CN113660938A - 核酸递送复合物 - Google Patents

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青木吉嗣
武田伸一
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Nippon Medical School Foundation
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Abstract

提供了包含含核酸纳米颗粒和非包膜病毒的空心颗粒的复合物，生产所述复合物的方法，以及包含所述复合物的药物组合物。

Description

核酸递送复合物
技术领域
本发明涉及用于递送核酸的复合物，生产所述复合物的方法，以及包含所述复合物作为活性成分的药物组合物。
背景技术
自从20世纪70年代后半期报道了反义核酸，已进行了大量旨在将核酸分子作为药物应用的研究与开发。特别地，21世纪早期报道的在哺乳动物细胞中诱导RNA干扰的小干扰RNA (siRNA)的发现加速了核酸药物的开发。近年来，非编码RNA例如微小RNA (miRNA)和长非编码RNA (lncRNA)的生物功能和重要性已被发现。因此非编码RNA作为核酸药物的新靶标引起了注意。此外，miRNA自身作为核酸药物引起了注意。
例如，杜氏肌营养不良症(DMD)是一种严重的遗传病，表现出渐进式肌无力和肌萎缩，并且通常是由起因于dystrophin基因中的缺失突变的移码造成的。目前，利用DMD模型动物，用反义吗啉代核酸纠正外显子跳跃导致的移码突变而引起的氨基酸阅读框移动的技术开发正在进行中(非专利文献1)。
到目前为止，核酸药物具有体内降解的问题。随后，修饰核酸技术和药物递送系统(DDS)技术被显著开发，并且稳定而高效的候选产品一个接一个地被开发。例如，通过将核酸引入腺伴随病毒(AAV)的非病毒空心颗粒内部而制备的DDS已作为具有高安全性和器官向性的技术建立起来(专利文献1)。
此外，为了增强核酸药物对靶器官的治疗效果，并改善核酸药物的安全性和成本，具有高细胞膜通透性的肽缀合吗啉代被开发(非专利文献2)。然而，需要建立具有更高安全性、器官/组织特异性和高治疗效果的划时代的DDS。
引文列表
专利文献
专利文献1：WO2012/144446
非专利文献
非专利文献1： Komaki H. et al., Science translational medicine, vol.10, Issue 4, 37, eaan0713, 2018
非专利文献2： Ezzat K et al., NANO LETTERS, vol. 15, 第364页, 2015。
发明内容
本发明待解决的问题
本发明的目的是建立具有高安全性、器官/组织特异性和高治疗效果的DDS。
问题的解决方案
由于辛勤的研究，本申请发明人利用将非包膜病毒作为核酸药物的载体制备时生成的空心颗粒，从而成功生产了含核酸药物的纳米颗粒和空心颗粒的复合物，其中纳米颗粒和空心颗粒彼此静电共轭。发现所述复合物是具有安全性、器官/组织特异性和高治疗效果的DDS。基于这些发现和结果完成了本发明。
本发明提供以下内容：
[1] 包含含核酸纳米颗粒和非包膜病毒的空心颗粒的复合物。
[2] 根据[1]所述的复合物，其中所述核酸是选自二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、肽缀合的PMO(P-PMO)、三环DNA(tcDNA)和2'O 甲基寡聚物(2'OMe)的核酸衍生物。
[3] 根据[1]或[2]所述的复合物，其中所述核酸衍生物为含有肽的P-PMO，所述肽具有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中示出的序列。
[4] 根据[1]至[3]中任一项所述的复合物，其中经透射电镜(TEM)测量，所述复合物具有50至1000 nm的最长轴。
[5] 根据[1]至[4]中任一项所述的复合物，其中所述空心颗粒为腺伴随病毒的空心颗粒。
[6] 根据[1]至[5]中任一项所述的复合物，其中所述核酸是dystrophin基因的反义核酸。
[7] 根据[1]至[6]中任一项所述的复合物，其中所述纳米颗粒由所述核酸组装而形成。
[8] 生产包含含核酸纳米颗粒和衣壳病毒的复合物的方法，所述方法包括：
(i) 生产含有核酸的纳米颗粒的步骤，
(ii)生产非包膜病毒的空心颗粒的步骤，以及
(iii) 将通过(i)得到的纳米颗粒与通过(ii)得到的非包膜病毒空心颗粒混合的步骤。
[9] 根据[8]所述的方法，其中步骤(iii)中所述核酸和所述空心颗粒以150至1500摩尔的所述核酸与1摩尔的所述空心颗粒的比例混合。
[10] 包含[1]至[7]中任一项所述复合物的药物组合物。
[11] 根据[10]所述的药物组合物，其用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。
[12] 根据[10]或[11]所述的药物组合物，其用于全身静脉内施用。
[13] 根据[10]或[11]所述的药物组合物，其用于全身施用。
[14] 预防或治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用[1]至[7]中任一项所述复合物。
