
(式中、B1は、オリゴヌクレオチドの5’末端の塩基であり、Zaは、O又はSであり、n1又はn2は、それぞれ独立して5~29の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して10~18である。)
(式中、B1及びB2は、オリゴヌクレオチド中隣接する塩基であり、Za又はZbは、それぞれ独立してO又はSであり、n1又はn2は、それぞれ独立して5~29の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して10~18である。)
式:
(式中、
L0はオリゴヌクレオチドに結合し、L6は脂質に結合する。
L0は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
L1は、式:
(式中、
Zは、それぞれ独立してO又はSであり、
R6は、それぞれ独立してヒドロキシ、アルキル又はアルキルオキシである)で示される基であり、
L2及びL4は、それぞれ独立して単結合又は置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレンであり、
L3は、それぞれ独立して単結合、C(=O)NR7(R7は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである)、NR8C(=O)(R8は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はR8はL2のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい)又はS-Sであり、
L5は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレン、C(=O)NR9、NR9C(=O)、NR9、O又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
R9は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
uは、1又は2であり、
L6は、単結合又はアミノ酸リンカーである)
で示される基。
ヌクレオチドリンカーの長さは、1~10塩基、2~8塩基、4塩基、5塩基、6塩基、7塩基である。例えば、以下に記載のリンカーが挙げられる。
(式中、B3は、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、5-メチルシトシン(5-Me-C)、チミン(T)、又はウラシル(U)である。また、B3は欠失(Ab)していてもよい。Wは、それぞれ独立してH又はOHであり、好ましくはHである。Zcは、それぞれ独立してO又はSである。vは1~10の整数である。)
特に好ましくは、B3がアデニン又はチミンであり、ZcがOであり、vが1~9である。
ここで、1~数個とは1~10個、1~8個、5個、6個、7個である。
好ましくは、3~9個のブタンジオールが結合したリンカーが挙げられる。
(式中、aは0~18の整数であり、bは1~5の整数である。アルキレンは上記β群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。含窒素環は上記γ群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。)
具体的には、以下が挙げられる。
(式中、Zは、O又はSである)
である。
L2として好ましくは、1~20の置換又は非置換のアルキレンである。
L3として好ましくは、単結合、C(=O)NH又はNR8C(=O)(R8はL2のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成している)である。
L5として好ましくは、単結合、C(=O)NH、NH又はOである。
(式中、
OLは、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに結合することを意味し、LIは、脂質に結合することを意味する。
Zd及びZeは、それぞれ独立してO又はSであり、v1又はv2は、それぞれ独立して0~10の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して0~5であり、より好ましくはそれぞれ独立して0~3である。v3~v6は、それぞれ独立して1~4の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して1~3、より好ましくはそれぞれ独立して2又は3である。Nucleotide Linkder(ヌクレオチドリンカー)及びAmino acid Linker(アミノ酸リンカー)は、上記と同意義である。)
「脂質」とリンカーは、下記実施例1に記載の通り脂質とリンカーの一部を含む化合物として合成し、該化合物を樹脂に固相化し、オリゴヌクレオチドに導入することにより、本発明の「複合体」が得られる。本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、その後、他のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、本発明の「複合体」が得られる。「脂質とリンカーの一部を含む化合物」の具体例としては、下記実施例1に記載の化合物等が挙げられる。
また、本発明の「複合体」に関し、脂質が結合していないオリゴヌクレオチドの3’末端又は5’末端はリン酸エステル部分を含んでいてもよい。「リン酸エステル部分」とは、リン酸エステル並びに修飾リン酸エステルが含まれる、末端リン酸基を意味する。リン酸エステル部分は、いずれの末端に位置してもよいが、5’-末端ヌクレオシドであることが好ましい。具体的には、式:-O-P(=O)(OH)OHで示される基又はその修飾基である。つまり、O及びOHの1以上が、H、O、OR’、S、N(R’)(ここでR’は、H、アミノ保護基又は置換若しくは非置換のアルキルである)又はアルキルで置換されていてもよい。5’又は3’末端は、それぞれ独立して置換又は非置換の1~3のリン酸エステル部分を含んでいてもよい。
a)本発明の複合体に包含されている核酸医薬の標的遺伝子に対する発現抑制活性を向上させる。
b)代謝安定性が高い。
c)CYP酵素(例えば、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等)に対する阻害作用が弱い。
d)高いバイオアベイラビリティー、適度なクリアランス等良好な薬物動態を示す。
e)変異原性を有さない。
f)心血管系のリスクが低い。
g)高い溶解性を示す。
h)急性毒性のリスクが低い。
a)本発明の複合体に包含されている核酸医薬の標的遺伝子との親和性が高い。
b)ヌクレアーゼに対する抵抗性が高い。
c)薬物動態が改善する。
d)組織移行性が高くなる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム又はマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール又はメチルセルロース等を用いることができる。
また、液剤又は乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
CPG:コントロールドポーラーガラス
DIEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
DMTr:ジメトキシトリチル
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU:O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロ-ホスフェート
NMP:N-メチルピロリドン
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
TBS:tert-ブチルジメチルシリル
TBAF:テトラブチルアンモニウムフルオリド
TFA:トリフルオロ酢酸
THF:テトラヒドロフラン
実施例で得られた化合物のNMR分析は300MHz、400MHzで行い、CD3OD、CDCl3、DMSO-d6を用いて測定した。
1)ODS酸性分析
移動相:[A]は0.1%ギ酸含有水溶液[B]は0.1%ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント:3.5分間で5%-100%溶媒[B]のリニアグラジエントを行った後、0.5分間、100%溶媒[B]を維持した。
カラム:ACQUITY UPLC(登録商標)BEH C18(1.7μm、i.d.2.1x50mm)(Waters)
流速:0.8 mL/分
PDA検出波長:254nm(検出範囲210-500nm)
2)ODS塩基性分析
移動相:[A]は10mM炭酸アンモニウム含有水溶液、[B]はアセトニトリル
グラジェント:3.5分間で5%-100%溶媒[B]のリニアグラジエントを行い、0.5分間、100%溶媒[B]を維持した。
カラム:ACQUITY UPLC(登録商標)BEH C18(1.7μm、i.d.2.1x50mm)(Waters)
流速:0.8 mL/分
PDA検出波長:254nm(検出範囲210-500nm)
3)C4塩基性分析
移動相:[A]は10mM炭酸アンモニウム含有水溶液、[B]はアセトニトリル
グラジェント:3.5分間で60%-100%溶媒[B]のリニアグラジエントを行い、0.5分間、100%溶媒[B]を維持した。
カラム:Xbridge Protein BEH C4(3.5μm、i.d.2.1x50mm)(Waters)
流速:0.8 mL/分
PDA検出波長:254nm(検出範囲210-500nm)
工程1
化合物2-12(5.07g、22.19mmol、東京化成工業株式会社)をDMF(51.8mL)、ジクロロメタン溶液(28.6mL)に溶解し、DIEA(5.81mL、33.3mmol)、HBTU(9.26g、24.4mmol)を加え、室温で激しく30分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物1(1.0g、11.1mmol)を加えて激しく撹拌した。その後、40℃に昇温しさらに2時間撹拌した。反応液に飽和重そう水(10mL)を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水(50mL)、アセトニトリル(50mL)、ジクロロメタン(50mL)で洗浄後、白色固体として化合物3-12(4.8g、9.4mmol)を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:6.20 (2H, brs), 3.96 (1H, d, J = 4.0 Hz), 3.75 (1H, m), 3.40 (2H, dd, J=4.0, 12.0 Hz), 3.25 (2H, dd, J = 4.0, 12.0 Hz), 2.22 (4H, t, J = 12.0 Hz), 1.62 (4H, d, J = 8.0 Hz), 1.29-1.25 (40H, m), 0.90-0.86 (6, m)
ESI-MS(m/z) : 512 (M+1).
工程2
化合物3-12(5.10g、9.98mmol)をジクロロメタン(257mL)に懸濁し、DIEA(6.97mL、39.9mmol)を加えた。その後室温にて、化合物4(4.46mL、20.0mmol)を加え、2時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液を分液漏斗へ移し、有機層を飽和重そう水(100mL)で二回、水(100mL)で二回、食塩水(100mL)で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。褐色オイルである化合物5-12(4.80g、6.75mmol)を粗生成物として得た。化合物の生成は31P-NMRにより3価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR(CDCl3)δ:148.2 (s)
化合物6(米国特許出願公開第2014/0142253号明細書参照、292mg、0.435mmol)のDMF溶液(2.0mL)にイミダゾール(71mg、1.044mmol)とt-ブチルジメチルクロロシラン(79mg、0.522mmol)加え、室温で16時間撹拌した。反応液へ水を加えてシクロペンチルメチルエーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物7の粗製物(352mg)を得た。
化合物7の粗製物(352mg)のジクロロメタン溶液(2.4mL)にジエチルアミン(0.6mL、5.74mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。反応液にエタノールを加えて撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をエタノールで2回共沸し、得られた粗製物をアミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一(クロロホルム)で精製し、無色油状物質として化合物8(190mg、78%)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.43 (2H, m), 7.32 (4H, d, J = 8.8 Hz), 7.29-7.25 (2H, m), 7.22-7.18 (1H, m), 6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz), 3.79 (6H, s), 3.68-3.61 (2H, m), 3.08-3.02 (2H, m), 2.63 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.75-1.69 (1H, m), 1.41-1.30 (6H, m), 1.27-1.15 (2H, m), 0.84 (9H, s), 0.01 (6H, s).
