TW201540724A

TW201540724A - 反義核酸

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Publication number: TW201540724A
Application number: TW104107708A
Authority: TW
Inventors: 若山達志; 瀬尾春奈; 佐藤洋平; 武田伸一; 永田哲也
Original assignee: 日本新藥股份有限公司; 獨立行政法人國立精神神經醫療研究中心
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2015-11-01
Also published as: AU2020200679A1; TR201901939T4; TW201945383A; BR112016020618B1; KR102335801B1; HRP20190235T1; US20220162604A1; EP3118311A4; US9988629B2; RU2016139108A; CN110951732A; PT3118311T; CN106459955A; ZA201605864B; EP3514234A1; JPWO2015137409A1; PH12016501761A1; MY193708A; RS58573B1; EP3118311A1

Abstract

提供高效率跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因第51號外顯子之藥劑。本發明係提供可跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因第51號外顯子之反義低聚物。

Description

反義核酸

本發明係有關可跳讀(skipping)人類肌肉萎縮蛋白基因第51號外顯子之反義低聚物及含有該低聚物之醫藥組成物。

裘馨氏型肌肉萎縮症(DMD,Duchenne muscular dystrophy)為出生男嬰約3,500人中有1人發症，係頻率最高之遺傳性進行性肌肉萎縮症。為於乳幼兒期顯示與正常人類幾乎相同之運動機能，從4至5歲看到肌力降低，之後肌力降低進行至12歲左右，變成不能步行，於20歲因心不全或呼吸器不全導至死亡之嚴重疾病。目前對於DMD無有效之治療法，而強力尋求開發新的治療藥。

已知DMD之原因為肌肉萎縮蛋白基因變異。肌肉萎縮蛋白基因存在於X染色體，為由220萬鹼基之DNA形成之巨大基因。從DNA轉錄為mRNA前體，更藉由剪接除去內含子(intron)，結合79外顯子之mRNA成為11,058鹼基。從該mRNA轉譯為3,685胺基酸，生成肌肉萎縮蛋白蛋白質。肌肉萎縮蛋白蛋白質參予維持肌肉細胞膜之安定性，在使肌肉細胞不易崩壞為必要。由於DMD 病患之肌肉萎縮蛋白基因有變異，在肌肉細胞中具有機能之肌肉萎縮蛋白蛋白質幾乎無表現。因此，DMD病患體內變成不能維持肌肉細胞構造，多量鈣離子流入肌肉細胞內。其結果由於產生類似炎症之反應，纖維化進展，導至肌肉細胞再生困難。

貝克氏型肌肉萎縮(BMD(Becker muscular dystrophy)之原因亦為肌肉萎縮蛋白基因變異，其症狀雖因肌肉萎縮，呈現肌肉力降低，惟，通常比DMD輕，肌肉力降低之進行亦慢，大多情況於成人期發症。DMD與BMD之臨床症狀不同，取決於藉由變異，肌肉萎縮蛋白之mRNA在轉譯為肌肉萎縮蛋白蛋白質時胺基酸讀碼框被破壞或是被維持(非專利文獻1)。亦即，於DMD，藉由胺基酸讀碼框被破壞之變異，具有機能之肌肉萎縮蛋白蛋白質幾乎無表現，於BMD，藉由變異，雖然外顯子一部分缺失，惟，為了維持胺基酸讀碼框，即使為不完全，亦產生具有機能之肌肉萎縮蛋白蛋白質。

作為DMD之治療法，期待外顯子跳讀法。該方法為改變剪接，修復肌肉萎縮蛋白之mRNA之胺基酸讀碼框，誘導回復部分機能之肌肉萎縮蛋白蛋白質之表現之方法(非專利文獻2)。成為外顯子跳讀對象之胺基酸序列部分變成缺失。因此，於該治療表現之肌肉萎縮蛋白蛋白質雖然比正常者短，惟，為了維持胺基酸讀碼框，保持部分使肌肉細胞安定化之機能。因此，期待藉由外顯子跳讀，DMD可呈現與較輕症之BMD相同之症狀。外顯子跳讀法為經由小鼠或狗的動物實驗，對於人類DMD病患進行臨床試驗。

外顯子跳讀可藉由將5’或3’剪接部位中之任一者或雙方或外顯子內部作為標的之反義核酸之結合而誘導。外顯子係僅雙方之剪接部位藉由剪接體複合物辨識時包含於mRNA中。因此，將剪接部位以反義核酸作為目標，可誘導外顯子跳讀。又，外顯子為了於剪接機構被辨識，認為必需與外顯子剪接增強子(ESE)之SR蛋白質結合，將ESE作為目標，亦可誘導外顯子跳讀。

由於肌肉萎縮蛋白基因之變異因DMD病患而異，對應基因變異的場所或種類之反義核酸成為必要。至此，西澳大學Steve Wilton人等對於所有79個外顯子製作誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻3)、荷蘭之Annemieke Aartsma-Rus人等對於39種外顯子製作誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻4)。

認為所有DMD病患之約13%可藉由將第51號外顯子(以下，亦稱為「外顯子51」)跳讀而治療。近年來有從多家研究機關對於將肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51作為外顯子跳讀目標之研究報告(專利文獻1至6及非專利文獻5至6)。惟，以高效率跳讀外顯子51之技術至今尚未確立。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開公報第2004/048570號

[專利文獻2]國際公開公報第2002/024906號

[專利文獻3]國際公開公報第2010/048586號

[專利文獻4]國際公開公報第2010/050801號

[專利文獻5]美國專利公開公報第2010/0168212號

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: p. 90-95

[非專利文獻2] Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p. 167-172

[非專利文獻3] Wilton S. D., et al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

[非專利文獻4] Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77

[非專利文獻5] Aoki Y., et al., Molecular therapy 2010: 18: p. 1995-2005

[非專利文獻6] Nakano S., et al., Pediatr Int. 2011: 53: 524-529

於如上述之狀況，期待以高效率誘導肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51跳讀之反義低聚物及含有該低聚物之肌肉萎縮治療藥。

本發明者人等將上述文獻中記載之技術內容及肌肉萎縮蛋白基因之構造等進行詳細研究之結果，發現投予具有序列編號1及2表示之鹼基序列之反義低聚物，可高效率的誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之跳讀。本發明者人等以該見解為基礎因而完成本發明。

亦即，本發明為如下所述。

[1]選自由以下(a)至(d)所成群組中任何一項所述之反義低聚物。

(a)含有序列編號1或2之鹼基序列之反義低聚物；(b)包含序列編號1或2之鹼基序列中，1至5個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(c)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有80%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(d)與由與序列編號1或2之鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物

[2]選自由以下(e)至(h)所成群組中任何一項所述之反義低聚物。

(e)包含序列編號1或2之鹼基序列之反義低聚物；(f)包含序列編號1或2之鹼基序列中，1至3個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(g)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有80%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(h)與由與序列編號1或2之鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在高嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物

