CN106459955B

CN106459955B - 反义核酸

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Publication number: CN106459955B
Application number: CN201580012727.4A
Authority: CN
Inventors: 若山达志; 瀬尾春奈; 佐藤洋平; 武田伸一; 永田哲也
Original assignee: National Research And Development Corp National Spirit Neurological Medical Research Center; Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: National Research And Development Corp National Spirit Neurological Medical Research Center; Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2035-03-11
Also published as: AU2015227733A1; KR20160132056A; BR112016020618B1; HRP20190235T1; US20180179538A1; DK3118311T3; EP3514234A1; PH12016501761B1; PT3118311T; IL247663A0; MY193708A; RU2730681C2; ZA201605864B; RU2702424C2; JPWO2015137409A1; PL3118311T3; RS58573B1; ES2710802T3; CN106459955A; EP3118311A4

Abstract

提供了允许人肌养蛋白基因中的外显子51高度有效跳跃的药物。本发明提供了反义寡聚物，其能使人肌养蛋白基因中的外显子51被跳跃。

Description

反义核酸

技术领域

本发明涉及引起人肌养蛋白基因中的外显子51跳跃的反义寡聚物和包含寡聚物的药物组合物。

发明背景

杜兴(Duchenne)肌肉营养不良(DMD)是遗传性进行性肌肉营养不良的最常见形式，其影响约3,500名新生男孩中的一名。虽然运动功能在婴儿和儿童中与健康人鲜有不同，但是在约4至5岁龄的儿童中观察到肌无力。然后，约12岁龄时肌无力进展到离床活动丧失，和至二十几岁进展至由于心脏或呼吸功能不全而死亡。DMD是此类重度病症。目前，不能获得用于DMD的有效疗法，并且已经强烈期望开发新的治疗剂。

已知DMD是由肌养蛋白基因中的突变引起的。肌养蛋白基因位于X染色体上，并且是由220万个DNA核苷酸对组成的巨型基因。DNA被转录成mRNA前体，并且内含子通过剪接而被除去以合成11,058个碱基的mRNA，其中79个外显子连接在一起。此mRNA被翻译为3,685个氨基酸以制备肌养蛋白。肌养蛋白与肌细胞中膜稳定性的维持有关，并且对于使肌细胞变得脆性较小是必要的。来自DMD患者的肌养蛋白基因含有突变，因此，在肌细胞中功能性的肌养蛋白很少被表达。因此，肌细胞的结构在DMD患者的身体中得不到维持，导致钙离子大量流入肌细胞中。因此，发生炎症样应答以促成纤维化，使得肌细胞仅可以艰难再生。

贝克尔(Becker)肌肉营养不良(BMD)也是由肌养蛋白基因中的突变引起的。症状牵涉伴随肌肉萎缩的肌无力，但是在与DMD相比时肌无力的进展通常是轻度并且缓慢的。在许多病例中，其在成年人中发作。认为DMD和BMD之间的临床症状的差异存在于将肌养蛋白mRNA翻译成肌养蛋白时氨基酸的阅读框被突变破坏与否(非专利文献1)。更具体地，在DMD中，突变的存在使氨基酸阅读框移位，从而消除了功能性肌养蛋白的表达，而在BMD中，制备了发挥功能(尽管不完全)的肌养蛋白，因为氨基酸阅读框是保留的，而外显子的一部分通过突变而缺失。

预期外显子跳跃充当用于治疗DMD的方法。此方法牵涉修改剪接以恢复肌养蛋白mRNA的氨基酸阅读框，并且诱导具有部分恢复的功能的肌养蛋白的表达(非专利文献2)。作为外显子跳跃的靶标的氨基酸序列部分会丧失。出于此原因，通过此治疗表达的肌养蛋白比正常蛋白变得更短，但是由于维持了氨基酸阅读框，部分保留了稳定肌细胞的功能。因此，预期外显子跳跃会导致DMD呈现与较轻的BMD的症状相似的症状。外显子跳跃方法已经通过使用小鼠或犬的动物测试，并且目前在人DMD患者的临床试验中评估。

可以通过靶向5′或3′剪接位点或5′和3′剪接位点两者，或外显子-内部位点的反义核酸的结合诱导外显子的跳跃。外显子仅当其两个剪接位点都被剪接体复合物识别时会被包含在mRNA中。因此，可以用反义核酸靶向剪接位点诱导外显子跳跃。此外，认为SR蛋白对外显子剪接增强子(ESE)的结合对于外显子被剪接机制识别是必要的。因而，也可以通过靶向ESE诱导外显子跳跃。

由于肌养蛋白基因的突变可以随DMD患者而变化，需要基于相应的遗传突变的位点或类型设计反义核酸。过去，Steve Wilton等，西澳大学(University of WesternAustralia)制备了诱导针对所有79个外显子的外显子跳跃的反义核酸(非专利文献3)，并且荷兰的Annemieke Aartsma-Rus等制备了诱导针对39个外显子的外显子跳跃的反义核酸(非专利文献4)。

认为可以通过使外显子51(下文称为“外显子51”)跳跃治疗所有DMD患者中的约13％的患者。近年，多个研究组织报告了靶向肌养蛋白基因中的外显子51进行外显子跳跃的研究(专利文献1至6；非专利文献5至6)。然而，尚未建立以高效率使外显子51跳跃的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开文本WO 2004/048570

专利文献2：国际公开文本WO 2002/024906

专利文献3：国际公开文本WO 2010/048586

专利文献4：国际公开文本WO 2010/050801

专利文献5：US 2010/0168212

非专利文献1：Monaco A.P.et al.，Genomics 1988；2：p.90-95

非专利文献2：Matsuo M.，Brain Dev 1996；18：p.167-172

非专利文献3：Wilton S.D.，et al.，Molecular Therapy 2007：15：p.1288-96

非专利文献4：Annemieke Aartsma-Rus et al.，(2002)NeuromuscularDisorders 12：S71-S77

非专利文献5：Aoki Y.，et al.，Molecular therapy 2010：18：p.1995-2005

非专利文献6：Nakano S.，et al.，Pediatr Int.2011：53：524-429

发明内容

本发明要解决的问题

在前述情况下，期望以高效率诱导肌养蛋白基因中外显子51跳跃的反义寡聚物和包含其寡聚物的肌肉营养不良治疗剂。

解决问题的手段

由于上文文献的技术内容和肌养蛋白基因结构的详细研究，本发明人已经发现了可以通过施用具有以SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列的反义寡聚物以高效率诱导外显子51跳跃。基于此发现，本发明人已经实现本发明。

即，本发明如下：

[1]反义寡聚物，其选自由以下(a)至(d)组成的组：

(a)反义寡聚物，其包含SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列；

(b)反义寡聚物，其由在SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列中具有1至5个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸序列组成，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；

(c)反义寡聚物，其具有与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；和

(d)反义寡聚物，其在严格条件下与寡核苷酸杂交，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性，所述寡核苷酸由与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。

