BR112016020618B1 - Oligômero antissentido, composição farmacêutica, e, uso de um oligômero antissentido - Google Patents

Abstract

OLIGÔMERO ANTISSENTIDO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DISTROFIA MUSCULAR, E, USO DE UM OLIGÔMERO ANTISSENTIDO. É provida uma droga que permite o salto de éxon 51 altamente eficiente no gene da distrofia humana. A presente invenção provê um oligômero antissentido que permite que o éxon 51 no gene da distrofia humana seja saltado.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um oligômero antissentido que causa o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana, e uma composição farmacêutica compreendendo o oligômero.

FUNDAMENTOS

[0002] Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais frequente de distrofia muscular progressiva hereditária que afeta um em cerca de 3.500 meninos recém-nascidos. Embora as funções motoras sejam raramente diferentes de seres humanos saudáveis na primeira e segunda infância, fraqueza muscular é observada em crianças em torno dos 4 a 5 anos de idade. Então, fraqueza muscular progride para a perda da ambulação em torno dos 12 anos de idade e morte devido a insuficiência cardíaca ou respiratória em torno dos vinte anos. DMD é um distúrbio grave. Atualmente, não existe uma terapia eficaz disponível para DMD, sendo fortemente desejado o desenvolvimento de um novo agente terapêutico.

[0003] DMD é conhecida como sendo causada por uma mutação no gene da distrofina. O gene da distrofina está localizado no cromossoma X e é um gene grande consistindo em 2,2 milhões de pares de nucleotídeos do DNA. DNA é transcrito em precursores de mRNA, e íntrons são removidos por emenda para sintetizar mRNA de 11,058 bases, em que 79 éxons estão unidos juntos. Este mRNA é traduzido em 3.685 aminoácidos para produzir a proteína distrofina. A proteína distrofina está associada com a manutenção da estabilidade da membrana em células musculares e necessária para tornar células musculares menos frágeis. O gene da distrofina de pacientes com DMD contém uma mutação e, assim, a proteína distrofina, que é funcional em células do músculo, é raramente expressada. Portanto, a estrutura de células do músculo não pode ser mantida no corpo dos pacientes com DMD, levando a um grande influxo de íons cálcio nas células musculares. Consequentemente, uma resposta de tipo inflamatória ocorre para promover fibrose de modo que células musculares podem ser regeneradas com dificuldade.

[0004] Distrofia muscular de Becker (BMD) também é causada por uma mutação no gene da distrofina. Os sintomas envolvem fraqueza muscular acompanhada por atrofia de músculo, mas são tipicamente suaves e lentos na progressão da fraqueza muscular, quando comparado com DMD. Em muitos casos, seu início ocorre na idade adulta. Diferenças nos sintomas clínicos entre DMD e BMD são consideradas como residindo se o quadro de leitura para aminoácidos na tradução do mRNA da distrofina na proteína distrofina for rompido pela mutação ou não (Documento não patentário 1). Mais especificamente, em DMD, a presença de mutação desloca o quadro de leitura de aminoácidos de modo que a expressão da proteína distrofina funcional é abolida, ao passo que, em BMD, a proteína distrofina, que funciona embora imperfeitamente, é produzida porque o quadro de leitura de aminoácidos é conservado, enquanto uma parte dos éxons é deletada pela mutação.

[0005] O salto de éxons é esperado para servir como um método para tratar DMD. Este método envolve modificação de emendas para restaurar o quadro de leitura de aminoácidos do mRNA da distrofina e induzir a expressão da proteína distrofina tendo a função parcialmente restaurada (Documento não patentário 2). A parte de sequência de aminoácidos, que é um alvo para o salto do éxon, será perdida. Por esta razão, a proteína distrofina expressada por este tratamento torna-se mais curta do que o normal, mas, uma vez que o quadro de leitura de aminoácidos é mantido, a função para estabilizar as células dos músculos é parcialmente retida. Consequentemente, espera-se que o salto de éxon irá levar DMD aos sintomas similares aos da BMD, que é mais suave. A abordagem de salto de éxon passou em testes com animais usando camundongos ou cães e agora está atualmente avaliada em testes clínicos com pacientes humanos com DMD.

[0006] O salto de um éxon pode ser induzido por ligação de ácidos nucleicos antissentido alvejando quer o sítio de emenda 5’ ou 3’ ou ambos os sítios, ou sítios internos do éxon. Um éxon só será incluído no mRNA quando ambos os sítios de emenda do mesmo são reconhecidos pelo complexo ‘spliceossoma’. Assim, o salto de éxon pode ser induzido por alvejamento dos sítios de emenda com ácidos nucleicos antissentido. Além disso, a ligação de uma proteína SR a um intensificador de emenda exônico (ESE) é considerada necessária para um éxon a ser reconhecido pelo mecanismo de emenda. Portanto, salto de éxon também pode ser induzido por alvejamento de ESE.

[0007] Uma vez que uma mutação no gene da distrofina pode variar dependendo de pacientes DMD, ácidos nucleicos antissentido devem ser projetados com base no sítio ou tipo de mutação genética respectivo. No passado, ácidos nucleicos antissentido, que induzem o salto de éxon para todos os 79 éxons, foram produzidos por Steve Wilton et al., University of Western Australia (Documento não patentário 3), e ácidos nucleicos antissentido que induzem o salto de éxon para 39 éxons foram produzidos por Annemieke Aartsma-Rus, et al., Holanda (Documento não patentário 4).

[0008] Considera-se que aproximadamente 13% de todos os pacientes com DMD podem ser tratados por salto do éxon 51 (a seguir referido como “éxon 51”). Nos últimos anos, várias organizações de pesquisa relataram, em seus estudos, onde o éxon 51 no gene da distrofina estava alvejado para o salto de éxon (documentos patentários 1 a 6; documentos não patentários 5 a 6). No entanto, uma técnica para o salto do éxon 51 com uma eficiência elevada ainda não foi estabelecida.

DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR Documento patentário

[0009] Documento patentário 1: Publicação internacional WO 2004/048570

[00010] Documento patentário 2: Publicação internacional WO 2002/024906

[00011] Documento patentário 3: Publicação internacional WO 2010/048586

[00012] Documento patentário 4: Publicação internacional WO 2010/050801

[00013] Documento patentário 5: US 2010/0168212

[00014] Documento não patentário 1: Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: p. 90-95

[00015] Documento não patentário 2: Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p. 167-172

[00016] Documento não patentário 3: Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

[00017] Documento não patentário 4: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77

[00018] Documento não patentário 5: Aoki Y., et al., Molecular therapy 2010: 18: p,1995-2005

[00019] Documento não patentário 6: Nakano S., et al., Pediatr Int. 2011: 53: 524-429

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[00020] Sob as circunstâncias acima, oligômeros antissentido que induzem salto do éxon 51 no gene da distrofina com uma alta eficiência e terapêutica para distrofia muscular compreendendo oligômeros têm sido desejados.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

[00021] Como um resultado de estudos detalhados sobre os conteúdos técnicos dos documentos acima e a estrutura do gene da distrofina, os presentes inventores descobriram que o salto do éxon 51 pode ser induzido com uma elevada eficiência por administração do oligômero antissentido tendo as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NO: 1 e 2. Com base nesta descoberta, os presentes inventores realizaram a presente invenção.

[00022] Isto é, a presente invenção é como a seguir. [1] Um oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (a) a (d) abaixo: (a) um oligômero antissentido compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2; (b) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo deleção, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 5 nucleotídeos na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2, e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana; (c) um oligômero antissentido que tem uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 80% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana; e (d) um oligômero antissentido que hibridiza sob condições estringentes para um oligonucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana. [2] Um oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (e) a (h) abaixo: (e) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2; (f) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo deleção, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 3 nucleotídeos na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2, e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana; (g) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 80% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana; e (h) um oligômero antissentido que hibridiza sob condições estringentes elevadas em oligonucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana. [3] Um oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (i) e (j) abaixo: (i) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2; e (j) um oligômero antissentido que tem uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 90% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana. [4] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [3] acima, que é um oligonucleotídeo. [5] O oligômero antissentido de acordo com [4] acima, em que a porção de açúcar e/ou a região de ligação a fosfato de, pelo menos, um nucleotídeo constituindo o oligonucleotídeo é modificada. [6] O oligômero antissentido de acordo com [4] ou [5] acima, em que a porção de açúcar de, pelo menos, um nucleotídeo constituindo o oligonucleotídeo é uma ribose em que o grupo 2’-OH é substituído por qualquer um selecionado dentre o grupo consistindo em OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R é uma alquila ou uma arila e R’ é um alquileno). [7] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [4] a [6] acima, em que a região de ligação a fosfato de, pelo menos, um nucleotídeo constituindo o oligonucleotídeo é qualquer uma selecionada dentre o grupo consistindo em uma ligação fosforotioato, uma ligação fosforoditioato, uma ligação alquilfosfonato, uma ligação fosforoamidato e uma ligação boranofosfato. [8] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [3] acima, que é um oligômero morfolino. [9] O oligômero antissentido de acordo com [8] acima, em que a porção do anel morfolina, a região de ligação a fosfato, 3’-extremidade e /ou 5’-extremidade de, pelo menos, um morfolino constituindo o oligômero morfolino é modificado. [10] O oligômero antissentido de acordo com [9] ou [10] acima, em que a região de ligação a fosfato de, pelo menos, um morfolino constituindo o oligômero morfolino é qualquer um selecionado dentre uma ligação fosforodiamidato, uma ligação fosforotioato, uma ligação fosforoditioato, uma ligação alquilfosfonato, uma ligação fosforoamidato e uma ligação boranofosfato. [11] O oligômero antissentido de acordo com [10] acima, que é um oligômero morfolino fosforodiamidato. [12] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [9] a [11] acima, em que a extremidade 5’ é qualquer uma das fórmulas químicas (1) a (3) abaixo:

[13] Uma composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular, compreendendo como um ingrediente ativo o oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [12] acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo. [14] A composição farmacêutica de acordo com [13] acima, compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável. [15] Um método para tratamento de distrofia muscular, que compreende a administração, a um paciente com distrofia muscular, do oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [12] acima ou da composição farmacêutica de acordo com [13] ou [14] acima. [16] O método para tratamento de acordo com [15] acima, em que o paciente com distrofia muscular é um paciente com deleções de nucleotídeos dentro de éxons 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 ou 47-50. [17] O método para tratamento de acordo com [15] ou [16] acima, em que o paciente é um humano. [18] O uso do oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [12] acima na fabricação da composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular. [19] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [12] acima, para uso no tratamento de distrofia muscular. [20] O oligômero antissentido de acordo com [19] acima, em que o paciente com distrofia muscular no referido tratamento é um paciente com deleções de nucleotídeos dentro de éxons 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 ou 47-50. [21] O oligômero antissentido de acordo com [19] ou [20] acima, em que o paciente é um humano.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[00023] O oligômero antissentido da presente invenção pode induzir o salto do éxon 51 no gene da distrofia humana com elevada eficiência. Também, os sintomas da distrofia muscular de Duchenne podem ser aliviados de um modo eficaz por administração da composição farmacêutica da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00024] Figura 1 mostra a eficiência do salto do éxon 51 no gene da distrofia humana de linhagem de células de rabdomiossarcoma humano (células RD).

MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[00025] Aqui a seguir, a presente invenção é descrita em detalhes. As modalidades descritas abaixo são destinadas a serem apresentadas a título de exemplo apenas para descrever a invenção, mas não limitadas apenas às seguintes modalidades. A presente invenção pode ser implementada de vários modos sem sair da essência da invenção.

1. Oligômero antissentido

[00026] A presente invenção fornece o oligômero antissentido (a seguir referido como o “oligômero antissentido da presente invenção”) que causa o salto do éxon 51 no gene da distrofia humana com uma elevada eficiência.

[Éxon 51 no gene da distrofina humana]

[00027] Na presente invenção, o termo “gene” é destinado a significar um gene genômico e também incluir cDNA, precursor de mRNA e mRNA. Preferivelmente, o gene é precursor de mRNA, isto é, pre-mRNA.

[00028] No genoma humano, o gene da distrofina humana se localiza no locus Xp21,2. O gene da distrofina humana tem um tamanho de 2,2 milhões de pares de nucleotídeo e é o maior gene dentre os genes humanos conhecidos. No entanto, as regiões de codificação do gene da distrofina humana são apenas de 14kb, distribuídas como 79 éxons em todo o gene da distrofina humana (Roberts, RG, et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). O pre-mRNA, que é o transcrito do gene da distrofina humana, sofre uma emenda (splicing) para gerar mRNA maduro de 14 kb. A sequência de nucleotídeos de gene tipo selvagem humano da distrofina é conhecida (Número de Acesso ao GeneBank NM_004006).

[00029] A sequência de nucleotídeos de éxon 51 no gene da distrofina humana de tipo selvagem é representada por SEQ ID NO: 3.

[Oligômero antissentido]

[00030] O oligômero antissentido da presente invenção é projetado para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana, assim modificando a proteína codificada pelo tipo DMD de gene da distrofina no tipo BMD da proteína distrofina. Assim, éxon 51 no gene da distrofina que é o alvo do salto do éxon pelo oligômero antissentido inclui ambos os tipos selvagem e mutante.

[00031] O oligômero antissentido da presente invenção é especificamente o oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (a) a (d) abaixo. (a) um oligômero antissentido compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2; (b) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo deleção, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 5 nucleotídeos na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2, e tem uma atividade para causar o salto do 51° éxon no gene da distrofia humana; (c) um oligômero antissentido que tem uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 80% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana; e (d) um oligômero antissentido que hibridiza sob condições estringentes para um oligonucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana.

[00032] Os oligômeros antissentido de (b) a (d) são mutantes do oligômero antissentido de (a) em particular e são destinados a corresponder a mutações do gene da distrofina dos pacientes, por exemplo, polimorfismo.

[00033] Como outra modalidade, o oligômero antissentido da presente invenção é especificamente o oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (k) a (n) abaixo. (k) Um oligômero antissentido compreendendo à sequência de nucleotídeos mostrada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33; (l) Um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo deleção, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 5 nucleotídeos na sequência de nucleotídeos mostrada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33, e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana; (m) Um oligômero antissentido que tem uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 80% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana; e (h) Um oligômero antissentido que hibridiza sob condições estringentes para um oligonucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos mostrada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana.

[00034] Os oligômeros antissentido de (l) a (n) são mutantes do oligômero antissentido de (k) em particular e são destinados a corresponder a mutações do gene da distrofina dos pacientes, por exemplo, polimorfismo.

[00035] Também, o oligômero antissentido da presente invenção é o oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (o) a (r) abaixo. (o) Um oligômero antissentido que consiste da sequência de nucleotídeos mostrada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33; (p) Um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo deleção, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 3 nucleotídeos na sequência de nucleotídeos mostrada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33, e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana; (q) Um oligômero antissentido que tem uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 80% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana; e (r) Um oligômero antissentido que hibridiza sob condições estringentes elevadas para um oligonucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos mostrada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana.

[00036] Além disso, o oligômero antissentido da presente invenção é o oligômero antissentido que é selecionado dentre um grupo consistindo em (i) e (j) abaixo: (i) um oligômero antissentido consistindo em uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33; ou (j) um oligômero antissentido que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 90% de identidade com uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 a 33 e tem uma atividade para causar o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana.

[00037] Como usado aqui, o termo “oligômero antissentido que hibridiza sob condições estringentes” refere-se a, por exemplo, um oligômero antissentido obtido por hibridização de colônias, hibridização de placas, hibridização Southern ou similares, usando como uma sonda todo ou parte de um oligonucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de, por exemplo, SEQ ID NO: 1. O método de hibridização que pode ser usado inclui métodos descritos em, por exemplo, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001,” “Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997,” etc.

[00038] Como usado aqui, o termo “condições estringentes” pode ser qualquer uma das condições estringentes baixas, condições estringentes moderadas ou condições estringentes elevadas. O termo “condição estringente baixa” é, por exemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,5% SDS, 50% formamida a 32°C. O termo “condição estringente moderada” é, por exemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,5% SDS, 50% formamida a 42°C, ou 5x SSC, 1% SDS, 50mM Tris-HCl (pH 7,5), 50% formamida a 42°C. O termo “condição estringente elevada” é, por exemplo, (1) 5x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,5% SDS, 50% formamida a 50°C , (2) 0,2x SSC, 0,1% SDS a 60°C, (3) 0,2x SSC, 0,1% SDS a 62°C, (4) 0,2x SSC, 0,1% SDS a 65°C, ou (5) 0,1x SSC, 0,1% SDS a 65°C, mas não é assim limitado. Sob estas condições, oligômero antissentido com maior homologia são esperados para serem obtidos de modo eficiente em maiores temperaturas, embora fatores múltiplos estejam envolvidos na estringência da hibridização incluindo temperatura, concentração da sonda, comprimento da sonda, força iônica, concentração de sal e outros, e os versados na técnica podem selecionar de modo aproximado estes fatores para alcançar uma estringência similar.