[3]選自以下(i)及(j)之反義低聚物。

(i)由序列編號1或2之鹼基序列而成之反義低聚物；(j)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有90%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；

[4]如上述[1]至[3]中任何一項所述之反義低聚物，其中，該反義低聚物為低聚核苷酸。

[5]如上述[4]所述之反義低聚物，其中，構成上述低聚核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分及/或磷酸結合部分為經修飾。

[6]如上述[4]或[5]所述之反義低聚物，其中，構成上述低聚核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為2’位之-OH基以選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所成群組之任何一種基取代之核糖。 (上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基。)

[7]如上述[4]至[6]中任何一項所述之反義低聚物，其中，構成上述低聚核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸結合部分為選自由硫代磷酸酯結合、二硫代磷酸酯結合、烷基磷酸酯結合、胺基磷酸酯結合及硼烷磷酸酯結合所成群組之任何一種。

[8]如上述[1]至[3]中任何一項所述之反義低聚物，其中，該反義低聚物為嗎啉代低聚物。

[9]如上述[8]所述之反義低聚物，其中，構成上述嗎啉代低聚物之至少1個嗎啉代之嗎啉代環部分、磷酸結合部分、3‘末端及/或5’末端為經修飾。

[10]如上述[9]或[10]所述之反義低聚物，其中，構成上述嗎啉代低聚物之至少1個嗎啉代之磷酸結合部分為選自磷醯二胺結合、硫代磷酸酯結合、二硫代磷酸酯結合、烷基磷酸酯結合、胺基磷酸酯結合及硼烷磷酸酯結合所成群組之任何一種。

[11]如上述[10]所述之反義低聚物，其中，該反義低聚物為磷醯二胺嗎啉代低聚物。

[12]如上述[9]至[11]中任何一項所述之反義低聚物，其中，5’末端為下述化學式(1)至(3)之任何一種基。

[13]一種肌肉萎縮治療用醫藥組成物，為含有上述[1]至[12]中任何一項所述之反義低聚物、其醫藥學上可容許之鹽或水合物。

[14]如上述[13]所述之醫藥組成物，係更含有醫藥學上可容許之擔體。

[15]一種肌肉萎縮之治療方法，為包含對肌肉萎縮病患投予上述[1]至[12]中任何一項所述之反義低聚物或上述[13] 或[14]所述之醫藥組成物之步驟。

[16]如上述[15]所述之治療方法，其中，上述肌肉萎縮病患為在肌肉萎縮蛋白基因之外顯子29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50或47-50有核苷酸缺失之病患。

[17]如上述[15]或上述[16]所述之治療方法，其中，上述病患為人類。

[18]一種上述[1]至[12]中任何一項所述之反義低聚物之用途，係用於製造肌肉萎縮治療用醫藥組成物。

[19]一種上述[1]至[12]中任何一項所述之反義低聚物，係使用於肌肉萎縮之治療。

[20]如上述[19]所述之反義低聚物，其中，於上述治療中肌肉萎縮病患為在肌肉萎縮蛋白基因之外顯子29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50或47-50有核苷酸缺失之病患。

[21]如上述[19]或[20]所述之反義低聚物，其中，上述病患為人類。

藉由本發明之反義低聚物可高效率的誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51跳讀。又，藉由投予本發明之醫藥組成物可有效的減輕裘馨氏型肌肉萎縮之症狀。

第1圖為表示在人類横紋肌肉腫(RD細胞)中人類肌肉萎縮蛋白基因外顯子51之跳讀效率之圖。

以下，將本發明加以詳細說明。以下之實施形態為用於說明本發明之例示，本發明不只限於該實施形態。本發明只要不脫離該要旨，可以種種形態實施。

1.反義低聚物

本發明為提供高效率跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之第51號外顯子之反義低聚物(以下，稱為「本發明之反義低聚物」)。

[人類肌肉萎縮蛋白基因之第51號外顯子]

於本發明中，「基因」除了基因體基因之外亦包含cDNA、mRNA前驅體及mRNA。基因較好為mRNA前驅體，亦即為pre-mRNA。

於人類基因體中，人類肌肉萎縮蛋白基因存在於基因座Xp21.2。人類肌肉萎縮蛋白基因具有220萬鹼基對之大小，作為已知之人類基因，為最大之基因。惟，人類肌肉萎縮蛋白基因之編碼區不超過14kb，該編碼區係79個外顯子分散於肌肉萎縮蛋白基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16：536-538(1993))。為人類肌肉萎縮蛋白基因轉錄物之pre-mRNA經剪接，生成14kb之成熟mRNA。人類之野生型肌肉萎縮蛋白基因之鹼基序列為公知(GenBank Accession No.NM_004006)。

人類之野生型肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51鹼基序列表示於序列編號3。

[反義低聚物]

本發明之反義低聚物為藉由人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之跳讀，以將DMD型肌肉萎縮蛋白基因編碼之蛋白質改變成BMD型肌肉萎縮蛋白蛋白質為目的而製作者。因此，為反義低聚物外顯子跳讀對象之肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51不僅是野生型，亦包含變異型。

本發明之反義低聚物具體而言為選自由以下(a)至(d)所成群組之任何一者所述之反義低聚物。

(a)含有序列編號1或2之鹼基序列之反義低聚物；(b)包含序列編號1或2之鹼基序列中，1至5個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(c)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有80%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；及(d)與由與序列編號1或2之鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物。

(b)至(d)之反義低聚物具體而言為(a)之反義低聚物之變異體，係以對應病患肌肉萎縮蛋白基因之變異(例如多型)等為念者。

作為其他之態樣，本發明之反義低聚物具體而言為選自由以下(k)至(n)所成群組之任何一者所述之反義低聚物。

(k)含有序列編號6至33中任何一種鹼基序列之反義低聚物；(l)包含序列編號6至33中任何一種鹼基序列中，1至5個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(m)具有對於序列編號6至33中任何一種鹼基序列具有80%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；及(n)與由與序列編號6至33中任何一種鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物

(l)至(n)之反義低聚物具體而言為(k)之反義低聚物之變異體，係以對應病患肌肉萎縮蛋白基因之變異(例如多型)等為念者。

本發明之反義低聚物為選自由以下(o)至(r)所成群組之任何一種所述之反義低聚物。

(o)由序列編號6至33中任何一種鹼基序列而成之反義低聚物；(p)包含序列編號6至33中任何一種鹼基序列中，1至3個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(q)具有對於序列編號6至33中任何一種鹼基序列具有80%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(r)與由與序列編號6至33中任何一種鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在高嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51活性之反義低聚物

另，本發明之反義低聚物為選自以下(i)及(j)之反義低聚物。

(i)由序列編號6至33中任何一種鹼基序列而成之反義低聚物；及(j)具有對於序列編號6至33中任何一種鹼基序列，具有90%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；本說明書中，「在嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物」係指例如將與由與序列編號1之鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸之全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或南方雜交法等獲得之反義低聚物。雜交之方法可利用例如“Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001”及“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997”等中所述之方法。

