JP2023548838A - ニワトリ貧血ウイルス（ｃａｖ）に基づくベクター - Google Patents
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Abstract
本発明は一般に、ＣＡＶベクターを作製するための組成物及びその使用に関する。
Description
（背景技術）
ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）は、ニワトリに感染するジャイロウイルス（Ｇｙｒｏｖｉｒｕｓ）属の非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＣＡＶゲノムは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３（アポプチンとも呼ばれる）をコードする３つのオープンリーディングフレームをコードする。ＶＰ１は、カプシド集合に関与する主要成分である。
ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）は、ニワトリに感染するジャイロウイルス（Ｇｙｒｏｖｉｒｕｓ）属の非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＣＡＶゲノムは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３（アポプチンとも呼ばれる）をコードする３つのオープンリーディングフレームをコードする。ＶＰ１は、カプシド集合に関与する主要成分である。
本開示は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞を感染又は調節するためのベクター、他の組成物、及び関連する方法を提供する。一般に、本明細書に開示されるベクターは、ＣＡＶ配列、又はそれと相同性を有する配列、及びタンパク質性外部を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶカプシドタンパク質を含むタンパク質性外部によって、又はＣＡＶカプシドによって閉じ込められる。
本開示はまた、送達ビヒクルとして、例えば、遺伝物質を送達するため、エフェクター、例えば、ペイロードを送達するため、又は治療剤若しくは治療用エフェクターを真核細胞（例えば、哺乳動物細胞又は組織、例えば、ヒト細胞又はヒト組織）に送達するために使用することができるＣＡＶベクター（ＣＡＶｅｃｔｏｒ）（例えば、合成ＣＡＶベクター）を産生するための構築物を提供する。一般に、ＣＡＶベクターはＣＡＶゲノムの核酸配列（例えば、ＣＡＶ ５’ＵＴＲ、反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２遺伝子、アポプチン遺伝子、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、ＧＣリッチ領域、ポリＡシグナル配列、例えば、本明細書に記載されるようなポリＡシグナル配列、又はその機能断片の１つ以上）に対して実質的な（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する１つ以上の核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態において、ＣＡＶベクターはまた、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）ＶＰ１分子に対して実質的な（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質性外部を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、タンパク質性外部（例えば、ＣＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、又は例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチドを含むタンパク質性外部）に閉じ込められた遺伝子エレメント（例えば、エフェクター、例えば、外因性又は内因性エフェクター、例えば、治療用エフェクターを含む又はコードする遺伝子エレメント）を含む。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、遺伝子エレメントを細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に導入することができる。一部の実施形態において、ＣＡＶベクターはＣＡＶ ＶＰ１核酸（例えば、本明細書に記載される）によってコードされるポリペプチドを含むタンパク質性外部を含む感染性ビヒクル又は粒子である。本開示のＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、典型的には環状及び／又は一本鎖ＤＮＡ分子（例えば、環状及び一本鎖）である。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、それを閉じ込めるタンパク質性外部に結合するタンパク質結合配列、又はそれに結合されたポリペプチドを含み、これはタンパク質性外部内への遺伝子エレメントの閉じ込め及び／又は他の核酸と比較してタンパク質性外部内への遺伝子エレメントの濃縮を促進し得る。
いくつかの例では、遺伝子エレメントは、例えば本明細書に記載されるような遺伝子エレメント構築物を使用して提供される。一般に、遺伝子エレメント構築物は、タンパク質性外部に閉じ込められてＣＡＶベクターを形成する遺伝子エレメントの配列に対応する核酸配列を含む。いくつかの例において、遺伝子エレメント構築物は、環状又は線状である。いくつかの例では、遺伝子エレメントは環状である。いくつかの例では、遺伝子エレメントは一本鎖である。いくつかの例では、遺伝子エレメントは二本鎖である。いくつかの例では、遺伝子エレメントはＤＮＡである。一部の実施形態では、タンパク質性外部内への閉じ込めに適した遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント構築物中の遺伝子エレメント配列のローリングサークル複製を介して産生することができる。
一部の例では、遺伝子エレメントは、エフェクター（例えば、非コードＲＮＡなどの核酸エフェクター、又はポリペプチドエフェクター、例えば、タンパク質）を含むか、又はそれをコードし、例えば、エフェクターは細胞（例えば、標的細胞）で発現することができる。一部の実施形態では、エフェクターは、例えば、本明細書に記載されるような治療薬又は治療用エフェクターである。一部の実施形態では、エフェクターは、例えば、野生型ＣＡＶ及び／又は標的細胞に対して内在性又は外因性である。一部の実施形態では、エフェクターは、野生型ＣＡＶ及び／又は標的細胞に対して外因性エフェクターである。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、細胞と接触して、細胞によりエフェクターが生成又は発現されるように、エフェクターをコード化する遺伝子エレメントを細胞に導入することによって、エフェクターを細胞中に送達することができる。特定の事例では、エフェクターは、標的細胞に対して内在性である（例えば、ＣＡＶベクターにより、増加した量で供給される）。他の事例では、エフェクターは、標的細胞に対して外因性である。エフェクターは、一部の事例では、細胞の機能を調節するか、又は細胞中の標的分子の活性若しくはレベルを調節（例えば、増加又は減少）することができる。例えば、エフェクターは、細胞中の標的タンパク質のレベルを低下させることができる。別の例では、エフェクターは、細胞中の標的タンパク質のレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターはエフェクター、例えば、外因性タンパク質をインビボで送達及び発現することができる。ＣＡＶベクターは、例えば、遺伝物質を標的細胞、組織、若しくは対象に送達するために；エフェクターを標的細胞、組織、若しくは対象に送達するために；又は、例えば、所望の細胞、組織、若しくは対象において治療剤として作用することができるエフェクターを送達することによって、疾患及び障害を治療するために使用することができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物（例えば、遺伝子エレメント構築物）は、例えば宿主細胞において、合成ＣＡＶベクターを産生するために使用され得る。合成ＣＡＶベクターは、野生型ウイルス（例えば、野生型ＣＡＶ、例えば、本明細書に記載のＣＡＶ）と比較して少なくとも１つの構造的差異、例えば、野生型ウイルスのゲノムと比較した遺伝子エレメントの差異、及び／又は野生型ウイルスと比較した構造的タンパク質（例えば、タンパク質性外部のタンパク質、例えば、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１分子）の差異を有する。一部の実施形態では、差異は、野生型ウイルスと比較して、欠失、挿入、置換、又は他の修飾（例えば、酵素修飾）の１つ以上を含む。一般に、合成ＣＡＶベクターは、タンパク質性外部（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含む）内に閉じ込められた外因性遺伝子エレメントを含み、これは、遺伝子エレメント、又はその中にコードされるエフェクター（例えば、外因性エフェクター又は内因性エフェクター）（例えば、ポリペプチド又は核酸エフェクター）を真核（例えば、ヒト）細胞に送達するために使用され得る。