[00039] Quando kits comercialmente disponíveis são usados para hibridização, por exemplo, pode ser usado um sistema de rotulação e detecção direta tipo Alkphos (GE Healthcare). Neste caso, de acordo com o protocolo em anexo, após cultivo com uma sonda rotulada durante a noite, a membrana é lavada com um tampão de lavagem primário contendo 0,1% (p/v) SDS a 55°C, assim detectando o oligômero antissentido hibridizado. Alternativamente, quando a sonda é rotulada com digoxigenina (DIG) usando um reagente comercialmente disponível (por exemplo, um PCR Labelling Mix (Roche Diagnostics), etc.) na produção de uma sonda com base em toda ou parte da sequência complementar para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, hibridização pode ser detectada com um kit de detecção de ácido nucleico DIG (Roche Diagnostics).

[00040] Além do oligômero antissentido descrito acima, outros oligômeros antissentido que podem ser hibridizados incluem oligômeros antissentido tendo 90% ou maior, 91% ou maior, 92% ou maior, 93% ou maior, 94% ou maior, 95% ou maior, 96% ou maior, 97% ou maior, 98% ou maior, 99% ou maior, 99,1% ou maior, 99,2% ou maior, 99,3% ou maior, 99,4% ou maior, 99,5% ou maior, 99,6% ou maior, 99,7% ou maior, 99,8% ou maior, e 99,9% ou maior identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 2, como calculado por software de pesquisa de homologia como FASTA e BLAST usando os parâmetros padrão.

[00041] A identidade entre sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)) ou algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) por Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Programas chamados blastn, blastx, tblastn e tblastx com base em algoritmo BLAST foram desenvolvidos (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Quando uma sequência de nucleotídeos é sequenciada usando blastn, os parâmetros são, por exemplo, escore=100 e comprimento da palavra =12. Quando os programas BLAST e Gapped BLAST são usados, os parâmetros padrão para cada programa são empregados.

[00042] O termo “causa o salto de éxon 51 no gene da distrofia humana” é destinado a significar que, por ligação do oligômero antissentido da presente invenção ao sítio correspondendo ao éxon 51 do transcrito (por exemplo, pre-mRNA) do gene da distrofina humana, por exemplo, a sequência de nucleotídeos correspondendo à extremidade 5’ de éxon 53 é emendada na sequência de nucleotídeos correspondendo à extremidade 3’ de éxon 50 em pacientes DMD com deleção de éxon 52 quando o transcrito sofre emenda, assim resultando na formação de um mRNA maduro que é livre de deslocamento do quadro de códons.

[00043] Aqui, o termo “ligação” descrito acima é destinado a significar que quando o oligômero antissentido da presente invenção é misturado com o transcrito de gene da distrofina humana, ambos são hibridizados sob condições fisiológicas para formar um ácido nucleico de fita dupla. O termo “sob condições fisiológicas” refere-se a condições fixadas para imitar o ambiente in vivo em termos de pH, composição de sal e temperatura. As condições são, por exemplo, 25 a 40°C, preferivelmente 37°C, pH 5 a 8, preferivelmente pH 7,4 e 150 mM de concentração de cloreto de sódio.

[00044] Se o salto do éxon 51 no gene da distrofia humana é causado ou não, pode ser confirmado por introdução do oligômero antissentido da presente invenção em uma célula de expressão de distrofina (por exemplo, células de rabdomiossarcoma humanas), amplificando a região circundando o éxon 51 de mRNA do gene da distrofina humana a partir do RNA total da célula de expressão da distrofina por RT-PCR e realizando PCR nested ou análise de sequência sobre o produto amplificado por PCR.

[00045] A eficiência de salto pode ser determinada como a seguir. O mRNA para o gene da distrofina humana é coletado a partir de células de teste; no mRNA, o nível de polinucleotídeo “A” da banda onde o éxon 51 é saltado e o nível do polinucleotídeo “B” da banda onde o éxon 51 não é saltado são medidos. Usando estes valores de medição de “A” e “B,” a eficiência é calculada pela seguinte equação: Eficiência de salto (%) = A/(A + B) x 100

[00046] Preferivelmente, o oligômero antissentido da presente invenção causa o salto de éxon 51 com a eficiência de 10% ou maior, 20% ou maior, 30% ou maior, 40% ou maior, 50% ou maior, 60% ou maior, 70% ou maior, 80% ou maior, e 90% ou maior.

[00047] Para o cálculo da eficiência de salto, a Publicação Internacional WO2012/029986 pode ser consultada.

[00048] O oligômero antissentido da presente invenção inclui, por exemplo, um oligonucleotídeo, oligômero morfolino ou ácido nucleico peptídeo (PNA), tendo um comprimento de 16 a 35 nucleotídeos. O comprimento é preferivelmente de 19 a 32, de 20 a 31, 21 ou 30 nucleotídeos e oligômeros morfolino são preferidos.

[00049] O oligonucleotídeo descrito acima (a seguir referido como “o oligonucleotídeo da presente invenção”) é o oligômero antissentido da presente invenção composto de nucleotídeos como constituintes de unidade. Tais nucleotídeos podem ser qualquer um de ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e nucleotídeos modificados.

[00050] O nucleotídeo modificado refere-se a um tendo nucleobases totalmente ou parcialmente modificadas, porções de açúcar e/ou região de ligação a fosfatos, que constituem o ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo.

[00051] Na presente invenção, a nucleobase inclui, por exemplo, adenina, guanina, hipoxantina, citosina, timina, uracila, e bases modificadas das mesmas. Exemplos de tais bases modificadas incluem, mas não limitadas a, pseudouracila, 3-metiluracila, di-hidrouracila, 5-alquilcitosinas (por exemplo, 5-metilcitosina), 5-alquiluracilas (por exemplo, 5-etiluracila), 5- halouracilas (5-bromouracila), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidinas (6- metiluracila), 2-tiouracila, 4-tiouracila, 4-acetilcitosina, 5-(carboxi- hidroximetil) uracila, 5’-carboximetilaminometil-2-tiouracila, 5- carboximetilaminometiluracila, 1-metiladenina, 1-metil-hipoxantina, 2,2- dimetilguanina, 3-metilcitosina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, 5-metilamino metiluracila, 5-metilcarbonilmetiluracila, 5-metiloxiuracila, 5-metil-2- tiouracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, 2- tiocitosina, purina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, isoguanina, indol, imidazol, xantina, etc.

[00052] Modificação da porção de açúcar pode incluir, por exemplo, modificações na 2’-posição de ribose e modificações de outras posições do açúcar. A modificação na 2’-posição de ribose inclui substituição de 2’-OH de ribose com OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ou I, em que R representa uma alquila ou uma arila e R’ representa um alquileno.

[00053] A modificação para as outras posições do açúcar inclui, por exemplo, substituição de O na 4’ posição de ribose ou desoxirribose com S, ligando entre as 2’ e 4’ posições do açúcar, por exemplo, LNA (ácido nucleico travado) ou ENA (ácidos nucleicos ligados em ponte a 2’-O,4’-C-), mas não é assim limitado.

[00054] A modificação da região de ligação a fosfato inclui, por exemplo, a modificação de substituição de ligação fosfodiéster com ligação fosforotioato, ligação fosforoditioato, ligação alquil fosfonato, ligação fosforoamidato ou ligação boranofosfato (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160) (ver, por exemplo, republicações internas no Japão dos pedidos PCT 2006/129594 e 2006/038608).

[00055] Nesta invenção, a alquila é preferivelmente uma alquila linear ou ramificada tendo 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n- pentila, isopentila, neopentila, terc-pentila, n-hexila e isso-hexila. A alquila pode ser opcionalmente substituída. Exemplos de tais substituintes são um halogênio, um alcóxi, ciano e nitro. A alquila pode ser substituída com 1 a 3 substituintes.

[00056] Nesta invenção, a cicloalquila é preferivelmente uma cicloalquila tendo 5 a 12 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, ciclo-octila, ciclodecila e ciclododecila.

[00057] Nesta invenção, o halogênio inclui flúor, cloro, bromo e iodo.

[00058] O alcóxi é um alcóxi linear ou ramificada tendo 1 a 6 átomos de carbono como metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, isobutóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, n-pentilóxi, isopentilóxi, n-hexilóxi, iso-hexilóxi, etc. Dentre outras, um alcóxi tendo 1 a 3 átomos de carbono é preferido.

[00059] Nesta invenção, a arila é preferivelmente uma arila tendo 6 a 10 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem fenila, α-naftila e β- naftila. Dentre outras, fenila é preferida. A arila pode ser opcionalmente substituída. Exemplos de tais substituintes são uma alquila, um halogênio, um alcóxi, ciano e nitro. A arila pode ser substituída com um a três de tais substituintes.

[00060] Nesta invenção, o alquileno é preferivelmente um alquileno linear ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, 2-(etil) trimetileno e 1-(metil) tetrametileno.