本說明書中，「嚴苛之條件」可為低嚴苛條件、中嚴苛條件及高嚴苛條件中之任何一種。「低嚴苛條件」為例如5×SSC、5×丹哈德溶液(Denhardt's solution)、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。又，「中嚴苛條件」為例如5×SSC、5×丹哈德溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃或5×SSC、1%SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。「高嚴苛條件」為例如(1)5×SSC、5×丹哈德溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃、(2)0.2×SSC、0.1%SDS、60℃、(3)0.2×SSC、0.1%SDS、62℃、(4)0.2×SSC、0.1%SDS、65℃或(5)0.1×SSC、0.1%SDS、65℃之條件，惟，不只限於此。於該等條件中，溫度越上昇，越可期待可有效率的獲得具有高序列同一性之反義低聚物。惟，影響雜交嚴苛度之要素認為是溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等之複數要素，只要是業者，適當選擇該等要素，即可實現同樣的嚴苛度。

又，於雜交中使用市售之套組時，可使用例如鹼性磷酸酶直接標記和檢測系統(Alkphos Direct Labelling and Detection System)(GE Healthcare公司製造)。於該情況，可依照套組中附加之指南，將經標記之探針進行一晚之保溫後將薄膜於55℃之條件下以含有0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後檢測已雜交之反義低聚物。或以與序列編號3之鹼基序列為互補之鹼基序列之全部或一部分為基礎製作探針時，可使用市售之試藥(例如PCR Labeling Mix(羅氏-診斷公司(Roche-diagnostics)等)，將該探針進行洋地黃毒苷標記(digoxigenin labeled)(DIG)時，使用DIG核酸檢出套組(羅氏-診斷公司)檢出雜交。

作為上述之外可雜交之反義低聚物，可列舉在藉由FASTA、BLAST等相同性檢索軟體，使用預設之參數計算時，與序列編號1或2之鹼基序列有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上同一性之反義低聚物。

又，鹼基序列之同一性可使用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441,(1985))、卡林及阿酋(Karlin S & Altschul SF)之運演算法則(Algorithm)BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)決定。開發以BLAST運演算法則為基礎，稱為blastn、blastx、tblastn或tblastx之程式(Altschul SF,et al：J Mol Biol 215：403,1990)。於使用blastn解析鹼基序列時，參數例如設為score=100、wordlength=12。於使用BLAST及Gapped BLAST程式時，使用各程式之預設參數。

「可將人類肌肉萎縮蛋白基因之第51號外顯子跳讀」係指藉由在人類肌肉萎縮蛋白基因之轉錄物(例如pre-mRNA)相當於外顯子51之部位與本發明之反義低聚物結合，於該轉錄物接受剪接時，例如於外顯子52缺失之DMD病患時，在相當於外顯子50之3’末端之鹼基序列，連結相當於外顯子53之5’末端之鹼基序列，形成不會引起密碼子(codon)移碼之成熟mRNA。

此處，上述「結合」係指在將本發明之反義低聚物與人類肌肉萎縮蛋白基因之轉錄物混合時，在生理條件下兩者雜交，形成雙股。上述「生理條件下」係指調節成與生體內類似之pH值、鹽組成、溫度之條件。可列舉例如為25至40℃，較好為37℃、pH值5至8，較好pH值為7.4、氯化鈉濃度為150mM之條件。

人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51是否發生跳讀可藉由在肌肉萎縮蛋白表現細胞(例如人類横紋肌肉腫細胞)中導入本發明之反義低聚物，從上述肌肉萎縮蛋白表現細胞之總RNA將人類肌肉萎縮蛋白基因之mRNA外顯子51之周邊區域進行RT-PCR増幅，對於該PCR増幅產物進行nested PCR或序列分析確認之。

跳讀效率可由將人類肌肉萎縮蛋白基因之mRNA從被檢細胞回收，測定該mRNA中外顯子51跳讀之帶之聚核苷酸量「A」及外顯子51未跳讀之帶之聚核苷酸量「B」，以該等「A」及「B」之測定值為基礎，依以下之公式計算。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

本發明之反義低聚物較好以10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上之效率將外顯子51跳讀。

對於跳讀效率之計算，可參照國際公開公報第2012/029986號。

本發明之反義低聚物具有例如16至35鹼基之長度，可列舉低聚核苷酸、嗎啉代低聚物或肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)低聚物。較好為19至32鹼基、20至31鹼基、21鹼基或30鹼基之長度，較好為嗎啉代低聚物。

上述低聚核苷酸(以下，稱為「本發明之低聚核苷酸」)為將核苷酸作為構成單位之本發明之反義低聚物，相關之核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或修飾核苷酸中之任何一種。

修飾核苷酸為構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分及磷酸結合部分全部或一部經修飾者。

於本發明中，核酸鹼基可列舉例如腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或該等之修飾鹼基。相關之修飾鹼基可列舉例如偽尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如5-乙基尿嘧啶)、5-鹵尿嘧啶(5-溴尿嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5’-羧基甲胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲胺基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲胺基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、嘧唑、黃嘌呤等，惟，不只限於此。

糖部分之修飾可列舉例如核糖2’位之修飾及糖其他部分之修飾。核糖2’位之修飾可列舉例如將核糖2’位之-OH基以OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、I取代之修飾。此處，R表示烷基或芳基。R’表示伸烷基。

糖其他部分之修飾可列舉例如核糖或去氧核糖4’位之O以S取代者、糖之2’位與4’位交聯者、例如LNA(鎖核酸(Locked Nucleic Acid))或ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)等，惟，不只限於此。

磷酸結合部分之修飾可列舉例如以硫代磷酸酯結合、二硫代磷酸酯結合、烷基磷酸酯結合、胺基磷酸酯結合、硼烷磷酸酯結合(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)取代磷酸二酯結合之修飾(例如參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

於本發明中，烷基較好為直鏈狀或支鏈狀、碳原子數1至6之烷基。具體而言可列舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基。該烷基亦可經取代，相關之取代基可列舉例如鹵素原子、烷氧基、氰基、硝基，該等可為1至3個取代。

於本發明中，環烷基較好為碳原子數5至12之環烷基。具體而言，可列舉例如環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二烷基。

於本發明中，鹵素原子可列舉氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。

烷氧基為直鏈狀或支鏈狀、碳原子數1至6之烷氧基，可列舉例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊基氧基、異戊基氧基、正己基氧基、異己基氧基等。較好為碳原子數1至3之烷氧基。

於本發明中，芳基較好為碳原子數6至10之芳基。具體而言，可列舉例如苯基、α-萘基、β-萘基。較好為苯基。該芳基亦可經取代，相關之取代基可列舉例如烷基、鹵素原子、烷氧基、氰基、硝基，該等可為1至3個取代。