[2]反义寡聚物，其选自由以下(e)至(h)组成的组：

(e)反义寡聚物，其由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列组成；

(f)反义寡聚物，其由在SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列中具有1至3个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸序列组成，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；

(g)反义寡聚物，其由与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列组成，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；和

(h)反义寡聚物，其在高严格条件下与寡核苷酸杂交，并且具有人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性，所述寡核苷酸由与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。

[3]反义寡聚物，其选自由以下(i)至(j)组成的组：

(i)反义寡聚物，其由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列组成；和

(j)反义寡聚物，其具有与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性。

[4]根据上述[1]至[3]中任一项的反义寡聚物，其是寡核苷酸。

[5]根据上述[4]的反义寡聚物，其中构成所述寡核苷酸的至少一个核苷酸的糖部分和/或磷酸结合区被修饰。

[6]根据上述[4]或[5]的反义寡聚物，其中构成所述寡核苷酸的至少一个核苷酸的糖部分是核糖，其中2′-OH基团被选自下组的任一个取代：OR、R、R′OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br和I(其中R是烷基或芳基，并且R′是亚烷基)。

[7]根据上述[4]至[6]中任一项的反义寡聚物，其中构成所述寡核苷酸的至少一个核苷酸的磷酸结合区是选自下组的任一个：硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、氨基磷酸酯键和硼烷磷酸酯(boranophosphate)键。

[8]根据上述[1]至[3]中任一项的反义寡聚物，其是吗啉代寡聚物。

[9]根据上述[8]的反义寡聚物，其中构成所述吗啉代寡聚物的至少一个吗啉代的吗啉代环部分、磷酸结合区、3’末端和/或5’末端被修饰。

[10]根据上述[9]或[10]的反义寡聚物，其中构成所述吗啉代寡聚物的至少一个吗啉代的磷酸结合区是选自下组的任一个：二氨基磷酸酯键(phosphorodiamidate bond)、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、氨基磷酸酯键和硼烷磷酸酯键。

[11]根据上述[10]的反义寡聚物，其是二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物。

[12]根据上述[9]至[11]中任一项的反义寡聚物，其中所述5′末端是以下化学式(1)至(3)中的任一个：

[13]用于治疗肌肉营养不良的药物组合物，其包含根据上述[1]至[12]中任一项的反义寡聚物，或其药学可接受盐或水合物作为活性成分。

[14]根据上述[13]的药物组合物，其包含药学可接受的载体。

[15]用于治疗肌肉营养不良的方法，其包括对肌肉营养不良患者施用根据上述[1]至[12]中任一项的反义寡聚物或根据权利要求[13]或[14]的药物组合物。

[16]根据上述[15]的治疗方法，其中所述肌肉营养不良患者是在外显子29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50或47-50内具有核苷酸缺失的患者。

[17]根据上述[15]或[16]的治疗方法，其中所述患者是人。

[18]根据上述[1]至[12]中任一项的反义寡聚物在制备用于治疗肌肉营养不良的药物组合物中的用途。

[19]根据上述[1]至[12]中任一项的反义寡聚物，其在治疗肌肉营养不良中的用途。

[20]根据上述[19]的反义寡聚物，其中所述治疗中的肌肉营养不良患者是在外显子29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50或47-50内具有核苷酸缺失的患者。

[21]根据上述[19]或[20]的反义寡聚物，其中所述患者是人。

本发明的效果

本发明的反义寡聚物可以以高效率诱导人肌养蛋白基因中的外显子51的跳跃。还有，可以通过施用本发明的药物组合物有效减轻杜兴肌肉营养不良的症状。

附图说明

图1显示人横纹肌肉瘤细胞系(RD细胞)中的人肌养蛋白基因的外显子51跳跃的效率。

具体实施方式

在下文中，详细描述本发明。下文描述的实施方案仅意图作为例子呈现以描述本发明，而非仅限于以下实施方案。可以在不偏离本发明的要旨的情况下以各种方式实施本发明。

1.反义寡聚物

本发明提供了以高效率引起人肌养蛋白基因中的外显子51跳跃的反义寡聚物(在下文中称为“本发明的反义寡聚物”)。

[人肌养蛋白基因中的外显子51]

在本发明中，术语“基因”意图指基因组基因，并且还包括cDNA、mRNA前体和mRNA。优选地，基因是mRNA前体，即pre-mRNA。

在人基因组中，人肌养蛋白基因位于基因座Xp21.2。人肌养蛋白基因具有220万个核苷酸对的大小，并且是已知人基因中的最大基因。然而，人肌养蛋白基因的编码区仅为14kb，贯穿人肌养蛋白基因以79个外显子分布(Roberts，RG等，Genomics，16：536-538(1993))。pre-mRNA(其是人肌养蛋白基因的转录物)经历剪接以产生14kb的成熟mRNA。人野生型肌养蛋白基因的核苷酸序列是已知的(GeneBank登录号NM_004006)。

人野生型肌养蛋白基因中的外显子51的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：3。

[反义寡聚物]

本发明的反义寡聚物设计为引起人肌养蛋白基因中的外显子51的跳跃，从而将由肌养蛋白基因的DMD类型编码的蛋白质修饰为肌养蛋白的BMD类型。因而，作为通过反义寡聚物的外显子跳跃的靶标的肌养蛋白基因中的外显子51包括野生型和突变体类型两者。

具体地，本发明的反义寡聚物是反义寡聚物，其选自由以下(a)至(d)组成的组：

(a)反义寡聚物，其包含SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列；

(d)反义寡聚物，其在严格条件下与寡核苷酸杂交，并且具有引起肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性，所述寡核苷酸由与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。

具体地，(b)至(d)的反义寡聚物是(a)的反义寡聚物的突变体，并且意图对应于患者的肌养蛋白基因的突变，例如多态性。

作为另一个实施方案，本发明反义寡聚物具体是反义寡聚物，其选自由以下(k)至(n)组成的组：

(k)反义寡聚物，其包含以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列；

(l)反义寡聚物，其由在以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列中具有1至5个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸序列组成，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；

(m)反义寡聚物，其具有与以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；和

(n)反义寡聚物，其在严格条件下与寡核苷酸杂交，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性，所述寡核苷酸由与以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。

具体地，(1)至(n)的反义寡聚物是(k)的反义寡聚物的突变体，并且意图对应于患者的肌养蛋白基因的突变，例如多态性。

还有，本发明反义寡聚物是反义寡聚物，其选自由以下(o)至(r)组成的组：

(o)反义寡聚物，其由以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列组成；

(p)反义寡聚物，其由在以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列中具有1至3个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸序列组成，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；

(q)反义寡聚物，其具有与SEQ ID NO：6至33中任一项的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性；和

(r)反义寡聚物，其在高严格条件下与寡核苷酸杂交，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性，所述寡核苷酸由与以SEQ ID NO：6至33中任一项所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。

此外，本发明的反义寡聚物是反义寡聚物，其选自由以下(i)和(j)组成的组：

(i)反义寡聚物，其由SEQ ID NO：6至33中任一项的核苷酸序列组成；或

(j)反义寡聚物，其由与SEQ ID NO：6至33中任一项的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列组成，并且具有引起人肌养蛋白基因中第51个外显子跳跃的活性。