[00061] Nesta invenção, a acila inclui uma alcanoíla ou aroíla linear ou ramificada. Exemplos da alcanoíla incluem formila, acetila, 2-metilacetila, 2,2-dimetilacetila, propionila, butirila, isobutirila, pentanoíla, 2,2- dimetilpropionila, hexanoíla, etc. Exemplos da aroíla incluem benzoíla, toluoíla e naftoíla. A aroíla pode ser opcionalmente substituída em posições substituíveis e pode ser substituída com uma alquila(s).

[00062] Preferivelmente, o oligonucleotídeo da presente invenção é o oligômero antissentido da presente invenção contendo uma unidade constituinte representada por fórmula geral abaixo em que o grupo -OH na posição 2’ de ribose é substituído com metóxi e a região de ligação a fosfato é uma ligação fosforotioato:

em que Base representa uma nucleobase.

[00063] O oligonucleotídeo da presente invenção pode ser facilmente sintetizado usando vários sintetizadores automatizados (por exemplo, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativamente, a síntese também pode ser confiada a uma organização terceirizada (por exemplo, Promega Inc., Takara Co., ou Japan Bio Service Co.), etc.

[00064] O oligômero morfolino da presente invenção é o oligômero antissentido da presente invenção compreendendo a unidade constituinte representada por fórmula geral abaixo:

em que Base tem o mesmo significado que definido acima, e, W representa um grupo mostrado por qualquer um dos seguintes grupos:

em que X representa -CH2R1, -O-CH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 ou F; R1 representa H ou uma alquila; R2 e R3, que podem ser iguais ou diferentes, cada representa H, uma alquila, a cicloalquila ou uma arila; Y1 representa O, S, CH2 ou NR1; Y2 representa O, S ou NR1; Z representa O ou S.

[00065] Preferivelmente, o oligômero morfolino é um oligômero compreendendo a unidade constituinte representado por fórmula geral abaixo (oligômero morfolino fosforodiamidato (a seguir referido como “PMO”)).

em que Base, R2 e R3 têm o mesmo significado que definido acima.

[00066] O oligômero morfolino da presente invenção compreende um tendo nucleobases totalmente ou parcialmente modificadas, porções de anel morfolina, região de ligação a fosfatos, 3’-extremidade e /ou 5’-extremidade que constituem o oligômero morfolino.

[00067] A modificação da região de ligação a fosfato inclui, por exemplo, a modificação de substituição com ligação fosforodiamidato, ligação fosforotioato, ligação fosforoditioato, ligação alquilfosfonato, ligação fosforoamidato e ligação boranofosfato (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (ver, por exemplo, republicações internas no Japão de Pedidos PCT Nos. 2006/129594 e 2006/038608).

[00068] O oligômero morfolino pode ser produzido de acordo com, por exemplo, WO 1991/009033 ou WO 2009/064471. Em particular, PMO pode ser produzido pelo procedimento descrito em WO 2009/064471 ou produzido pelo processo mostrado abaixo.

[Método para produzir PMO]

[00069] Uma modalidade de PMO é, por exemplo, o composto representado por fórmula geral (I) abaixo (a seguir PMO (I)).

em que Base, R2 e R3 têm o mesmo significado que definido acima; e, n é um inteiro dado de 1 a 99, preferivelmente um inteiro dado de 24 a 34, 27 a 31 ou 28 a 30, preferivelmente 29.

[00070] PMO (I) pode ser produzido de acordo com um método conhecido, por exemplo, pode ser produzido realizando os procedimentos nas seguintes etapas.

[00071] Os compostos e reagentes usados nas etapas abaixo não são particularmente limitados, desde que eles sejam comumente usados para preparar PMO.

[00072] Também, as seguintes etapas podem ser todas realizadas pelo método de fase líquida, ou o método de fase sólida (usando sintetizadores manuais ou automatizados de fase sólida comercialmente disponíveis). Na produção de PMO, pelo método de fase sólida, é desejado usar sintetizadores automatizados em vista de procedimentos de operação simples e sínteses precisas.

(1) Etapa A:

[00073] O composto representado por fórmula geral (II) abaixo (a seguir, referido como Composto (II)) é reagido com um ácido para preparar o composto representado por fórmula geral (III) abaixo (a seguir referido como Composto (III)):

em que n, R2 e R3 têm o mesmo significado que definido acima; cada BP independentemente representa uma nucleobase que pode ser opcionalmente protegida; T representa tritila, monometoxitritila ou dimetoxitritila; e, L representa hidrogênio, uma acila ou um grupo representado por fórmula geral (IV) abaixo (a seguir referido como grupo (IV)).

[00074] Uma “nucleobase” para BP inclui a mesma “nucleobase” como em Base, desde que o grupo amino ou hidróxi na nucleobase mostrada por BP possa ser protegido.

[00075] Tal grupo protetor para amino não é particularmente limitado desde que seja usado como um grupo protetor para ácidos nucleicos. Exemplos específicos incluem benzoíla, 4-metóxibenzoíla, acetila, propionila, butirila, isobutirila, fenilacetila, fenóxiacetila, 4-terc-butilfenóxiacetila, 4- isopropilfenóxiacetila e (dimetilamino)metileno. Exemplos específicos do grupo protetor para o grupo hidróxi incluem 2-cianoetila, 4-nitrofenetila, fenilsulfoniletila, metilsulfoniletila e trimetilsililetila, e fenila, que pode ser substituído por 1 a 5 grupos de retirada de elétrons em posições substituíveis opcionais, difenilcarbamoíla, dimetilcarbamoíla, dietilcarbamoíla, metilfenilcarbamoíla, 1-pirolidinilcarbamoíla, morfolinocarbamoíla, 4-(terc- butilcarbóxi) benzila, 4-[(dimetilamino)carbóxi]benzila e 4- (fenilcarbóxi)benzila, (ver, por exemplo, WO 2009/064471).

[00076] O “carreador sólido” não é particularmente limitado desde que seja um carreador utilizável para a reação em fase sólida de ácidos nucleicos. É desejável que o carreador sólido tenha as seguintes propriedades: por exemplo, (i) ele seja fracamente solúvel em reagentes que podem ser usados para a síntese de derivados de morfolino ácido nucleico (por exemplo, diclorometano, acetonitrila, tetrazol, N-metilimidazol, piridina, anidrido acético, lutidina, ácido trifluoroacético); (ii) seja quimicamente estável para os reagentes utilizáveis para a síntese de derivados de morfolino ácido nucleico; (iii) ele possa ser quimicamente modificado; (iv) ele possa ser carregado com os derivados de morfolino ácido nucleico desejados; (v) ele tenha uma resistência suficiente para suportar pressão elevada através dos tratamentos; e (vi) ele tenha uma faixa uniforme de diâmetro de partícula e distribuição. Especificamente, poliestireno intumescível (por exemplo, resina de aminometil poliestireno a 1% divinilbenzeno reticulado (malha 200-400) (2,4-3,0 mmol/g) (fabricado por Tokyo Chemical Industry), resina poliestireno aniinonictiladoHCl [divinilbenzeno 1%, malha 100-200] (fabricado por Peptide Institute, Inc.)), poliestireno não intumescível (por exemplo, Primer Support (fabricado por GE Healthcare)), poliestireno fixado em cadeia PEG (por exemplo, resina NH2-PEG (fabricada por Watanabe Chemical Co.), resina TentaGel), vidro de poro controlado (vidro de poro controlado; CPG) (fabricado por, por exemplo, CPG), vidro de poro controlado por oxalila (ver, por exemplo, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), suporte de TentaGel - suporte derivatizado de aminopolietileno glicol (por exemplo, Wright et al., confere, Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), e um copolímero de Poros- poliestireno/divinilbenzeno.

[00077] Um “ligante” que pode ser usado é um ligante conhecido, geralmente usado para conectar ácidos nucleicos ou derivados de morfolino ácido nucleico. Exemplos incluem 3-aminopropila, succinila, 2,2’- dietanolsulfonila e um alquil amino de cadeia longa (LCAA).

[00078] Esta etapa pode ser realizada por reação de Composto (II) com um ácido.

[00079] O “ácido” que pode ser usado nesta etapa inclui, por exemplo, ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético e ácido tricloroacético. O ácido usado está apropriadamente em uma faixa de, por exemplo, 0,1 mols equivalentes para 1000 mols equivalentes com base em 1 mol de Composto (II), preferivelmente em uma faixa de 1 mol equivalente para 100 mols equivalentes, com base em 1 mol de Composto (II).

[00080] Uma amina orgânica pode ser usada em combinação com o ácido descrito acima. A amina orgânica não é particularmente limitada e inclui, por exemplo, trietilamina. A quantidade da amina orgânica usada está apropriadamente em uma faixa de, por exemplo, 0,01 mol equivalente para 10 mols equivalentes e, preferivelmente, em uma faixa de 0,1 mol equivalente a 2 mola equivalentes, com base em 1 mol do ácido.