ある態様において、本開示は、（ｉ）プロモーターエレメント及びエフェクター（例えば、内因性又は外因性エフェクター）をコードする配列、及びタンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）を含む遺伝子エレメントと、（ｉｉ）タンパク質性外部とを含むＣＡＶベクターを提供し、遺伝子エレメントはタンパク質性外部（例えば、カプシド）内に閉じ込められている。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは遺伝子エレメントを真核生物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）細胞に送達することができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖ＤＮＡ及び／又は環状ＤＮＡである。これに代わり、又はこれと組み合わせて、遺伝子エレメントは、下記特性のうちの１つ、２つ、３つ、又は全部を有する：環状である、一本鎖である、細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．０００１％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で細胞のゲノム中に組み込まれる、且つ／又はゲノム当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、若しくは３０コピー未満で標的細胞のゲノム中に組み込まれる。一部の実施形態では、組み込み頻度は、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：７１１－７２１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、遊離ベクターから分離されたゲノムＤＮＡの定量的ゲル精製アッセイによって決定される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質性外部内に閉じ込められる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶの配列、例えば、本明細書に記載の野生型ＣＡＶ配列に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する核酸配列（例えば、３００～４０００ヌクレオチド、例えば、３００～３５００ヌクレオチド、３００～３０００ヌクレオチド、３００～２５００ヌクレオチド、３００～２０００ヌクレオチド、３００～１５００ヌクレオチド、１０００～４０００ヌクレオチド、２０００～４０００ヌクレオチド、１０００～３０００ヌクレオチド、２０００～２５００ヌクレオチド、又は２０００～３０００ヌクレオチドの核酸配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶの配列（例えば、本明細書に記載のＣＡＶ配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する核酸配列（例えば、少なくとも３００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２５００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド以上の核酸配列）を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞での発現のために、コドン最適化される。一部の実施形態では、核酸配列中のコドンの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞での発現のためにコドン最適化される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメント配列の第１のコピー（例えば、変異型ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）ゲノム）と、遺伝子エレメント配列の第２のコピー（例えば、ＣＡＶゲノム又はその断片）の少なくとも一部とを、タンデムに配列して含む。そのような構造を有する遺伝子エレメント構築物は、本明細書では一般にタンデム構築物と呼ばれる。そのようなタンデム構築物は、ＣＡＶベクター遺伝子エレメントを産生するために使用される。遺伝子エレメント配列の第１のコピー及び遺伝子エレメント配列の第２のコピーは、場合によっては遺伝酸構築物上で互いに直接隣接していてもよい。他の例では、遺伝子エレメント配列の第１のコピー及び遺伝子エレメント配列の第２のコピーは、例えば、スペーサー配列によって分離され得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー、又はその一部は、例えば、本明細書に記載されるような上流複製促進配列（ｕＲＦＳ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー、又はその一部は、例えば、本明細書に記載されるような下流複製促進配列（ｄＲＦＳ）を含む。一部の実施形態では、ｕＲＦＳ及び／又はｄＲＦＳは、複製起点（ＯＲＩ）（例えば、哺乳動物ＯＲＩ又は昆虫ＯＲＩ）又はその一部を含む。一部の実施形態では、ｕＲＦＳ及び／又はｄＲＦＳは複製起点を含まない。一部の実施形態では、ｕＲＦＳ及び／又はｄＲＦＳはヘアピンループ（例えば、５’ＵＴＲ中）を含む。一部の実施形態では、タンデム構築物は、遺伝子エレメントの第２のコピー又はその一部を欠く他の類似の構築物よりも高いレベルの遺伝子エレメントを産生する。理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載のタンデム構築物は、一部の実施形態では、ローリングサークル複製によって複製することができる。一部の実施形態では、タンデム構築物はプラスミドである。
タンデム構築物は、場合によっては、遺伝子エレメントの配列の第１のコピー及び遺伝子エレメントの配列の第２のコピー、又はその一部（例えば、ｕＲＦＳ又はｄＲＦＳ）を含み得る。第２のコピーは、第１のコピー若しくはその一部の同一のコピーであってもよく、又は１つ以上の配列の差異、例えば置換を含んでもよいことが理解される。いくつかの例では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー又はその一部（例えば、ｕＲＦＳ）は、遺伝子エレメント配列の第１のコピーに対して５’に位置する。いくつかの例では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー又はその一部（例えば、ｄＲＦＳ）は、遺伝子エレメント配列の第１のコピーに対して３’に位置する。いくつかの例では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー又はその一部及び遺伝子エレメント配列の第１のコピーは、タンデム構築物中で互いに隣接している。いくつかの例では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー又はその一部及び遺伝子エレメント配列の第１のコピーは、例えば、スペーサー配列によって分離される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるタンデム構築物を使用して、カプシドに結合するタンパク質結合配列と、治療用エフェクターをコードする（ＣＡＶにとって）異種の配列とを含む遺伝子エレメントをカプセル化するカプシド（例えば、ＣＡＶＯＲＦ、例えば、ＶＰ１ポリペプチドを含むカプシド）を含む（例えば、ヒト細胞に対して）感染性のＣＡＶベクター、媒体、又は粒子の遺伝子エレメントを作製することができる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、哺乳動物、例えば、ヒトの細胞内に遺伝子エレメントを送達することができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶゲノム配列に対して約６％未満（例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％未満）の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶゲノム配列に対して１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％又は６％以下の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶに対して少なくとも約２％～少なくとも約５．５％（例えば、２～５％、３％～５％、４％～５％）の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、非ウイルス配列（例えば、非ＣＡＶゲノム配列）の約２０００、３０００、４０００、４５００、若しくは５０００超のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、非ウイルス配列（例えば、非ＣＡＶゲノム配列）の約２０００～５０００、２５００～４５００、３０００～４５００、２５００～４５００、３５００、又は４０００、４５００（例えば、約３０００～４５００）超のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖、環状ＤＮＡである。これに代わり、又はこれと組み合わせて、遺伝子エレメントは、下記特性のうちの１つ、２つ、又は３つを有する：環状である、一本鎖である、細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で細胞のゲノム中に組み込まれる、ゲノム当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、若しくは３０コピー未満で標的細胞のゲノム中に組み込まれるか、或いは細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．０００１％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる（例えば、細胞溶解物からの遺伝子エレメント配列に対してゲノムＤＮＡ中への組み込み頻度を比較することによって）。一部の実施形態では、組み込み頻度は、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：７１１－７２１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、遊離ベクターから分離されたゲノムＤＮＡの定量的ゲル精製アッセイによって決定される。