[15] 根据[14]所述的方法，其用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。
[16] 根据[14]或[15]所述的方法，其中所述复合物全身施用于所述受试者。
[17] 根据[16]所述的方法，其中所述复合物全身静脉内施用于所述受试者。
[18] [1]至[7]中任一项所述复合物作为DDS的用途。
[19] 根据[18]所述的用途，其中所述DDS用于全身施用。
[20] 根据[19]所述的用途，其中所述DDS用于全身静脉内施用。
[21] 非包膜蛋白的空心颗粒作为核酸药物的载体的用途。
[22] 根据[21]所述的用途，其中所述核酸药物包括选自二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、肽缀合的PMO(P-PMO)、三环DNA(tcDNA)和2'O 甲基寡聚物(2'OMe)的核酸衍生物。
[23] 根据[22]所述的用途，其中所述核酸衍生物为含有肽的P-PMO，所述肽具有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中示出的序列。
[24] 根据[21]至[23]中任一项所述的用途，其中所述核酸药物和所述空心颗粒形成复合物且所述复合物具有50至1000 nm的最长轴。
[25] 根据[21]至[24]中任一项所述的用途，其中所述空心颗粒为腺伴随病毒的空心颗粒。
[26] 根据[21]至[25]中任一项所述的用途，其中所述核酸药物包括dystrophin基因的反义核酸。
[27] 根据[21]至[26]中任一项所述的用途，其中所述核酸药物包括由核酸组装而形成的纳米颗粒。
[28] 根据[21]至[27]中任一项所述的用途，其中所述核酸药物为全身施用。
[29] 根据[28]所述的用途，其中所述核酸药物为全身静脉内施用。
本发明效果
本发明提供了具有高安全性、器官/组织特异性，和高治疗效果的DDS。
附图说明
[图1] 图1显示通过DLS(动态光散射)方法得到的本发明的复合物、AAV空心颗粒和P-PMO的粒度分布。
[图2] 图2显示本发明的复合物和P-PMO的凝胶移位测定结果。
[图3] 图3显示由本发明的复合物或P-PMO诱导的外显子51跳跃的效率。
[图4] 图4显示施用了本发明的复合物或P-PMO的小鼠的肌肉中dystrophin阳性肌肉纤维数量和荧光强度。
[图5] 图5显示施用了本发明的复合物或P-PMO的小鼠的肌肉中dystrophin的量。
[图6] 图6显示施用了本发明的复合物或P-PMO的小鼠的不同肌肉中dystrophin的量。
[图7] 图7是显示本发明的复合物的实例的2D示意图。
具体实施方式
(1)本发明的复合物
本发明的复合物是包含含核酸纳米颗粒和非包膜病毒的空心颗粒的复合物。
如本文所用，“核酸”包括天然核酸、核酸衍生物和它们的组合。“天然核酸”指的是仅由天然核苷酸组成的DNA和RNA，这些核苷酸天然存在，彼此连接。正如在本发明的实施方案中所用的，天然核酸是对于构成该复合物的空心颗粒所来源的非包膜病毒和该复合物施用的活体是外源性的核酸。
所述核酸衍生物包括化学修饰的核酸、核酸类似物、人工核酸和它们的组合。“化学修饰的核酸”是指经人工、化学修饰的核酸。其实例包括甲基膦酸酯DNA/RNA、硫代磷酸酯DNA/RNA、氨基磷酸酯DNA/RNA和2'-O-甲基DNA/RNA。“核酸类似物”指的是人工构造的具有与天然核酸相似结构和/或性质的高分子化合物。其实例包括肽核酸(PNA)、具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)、桥联核酸和/或锁核酸(BNA/LNA)和吗啉代核酸(包括二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物:PMO)。吗啉代寡聚物指的是通过吗啉代亚基(单体)聚合得到的寡聚物。吗啉代亚基具有这样的结构，其中作为RNA的组成单元的核糖核苷酸的整个核糖(组成糖)被吗啉代环取代。“人工核酸”指的是在自然界不存在的人工生产的核酸，且包括包含非天然核苷酸作为天然核酸的一部分的核酸和仅由彼此连接的非天然核苷酸组成的核酸。如本文所用，“非天然核苷酸”指的是人工构造或经人工化学修饰的不存在于自然界的核苷酸，且具有与天然核苷酸相似结构和/或性质。非天然核苷酸包括那些与如上所述的化学修饰的核酸和核酸类似物相对应的核苷酸。
在本发明所用的核酸中，如有必要，它的磷酸基团、糖和/或碱基可被标记。本领域已知的标记物质可用做标签。标记物质的实例包括放射性同位素(例如32P、3H、14C)、DIG、生物素、荧光染料(例如FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodypy493、NBD、TAMRA)和发光物质(例如吖啶酯)。