[00081] Quando um sal ou mistura do ácido e da amina orgânica é usado nesta etapa, o sal ou mistura inclui, por exemplo, um sal ou mistura de ácido trifluoroacético e trietilamina, e mais especificamente, a mistura de 1 equivalente de trietilamina e 2 equivalentes de ácido trifluoroacético.

[00082] O ácido que pode ser usado nesta etapa também pode ser usado na forma de uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% a 30%. O solvente não é particularmente limitado desde que ele seja inerte para a reação, e inclui, por exemplo, diclorometano, acetonitrila, um álcool (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), água, ou uma mistura dos mesmos.

[00083] A temperatura de reação na reação descrita acima está preferivelmente em uma faixa de, por exemplo, 10°C a 50°C, mais preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e o mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C.

[00084] O tempo de reação pode variar dependendo de tipo do ácido usado e temperatura de reação, e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 24 horas em geral, e preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 5 horas.

[00085] Após completar esta etapa, a base pode ser adicionada, se necessário, para neutralizar o ácido que permaneceu no sistema. A “base” não é particularmente limitada e inclui, por exemplo, di-isopropilamina. A base também pode ser usada na forma de uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% (v/v) a 30% (v/v).

[00086] O solvente usado nesta etapa não é particularmente limitado desde que seja inerte para a reação, e inclui diclorometano, acetonitrila, um álcool (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), água, e uma mistura dos mesmos. A temperatura de reação é preferivelmente em uma faixa de, por exemplo, 10°C a 50°C, mais preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e o mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C.

[00087] O tempo de reação pode variar dependendo do tipo da base e temperatura de reação usadas, e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 24 horas em geral, e preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 5 horas.

[00088] Em Composto (II), o composto de fórmula geral (IIa) abaixo (aqui a seguir, Composto (IIa)), em que n é 1 e L é um grupo (IV), pode ser produzido pelo seguinte procedimento.

em que BP, T, ligante e carreador sólido têm o mesmo significado que definido acima.

Etapa 1:

[00089] O composto representado por fórmula geral (V) abaixo é reagido com um agente acilante para preparar o composto representado por fórmula geral (VI) abaixo (a seguir referido como Composto (VI)).

em que BP, T e ligante têm o mesmo significado que definido acima; e, R4 representa hidróxi, a halogênio, grupo carboxila ou amino.

[00090] Esta etapa pode ser realizada por procedimentos conhecidos para introduzir ligantes, usando Composto (V) como o material de partida.

[00091] Em particular, o composto representado por fórmula geral (VIa) abaixo pode ser produzido realizando o método conhecido como esterificação, usando Composto (V) e anidrido succínico.

em que BP e T têm o mesmo significado que definido acima.

Etapa 2:

[00092] Composto (VI) é reagido com um carreador sólido por um agente condensante para preparar Composto (IIa).

em que BP, R4, T, ligante e carreador sólido têm o mesmo significado que definido acima.

[00093] Esta etapa pode ser realizada usando Composto (VI) e um carreador sólido de acordo com um processo conhecido como reação de condensação.

[00094] Em Composto (II), o composto representado por fórmula geral (IIa2) abaixo em que n é 2 a 99 (preferivelmente um inteiro dado de 25 a 35, 28 a 32, ou 29 a 31, preferivelmente 30) e L é um grupo representado por fórmula geral (IV) pode ser produzido usando Composto (IIa) como o material de partida e repetindo a etapa A e etapa B do método de produção de PMO descrito no relatório por um número desejado de vezes.

em que BP, R2, R3, T, ligante e carreador sólido têm o mesmo significado que definido acima; e, n’ representa 1 a 98 (em uma modalidade específica, n’ é 1 a 34, 1 a 33, 1 a 32, 1 a 31, 1 a 30, 1 a 29, 1 a 28, 1 a 27, 1 a 26, 1 a 25, 1 a 24).

(2) Etapa B

[00095] Composto (III) é reagido com um composto de monômero morfolino na presença de uma base para preparar o composto representado por fórmula geral (VII) abaixo (a seguir referido como Composto (VII)):

em que BP, L, n, R2, R3 e T têm o mesmo significado que definido acima.

[00096] Esta etapa pode ser realizada por reação do Composto (III) com o composto de monômero morfolino na presença de uma base.

[00097] O composto de monômero morfolino inclui, por exemplo, compostos representados por fórmula geral (VIII) abaixo:

em que BP, RI 2, R3 e T têm o mesmo significado que definido acima.

[00098] A “base” que pode ser usada nessa etapa inclui, por exemplo, di-isopropilamina, trietilamina e N-etilmorfolina. A quantidade da base usada está apropriadamente em uma faixa de 1 mol equivalente a 1000 mols equivalentes com base em 1 mol de Composto (III), preferivelmente, 10 mols equivalentes para 100 mols equivalentes com base em 1 mol de Composto (III).

[00099] O composto de monômero morfolino e base que pode ser usada nessa etapa também podem ser usados como uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% a 30%. O solvente não é particularmente limitado desde que seja inerte para a reação, e inclui, por exemplo, N,N-dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, DMF, diclorometano, acetonitrila, tetra-hidrofurano, ou uma mistura dos mesmos.

[000100] A temperatura de reação está preferivelmente em uma faixa de, por exemplo, 0°C a 100°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 10°C a 50°C.

[000101] O tempo de reação pode variar dependendo do tipo da base e temperatura de reação usadas, e está apropriadamente em uma faixa de 1 minuto a 48 horas em geral, e preferivelmente em uma faixa de 30 minutos a 24 horas.

[000102] Além disso, após completar esta etapa, um agente acilante pode ser adicionado, se necessário. O “agente acilante” inclui, por exemplo, anidrido acético, cloreto de acetila e anidrido fenóxiacético. O agente acilante também pode ser usado como uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% a 30%. O solvente não é particularmente limitado desde que seja inerte para a reação, e inclui, por exemplo, diclorometano, acetonitrila, tetra-hidrofurano, um álcool(s) (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), água, ou uma mistura dos mesmos.

[000103] Se necessário, a base como piridina, lutidina, colidina, trietilamina, di-isopropiletilamina, N-etilmorfolina, etc. também pode ser usada em combinação com o agente acilante. A quantidade do agente acilante está apropriadamente em uma faixa de 0,1 mol equivalente a 10000 mols equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 1 mol equivalente a 1000 mols equivalentes. A quantidade da base está apropriadamente em uma faixa de, por exemplo, 0,1 mol equivalente a 100 mols equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 1 mol equivalente a 10 mols equivalentes, com base em 1 mol do agente acilante.

[000104] A temperatura de reação nessa reação está preferivelmente em uma faixa de 10°C a 50°C, mais preferivelmente, em uma faixa de 10°C a 50°C, bem mais preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e o mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C. O tempo de reação pode variar dependendo do tipo do agente acilante usado e da temperatura de reação, e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 24 horas em geral, e preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 5 horas.

(3) Etapa C:

[000105] No Composto (VII) produzido em Etapa B, o grupo protetor é removido usando um agente de desproteção para preparar o composto representado por fórmula geral (IX).

em que Base, BP, L, n, R2, R3 e T têm o mesmo significado que definido acima.

[000106] Esta etapa pode ser realizada por reação de Composto (VII) com um agente de desproteção.

[000107] O “agente de desproteção” inclui, por exemplo, amônia concentrada, água e metilamina. O “agente de desproteção” usado nessa etapa também pode ser usado como uma diluição com, por exemplo, água, metanol, etanol, álcool isopropílico, acetonitrila, tetra-hidrofurano, DMF, N,N- dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, ou uma mistura destes solventes. Dentre os mesmos, etanol é preferido. A quantidade do agente de desproteção usado está apropriadamente em uma faixa de, 1 mol equivalente a 100000 mols equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 10 mols equivalentes a 1000 mols equivalentes, com base em 1 mol de Composto (VII).

[000108] A temperatura de reação está apropriadamente em uma faixa de 15°C a 75°C, preferivelmente, em uma faixa de 40°C a 70°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 50°C a 60°C. O tempo de reação para a desproteção pode variar dependendo do tipo de Composto (VII), temperatura de reação, etc., e está apropriadamente em uma faixa de 10 minutos a 30 horas, preferivelmente 30 minutos a 24 horas, e mais preferivelmente em uma faixa de 5 horas a 20 horas.

(4) Etapa D:

[000109] PMO (I) é produzido por reação de Composto (IX) produzido em etapa C com um ácido:

em que Base, n, R2, R3 e T têm o mesmo significado que definido acima.

[000110] Esta etapa pode ser realizada por adição de ácido ao Composto (IX).