如本文中使用，术语“在严格条件下杂交的反义寡聚物”指例如使用寡核苷酸的全部或部分作为探针通过集落杂交、噬菌斑杂交、Southern杂交等获得的反义寡聚物，所述寡核苷酸由与例如SEQ ID NO：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。可以使用的杂交方法包括记载于例如″Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，Laboratory Press 2001，″″Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997，″等的方法。

如本文中使用，术语“严格条件”可以是低严格条件、中等严格条件或高严格条件中的任一种。术语“低严格条件”是例如于32℃的5x SSC，5x登哈特(Denhardt)氏溶液，0.5％SDS，50％甲酰胺。术语“中等严格性”是例如于42℃的5x SSC，5x登哈特氏溶液，0.5％SDS，50％甲酰胺，或者于42℃的5x SSC，1％SDS，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，50％甲酰胺。术语“高严格条件”是例如(1)于50℃的5x SSC，5x登哈特氏溶液，0.5％SDS，50％甲酰胺，(2)于60℃的0.2x SSC，0.1％SDS，(3)于62℃的0.2x SSC，0.1％SDS，(4)于65℃的0.2x SSC，0.1％SDS，或者(5)于65℃的0.1x SSC，0.1％SDS，但是不限于此。在这些条件下，预期在较高的温度有效地获得具有较高的同源性的反义寡聚物，尽管杂交严格性涉及多种因素，包括温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，并且本领域技术人员可以适当选择这些因素以实现相似的严格性。

当使用商品化试剂盒进行杂交时，例如，可以使用Alkphos Direct Labellingand Detection System(GE Healthcare)。在此情况中，根据所附的方案，在用经标记的探针培养过夜后，于55℃用含有0.1％(w/v)SDS的一级清洗缓冲液清洗膜，从而检测杂交的反义寡聚物。或者，当在制备基于与SEQ ID NO：3的核苷酸序列的互补序列的全部或部分的探针中使用商品化试剂(例如PCR标记混合物(Roche Diagnostics)等)用洋地黄毒苷(DIG)标记探针时，可以用DIG Nucleic Acid Detection Kit(Roche Diagnostics)标记杂交。

除了上文描述的反义寡聚物外，可以杂交的其它反义寡聚物包括与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列具有90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上，99.1％以上，99.2％以上，99.3％以上，99.4％以上，99.5％以上，99.6％以上，99.7％以上，99.8％以上，和99.9％以上同一性的反义寡聚物，所述同一性如通过同源性搜索软件，如FASTA and BLAST使用缺省参数计算。

可以使用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441，(1985))或Karlin和Altschul的算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)测定核苷酸序列之间的同一性。已经开发出基于BLAST算法的称作blastn，blastx，tblastn和tblastx的程序(Altschul SF等：J.Mol.Biol.215：403，1990)。当使用blastn对核苷酸序列测序时，参数是例如得分＝100和字长＝12。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用每个程序的缺省参数。

术语“引起人肌养蛋白基因中的外显子51的跳跃”意图指通过本发明的反义寡聚物对与人肌养蛋白基因的转录物(例如pre-mRNA)的外显子51对应的位点结合，例如，在转录物经历剪接时在与具有外显子52缺失的DMD患者中的外显子50的3′末端对应的核苷酸序列处剪接与外显子53的5′末端对应的核苷酸序列，从而导致没有密码子移码的成熟mRNA的形成。

在本文中，上文描述的术语“结合”意图指当混合本发明的反义寡聚物与人肌养蛋白基因的转录物时，这两者在生理学条件下杂交以形成双链核酸。术语“在生理学条件下”指设置为就pH、盐组成和温度而言模拟体内环境的条件。例如，条件是25至40℃，优选37℃，pH 5至8，优选pH 7.4和150mM氯化钠浓度。

可以如下确认是否引起人肌养蛋白基因中的外显子51的跳跃，通过将本发明的反义寡聚物导入肌养蛋白表达细胞(例如人横纹肌肉瘤细胞)中，通过RT-PCR从肌养蛋白表达细胞的总RNA扩增人肌养蛋白基因的mRNA的外显子51周围的区域，并且对PCR扩增的产物进行巢式PCR或序列分析。

可以如下测定跳跃效率。从测试细胞收集人肌养蛋白基因的mRNA；在mRNA中，测量跳跃外显子51的条带的多核苷酸水平“A”和没有跳跃外显子51的条带的多核苷酸水平“B”。使用“A”和“B”的这些测量数值，通过以下公式计算效率：

跳跃效率(％)＝A/(A+B)x 100

优选地，本发明的反义寡聚物以10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，和90％以上的效率引起外显子51的跳跃。

关于跳跃效率的计算，可以参考国际公开文本WO2012/029986。

本发明的反义寡聚物包括例如寡核苷酸、吗啉代寡聚物或肽核酸(PNA)，具有16至35个核苷酸的长度。优选地，长度是19至32、20至31、21或30个核苷酸，并且吗啉代寡聚物是优选的。

上文描述的寡核苷酸(在下文中称为“本发明的寡核苷酸”)是由作为构成单元的核苷酸构成的本发明的反义寡聚物。此类核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和经修饰的核苷酸中的任一种。

经修饰的核苷酸指具有构成核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的完全或部分经修饰的核碱基、糖部分和/或磷酸结合区的核苷酸。

在本发明中，核碱基包括例如腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、和其经修饰的碱基。此类经修饰的碱基的例子包括但不限于假尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如5-乙基尿嘧啶)、5-卤代尿嘧啶(5-溴尿嘧啶)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5′-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸、2-硫胞嘧啶(2-thiocytosine)、嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、异鸟嘌呤、吲哚、咪唑、黄嘌呤等。

糖部分的修饰可以包括例如核糖的2′位的修饰和糖的其它位置的修饰。核糖的2′位的修饰包括用OR、R、R′OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br或I替换核糖的2′-OH，其中R代表烷基或芳基，并且R′代表亚烷基。

糖的其它位置的修饰包括例如用S替换核糖或脱氧核糖的4′位的O，糖的2′和4′位之间的桥接，例如LNA(锁定核酸)或ENA(2′-O，4′-C-乙烯桥接核酸)，但不限于此。

磷酸结合区的修饰包括例如用硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、氨基磷酸酯键或硼烷磷酸酯键替换磷酸二酯键的修饰(Enya等：Bioorganic&MedicinalChemistry，2008，18，9154-9160)(参见例如Japan Domestic Re-Publications of PCTApplication No.2006/129594和2006/038608)。

在本发明中，优选地，烷基是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。具体的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基和异己基。任选地，烷基可以是取代的。此类取代基的例子是卤素、烷氧基、氰基和硝基。烷基可以用1至3个取代基取代。

在本发明中，优选地，环烷基是具有5至12个碳原子的环烷基。具体的例子包括环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基和环十二烷基。

在本发明中，卤素包括氟、氯、溴和碘。

烷氧基是具有1至6个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基等。特别地，优选具有1至3个碳原子的烷氧基。

