JPWO2020158792A1 - 核酸送達複合体 - Google Patents

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Abstract

核酸を含むナノ粒子と、非エンベロープウイルスの中空粒子を含む複合体、当該複合体の製造方法、および当該複合体を含む医薬組成物が提供される。

Description

本発明は、核酸を送達するための複合体及びその製造方法、並びに当該複合体を有効成分として含む医薬組成物に関する。
アンチセンス核酸が１９７０年代後半に報告されてから、核酸分子を薬剤として応用することを目指す多くの研究・開発が行われてきた。とりわけ、２０００年代初頭にはほ乳類細胞においてＲＮＡ干渉を誘導するｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が報告され、核酸医薬品の開発に拍車がかかっている。近年においては、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）やｌｏｎｇ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）など非翻訳性ＲＮＡの生物学的機能およびその重要性が明らかになり、核酸医薬品の新たな標的として、またｍｉＲＮＡに関してはそれ自体も核酸医薬品として注目を集めている。
例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、多くの場合ジストロフィン遺伝子の欠失変異によるフレームシフトが原因となり、進行性の筋力低下・筋萎縮を示す重篤な遺伝性疾患である。現在、ＤＭＤモデル動物を対象に、フレームシフト変異によるアミノ酸読み枠のずれを、アンチセンス・モルフォリノ核酸を用いたエクソンスキップにより修正する技術の開発が進められている（非特許文献１）。
これまで、核酸医薬品は生体内における分解の問題が指摘されてきたが、修飾核酸技術や薬剤送達系（ＤＤＳ）技術が著しく発展したことから、安定で有効性の高い候補品が次々と開発されている。例えば、非ウイルス性のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の中空粒子の内部に核酸を導入するＤＤＳは、安全性が高く臓器指向性のある技術として確立されている（特許文献１）。
さらに、核酸医薬品の標的臓器に対する治療効果を高め、安全性とコストを改善するために、高い細胞膜透過性を有するペプチド付加モルフォリノの開発も進められている（非特許文献２）。しかしながら、より安全性が高く、臓器／組織特異性を有し、高い治療効果を併せ持つ画期的なＤＤＳを確立することが望まれている。
国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット
Ｋｏｍａｋｉ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１０，Ｉｓｓｕｅ ４３７，ｅａａｎ０７１３，２０１８ Ｅｚｚａｔ Ｋ， ｅｔ ａｌ．，ＮＡＮＯ ＬＥＴＴＥＲＳ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ４３６４，２０１５
本発明は、安全性が高く、臓器／組織特異性を有し、高い治療効果を併せ持つＤＤＳを確立することを目的とする。
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、核酸医薬品の担体として非エンベロープウイルスの調製の際に生じる中空粒子を活用し、核酸医薬を含むナノ粒子と中空粒子が静電気的に結合した複合体を調製することに成功した。この複合体は、安全性、臓器／組織特異性を有し、高い治療効果を併せ持つＤＤＳであることを確認した。本発明は、これらの知見と結果に基づくものであり、以下を提供するものである。
すなわち、本発明は、
［１］ 核酸を含むナノ粒子と、非エンベロープウイルスの中空粒子を含む複合体、
［２］ 核酸が、ホスホロジアミデート化モルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド付加ＰＭＯ（Ｐ−ＰＭＯ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）及び２’Oメチルオリゴマー（２’ＯＭｅ）からなる群より選択される核酸誘導体である、［１］記載の複合体、
［３］ 核酸誘導体が、配列番号１又は配列番号２に記載の配列を有するペプチドを含むＰ−ＰＭＯである、［１］又は［２］記載の複合体、
［４］ 最も長い部分が５０〜１０００ｎｍである、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の複合体、
［５］ 中空粒子がアデノ随伴ウイルスの中空粒子である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の複合体、
［６］ 核酸が、ジストロフィン遺伝子のアンチセンス核酸である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の複合体、
［７］ ナノ粒子が、核酸が集合して形成されている、［１］〜［６］のいずれか１項記載の複合体、
［８］ 以下の工程を含む、核酸を含むナノ粒子とカプシドウイルスを含む複合体の製造方法；
（ｉ）核酸を含むナノ粒子を製造する工程、
（ｉｉ）非エンベロープウイルスの中空粒子を製造する工程、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）のナノ粒子と（ｉｉ）の非エンベロープウイルスの中空粒子を混合する工程、
［９］ （ｉｉｉ）の工程において、核酸と中空粒子を、中空粒子１に対して核酸が１５０〜１５００のモル比で混合する、［８］記載の製造方法。
［１０］ ［１］〜［７］いずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物、
［１１］ デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）治療用である、［１０］記載の医薬組成物、
［１２］ 経静脈全身投与用である、［１０］又は［１１］に記載の医薬組成物、
［１３］ 全身投与用である、［１０］又は［１１］に記載の医薬組成物、
［１４］ ［１］〜［７］いずれか１項に記載の複合体を対象に投与することを含む、疾患の予防又は治療方法、
［１５］ デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療するための、［１３］記載の方法、
［１６］ 複合体が対象に全身投与される、［１４］又は［１５］記載の方法、
［１７］ 複合体が対象に経静脈全身投与される、［１６］記載の方法、
［１８］ ［１］〜［７］いずれか１項に記載の複合体のＤＤＳとしての使用、
［１９］ ＤＤＳが全身投与用である、［１８］記載の使用、
［２０］ ＤＤＳが経静脈全身投与用である、［１９］記載の使用、