[000111] O “ácido” que pode ser usado nessa etapa inclui, por exemplo, ácido tricloroacético, ácido dicloroacético, ácido acético, ácido fosfórico, ácido clorídrico, etc. O ácido usado é apropriadamente usado para permitir à solução ter uma faixa de pH de 0,1 a 4,0, e mais preferivelmente, em uma faixa de pH 1,0 a 3,0. O solvente não é particularmente limitado desde que seja inerte para a reação, e inclui, por exemplo, acetonitrila, água, ou uma mistura destes solventes.

[000112] A temperatura de reação está apropriadamente em uma faixa de 10°C a 50°C, preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C. O tempo de reação para a desproteção pode variar dependendo do tipo de Composto (IX), temperatura de reação, etc., e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 5 horas, preferivelmente 1 minuto a 1 hora, e mais preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 30 minutos.

[000113] PMO (I) pode ser obtido submetendo-se a mistura de reação obtida nessa etapa a meios convencionais de separação e purificação como extração, concentração, neutralização, filtração, separação centrífuga, recristalização, cromatografia de coluna de fase reversa C8 a C18, cromatografia de coluna de troca catiônica, cromatografia de coluna de troca aniônica, cromatografia de coluna de filtração em gel, cromatografia líquida de alto desempenho, diálise, ultrafiltração, etc., sozinhos ou em combinação dos mesmos. Assim, o PMO (I) desejado pode ser isolado e purificado (ver, por exemplo, WO 1991/09033).

[000114] Na purificação de PMO (I) usando cromatografia de fase reversa, por exemplo, uma mistura de solução de 20 mM tampão acetato/ trietilamina e acetonitrila pode ser usada como um solvente de eluição.

[000115] Na purificação de PMO (I) usando cromatografia de troca iônica, por exemplo, uma solução mistura de 1 M solução salina e 10 mM solução aquosa hidróxido de sódio pode ser usado como um solvente de eluição.

[000116] Um ácido nucleico peptídeo é o oligômero da presente invenção tendo um grupo representado pela seguinte fórmula geral como a unidade constituinte:

em que Base tem o mesmo significado que definido acima.

[000117] Os ácidos nucleicos peptídeos podem ser preparados por referência a, por exemplo, as seguintes literaturas. 1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994) 4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995) 5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

[000118] No oligômero da presente invenção, a extremidade 5’ pode ser qualquer uma das estruturas químicas (1) a (3) abaixo, e preferivelmente é (3)-OH.

[000119] Aqui a seguir, os grupos mostrados (1), (2) e (3) acima são referidos como “Grupo (1),” “Grupo (2)” e “Grupo (3),” respectivamente.

2. Composição farmacêutica

[000120] O oligômero da presente invenção causa o salto do éxon 51 com uma maior eficiência como comparado com os oligômeros antissentido da técnica anterior. Assim, é esperado que as condições de distrofia muscular possam ser aliviadas com uma elevada eficiência por administração de uma composição farmacêutica compreendendo o oligômero da presente invenção aos pacientes DMD, que têm mutação convertendo-se enquadrado por salto do éxon 51, por exemplo, pacientes com deleção de éxon 29-50, pacientes com deleção de éxon 50, pacientes com deleção de éxon 45-50, pacientes com deleção de éxon 48-50, pacientes com deleção de éxon 49-50, pacientes com deleção de éxon 52, pacientes com deleção de éxon 52-63, pacientes com deleção de éxon 13-50, pacientes com deleção de éxon 19-50, pacientes com deleção de éxon 43-50, ou pacientes com deleção de éxon 47-50. Por exemplo, quando a composição farmacêutica compreendendo o oligômero da presente invenção é usada, os mesmos efeitos terapêuticos podem ser alcançados, mesmo em uma dose menor do que a dos oligômeros da arte anterior. Assim, efeitos colaterais podem ser aliviados e tal fato é econômico.

[000121] Em outra modalidade, a presente invenção fornece a composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular, compreendendo, como um ingrediente ativo, o oligômero da presente invenção, um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo (a seguir referido como “a composição da presente invenção”).

[000122] Também, a presente invenção fornece um método para tratamento de distrofia muscular, que compreende a administração a um paciente de DMD do oligômero da presente invenção.

[000123] No referido método para tratamento, o oligômero da presente invenção pode ser administrado como a composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular.

[000124] Além disso, a presente invenção provê o uso do oligômero da presente invenção na fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular e o oligômero da presente invenção aplicado para o tratamento de distrofia muscular.

[000125] Exemplos do sal farmaceuticamente aceitável do oligômero da presente invenção contido composição da presente invenção são sais de metal alcalino como sais de sódio, potássio e lítio; sais de metal alcalinoterroso como sais de cálcio e magnésio; sais de metal como sais de alumínio, ferro, zinco, cobre, níquel, cobalto, etc.; sais de amônio; sais de amina orgânica como sais de t-octilamina, dibenzilamina, morfolino, glucosamina, alquil éster de fenilglicina, etilenodiamina, N-metilglucamina, guanidina, dietilamina, trietilamina, diciclo-hexilamina, N,N’ -dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, procaína, dietanolamina, N-benzilfenetilamina, piperazina, tetrametilamônio, tris(hidróximetil) aminometano; sais de hidro-haleto como sais hidrofluoratos, hidrocloretos, hidrobrometos e hidroiodetos; sais de ácido inorgânico, como nitratos, percloratos, sulfatos, fosfatos, etc.; alcano sulfonatos inferiores como metanossulfonatos, trifluorometanossulfonatos e etanossulfonatos; arilsulfonatos como benzenossulfonatos e p-toluenossulfonatos; sais de ácido orgânico, como acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, tartaratos, oxalatos, maleatos, etc.; e sais de aminoácidos como sais de glicina, lisina, arginina, ornitina, ácido glutâmico e ácido aspártico. Estes sais podem ser produzidos por métodos conhecidos. Alternativamente, o oligômero da presente invenção contido na composição da presente invenção pode estar na forma de um hidrato do mesmo.

[000126] A via de administração para a composição da presente invenção não é particularmente limitada desde que seja uma via farmaceuticamente aceitável para administração, e possa ser escolhida dependendo do método de tratamento. Em vista de sua facilidade para liberação nos tecidos musculares, são preferidas administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intramuscular, administração subcutânea, administração oral, administração em tecido, administração transdérmica, etc. Também, formas de dosagem que são disponíveis para a composição da presente invenção não são particularmente limitadas, e incluem, por exemplo, várias injeções, agentes orais, gotas, inalações, unguentos, loções, etc.

[000127] Na administração do oligômero da presente invenção aos pacientes com distrofia muscular, a composição da presente invenção pode conter um carreador para promover a liberação do oligômero aos tecidos musculares. Tal carreador não é particularmente limitado desde que seja farmaceuticamente aceitável, e exemplos incluem carreadores catiônicos, como lipossomas catiônicos, polímeros catiônicos, etc., ou carreadores usando envelope viral. Os lipossomas catiônicos são, por exemplo, lipossomas compostos de 2-O-(2-dietilaminoetil)carabamoil-1,3-O-dioleoilglicerol e fosfolipídeos como os constituintes essenciais (a seguir referidos como “lipossoma A”), Oligofectamine (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectin (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectamine (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectamine 2000 (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), DMRIE-C (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), GeneSilencer (marca registrada) (fabricado por Gene Therapy Systems), TransMessenger (marca registrada) (fabricado por QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (marca registrada) (fabricado por Mirus) e Nucleofector II (Lonza). Dentre outros, lipossoma A é preferido. Exemplos de polímeros catiônicos são JetSI (marca registrada) (fabricado por Qbiogene, Inc.) e Jet-PEI (marca registrada) (polietilenimina, fabricado por Qbiogene, Inc.). Um exemplo de carreadores usando envelope viral é GenomeOne (marca registrada) (lipossoma HVJ-E, fabricado por Ishihara Sangyo). Alternativamente, os dispositivos médicos descritos em Patente JP No. 2924179 e os carreadores catiônicos descritos em republicação interna no Japão PCT Nos. 2006/129594 e 2008/096690 também podem ser usados.

[000128] Para outros detalhes, Patente US 4.235.871, Patente US 4.737.323, WO96/14057, “New RRC, Lipossomas: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) páginas 33-104”, etc. podem ser consultados.

[000129] A concentração do oligômero da presente invenção contido na composição da presente invenção pode variar dependendo do tipo do carreador, etc., e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 nM a 100 μM, preferivelmente em uma faixa de 100 nM a 10 μM. Uma razão em peso do oligômero da presente invenção contido na composição da presente invenção e o carreador (carreador/oligômero antissentido da presente invenção) pode variar dependendo da propriedade do oligômero, tipo do carreador, etc., e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 a 100, preferivelmente em uma faixa de 0,1 a 10.