於本發明中，伸烷基較好為直鏈狀或支鏈狀、碳原子數1至6之伸烷基。具體而言，可列舉例如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。

於本發明中，醯基可列舉直鏈狀或支鏈狀之烷醯基或芳醯基。烷醯基可列舉例如甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。芳醯基可列舉例如苯甲醯基、甲苯甲醯基、萘醯基。相關之芳醯基可在可取代之位置經取代，亦可經烷基取代。

本發明之低聚核苷酸較好核糖2’位之-OH基以甲氧基取代、磷酸結合部分為硫代磷酸酯結合，將下述通式表示之基作為構成單位之本發明之反義低聚物。

(式中，Base表示核酸鹼基。)

本發明之低聚核苷酸使用各種自動合成裝置(例如AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))即可容易合成或可委託第三機關(例如Promega公司、Takara公司或日本Bio Services公司)等製作。

本發明之嗎啉代低聚物為將下述通式表示之基作為構成單位之本發明之反義低聚物。

(式中，Base與上述者同意義；W表示以下任何式表示之基。

(式中，X表示-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；R¹表示氫原子、烷基；R²及R³可相同或不同，表示氫原子、烷基、環烷基或芳基；Y₁表示0、S、CH₂或NR¹； Y₂表示0、S或NR¹；Z表示0或S。))

嗎啉代低聚物較好為將以下之式表示之基作為構成單位之低聚物(磷醯二胺嗎啉代低聚物(以下，稱為「PMO」))。

(式中，Base、R²、R³與上述者同意義。)

本發明嗎啉代低聚物包含構成相關低聚物之核酸鹼基、嗎啉代環部分、磷酸結合部分、3‘末端及/或5’末端之全部或一部經修飾者。

磷酸結合部分之修飾可列舉例如經磷醯二胺結合、硫代磷酸酯結合、二硫代磷酸酯結合、烷基磷酸酯結合、胺基磷酸酯結合、硼烷磷酸酯結合(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)取代之修飾者(例如參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

嗎啉代低聚物可依照例如國際公開公報第1991/009033號或國際公開公報第2009/064471號製造。尤其是，PMO可依照國際公開公報第2009/064471號中記載之方法製造或依照以下表示之方法製造。

[PMO之製法]

PMO之1種態樣可列舉例如以下述通式(I)表示之化合物(以下，稱為PMO(I)。)。

[式中，各Base、R²、R³與上述者同意義；n為在1至99範圍內之任意整數，較好為24至34、27至31或28至30範圍內之任意整數，較好為29]。

PMO(I)可依照公知之方法製造，例如可藉由實施下述步驟之操作製造。

於下述步驟中使用之化合物及試藥只要是在製造PMO中通常使用者即可，並無特別限制。

又，於下述之所有步驟可以液相法或固相法(使用手動或市售之固相自動合成機)實施。以固相法製造PMO時，從操作步驟簡便化及合成之正確性觀點而言，以使用自動合成機之方法較佳。

(1)步驟A：

使酸與下述通式(II)表示之化合物(以下，稱為化合物(II)。)作用，製造下述通式(III)表示之化合物(以下，稱為化合物(III))之步驟。

[式中、n、R²、R³與上述者同意義；各B^P各自獨立，表示可經保護之核酸鹼基；T表示三苯甲基、單甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；L表示氫原子、醯基或下述通式(IV)表示之基(以下，稱為基(IV))]。

B^P中之「核酸鹼基」可列舉與Base相同之「核酸鹼基」。惟，B^P中之核酸鹼基之胺基或羥基可經保護。

相關之胺基保護基只要可作為核酸之保護基使用者即可，並無特別限制，具體而言可列舉例如苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯基乙醯基、苯氧基乙醯基、4-第三丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、(二甲胺基)亞甲基。羥基之保護基可列舉例如2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯磺醯基乙基、甲磺醯基乙基、三甲矽基乙基、在可取代之任意位置可經1至5個電子吸引基取代之苯基、二苯基胺基甲醯基、二甲基胺基甲醯基、二乙基胺基甲醯基、甲基苯基胺基甲醯基、1-吡咯啶基胺基甲醯基、嗎啉代胺基甲醯基、4-(第三丁基羧基)苯甲基、4-[(二甲胺基)羧基]苯甲基、4-(苯基羧基)苯甲基(例如，參照國際公開公報第2009/064471號公報)。

「固相擔體」只要是核酸之固相反應中可使用之擔體即可，並無特別限制，較好為例如(i)幾乎不溶解於嗎啉代核酸衍生物合成中可使用之試藥(例如二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基嘧唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶、三氟乙酸)者、(ii)對於嗎啉代核酸衍生物合成中可使用之試藥在化學上為安定者、(iii)可經化學修飾者、(iv)可填裝所期待之嗎啉代核酸衍生物者、(v)對於處理中相關之高壓具有充分忍受強度者、(vi)以一定粒徑範圍分布者。具體而言，可列舉膨潤性聚苯乙烯(例如胺基甲基聚苯乙烯樹脂1%二乙烯基苯交聯(200至400網眼)(2.4至3.0mmol/g)(東京化成公司製造)、胺基甲基化聚苯乙烯樹脂鹽酸鹽(Aminomethylated Polystyrene Resin．HCl)[二乙烯基苯1%，100至200網眼](肽研究所公司製造))、非膨潤性聚苯乙烯(例如Primer Support(GE Healthcare公司製造))、PEG鏈結合型聚苯乙烯(例如NH₂-PEG resin(渡辺化學公司製造)、TentaGel resin)、定孔玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如CPG公司製造)、草醯化-定孔玻璃(參照例如Alul人等，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel擔體-胺基聚乙二醇衍生物化擔體(參照例如Wright人等，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物。

「連結基」可使用通常用於將核酸或嗎啉代核酸衍生物連結之公知之基，可列舉例如3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。

本步驟可藉由使酸與化合物(II)作用而實施。

本步驟中可使用之「酸」可列舉例如三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。酸的使用量例如對於化合物(II)1莫耳，以在0.1莫耳當量至1000莫耳當量範圍內較適當，較好在1莫耳當量至100莫耳當量範圍內。

又，可將有機胺與上述酸一同使用。有機胺並無特別限制，可列舉例如三乙胺。有機胺之使用量例如對於酸1莫耳，以在0.01莫耳當量至10莫耳當量範圍內較適當，較好在0.1莫耳當量至2莫耳當量範圍內。

於本步驟中，使用酸與有機胺之鹽或混合物時，可列舉例如三氟乙酸與三乙胺之鹽或混合物，更具體而言，可列舉對於三氟乙酸2當量，將三乙胺1當量混合者。

本步驟中可使用之酸亦可以適當溶劑稀釋到0.1%至 30%範圍內之濃度使用。溶劑只要不參予反應者即可，並無特別限制，可列舉例如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或該等之混合物。