［２１］ 核酸医薬の担体としての、非エンベロープウイルスの中空粒子の使用、
［２２］ 核酸医薬が、ホスホロジアミデート化モルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド付加ＰＭＯ（Ｐ−ＰＭＯ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）及び２’Oメチルオリゴマー（２’ＯＭｅ）からなる群より選択される核酸誘導体を含む、［２１］記載の使用、
［２３］ 核酸誘導体が、配列番号１又は配列番号２に記載の配列を有するペプチドを含むＰ−ＰＭＯである、［２２］記載の使用、
［２４］ 核酸医薬と中空粒子が複合体を形成し、該複合体の最も長い部分が５０〜１０００ｎｍである、［２１］〜［２３］のいずれか１項に記載の使用、
［２５］ 中空粒子がアデノ随伴ウイルスの中空粒子である、［２１］〜［２４］のいずれか１項に記載の使用、
［２６］ 核酸医薬が、ジストロフィン遺伝子のアンチセンス核酸を含む、［２１］〜［２５］のいずれか１項に記載の使用、
［２７］ 核酸医薬が、核酸が集合して形成されたナノ粒子を含む、［２１］〜［２６］のいずれか１項記載の使用、
［２８］ 核酸医薬が全身投与される、［２１］〜［２７］のいずれか１項記載の使用、及び
［２９］ 核酸医薬が経静脈全身投与される、［２８］記載の使用
に関する。
本発明により、安全性が高く、臓器／組織特異性を有し、高い治療効果を併せ持つＤＤＳが提供される。
本発明の複合体、ＡＡＶ中空粒子及びＰ−ＰＭＯのＤＬＳ（動的光散乱）法による粒子径分布を示す図である。 本発明の複合体及びＰ−ＰＭＯのゲルシフトアッセイの結果を示す図である。 本発明の複合体及びＰ−ＰＭＯのそれぞれによるエクソン５１スキップの効率を示す図である。 本発明の複合体及びＰ−ＰＭＯのそれぞれを投与したマウスの筋肉中のジストロフィン陽性筋線維数及び蛍光強度を示す図である。 本発明の複合体及びＰ−ＰＭＯのそれぞれを投与したマウスの筋肉中のジストロフィン量を示す図である。 本発明の複合体及びＰ−ＰＭＯのそれぞれを投与したマウスの各種筋肉中のジストロフィン量を示す図である。 本発明の複合体の一例を示す２Ｄ模式図である。
（１） 本発明の複合体
本発明の複合体は、核酸を含むナノ粒子と、非エンベロープウイルスの中空粒子を含む複合体である。
本明細書において「核酸」は、天然型核酸、核酸誘導体及びそれらの組合せを含む。「天然型核酸」とは、自然界に存在する天然型ヌクレオチドのみが連結しているＤＮＡ及びＲＮＡをいう。ただし、本実施形態の天然型核酸は、複合体を構成する中空粒子が由来する非エンベロープウイルス及び複合体を投与する生体に対して外因性の核酸である。
核酸誘導体は、化学修飾核酸、核酸類似体、人工核酸及びそれらの組合せを含む。「化学修飾核酸」とは、人工的に化学修飾をされた核酸をいう。例えば、メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡ等が挙げられる。「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された高分子化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ／ＬＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、モルフォリノ核酸（ホルフォリノオリゴマー：ＰＭＯを含む）等が挙げられる。モルフォリノオリゴマーは、モルフォリノサブユニット（単量体）が重合したオリゴマーを指すものである。モルフォリノサブユニットは、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドのリボース（構成糖）全体が、モルフォリノ環に置き換わって構造を有する。「人工核酸」とは人為的に作製された、天然には存在しない核酸を言い、天然型核酸の一部に非天然型ヌクレオチドを含む核酸又は非天然型ヌクレオチドのみが連結してなる核酸を包含する。ここでいう「非天然型ヌクレオチド」とは、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドをいう。非天然型ヌクレオチドには前記の化学修飾核酸、核酸類似体に該当するものも包含される。
本発明に使用される核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知の標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ）、ＤＩＧ、ビオチン、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ７、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｂｏｄｉｐｙ４９３、ＮＢＤ、ＴＡＭＲＡ）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエステル）が挙げられる。
本発明に使用される核酸は、任意の遺伝子、ｍＲＮＡ若しくはその断片、又はこれらの相補配列を有する核酸、例えば、オリゴヌクレオチドが挙げられる。当該核酸は、生体内又は細胞内において、好ましくは細胞内において、特定の生物学的機能、例えば、酵素機能、触媒機能又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、転写、翻訳の阻害又は亢進）を有する核酸であって良く、機能性核酸と呼ぶことがある。具体的には、例えば、ＲＮＡ干渉剤、核酸アプタマー（ＲＮＡアプタマー及びＤＮＡアプタマーを含む）、デコイ、アンチセンス核酸（アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ）、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、Ｕ１アダプター、モレキュラー・ビーコン、リボスイッチ、又は転写因子結合領域等が挙げられる。特にアンチセンスＤＮＡやＲＮＡ干渉剤は、本発明における「核酸」として好ましく適用できる。ここで、「ＲＮＡ干渉剤」とは、生体内においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができる物質をいう。例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む）が挙げられる。
本発明に使用される核酸の塩基長は特に限定されないが、例えば１０〜１０，０００塩基、好ましくは１２〜２００塩基、さらに好ましくは１５〜５０塩基である。