本明細書のシステム及び方法の一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物、例えば、タンデム構築物である第１の核酸分子、及びタンパク質性外部、例えば、カプシドタンパク質をコードする第２の核酸分子を細胞に導入することによって作製される。一部の実施形態では、第１の核酸分子及び第２の核酸分子は、互いに結合している（例えば、本明細書に記載の遺伝子エレメント構築物中、例えば、シスで）。一部の実施形態では、第１の核酸分子及び第２の核酸分子は、別個である（例えば、トランスで）。一部の実施形態では、第１の核酸分子はプラスミド、コスミド、バクミド、ミニサークル、又は人工染色体である。一部の実施形態では、第２の核酸分子はプラスミド、コスミド、バクミド、ミニサークル、又は人工染色体である。一部の実施形態では、第２の核酸分子は宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
一部の実施形態では、方法は、第１の核酸分子及び／又は第２の核酸分子を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、第２の核酸分子は、第１の核酸分子の前に、同時に、又は後に宿主細胞に導入される。他の実施形態では、第２の核酸分子は宿主細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、第２の核酸分子は、ヘルパー構築物、ヘルパーウイルス又は他のヘルパーベクターであるか、又はそれらを含むか、又はそれらの一部である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＶ又はＣＡＶベクターは、本明細書に記載のエフェクターなどの薬剤を、治療される対象の標的細胞などの標的細胞に導入するための有効な送達ビヒクルとして使用することができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＶベクターは、（例えば、直列に）：
（ｉ）アルギニンリッチ領域を含む第１の領域、例えば、少なくとも６０％、７０％、又は８０％の塩基性残基（例えば、アルギニン、リジン、又はそれらの組み合わせ）を含む少なくとも約４０個のアミノ酸の配列、
（ｉｉ）ゼリーロールドメインを含む第２の領域、例えば、疎水性界面を横切って一緒にパックする２つの逆平行ベータシートに配列された少なくとも６個のベータ鎖、例えば、６、７又は８個のベータ鎖を含む配列、及び
（ｉｉｉ）任意選択で、ポリペプチドは例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質に対して１００％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する
を含むポリペプチド（例えば、合成ポリペプチド、例えば、ＶＰ１分子）を含むタンパク質性外部を含む。
（ｉ）アルギニンリッチ領域を含む第１の領域、例えば、少なくとも６０％、７０％、又は８０％の塩基性残基（例えば、アルギニン、リジン、又はそれらの組み合わせ）を含む少なくとも約４０個のアミノ酸の配列、
（ｉｉ）ゼリーロールドメインを含む第２の領域、例えば、疎水性界面を横切って一緒にパックする２つの逆平行ベータシートに配列された少なくとも６個のベータ鎖、例えば、６、７又は８個のベータ鎖を含む配列、及び
（ｉｉｉ）任意選択で、ポリペプチドは例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質に対して１００％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する
を含むポリペプチド（例えば、合成ポリペプチド、例えば、ＶＰ１分子）を含むタンパク質性外部を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＶベクターは、以下のいずれか１つ以上の（例えば、１、２、３、４、又はこれらの全て）を含むポリペプチドを含むタンパク質性外部を含む：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＲＡＲＲＰＲＧＲＦＹＡＦＲＲＧＲ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核局在化シグナル（ＮＬＳ）；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＫＲＬＲＲＲＹＫＦＲＨＲＲＲＱＲＹＲＲＲＡＦＲＫ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核局在化シグナル（ＮＬＳ）；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＩＦＬＴＥＧＬＩＬ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）；
（ｉｖ）アミノ酸配列ＬＫＥＦＬＬＡＳＭＮＬ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）；
（ｖ）アミノ酸配列ＥＬＤＴＮＦＦＴＬＹＶＡＱ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）；
（例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９、Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．１６：４５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。）
（ｉ）アミノ酸配列ＲＲＡＲＲＰＲＧＲＦＹＡＦＲＲＧＲ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核局在化シグナル（ＮＬＳ）；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＫＲＬＲＲＲＹＫＦＲＨＲＲＲＱＲＹＲＲＲＡＦＲＫ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核局在化シグナル（ＮＬＳ）；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＩＦＬＴＥＧＬＩＬ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）；
（ｉｖ）アミノ酸配列ＬＫＥＦＬＬＡＳＭＮＬ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）；
（ｖ）アミノ酸配列ＥＬＤＴＮＦＦＴＬＹＶＡＱ、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）；
（例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９、Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．１６：４５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。）