[000130] Além do oligômero da presente invenção e do carreador descritos acima, aditivos farmaceuticamente aceitáveis também podem ser opcionalmente formulados na composição da presente invenção. Exemplos de tais aditivos são auxiliares de emulsificação (por exemplo, ácidos graxos tendo 6 a 22 átomos de carbono e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, albumina e dextrano), estabilizantes (por exemplo, colesterol e ácido fosfatídico), agentes isotonificantes (por exemplo, cloreto de sódio, glicose, maltose, lactose, sacarose, trealose), e agentes de controle do pH (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e trietanolamina). Um ou mais destes aditivos pode ser usado. O teor do aditivo na composição da presente invenção é apropriadamente 90% em peso ou menor, preferivelmente 70% em peso ou menor e mais preferivelmente, 50% em peso ou menor.

[000131] A composição da presente invenção pode ser preparada por adição do oligômero da presente invenção a uma dispersão de carreador e agitando de modo apropriado a mistura. Aditivos podem ser adicionados em uma etapa apropriada ou antes ou após a adição do oligômero da presente invenção. Um solvente aquoso, que pode ser usado além do oligômero da presente invenção não é particularmente limitado desde que seja farmaceuticamente aceitável, e exemplos são água injetável ou água destilada injetável, fluido eletrólito como solução salina fisiológica, etc., e fluido de açúcar como fluido de glicose, fluido de maltose, etc. Um versado na técnica pode escolher apropriadamente condições para pH e temperatura para tal questão.

[000132] A composição da presente invenção pode ser preparada em, por exemplo, uma forma líquida e sua preparação liofilizada. A preparação liofilizada pode ser preparada por liofilização da composição da presente invenção em uma forma líquida em um modo convencional. A liofilização pode ser realizada, por exemplo, esterilizando apropriadamente a composição da presente invenção em uma forma líquida, distribuindo uma alíquota em um recipiente de frasco pequeno, realizando o congelamento preliminar durante 2 horas em condições de cerca de -40 a -20°C, realizando uma secagem primária a cerca de 0 a 10°C sob pressão reduzida, e então realizando uma secagem secundária a cerca de 15 a 25°C, sob pressão reduzida. Em geral, a preparação liofilizada da composição da presente invenção pode ser obtida por substituído do conteúdo do frasco com gás nitrogênio e tampando.

[000133] A preparação liofilizada da composição da presente invenção pode ser usada em geral por reconstituição por adição de uma solução apropriada opcional (líquido de reconstituição) e redissolução da preparação. Tal líquido de reconstituição inclui água injetável, solução salina fisiológica e outros fluidos de infusão. Um volume do líquido de reconstituição pode variar dependendo de seu uso desejado, etc., não é particularmente limitado, e é de modo apropriado 0,5 a 2 vezes maior do que o volume antes da liofilização ou não mais do que 500 mL.

[000134] É desejado controlar uma dose da composição da presente invenção a ser administrada, levando os seguintes fatores em consideração: o tipo e forma de dosagem do oligômero da presente invenção contido; as condições dos pacientes incluindo idade, peso corporal, etc.; via de administração; e as características e extensão da doença. Uma dose diária calculada como uma quantidade do oligômero antissentido da presente invenção está geralmente em uma faixa de 0,1 mg a 10 g/humano, e preferivelmente 1 mg a 1 g/humano. Esta faixa numérica pode variar ocasionalmente dependendo do tipo de doença alvo, via de administração e molécula alvo. Assim, uma dose menor do que a faixa pode ser suficiente em alguma ocasião e, inversamente, uma dose maior do que a faixa pode ser necessária ocasionalmente. A composição pode ser administrada de uma a várias vezes diariamente ou em intervalos de um dia a vários dias.

[000135] Em ainda outra modalidade da composição da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo um vetor capaz de expressar o oligonucleotídeo da presente invenção e o carreador descritos acima. Tal vetor de expressão pode ser um vetor capaz de expressar uma pluralidade de oligonucleotídeos da presente invenção. A composição pode ser formulada com aditivos farmaceuticamente aceitáveis como no caso com a composição da presente invenção contendo o oligômero da presente invenção. A concentração do vetor de expressão contido na composição pode variar dependendo do tipo de carreador, etc., e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 nM a 100 μM, preferivelmente em uma faixa de 100 nM a 10 μM. Uma razão em peso do vetor de expressão contido na composição e o carreador (carreador/vetor de expressão) podem variar dependendo da propriedade do vetor de expressão, tipo do carreador, etc., e está apropriadamente em uma faixa de 0,1 a 100, preferivelmente em uma faixa de 0,1 a 10. O teor do carreador contido na composição é o mesmo como no caso com a composição da presente invenção contendo o oligômero da presente invenção, e um método para produzir o mesmo é também o mesmo como no caso com a composição da presente invenção.

[000136] Aqui a seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos EXEMPLOS e EXEMPLOS DE TESTE abaixo, mas não é considerada como limitada aos mesmos.

EXEMPLOS [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1] Ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(4-Benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2- il] metóxi}-4-oxobutanoico carregado sobre resina de amino poliestireno Etapa 1: Produção de 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1(2H)-il)- 4-tritilmorfolin-2-il]metóxi}-4-oxobutanoico

[000137] Sob atmosfera de argônio, 3,44 g de N-{1-[(2R, 6S)-6- (hidróximetil)- 4-tritilmorfolin -2-il]-2-oxo-1,2-di-hidropirimidin-4-il} benzamida e 1,1 g de 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) foram colocados em suspensão em 50 mL de diclorometano, e 0,90 g de anidrido succínico foi adicionado à suspensão, seguido por agitação em temperatura ambiente durante 3 horas. Para a reação mistura foram adicionados 10 mL de metanol, e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi extraído usando acetato de etila e 0,5 M solução aquosa de di-hidrogenofosfato de potássio. A camada orgânica resultante foi lavada sequencialmente com 0,5M de solução aquosa de di-hidrogenofosfato de potássio, água e salmoura na ordem mencionada. A camada orgânica resultante foi secada sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida para dar 4,0 g do produto.

Etapa 2; Produção de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1- il)-4- tritilmorfolin-2-il]metóxi}-4-oxobutanoico carregado sobre resina de amino poliestireno

[000138] Após 4,0 g de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2- oxopirimidin-1(2H)-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metóxi}-4-oxobutanoico serem dissolvidos em 200 mL de piridina (desidratado), 0,73 g de 4-DMAP e 11,5 g de cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida foram adicionados à solução. Então, 25,0 g de resina de amino poliestireno Primer support 200 amino (fabricada por GE Healthcare Japan Co., Ltd., 17-5214-97) e 8,5 mL de trietilamina foram adicionados à mistura, seguido por agitação em temperatura ambiente durante 4 dias. Após completar a reação, a resina foi tomada por filtração. A resina resultante foi lavada sequencialmente com piridina, metanol e diclorometano na ordem mencionada, e secada sob pressão reduzida. A esta resina resultante, foram adicionados 200 mL de tetra- hidrofurano (desidratado), 15 mL de anidrido acético e 15 mL de 2,6-lutidina, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A resina foi tomada por filtração, lavada sequencialmente com piridina, metanol e diclorometano na ordem mencionada e secada sob pressão reduzida para dar 26,7 g do produto.

[000139] A quantidade de carga do produto foi determinada a partir da quantidade molar da tritila por g resina por medição da absorbância de UV a 409 nm usando um método conhecido. A quantidade de carga da resina foi 192,2 μmol/g. Condições de medição de UV Aparelho: U-2910 (Hitachi, Ltd.) Solvente: ácido metanossulfônico Comprimento de onda: 265 nm Valor ε: 45000

[000140] De acordo com as descrições em EXEMPLOS 1, 2 e EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 abaixo, PMOs mostrados por PMO Nos. 13 em TABELA 1 foram sintetizados. Os PMOs foram dissolvidos em água para injeção (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). [TABELA 1]

[EXEMPLO 1] PMO No. 1

[000141] 0,2 g de ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(4-benzamida-2-oxopirimidin- 1(2H)-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metóxi} 4-oxobutanoico suportado em uma resina de aminopoliestireno (Exemplo de Referência 1) (26 μmol) foi cheio em uma coluna com uma ponta de filtro. Então, o ciclo sintético mostrado abaixo foi iniciado usando uma máquina de sintetizar ácido nucleico (AKTA Oligopilot 10 plus). O composto de monômero morfolino desejado foi adicionado em cada ciclo de copulação para dar a sequência de nucleotídeos do composto titular (ver a Tabela 2 abaixo). [TABELA 2]

[000142] A solução desbloqueante usada foi solução de diclorometano contendo 3% (p/v) ácido trifluoroacético. A solução neutralizante e de lavagem usada foi uma solução obtida por dissolução de N,N-di- isopropiletilamina como sendo 10% (v/v) e tetra-hidrofurano para ser 5% (v/v) em diclorometano contendo 35% (v/v) acetonitrila. A solução de copulação A usada foi uma solução obtida por dissolução do composto de monômero morfolino em tetra-hidrofurano para ser 0,10 M. A solução de copulação B usada foi uma solução obtida por dissolução de N,N- di- isopropiletilamina para ser 20% (v/v) e tetra-hidrofurano para ser 10% (v/v) em acetonitrila. A solução de terminação usada foi uma solução obtida por dissolução de 20% (v/v) anidrido acético e 30% (v/v) 2,6-lutidina em acetonitrila.