ナノ粒子とは、一般的には粒子径がナノメートル（ｎｍ）オーダーの微細粒子を指す。本発明の複合体には、直径が１〜１０００ｎｍであるナノ粒子を使用することができる。好適には１０〜２００ｎｍ径の粒子、より好適には３０〜９０ｎｍ径の粒子を使用することができる。本発明の複合体に含まれるナノ粒子は、その表面全体あるいは部分が正電荷又は負電荷を有するものであって核酸を含んでいればあらゆる形状およびあらゆる形態を有してもよく、通常は球状であるが、当該ナノ粒子の性状や用途に応じて異なる形態が可能である。ナノ粒子としては、リポソーム、アルブミンナノ粒子、ミセル、デンドリマー、ナノエマルジョン、金属ナノ粒子、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）が例示される。さらに、本発明には、粒子内に２種以上の機能性核酸を含むナノ粒子を使用することができる。
リポソームは、脂質二重膜から構成される脂質ナノ粒子である。細胞膜は主にリン脂質二重膜から構成されているため、リポソームは生体適合性の面で優れている。本発明において、核酸はリポソームの内部に封入され、リポソームの表面に結合させ、又はリポソームの脂質二重膜に挿入される。リポソームは、表面に修飾を施すことにより、様々な機能を付与することができる。例えば、リポソームにＰＥＧ修飾を行うことで血中安定性を改善することができ、特定の受容体に対するリガンドや特定の細胞（例えばがん）に対する抗体（又は抗体断片）をリポソーム表面に付加することにより標的指向性を与えることができる。ここで、リポソームを構成する膜成分に特に限定はなく、例えば、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。特にリン脂質として、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＥＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＰＳ、ＰＧ、ＰＩ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣなどを挙げることができる。
ミセルは、親水性部分と疎水性部分を有する両親媒性分子の集合体（会合体）である。ミセルは、疎水性コア又は親水性コアを有することができる。例えば、リン脂質からなる親水性部分と脂肪酸からなる疎水性部分を有する分子が、水性溶媒中で疎水性コアを有するミセルを形成する。ミセルはポリマーを含んでもよい。ある態様において、ミセルはホモポリマーを含んでもよい。典型的なホモポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）など）、ポリ（アミノ酸）（例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）など）、ポリ−（γ−Ｌ−グルタミルグルタミン）（ＰＧＧＡ）、ポリ（フェニレンオキシド）（ＰＰＯ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（乳酸）を含む。ある態様において、ミセル担体は、ポリ−（γ−Ｌ−グルタミルグルタミン）（ＰＧＧＡ）を含んでもよい。他の態様において、ミセルは、コポリマー、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含んでもよい。一部の態様において、ミセルは、ブロックコポリマーを含んでもよい。典型的なブロックコポリマーは、ジブロックコポリマーである。一部の態様において、ジブロックコポリマーは、非極性繰り返し単位と極性繰り返し単位とを含んでもよい。典型的な極性繰り返し単位は、アルキレングリコール（例えばエチレングリコールなど）、アルキレンオキシド（例えばエチレンオキシドなど）、および親水性アミノ酸を含む。典型的な非極性繰り返し単位は、γ−Ｌ−グルタミルグルタミン、グルタミン酸、乳酸−コ−グリコール酸、フェニレンオキシド、ε−カプロラクトン、乳酸、スチレン、ブチレンオキシド、炭化水素、および疎水性アミノ酸、例えばアスパラギン酸などを含む。２種を超える異なる繰り返し単位を有する他のブロックコポリマー、例えばトリブロックコポリマーなどを用いてもよい。
本発明において上記ミセルはその表面が、正電荷あるいは負電荷を有するような構造をとるものが好ましく、そのためのオリゴペプチド又はその誘導体のような電荷付与機能を有する物質を含んでいてもよい。特に限定はされないが、本発明の一態様として、指向性を有するカプシドと当該ミセルの組み合わせにおいては、当該カプシド表面が負電荷であれば前記ミセル表面は正電荷になるようにすることが好ましい。
本発明の一態様として、核酸はミセル内部に包含される。また、別の態様として、両親媒性分子となるように修飾された核酸が集合してミセルを形成する。本発明の一態様として、ミセルを形成するように核酸にペプチドを付加することができる。核酸に付加するペプチドとしては、核酸と結合して両親媒性分子となるものであれば何でも良く、さらにナノ粒子に細胞指向性及び／又は細胞透過性を付与するペプチドが使用できる。当該ペプチドは、例えばリンカー部分を介して核酸に結合される。リンカー部分はアミドリンカーが例示され、任意に置換されたピペラジニル部分を含んでもよく、βアラニン及び／又は６−アミノヘキサン酸サブユニットをさらに含んでもよい。さらにペプチドは、リンカー部分なしで核酸に直接結合させることもできる。ペプチドの結合は核酸の３’末端でもよく、５’末端でもよい。
本発明において、ナノ粒子は核酸が集合して形成されていてもよい。本発明の一態様として、ナノ粒子はホスホロジアミデート化モルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）及び／又はペプチド付加ＰＭＯ（Ｐ−ＰＭＯ）が自己集合したナノ粒子である。Ｐ−ＰＭＯはモルフォリノ核酸にペプチドが結合した核酸誘導体である。Ｐ−ＰＭＯに含まれるペプチドは、細胞膜透過性を有するペプチドが好適に使用でき、例えば配列番号１の配列を有するＰｉｐ６ａ又は配列番号２の配列を有するＢペプチドが使用できる。また、本発明の別の一態様として、ナノ粒子はトリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、例えばホスホロチオエート化ｔｃＤＮＡが自己集合したナノ粒子である。また、本発明の別の一態様として、ナノ粒子は２’Oメチルオリゴマー（２’ＯＭｅ）が自己集合したナノ粒子である。
本発明の複合体は、非エンベロープウイルスの中空粒子を含む。ウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）において、ウイルス核酸又はコアを取り囲む複数の単位タンパク質（カプソメア：ｃａｐｓｏｍｅｒｅ）からなる外皮（ｃｏａｔ）又は殻（ｓｈｅｌｌ）をカプシドという。本明細書では、単に「カプシド」と標記した場合には当該構造体を意味する。また、カプシドにおいて、その内部にウイルス核酸、コア又は他の物質を含まないカプシドタンパク質のみから構成されたものを、本明細書では「中空粒子」と呼ぶ。これに対して、その内部にウイルス核酸やコアを含むものを、「ヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）」と呼ぶ。