工程1
化合物3-6(1.0g、2.92mmol)のTHF(20mL)―クロロホルム(20mL)溶液にDIEA(1.53mL、8.76mmol)、ビス(ニトロフェニル)カーボネート(1.33g、4.38mmol)、DMAP(178mg、1.46mmol)を加え、60℃で1時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=60:40→20:80)で精製し、化合物9-6(982mg、66%)を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.32-8.26 (2H, m), 7.42 (2H, dt, J = 9.9, 2.5 Hz), 6.36 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.80 (1H, ddd, J = 10.7, 5.6, 3.3 Hz), 3.65-3.50 (4H, m), 2.26 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.69-1.62 (4H, m), 1.28 (16H, dt, J = 19.1, 4.7 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程2
化合物8(500mg、0.89mmol)のジクロロメタン溶液(10.0mL)に化合物9-6(450mg、0.89mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、アミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=65:35→10:90)で精製し、化合物10-6(625mg、76%)を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.31 (4H, t, J = 6.2 Hz), 7.26 (3H, t, J = 3.9 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, t, J = 6.0 Hz), 6.25 (2H, t, J = 5.8 Hz), 4.70 (2H, dd, J = 10.3, 5.3 Hz), 3.79 (6H, d, J = 4.4 Hz), 3.62 (2H, dd, J = 10.1, 5.1 Hz), 3.51 (2H, dd, J = 13.3, 6.4 Hz), 3.32-3.26 (2H, m), 3.08 (4H, dt, J = 20.2, 6.6 Hz), 2.19 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.70 (1H, t, J = 5.7 Hz), 1.61 (8H, t, J = 9.3 Hz), 1.42 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.26 (20H, tt, J = 26.0, 10.5 Hz), 0.88 (6H, dd, J = 12.0, 5.3 Hz), 0.83 (9H, s).
工程3
化合物10-6(625mg、0.67mmol)のTHF溶液(10mL)にTBAF(1M THF溶液、1.34mL、1.34mmol)を加え、室温で24時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、得られた粗製物をジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=50:50→10:90)で精製し、化合物11-6(541mg、99%)を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz), 7.26 (9H, ddt, J = 31.6, 12.0, 4.9 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.38 (2H, q, J = 6.1 Hz), 4.88 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.67 (1H, t, J = 5.0 Hz), 3.79 (6H, t, J = 7.5 Hz), 3.69-3.61 (2H, m), 3.50-3.44 (2H, m), 3.30 (3H, tt, J = 20.6, 6.5 Hz), 3.15-3.06 (3H, m), 2.63 (1H, s), 2.21-2.17 (4H, m), 1.78 (1H, s), 1.62 (4H, t, J = 6.9 Hz), 1.43 (2H, t, J = 5.4 Hz), 1.30 (20H, dt, J = 29.2, 11.0 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.9 Hz).
化合物11-6(541mg、0.66mmol)の塩化メチレン溶液(2mL)にDIEA(0.35mL、1.98mmol)、DMAP(8.0mg、0.066mmol)、無水コハク酸(132mg、1.32mmol)を加え、室温で4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗精製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(クロロホルム:メタノール=40:1→10:1)で精製し、化合物12-6(591mg、97%)を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.31-7.25 (8H, m), 7.20 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.5 Hz), 6.62 (1H, t, J = 6.3 Hz), 6.48 (1H, t, J = 6.5 Hz), 5.91 (1H, t, J = 5.5 Hz), 4.71 (1H, t, J = 5.3 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 11.0, 3.2 Hz), 4.14 (1H, dd, J = 10.9, 5.9 Hz), 3.79 (6H, s), 3.40 (4H, tt, J = 20.4, 7.0 Hz), 3.08 (4H, dq, J = 33.3, 8.0 Hz), 2.69-2.49 (4H, m), 2.20 (4H, dd, J = 15.6, 8.2 Hz), 1.95 (1H, s), 1.61 (4H, d, J = 7.0 Hz), 1.27 (22H, d, J = 5.0 Hz), 0.87 (6H, dd, J = 6.8, 5.1 Hz).
工程5
化合物12-6(312mg、0.34mmol)のアセトニトリル/塩化メチレン混合溶液(4:1、25mL)にDIEA(0.30mL、1.70mmol)とHBTU(142mg、0.37mmol)を加え、室温で15分間振とう撹拌した。反応液へHybridCPG amino form 2000Å(Prime Synthesis社)(2.8g)を加え、24時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、HybridCPGをアセトニトリルで3回、ジエチルエーテルで3回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したHybridCPGにTHF/無水酢酸/ピリジン混液(8:1:1、30mL)を加えて3時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、HybridCPGをピリジンで2回、イソプロパノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物12-6の担持量はDMTrカチオンの比色定量により算出し、担持量が114μmol/gの化合物13-6を得た。
化合物12-8の担持量が107μmol/gの化合物13-8
化合物12-10の担持量が69μmol/gの化合物13-10
化合物12-12の担持量が31μmol/gの化合物13-12
化合物12-14の担持量が40μmol/gの化合物13-14
化合物12-18の担持量が15μmol/gの化合物13-18
化合物12-20の担持量が48μmol/gの化合物13-20
化合物12-22の担持量が47μmol/gの化合物13-22
(式中、n’は5~29の整数である。)
4-1)化合物14-16の合成
化合物3-16(3.0g、4.81mmol)のTHF(80mL)溶液にPyridine(0.78mL、9.63mmol)、クロロぎ酸4-ニトロフェニル(1.94g、9.63mmol)、DMAP(59mg、0.481mmol)を加え、70℃で3時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=50:50)で精製し、化合物14-16(1g、26%)を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.29 (2H, dt, J = 9.7, 2.6 Hz),7.43 (2H, dt, J = 9.9, 2.7 Hz),6.28 (2H, t, J = 6.4 Hz),4.80-4.77 (1H, m),3.62 (2H, ddd, J = 14.5, 7.0,),3.51 (2H, dt, J = 14.5, 6.3 Hz),2.25 (4H, t, J = 7.7 Hz),1.65 (4H, td, J = 12.4, 5.3 Hz),1.36-1.20 (56H, m),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
化合物17(3.00g、7.15mmol)のジクロロメタン溶液(15ml)に室温でトリエチルアミン(1.98ml、14.3mmol、2.0eq.)、無水コハク酸(751mg、7.51mmol、1.05eq.)を加え、室温で1時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2:120g、クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン=95:5:1→75:25:1)により精製し、化合物18(3.37g、収率91%)を無色粉末として得た。1H-NMRでは63:37のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z) : 530 (M+H). HPLC Peak RT = 1.86 min.
1H-NMR(CDCl3)δ:(Major) 7.39-7.33 (2H, m), 7.30-7.22 (6H, m), 7.22-7.16 (1H, m), 6.85-6.77 (4H, m), 4.50 (1H, brs), 4.41 (1H, m), 3.88 (1H, d, J = 11.0 Hz), 3.775 (6H, s), 3.65 (1H, dd, J = 11.0, 4.0 Hz), 3.43 (1H, dd, J = 9.2, 4.5 Hz),3.14 (1H, dd, J = 9.2, 2.7 Hz), 2.85-1.97 (6H, m). (Minor) 7.39-7.33 (2H, m), 7.30-7.22 (6H, m), 7.22-7.16 (1H, m), 6.85-6.77 (4H, m), 4.41 (1H, m), 4.31 (1H, brs), 4.11 (1H, d, J = 12.3 Hz), 3.783 (6H, s), 3.25 (1H, dd, J = 12.3, 3.5 Hz), 3.18 (1H, dd, J = 9.5, 4.8 Hz),3.10 (1H, dd, J = 9.5, 4.8 Hz), 2.85-1.97 (6H, m).
工程1
Journal of Medicinal Chemistry,48,7781(2005)に記載の方法に従って、化合物1より化合物19を合成した。
工程2
化合物19(3.00g、7.15mmol)のTHF-水(9:1)の混合溶液(30ml)に室温でトリフェニルホスフィン(1.98ml、14.3mmol、2.0eq.)を加え、室温で1時間撹拌した後、70℃に昇温し、4時間撹拌した。室温へ放冷後、反応液を減圧下濃縮することにより、化合物20の粗生成物を無色油状物として得た。
工程3
化合物20(7.15mmol)のジクロロメタン溶液(30ml)に室温でトリエチルアミン(2.10ml、15.1mmol、1.2eq.)、Fmoc-Cl(3.59g、13.9mmol、1.1eq.)を加え、室温で1時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた固体をn-ヘキサン及び少量のクロロホルムにて洗浄した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2:120g、n-ヘキサン:酢酸エチル=75:25→0:100)により精製し、化合物21(4.18g、化合物19からの収率65%)を無色泡状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 512 (M+H). HPLC Peak RT = 2.71 min.
1H-NMR(CDCl3)δ:7.80 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.5Hz), 7.40 (2H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.30 (2H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz), 6.02 (1H, brs), 5.21 (2H, brs), 4.46-4.27 (2H, m), 4.21 (1H, m), 3.59 (1H, m), 3.45-3.29 (2H, m), 3.27-3.13 (2H, m), 1.46 (18H, s).
化合物21(1.5g、2.93mmol)にTFA(10ml)を加え、室温で1時間撹拌した後、減圧下濃縮することにより、化合物22の粗生成物を得た。
ESI-MS (m/z) : 312 (M+H). HPLC Peak RT = 1.06 min.