在本发明中，优选地，芳基是具有6至10个碳原子的芳基。具体的例子包括苯基、α-萘基和β-萘基。特别地，苯基是优选的。任选地，芳基可以是取代的。此类取代基的例子是烷基、卤素、烷氧基、氰基和硝基。芳基可以被此类取代基中的一个或多个取代。

在本发明中，优选地，亚烷基是具有1至6个碳原子的直链或支链亚烷基。具体的例子包括亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、戊亚甲基、己亚甲基、2-(乙基)三亚甲基和1-(甲基)四亚甲基。

在本发明中，酰基包括直链或支链链烷酰基(alkanoyl)或芳酰基。链烷酰基的例子包括甲酰基、乙酰基、2-甲基乙酰基、2，2-二甲基乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、2，2-二甲基丙酰基、己酰基等。芳酰基的例子包括苯甲酰基、甲苯酰基和萘甲酰基。任选地，芳酰基可以在可取代的位置处被取代，并且可以用烷基取代。

优选地，本发明的寡核苷酸是含有表示为下述通式的构成单元的本发明的反义寡聚物，其中核糖的2’位的-OH基团被甲氧基取代，并且磷酸结合区是硫代磷酸酯键：

其中碱基代表核碱基。

可以使用各种自动合成仪(例如AKTA oligopilot plus 10/100(GEHealthcare))容易地合成本发明的寡核苷酸。或者，合成也可以委托给第三方组织(例如Promega Inc.，Takara Co.或Japan Bio Service Co.)等。

本发明的吗啉代寡聚物是包含表示为下述通式的构成单元的本发明的反义寡聚物：

其中碱基具有如上文限定的相同意义，并且

W代表以任一种下述基团所示的基团：

其中X代表-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；

R¹代表H或烷基；

R²和R³(其可以是相同或不同的)各自代表H、烷基、环烷基或芳基；

Y₁代表O、S、CH₂或NR¹；

Y₂代表O、S或NR¹；

Z代表O或S。

优选地，吗啉代寡聚物是包含表示为下述通式的构成单元的寡聚物(二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(在下文中称为“PMO”))。

其中碱基、R²和R³具有如上文限定的相同意义。

本发明的吗啉代寡聚物包括具有构成吗啉代寡聚物的完全或部分经修饰的核碱基、吗啉代环部分、磷酸结合区、3’末端和/或5’末端的吗啉代寡聚物。

磷酸结合区的修饰包括例如用二氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、氨基磷酸酯键和硼烷磷酸酯键替换的修饰(Enya等：Bioorganic&MedicinalChemistry，2008，18，9154-9160)(参考例如Japan Domestic Re-Publications of PCTApplication Nos.2006/129594和2006/038608)。

可以根据例如WO 1991/009033或WO 2009/064471制备吗啉代寡聚物。特别地，可以通过记载于WO 2009/064471的方案制备或者通过下文显示的方法制备PMO。

[用于制备PMO的方法]

例如，PMO的一个实施方案是以下文的通式(I)所示的化合物(在下文中为PMO(I))。

其中碱基、R²和R³具有如上文限定的相同意义；并且

n是1至99的给定整数，优选24至34、27至31或28至30，优选29的给定整数。

PMO(I)可以根据已知的方法制备，例如可以通过实施以下步骤中的方案制备。

下述步骤中使用的化合物和试剂没有特别限制，只要它们通常用于制备PMO。

还有，以下步骤可以全部通过液相方法或固相方法(使用手动或商品化固相自动合成仪)实施。在通过固相方法制备PMO中，鉴于简单的操作方案和准确合成，期望使用自动合成仪。

(1)步骤A：

使以下述通式(II)所示的化合物(在下文中称为化合物(II))与酸起反应以制备以下述通式(III)所示的化合物(在下文中称为化合物(III))：

其中n、R²和R³具有如上文限定的相同意义；

每个B^P独立代表核碱基，所述核碱基可以任选被保护；

T代表三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；并且

L代表氢、酰基或以下述通式(IV)所示的基团(在下文中称为基团(IV))。

B^P的“核碱基”包括与碱基中相同的“核碱基”，只要以B^P所示的核碱基中的氨基或羟基基团可以被保护。

氨基的此类保护基没有特别限制，只要它用作核酸的保护基。具体的例子包括苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基和(二甲基氨基)亚甲基。羟基基团的保护基团的具体的例子包括2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯基磺酰基乙基、甲基磺酰基乙基和三甲基甲硅烷基乙基、和苯基(其可以在任选的可取代位置处被1至5个吸电子基团取代)、二苯基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、甲基苯基氨基甲酰基、1-吡咯烷基氨基甲酰基、吗啉代氨基甲酰基、4-(叔丁基羧甲基)苄基、4-[(二甲基氨基)羧基]苄基，4-(苯基羧基)苄基(参考例如WO 2009/064471)。

“固体载体”没有特别限制，只要它是可用于核酸的固相反应的载体。期望固体载体具有以下特征：例如(i)它在可以用于合成吗啉代核酸衍生物的试剂(例如二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶(lutidine)、三氟乙酸)中略溶；(ii)它对于可用于合成吗啉代核酸衍生物的试剂是化学稳定的；(iii)它可以是化学修饰的；(iv)它可以被加载期望的吗啉代核酸衍生物；(v)它具有足以承受经由处理的高压力的强度；和(vi)它具有一致的粒径范围和分布。具体地，可膨胀的聚苯乙烯(例如氨基甲基聚苯乙烯树脂1％二乙烯基苯(divinilbenzene)交联(200-400目)(2.4-3.0mmol/g)(由TokyoChemical Industry制备)，氨基甲基化聚苯乙烯树脂HCl[二乙烯基苯1％，100-200目](由Peptide Institute，Inc.制备))，不可膨胀的聚苯乙烯(例如Primer Support(由GEHealthcare制备))，PEG链附接的聚苯乙烯(例如NH₂-PEG树脂(由Watanabe Chemical Co.制备)，TentaGel树脂)，可控孔玻璃(可控孔玻璃；CPG)(由例如CPG制备)，草酰可控孔玻璃(参考例如Alul等，Nucleic Acids Research，Vol.19，1527(1991))，TentaGel支持物-氨基聚乙二醇衍生的支持物(例如Wright等，参考Tetrahedron Letters，Vol.34，3373(1993))，和Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。

可以使用的“接头”是一般用于连接核酸或吗啉代核酸衍生物的已知的接头。例子包括3-氨基丙基、琥珀酰基、2，2′-二乙醇磺酰基和长链烷基氨基(LCAA)。

可以通过使化合物(II)与酸起反应实施此步骤。

可以在此步骤中使用的“酸”包括例如三氟乙酸、二氯乙酸和三氯乙酸。使用的酸适当地在例如基于1mol化合物(II)的0.1mol当量至1000mol当量的范围中，优选地，在基于1mol化合物(II)的1mol当量至100mol当量的范围中。