上述反應中之反應溫度例如較好在10℃至50℃範圍內，更好在20℃至40℃範圍內，最好在25℃至35℃範圍內。

反應時間依使用之酸之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時範圍內較適當。更好在1分鐘至5小時範圍內。

本步驟完成後，必要時為了將系中存在之酸中和，可添加鹼。「鹼」並無特別限制，可列舉例如二異丙胺。鹼可以適當之溶劑稀釋到0.1%(v/v)至30%(v/v)範圍內之濃度使用。

本步驟中使用之溶劑只要不參予反應者即可，並無特別限制，可列舉二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或該等之混合物。反應溫度例如較好在10℃至50℃範圍內，更好在20℃至40℃範圍內，最好在25℃至35℃範圍內。

反應時間依使用之鹼之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時範圍內較適當，較好在1分鐘至5小時範圍內。

又，於化合物(II)中，n=1，L為基(IV)之下述通式(IIa)表示之化合物(以下，稱為化合物(IIa))可依照以下之方法製造。

[式中，B^P、T、連結基、固相擔體與上述者同意義]。

步驟1：

經由使醯化劑與下述通式(V)表示之化合物作用，製造下述通式(VI)表之化合物(以下，稱為化合物(VI))之步驟。

[式中、B^P、T、連結基與上述者同意義；R⁴表示羥基、鹵素原子、羧基或胺基]。

本步驟可將化合物(V)作為出發原料，藉由公知之連結基導入反應而實施。

尤其是下述通式(VIa)表示之化合物可藉由實施使用化合物(V)及琥珀酸酐進行酯化反應之已知方法製造。

[式中，B^P、T與上述者同意義]。

步驟2：

使縮合劑等與化合物(VI)作用，並與固相擔體進行反應，製造化合物(IIa)之步驟。

[式中，B^P、R⁴、T、連結基、固相擔體與上述者同意義]。

本步驟可藉由使用化合物(VI)及固相擔體，進行縮合反應之已知方法製造。

於化合物(II)中，n=2至99(較好在25至35、28至32或29至31範圍內之任意整數，較好為30)、L為基(IV)之下述通式(IIa2)表示之化合物可藉由將化合物(IIa)作為出發原料，將本說明書中記載之PMO製法相關之步驟A及步驟B反覆操作所期待之次數而製造。

[式中，B^P、R²、R³、T、連結基、固相擔體與上述者同意義；n’表示1至98(於特定態樣，n’為1至34、1至33、1至32、1至31、1至30、1至29、1至28、1至27、1至26、1至25、1至24)]。

(2)步驟B：

使嗎啉代單體化合物與化合物(III)，在鹼存在下進行作用，製造下述通式(VII)表示之化合物(以下，稱為化合物(VII))之步驟。

[式中，各B^P、L、n、R²、R³、T與上述者同意義]。

本步驟可藉由使嗎啉代單體化合物與化合物(III)，在鹼存在下進行作用而實施。

嗎啉代單體化合物可列舉例如下述通式(VIII)表示之化合物。

[式中，B^P、R²、R³、T與上述者同意義]。

本步驟中可使用之「鹼」可列舉例如二異丙胺、三乙胺或N-乙基嗎啉。鹼之使用量例如對於化合物(III)1莫耳，以在1莫耳當量至1000莫耳當量範圍內較適當，較好在10莫耳當量至100莫耳當量範圍內。

本步驟中可使用之嗎啉代單體化合物及鹼可以適當之溶劑稀釋至0.1%至30%濃度使用。溶劑只要不參予反應者即可，並無特別限制，可列舉例如N,N-二甲基咪唑酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或該等之混合物。

反應溫度例如較好在0℃至100℃範圍內，更好在10℃至50℃範圍內。

反應時間依使用之鹼之種類、反應溫度而異，通常以在1分鐘至48小時範圍內較適當，較好在30分鐘至24小時範圍內。

另，本步驟完成後必要時可添加醯化劑。「醯化劑」可列舉例如乙酸酐、乙醯氯、苯氧基乙酸酐。醯化劑可以適當之溶劑稀釋至例如0.1%至30%範圍內之濃度使用。溶劑只要不參予反應者即可，並無特別限制，可列舉例如二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或該等之混合物。

又，必要時可將醯化劑與例如吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、三乙胺、二異丙基乙胺、N-乙基嗎啉等鹼一起使用。醯化劑之使用量較好在0.1莫耳當量至10000莫耳當量範圍內，更好在1莫耳當量至1000莫耳當量範圍內。鹼之使用量例如對於醯化劑1莫耳，以在0.1莫耳當量至100莫耳當量範圍內較適當，較好在1莫耳當量至10莫耳當量範圍內。

本反應之反應溫度較好在10℃至50℃範圍內，更好在10℃至50℃範圍內，最好在20℃至40℃範圍內，最好在25℃至35℃範圍內。反應時間例如依使用之醯化劑之種類、反應溫度而異，通常在0.1分鐘至24小時範圍內較適當，較好在1分鐘至5小時範圍內。

(3)步驟C：

對步驟B製造之化合物(VII)使用脫保護劑將保護基脫離，製造通式(IX)表示之化合物之步驟。

[式中，Base、B^P、L、n、R²、R³、T與上述者同意義]。

本步驟可藉由使脫保護劑與化合物(VII)作用而實施。

「脫保護劑」可列舉例如濃氨水、甲胺。本步驟中可使用之「脫保護劑」可以例如水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑酮、N-甲基哌啶酮或該等之混合溶劑稀釋使用。其中，較好為乙醇。脫保護劑之使用量例如對於化合物(VII)1莫耳，以在例如1莫耳當量至100000莫耳當量範圍內較適當，較好在10莫耳當量至1000莫耳當量範圍內。

反應溫度例如在15℃至75℃範圍內較適當，較好在40℃至70℃範圍內，更好在50℃至60℃範圍內。脫保護反應時間依化合物(VII)之種類、反應溫度等而異，以在10分鐘至30小時範圍內較適當，較好在30分鐘至24小時範圍內，更好在5小時至20小時範圍內。

(4)步驟D：

藉由使酸與步驟C中製造之化合物(IX)作用，製造PMO(I)之步驟。

[式中，Base、n、R²、R³、T與上述者同意義]。

本步驟可藉由在化合物(IX)中加入酸而實施。

本步驟中可使用之「酸」可列舉例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。酸之使用量以例如使溶液之pH值在0.1至4.0範圍內使用較適當，更好使在1.0至3.0範圍內使用。溶劑只要不參予反應者即可，並無特別限制，可列舉例如乙腈、水或該等之混合溶劑。

反應溫度較好在10℃至50℃範圍內，更好在20℃至40℃範圍內，更好在25℃至35℃範圍內。脫保護反應時間係依化合物(IX)之種類、反應溫度等而異，以在0.1分鐘至5小時範圍內較適當，較好在1分鐘至1小時範圍內，更好在1分鐘至30分鐘範圍內。