工程5
化合物22のジクロロメタン溶液(15ml)に室温でトリエチルアミン(2.43ml、17.59mmol)、ミリストイルクロリド(1.59g、6.45mmol)を加え、室温で1晩撹拌した。生じた白色の析出物をろ取した後、ジクロロメタン、水、n-ヘキサンにて洗浄、減圧下乾燥することにより、化合物23-12(2.45g)を固体として得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:12.32 (1H, s), 7.76 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.35 (4H, dt, J = 33.7, 7.3 Hz), 6.56 (1H, s), 6.40 (1H, s), 4.32-4.19 (2H, m), 3.60 (2H, s), 3.20-3.09 (4H, m), 2.23 (4H, t, J = 7.1 Hz), 1.64 (4H, s), 1.37-1.25 (40H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程6
化合物23-12(1.9g、2.60mmol)のDMF溶液(15ml)にピペリジン(0.290ml、2.93mmol)を加え、80℃で20分間撹拌した。室温まで冷却した後、生じた析出物をろ取し、n-ヘキサンにて洗浄、減圧下乾燥することにより、化合物24-12(742mg、収率50%)を固体として得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:6.43 (1H, s), 3.43 (2H, t, J = 8.2 Hz), 3.03 (4H, m), 2.22 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.73 (4H, m), 1.38-1.25 (40H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.7 Hz).
工程7
化合物18(585mg、1.13mmol)の‘DMF溶液(5mL)に室温でDIEA(1.20ml、1.79mmol)、HBTU(677mg、1.79mmol)を加え、室温で10分間撹拌した後、45℃で化合物24-12(700mg、1.37mmol)のジクロロメタン溶液(30mL)に加え、45℃で30分間撹拌した。不溶物が確認されたのでDMF(1.5mL)を加えることで完全妖怪させた.反応液の溶媒を減圧留去したのち,反応液を飽和重そう水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、80℃でn-ヘキサンを加えて、目的物を析出させ、ろ取することで化合物25-12(1.31g、収率88%)を固体として得た。得られた生成物はそれ以上の精製を経ず、次反応に用いた。
化合物25-12(1.0g、0.919mmol)のジクロロメタン溶液(20ml)に室温でトリエチルアミン(0.510ml、3.68mmol、4eq.)、無水コハク酸(184mg、1.839mmol、2eq.)、ジメチルアミノピリジン(11mg)を順次加え、室温で2時間撹拌した後、原料が残っていたのでトリエチルアミン(0.255ml)、無水コハク酸(90mg)を加え,室温で一晩撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2:30g、クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン=100:0:1→90:10:1)により精製することで化合物26-12(261mg、収率35%)を固体として得た。
ESI-MS (m/z) : 1110 (M-H). HPLC Peak RT = 3.08 min.
工程9
3-1)工程5と同様の方法により、化合物26-12の担持量が31.2umol/gの化合物27-12を得た。
工程1
Journal of Controlled Release,220,44―50(2015)に記載の方法に従って化合物28-7-7-7を合成した。
工程2
化合物28-7-7-7(1g、2.45mmol)のTHF溶液(50mL)ビス(ニトロフェニル)カーボネート(2.23g、7.34mmol)、DMAP(897mg、7.34mmol)を加え、65℃で2時間撹拌した。反応液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=100:10)で精製し、化合物29-7-7-7(932mg、66%)を無色固体として得た。
ESI-MS (m/z) : 591 (M+H+H2O). HPLC Peak RT = 2.49 min.
工程3
化合物29-7-7-7(644mg、1.12mmol)のジクロロメタン溶液(6.4mL)に6-アミノ-2-ヒドロキシメチルヘキサン-1-オール(500mg、0.89mmol)のDMF溶液(6.4mL)及びDIEA(0.39mL、2.24mmol)を加え、40℃で2時間撹拌した。反応溶液に水を加え反応を停止後分液漏斗へ移し、有機層を水で二回、食塩水で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をアミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=50:50)で精製し、化合物30-7-7-7(424mg、65%)を無色油状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 583 (M+H). HPLC Peak RT = 2.06 min.
工程4
化合物30-7-7-7(424mg、0.729mmol)のピリジン溶液(6.4mL)にDMTrCl(272mg、0.802mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、ジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:1)で精製し、化合物31-7-7-7(510mg、51%)を無色油状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 883 (M-H). HPLC Peak RT = 2.60 min
化合物31-7-7-7(510mg、0.58mmol)の塩化メチレン溶液(6.4mL)にDMAP(137mg、1.12mmol)、無水コハク酸(337mg、3.37mmol)、DIEA(0.59mL、3.37mmol)を加え、室温で3日間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー(クロロホルム:メタノール=20:1)で精製し、化合物32-7-7-7(945mg)を無色液体物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 983 (M-H). HPLC Peak RT = 1.97 min
工程6
3-1)工程5と同様の方法により、化合物32-7-7-7の担持量が16μmol/gの化合物33-7-7-7を得た。
1-1)工程1及び3-1)の工程1~4と同様の方法により、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13(6), 1037-1040; 2003に記載の化合物40から化合物41を合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.42-7.18 (m, 5H), 6.81 (m, 2H), 6.55 (brs, 1H), 6.39 (brs, 1H), 5.91 (brs, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.45-3.37 (m, 4H), 3.05 (m, 4H), 2.58-2.52 (m, 4H), 2.19 (m, 4H), 1.95 (brs, 1H), 1.60-1.14 (m, 32H), 0.88 (m, 4H), 0.78-0.61 (m, 8H), 0.28 (m, 4H).
工程2
3-1)工程5と同様の方法により、化合物41の担持量が92μmol/gの化合物42を得た。
工程1
デカン酸(1.16g、6.75mmol、東京化成工業株式会社)をDMF(14mL)、ジクロロメタン溶液(14mL)に溶解し、DIEA(3.14mL、18mmol)、HBTU(2.82g、7.43mmol)を加え、室温で激しく1時間撹拌した。得られた褐色溶液に対して、室温で化合物43(Chemistry-A European Journal (2010), 16, (15), 4519-4532, S4519参照、2.0g、2.25mmol)を加えて室温で24時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後に、残渣を25%含水アセトニトリルで処理し、生じた固体をろ取した。得られた固体を水で3回、25%含水アセトニトリルで三回洗浄後、化合物44-8(2.19g、2.07mmol)を白色固体として得た。
工程2
化合物44-8(0.5g、0.471mmol)をエタノール(6mL)に溶解し、水酸化パラジウム(221mg、Pd20%、含水)を加えて水素雰囲気下、室温で2時間激しく撹拌した。窒素で置換後、不溶物をセライトを用いて濾去した。残渣を減圧下で濃縮し、残渣に対してアセトニトリルを加えた。生じた白色固体をろ取し、化合物45-8(0.400g、0.471mmol)を白色泡状固体として得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:6.44 (brs, 2H), 3.71 (m, 6H), 3.37 (m, 6H), 3.27 (m, 12H), 2.45 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.63 (m, 6H), 1.25 (m, 36H), 0.88 (t, 9H, J = 6.8 Hz).
窒素気流下、化合物45-8(0.4g、0.432mmol)のDMF(1.7mL)―ジクロロメタン(1.4mL)―クロロホルム(1.0mL)溶液に、ビス-(p-ニトロフェニル)カーボネート(0.131g、0.432mmol)及びDIEA(0.226mL、1.30mmol)を加えた後、室温下12時間撹拌した。次に、2)で得られた化合物8(0.243g、0.432mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈後、水で有機層を3回、0.2M炭酸水素カリウム水溶液で2回、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。固体をフィルター濾去したのちに、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:アセトン=1:0→9:1)で精製し、化合物46-8(0.375g、0.247mmol)を白色固体として得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.40 (m, 2H), 7.30-7.26 (m, 13H), 7.09 (m, 3H), 5.82 (brs, 1H), 5.51 (brm, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.68-3.65 (m, 13H), 3.25 (m, 12H), 3.03 (m, 2H), 2.44 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.63-1.60 (m, 6H), 1.27-1.25 (m, 28H), 0.89-0.72 (m, 18H).
工程4
3-1)工程3及び工程4と同様の方法により、化合物46-8から化合物47-8を合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.41-7.20 (m, 5H), 6.82 (m, 4H), 6.61 (brs, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.69-3.62 (m, 12H), 3.25 (m, 12H), 3.02 (m, 6H), 2.60 (m, 6H), 2.42 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.60 (m, 12H), 1.27 (m, 20H), 0.88 (m, 9H).
工程5
3-1)工程5と同様の方法により、化合物47-8の担持量が68.6μmol/gの化合物48-8を得た。
9-1)と同様の方法により、以下の化合物を得た。
化合物47-12
1H-NMR(CDCl3)δ:7.40-7.26 (m, 5H), 6.81 (m, 4H), 6.56 (brs, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.69-3.62 (m, 12H), 3.25 (m, 12H), 3.07 (m, 8H), 2.58 (m, 4H), 2.44 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.60 (m, 12H), 1.27-1.22 (m, 60H), 0.88 (m, 9H).
化合物47-12の担持量が70.0μmol/gの化合物48-12
工程1
化合物49(20g、77mmol、東京化成工業株式会社)をジクロロメタン(5mL)に溶解し、0℃においてDIEA(13.5mL、77mmol)を加え、室温まで昇温した。その後、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=7:3→4:6)で精製し、化合物50(22.5g、59.4mmol)を無色油状物として得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:5.18 (brs, 2H), 4.11 (m, 4H), 3.74 (m, 1H), 3.45 (s, 1H), 3.39 (m, 1H), 3.29-3.20 (m, 4H), 0.93 (t, 4H, J = 8.4 Hz), 0.00 (s, 18H).