有机胺可以与上文描述的酸组合使用。有机胺没有特别限制，并且包括例如三乙胺。使用的有机胺的量适当地在基于1mol酸的例如0.01mol当量至10mol当量的范围中，并且优选在0.1mol当量至2mol当量的范围中。

当在此步骤中使用盐或酸和有机胺的混合物时，盐或混合物包含例如三氟乙酸和三乙胺的盐或混合物，并且更具体地，1当量的三乙胺和2当量的三氟乙酸的混合物。

可以在此步骤中使用的酸也可以在0.1％至30％的浓度中用合适的溶剂以稀释物的形式使用。溶剂没有特别限制，只要它对反应是惰性的，并且包括例如二氯甲烷、乙腈、醇(乙醇、异丙醇、三氟乙醇等)、水、或其混合物。

优选地，上文描述的反应中的反应温度在例如10℃至50℃的范围中，更优选在20℃至40℃的范围中，且最优选在25℃至35℃的范围中。

反应时间可以随使用的酸的种类和反应温度而变化，并且一般适当地在0.1分钟至24小时的范围中，并且优选地在1分钟至5小时的范围中。

在完成此步骤后，若必要的话，可以添加碱，以中和系统中保留的酸。“碱”没有特别限制，并且包括例如二异丙胺。碱也可以在合适的溶剂中以稀释物的形式使用，浓度是0.1％(v/v)至30％(v/v)。

此步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要它对反应是惰性的，并且包括二氯甲烷、乙腈、醇(乙醇、异丙醇、三氟乙醇等)、水、或其混合物。反应温度在例如10℃至50℃的范围中，更优选在20℃至40℃的范围中，且最优选在25℃至35℃的范围中。

反应时间可以随使用的碱的种类和反应温度而变化，并且一般适当地在0.1分钟至24小时的范围中，并且优选地在1分钟至5小时的范围中。

在化合物(II)中，可以通过以下方案制备下述通式(IIa)的化合物(在下文中为化合物(IIa))，其中n是1并且L是基团(IV)：

其中B^P、T、接头和固体载体具有如上文限定的相同的意义。

步骤1：

使以下述通式(V)所示的化合物与烷化剂起反应以制备以下述通式(VI)所示的化合物(在下文中为化合物(VI))。

其中B^P、T和接头具有如上文限定的相同的意义；并且

R⁴代表羟基、卤素、羧基基团或氨基。

可以通过使用化合物(V)作为起始材料进行用于引入接头的已知方案来实施此步骤。

具体地，可以通过使用化合物(V)和琥珀酐实施称为酯化的方法制备以下述通式(VIa)所示的化合物。

其中B^P和T具有如上文限定的相同的意义。

步骤2：

通过缩合剂使化合物(VI)与固体载体起反应以制备化合物(IIa)。

其中B^P、R⁴、T、接头和固体载体具有如上文限定的相同的意义。

可以根据称为缩合反应的过程使用化合物(VI)和固体载体实施此步骤。

在化合物(II)中，可以通过使用化合物(IIa)作为起始材料，并且将说明书中描述的PMO制备方法的步骤A和步骤B重复期望的次数来制备以下述通式(IIa2)所示的化合物，其中n是2至99(优选25至35、28至32或29至31，优选30的给定整数)，并且L是以通式(IV)所示的基团。

其中B^P、R²、R³、T、接头和固体载体具有如上文限定的相同的意义；并且

n′代表1至98(在一个具体的实施方案中，n’是1至34，1至33，1至32，1至31，1至30，1至29，1至28，1至27，1至26，1至25，1至24)。

(2)步骤B

在存在碱的情况下使化合物(III)与吗啉代单体化合物起反应以制备以下述通式(VII)所示的化合物(在下文中称为化合物(VII))：

其中B^P、L、n、R²、R³和T具有如上文限定的相同的意义。

可以通过在存在碱的情况下使化合物(III)与吗啉代单体化合物起反应来实施此步骤。

吗啉代单体化合物包括例如以下述通式(VIII)所示的化合物：

其中B^P、R²、R³和T具有如上文限定的相同的意义。

可以在此步骤中使用的“碱”包括例如二异丙胺、三乙胺和N-乙基吗啉代。使用的碱的量适当地在基于1mol化合物(III)的1mol当量至1000mol当量，优选在基于1mol化合物(III)的10mol当量至100mol当量的范围中。

可以在此步骤中使用的吗啉代单体化合物和碱也可以在0.1％至30％的浓度中作为用合适的溶剂得到的稀释物使用。溶剂没有特别限制，只要它对于反应是惰性的，并且包括例如N，N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、或其混合物。

反应温度优选在例如0℃至100℃的范围中，并且更优选在10℃至50℃的范围中。

反应时间可以随使用的酸的种类和反应温度而变化，并且一般适当地在1分钟至48小时的范围中，并且优选地在30分钟至24小时的范围中。

此外，在完成此步骤后，若必要的话，可以添加烷化剂。例如，“烷化剂”包括乙酸酐、乙酰氯和苯氧基乙酸酐。烷化剂也可以作为用合适的溶剂得到的稀释物使用，浓度为0.1％至30％。溶剂没有特别限制，只要它对于反应是惰性的，并且包括例如二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、醇(乙醇、异丙醇、三氟乙醇等)、水、或其混合物。

若必要的话，诸如吡啶、二甲基吡啶、可力丁(collidine)、三乙胺、二异丙基乙胺、N-乙基吗啉代等的碱也可以与烷化剂组合使用。烷化剂的量适当地在0.1mol当量至10000mol当量的范围中，并且优选地在1mol当量至1000mol当量的范围中。基于1mol的烷化剂，碱的量适当地在例如0.1mol当量至100mol当量的范围中，并且优选地在1mol当量至10mol当量的范围中。

此反应中的反应温度优选在10℃至50℃的范围中，更优选在10℃至50℃的范围中，且最优选在20℃至40℃的范围中，且最优选在25℃至35℃的范围中。反应时间可以随使用的烷化剂的种类和反应温度而变化，并且一般适当地在0.1分钟至24小时的范围中，并且优选在1分钟至5小时的范围中。

(3)步骤C：

在步骤B中制备的化合物(VII)中，使用脱保护剂除去保护基以制备以通式(IX)所示的化合物。

其中碱基、B^P、L、n、R²、R³和T具有如上文限定的相同的意义。

可以通过使化合物(VII)与脱保护剂起反应实施此步骤。

“脱保护剂”包括例如浓氨水和甲胺。此步骤中使用的“脱保护剂”也可以用作在例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、DMF、N，N-二甲基咪唑啉酮、M甲基哌啶酮、或这些溶剂的混合物中的稀释物。在它们之中，甲醇是优选的。基于1mol的化合物(VII)，使用的脱保护剂的量适当地在例如1mol当量至100000mol当量的范围中。

反应温度适当地在15℃至75℃的范围中，优选在40℃至70℃的范围中，并且更优选在50℃至60℃的范围中。用于脱保护的反应时间可以随化合物(VII)的种类、反应温度等而变化，并且适当地在10分钟至30小时，优选30分钟至24小时的范围中，并且更优选在5小时至20小时的范围中。