一態様では、本発明はエフェクター、例えば、ペイロードをコード化する配列に作動可能に連結されたプロモーターエレメントと、外部タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントの配列を含む単離された核酸分子（例えば、遺伝子エレメント構築物）を特徴とする。一部の実施形態では、外部タンパク質結合配列は、例えば、本明細書に開示されるＣＡＶの５’ＵＴＲ配列と、少なくとも７５％（少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％）同一の配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは一本鎖ＤＮＡである、環状である、細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる、且つ／又はゲノム当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、若しくは３０コピー未満で標的細胞のゲノム中に組み込まれるか、或いは細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる。一部の実施形態では、組み込み頻度は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：７１１－７２１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように決定される。複数の実施形態では、エフェクターはＴＴＶに由来せず、またＳＶ４０－ｍｉＲ－Ｓ１ではない。複数の実施形態では、核酸分子は、ＴＴＭＶ－ＬＹ２のポリヌクレオチド配列を含まない。実施形態において、プロモーターエレメントは、真核生物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）細胞におけるエフェクターの発現を指令する。実施形態において、エフェクターは、哺乳動物核酸又はポリペプチド（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ポリペプチド又は核酸）である。
一部の実施形態では、核酸分子は、環状である。一部の実施形態では、核酸分子は、線状である。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、塩基修飾、糖修飾、若しくは骨格修飾）を含む。
一部の実施形態では、核酸分子は、ＶＰ１分子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、例えば、本明細書に記載のとおり）をコード化する配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、ＶＰ２分子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質、例えば、本明細書に記載のとおり）をコード化する配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、アポプチン分子（例えば、ＣＡＶアポプチンタンパク質、例えば、本明細書に記載のとおり）をコード化する配列を含む。一態様では、本発明は、以下の１つ、２つ、若しくは３つを含む遺伝子エレメントを特徴とする：（ｉ）プロモーターエレメントと、エフェクター、例えば、外性若しくは内在性エフェクターをコード化する配列；（ｉｉ）野生型ＣＡＶ配列に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する、少なくとも７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、若しくは１５０ヌクレオチド；又は野生型ＣＡＶ配列に対して少なくとも７２％（例えば、少なくとも７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する、少なくとも１００個（例えば、少なくとも３００個、５００個、１０００個、１５００個）の連続した核酸；並びに（ｉｉｉ）タンパク質結合配列、例えば、外部タンパク質結合配列、ここで、遺伝子エレメント構築物は、一本鎖ＤＮＡである；並びに、遺伝子エレメント構築物は、環状であり、細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％の頻度で組み込まれる、且つ／又はゲノム当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、若しくは３０コピー未満で標的細胞のゲノム中に組み込まれる。一部の実施形態では、エフェクター（例えば、外性若しくは内在性エフェクター）をコード化する遺伝子エレメントは、コドン最適化される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、環状である。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、線状である。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子エレメントは、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、塩基修飾、糖修飾、若しくは骨格修飾）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＶＰ１分子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、例えば、本明細書に記載のとおり）をコード化する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＶＰ２分子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質、例えば、本明細書に記載のとおり）をコード化する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、アポプチン分子（例えば、ＣＡＶアポプチンタンパク質、例えば、本明細書に記載のとおり）をコード化する配列を含む。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載のタンデム構築物を含む宿主細胞を特徴とする。一部の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）ＶＰ１分子、ＶＰ２分子、又はアポプチン分子の１つ以上をコードする配列（例えば、本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１ポリペプチドをコードする配列）を含む核酸分子であって、例えば、核酸分子は、プラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又は染色体に組み込まれている、核酸分子と；（ｂ）遺伝子エレメントとを含み、遺伝子エレメントは、（ｉ）エフェクター（例えば、外因性エフェクター又は内因性エフェクター）をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）に作動可能に連結されたプロモーターエレメントと、（ｉｉ）（ａ）のポリペプチドに結合するタンパク質結合配列とを含み、任意選択で遺伝子エレメントはＶＰ１ポリペプチド（例えば、ＶＰ１タンパク質）をコードしない。例えば、宿主細胞は、（ａ）及び（ｂ）をシス（同じ核酸分子の両部分）又はトランス（異なる核酸分子の各部分）のいずれかで含む。複数の実施形態において、（ｂ）の遺伝子エレメントは、環状、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、宿主細胞は、例えば本明細書に記載の製造細胞株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、接着性若しくは懸濁状態、又はその両方である。一部の実施形態では、宿主細胞又はヘルパー細胞は、マイクロキャリア中で増殖させる。一部の実施形態では、宿主細胞又はヘルパー細胞は、ｃＧＭＰ製造規範に適合している。一部の実施形態では、宿主細胞又はヘルパー細胞は、細胞増殖を促進するのに好適な培地中で増殖させる。特定の実施形態では、宿主細胞又はヘルパー細胞が十分に（例えば、適切な細胞密度まで）増殖したら、培地を、宿主細胞又はヘルパー細胞によるＣＡＶベクターの産生に好適な培地と交換してもよい。
ある態様において、本発明は、ＣＡＶベクター（例えば、合成ＣＡＶベクター）を含む医薬組成物を特徴とする。実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含む。複数の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。複数の実施形態において、医薬組成物は、対象被験者の１キログラム当たり約１０５～１０１４（例えば約１０６～１０１３、１０７～１０１２、１０８～１０１１、若しくは１０９～１０１０）ＣＡＶベクターゲノム当量を含む単位用量を含む。一部の実施形態では、調製物を含む医薬組成物は、許容される期間及び温度で安定しており、且つ／又は所望の投与経路及び／又はこの投与経路が必要とする任意のデバイス、例えば注射針若しくは注射器と適合性である。一部の実施形態では、医薬組成物は、単回用量又は複数回用量としての投与のために製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、投与の現場で、例えば、医療従事者によって製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、所望の濃度のＣＡＶベクターゲノム又はゲノム当量（例えば、体積当たりのゲノム数によって定義される）を含む。
ある態様において、本発明は、ＣＡＶベクターを含む医薬組成物を特徴とし、この組成物は、２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ§§６１０．１２及び§６１０．１３の要件を満たす。例えば、医薬組成物は、以下の特徴の１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全てを有し得る：
（ｉ）外来性因子を実質的に欠く、
（ｉｉ）発熱性物質を実質的に欠く、