中空粒子は、本発明の複合体を投与する生物種に合わせて選択すればよい。例えば、投与する生物種を、動物とする場合には動物ウイルス由来の中空粒子を、植物とする場合には植物ウイルス由来の中空粒子を、それぞれ用いればよい。カプシドは、大別すると正２０面体型とらせん型が知られているが、本発明の複合体に使用される中空粒子のカプシドは、いずれの形態であってもよい。
本発明に使用される非エンベロープウイルスの中空粒子の由来には特に限定はなく、ＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスを問わない。動物ウイルス由来の中空粒子としては、例えば、ＲＮＡウイルスであれば、ピコルナウイス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、レオウイルス科又はビルナウイルス科に属するウイルス由来の中空粒子が挙げられる。また、ＤＮＡウイルスであれば、アデノウイルス科、イリドウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、又はパポバウイルス科に属するウイルス由来の中空粒子が挙げられる。ＲＮＡウイルス群のピコルナウイス科に属するウイルスや、ＤＮＡウイルス群のアデノウイルス科又はパルボウイルス科に属するウイルス由来の中空粒子は、本発明に好適に使用できる。アデノウイルス科のアデノウイルス、又はパルボウイルス科のＡＡＶに由来する中空粒子は、本発明に特に好適に使用できる。
植物ウイルス由来の中空粒子としては、例えば、ＲＮＡウイルスであれば、テヌイウイルス属、トバモウイルス群、ポティウイルス科、ダイアンソウイルス群、ブロモウイルス群、ククモウイルス群、レオウイルス科又はクリプティックウイルス群に属するウイルス由来の中空粒子が挙げられる。また、ＤＮＡウイルスであれば、カリモウイルス属、バドナウイルス属又はジェミニウイルス属のいずれのウイルス由来の中空粒子が挙げられる。
中空粒子のカプシドを構成するカプソメアは、カプシドを構成可能な範囲において変異を含んでいてもよい。ここでいう「変異」とは、カプソメアを構成するアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されていることをいう。アミノ酸置換の場合、類似アミノ酸間での置換が好ましい。「類似アミノ酸」とは、アミノ酸を電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質に基づいて分類した場合に、同一の集団に属するアミノ酸をいう。このような集団には、例えば、塩基性アミノ酸群（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸群（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非極性アミノ酸群（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン）、極性無電荷アミノ酸群（セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン）、分枝鎖アミノ酸群（ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、チロシン）、異節環状アミノ酸群（ヒスチジン、トリプトファン、プロリン）、脂肪族アミノ酸群（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）が挙げられる。特定の細胞や組織に対する指向性を有する種々の変異カプソメアが知られているが、本発明にはこれらを含む中空粒子を使用してもよい。
本発明に使用される中空粒子は、修飾されていてもよい。ここでいう修飾は、機能上の修飾又は標識としての修飾を含む。「機能上の修飾」とは、中空粒子とその標的細胞間の特異的な結合活性を増強又は安定化する上で有用な修飾をいう。例えば、カプシドのグリコシル化、脱グリコシル化、ＰＥＧ化等が挙げられる。「標識としての修飾」とは、本発明の複合体又はその標的細胞をｉｎ ｖｉｖｏで検出する上で有用な修飾をいう。例えば、蛍光色素（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、Ｓｉｒｉｕｓ等）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによるカプシドの標識が挙げられる。カプシドの修飾は、タンパク質への修飾が可能で、かつカプシドの有するウイルスの初期感染活性に影響を与えない方法であれば、特に限定はしない。また、市販の修飾キットを用いてもよい。例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ （Ａ１０２３８）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）が挙げられる。
本発明に使用される中空粒子は、その表面にイオン結合が形成できるような正電荷又は負電荷の電荷が分布していれば天然型カプシド又は人工型カプシドのいずれを有するものであっても好適に使用できる。特に限定はされないが例えばカプシド表面にアミノ酸を付加することで当該カプシド表面のゼータ電位を調製することにより任意の電荷を分布させることができる。さらに任意の電荷を強弱させることにより、クーロン力を調整し本発明の複合体の安定性を制御することができる。
本発明の複合体は、核酸を含むナノ粒子と非エンベロープウイルスの中空粒子を含み、これらは例えば静電気的又は化学的（共有結合又はイオン結合）に結合して複合体を形成している。本発明の複合体の模式図を図７に示す。図７の模式図は１例であって、本発明の複合体は図７に示される形態に限定されない。また、本発明の複合体に含まれるナノ粒子は１つであることに限定されず、複数のナノ粒子と複数の中空粒子を含む複合体、複数のナノ粒子と１つの中空粒子を含む複合体も本発明に含まれる。
本発明の複合体のサイズは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は動的光散乱法（ＤＬＳ）、例えば、光子相関分光法、レーザー回折、低角レーザー光散乱（ＬＡＬＬＳ）および中角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）、光遮蔽法（たとえば、Ｃｏｕｌｔｅｒ分析法）で測定することができる。本発明の複合体をＴＥＭで測定した場合の最も長い部分の長さ（長軸径）は、例えば５０〜１０００ｎｍ、好ましくは８０〜８００ｎｍ、より好ましくは１００〜５００ｎｍである。本発明の複合体のサイズはある範囲に分布するため、前記の値は複合体全体の平均値もしくは最頻値である。
（２）本発明の複合体の製造方法
本発明は、前記（１）に記載する本発明の複合体の製造方法を提供し、以下の工程を含む。
（ｉ）核酸を含むナノ粒子を製造する工程、
（ｉｉ）非エンベロープウイルスの中空粒子を製造する工程、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）のナノ粒子と（ｉｉ）の非エンベロープウイルスの中空粒子を混合する工程。