(4)步骤D：

通过使步骤C中制备的化合物(IX)与酸起反应制备PMO(I)：

其中碱基、n、R²、R³和T具有如上文限定的相同的意义。

可以通过将酸添加到化合物(IX)实施此步骤。

可以在此步骤中使用的“酸”包括例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸、氢氯酸等。使用的酸适当用于让溶液具有0.1至4.0的pH范围，并且更优选地在pH 1.0至3.0的范围中。溶剂没有特别限制，只要它对反应是惰性的，并且包括例如乙腈、水、或这些溶剂的混合物。

反应温度适当地在10℃至50℃的范围中，优选在20℃至40℃的范围中，并且更优选在25℃至35℃的范围中。用于脱保护的反应时间可以随化合物(IX)的种类、反应温度等而变化，并且适当地在0.1分钟至5小时，优选1分钟至1小时的范围中，并且更优选在1分钟至30分钟的范围中。

可以通过使此步骤中获得的反应混合物进行常规分离和纯化手段，如提取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、反相柱层析C₈至C₁₈、阳离子交换柱层析、阴离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、高效液相层析、透析、超滤等(单独或组合)获得PMO(I)。因此，可以分离并纯化期望的PMO(I)(参考例如WO 1991/09033)。

在使用反相层析纯化PMO(I)中，例如，可以使用20mM三乙胺/乙酸盐缓冲液和乙腈的溶液混合物作为洗脱溶剂。

在使用离子交换层析纯化PMO(I)中，例如，可以使用1M盐水溶液和10mM氢氧化钠水溶液的溶液混合物作为洗脱溶剂。

肽核酸是具有表示为下述通式的基团为构成单元的本发明的寡聚物：

其中碱基具有如上文限定的相同的意义。

可以通过参考例如以下文献制备肽核酸。

1)P.E.Nielsen，M.Egholm，R.H.Berg，O.Buchardt，Science，254，1497(1991)

2)M.Egholm，O.Buchardt，P.E.Nielsen，R.H.Berg，Jacs.，114，1895(1992)

3)K.L.Dueholm，M.Egholm，C.Behrens，L.Christensen，H.F.Hansen，T.Vulpius，K.H.Petersen，R.H.Berg，P.E.Nielsen，O.Buchardt，J.Org.Chem.，59，5767(1994)

4)L.Christensen，R.Fitzpatrick，B.Gildea，K.H.Petersen，H.F.Hansen，T.Koch，M.Egholm，O.Buchardt，P.E.Nielsen，J.COull，R.H.Berg，J.Pept.Sci.，1，175(1995)

5)T.Koch，H.F.Hansen，P.Andersen，T.Larsen，H.G.Batz，K.Otteson，H.Orum，J.Pept.Res.，49，80(1997)

在本发明的寡聚物中，5′末端可以是下述化学结构(1)至(3)中的任一个，并且优选是(3)-OH。

在下文中，以上述(1)、(2)和(3)所示的基团分别称为“基团(1)”、“基团(2)”和“基团(3)”。

2.药物组合物

与现有技术的反义寡聚物相比，本发明的寡聚物以更高的效率引起外显子51跳跃。因此，预期肌肉营养不良状况可以通过对由于外显子51跳跃而具有转化为框内的突变的DMD患者施用包含本发明的寡聚物的药物组合物来高效缓解，所述DMD患者是例如具有外显子29-50缺失的患者，具有外显子50缺失的患者，具有外显子45-50缺失的患者，具有外显子48-50缺失的患者，具有外显子49-50缺失的患者，具有外显子52缺失的患者，具有外显子52-63缺失的患者，具有外显子13-50缺失的患者，具有外显子19-50缺失的患者，具有外显子43-50缺失的患者，或具有外显子47-50缺失的患者。例如，当使用包含本发明的寡聚物的药物组合物时，甚至可以以比现有技术的寡聚物的剂量更小的剂量实现相同的治疗效果。因而，可以减轻副作用，并且其是经济的。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗肌肉营养不良的药物组合物，其包含本发明的寡聚物，其药学可接受盐或水合物(在下文中称为“本发明的组合物”)作为活性成分。

还有，本发明提供了用于治疗肌肉营养不良的方法，其包括对DMD患者施用本发明的寡聚物。

在所述治疗方法中，可以施用本发明的寡聚物作为用于治疗肌肉营养不良的药物组合物。

此外，本发明提供了本发明的寡聚物在制备用于治疗肌肉营养不良的药物组合物中的用途和为了治疗肌肉营养不良应用的本发明的寡聚物。

本发明的组合物中含有的本发明的寡聚物的药学可接受盐的例子是碱金属盐，如钠、钾和锂盐；碱土金属盐，如钙和镁盐；金属盐，如铝、铁、锌、铜、镍、钴等的盐；铵盐；有机胺盐，如叔辛胺、二苄胺、吗啉代、葡糖胺、苯基甘氨酸烷基酯、乙二胺、N-甲基葡糖胺、胍、二乙胺、三乙胺、二环己胺、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、N-苄基苯乙胺、哌嗪、四甲基铵、三(羟甲基)氨基甲烷的盐；氢卤化物盐，如氢氟酸、氢氯酸、氢溴酸和氢碘酸的盐；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；低级链烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；有机酸盐，如乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，草酸盐，马来酸盐等；和氨基酸盐，如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。可以通过已知的方法制备这些盐。或者，本发明的组合物中含有的本发明的寡聚物可以为其水合物的形式。

本发明的组合物的施用路径没有特别限制，只要它是药学可接受的施用路径，并且可以根据治疗方法选择。鉴于容易对肌肉组织的递送，优选静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、口服施用、组织施用、经皮施用等。还有，可用于本发明的组合物的剂量形式没有特别限制，并且包括例如各种注射液、口服剂、滴液、吸入剂、软膏、洗剂等。

在对肌肉营养不良患者施用本发明的寡聚物中，本发明的组合物可以含有载体以促进寡聚物对肌肉组织的递送。此类载体没有特别限制，只要它是药学可接受的，并且例子包括阳离子载体，如阳离子脂质体、阳离子聚合物等，或者使用病毒包膜的载体。例如，阳离子脂质体是由2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和磷脂作为必要组分构成的脂质体(在下文中称为“脂质体A”)、Oligofectamine(注册商标)(由InvitrogenCorp.制造)、Lipofectin(注册商标)(由Invitrogen Corp.制造)、Lipofectamine(注册商标)(由Invitrogen Corp.制造)、Lipofectamine 2000(注册商标)(由Invitrogen Corp.制造)、DMRIE-C(注册商标)(由Invitrogen Corp.制造)、GeneSilencer(注册商标)(由GeneTherapy Systems制造)、TransMessenger(注册商标)(由QIAGEN，Inc.制造)、TransIT TKO(注册商标)(由Mirus制造)和Nucleofector II(Lonza)。特别地，脂质体A是优选的。阳离子聚合物的例子是JetSI(注册商标)(由Qbiogene，Inc.制造)和Jet-PEI(注册商标)(聚乙烯亚胺，由Qbiogene，Inc.制造)。使用病毒包膜的载体的一个例子是GenomeOne(注册商标)(HVJ-E脂质体，由Ishihara Sangyo制造)。或者，也可以使用日本专利No.2924179中描述的医学装置和日本国内再公开PCT No.2006/129594和2008/096690中描述的阳离子载体。