（ｉｉｉ）対照参照若しくは規格、例えば、エンドトキシン汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のエンドトキシンを含む、
（ｉｖ）対照参照若しくは規格、例えば、マイコプラズマ汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のマイコプラズマを含む、
（ｖ）対照参照標準よりも少ない宿主細胞ＤＮＡ、例えば、１用量あたり１０ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、１用量あたり５ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む、
（ｖｉ）対照参照標準よりも少ない、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、及び／若しくは１０ｎｇ／用量未満、５ｎｇ／用量未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、
（ｖｉｉ）例えば、感染性粒子に対する非感染性粒子の所定の放出仕様を満たす、閾値量未満の非感染性粒子、例えば、粒子対感染単位＜２０００：１、＜１０００：１、＜５００：１、＜３００：１、＜２００：１、＜１００：１、若しくは＜５０：１の粒子を含む、並びに／又は
（ｖｉｉｉ）閾値量未満の、例えば、空のカプシドについての所定の放出仕様を満たす、空のカプシドを含む（すなわち、ゲノムを欠く）を含む。
（ｉ）外来性因子を実質的に欠く、
（ｉｉ）発熱性物質を実質的に欠く、
（ｉｉｉ）対照参照若しくは規格、例えば、エンドトキシン汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のエンドトキシンを含む、
（ｉｖ）対照参照若しくは規格、例えば、マイコプラズマ汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のマイコプラズマを含む、
（ｖ）対照参照標準よりも少ない宿主細胞ＤＮＡ、例えば、１用量あたり１０ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、１用量あたり５ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む、
（ｖｉ）対照参照標準よりも少ない、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、及び／若しくは１０ｎｇ／用量未満、５ｎｇ／用量未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、
（ｖｉｉ）例えば、感染性粒子に対する非感染性粒子の所定の放出仕様を満たす、閾値量未満の非感染性粒子、例えば、粒子対感染単位＜２０００：１、＜１０００：１、＜５００：１、＜３００：１、＜２００：１、＜１００：１、若しくは＜５０：１の粒子を含む、並びに／又は
（ｖｉｉｉ）閾値量未満の、例えば、空のカプシドについての所定の放出仕様を満たす、空のカプシドを含む（すなわち、ゲノムを欠く）を含む。
一態様では、本発明は、被験者の疾患若しくは障害を治療する方法を特徴とし、この方法は、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるような例えば合成ＣＡＶベクターを被験者に投与するステップを含む。
一態様では、本発明は、エフェクター又はペイロード（例えば、内在性エフェクター若しくは外因性エフェクター）を細胞、組織若しくは被験者に送達する方法を特徴とし、この方法は、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるような例えば合成ＣＡＶベクターを被験者に投与するステップを含み、ここで、ＣＡＶベクターは、エフェクターをコード化する核酸を含む。複数の実施形態において、ペイロードは、核酸である。複数の実施形態において、ペイロードは、ポリペプチドである。
一態様では、本発明は、ＣＡＶベクターを細胞に送達する方法を特徴とし、これは、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるような例えば合成ＣＡＶベクターを細胞、例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞と、例えば、インビボ若しくはエクスビボで接触させるステップを含む。
ある態様において、本発明は、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターを作製する方法を特徴とする。本方法は：
（ａ）以下を含む宿主細胞を提供することと：
（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶベクターの遺伝子エレメントの核酸配列の第１のコピー、及びＣＡＶベクターの遺伝子エレメントの核酸配列の第２のコピー、又はその一部（例えば、ｕＲＦＳ又はｄＲＦＳ）を含む第１の核酸分子；並びに
（ｉｉ）ＣＡＶ ＶＰ１ポリペプチド、又は例えば本明細書に記載のＶＰ１、ＶＰ２、若しくはアポプチン分子から選択されるアミノ酸配列の１つ以上、又はそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする第２の核酸分子；
（ｂ）遺伝子エレメントの核酸配列の第１のコピーの複製（例えば、ローリングサークル複製）に適した条件下で宿主細胞を培養し、それによって遺伝子エレメントを産生することと；
任意選択で、（ｃ）タンパク質性外部（例えば、第２の核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む）内への遺伝子エレメントの閉じ込めに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
任意選択で、（ｄ）細胞又は細胞培養物からＣＡＶベクターを回収すること
を含む。
（ａ）以下を含む宿主細胞を提供することと：
（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶベクターの遺伝子エレメントの核酸配列の第１のコピー、及びＣＡＶベクターの遺伝子エレメントの核酸配列の第２のコピー、又はその一部（例えば、ｕＲＦＳ又はｄＲＦＳ）を含む第１の核酸分子；並びに
（ｉｉ）ＣＡＶ ＶＰ１ポリペプチド、又は例えば本明細書に記載のＶＰ１、ＶＰ２、若しくはアポプチン分子から選択されるアミノ酸配列の１つ以上、又はそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする第２の核酸分子；
（ｂ）遺伝子エレメントの核酸配列の第１のコピーの複製（例えば、ローリングサークル複製）に適した条件下で宿主細胞を培養し、それによって遺伝子エレメントを産生することと；
任意選択で、（ｃ）タンパク質性外部（例えば、第２の核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む）内への遺伝子エレメントの閉じ込めに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
任意選択で、（ｄ）細胞又は細胞培養物からＣＡＶベクターを回収すること
を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の１つ以上（例えば、全て）を含む、ＣＡＶベクター組成物を製造する方法を特徴とする：
ａ）例えば、本明細書に記載されるような、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターの１つ以上の成分（例えば、成分の全て）を含む、例えば発現する宿主細胞を提供することと；
ｂ）宿主細胞からＣＡＶベクターの調製物を産生するのに適した条件下で宿主細胞を培養することであって、調製物のＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えば、本明細書に記載されるような）を閉じ込めるタンパク質性外部（例えば、ＣＡＶベクターＶＰ１ポリペプチドを含む）を含み、それによってＣＡＶベクターの調製物を作製する、培養することと；
任意選択で、ｃ）宿主細胞からＣＡＶベクターを回収することと、
任意選択で、ｄ）例えば、対象への投与に適した医薬組成物として、ＣＡＶベクターの調製物を製剤化すること。
ａ）例えば、本明細書に記載されるような、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターの１つ以上の成分（例えば、成分の全て）を含む、例えば発現する宿主細胞を提供することと；
ｂ）宿主細胞からＣＡＶベクターの調製物を産生するのに適した条件下で宿主細胞を培養することであって、調製物のＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えば、本明細書に記載されるような）を閉じ込めるタンパク質性外部（例えば、ＣＡＶベクターＶＰ１ポリペプチドを含む）を含み、それによってＣＡＶベクターの調製物を作製する、培養することと；
任意選択で、ｃ）宿主細胞からＣＡＶベクターを回収することと、
任意選択で、ｄ）例えば、対象への投与に適した医薬組成物として、ＣＡＶベクターの調製物を製剤化すること。