PMO(I)係可將本步驟獲得之反應混合物藉由通常之分離精製手段，例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、再結晶、C₈至C₁₈之逆相管柱層析、陽離子交換管柱層析、陰離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、高速液體層析、透析、超濾等方法單獨或組合使用而獲得，可將所期待之PMO(I)分離精製(參照例如國際公開公報 WO1991/09033)。

使用逆相層析將PMO(I)精製時，溶出溶劑可使用例如20mM三乙胺/乙酸緩衝液與乙腈之混合溶液。

又，使用離子交換層析將PMO(I)精製時，可使用例如1M食鹽水與10mM氫氧化鈉水溶液之混合溶液。

肽核酸為將下述通式表示之基作為構成單位之本發明之反義低聚物。

(式中，Base與上述者同意義)。

肽核酸可依例如以下之文獻製造。

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

又，本發明之反義低聚物，5’末端亦可為下述化學式(1)至(3)中之任何一種基。較好為(3)-OH。

以下，將上述(1)、(2)及(3)表示之基分別稱為「基(1)」、「基(2)」及「基(3)」。

2.醫藥組成物

本發明之反義低聚物與以往技術相關之反義低聚物比較，可以高效率將外顯子51跳讀。因此，對DMD病患(具有於外顯子51跳讀訊框化(in-frame)變異之病患，例如，外顯子29-50缺失病患、外顯子50缺失病患、外顯子45-50缺失病患、外顯子48-50缺失病患、外顯子49-50缺失病患、外顯子52缺失病患、外顯子52-63缺失病患、13-50缺失病患、19-50缺失病患、43-50缺失病患或47-50缺失病患)投予含有本發明反義低聚物之醫藥組成物，預測可高效率的緩和肌肉萎縮之症狀。例如，使用含有本發明反義低聚物之醫藥組成物時，與以往技術相關之低聚物相比，即使以少量之投予量，亦可獲得同程度之治療效果，可減輕副作用且較經濟。

此處，作為其他實施態樣，提供將本發明之反義低聚物、其醫藥學上容許之鹽或水合物作為有效成分之肌肉萎縮治療用醫藥組成物(以下，稱為「本發明之組成物」)。

又，本發明提供包含對DMD病患投予本發明反義低聚物之步驟之肌肉萎縮治療方法。

於該治療方法，本發明之反義低聚物亦可作為上述肌肉萎縮治療用醫藥組成物投予。

另，本發明提供本發明之反義低聚物用於製造肌肉萎縮治療用醫藥組成物之用途及使用於治療肌肉萎縮用之本發明之反義低聚物。

本發明之組成物中含有之本發明之反義低聚物醫藥學上容許之鹽之例可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽，如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；如第三-辛胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙基胺鹽、六氫吡嗪鹽、四甲基銨鹽、三(羥甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等低級烷基磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽等。該等鹽可以公知之方法製造。本發明組成物中含有之本發明之反義低聚物亦可為其水合物之形態。

本發明組成物之投予形態只要是醫藥學上容許之投予形態即可，並無特別限制，可對應治療方法加以選擇，從對肌肉組織送達容易性之觀點而言，較好為靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮下投予、經口投予、組織內投予、經皮投予等。又，本發明組成物採取之劑型並無特別限制，可列舉例如各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、乳液劑等。

於肌肉萎縮病患投予本發明之反義低聚物時，本發明之組成物可含有促進將該低聚物送達肌肉組織之擔體。該等擔體只要是醫藥學上容許者即可，並無特別限制，其例可列舉陽離子性脂質體、陽離子性聚合物等陽離子性擔體，或利用病毒鞘膜之擔體。陽離子性脂質體可列舉例如2-O-(2-二乙胺基乙基)胺基甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油與磷脂質作為必須構成成分而形成之脂質體(以下，稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamin(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、 Lipofectarnine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製造)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製造)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製造)、Nucleofector II(Lonza)。該等中較好為脂質體A。陽離子性聚合物可列舉例如JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製造)、Jet-PEI(註冊商標)(聚乙烯亞胺、Qbiogene公司製造)。利用病毒鞘膜之擔體可列舉例如GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體、石原產業公司製造)。或可使用專利2924179號中記載之醫藥器材、專利再公表公報第2006/129594號及專利再公表公報第2008/096690號中記載之陽離子性擔體。

詳言之，可參照美國專利第4,235,871號、美國專利第4,737,323號、國際公開公報第96/14057號、“New RRC,Liposomes：A practical approach,IRL Press,Oxford(1990)pages 33-104”等。

本發明組成物中含有之本發明之反義低聚物之濃度係依擔體之種類等而異，以在0.1nM至100μM範圍內較適當，較好在100nM至10μM範圍內。又，本發明組成物中含有之本發明之反義低聚物與擔體之重量比(擔體/本發明之反義低聚物)係依該低聚物之性質及該擔體種類等而異，以在0.1至100範圍內較適當，較好在0.1至10範圍內。

本發明之組成物除了本發明之反義低聚物及上述之擔體以外可任意配合醫藥學上容許之添加劑。相關之添加劑可列舉例如乳化補助劑(例如碳原子數6至22之脂肪酸或其醫藥學上容許之鹽、白蛋白、葡聚糖)、安定化劑(例如膽固醇、磷脂酸)、等張化劑(例如氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH調整劑(例如鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。該等可使用一種或二種以上。本發明組成物中該添加劑之含量以在90重量%以下較適當，較好在70重量%以下，更好在50重量%以下。

本發明之組成物可藉由在擔體之分散液中加入本發明之反義低聚物，適當攪拌而調製。又，添加劑可在本發明反義低聚物添加前，亦可在添加後以適當步驟添加。添加本發明反義低聚物時可使用之水性溶劑只要是醫藥學上容許者即可，並無特別限制，可列舉例如注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液、葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。又，相關情況之pH值及溫度等之條件業者可適當選擇。

本發明之組成物可作成例如液劑或其凍結乾燥製劑。該凍結乾燥製劑可依常法，將具有液劑形態之本發明組成物藉由凍結乾燥處理而調製。例如將具有液劑形態之本發明組成物進行適當滅菌後於小瓶中分注規定量，以約-40至-20℃之條件進行約2小時之預備凍結，於約0至10℃，在減壓下進行一次乾燥，接著於約15至25℃，在減壓下進行二次乾燥，即可凍結乾燥。通常將小瓶內部以氮氣置換，封瓶，可獲得本發明組成物之凍結乾燥製劑。

本發明組成物之凍結乾燥製劑通常可藉由添加任意適當之溶液(再溶解液)再溶解而使用。該等再溶解液可列舉注射用水、生理食鹽水、其他一般輸液。該再溶解液之液量依用途等而異，並無特別限制，以凍結乾燥前液量之0.5至2倍量或500mL以下較適當。