关于更多详情，可以参考美国专利No.4,235,871，美国专利No.4,737,323，WO96/14057，“New RRC，Liposomes：A practical approach，IRL Press，Oxford(1990)pages 33-104”等。

本发明的组合物中含有的本发明的寡聚物的浓度可以随载体的种类等而变化，并且适当地在0.1nM至100μM的范围中，优选在100nM至10μM的范围中。本发明的组合物中含有的本发明的寡聚物和载体的重量比(载体/本发明的反义寡聚物)可以随寡聚物的特性，载体的类型等而变化，并且适当地在0.1至100的范围中，优选在0.1至10的范围中。

除了本发明的寡聚物和上文描述的载体外，任选地，也可以在本发明的组合物中配制药学可接受添加剂。此类添加剂的例子是乳化助剂(例如具有6至22个碳原子的脂肪酸及其药学可接受盐、清蛋白和右旋糖苷)、稳定剂(例如胆固醇和磷脂酸)、等张剂(例如氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、和pH控制剂(例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾和三乙醇胺)。可以使用这些添加剂中的一种或多种。适当地，本发明的组合物中的添加剂的含量是90wt％以下，优选70wt％以下且更优选50wt％以下。

可以通过将本发明的寡聚物添加到载体分散体，并且充分搅拌混合物制备本发明的组合物。可以在添加本发明的寡聚物之前或之后的适当步骤时添加添加剂。可以在添加本发明的寡聚物中使用的水性溶剂没有特别限制，只要它是药学可接受的，并且例子是注射用水或注射用蒸馏水，电解质流体，如生理盐水，等等，和糖流体，如葡萄糖流体、麦芽糖流体等。本领域技术人员可以为此类事情适当选择pH和温度条件。

可以将本发明的组合物制备成例如液体形式及其冻干制剂。可以通过常规的方式冻干液体形式的本发明的组合物来制备冻干制剂。例如，可以如下实施冻干，通过适当灭菌液体形式的本发明的组合物，将等分试样分配到小瓶容器中，在约-40至-20℃的条件下实施初步冷冻2小时，在减压下在约0至10℃实施一级干燥，并且在减压下在约15至25℃实施二级干燥。一般地，可以通过用氮气替换小瓶的内容物并且封盖获得本发明的组合物的冻干制剂。

一般地，可以通过添加任选的合适溶液(重建液体)，并且再溶解制剂实现在重建后使用本发明的组合物的冻干制剂。此类重建液体包括注射用水、生理盐水和其它输注液体。重建液体的体积可以随意图的用途等而变化，没有特别限制，并且适当地比冻干前的体积大0.5至2倍或者不超过500mL。

期望通过考虑以下因素控制要施用的本发明的组合物的剂量：含有的本发明的寡聚物的类型和剂量形式；患者的状况，包括年龄、体重等；施用路径；和疾病的特征和程度。以本发明的反义寡聚物的量计算的每日剂量一般在0.1mg至10g/人，且优选1mg至1g/人的范围中。此数字范围有时可以随靶标疾病的类型、施用路径和靶分子而变化。因此，比该范围低的剂量在一些情况下可以是足够的，并且相反，有时可以需要比该范围高的剂量。可以以每日一次或几次或者以一天至几天的时间间隔施用组合物。

在本发明的组合物的又一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含能够表达本发明的寡核苷酸的载体和上文描述的载体。此类表达载体可以是能够表达本发明的多个寡核苷酸的载体。可以用药学可接受添加剂配制所述组合物，就像在含有本发明的寡聚物的本发明的组合物的情况下一样。组合物中的表达载体的浓度可以随载体的类型等而变化，并且适当地在0.1nM至100μM的范围中，优选在100nM至10μM的范围中。组合物中含有的表达载体和载体(载体/表达载体)的重量比可以随表达载体的特性、载体的类型等而变化，并且适当地在0.1至100的范围中，优选在0.1至10的范围中。组合物中含有的载体的含量与含有本发明的寡聚物的本发明的组合物的情况下相同，并且其制备方法也与在本发明的组合物的情况下相同。

在下文中，本发明通过参考以下实施例和测试例更加详细地描述，但是不应视为限于此。

实施例

[参照例1]

加载到氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧基嘧啶-1- 基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧基丁酸

步骤1：4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧基丁酸的制备

在氩气气氛下，在50mL二氯甲烷中悬浮3.44g N-{1-[(2R，6S)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺和1.1g 4-二甲基氨基嘧啶(4-DMAP)，并且将0.90g琥珀酸酐添加到悬浮液，接着在室温搅拌3小时。对反应混合物添加10mL甲醇，并且在减压下浓缩混合物。使用乙酸乙酯和0.5M磷酸二氢钾水溶液提取残留物。用0.5M磷酸二氢钾水溶液、水和盐水以提及的次序序贯清洗所得的有机层。通过硫酸钠干燥所得的有机层，并且在减压下浓缩以给出4.0g产物。

步骤2：加载到氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸的制备

在200mL嘧啶(脱水)中溶解4.0g 4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸后，对溶液添加0.73g 4-DMAP和11.5g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。然后，对混合物添加25.0g氨基聚苯乙烯树脂Primer support 200amino(GE Healthcare Japan Co.，Ltd.，17-5214-97制造)和8.5mL三乙胺，接着在室温摇动4天。在完成反应后，通过过滤取出树脂。用嘧啶、甲醇和二氯甲烷以提及的次序序贯清洗所得的树脂，并且在减压下干燥。对所得的树脂添加200mL四氢呋喃(脱水)、15mL乙酸酐和15mL 2，6-二甲基吡啶，并且在室温摇动2小时。通过过滤取出树脂，序贯用嘧啶、甲醇和二氯甲烷以提及的次序清洗，并且在减压下干燥以给出26.7g产物。

通过使用已知的方法测量409nm的UV吸光度从每g树脂的三苯甲基的摩尔量测定产物的加载量。树脂的加载量是192.2μmol/g。

UV测量的条件

装置：U-2910(Hitachi，Ltd.)