本发明所用核酸的实例包括任何基因、mRNA或它们的片段，以及具有与所述基因、mRNA或它们的片段互补的序列的核酸，例如寡核苷酸。核酸可以是在体内或在细胞中具有特定生物功能的核酸，例如酶功能、催化功能或生物抑制或增强功能(例如抑制或增强转录或翻译的功能)，优选在细胞中。这样的核酸也被称为功能核酸。功能核酸的具体实例包括RNA干扰剂、核酸适配体(包括RNA适配体和DNA适配体)、诱饵、反义核酸(反义DNA、反义RNA、反义RNA/DNA)、核酶(包括脱氧核酶)、U1衔接子、分子信标、核糖开关(riboswitch)和转录因子结合区。尤其地，所述反义DNA和所述RNA干扰剂可优选用作本发明的“核酸”。如本文所用，“RNA干扰剂”指的是在体内诱导RNA干扰以降解目的基因转录物并从而抑制(沉默)目的基因表达的物质。RNA干扰剂的实例包括siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)和miRNA(微小RNA)(包括pri-miRNA和pre-miRNA)。
用于本发明的核酸的长度没有特别限制，并且核酸可具有，例如，10至10,000个核苷酸的长度，优选12至200个核苷酸，更优选15至50个核苷酸。
纳米颗粒一般指的是粒度在纳米(nm)量级的细小颗粒。对于本发明的复合物，具有1至1000 nm直径，优选10至200 nm直径，并且更优选30至90 nm直径的纳米颗粒可被使用。本发明的复合物包含的纳米颗粒可具有任何形状和任何形式，只要纳米颗粒全部或部分表面具有正电荷或负电荷，并且纳米颗粒包含核酸。尽管纳米颗粒在形状上通常是球形的，但纳米颗粒可采取不同形式，这取决于纳米颗粒的性质和预期用途。纳米颗粒的实例包括脂质体、白蛋白纳米颗粒、胶束、树状分子(dendrimer)、纳米乳液、金属纳米颗粒和聚乳酸与聚乙醇酸(PLGA)的共聚物。在本发明中，可使用在颗粒中包含两种或更多种功能核酸的纳米颗粒。
脂质体是由脂质双层膜构成的脂质纳米颗粒。由于细胞膜主要由磷脂双层膜构成，脂质体在生物相容性方面极佳。在本发明中，核酸被包封到脂质体内部、结合至脂质体表面或插入脂质体的脂质双层膜中。通过修饰脂质体的表面，可给予脂质体不同功能。例如，可用PEG修饰脂质体以提高其在血液中的稳定性。例如，可向脂质体表面加入特定受体的配体或针对特定细胞(例如癌细胞)的抗体(或其片段)，以给予脂质体靶标向性。如本文所用，构成脂质体的膜组分没有特别限制。膜组分的实例包括磷脂、甘油糖脂和鞘糖脂。尤其地，磷脂的实例包括DPPC、DSPE-PEG、DSPE-PEG-NHS、EPC、POPC、DSPC、DSPE、PS、PG、PI、DMPG和DMPC。
胶束是具有亲水部分和疏水部分的两亲性分子的聚集体。胶束可具有疏水核心或亲水核心。例如，具有由磷脂构成的亲水部分和由脂肪酸构成的疏水部分的分子在水溶剂中形成具有疏水核心的胶束。胶束可包含聚合物。在实施方案中，胶束可包含均聚物。均聚物的典型实例包括聚(亚烷基二醇)[例如聚(乙二醇)(PEG)等]、聚(氨基酸)[例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)(PGA)等]、聚(γ-L-谷氨酰基谷氨酰胺)(PGGA)、聚(苯醚)(PPO)、聚(ε-己内酯)(PCL)和聚(乳酸)。在一个实施方案中，胶束载体可含有聚(γ-L-谷氨酰基谷氨酰胺)(PGGA)。在另一实施方案中，胶束可含有共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在一个实施方案中，所述胶束可含有嵌段共聚物。嵌段共聚物的典型实例是双嵌段共聚物。在一个实施方案中，双嵌段共聚物可含有非极性重复单元和极性重复单元。极性重复单元的典型实例包括亚烷基二醇(例如乙二醇)、氧化烯(例如环氧乙烷)和亲水氨基酸。非极性重复单元的典型实例包括γ-L-谷氨酰基谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸-共-乙醇酸、苯醚、ε-己内酯、乳酸、苯乙烯、环氧丁烷、烃和疏水氨基酸(例如天冬氨酸)。也可使用其他具有超过两种不同重复单元的嵌段共聚物(例如三嵌段共聚物)。
在本发明中，胶束表面优选具有正电荷或负电荷，并因此胶束可含有具有电荷赋予功能的物质，例如寡肽或其衍生物。作为本发明的一方面，在具有向性的衣壳与胶束的组合中，优选胶束表面带正电荷而衣壳表面带负电荷。
在本发明的一方面，核酸被包封到胶束内部。在本发明的另一方面，被修饰成为两亲性分子的核酸聚合以形成胶束。在本发明的一个方面，可将肽加入核酸以形成胶束。加入核酸的肽可以是任何肽，只要它与核酸结合以形成两亲性分子，且可使用进一步给予纳米颗粒细胞向性和/或细胞通透性的肽。肽与核酸结合，例如通过接头部分。接头部分的实例是酰胺接头。接头部分可包括任选取代的哌嗪基部分，且可进一步包括β-丙氨酸亚基和/或6-氨基己酸亚基。肽也可以不用接头部分直接与核酸结合。肽可在3'端或5'端与核酸结合。
在本发明中，纳米颗粒可通过组装核酸而形成。在本发明的一个方面，所述纳米颗粒是由二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)和/或肽缀合的PMO(P-PMO)自组装形成的纳米颗粒。P-PMO是其中肽与吗啉代核酸结合的核酸衍生物。P-PMO中包含的肽可优选为具有细胞膜通透性的肽，并且例如可使用具有SEQ ID NO：1的序列的Pip6a或具有SEQ ID NO：2的序列的B肽。在本发明的另一方面，所述纳米颗粒是由三环DNA(tcDNAs)例如硫代磷酸tcDNA自组装形成的纳米颗粒。在本发明的另一个方面，所述纳米颗粒是由2'O甲基寡聚物(2'OMe)自组装形成的纳米颗粒。