LC/MS: [M+] m/z: 380
工程2
窒素気流下、化合物50(3.79g、10mmol)のTHF(33mL)溶液に、ビス-(p-ニトロフェニル)カーボネート(3.04g、10mmol)及びDIEA(1.75mL、10mmol)、DMAP(1.2g、10mmol)を加えた後、室温下12時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=4:1→1:1)で精製し、化合物51(4.43g、8.14mmol)を無色油状物として得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.26 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.38 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 5.20 (brs, 2H), 4.77 (brs, 1H), 4.13 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 3.51-3.46 (m, 4H), 0.93 (m, 4H), 0.00 (m, 18H).
LC/MS: [M+] m/z: 545
工程3
3-2)の工程2及び工程3と同様の方法により、化合物51から化合物52を合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.41-7.20 (m, 5H), 6.82 (m, 4H), 3.79 (s, 6H), 3.72-3.62 (m, 4H), 3.22-3.01 (m, 6H), 1.29 (m, 6H).
2-へキシルデカン酸(110mg、0.428mmol)のジクロロメタン(2mL)-DMF(2.5mL)溶液にDIEA(0.102mL、0.583mmol)、HBTU(0.162g、0.428mmol)を加え、室温で激しく30分撹拌した。得られた褐色溶液に対して、室温で化合物52(0.110g、0.194mmol)を加えて室温で24時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後に、残渣を酢酸エチルで希釈後、水で有機層を3回洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。固体をフィルター濾去したのちに、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-へキサン:酢酸エチル=1:0→1:1)で精製し、化合物53-5-7(90mg、0.086mmol)を白色アモルファスとして得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.42-7.19 (m, 5H), 6.83 (m, 4H), 4.81 (brm, 1H), 4.65 (brs, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.67 (m, 2H), 3.46-3.39 (m, 3H), 3.25 (m, 1H), 3.11 (m, 3H), 2.05 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.55-1.24 (m, 48H), 0.84 (m, 12H).
工程5
3-1)工程4と同様の方法により、化合物53-5-7から化合物54-5-7を合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.42-7.19 (m, 5H), 6.83 (m, 4H), 6.65 (brs, 1H), 6.52 (brs, 1H), 5.86 (brs, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.38 (brs, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.41 (m, 4H), 3.02 (m, 4H), 2.55 (m, 4H), 2.05 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.55-1.24 (m, 48H), 0.84 (m, 12H).
LC/MS: [M-] m/z: 1142
工程6
3-1)工程5と同様の方法により、化合物54-5-7の担持量が70.0μmol/gの化合物55-5-7を合成した。
3-1)工程1と同様の方法により、化合物56(6.94g、24.4mmol、東京化成工業株式会社)から化合物57を合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.30 (d, 2H, J =9.2 Hz), 7.45 (m, 2H), 6.32 (brs, 2H), 4.75 (brs, 1H), 4.55 (brs, 1H), 3.51 (m, 6H), 1.87 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.67 (m, 16H), 1.25 (m, 6H), 1.21 (m, 6H), 1.03 (m, 12H), 0.88 (m, 42H).
LC/MS: [M+] m/z: 789
工程2
3-1)工程2~4と同様の方法により、化合物57から化合物58を合成した。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.42-7.18 (m, 6H), 6.80 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 5.89 (brs, 1H), 4.62 (brs, 1H), 4.38 (brs, 1H), 4.14 (brs, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.57-3.34 (m, 4H), 3.05 (m, 6H), 2.66-2.57 (m, 4H), 1.87 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.66 (m, 1H), 1.56 (m, 16H), 1.45 (m, 6H), 1.25 (m, 6H), 1.03 (m, 12H), 0.88 (m, 42H).
LC/MS: [M-] m/z: 1198
工程3
3-1)工程5と同様の方法により、化合物58の担持量が53.4μmol/gの化合物59を合成した。
窒素気流下、化合物52(307mg、0.389mmol)のTHF(3mL)溶液に、DIEA(0.102mL、0.583mmol)、DMAP(23.8mg、0.194mmol)、11)の工程1で得られた化合物57(110mg、0.194mmol)を加えて、55℃で5時間撹拌した。その後反応溶液を室温で一晩静置した。反応液を酢酸エチルで希釈後、水で有機層を3回洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。固体をフィルター濾去したのちに、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:0→1:1)で精製し、化合物60(100mg、0.054mmol)を白色アモルファスとして得た。
LC/MS: [M+3H]3+ m/z: 622
工程2
3-1)工程4と同様の方法により、化合物60から化合物61を合成した。
LC/MS: [M+2H]2+ m/z: 983
工程3
3-1)工程5と同様の方法により、化合物61の担持量が47.7μmol/gの化合物62を合成した。
工程1
窒素気流下、化合物63(Nucleic Acids Research, Volume 42, Issue 13, 29 July 2014, Pages 8796-8807参照、0.621g、1.48mmol)のジクロロメタン溶液(29mL)溶液に、DMAP(181mg、1.48mmol)、DIEA(0.258mL、1.48mmol)、3-1)工程1と同様の方法により得られた化合物9-12(1.0g、1.48mmol)を加えて、加熱還流下で4時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=1:0→9:1)で精製し、化合物64-12(1.0g、1.05mmol)を無色油状物として得た。
LC/MS: [M+H] m/z: 955
工程2
1-1)工程2と同様の方法により、化合物64-12から化合物65-12を合成した。
31P-NMR(CDCl3)δ:147.9, 147.6, 147.4, 146.3
工程1
9-フルオレニルメチル-N-ヒドロキシスクシンイミド(4.00g、11.87mmol、渡辺化学工業株式会社)のメタノール懸濁液(40.0mL)に、室温で化合物1(1.07g、11.87mmol)のメタノール溶液(10.0mL)を加え、1.5時間撹拌した。反応液にピリジン塩酸塩(3.02g、26.1mmol)を加えて10分間撹拌した後に、ろ過した。ろ液を濃縮後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一(クロロホルム:メタノール=90:10→75:25)で精製し、白色固体物質として化合物66(1.53g、37%)を得た。
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.90 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.82 (2H, s), 7.70 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.44-7.41 (3H, m), 7.34 (2H, t, J = 7.4 Hz), 5.53 (1H, d, J = 5.0 Hz), 4.32 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.22 (1H, t, J = 6.7 Hz), 3.71 (1H, s), 3.12-3.06 (1H, m), 3.03-2.96 (1H, m), 2.87 (1H, dd, J = 12.9, 2.6 Hz), 2.60 (1H, dd, J = 12.9, 9.2 Hz).
ESI-MS(m/z) : 313 (M+1).
工程2
パルミチン酸(300mg、1.17mmol)をDMF(6.0mL)、ジクロロメタン溶液(2.0mL)に溶解し、DIEA(0.31mL、1.76mmol)、HBTU(489mg、1.29mmol)を加え、室温で激しく30分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物66(409mg、1.17mmol)を加えて3日間撹拌した。反応液に飽和重そう水(8.0mL)と水(2.0mL)を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水(40mL)で洗浄後、白色固体として化合物67-14(719mg、quant.)を得た。
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.89 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.77 (1H, t, J = 5.6 Hz), 7.70 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.33 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.22 (1H, t, J = 5.8 Hz), 4.95 (1H, s), 4.28-4.19 (3H, m), 3.51 (2H, t, J = 5.6 Hz), 3.14-3.08 (2H, m), 3.02-2.89 (4H, m), 2.07 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.47 (2H, s), 1.22 (19H, s), 0.94 (2H, d, J = 6.5 Hz), 0.85 (3H, t, J = 6.8 Hz).
ESI-MS(m/z) : 552 (M+1).
工程3
3-1)工程1~4と同様の方法により、化合物67-14から化合物68-14を合成した。
ESI-MS (m/z) : 1125 (M-H). HPLC Peak RT = 1.09 min
工程4
3-1)工程5と同様の方法により、化合物68-14の担持量が108μmol/gの化合物69-14を合成した。
工程1
パルミチン酸(209mg、0.81mmol)をDMF(6.0mL)に溶解し、HBTU(309mg、0.81mmol)を加え、室温で10分間撹拌した。反応液に化合物70-3(300mg、0.81mmol、渡辺化学工業株式会社)とDIEA(0.14mL、0.81mmol)を加えて50℃で5分間撹拌した後、室温で3時間撹拌した。反応液へ2M塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一(クロロホルム:メタノール=100:0→90:10)で精製し、白色固体物質として化合物71-3-14(491mg、99%)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.76 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.58 (2H, d, J = 6.9 Hz), 7.39 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.30 (2H, t, J = 7.4 Hz), 6.43 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.08 (1H, s), 4.58-4.18 (5H, m), 3.19-3.06 (3H, m), 2.21 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.90-1.24 (30H, m), 0.87 (3H, t, J = 6.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 608 (M+1).