本発明の一態様として、ナノ粒子としてリポソームを製造する際は、周知のリポソーム製造方法を用いることができる。例えば、溶媒の注入、脂質の水和、逆蒸発、凍結と融解の繰返しによる凍結乾燥により調製することができる。リポソームは多重状、または小型単層小胞体（ＳＵＶ）を含む単層状とすることができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，３３：３３７，１９８８）。核酸を含むリポソームは、周知の方法によってリポソームに核酸を導入して製造することができる。
本発明の別の一態様として、ナノ粒子としてミセルを製造する際は、ミセルを製造する周知の方法によって製造することができる。当業者は、多くのミセル担体が、その両親媒性分子から、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）および臨界ミセル温度（ｃｍｔ）で自己組織化し得ることを理解している。核酸を含むミセルは、周知の方法によってミセル担体と核酸を混合して製造することができる。また、核酸が両親媒性分子の場合は核酸を自己集合させてミセルを製造することができる。例えば、Ｐ−ＰＭＯ及びｔｃＤＮＡのミセルは非特許文献２を参照して製造することができる。
本発明の製造方法において、非エンベロープウイルスの中空粒子は、中空粒子が由来するウイルスに感染した宿主細胞から直接調製することができる。また、中空粒子のみ得ることを目的とする場合、組換えカプシドとして調製することもできる。これらの調製方法は、特許文献１に記載される。中空粒子は、通常、ウイルスに感染した宿主細胞内でウイルスが増殖し、娘ウイルス粒子が構築される際に、同時に形成される。したがって、中空粒子は、ウイルスに感染した宿主細胞の抽出液から、又はウイルス粒子の放出若しくは出芽後の培養液から直接調製することができる。この場合、宿主細胞の抽出液又は培養液には中空粒子と共にウイルス粒子も混在している。したがって、宿主細胞の抽出液又は培養液からウイルス粒子を分離し、又は失活させて、中空粒子を精製することが好ましい。これらは、公知の方法を利用すればよい。例えば、ウイルス粒子の分離と中空粒子の調製方法は、塩化セシウムを用いた密度勾配遠心法、及び特開２００７−１１７００３号公報に記載のイオン交換膜を用いる方法が挙げられる。中空粒子のみを組換えカプシドとして調製する場合、所望のウイルスのＣａｐ遺伝子を含む発現ベクターを、適当な宿主細胞内で発現させてもよい。例えば、ＡＡＶの組換え中空粒子を必要とするのであれば、所望の血清型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子を含むヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入すれば足りる。Ｃａｐ遺伝子を宿主細胞内で発現させた後に、その宿主細胞を破砕した細胞抽出液から、又はその宿主細胞の培養液から、組換え中空粒子を得ることができる。細胞抽出液や培養液からの回収方法は、当該分野で公知の方法により行えばよい。
細胞破砕物からＡＡＶ由来の中空粒子を精製する方法は、当該分野で公知の方法に基づいて精製すればよい。例えば、一般的な方法である、セシウム密度勾配超遠心法によって精製することができる。又はイオン交換クロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いた精製方法を利用して精製してもよい。さらに、イオン交換膜を用いて中空粒子とウイルス粒子とを分離、精製する方法を利用してもよい。
ナノ粒子と非エンベロープウイルスの中空粒子を混合する工程には、さらに、混合液を撹拌する工程及び／又は静置する工程を含んでもよい。撹拌する工程及び静置する工程は、それぞれ１〜６０分実施され、好適にはそれぞれ５〜３０分実施される。また、これらの工程は、それぞれ０〜４０℃で実施され、好適にはそれぞれ４℃〜室温で実施される。
ナノ粒子と非エンベロープウイルスの中空粒子を混合する工程において、混合する核酸と中空粒子のモル比は、例えば５０〜１００００：１、好ましくは１００〜８０００：１、より好ましくは１５０〜５０００：１である。
本発明の方法は、その用途によって、さらに、ナノ粒子及び／又は複合体の大きさを調整する工程を含んでもよい。当該調整方法は、例えば、エクストルーダーを用いて、孔径の異なるフィルターを通過させることによって、大きさの調節が可能である。
（３）本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前記（２）の複合体を有効成分として含む。医薬組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができる。例えば、静脈内投与、動脈内投与などの全身投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与などの局所投与が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。
本発明の組成物に含まれる本発明の複合体の濃度は、０．１ｎＭ〜１０００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ〜５００μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ〜１００μＭの範囲内がより好ましい。本発明の組成物を生体に投与する際の用量としては、含有される本発明の複合体に含有される核酸の種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明の複合体の量として、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ〜１ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与、又は１日から数日間の間隔で反復投与することができる。
本発明の一態様として、医薬組成物はさらに医薬的に許容可能な添加剤を含む。添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）、及びこれらの組合せを挙げることができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
本発明の医薬組成物が適用可能な疾病には特に限定はない。その治療（症状の緩和を含む）もしくは予防に有効な核酸医薬品が知られている種々の疾病に対して、当該核酸医薬品を含む本発明の複合体を調製することにより、これを治療薬・予防薬として使用することができる。例えば、がん（固形がん、血液がん等）、感染症、遺伝性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、メタボリックシンドローム等への適用が例示されるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物が適用可能な対象についても特に限定はない。本発明の複合体に含まれる核酸医薬の適用対象又は治療もしくは予防が必要な対象であればよく、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が挙げられる。