投予本發明組成物時之用量以考慮含有之本發明反義低聚物之種類、劑型、年齡或體重等病患之狀態、投予途徑、疾病之性質及程度進行調製較佳，對於成人，本發明反義低聚物之量每日在0.1mg至10g/人之範圍內，通常較好在1mg至1g/人之範圍內。該數值有依作為標的之疾病種類、投予形態、標的分子而異之情況。因此，根據情況有在該等量以下即充足，或相反的有需要該等以上之用量。或可以1日1次至數次投予或以1日至數日之間隔投予。

本發明組成物之另一態樣可列舉含有可表現本發明低聚核苷酸之載體及上述擔體之醫藥組成物。相關之表現載體可為可表現複數本發明低聚核苷酸者。該組成物與含有本發明低聚物之本發明之組成物相同，可添加醫藥學上容許之添加劑。該組成物中含有之表現載體之濃度依擔體之種類等而異，以在0.1nM至100μM範圍內較適當，較好在100nM至10μM範圍內。該組成物中含有之表現載體與擔體之重量比(擔體/表現擔體)依表現擔體之性質、擔體之種類等而異，以在0.1至100範圍內較適當，較好在0.1至10範圍內。又，該組成物中含有之擔體之含量與含有本發明反義低聚物之本發明組成物時相同，其調製方法等亦與本發明組成物之情況相同。

以下，列舉實施例及試驗例對本發明作更詳細的說明，惟，本發明不只限於該等實施例所示範圍。

[實施例]

[參考例1]

擔載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

步驟1：製造4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

在氬氣大氣下，將N-{1-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺3.44g及4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)1.1g懸濁於二氯甲烷50mL中，加入琥珀酸酐0.90g，於室溫攪拌3小時。在反應液中加入甲醇10mL，減壓濃縮。在殘渣中使用乙酸乙酯及0.5M磷酸二氫鉀水溶液進行萃取操作。獲得之有機層依序以0.5M磷酸二氫鉀水溶液、水、飽和食鹽水洗淨。獲得之有機層以硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，獲得目的物4.0g。

步驟2：製造擔載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

將4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸4.0g溶解於吡啶(脫水)200mL中，加入4-DMAP 0.73g、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽11.5g。接著，加入胺基聚苯乙烯樹脂引子支持體200胺基(Primer support 200 amino)(GE Healthcare Japan公司製造，17-5214-97)25.0g、三乙胺8.5mL，於室溫振動4日。反應後濾取樹脂。獲得之樹脂依序以吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，減壓乾燥。在獲得之樹脂中加入四氫呋喃(脫水)200mL、乙酸酐15mL、2,6-二甲基吡啶15mL，於室溫振動2小時。濾取樹脂，依序以吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，減壓乾燥，獲得目的物26.7g。

該目的物之負載量係藉由使用公知之方法，測定409nm之UV吸光度決定每1g樹脂之三苯甲基之莫耳量。樹脂之負荷量為129.2μmol/g。

UV測定條件

機器：U-2910(日立製作所)

溶劑：甲磺酸

波長：265nm

ε值：45000

依照以下實施例1、2及比較例1之記載，合成表1之PMO編號1至3表示之PMO。合成之PMO以注射用水(大塚製藥工場公司製造)溶解。

[實施例1]

PMO編號1

將擔載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例1)0.2g(26μmol)填充於附有過濾器之管柱，使用核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)，開始下述之合成循環。在各偶合循環中添加所期待之嗎啉代單體化合物，使成為標記化合物之鹼基序列(參照下述表2)。

又，解塊溶液(deblocking solution)使用含有3%(w/v)三氟乙酸之二氯甲烷溶液。中和/洗淨溶液使用以含有35%(v/v)乙腈之二氯甲烷溶液溶解使N,N-二異丙基乙胺成為10%(v/v)且四氫呋喃成為5%(v/v)者。偶合溶液A使用以四氫呋喃溶解使嗎啉代單體化合物成為0.10M者。偶合溶液B使用以乙腈溶解使N,N-二異丙基乙胺成為20%(v/v)且四氫呋喃成為10%(v/v)者。封端(capping)溶液使用對於乙腈，以20%(v/v)乙酸酐及30%(v/v)2,6-二甲基吡啶溶解者。

將於上述合成之擔載PMO之胺基聚苯乙烯樹脂從反應容器中回收，於室溫減壓乾燥2小時以上。將乾燥之擔載於胺基聚苯乙烯樹脂之PMO放入反應容器中，加入28%氨水-乙醇(1/4)5mL，於55℃攪拌15小時。將胺基聚苯乙烯樹脂濾別，以水-乙醇(1/4)1mL洗淨。將獲得之濾液減壓濃縮。將獲得之殘渣溶解於20mM之乙酸-三乙胺緩衝液(TEAA緩衝液)與乙腈之混合溶劑(4/1)10mL中，以膜濾器過濾。獲得之濾液以逆相HPLC精製。使用之條件如以下表3所示者。

分析各區分，回收目的物、減壓濃縮。濃縮殘渣中加入2M磷酸水溶液0.5mL，攪拌15分鐘。另，加入2M氫氧化鈉水溶液2mL，作成鹼性，以膜濾器(0.45μm)過濾。

將含有所得目的物之水溶液以陰離子交換樹脂管柱精製。使用之條件如下述表4所示。

分析各區分(HPLC)，獲得目的物之水溶液。在獲得之水溶液中添加0.1M磷酸緩衝液(pH 6.0)，中和。接著，以下述表5所示之條件，以逆相HPLC進行脫鹽。

回收目的物，減壓濃縮。將獲得之殘渣溶解於水中，凍結乾燥，獲得白色綿狀固體之目的化合物。

ESI-TOF-MS計算值：10021.46測定值：10021.91

[實施例2]

PMO編號2

以與實施例1相同之方法製造標記化合物。

ESI-TOF-MS計算值：9916.71測定值：9916.43

[比較例1]

PMO編號3

以與實施例1相同之方法製造標記化合物。

ESI-TOF-MS計算值：9949.46測定值：9949.41

[試驗例1]

體外分析(In vitro assay)

使用PMO編號1、2之本發明之反義低聚物及PMO編號3之反義低聚物進行實驗。各種反義低聚物之序列表示於以下之表6。

對於RD細胞(人類横紋肌肉腫細胞株)3.5×10⁵個，使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L，藉由Nucleofector II(Lonza)導入PMO編號1及2之本發明反義低聚物及PMO.編號3之反義低聚物各0.3,1,3,10μM。程式係使用T-030。

導入後將細胞於含有10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen公司製造)之伊格爾氏最低必需培養基(Eagle's minimal essential medium)(EMEM)(Sigma公司製造，以下亦相同)2mL中，在37℃、5%CO₂條件下培養3日。將細胞以PBS(Nissui公司製造，以下亦相同)洗淨後於細胞中添加Isogen II(Nippongene公司製造)500μl，於室溫放置數分鐘使細胞溶解，將該溶解物回收於Eppendorf管中。依照Isogen附加之指南萃取total RNA。萃取之total RNA濃度使用NanoDrop ND-1000(LMS公司製造)測定。