工程2
化合物71-3-14(240mg、0.40mmol)をアセトニトリル(2.5mL)、ジクロロメタン溶液(5.0mL)に懸濁し、DIEA(0.21mL、1.19mmol)、HBTU(165mg、0.44mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。米国特許出願公開第2009/259030号明細書を参照し、合成した6-アミノ-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ヘキサンー1-オール(178mg、0.40mmol)のアセトニトリル(2.5mL)溶液を反応液に加えて室温で3時間撹拌した。反応液へ飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一(ヘキサン:酢酸エチル=70:30→10:90)で精製し、白色固体物質として化合物72-3-14(146mg、36%)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.76 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.58 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.39 (4H, t, J = 7.4 Hz), 7.32-7.28 (8H, m), 7.20 (1H, t, J = 7.3 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.21-6.15 (2H, m), 4.96 (1H, d, J = 6.1 Hz), 4.42-4.28 (3H, m), 4.20 (1H, t, J = 6.8 Hz), 3.78 (6H, s), 3.65-3.60 (2H, m), 3.24-3.18 (4H, m), 3.05 (1H, dd, J = 9.1, 7.3 Hz), 2.62 (1H, t, J = 5.6 Hz), 2.16 (2H, t, J = 7.0 Hz), 1.84-1.76 (2H, m), 1.55-1.23 (38H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
ESI-MS(m/z) : 1039 (M+1).
工程3
3-1)工程1~4と同様の方法により、化合物72-3-14から化合物73-3-14を合成した。
ESI-MS (m/z) : 1137 (M-H). HPLC Peak RT = 1.34 min
工程4
3-1)工程5と同様の方法により、化合物73-3-14の担持量が120μmol/gの化合物74-3-14を合成した。
(式中、n’’は2~29の整数である。)
16-1)化合物75-2の合成
化合物2-2(300mg、3.40mmol)のTHF溶液(4.5mL)にN-ヒドロキシコハク酸イミド(431mg、3.75mmol)を加えた。続いて、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(773mg、3.75mmol)のTHF溶液(1.5mL)加え、室温で2時間撹拌した。生成した固体をろ過で除いた後、ろ液を濃縮して化合物75-2(476mg、75%)を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.59 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.84-1.74 (2H, m), 1.05 (3H, t, J = 7.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 186 (M+1).
化合物75-6(803mg、77%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.71 (2H, m), 1.42-1.29 (8H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 242 (M+1).
化合物75-10(232mg、52%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.71 (2H, m), 1.42-1.20 (16H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
ESI-MS(m/z) : 298 (M+1).
化合物75-12(402mg、56%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.78-1.70 (2H, m), 1.40 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.26 (18H, s), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
化合物75-16(256mg、62%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.70 (2H, m), 1.44-1.26 (24H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
化合物75-18(310mg、79%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.70 (2H, m), 1.42-1.25 (32H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.59 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.79-1.71 (2H, m), 1.63-1.53 (1H, m), 1.32-1.26 (2H, m), 0.90 (6H, d, J = 6.7 Hz).
ESI-MS(m/z) : 228 (M+1).
化合物77(302mg、60%)、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, d, J = 4.0 Hz), 2.63-2.56 (1H, m), 1.82-1.56 (4H, m), 1.43-1.31 (4H, m), 1.03 (3H, t, J = 7.5 Hz), 0.92 (3H, t, J = 7.0 Hz).
ESI-MS(m/z) : 242 (M+1).
化合物78(224mg、54%)、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, d, J = 4.8 Hz), 2.68-2.61 (1H, m), 1.78-1.68 (2H, m), 1.63-1.54 (2H, m), 1.43-1.26 (20H, m), 0.89-0.86 (6H, m).
化合物79(296mg、84%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.82 (4H, s), 2.68-2.60 (1H, m), 1.74-1.68 (2H, m), 1.61-1.56 (2H, m), 1.40-1.25 (64H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.5 Hz).
化合物80(373mg、82%)、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.76-1.67 (6H, m), 1.45-1.37 (2H, m), 1.26-1.11 (7H, m), 0.90-0.82 (2H, m).
ESI-MS(m/z) : 282 (M+1).
化合物81(476mg、quant.)、白色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 3.68-3.63 (6H, m), 3.49-3.47 (2H, m), 3.01 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.87-2.82 (4H, m), 2.74 (2H, t, J = 7.1 Hz).
ESI-MS(m/z) : 285 (M+1).
化合物82(459mg、quant.)、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.40-5.33 (4H, m), 2.83 (4H, s), 2.77 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.05 (4H, q, J = 6.7 Hz), 1.78-1.71 (2H, m), 1.43-1.26 (14H, m), 0.89 (3H, t, J = 6.7 Hz).
ESI-MS(m/z) : 378 (M+1).
化合物83(433mg、quant.)、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.01 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.88 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.77 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.58-7.49 (2H, m), 7.45-7.39 (2H, m), 3.53 (2H, t, J = 8.0 Hz), 3.06 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.86 (4H, s).
ESI-MS(m/z) : 298 (M+1).
ESI-MS (m/z) : 324 (M+H). HPLC Peak RT = 1.29 min
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.31 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.48 (2H, d, J = 9.2 Hz), 2.62 (2H, t, J = 6.7 Hz), 2.16 (3H, s), 2.12 (6H, s), 1.87-1.74 (2H, m), 1.60-1.05 (24H, m), 0.87-0.83 (12H, m).
ESI-MS(m/z) : 596 (M+1).
工程1
15-1)工程1~3と同様の方法により、化合物70-3及び化合物9-12から化合物89-3-12を合成した。
LC/MS: Rt=2.48min [M-] m/z: 1435
工程2
3-1)工程5と同様の方法により、化合物89-3-12の担持量が68μmol/gの化合物90-3-12を合成した。
工程1
15-1)工程1と同様の方法により、化合物91-3から化合物92-3-12を淡赤色固体(1.11g)として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.16 (1H, d, J = 7.7 Hz), 5.64 (1H, m), 4.58 (1H, td, J = 8.1, 4.6 Hz), 3.74 (3H, s), 3.27-3.23 (2H, m), 2.23-2.16 (4H, m), 1.86-1.82 (2H, m), 1.74-1.28 (48H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程2
化合物92-3-12(1.17g)をTHF(12mL)に溶解し、2M水酸化ナトリウム水溶液(2mL)を加え一晩撹拌した。アセトニトリル(40mL)を加えることで生成した沈殿物をろ取し、粗固体を得た。その後、酢酸エチル(50mL)に溶解し、1M 塩酸水溶液(40mL)で有機相を洗った。有機層を水洗し、その後飽和食塩水で脱水して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮を行い、化合物93-3-12を無色個体(199mg)として得た(収率18%)。
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.82 (1H, d, J = 7.0 Hz), 5.81 (1H, t, J = 6.0 Hz), 4.51 (1H, td, J = 7.4, 4.6 Hz), 3.37 (1H, td, J = 13.8, 6.9 Hz), 3.18 (1H, dt, J = 19.4, 5.7 Hz), 2.33-2.25 (2H, m), 2.19 (2H, t, J = 7.7 Hz), 1.95-1.77 (2H, m), 1.63-1.25 (49H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程3
3-1)工程1と同様の方法により、化合物93-3-12から化合物94-3-12を合成した。
m/z 1097.84[M-H]
工程4
3-1)工程5と同様の方法により、化合物94-3-12の担持量が84μmol/gの化合物95-3-12を合成した。
化合物94-3-14
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.35-6.82 (13H), 6.47 (1H, m), 6.20 (1H, t, 6 Hz), 6.02 (1H, t, 6 Hz), 4.51 (1H, q, J = 7.5 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 8.1, 3.6 Hz), 4.18 (1H, d, J = 5.6 Hz), 4.09 (1H, dd, J = 11.0, 4.3 Hz), 3.77 (6H, s), 3.42-2.97 (8H, m), 2.72-1.74 (12H, m), 1.60-1.15 (58H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
化合物94-3-14の担持量が60μmol/gの化合物95-3-14
化合物94-3-16
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.02-6.81 (13H), 6.40 (1H, dd, J = 8.9, 4.4 Hz), 6.18 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.97 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.53 (1H, dd, J = 15.9, 7.4 Hz), 4.44 (1H, d, J = 11, 4 Hz), 4.20-4.15 (1H, m), 4.09 (1H, dd, J = 11.1, 4.0 Hz), 3.79 (6H, s), 3.45-3.00 (8H, m), 2.78-2.42 (4H, m), 2.20 (4H, m), 2.04-1.24 (62H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
化合物94-3-16の担持量が65μmol/gの化合物95-3-16
化合物94-2-14
m/z 1138.74[M―H]
化合物94-2-14の担持量が77μmol/gの化合物95-2-14
20-1)工程1~3と同様の方法により、化合物78から化合物96を合成した。
m/z 1153.04[M―H]
工程2
3-1)工程5と同様の方法により、化合物96の担持量が52μmol/gの化合物97を合成した。
工程1
15-1)工程1~3と同様の方法により、化合物98-3より化合物99-3-18を合成した。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.30 (5H, d, J = 8.7 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.81 (5H, d, J = 8.7 Hz), 6.74 (1H, t, J = 5.8 Hz), 6.26 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.55 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.72-4.67 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.58-3.49 (17H, m), 3.32-3.27 (6H, m), 3.14 (2H, q, J = 6.5 Hz), 3.04 (2H, d, J = 5.4 Hz), 2.49-2.46 (4H, m), 2.20 (5H, t, J = 7.5 Hz), 1.76-1.72 (4H, m), 1.65-1.62 (10H, m), 1.42-1.41 (3H, m), 1.25 (68H, s), 0.88 (6H, t, J = 6.6 Hz).