本発明の一態様として、本発明に使用される核酸は、ＤＭＤ患者（又はＤＭＤ疾患動物）のジストロフィン遺伝子上のスプライシング促進部位を含む領域に対して、相補的な（アンチセンス）塩基配列を有する核酸（アンチセンス核酸）である。スプライシング促進部位は、ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングによってイントロンが切り出される際に機能する領域である。当該部位は、イントロンとエクソンの両方に存在する。当該アンチセンス核酸は、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス促進部位にハイブリダイズすることで、スプライソソーム複合体の形成を阻害し、配列特異的にエクソンスキップを誘導する。そして、最終的に、スプライシング過程において、ストップコドンを有しＤＭＤの原因となるエクソンをスキップさせ、ジストロフィンタンパク質の発現を可能とする成熟ｍＲＮＡが生成される。ＤＭＤの原因となるエクソンとしては、具体的には、ヒトのジストロフィン遺伝子におけるエクソン２、８、２３、４３〜４６、５０〜５３等を挙げることができる。本発明の一態様として、エクソン５１の配列番号３の配列を標的とするアンチセンス核酸が例示される。
ジストロフィン遺伝子のエクソンススキップが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明の複合体を接触させ、前記ジストロフィン発現細胞のＴｏｔａｌ ＲＮＡから、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡの標的とするエクソンの周辺領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅産物に対してｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。スキッピング効率は、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡのうち、エクソンスキップしたポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソンスキップしなかったポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定し、これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
好ましくは、本発明の医薬組成物は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の効率でエクソンスキップする。
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＡＡＶ中空粒子の製造と物性測定
（１）８型及び９型ＡＡＶ中空粒子の製造
国際公開パンフレット ＷＯ２０１２／１４４４４６記載の２９３ＥＢ細胞 ４×１０８個を、１０％ＦＢＳ＋／ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む２２５ｃｍ２フラスコ２８本（又は６３２０ｃｍ２の１０段フラスコ１個）に接種し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。培養４８時間後に回収した細胞に、ＡＡＶのＩＴＲとその間に挿入されたｅＧＦＰ遺伝子を保持するＡＡＶベクタープラスミド、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）又は９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を保持するＡＡＶヘルパープラスミド、並びに２型アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子を保持するアデノウイルスヘルパープラスミドをそれぞれ６５０μｇずつリン酸カルシウム法にて導入した。そのまま培養を継続し、ＡＡＶ粒子及びＡＡＶ中空粒子を該細胞内で複製させた。プラスミド導入の７２時間後に細胞を遠心にて回収し、細胞ペレットを３０ｍＬのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）にて懸濁した。この懸濁液の凍結融解を４〜６回繰り返し、融解時に毎回ボルテックス操作にて懸濁液を十分に混合した。
凍結融解後の細胞懸濁液に１５０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２と２０μＬの２５０Ｕ／μＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルクミリポア社製）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、３００μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。その後、細胞懸濁液に９００μＬの５Ｍ ＮａＣｌを加えてよく混和し、４℃で１０，０００×ｇ、１０分間遠心して上清を回収した。
さらに、得られた上清を５０℃で３０分間加熱して、易熱性タンパク質を変性させた後、４℃で１０，０００×ｇ、１０分間遠心して上清を回収した。
（２）超遠心による粗精製
遠心チューブに入れた１．５０ｇ／ｍＬ塩化セシウム溶液上に１．２５ｇ／ｍＬ塩化セシウム溶液を重層し、さらにこの上に前記（１）で回収した熱処理後の上清を重層した。チューブを１６℃で２５，０００×ｇ、３時間超遠心後、内容液を遠心チューブ下方から０．５ｍＬずつ回収した。各画分の屈折率（ＲＩ：ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ：）を測定し、ＲＩが１．３６５〜１．３６８の画分を集め、その容量の約１００倍量のＭＨＮバッファー（３．３３ｍＭ ＭＥＳ、３．３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）、３．３３ｍＭ ＮａＯＡｃ）に対し、３０分間透析した。得られた透析物をその容量の約５倍量のＭＨＮバッファーで希釈した。
（３）中空粒子の分離及び精製
イオン交換担体として基材表面にスルホン酸基を保持する陽イオン交換膜ムスタングＳアクロディスク（ポール コーポレーション社製）を使用した。ＦＰＬＣシステムとして、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケア社製）を用い、以下に示す精製操作を行った。ＭＨＮバッファーでムスタングＳアクロディスクを平衡化した後、流速３ｍＬ／分で、前記（２）で得た透析後の希釈液をムスタングＳアクロディスクにロードし、中空粒子を膜に吸着させるとともにＡＡＶ粒子を分離、除去した。１０ＣＶ（ディスクの容量の１０倍量）のＭＨＮバッファーでムスタングＳアクロディスクを洗浄し、０〜２Ｍ ＮａＣｌ／５０ＣＶの濃度勾配条件にて中空粒子を溶出し、画分量１ｍＬで回収した。２８０ｎｍにおける吸光度のピークの画分に含まれる中空粒子を集め、電子顕微鏡により、中心に黒い部分がある、ウイルスゲノムが入っていない中空粒子であることを確認した。