本发明的复合物包含无包膜病毒的空心颗粒。在病毒颗粒(病毒粒子)中，在病毒核酸或核心周围由多个蛋白质单元(壳粒)构成的外被或外壳被称为衣壳。如本文所用，当仅提及“衣壳”时，该术语表示结构。如本文所用，术语“空心颗粒”表示衣壳内部不含病毒核酸、核心或其他物质而仅由衣壳蛋白构成的衣壳。另一方面，衣壳内部含病毒核酸或核心的衣壳被称为“核衣壳”。
空心颗粒可取决于本发明的复合物所施用的生物物种而选择。例如，当生物物种是动物时，可使用源自动物病毒的空心颗粒，而当生物物种是植物时，可使用源自植物病毒的空心颗粒。已知衣壳大致分为二十面体衣壳和螺旋衣壳。用于本发明的复合物的空心颗粒衣壳可以是任何形式。
本发明使用的无包膜病毒的空心颗粒的来源没有特别限制。无包膜病毒可以是RNA病毒或DNA病毒。源自为RNA病毒的动物病毒的空心颗粒的实例包括源自属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)和双RNA病毒科(Birnaviridae)的病毒的空心颗粒。源自为DNA病毒的动物病毒的空心颗粒的实例包括源自属于腺病毒科(Adenoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)和乳多空病毒科(Papovaviridae)的病毒的空心颗粒。源自属于小RNA病毒科的病毒(其为RNA病毒)的空心颗粒和源自属于腺病毒科和细小病毒科的病毒(其为DNA病毒)的空心颗粒可优选用于本发明。源自属于腺病毒科的腺病毒和属于细小病毒科的AAV的空心颗粒可特别优选用于本发明。
源自为RNA病毒的植物病毒的空心颗粒的实例包括源自属于水稻条纹病毒属(Tenuivirus)、烟草花叶病毒(Tobamovirus)组、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、香石竹病毒(Dianthovirus)组、雀麦花叶病毒(Bromovirus)组、黄瓜花叶病毒(Cucumovirus)组、呼肠孤病毒科和隐潜病毒(Crypticvirus)组的病毒的空心颗粒。源自为DNA病毒的植物病毒的空心颗粒的实例包括源自属于花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)和联体病毒属(Geminivirus)的病毒的空心颗粒。
只要可以构成衣壳，构成空心颗粒衣壳的衣壳体可含有突变。如本文所用，“突变”表示在衣壳体的氨基酸序列中取代、缺失、添加或插入一个至若干个氨基酸。在氨基酸取代的情况下，优选相似氨基酸间的取代。“相似氨基酸”指的是当基于电荷、侧链、极性和芳香性等性质对氨基酸分类时属于同一组别的氨基酸。这种组别包括，例如，碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸组(天冬氨酸、谷氨酸)、非极性氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、极性不带电氨基酸组(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、酪氨酸)、杂环氨基酸组(组氨酸、色氨酸、脯氨酸)和脂肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)。已知多种对特定细胞或组织具有向性的突变衣壳体。包含这些突变衣壳体的空心颗粒可被用于本发明。
用于本发明的空心颗粒可被修饰。如本文所用，修饰包括功能修饰和作为标签的修饰。“功能修饰”指的是可用于增强或稳定空心颗粒和它的靶细胞间的特异性结合活性的修饰。功能修饰的实例包括衣壳的糖基化、去糖基化和PEG化。“作为标签的修饰”指的是可用于在体内检测本发明的复合物或它的靶细胞的修饰。作为标签的修饰的实例包括用荧光染料[荧光素、罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5、Alexa Fluor(注册商标)等]、荧光蛋白(例如PE、APC、GFP、Venus、YFP、DsRed、Sirius等)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)、放射性同位素(例如3H、14C、35S等)、生物素或链霉亲和素标记衣壳。修饰衣壳的方法没有特别限制，只要该方法允许蛋白质被修饰且不影响衣壳具有的最初病毒传染活性。可以使用市场上可购买的修饰试剂盒。试剂盒的实例包括Alexa Fluor 568蛋白质标记试剂盒(A10238)(由Molecular Probes制造)。
本发明所用的空心颗粒可具有天然衣壳或人工衣壳，只要所述衣壳的表面上分布有正电荷或负电荷，以便可形成离子键。例如，向衣壳表面添加氨基酸以调整所述衣壳表面的ζ电位，从而任何电荷都可分布在所述衣壳表面。此外，增加或减少所述任何电荷以调整库仑力，从而可调控本发明的复合物的稳定性。
本发明的复合物包含含核酸纳米颗粒和非包膜病毒的空心颗粒，其中它们彼此结合，例如静电地或化学地(通过共价键或离子键)结合以形成复合物。本发明的复合物的示意图显示在图7。然而，图7的示意图只是一个实例，并且本发明的复合物不限于示于图7的形式。本发明的复合物可含有超过一种纳米颗粒。本发明还包括含有两种或更多种纳米颗粒和两种或更多种空心颗粒的复合物，以及含有两种或更多种纳米颗粒和一种空心颗粒的复合物。