工程2
3-1)工程5と同様の方法により、化合物99-3-18の担持量が56μmol/gの化合物100-3-18を合成した。
ペプチドN末端の合成においては、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(渡辺化学工業株式会社)を用いて上記と同様にペプチド伸長・脱保護反応を行った後、ミリスチン酸を樹脂上のペプチドと縮合(300umol ミリスチン酸、300umol HBTU、600umol DIEA、クロロホルム/NMP(1:1) 2mL/100umol resin)することで、脂質ペプチドを合成した。切り出し溶液(TFA 92.5%、H2O 2.5%、TIS 2.5%、DODT 2.5%、2mL/100umol resin)を合成カラムに加えて室温で一時間反応させた後ろ過し、ろ液に溶媒(アセトニトリル又は水)を加え、沈殿物を回収した。該沈殿物をDMSOに溶解し、逆相精製(YMC Pack C4、150x10mmI.D.、流速 3-5mL/min、10mM TEAA-アセトニトリル、イソクラティック溶出(50%アセトニトリルで流した後、95%アセトニトリルで溶出)、検出 260nm、280nm)を行った。回収したフラクションを濃縮、凍結乾燥して脂質ペプチド(例えば化合物101及び102等)を白色固体として得た。
化合物101 [M+H]+, calc. 997.68824, obs. 997.4476
化合物102 [M+H]+, clac. 1082.77739, obs. 1082.7048
ESI-MS, [M+H]+ calc. 688.26534, obs. 688.4007
1-1)工程1及び3-1)工程1と同様の方法により、化合物104より化合物105-14を合成した。
ESI-MS(m/z) : 779 (M-H).
6-N-Boc―カプロン酸(1.0g、Sigma―Aldrich)をDMF(20mL)に溶解し、DIEA(2.3mL)とHBTU(1.8g)を加えて室温で15分間撹拌した。化合物106(0.45g、東京化成株式会社)を加えて室温で一晩撹拌した。飽和重曹水(50mL)に反応液を加えて酢酸エチル(100mL)で抽出し、有機層を減圧濃縮してフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、A溶媒 クロロホルム/B溶媒 25%メタノール―クロロホルム、15分間で0→5%B溶媒のグラジエント)で精製を行い、化合物107を茶色油状物質(1.12g)として得た(収率44%)。
m/z 585.19[M―H]―(ES Negative mode)、理論値 586.394[M]
工程2
化合物107(1.12g)をジクロロメタン(5.6mL)に溶解し,TFA(5.6mL)を加えて室温で30分間撹拌した。その後、トルエン共沸操作を二回繰り返しTFAを除き、乾燥することで化合物108を橙色オイル状物質(1.9g)として得た。
m/z 387.44[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 386.289[M]
工程3
化合物108(1.9g)を1,4-ジオキサン/水(1:1、14.6mL)に溶解し、炭酸水素ナトリウム(1.58g)を加えた。クロロぎ酸9-フルオレニルメチル(1.08g)を加えて加熱しながら撹拌した。炭酸水素ナトリウム(0.79g)を加え、室温まで冷却し固体をろ取した。該固体を酢酸エチルに再溶解し、n―ヘキサンを加えて析出した固体をろ取し、乾燥することで化合物109(1.93g)を白色固体を得た。
m/z 831.46[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 830.425[M]
化合物109(0.50g)をジクロロメタン(5mL)に懸濁し、N,N-ジメチルアニリン(0.61mL)と塩化アルミニウム(III)(0.40g)を加えた。1時間還流しながら撹拌し、その後1M塩酸(20mL)を滴下することで反応を停止した。酢酸エチル(2x30mL)を加えて抽出し、得られた有機層を水洗した(2x30mL)。その後飽和食塩水で脱水し、濃縮乾固し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカタイプ、A溶媒 クロロホルム/B溶媒 25% メタノール―クロロホルム、12分間で0→50% B溶媒のグラジエント条件)で精製し、化合物110を無色固体(32mg)として得た(収率7%)。
m/z 815.32[M―H]―(ES Negative mode)、理論値 816.410[M]
工程5
3-1)工程4と同様の方法により、化合物110から化合物111を合成した。
m/z 1248.38[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 1247.656[M]
工程6
3-1)工程5と同様の方法により、化合物111の担持量が45μmol/gの化合物112を合成した。
化合物113(2g、Sigma―Aldrich)をメタノール(20mL)に溶解し、1,2―ジ(ピリジン―2―イル)ジスルファン(1.91g)を加えて室温で一日撹拌した。1M 塩酸水溶液(50mL)に滴下して反応を停止し、酢酸エチル(2x50mL)で抽出した。得られた有機層を濃縮して化合物114を黄色油状物質(2.44g)として得た(収率83%)。
m/z 340.38[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 339.205[M]
工程2
化合物114(1.22g)をメタノール(2mL)に溶解し、L-エチルシステイン塩酸塩(0.53g)を加え室温で一晩撹拌した。アセトニトリル(5mL)を加えて析出した固体をろ取した。該固体をアセトニトリルで洗浄し、乾燥することで化合物115を無色固体(0.98g)として得た(収率72%)。
m/z 378.96[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 377.242[M]
工程3
化合物115(400mg)を1,4―ジオキサン(4mL)とテトラヒドロフラン(4mL)と水(1mL)に溶解し、炭酸水素ナトリウム(222mg)とDIEA(462μL)とクロロぎ酸9-フルオレニルメチル(174mg)を加えて室温で3時間撹拌した。クロロぎ酸9-フルオレニルメチル(80mg)を追加して更に室温で1時間撹拌し、反応を完結させた。反応液を水(50mL)と酢酸エチル(50mL)で分液し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカタイプ、A溶媒 n―ヘキサン/B溶媒 酢酸エチル、20分間で0→20% B溶媒のグラジエント条件)で精製し、化合物116を無色アモルファス(534mg)として得た(収率84%)。
m/z 599.64[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 599.310[M]
化合物116(534mg)をテトラヒドロフラン(5.3mL)に溶解し、1M 水酸化ナトリウム水溶液(2mL)を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液を1M 塩酸水溶液(40mL)と酢酸エチル(40mL)で分液を行い、得られた有機層を二回水洗した。有機層を飽和食塩水で洗い、有機層を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカタイプ、A溶媒 クロロホルム/B溶媒 25%メタノール―クロロホルム、15分間で0→20% B溶媒のグラジエント条件)で精製し、目的の化合物117を無色オイル状物質(30mg)として得た(単離収率6%)。
m/z 572.34[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 571.279[M]
工程5
16-1)工程1と同様の方法により、化合物117から化合物118を合成した。
m/z 572.34[M+H]+(ES Positive mode)、理論値 571.279[M]
工程6
3-1)工程4と同様の方法により、化合物118から化合物119を合成した。
m/z 1024.34[M+Na]+(ES Positive mode)、理論値 1024.52[M+Na]+
工程7
3-1)工程5と同様の方法により、化合物119の担持量が32μmol/gの化合物120を合成した。
本明細書の実施例に利用したオリゴヌクレオチドはAKTA Oligopilot10(GE Healthcare)、NS-8-I(大日本精機)、NS-8-II(大日本精機)を用いて、ホスホロアミダイト法により合成した。モノマーは上記アミダイト合成で得られたアミダイトを用いて、0.1Mアセトニトリル溶液に調製した。カップリング時間は32秒~10分間とし、1つのモノマーの縮合に8~10当量のアミダイト体を用いた。PO酸化には0.02M Oxidizer(Sigma―Aldrich)、ヨウ素/ピリジン/水/=12.7/9/1(w/v/v)を使用し、PS酸化には50mM DDTT((ジメチルアミノ-メチリデン)アミノ-3H-1,2,4-ジチアゾリン-3-チオン)のアセトニトリル/3-ピコリン1/1(v/v)、1/4(v/v)、アセトニトリル/ピリジン1/4(v/v)溶液を用いた。活性化剤はETT activator(5-エチルチオ)-1H-テトラゾール)(Sigma―Aldrich)、キャッピング試薬はCapA、CapB(Sigma―Aldrich)を使用した。脱トリチル化試薬はDeb(3w/v%TCA CH2Cl2 solution)(和光純薬)、Deb(3w/v% Dichloroacetin acid、Toluene Solution)を使用した。
なお、NA-6、NA-7、NA-21、NA-23は、ジーンデザイン社に核酸合成及びオリゴヌクレオチドの精製を委託することで得た。
1)合成アミダイト体からの合成-1
上記A)で合成した合成アミダイト(例えば、化合物5-n’等)を用いて、上記B)と同様の方法で望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
2)合成アミダイト体からの合成-2
Biotage社製マイクロウェーブチューブ(2-5ml、10-20ml)に撹拌子、Molecular Sieves 4A 1/16及び上記A)で合成した合成アミダイト(例えば、化合物5-n’等。オリゴヌクレオチドの10~100等量)を入れ、クロロホルム(安定化剤として2-メチル-2-ブテン添加)で0.2Mに調製する。5時間乾燥後、オリゴヌクレオチドが結合した固相(CPG樹脂、ポリスチレン樹脂)、0.25M ETT activator(5-エチルチオ)-1H-テトラゾール)ジクロロメタン溶液(クロロホルムと同量)を加え密閉し、40℃で10分~1時間加熱する。室温へ放冷後、反応溶液をクロロホルムで2倍希釈し、樹脂をろ取する。得られた樹脂をNS-8-I(大日本精機)、NS-8-II(大日本精機)上でPS酸化する。その後乾燥した樹脂を下記D)の脱保護に付し、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成する。
上記A)で合成した脂質を担持した樹脂(例えば、化合物13-n’、化合物27-n’、化合物33-s’-t’-u’等)を用いて、上記B)と同様の方法で望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
4)活性化体からの合成
エッペンチューブ(1.5ml)にアミノ基リンカーを有する1本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、NA-23、NA-24等)を入れ、DMSO(0.5% DIEA添加)と重そう水(0.2M NaHCO3)を1:5で加え1mMに調製し、上記A)で合成した化合物(例えば、化合物14-n’等。DMSO溶液としてオリゴヌクレオチドの2~10等量)を入れ、室温~70℃で2時間静置することで、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
5)脂質アミノ酸からの合成