（４）ＡＡＶ中空粒子の物性測定
（１）〜（３）で調製したＡＡＶ８及びＡＡＶ９の中空粒子を、それぞれＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水）で４×１０１３ ｖ．ｐ．相当／ｍＬの濃度に調製し、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ８０２（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）法により粒子径を測定した。その結果、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の中空粒子の純度は、それぞれ９６．８％、９８．３％であり、粒子径はいずれも２８ｎｍ程度であった。さらに、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いてゼータ電位を測定した。ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の中空粒子の電気伝導率は１５ｍＳ／ｃｍ、等電点はｐＨ８．５付近であることを確認した。
実施例２：Ｐ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体の製造
（１）Ｐ−ＰＭＯの製造
ペプチド修飾型ＰＭＯ（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒ：Ｐ−ＰＭＯ）をＥｚｚａｔ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， ＮＡＮＯ ＬＥＴＴＥＲＳ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ４３６４記載の方法に従って調製した。本実施例で調製したＰ−ＰＭＯはＰｉｐ６ａペプチド（配列番号１）と、そのＣ末端にアミドリンカーにより連結されたマウスジストロフィン遺伝子のエクソン５１の配列番号３に記載される配列を標的とするＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。Ｐ−ＰＭＯ溶液をＰＢＳ（−）で５０μＭの濃度に調製した。
（２）Ｐ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体の製造
実施例２（１）で調製したＰ−ＰＭＯを、実施例１で調製したＡＡＶ８中空粒子と、ＰＢＳ（−）またはＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で、１５００：１、７５０：１、１５０：１のモル比で混合し、室温で１５分静置した。
Ｐ−ＰＭＯとＡＡＶ８中空粒子を１５００：１のモル比（５０μＭ Ｐ−ＰＭＯ、３３．３ｎＭ ＡＡＶ８中空粒子）で混合した混合液中の物質の粒子径をゼータサイザーナノ ＺＳＰを使用してＤＬＳ法により測定した。コントロールとして、ＡＡＶ８中空粒子単独、Ｐ−ＰＭＯ単独の粒子径分布もそれぞれ測定した。ＤＬＳ法による粒子径分布の測定の結果を図１に示す。また、１５００：１、７５０：１のモル比で混合した混合液を、１．５％アガロースゲル、１００Ｖ、１０分間の条件でゲルシフトアッセイを行った。コントロールとしてＰ−ＰＭＯを単独でゲルシフトアッセイに供した。ゲルシフトアッセイの結果を図２に示す。
図１の結果より、ＡＡＶ中空粒子、Ｐ−ＰＭＯ、混合液はそれぞれの粒子径のピークを有した。ＤＬＳ法はｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｚｅを測定するため得られる粒子サイズは実際の粒子径よりも大きくなる事が知られている。Ｐ−ＰＭＯは直径３０〜９０ｎｍ程度のミセル化ナノ粒子を形成することが報告されている（非特許文献２）。混合液中に含まれる物質の粒子径は、ＡＡＶ中空粒子及びＰ−ＰＭＯナノ粒子の粒子径よりも大きく、混合液中ではＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子の複合体が形成されていることが確認された。図２に示すゲルシフトアッセイにおいても、Ｐ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体は電気的性質がＰ−ＰＭＯと大きく異なっていることを確認した。さらに、透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）で５０００：１のモル比で混合したＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体を観察し、最も長い部分が１００〜５００ｎｍである粒子が存在することを確認した。この複合体を９５℃１０分で加熱処理した後にＴＥＭ解析を実施した場合には、このような構造体は確認されなかった。
実施例３：Ｐ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体の細胞導入効率
（１）Ｈ２Ｋ−ｍｄｘ５２筋芽細胞
筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス由来のＨ２Ｋ細胞株（Ｈ２Ｋ−ｍｄｘ５２）（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１２ Ａｕｇ ２１； １０９（３４）： １３７６３−１３７６８．）の細胞５０，０００個を０．５ｍＬの分化培地（５％ウマ血清を添加したＤＭＥＭ培地）で４日間培養し筋管細胞に分化させた。その後、培地を１５００：１、７５０：１または１５０：１のモル比のＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体を（Ｐ−ＰＭＯとして）５０μＭの濃度で含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に交換し、トランスフェクション試薬を添加せずに４８時間培養した。コントロールとして、複合体の代わりにＰ−ＰＭＯのみを同濃度で含む培地を添加した細胞を使用した。培養した細胞からＴＲＩｚｏｌ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを鋳型とし、配列番号４記載のプライマーＥｘ５０Ｆ及び配列番号５記載のプライマーＥｘ５３Ｒを使用してＲＴ−ＰＣＲによりジストロフィン遺伝子のエクソン５０から５３を増幅させた。増幅産物の塩基長をＭｕｌｔｉＮＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）により解析して、エクソン５１スキップの効率を測定した。その結果を図３に示す。また、培養した細胞に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を１５μＬ添加して３０分間静置し、ピペッティングで細胞を懸濁させ、遠心分離した上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標） ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（ＣＢＬ社製）を使用して細胞膜障害マーカーとして測定した。