本发明的复合物的尺寸可通过透射电镜(TEM)或动态光散射(DLS)方法确定，例如光子相关光谱法、激光衍射法、低角度激光散射(LALS)和中角度激光散射(MALLS)或光阻法(例如库尔特分析)。当本发明的复合物通过TEM测量时，最长轴的长度(主轴直径)为例如50至1000 nm，优选80至800 nm，更优选100至500 nm。由于本发明的复合物的尺寸分布在一定范围内，上述数值是全部复合物的平均数或众数。
(2)生产本发明的复合物的方法
本发明提供了生产以上(1)所述本发明的复合物的方法。所述方法包括以下步骤：
(i) 生产含核酸的纳米颗粒的步骤，
(ii) 生产非包膜病毒的空心颗粒的步骤，以及
(iii) 将通过(i)得到的纳米颗粒与通过(ii)得到的非包膜病毒空心颗粒混合的步骤。
在本发明的一个方面，当脂质体被生产作为纳米颗粒时，可使用众所周知的脂质体生产方法。例如，脂质体可以通过溶剂注射、脂质水合、逆蒸发(back-evaporation)、通过反复冻融的冻干法制备。脂质体可以制备成多层囊泡或包括小单层囊泡的单层囊泡(SUV)的形式(Methods in Biochemical Analysis, 33: 337, 1988)。根据众所周知的方法，含核酸的脂质体可通过将核酸引入脂质体而生产。
在本发明的另一方面，当胶束被生产作为纳米颗粒时，可使用众所周知的胶束生产方法。本领域技术人员了解，许多作为两亲性分子的胶束载体在临界胶束浓度(cmc)和临界胶束温度(cmt)时可以自组装。含核酸的所述胶束可根据众所周知的方法，通过混合胶束载体与核酸生产。当核酸是两亲性分子时，所述胶束可通过自组装核酸生产。例如，P-PMO和tcDNA的胶束可参考非专利文献2生产。
在本发明的生产方法中，无包膜病毒的空心颗粒可直接从被空心颗粒源自的病毒感染的宿主细胞中制备。为了仅获得所述空心颗粒的目的，也可将其作为重组衣壳制备。制备这种空心颗粒的方法描述在专利文献1中。当病毒在被病毒感染的宿主细胞中增殖，随后构建子病毒颗粒时，空心颗粒通常形成。因此，所述空心颗粒可直接从被病毒感染的宿主细胞的提取物中或从病毒颗粒释放或出芽后的培养基中制备。在宿主细胞的提取物或培养基中，不仅有空心颗粒还有病毒颗粒。因此，优选所述病毒颗粒从宿主细胞的提取物或培养基中分离出来，或被灭活以纯化空心颗粒。为了这些目的，可以用已知的方法。分离病毒颗粒及制备空心颗粒的方法的实例包括使用氯化铯的密度梯度离心法，以及如JP-A 2007-117003描述的包括使用离子交换膜的方法。在只有空心颗粒被制备为重组衣壳的情况下，含有所需病毒的Cap基因的表达载体可在合适的宿主细胞中表达。例如，为了制备AAV的重组空心颗粒，含有所需血清型AAV的Cap基因的核苷酸可被插入合适的表达载体中。在宿主细胞中表达所述Cap基因后，重组空心颗粒可以从通过破碎宿主细胞获得的细胞提取物或从宿主细胞的培养基获得。可通过本领域已知的方法从细胞提取物或培养基对空心颗粒进行收集。
从细胞匀浆中纯化源自AAV的空心颗粒可根据本领域已知方法进行。例如，空心颗粒可通过作为通用方法的氯化铯密度梯度超速离心法纯化，或通过使用包括离子交换色谱法的多种色谱法纯化。此外，空心颗粒和病毒颗粒也可通过使用离子交换膜分离并纯化。
混合纳米颗粒和无包膜病毒的空心颗粒的步骤可进一步包括搅拌混合物和/或允许混合物静置。搅拌和静置各进行1至60分钟，优选5至30分钟。此外，搅拌和静置各自在0至40℃，优选4℃至室温下进行。
在混合纳米颗粒和无包膜病毒的空心颗粒的步骤中，核酸和空心颗粒以核酸与空心颗粒例如50-10000:1的摩尔比例混合，优选100-8000:1，并且更优选150-5000:1。
本发明的方法可进一步包括取决于预期用途，调整纳米颗粒和/或复合物的尺寸的步骤。例如，尺寸调整可以通过将纳米颗粒和/或复合物通过具有不同孔径的过滤器进行，例如使用挤压机。
(3) 本发明的药物组合物
本发明的药物组合物包含以上(2)所述复合物作为活性成分。上述药物组合物的施用途径没有特别限制，只要施用途径是药学上可接受的，且可根据治疗方法选择。例如，本发明的药物组合优选全身例如静脉内或动脉内，或局部例如肌肉内、皮下、口服施用到组织或透皮施用。本发明的药物组合物的剂型没有特别限制。剂型的实例包括注射剂、口服制剂、滴注剂、吸入剂、药膏和洗剂。
包含在本发明组合物中的本发明复合物的浓度合适地在0.1 nM至1000 μM范围内，优选1 nM至500μM范围内，并且更优选10 nM至100 μM范围内。本发明的药物组合物体内施用的剂量优选考虑本发明复合物中所含核酸类型、剂型、患者的情况例如年龄和体重、施用途径以及疾病的性质和范围来调整。对于成年人，本发明的药物组合物通常在本发明的复合物的0.1 mg至10 g/天的范围，优选1 mg至1 g/天的范围施用。上面提到的数值可因目标疾病的类型、剂型和目标分子而变化。因此，在一些情况下，少于上述数值的剂量可为足够的，而在一些情况下则相反，可能需要超过上述数值的剂量。本发明的药物组合物可一天施用一次至若干次，或以一天至若干天的间隔重复施用。