例えば、この製造方法において提供される宿主細胞は、（ａ）本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ１ポリペプチドをコードする配列を含む核酸であって、プラスミドであるか、ウイルス核酸若しくはゲノムであるか、又はヘルパー細胞染色体に組み込まれている核酸；及び（ｂ）遺伝子エレメントを作製する能力を有するタンデム構築物を含み、ここで遺伝子エレメントは、（ｉ）エフェクター（例えば、外因性エフェクター又は内因性エフェクター）をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）に作動可能に連結されたプロモーターエレメント及び（ｉ）（ａ）のポリペプチドを結合するタンパク質結合配列（例えば、パッケージングシグナル）を含み、ここで宿主細胞は、（ａ）及び（ｂ）をシス又はトランスのいずれかで含む。実施形態において、（ｂ）の遺伝子エレメントは、環状の一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、宿主細胞は、製造用細胞株である。
一部の実施形態では、産生の時点で、ＣＡＶベクターの構成体を宿主細胞に導入する（例えば、一過性トランスフェクションにより）。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＡＶベクターの構成体を安定して発現する（例えば、その場合、ＣＡＶベクターの構成体をコード化する１つ又は複数の核酸が、宿主細胞、又はその前駆細胞に、例えば、安定なトランスフェクションによって導入される）。
一態様では、本発明は、ＣＡＶベクター組成物を製造する方法を特徴とし、これは以下：ａ）本明細書に記載の複数のＣＡＶベクター、又は本明細書に記載のＣＡＶベクターの調製物を提供するステップと、ｂ）ＣＡＶベクター又はその調製物を、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップと、を含む。
一態様では、本発明は、宿主細胞、例えば、第１の宿主細胞又はプロデューサ細胞、例えば、ＣＡＶベクターを含む第１の宿主細胞の集団を作製する方法を特徴とし、本方法は遺伝子エレメントを産生することができるタンデム構築物（例えば、本明細書に記載されるものなど）を宿主細胞に導入するステップと、ＣＡＶベクターの産生に好適な条件下で宿主細胞を培養するステップと、を含む。複数の実施形態では、本方法は、ヘルパー、例えば、ヘルパーウイルスを宿主細胞に導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、導入するステップは、宿主細胞のＣＡＶベクターによるトランスフェクション（例えば、化学的トランスフェクション）又はエレクトロポレーションを含む。
一態様では、本発明は、ＣＡＶベクターを作製する方法を特徴とし、これは宿主細胞、例えば、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるものを含む、第１の宿主細胞又はプロデューサ細胞を提供するステップと、ＣＡＶベクターを宿主細胞から精製するステップと、を含む。一部の実施形態では、方法は、提供ステップの前に、宿主細胞を、核酸構築物又はＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるものなどと接触させるステップと、宿主細胞をＣＡＶベクターの産生に好適な条件下でインキュベートするステップと、をさらに含む。複数の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞を作製する上記方法で記載された第１の宿主細胞又はプロデューサ細胞である。複数の実施形態では、宿主細胞からＣＡＶベクターを精製するステップは、宿主細胞を溶解させるステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、第１宿主細胞又はプロデューサ細胞により産生されたＣＡＶベクターを第２宿主細胞、例えば、許容細胞（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／６５９９５号の図１２に示すとおり）、例えば、第２宿主細胞の集団と接触させる第２ステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ＣＡＶベクターの産生に好適な条件下で第２宿主細胞をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、さらに、第２宿主細胞からＣＡＶベクターを精製して、例えば、これによりＣＡＶベクターシード集団を産生するステップを含む。複数の実施形態では、第１宿主細胞の集団からのものと比較して、第２宿主細胞の集団から少なくとも約２～１００倍多いＣＡＶベクターが産生される。複数の実施形態では、第２宿主細胞からＣＡＶベクターを精製するステップは、第２宿主細胞を溶解させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２宿主細胞により産生されたＣＡＶベクターを第３宿主細胞、例えば、許容細胞、例えば、第３宿主細胞の集団と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ＣＡＶベクターの産生に好適な条件下で第３宿主細胞をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、第３宿主細胞からのＣＡＶベクターを精製して、例えば、これによりＣＡＶベクターストック集団を産生するステップを含む。複数の実施形態では、第３宿主細胞からのＣＡＶベクターの精製は、第３宿主細胞を溶解させるステップを含む。複数の実施形態では、第２宿主細胞の集団からのものと比較して、第３宿主細胞の集団から少なくとも約２～１００倍多いＣＡＶベクターが生成される。
一部の実施形態では、宿主細胞は、細胞増殖を促進するのに好適な培地中で増殖させる。特定の実施形態では、宿主細胞又はヘルパー細胞が十分に（例えば、適切な細胞密度まで）増殖したら、培地を、宿主細胞又はヘルパー細胞によるＣＡＶベクターの産生に好適な培地と交換してもよい。一部の実施形態では、宿主細胞により産生されたＣＡＶベクターは、第２宿主細胞と接触させる前に、宿主細胞から分離する（例えば、宿主細胞を溶解することによって）。一部の実施形態では、宿主細胞により産生されたＣＡＶベクターを、精製ステップの介入なしに、第２宿主細胞と接触させる。
ある態様において、本発明は、医薬ＣＡＶベクター調製物を作成する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）本明細書に記載のようにＣＡＶベクター調製物を作製するステップ、（ｂ）１つ若しくは複数の医薬品質管理パラメータ、例えば、同一性、純度、力価、効力（例えば、ＣＡＶベクター粒子当たりのゲノム当量で）、及び／又はＣＡＶベクターに含まれる遺伝子エレメントからの核酸配列について、調製物（例えば、医薬ＣＡＶベクター調製物、ＣＡＶベクターシード集団若しくはＣＡＶベクターストック集団）を評価するステップ、並びに（ｃ）予め定めた基準を満たす、例えば、医薬品規格を満たす評価の医薬品用途のために調製物を製剤化するステップを含む。一部の実施形態では、同一性を評価するステップは、ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントの配列、例えば、エフェクターをコード化する配列を評価する（例えば、確認する）ことを含む。一部の実施形態では、純度を評価するステップは、不純物、例えば、マイコプラズマ、内毒素、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、動物由来の不純物（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能な因子（ＲＣＡ）、例えば、複製可能なウイルス若しくは不要なＣＡＶベクター（例えば、所望のＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載の合成ＣＡＶベクター以外のＣＡＶベクター）、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、偶発性物質、及び凝集体の量を評価するステップを含む。一部の実施形態では、力価を評価するステップは、調製物中の機能性及び非機能性（例えば、感染性及び非感染性）ＣＡＶベクターの比を評価すること（例えば、ＨＰＬＣによる評価など）を含む。一部の実施形態では、効力を評価するステップは、調製物中に検出可能なＣＡＶベクター機能のレベル（例えば、そこにコード化されたエフェクターの発現及び／又は機能又はゲノム当量）を評価することを含む。
複数の実施形態において、製剤化された調製物は、実質的に病原体、宿主細胞混入物若しくは不純物を含まず；予め定めたレベルの非感染性粒子又は予め定めた比の粒子：感染性単位（例えば、＜３００：１、＜２００：１、＜１００：１、若しくは＜５０：１）を有する。
一部の実施形態では、複数のＣＡＶベクターを単一バッチ中に産生することができる。複数の実施形態では、バッチ中に産生されたＣＡＶベクターのレベルを評価することができる（例えば、個別に、又は一緒に）。
一態様では、本発明は、以下：
（ｉ）本明細書に記載される核酸構築物を含む第１核酸分子、及び
（ｉｉ）任意選択で、例えば本明細書に記載のＶＰ１、ＶＰ２、若しくはアポプチン分子から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ若しくは複数をコード化する第２核酸分子
を含む宿主細胞を特徴とする。
（ｉ）本明細書に記載される核酸構築物を含む第１核酸分子、及び