図３の結果より、Ｐ−ＰＭＯ単独よりＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体の方が、エクソン５１スキップの効率が高く、細胞導入効率が高いことが示された。また、ＬＤＨ活性を細胞膜障害の指標として測定したが、いずれのサンプルでも細胞膜障害は確認されなかった。
（２）ｍｄｘ５２マウス（局所）
国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター（ＮＣＮＰ）で飼育・繁殖中の５週齢のｍｄｘ５２マウス（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． １９９７；２３８：４９２-４９７．）の両側前脛骨筋に、１５００：１又は１５０：１のモル比のＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体を、Ｐ−ＰＭＯの量として１０μｇ局所筋肉内投与し、２週間後に投与部位の骨格筋を回収した。コントロールとして複合体の代わりにＰ−ＰＭＯのみ投与して得た骨格筋を使用した。回収した骨格筋に対して抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−ＤＹＳ１（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用してジストロフィン免疫組織化学染色を行い、筋肉の横断面積あたりのジストロフィン陽性筋線維数及び蛍光強度を測定した。その結果を図４に示す。さらに、回収した骨格筋からＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加したＲＩＰＡバッファーによりタンパク質を抽出してウエスタンブロット解析を行い、ハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨに対するジストロフィン量の割合を測定した。その結果を図５に示す。
図４及び図５の結果より、Ｐ−ＰＭＯ単独よりＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体の方が、ジストロフィンの発現を亢進させる効果が高いことが示された。
（３）ｍｄｘ５２マウス（全身）
５週齢のｍｄｘ５２マウスに、１５００：１又は７５０：１のモル比のＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体を３ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇで経静脈全身投与し、２週間後に各部位の骨格筋を回収した。コントロールとしてＰ−ＰＭＯを投与しないマウスの（ｂｌａｎｋ）及び複合体の代わりにＰ−ＰＭＯのみ投与したマウスを使用した。回収した骨格筋からタンパク質を抽出し、実施例３（２）同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果を図６に示す。
図６の結果より、腓腹筋、横隔膜、心筋で、Ｐ−ＰＭＯ単独よりＰ−ＰＭＯ／ＡＡＶ中空粒子複合体の方が、ジストロフィンの発現をより高く亢進させることが示された。
SEQ ID NO: 1: Pip6a peptide
SEQ ID NO: 2: B peptide
SEQ ID NO: 3: mouse dystrophin gene exon 51 partial sequence
SEQ ID NO: 4: Ex50F primer
SEQ ID NO: 5: Ex53R primer

Claims (12)

  1. 核酸を含むナノ粒子と、非エンベロープウイルスの中空粒子を含む複合体。
  2. 核酸が、ホスホロジアミデート化モルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド付加ＰＭＯ（Ｐ−ＰＭＯ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）及び２’Oメチルオリゴマー（２’ＯＭｅ）からなる群より選択される核酸誘導体である、請求項１記載の複合体。
  3. 核酸誘導体が、配列番号１又は配列番号２に記載の配列を有するペプチドを含むＰ−ＰＭＯである、請求項１又は２記載の複合体。
  4. 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で測定した場合の最も長い部分の長さが５０〜１０００ｎｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
  5. 中空粒子がアデノ随伴ウイルスの中空粒子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
  6. 核酸が、ジストロフィン遺伝子の配列に相補的なアンチセンス核酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
  7. ナノ粒子が、核酸が集合して形成されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体。
  8. 以下の工程を含む、核酸を含むナノ粒子とカプシドウイルスを含む複合体の製造方法；
    （ｉ）核酸を含むナノ粒子を製造する工程、
    （ｉｉ）非エンベロープウイルスの中空粒子を製造する工程、及び
    （ｉｉｉ）（ｉ）のナノ粒子と（ｉｉ）の非エンベロープウイルスの中空粒子を混合する工程。
  9. （ｉｉｉ）の工程において、核酸と中空粒子を、中空粒子１に対して核酸が１５０〜１５００のモル比で混合する、請求項８記載の製造方法。
  10. 請求項１〜７いずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
  11. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）治療用である、請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 経静脈全身投与用である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
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