アミノ基リンカーを有する1本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、NA-23、NA-24等)(1.2umol)と6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(26umol)とを混合し、0.1% DIEA存在下、DMSO(1mL)中、2~4時間、室温で反応させ、反応液を限外ろ過した後、凍結乾燥により白色固体を得た。
得られた白色固体と上記A)で合成した化合物(例えば、化合物100、101等。オリゴヌクレオチドの2~50等量)を4mLの溶媒(DMSO/アセトニトリル(1:1)またはDMSO)に溶かし、室温で反応させることで、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
6)脂溶性ペプチドからの合成
アミノ基リンカーを有する1本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、NA-23、NA-24等)の25mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に10倍当量のNHS-PEG4-Maleimide (ThermoFisher Scientific社)を加えて、室温下5時間振とう撹拌した。反応液から限外濾過キット(分子量カットオフ3,000)を用いて、過剰のNHS-PEG4-Maleimideを除去した。続いて、上記A)で合成した化合物(例えば、化合物123。オリゴヌクレオチドの3~10等量)を加え、40℃で1時間反応させることで、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
1)樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護
オリゴヌクレオチドの切り出しは28%アンモニア水/40%メチルアミン水溶液/EtOH=4/4/1(v/v)を用いて、室温下で4時間振とうした。1μmol合成の際は、アンモニア溶液を1ml用い、5μmol又は10μmol合成の際は、5ml、10mlそれぞれ用いて切り出し反応を行った。樹脂を50%エタノール水で洗浄後、ろ過液を減圧下で1~5mL程度まで濃縮した。
2)樹脂上でのFmoc及びリン酸の脱保護
C)の5)の合成終了後、樹脂を20%ピぺリジン含有DMF溶液で洗浄した。
脂質を導入していないオリゴヌクレオチドは条件1の逆相HPLCで精製を行った。
逆相HPLCの条件
条件1
移動相 A液:100mM TEAA(triethylammoniumacetate pH7.0)水溶液あるいは100mM AcONa水溶液(pH5.4)
B液:アセトニトリル
B濃度グラジエント:10-30%
(条件1-1)
Column:Hydrosphere C18(YMC社製)100x20mmI.D、S-5 μm、12 nm
流速:10mL/min
カラム温度:室温
検出UV:260nm
(条件1-2)
Column:Hydrosphere C18(YMC社製)150x10mmI.D、S-5 μm、12 nm
流速:4mL/min
カラム温度:室温
検出UV:260nm
条件2
逆相HPLCの条件
化合物の脂溶性に応じ、開始時のB濃度を20%~50%まで調節した
移動相 A液:100mM TEAA(triethylammoniumacetate pH7.0)水溶液あるいは100mM AcONa水溶液(pH5.4)
B液:アセトニトリル
B濃度グラジエント:20-80%
(条件2-1)
Column:YMC-Pack C4(YMC社製)100x20mml.D、S-5 μm、12 nm
流速:10mL/min
カラム温度:室温
検出UV:260nm
(条件2-2)
Column:YMC-Pack C4(YMC社製)150x10mml.D、S-5 μm、12 nm
流速:4mL/min
カラム温度:室温
検出UV:260nm
得られたオリゴヌクレオチドはVivaSpin20(MWCO 3000)(Sartorius社製)、アミコンウルトラ(Amicon Ultra)-4 遠心式フィルターユニット-3Kを用いて、限外濾過を繰り返すことでフラクションに含まれる塩成分を除去した。その後、凍結乾燥にて目的とするオリゴヌクレオチドを粉末として得た。なお、TEAA溶媒を用いて精製したオリゴヌクレオチドに対しては100mM酢酸ナトリウム水溶液(20mL)で塩フォームの変換を行った後に脱塩操作を行った。
得られたオリゴヌクレオチドは、UPLC/MS測定による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。
条件1(脂質を導入していないオリゴヌクレオチド)
Xevo G2 Tof System(Waters社製)
Column:Aquity OST C18(2.1x50mm)(Waters社製)
移動相 A液:200mM 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール/8mMトリエチルアミン
B液:メタノール
B濃度グラジエント:10-30%(10min)
温度:50℃
流速:0.2mL/min
条件2(脂質を導入したオリゴヌクレオチド)
Xevo G2 Tof System(Waters社製)
Column:ACQUITY UPLC Protain BEH C4 Column、300Å、1.7μm、2.1mm×100mm、1/pkg(Waters社製)
移動相 A液:200mM 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール/8mMトリエチルアミン
B液:メタノール
B濃度グラジエント:10-95%(10min)
温度:50℃
流速:0.2mL/min
また、Ab(Abasic)は、以下で示される基である。
Buは以下で示される基である。
(式中、n’は、5~29の整数である。)
L5-n’は、上記A)で合成した化合物5-n’から誘導される基であり、L65-n’は、化合物65-n’から誘導される基である。)
(式中、n’は、5~29の整数である。)
M13-n’は上記A)で合成した化合物13-n’から誘導される基である。
M13a-n’はオリゴヌクレオチド以外の基に結合する基である。例えば、上記A)で合成した化合物124から誘導される基であるM124にM13-n’が結合することを意味する。
(式中、r1は以下の置換基(an’’)~(g)のいずれかで示される基である。)
(式中、n’’は、2~29の整数である。)
M13b-r1は上記A)の化合物13-n’と同様の方法により合成され、化合物75-n’’(置換基(an’’))、化合物77(置換基(b))、化合物78(置換基(c))、化合物80(置換基(d))、化合物83(置換基(e))、化合物82(置換基(f))又は化合物86(置換基(g))から誘導される基である。
(式中、n’は、5~29の整数、s’、t’又はu’は、それぞれ独立して3~20の整数である。)
なお、M27-n’は上記A)で合成した化合物27-n’から誘導される基であり、M33-s’-t’-u’は化合物33-s’-t’-u’から誘導される基である。
(式中、m’及びn’は、それぞれ独立して5~29の整数である。)
なお、M42は上記A)で合成した化合物42から誘導される基であり、M48-n’は化合物48-n’から誘導される基であり、M55-m’-n’は化合物55-m’-n’から誘導される基である。
(式中、n’は、5~29の整数である。)
なお、M120は上記A)で合成した化合物120から誘導される基であり、M120-n‘はNA-104と化合物75-n’’から上記C)4)に従い誘導される基である。
(式中、r2は、r1の置換基(an’’)~(e)、(g)及び以下の(h)、(i)のいずれかで示される基である。)
M112b-r2は上記A)の化合物112と同様の方法により合成され、化合物75-n’’(置換基(an’’))、化合物77(置換基(b))、化合物78(置換基(c))、化合物80(置換基(d))、化合物83(置換基(e))、化合物86(置換基(g))、化合物76(置換基(h))又は化合物81(置換基(i))から誘導される基である。
(式中、kは0~4の整数であり、n’は、1~4の整数である。)
なお、M69-n’は上記A)で合成した化合物69-n’から誘導される基であり、M74-kは化合物74-k-14から誘導される基であり、MNA-95は上記A)で合成した化合物95-2-14から誘導される基である。
(式中、r3は、以下の置換基(j)~(l)のいずれかで示される基である。)
なお、M90a及びM90b-r3は、上記A)で合成した化合物90-k-n’及び化合物121(置換基(j))、化合物122(置換基(k))又は上記C)6)に従い化合物123(置換基(l))から誘導される基である。
(式中、kは0~4の整数であり、r4は、以下の置換基(m)~(o)のいずれかで示される基である。)
なお、M95-r4は、上記A)で合成した化合物95-k-14及び化合物88(置換基(m))、化合物3-14(置換基(n))又はヘキシルイソシアネイト(置換基(o))から誘導される基である。
なお、 LNA-22に用いる置換基については、特許文献8の記載を参考に合成した。
MNA-24に用いる置換基については、リンクテクノロジーから購入した。核酸合成樹脂(3’-アミノCPG)を用いて、上記B)と同様の方法でオリゴヌクレオチドを合成することで、3’末端にアミノリンカーを有する核酸誘導体を合成した。
各オリゴヌクレオチドの100μM水溶液を等モル量混合した後、その後75℃下で5分間加温後、室温まで自然冷却させることで二本鎖核酸を得た。二本鎖形成の確認は、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。
Column:YMC-PAC Diol-120(4.6x300mm)(YMC社製)
移動相:40%アセトニトリル含有1xPBS溶液
流速0.5mL/min
温度:室温
実験1
ヒト子宮頸ガン由来細胞株HeLaは、DMEM Low Glucose(Sigma)+10%ウシ胎児血清(FBS)+Penicillin(100units/mL)+Streptomycin(100ug/mL)で培養した。細胞は、37℃、95~98%湿度及び5%CO2で維持した。自然取り込みによる導入実験では、すべての細胞において、遺伝子導入試薬を用いずにsiRNAを細胞へ導入した。HeLa細胞の培養上清に最終濃度1μMになるよう、核酸医薬としてsiRNAを含む本発明の複合体又は比較例として脂質が結合していないsiRNA(siRNA-1)を添加し、72時間後にCellAmp RNA Prep Kit(Takara)にて細胞を回収し、One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit(Takara)により定量的PCRを行った。内在性コントロールとしてGAPDHを使用した。
ヒトHPRT1の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:CTACCCTCTGGTAGATTGTCG(配列番号:5);
Rvプライマー:TCGAGAGCTTCAGACTCGTCTA(配列番号:6)
を用いた。ヒトGAPDHの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC(配列番号:7);
Rvプライマー:TGGTGAAGACGCCAGTGGA(配列番号:8)
を用いた。
結果を表16に示す。表には、Gapdhで正規化したHprt1のmRNA量について、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。
マウス肝臓ガン由来細胞株Hepa1c1c7は、MEM Alpha(Thermo Fisher Scientific)+10%ウシ胎児血清(FBS)+Penicillin(100units/mL)+Streptomycin(100ug/mL)で培養した。細胞は、37℃、95~98%湿度及び5%CO2で維持した。自然取り込みによる導入実験では、すべての細胞において、遺伝子導入試薬を用いずにsiRNAを細胞へ導入した。Hepa1c1c7細胞の培養上清に最終濃度2μMになるよう、核酸医薬としてsiRNAを含む本発明の複合体を添加し、72時間後にCellAmp RNA Prep Kit(Takara)にて細胞を回収し、One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit(Takara)により定量的PCRを行った。内在性コントロールとしてGapdhを使用し、マウスHprt1の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:TTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTA(配列番号:9);