[000143] A resina de aminopoliestireno carregada com o PMO sintetizado acima foi recuperada do vaso de reação e secada em temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas sob pressão reduzida. O PMO carregado sobre a resina de aminopoliestireno foi carregado em um vaso de reação, e 5 mL de 28% amônia água-etanol (1/4) foram adicionados ao mesmo. A mistura foi agitada a 55°C durante 15 horas. A resina de aminopoliestireno foi separada por filtração e lavada com 1 mL de água-etanol (1/4). O filtrado resultantes foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em 10 mL de uma mistura de solvente de 20 mM de tampão ácido acético-trietilamina (tampão TEAA) e 10ml de acetonitrila (4/1) e filtrado através de um filtro de membrana. O filtrado obtido foi purificado por HPLC de fase reversa. As condições usadas são como mostradas na Tabela 3 abaixo. [TABELA 3]

[000144] Cada fração foi analisada, e o produto objetivo foi recuperado e concentrado sob pressão reduzida. Ao resíduo concentrado, foi adicionado 0,5 mL de 2 M solução aquosa de ácido fosfórico, e a mistura foi agitada durante 15 minutos. Além disso, 2 mL de 2 M solução aquosa de hidróxido de sódio foram adicionados para tornar a mistura alcalina, seguido por filtração através de um filtro de membrana (0,45 μm).

[000145] A solução aquosa resultante contendo o produto objetivo foi purificada por coluna de resina de troca aniônica. As condições usadas são as mostradas na Tabela 4 abaixo. [TABELA4]

[000146] Cada fração foi analisada (em HPLC) e o produto objetivo foi obtido como uma solução aquosa. À solução aquosa resultante foi adicionado 0,1 M tampão fosfato (pH 6,0) para neutralização. A seguir, a mistura obtida foi desmineralizada por HPLC de fase reversa sob as condições descritas em Tabela 5 abaixo. [TABELA 5]

[000147] O produto objetivo foi recuperado e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em água. A solução aquosa obtida foi secada por congelamento para dar o composto objetivo como um sólido semelhante a um algodão branco. ESI-TOF-MS Calculado: 10021,46 Encontrado: 10021,91

[EXEMPLO 2] PMO No. 2

[000148] O composto titular foi produzido de acordo com o procedimento de EXEMPLO 1. ESI-TOF-MS Calculado: 9916,71 Encontrado: 9916,43

[EXEMPLO COMPARATIVO 1] PMO No. 3

[000149] O composto titular foi produzido de acordo com o procedimento de EXEMPLO 1. ESI-TOF-MS Calculado: 9949,46 Encontrado: 9949,41

[EXEMPLO DE TESTE 1] Teste in vitro

[000150] Experimentos foram realizados usando os oligômeros antissentido PMO Nos. 1 e 2 da presente invenção e o oligômero antissentido PMO No. 3. As sequências de vários oligômeros antissentido são dadas na Tabela 6 abaixo. [TABELA 6]

[000151] Usando um kit Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L em Nucleofector II (Lonza), 0,3, 1, 3, 10 μM dos oligômeros PMO Nos. 1 e 2 da presente invenção e oligômero antissentido PMO No. 3 foram transfectados com 3,5x 105 de células RD (linhagem de células de rabdomiossarcoma humano). O Programa T-030 foi usado.

[000152] Após transfecção, as células foram cultivadas durante três dias em 2 mL de meio essencial mínimo de Eagle (EMEM) (fabricado por Sigma, aqui a seguir igual) contendo 10% soro de bezerro fetal (FCS) (fabricado por Invitrogen) sob condições de 37°C e 5% CO2. As células foram lavadas com PBS (fabricado por Nissui, aqui a seguir igual e 500 μl de ISOGEN II (fabricado por Nippon Gene) foram adicionados às células. Após as células serem deixadas permanecer em temperatura ambiente durante alguns minutos para lisar as células, o lisado foi coletado em um tubo Eppendorf. O RNA total foi extraído de acordo com o protocolo junto com ISOGEN. A concentração do RNA total extraído foi determinada usando um NanoDrop ND-1000 (fabricado por LMS).

[000153] RT-PCR One Step foi realizado com 400 ng do RNA total extraído usando um kit Qiagen One Step RT-PCR Kit (fabricado por Qiagen). A solução de reação foi preparada de acordo com o protocolo anexo ao kit. PTC-100 (fabricado por MJ Research) foi usado como um ciclador térmico. O programa RT-PCR usado é como a seguir. 50°C, 30 min: reação de transcrição reversa 95°C, 15 min: desnaturação térmica [94°C, 30 segundos; 60°C, 30 segundos; 72 °C, 60 segundos] x 35 ciclos: amplificação PCR 72°C, 10 min: extensão final

[000154] As sequências de nucleotídeos do iniciador dianteiro e iniciador reverso usados para RT-PCR são dadas abaixo. Iniciador dianteiro: 5’- CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’SEQ ID NO: 5) Iniciador reverso: 5’- GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’SEQ ID NO: 6)

[000155] O produto de reação, 1 μL do RT-PCR acima foi analisado usando um Bioanalyzer (fabricado por Agilent Technologies, Inc.). O nível de polinucleotídeo “A” da banda com salto de éxon 51 e o nível de polinucleotídeo “B” da banda sem salto de éxon 51 foram medidos. Com base nestes valores de medição de “A” e “B”, a eficiência de salto foi determinada pela seguinte equação: Eficiência de salto (%)=A/( A + B ) x 100

Resultados experimentais

[000156] Os resultados são mostrados em Figura 1. Esta experiência revelou que, os oligômeros antissentido da presente invenção devem causar o salto do éxon 51 com uma eficiência marcadamente maior do que o oligômero antissentido PMO No,3.

[EXEMPLO 3] PMO No. 4-6

[000157] O composto titular foi produzido de acordo com o procedimento de EXEMPLO 1. Sequências de vários oligômeros antissentido são dadas abaixo. TABELA 7

[EXEMPLO 4] 2’-O-metóxi-fosforotioatos mostrado por SEQ ID NOS: 9 a 33

[000158] Vários oligômeros antissentido do título foram produzidos por contratação terceirizada do Japan Bio Service Co. As sequências de vários oligômeros antissentido são dadas em Tabela 8. [TABELA 8]

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[000159] Resultados experimentais em EXEMPLOS DE TESTE demonstram que os oligômeros da presente invenção causaram o salto do éxon 51 com uma eficiência marcadamente elevada em células RD. Assim, os oligômeros da presente invenção são extremamente utilizáveis para o tratamento de DMD.

Claims (11)

1. Oligômero antissentido, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou 2, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um oligonucleotídeo, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 2, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que a porção de açúcar e/ou a região de ligação a fosfato de, pelo menos, um nucleotídeo constituindo o oligonucleotídeo é modificada; a fração de açúcar de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é uma ribose na qual o grupo 2'-OH é substituído por qualquer um selecionado do grupo que consiste em OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2 , N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R é uma alquila ou uma arila e R' é um alquileno); e a região de ligação ao fosfato de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é qualquer um selecionado do grupo que consiste em uma ligação fosforotioato, uma ligação fosforoditioato, uma ligação alquilfosfonato, uma ligação fosforamidato e uma ligação boranofosfato.

4. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um oligômero morfolino, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser um oligômero morfolino fosforodiamidato, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Oligômero antissentido de acordo as reivindicações 4 ou 5, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que a extremidade 5’ é qualquer uma das fórmulas químicas (1) a (3) abaixo:

7. Composição farmacêutica para tratamento de distrofia muscular, caracterizada pelo fato de compreender, como um ingrediente ativo, o oligômero antissentido ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender um carreador farmaceuticamente aceitável.

9. Uso de um oligômero antissentido, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na fabricação da composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, caracterizado pelo fato de que o paciente com distrofia muscular no referido tratamento é um paciente com deleções de nucleotídeos dentro de éxons 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 ou 47-50.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, caracterizado pelo fato de que o paciente é um humano.

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