（ｉｉ）任意選択で、例えば本明細書に記載のＶＰ１、ＶＰ２、若しくはアポプチン分子から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ若しくは複数をコード化する第２核酸分子
を含む宿主細胞を特徴とする。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるＣＡＶベクターと、ポリヌクレオチドとを含む反応混合物を特徴とし、ポリヌクレオチドは、外部タンパク質（例えば、外部タンパク質結合配列に結合する能力を有する外部タンパク質、及び任意選択で、脂質エンベロープ）をコードするポリヌクレオチド、複製タンパク質（例えば、ポリメラーゼ）をコードするポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター（例えば、合成ＣＡＶベクター）を単離する、例えば、宿主細胞から単離する、及び／又は溶液（例えば、上清）中の他の構成要素から単離する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクター（例えば、合成ＣＡＶベクター）を、例えば、溶液（例えば、上清）から精製する。一部の実施形態では、溶液中の他の構成要素に対してＣＡＶベクターを溶液中で濃縮する。
前述したＣＡＶベクター、組成物又は方法のいずれかの一部の実施形態では、ＣＡＶベクターの提供は、ＣＡＶベクターを、ＣＡＶベクター産生細胞、例えば、本明細書に記載されるものなどを含む組成物から分離する（例えば、採取する）ステップを含む。他の実施形態では、ＣＡＶベクターの提供は、ＣＡＶベクター又はその調製物を、例えば、第三者から得るステップを含む。
前述したＣＡＶベクター、組成物又は方法のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載の方法に従って、同定されるようなＣＡＶベクターゲノムを含む。実施形態では、遺伝子エレメントは、自己複製及び／又は自己増幅が可能である。実施形態では、遺伝子エレメントは、自己複製及び／又は自己増幅が不可能である。実施形態では、遺伝子エレメントは、トランスで複製及び／又は増幅することができる。
前述したＣＡＶベクター、組成物又は方法のいずれかの追加の特徴は、以下に列挙する実施形態のうちの１つ又は複数を含む。
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、又は常用的な実験を用いて確認することができるであろう。そのような同等物は、以下に列挙する実施形態に包含されることが意図される。
列挙される実施形態
１．プロモーターエレメント；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性で、ＣＡＶカプシドポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）に特異的に結合するタンパク質結合配列
を含む遺伝子エレメント。
１．プロモーターエレメント；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性で、ＣＡＶカプシドポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）に特異的に結合するタンパク質結合配列
を含む遺伝子エレメント。
２．プロモーターエレメント；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
タンパク質結合配列；
を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントはＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージングされる（例えば、特異的にパッケージングされる）ことができる、遺伝子エレメント。
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
タンパク質結合配列；
を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントはＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージングされる（例えば、特異的にパッケージングされる）ことができる、遺伝子エレメント。
３．プロモーターエレメント；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
ＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列；
を含む遺伝子エレメントであって、
外因性エフェクターは：
（ａ）ヒト細胞での発現に最適化されたコドンである、
（ｂ）ヒトポリペプチド又は核酸である、
（ｃ）ヒトポリペプチド又は核酸に結合する、又は
（ｄ）ヒト細胞において活性を有する、例えば、ヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／又はレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる）
遺伝子エレメント。
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
ＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列；
を含む遺伝子エレメントであって、
外因性エフェクターは：
（ａ）ヒト細胞での発現に最適化されたコドンである、
（ｂ）ヒトポリペプチド又は核酸である、
（ｃ）ヒトポリペプチド又は核酸に結合する、又は
（ｄ）ヒト細胞において活性を有する、例えば、ヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／又はレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる）
遺伝子エレメント。
４．タンパク質結合配列が、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５．プロモーターエレメント；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
配列番号１のヌクレオチド１～３７４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は配列番号１００のヌクレオチド２１９５～２３１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列
を含む遺伝子エレメント。
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
配列番号１のヌクレオチド１～３７４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は配列番号１００のヌクレオチド２１９５～２３１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列
を含む遺伝子エレメント。
６．プロモーターエレメント；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
ＣＡＶゲノム配列（例えば、本明細書に記載される）の連続部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、又は３，００ヌクレオチド
を含む遺伝子エレメント。
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列、及び
ＣＡＶゲノム配列（例えば、本明細書に記載される）の連続部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、又は３，００ヌクレオチド
を含む遺伝子エレメント。
７．ＣＡＶゲノム配列（例えば、本明細書に記載される）の連続部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する少なくとも１，０００ヌクレオチドを含む、実施形態６の遺伝子エレメント。
８．例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性でＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントは以下の１つ以上を含まない：
（ｉ）完全長ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子（例えば、遺伝子エレメントはＣＡＶ ＶＰ１遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）；
（ｉｉ）完全長ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子（例えば、遺伝子エレメントはＣＡＶ ＶＰ２遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）；又は
（ｉｉ）完全長ＣＡＶアポプチン遺伝子（例えば、遺伝子エレメントはＣＡＶアポプチン遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶアポプチン遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）
遺伝子エレメント。
遺伝子エレメントは以下の１つ以上を含まない：