在本发明的一个方面，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的添加剂。添加剂的实例包括乳化助剂(例如具有6至22个碳原子的脂肪酸、或其药学上可接受的盐、白蛋白、右旋糖酐)、稳定剂(例如胆固醇、磷脂酸)、等渗剂(例如氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH调节剂(例如盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺)，及它们的组合。添加剂在本发明的药物组合物中的含量合适地为按重量计90%或更少，优选按重量计70%或更少，并且更优选按重量计50%或更少。
本发明的药物组合物可适用的疾病没有特别限制。对于已知有有效治疗性(包括症状减轻)或预防性核酸药物的多种疾病，制备包含该核酸药物的本发明的复合物，且所述复合物可用作治疗药或预防药。适用疾病的实例包括但不限于癌症(实体癌、血癌等)、感染、遗传病、炎性疾病、心血管疾病和代谢综合征。本发明的药物组合物适用的受试者没有特别限制。受试者可能是包含在本发明的复合物中的核酸药物适用的受试者，或需要治疗或预防的受试者。受试者的实例包括人类和非人的哺乳动物。
在本发明的一个方面，本发明所用核酸是具有与在DMD患者(或患有DMD的动物)的dystrophin基因上包含剪接促进位点的区域互补(反义)的核苷酸序列的核酸(反义核酸)。剪接促进位点是当内含子从mRNA前体通过剪接切除时发挥作用的区域。剪接促进位点在内含子和外显子中均存在。反义核酸通过与dystrophin基因的mRNA前体上的剪接促进位点杂交抑制剪接体复合物的形成，并以序列特异性方式诱导外显子跳跃。因此最终在剪接过程中，导致DMD的具有终止子的外显子被跳过，且随后产生能使dystrophin蛋白表达的成熟mRNA。导致DMD的外显子的具体实例包括人类dystrophin基因中的外显子2、8、23、43至46和50至53。在本发明的一个方面，使用靶向外显子51的序列(示于SEQ ID NO：3)的反义核酸。
dystrophin基因的外显子跳跃是否发生可以如下确定：将本发明的复合物与dystrophin表达细胞(例如人类横纹肌肉瘤细胞)接触，由RT-PCR从dystrophin表达细胞的总RNA中扩增与dystrophin基因的mRNA上的目标外显子相邻的区域并对PCR扩增产物进行巢式PCR或序列分析。跳跃效率可通过测量"A"(其为dystrophin基因的mRNA中跳跃外显子的多聚核苷酸量)和"B"(其为dystrophin基因的mRNA中非跳跃外显子的多聚核苷酸量)，然后基于"A"和"B"的测量数值根据以下公式计算来确定。
跳跃效率(%)=A/(A+B)×100
优选地，本发明的药物组合物以10%或更高、20%或更高、30%或更高、40%或更高、50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、或90%或更高的效率诱导外显子跳跃。
实施例
在下文参考实施例更具体地解释本发明，本发明的范围不局限于这些实施例。
实施例1：AAV空心颗粒的生产和物理性质的测量
(1) AAV 8型和9型空心颗粒的生产
如WO2012/144446中描述的，将4×108个293EB细胞接种到含有10% FBS+/DMEM/F12培养基的28个225 cm2烧瓶(或一个6320cm2 10段烧瓶)中，并在5% CO2、37℃下培养。培养48小时后，收集细胞，并通过磷酸钙法将将携带AAV ITR和在ITR之间插入的eGFP基因的AAV载体质粒，携带AAV 8型(AAV8)或AAV 9型(AAV9)的rep和cap基因的AAV辅助质粒以及携带腺病毒2型的E2A、E4和VA RNA基因的腺病毒辅助质粒各以650 μg的量引入细胞。继续培养使AAV颗粒和AAV空心颗粒在细胞中复制。引入质粒72小时后通过离心收集细胞，并且用30 mLTris缓冲盐水(TBS)将细胞沉淀悬浮。悬浮液反复冻融4至6次。每一次融化都将悬浮液通过涡旋充分混合。
向冻融后的细胞悬浮液加入150 μL 的1 M的MgCl2和20 μL的250 U/μL的Benzonase(由Merck Millipore制造)。在37℃孵育30分钟后，向细胞悬浮液中加入300 μL0.5 M的EDTA以终止反应。接着向细胞悬浮液中加入900 μL 5 M的NaCl，混合均匀，并在4℃以10,000×g离心10分钟。收集上清。
此外，由此获得的上清在50℃加热30分钟以使热敏感蛋白质变性，接着在4℃以10,000×g离心10分钟。收集上清。
(2) 通过超速离心法粗纯化
在置于离心管中的1.50 g/mL氯化铯溶液上，铺放1.25 g/mL的氯化铯溶液，并且在上面(1)中收集的先前经热处理的上清进一步铺在上方。在16℃以25,000×g离心3小时后，从离心管底部收集内容物流体的0.5 mL级分。测量每个级分的折射率(RI)，并且将具有1.365至1.368的折射率的级分混合。用约100倍体积的MHN缓冲液[3.33 mM MES, 3.33 mMHEPES (pH 6.5), 3.33 mM NaOAc]对混合物透析30分钟。产生的透析液用约5倍体积的MHN缓冲液稀释。
(3) 空心颗粒的分离和纯化