溶剂：甲磺酸

波长：265nm

ε值：45000

根据实施例1、2和下文参照例1中的描述，合成以表1中的PMO No.1-3所示的PMO。将合成的PMO在注射用水(由Otsuka Pharmaceutical Factory，Inc.制造)中溶解。

[表1]

[实施例1]

PMO No.1

用过滤嘴在柱中填充氨基聚苯乙烯树脂(参照例1)上支持的0.2g 4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(26μmol)。然后，使用核酸合成仪(AKTA Oligopilot 10plus)开始下文显示的合成循环。在每个偶联循环中添加期望的吗啉代单体化合物以给出标题化合物的核苷酸序列(参见下文表2)。

[表2]

使用的去封闭溶液是含有3％(w/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液。使用的中和和清洗溶液是通过在含有35％(v/v)乙腈的二氯甲烷中溶解N，N-二异丙基乙胺为10％(v/v)和四氢呋喃为5％(v/v)获得的溶液。使用的偶联溶液A是通过在四氢呋喃中溶解吗啉代单体化合物为0.10M获得的溶液。使用的偶联溶液B是通过在乙腈中溶解N，N-二异丙基乙胺为20％(v/v)和四氢呋喃为10％(v/v)获得的溶液。使用的帽化溶液是通过在乙腈中溶解20％(v/v)乙酸酐和30％(v/v)2，6-二甲基吡啶获得的溶液。

从反应容器回收加载有上文合成的PMO的氨基聚苯乙烯树脂，并且在减压下在室温干燥至少2小时。将加载到氨基聚苯乙烯树脂上的干燥的PMO注入反应容器，并且对其添加5mL 28％氨水-乙醇(1/4)。在55℃搅拌混合物15小时。通过过滤分离氨基聚苯乙烯树脂，并且用1mL水-乙醇(1/4)清洗。在减压下浓缩所得的滤液。在20mM乙酸-三乙胺缓冲液(TEAA缓冲液)和10ml乙腈(4/1)的10mL溶剂混合物中溶解所得的残留物，并且通过膜滤器过滤。通过反相HPLC纯化获得的滤液。使用的条件如下文表3中显示。

[表3]

分析每个级份，并且将目的产物回收，并且在减压下浓缩。对浓缩的残留物添加0.5mL 2M磷酸水溶液，并且搅拌混合物15分钟。此外，添加2mL 2M氢氧化钠水溶液以使混合物为碱性，接着通过膜滤器(0.45μm)过滤。

通过阴离子交换树脂柱纯化含有目的产物的所得的水溶液。使用的条件如下文表4中显示。

[表4]

分析每个级份(在HPLC上)，并且以水溶液获得目的产物。对所得的水溶液添加0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)进行中和。接着，通过在下文表5中描述的条件下的反相HPLC使获得的混合物去矿化(demineralize)。

[表5]

回收目的产物，并且在减压下浓缩混合物。在水中溶解所得的残留物。将获得的水溶液冷冻干燥以给出白色棉状固体的目的化合物。

ESI-TOF-MS 计算：10021.46

发现：10021.91

[实施例2]

PMO No.2

根据实施例1的方案制备标题化合物。

ESI-TOF-MS 计算：9916.71

发现：9916.43

[比较例1]

PMO No.3

根据实施例1的方案制备标题化合物。

ESI-TOF-MS 计算：9949.46

发现：9949.41

[测试例1]

体外测定法

使用本发明的反义寡聚物PMO No.1和2和反义寡聚物PMO No.3实施实验。下文表6中给出了各种反义寡聚物的序列。

[表6]

核苷酸序列	PMO No.
		CGGTAAGTTCTGTCCTCAAGGAAGATGGCA	1
CTCATACCTTCTGCTTCAAGGAAGATGGCA	2
		CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG	3

在Nucleofector II(Lonza)上使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L，用0.3、1、3、10μM本发明的寡聚物PMO No.1和2和反义寡聚物PMO No.3转染3.5x 10⁵个RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞系)。使用程序T-030。

在转染后，在37℃和5％CO₂的条件下在2mL含有10％胎牛血清(FCS)(由Invitrogen制造)的Eagle基本必需培养基(EMEM)(由Sigma制造，下文中相同)中将细胞培养三天。用PBS(由Nissui制造，下文中相同)清洗细胞，并且将500μl ISOGEN II(由NipponGene制造)添加到细胞。在让细胞于室温静置几分钟以裂解细胞后，在Eppendorf管中收集裂解物。根据ISOGEN所附的方案提取总RNA。使用NanoDrop ND-1000(由LMS制造)测定总RNA提取物的浓度。

使用Qiagen One Step RT-PCR试剂盒(由Qiagen制造)用400ng提取的总RNA实施一步RT-PCR。根据试剂盒所附的方案制备反应溶液。PTC-100(由MJ Research制造)用作热循环仪。使用的RT-PCR程序如下。

50℃，30min：逆转录反应

95℃，15min：热变性

[94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，60秒]x 35个循环：PCR扩增

72℃，10min：最终延伸

下文给出了用于RT-PCR的正向引物和反向引物的核苷酸序列。

正向引物：5’-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’(SEQ ID NO：5)

反向引物：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’(SEQ ID NO：6)

反应产物，使用Bioanalyzer(由Agilent Technologies，Inc.制造)分析1μL上述RT-PCR。测量具有外显子51跳跃的条带的多核苷酸水平“A”和没有外显子51跳跃的条带的多核苷酸水平“B”。基于“A”和“B”的这些测量数值，通过以下公式测定跳跃效率：

跳跃效率(％)＝A/(A+B)×100

实验结果

图1中显示了结果。此实验揭示了本发明的反义寡聚物可以比反义寡聚物PMONo.3以明显更高的效率引起外显子51跳跃。

[实施例3]

PMO No.4-6

根据实施例1的方案制备标题化合物。下文给出了各个反义寡聚物的序列。

表7

[实施例4]

以SEQ ID NO：9至33所示的2′-O-甲氧基-硫代磷酸酯

通过外包给Japan Bio Service Co.制备标题的各种反义寡聚物。表8中给出了各种反义寡聚物的序列。

[表8]

工业适用性

测试例中的实验结果证明了本发明的寡聚物在RD细胞中以明显较高的效率引起外显子51跳跃。因此，本发明的寡聚物对于治疗DMD非常有用。

Claims

1.由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列组成的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物。

2.权利要求1的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，所述反义寡聚物是寡核苷酸。

3.根据权利要求2的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，其中构成所述寡核苷酸的至少一个核苷酸的糖部分和/或磷酸结合区被修饰。

4.根据权利要求3的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，其中构成所述寡核苷酸的至少一个核苷酸的糖部分是核糖，其中2'-OH基团被选自下组的任一个替换：OR、R、R'、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br和I，其中R是烷基或芳基，并且R'是亚烷基。

5.根据权利要求3的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，其中构成所述寡核苷酸的至少一个核苷酸的磷酸结合区是选自下组的任一个：硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、氨基磷酸酯键和硼烷磷酸酯(boranophosphate)键。

6.根据权利要求1的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，所述反义寡聚物是吗啉代寡聚物。

7.根据权利要求6的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，所述反义寡聚物是二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物。

8.根据权利要求6的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物，其中所述5'末端是以下化学式(1)至(3)中的任一个：

9.用于治疗肌肉营养不良的药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物作为活性成分。

10.根据权利要求9的药物组合物，其包含药学可接受载体。

11.根据权利要求1至8中任一项的反义寡聚物或其药学可接受盐或水合物在制备用于治疗肌肉营养不良的药物组合物中的用途。