對於萃取之total RNA 400ng，使用Qiagen One Step RT-PCR Kit(Qiagen公司製造)進行One-Step RT-PCR。依照組合中附加之指南調製反應液。溫度循環器(Thermal cycler)使用PTC-100(MJ Research公司製造)。使用之RT-PCR之程式如以下所述。

50℃、30分鐘：逆轉錄反應

95℃、15分鐘：熱變性

[94℃、30秒鐘；60℃、30秒鐘；72℃、60秒鐘]x 35 循環：PCR増幅

72℃、10分鐘：最後之伸長反應

RT-PCR中使用之前置引子(forward primer)及反置引子(reverse primer)之鹼基序列如以下所述。

前置引子：5’-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’(序列編號5)

反置引子：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’(序列編號6)

將上述RT-PCR之反應產物1μl使用生物分析儀(Bioanalyzer)(Agilent公司製造)進行解析。測定外顯子51跳讀之帶之聚核苷酸量「A」及外顯子51未跳讀之帶之聚核苷酸量「B」。以該等「A」及「B」之測定值為基礎，依照以下之公式尋求跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

實驗結果

結果表示於第1圖。藉由本實驗，本發明之反義低聚物與PMO編號3比較，判定以顯著之高效率將外顯子51跳讀。

[實施例3]

PMO編號4-6

依照與實施例1相同之方法製造標記化合物。各種反義低聚物之序列表示於表7。

[實施例4]

序列編號9-33中記載之2’-O-甲氧基-硫代磷酸酯體

委託日本Bio Services公司製造標記之各種反義低聚物。各種反義低聚物之序列表示於表8。

[產業上之利用可能性]

從試驗例表示之實驗結果，本發明之反義低聚物於RD細胞顯示以顯著高效率跳讀外顯子51。因此，本發明之反義低聚物於DMD之治療中非常有用。

<110> 日本新藥股份有限公司獨立行政法人國立精神‧神經醫療研究中心

<120> 反義核酸

<130> G1311TW

<150> JPA2014-48897

<151> 2014-03-12

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核酸

<400> 1

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核酸

<400> 2

<210> 3

<211> 233

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

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<213> 人工序列

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<223> 合成核酸

<400> 4

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成核酸

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<210> 6

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<210> 7

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<223> 合成核酸

<400> 8

<210> 9

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核酸

<400> 10

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成核酸

<400> 11

<210> 12

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<210> 34

<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> 合成核酸

<400> 34

Claims

一種反義低聚物，為選自由以下(a)至(d)所成群組中任何一項所述之反義低聚物(a)含有序列編號1或2之鹼基序列之反義低聚物；(b)包含序列編號1或2之鹼基序列中，1至5個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(c)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有80%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；及(d)與由與序列編號1或2之鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物。
一種反義低聚物，為選自由以下(e)至(h)所成群組中任何一項所述之反義低聚物(e)由序列編號1或2之鹼基序列而成之反義低聚物；(f)包含序列編號1或2之鹼基序列中，1至3個鹼基係缺失、置換、挿入及/或附加之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；(g)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有80% 以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物；及(h)與由與序列編號1或2之鹼基序列為互補之鹼基序列而成的低聚核苷酸在高嚴苛條件下進行雜交之反義低聚物，且為具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物。
一種反義低聚物，為選自以下(i)及(j)之反應低聚物(i)由序列編號1或2之鹼基序列而成之反義低聚物；及(j)具有對於序列編號1或2之鹼基序列具有90%以上序列同一性之鹼基序列，且具有跳讀人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51之活性之反義低聚物。
如申請專利範圍第1項至第3項中任何一項所述之反義低聚物，其中，該反義低聚物為低聚核苷酸。
如申請專利範圍第4項所述之反義低聚物，其中，構成上述低聚核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分及/或磷酸結合部分為經修飾者。
如申請專利範圍第4項或第5項所述之反義低聚物，其中，構成上述低聚核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為2’位之-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所成群組之任何一種基取代之核糖者，而上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基。
如申請專利範圍第4項至第6項中任何一項所述之反義低聚物，其中，構成上述低聚核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸結合部分為選自由硫代磷酸酯結合、二硫代磷酸酯結合、烷基磷酸酯結合、胺基磷酸酯結合及硼烷磷酸酯結合所成群組之任何一種。
如申請專利範圍第1項至第3項中任何一項所述之反義低聚物，該反義低聚物係嗎啉代低聚物。
如申請專利範圍第8項所述之反義低聚物，其中，構成上述嗎啉代低聚物之至少1個嗎啉代之嗎啉代環部分、磷酸結合部分、3‘末端及/或5’末端為經修飾者。
如申請專利範圍第9項或第10項所述之反義低聚物，其中，構成上述嗎啉代低聚物之至少1個嗎啉代之磷酸結合部分為選自由磷醯二胺結合、硫代磷酸酯結合、二硫代磷酸酯結合、烷基磷酸酯結合、胺基磷酸酯結合及硼烷磷酸酯結合所成群組之任何一種。
如申請專利範圍第10項所述之反義低聚物，該反應低聚物係磷醯二胺嗎啉代低聚物。
如申請專利範圍第9項至第11項中任何一項所述之反義低聚物，其中，5’末端為下述化學式(1)至(3)中之任何一種基
一種肌肉萎縮治療用醫藥組成物，係含有申請專利範圍第1項至第12項中任何一項所述之反義低聚物、其醫藥學上可容許之鹽或水合物。
如申請專利範圍第13項所述之醫藥組成物，係更含有醫藥學上可容許之擔體。
一種肌肉萎縮之治療方法，係包含對肌肉萎縮病患投予申請專利範圍第1項至第12項中任何一項所述之反義低聚物或申請專利範圍第13項或第14項所述之醫藥組成物之步驟。
如申請專利範圍第15項所述之治療方法，其中，上述肌肉萎縮病患為在肌肉萎縮蛋白基因之外顯子29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50或47-50有核苷酸缺失之病患。
如申請專利範圍第15項或第16項所述之治療方法，其中，上述病患為人類。
一種申請專利範圍第1項至第12項中任何一項所述之反義低聚物之用途，係用於製造肌肉萎縮治療用醫藥組成物。
如申請專利範圍第1項至第12項中任何一項所述之反義低聚物，係使用於肌肉萎縮之治療。
如申請專利範圍第19項所述之反義低聚物，其中，於該治療中，肌肉萎縮病患為在肌肉萎縮蛋白基因之外顯子29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50或47-50有核苷酸缺失之病患。
如申請專利範圍第19項或第20項所述之反義低聚物，其中，上述病患為人類。