使用阳离子交换膜Mustang S Acrodisc(由Pall公司制造)作为离子交换载体，其在基质材料表面保留磺酸基团。使用AKTA explorer(由GE Healthcare制造)作为FPLC系统。纯化按下述进行。用MHN缓冲液平衡Mustang S Acrodisc后，将上面(2)所得透析后的稀释溶液以3 mL/min的流速上载到Mustang S Acrodisc，以将空心颗粒吸附到膜上并将AAV颗粒去除和分离。用10 CV(盘容量的10倍)的MHN缓冲液洗涤Mustang S Acrodisc。在0至2M NaCl/50 CV的浓度梯度条件下洗脱空心颗粒，并且收集1 mL的级分。收集280 nm吸收峰值处的级分所含的空心颗粒。通过电子显微镜发现空心颗粒在中心具有黑色部分，并且不含病毒基因组。
(4) AAV空心颗粒的物理性质的测量
上面(1)至(3)制备的AAV8和AAV9的空心颗粒用PBS(-)(磷酸盐缓冲盐水)调整到浓度为4×1013 v.p.当量/mL。用Viscotek 802(由Malvern制造)通过动态光散射测量粒度。作为结果，AAV8和AAV9的空心颗粒的纯度分别是96.8%和98.3%。AAV8和AAV9两者的空心颗粒的粒度均为约28 nm。此外，用Zetasizer nano(由Malvern制造)测量ζ电位。AAV8和AAV9两者的空心颗粒的电导率均为15 mS/cm，并且AAV8和AAV9两者的空心颗粒的等电点均为约pH 8.5。
实施例2：P-PMO/AAV空心颗粒复合物的生产
(1) P-PMO的生产
根据Ezzat K, et al., 2015, NANO LETTERS, vol. 15, pp4364中描述的方法制备肽缀合的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(P-PMO)。本实施例中制备的P-PMO由Pip6a肽(SEQ ID NO：1)和靶向SEQ ID NO：3中示出的序列的PMO反义寡核苷酸组成，SEQ ID NO：3中示出的序列是小鼠dystrophin基因的外显子51的序列，其中所述PMO反义寡核苷酸通过酰胺接头与Pip6a C端连接。P-PMO溶液用PBS(-)以50 μM浓度制备。
(2) P-PMO/AAV空心颗粒复合物的生产
实施例2 (1)中制备的P-PMO与实施例1中制备的AAV8空心颗粒以1500:1、750:1或150:1的摩尔比例在PBS(-)或Opti-MEM培养基(由Thermo Fisher Scientific制造)中混合，随后在室温静置15分钟。
用Zetasizer Nano ZSP通过DLS测量P-PMO与AAV8空心颗粒以1500:1的摩尔比例(50 μM P-PMO、33.3 nM AAV8空心颗粒)的混合物中物质的粒度。作为对照还测量单独的AAV8空心颗粒和单独的P-PMO的粒度分布。通过DLS的粒度分布测量结果展示在图1。此外，在1.5%琼脂糖凝胶、100 V和10分钟的条件下对以750:1和150:1的摩尔比例的混合物进行凝胶移位测定。作为对照，对单独的P-PMO进行凝胶移位测定。凝胶移位测定的结果展示在图2。
从图1展示的结果可以看出，AAV空心颗粒、P-PMO和混合物具有其各自的粒度峰值。已知由于流体动力学尺寸是通过DLS测量，通过DLS得到的粒度将比实际粒度大。据报道，P-PMO形成具有约30至90 nm的直径的胶束化纳米颗粒(非专利文献2)。另一方面，混合物中所含物质的粒度比AAV空心颗粒的粒度和P-PMO纳米颗粒的粒度都大。因此发现混合物中形成了P-PMO/AAV空心颗粒的复合物。从图2展示的凝胶移位测定结果也可看出，P-PMO/AAV空心颗粒复合物与P-PMO在电学性能上明显不同。此外，通过透射电镜(TEM)成像观察以5000:1的摩尔比例混合得到的P-PMO/AAV空心颗粒复合物。结果发现有颗粒具有100至500nm的最长轴。当该复合物在95℃下热处理10分钟并随后进行TEM分析时，没有发现这种结构。
实施例3：P-PMO/AAV空心颗粒复合物的细胞引入效率
(1) H2K-mdx52 成肌细胞
在0.5 mL的分化培养基(补充5%马血清的DMEM培养基)中，将源自mdx小鼠的H2K细胞系(H2K-mdx52)的50,000个细胞培养4天以使之分化为肌管细胞，mdx小鼠是肌营养不良模型动物(Proc Natl Acad Sci USA 2012 Aug 21; 109 (34): 13763-13768)。随后，培养基换成含50 μM(和P-PMO的浓度一样)的P-PMO/AAV空心颗粒复合物的Opti-MEM培养基(由Thermo Fisher Scientific制造)，摩尔比例为1500:1、750：1或150:1。不加转染试剂将细胞培养48小时。作为对照，将细胞培养在只含有相同浓度的P-PMO而不是复合物的培养基中。使用TRIzol(由Invitrogen制造)从培养的细胞中提取总RNA。使用RNA作为模板并使用分别示于SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的引物Ex50F和Ex53R，通过RT-PCR扩增dystrophin基因的外显子50至53。扩增产物的核苷酸长度通过MultiNA(由Shimadzu公司制造)分析，以确定外显子51的跳跃效率。结果展示在图3。此外，向培养的细胞中加入15 μL 0.1%的Triton-X100。允许细胞静置30分钟，用移液管吸取而悬浮，随后离心。通过用CytoSelect(商标)LDH细胞毒性测定试剂盒(由CBL制造)测量上清中的乳酸脱氢酶(LDH)，作为细胞膜缺陷标记。