Rvプライマー:AGGCAGATGGCCACAGGACTA(配列番号:10)
を用い、
マウスGapdhの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Fwプライマー:TGTGTCCGTCGTGGATCTGA(配列番号:11);
Rvプライマー:TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG(配列番号:12)
を用いた。
結果を表17に示す。表には、Gapdhで正規化したHprt1のmRNA量について、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。
実験1と同様に、本発明の複合体(siRNA-2、6又は7)又は比較例として脂質が結合していないsiRNA(siRNA-1)をHeLa細胞の培養上清に最終濃度0.5μMになるよう添加し、72時間後に細胞を回収し定量的PCRを行った。内在性コントロールとしてGAPDHを使用した。HPRT1及びGAPDHの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、実験1と同一のものと使用した。結果を表18に示す。
(動物)
C57BL/6JJclマウス(オス8週齢及びメス8週齢)を日本クレアから導入した。担癌モデルマウスは次の通り作製した。ヒト上皮様細胞ガン由来細胞株A431を、DMEM Low Glucose(Sigma)+10%ウシ胎児血清(FBS)+Penicillin(100units/mL)+Streptomycin(100ug/mL)で培養した。ヌードマウスBalbc-nu/nu(オス5週齢)の背部に約10万個の細胞を移植した。約10日後に腫瘍の直径が1cm程度に到達したため、実験に供した。
各種マウスへ、生理食塩水(大塚生食注、大塚製薬工場)に溶解した本発明の複合体溶液(siRNA-8~17)、比較例として脂質が結合していないsiRNA(siRNA-18)又はリンカーのみが第2鎖に結合しているsiRNA(siRNA-21)約0.2mLを、マウス個体あたり投与量が50mg/kg若しくは25mg/kgとなるように静脈投与した。オスのマウスへ投与3日後にイソフルラン麻酔下で全血約0.5mL及び肝臓、腎臓、肺、脾臓、脂肪、筋肉、小腸、大腸、精巣、骨、骨髄、胸腺、気道、皮膚、後根神経節、脊髄、及び脳組織を採取した。メスのマウスへ投与3日後にイソフルラン麻酔下で子宮及び卵巣を摘出した。担癌モデルマウスへ投与3日後に腫瘍組織を摘出した。RNA抽出は、摘出組織からはRNeasy 96 Universal Tissue Kit (Qiagen)を用いて、また全血に含まれる血球からはQIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen)を用いてメーカー推奨プロトコル通りに行った。得られたRNAのうち20ng(後根神経節及び血球)又は100ng(その他組織)を用いて、One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit(Takara)による定量的PCRを行った。内在性コントロールとしてGapdhを使用し、マウスHprt1又はマウスGapdhの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、実験2と同じである。
結果を表19~21(投与量:50mg/kg)及び表22及び23(投与量:25mg/kg)に示す。各表には、Gapdhで正規化したHprt1のmRNA量について、生理食塩水投与群に対する割合をノックダウン効率として示した。
例えば、上記結果の「骨格筋で高効率なノックダウンが可能なこと」から、本発明の複合体は筋肉で病変を示す疾患、具体的には筋ジストロフィーや筋強直性ジストロフィー、ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症、加齢性筋萎縮症、ガン性筋委縮症、脊髄性筋委縮症、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性筋炎等の疾患に対する活性を示す核酸医薬を包含させることにより、該核酸医薬を骨格筋に送達させ、効果を発揮させることができると考えられ、非常に有用である。
本発明の複合体(siRNA-11)、比較例として脂質が結合していないsiRNA(siRNA-18)又は特許文献8記載の化合物(siRNA-19及び20)20nmolを0.27ユニットのホスホリパーゼA2(和光純薬工業)と10μlの反応バッファー中で反応させた。反応バッファーは10mM Tris-HCl、10mM CaCl2、150mM NaCl2(pH8.5)を用いた。反応開始5分後、15分後、60分後にサンプリングし、溶液中の遊離脂肪酸濃度(uM)を、NEFA測定キット ワコー(和光純薬工業)を用いて測定した。
結果を表24に示す。
Claims (7)
- 第1の鎖が、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第2の鎖が、該第1の鎖にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、前記標的遺伝子の発現抑制活性を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
第2の鎖に
式:
(式中、
A11は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式:
で示される基であり、
A1~A10及びA16~A19は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
A1及びA2又はA16及びA17は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、A1を構成するいずれかの炭素原子とA2を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、A16を構成するいずれかの炭素原子とA17を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Y1~Y7は、それぞれ独立して単結合又はOであり、
X1、X3及びX6は、それぞれ独立してNR1C(=O)、C(=O)NR1、R2C(=O)NR1又はNR1C(=O)R2であり、
X2、X4、X5及びX7は、それぞれ独立して単結合、NR3C(=O)、C(=O)NR3、R4C(=O)NR3、NR3C(=O)R4又はS-Sであり、
R2及びR4は、それぞれ独立してO又はNR5であり、
R1、R3及びR5は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
A12及びA14は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、トコフェロール、葉酸又はcRGDを含む基であり、
A13、A15、A20及びA21は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
m、n、p、q、r、s及びtは、それぞれ独立して1又は2である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。)
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体。 - 該脂質が、
A1~A5及びY1~Y5が、単結合であり、
A6~A10が、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
X1~X5が、NHC(=O)であり、
m、n、p、q及びrが、1である、請求項1記載の複合体。 - A11及びA13が、炭素数が6~30のアルキルである請求項1又は2記載の複合体。
- 該脂質が、オリゴヌクレオチドの3’末端及び/又は5’末端に結合している、請求項1~3いずれかに記載の複合体。
- 該リンカーが、
式:
(式中、
L0はオリゴヌクレオチドに結合し、L6は脂質に結合する。
L0は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
L1は、式:
(式中、
Zは、それぞれ独立してO又はSであり、
R6は、それぞれ独立してヒドロキシ、アルキル又はアルキルオキシである)で示される基であり、
L2及びL4は、それぞれ独立して単結合又は置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレンであり、
L3は、それぞれ独立して単結合、C(=O)NR7(R7は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである)、NR8C(=O)(R8は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はR8はL2のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい)又はS-Sであり、
L5は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換の炭素数が1~20のアルキレン、C(=O)NR9、NR9C(=O)、NR9、O又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
R9は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
uは、1又は2であり、
L6は、単結合又はアミノ酸リンカーである)
で示される基である、請求項1~4いずれかに記載の複合体。 - 式(C-1)~(C-7)のいずれかで示される複合体。
(式中、
OLは、第1の鎖が、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第2の鎖が、該第1の鎖にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、前記標的遺伝子の発現抑制活性を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
5’は、該第2の鎖の5’末端に結合することを意味し、
3’は、該第2の鎖の3’末端に結合することを意味し、
Z1-1は、O又はSであり、
L0-1は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
L5-1は、単結合、NH又はOであり、
L6-1は、単結合又はアミノ酸リンカーであり、
LIは、式(LI-1)~(LI-9)のいずれかで示される脂質である。
(式中、
A1-1は、単結合又はメチレンであり、
A2-1は、炭素数が1~4の直鎖状のアルキレンであり、
A11-1は、炭素数が7~23の直鎖又は分枝状のアルキルであり、
A12-1は、炭素数が3~23の直鎖若しくは分枝状のアルキル若しくはアルケニル、トコフェロール、葉酸又はcRGDを含む基又は式:
で示される基である。)、
(式中、A13-1、A14-1及びA15-1は、炭素数が9~13の直鎖状のアルキルである。)、
(式中、
A20-1及びA21-1は、炭素数が13の直鎖状アルキルであり、
A12-2は、炭素数が15の直鎖状アルキル、トコフェロール、葉酸又はcRGDを含む基である。)
(式中、
A11-2は、炭素数が15の直鎖状アルキルであり、
A12-3は、アミノで置換されている炭素数が1~4の直鎖状アルキルである。)
(式中、
A20-2及びA21-2は、炭素数が13の直鎖状アルキルであり、
A12-4は、アミノで置換されている炭素数が4の直鎖状アルキルである。)
(式中、A11-3及びA12-5は、炭素数が15の直鎖状アルキルである。)
(式中、
A11-4は、炭素数が14の直鎖状アルキルであり、
A12-6は、炭素数が6~12の直鎖状アルキルである。) - 請求項1~6いずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
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