从图3展示的结果可以看出，与单独的P-PMO相比，P-PMO/AAV空心颗粒复合物显示出高的外显子51跳跃效率。因此显示出P-PMO/AAV空心颗粒复合物具有比单独的P-PMO更高的细胞引入效率。此外，当LDH活性被作为细胞膜缺陷的指标测量时，所有样品中都未发现细胞膜缺陷。
(2) mdx52小鼠(局部的)
向5周龄的mdx52小鼠的双侧胫骨前肌经肌肉内施用P-PMO量为10 μg，摩尔比例为1500:1或150:1的P-PMO/AAV空心颗粒复合物(Biochem Biophyss Res Commun. 1997;238: 492-497)，所述小鼠在日本国立神经病学和精神病学中心(NCNP)饲养和繁殖。施用两周后，移除施用部位的骨骼肌。作为对照，使用仅施用P-PMO而非复合物得到的骨骼肌。使用抗dystrophin抗体NCL-DYS1(由Leica Microsystems制造)对因此获得的骨骼肌进行dystrophin免疫组化染色，并且测量每横截面积肌肉的dystrophin阳性肌肉纤维数量和荧光强度。结果展示在图4。此外，用补充了Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail(由Roche制造)的RIPA缓冲液从移除的骨骼肌中提取蛋白质，并对其进行蛋白质印迹分析以确定dystrophin对于管家蛋白GAPDH的相对量。结果展示在图5。
从图4和5展示的结果中可以看出，P-PMO/AAV空心颗粒复合物在增强dystrophin表达方面比单独的P-PMO更有效。
(3) mdx52小鼠(全身的)
向5周龄的mdx52小鼠经全身静脉内施用3 mg/kg或6 mg/kg的摩尔比例为1500:1或750:1的P-PMO/AAV空心颗粒复合物。施用两周后，每个部位的骨骼肌均被移除。作为对照，使用没有接受P-PMO的小鼠(空白)和只接受P-PMO而非复合物的小鼠。从被移除的骨骼肌中提取蛋白质，并且用实施例3(2)中相同的方式对其进行蛋白质印迹分析。结果展示在图6。
从图6展示的结果可以看出，与单独的P-PMO相比，P-PMO/AAV空心颗粒复合物极大增强了dystrophin在腓肠肌、膈膜和心肌中的表达。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1: Pip6a肽
SEQ ID NO: 2: B肽
SEQ ID NO: 3: 小鼠dystrophin基因外显子51的部分序列
SEQ ID NO: 4: Ex50F引物
SEQ ID NO: 5: Ex53R引物。
Figure IDA0003286594340000011
Figure IDA0003286594340000021
Figure IDA0003286594340000031

Claims (12)

1.包含含核酸纳米颗粒和非包膜病毒的空心颗粒的复合物。
2. 根据权利要求1所述的复合物，其中所述核酸是选自二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、肽缀合的PMO(P-PMO)、三环DNA(tcDNA)和2'O 甲基寡聚物(2'OMe)的核酸衍生物。
3. 根据权利要求1或2所述的复合物，其中所述核酸衍生物为含有肽的P-PMO，所述肽具有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中示出的序列。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的复合物，其中经透射电镜(TEM)测量，所述复合物具有50至1000 nm的最长轴。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合物，其中所述空心颗粒为腺伴随病毒的空心颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物，其中所述核酸是与dystrophin基因序列互补的反义核酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合物，其中所述纳米颗粒由所述核酸组装而形成。
8.生产包含含核酸纳米颗粒和衣壳病毒的复合物的方法，所述方法包括：
(i) 生产含有核酸的纳米颗粒的步骤，
(ii)生产非包膜病毒的空心颗粒的步骤，以及
(iii) 将通过(i)得到的纳米颗粒与通过(ii)得到的非包膜病毒空心颗粒混合的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(iii)中所述核酸和所述空心颗粒以150至1500摩尔的所述核酸与1摩尔的所述空心颗粒的比例混合。
10.包含权利要求1至7中任一项所述复合物的药物组合物。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其用于全身静脉内施用。
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