（ｉ）完全長ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子（例えば、遺伝子エレメントはＣＡＶ ＶＰ１遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）；
（ｉｉ）完全長ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子（例えば、遺伝子エレメントはＣＡＶ ＶＰ２遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）；又は
（ｉｉ）完全長ＣＡＶアポプチン遺伝子（例えば、遺伝子エレメントはＣＡＶアポプチン遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶアポプチン遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）
遺伝子エレメント。
９．例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性でＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントは以下の１つ以上を含む：
（ｉ）例えば、ＣＡＶ ＶＰ１コード配列の配列内、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１コード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子若しくはその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００以上のｂｐの連続断片）；
（ｉｉ）例えば、ＣＡＶ ＶＰ２コード配列の配列内、例えば、ＣＡＶ ＶＰ２コード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子若しくはその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００以上のｂｐの連続断片）；又は
（ｉｉ）例えば、ＣＡＶアポプチンコード配列の配列内、例えば、ＣＡＶアポプチンコード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶアポプチン遺伝子若しくはその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００ｂｐ以上のｂｐの連続断片）、
遺伝子エレメント。
遺伝子エレメントは以下の１つ以上を含む：
（ｉ）例えば、ＣＡＶ ＶＰ１コード配列の配列内、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１コード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子若しくはその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００以上のｂｐの連続断片）；
（ｉｉ）例えば、ＣＡＶ ＶＰ２コード配列の配列内、例えば、ＣＡＶ ＶＰ２コード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子若しくはその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００以上のｂｐの連続断片）；又は
（ｉｉ）例えば、ＣＡＶアポプチンコード配列の配列内、例えば、ＣＡＶアポプチンコード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶアポプチン遺伝子若しくはその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００ｂｐ以上のｂｐの連続断片）、
遺伝子エレメント。
１０．タンパク質結合配列が、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態８又は９の遺伝子エレメント。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態８又は９の遺伝子エレメント。
１１．遺伝子エレメントが機能的ＣＡＶアポプチン遺伝子を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１２．遺伝子エレメントが機能的ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子、機能的ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子、又は機能的ＣＡＶアポプチン遺伝子を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１３．遺伝子エレメントが短縮ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１コード配列に含まれる１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、又は２０未満のヌクレオチドの連続配列）を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１４．遺伝子エレメントが短縮ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ２コード配列に含まれる６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、又は２０未満のヌクレオチドの連続配列）を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１５．遺伝子エレメントが短縮ＣＡＶアポプチン遺伝子（例えば、ＣＡＶアポプチンコード配列に含まれる３５０、３００、２００、１００、５０、４０、３０、又は２０未満のヌクレオチドの連続配列）を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１６．プロモーターエレメントと、エフェクター（例えば、外因性エフェクター、例えば、治療用エフェクター）をコードする核酸配列とをさらに含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１７．以下の一方又は両方を含む：
配列番号１０のヌクレオチド１～６０６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５若しくは６０６ヌクレオチド、
及び／又は
配列番号１０のヌクレオチド２１９５～２３１９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、若しくは１２４ヌクレオチド
前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
配列番号１０のヌクレオチド１～６０６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５若しくは６０６ヌクレオチド、
及び／又は
配列番号１０のヌクレオチド２１９５～２３１９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、若しくは１２４ヌクレオチド
前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１８．ＣＡＶ ＵＴＲ、例えば、ＣＡＶ ５’ＵＴＲ（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は２～１３のいずれかに列挙される）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１９．完全長ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
２０．完全長ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
２１．完全長ＣＡＶアポプチン遺伝子を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
２２．完全長ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子を含まない、実施形態１～１８、２０、又は２１のいずれかの遺伝子エレメント。
２３．ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子の５’末端から１～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、若しくは９００～１０００ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態２２の遺伝子エレメント。
２４．ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子の３’末端から１～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、若しくは９００～１０００ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態２２又は２３の遺伝子エレメント。
２５．ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子配列の１３４９、１３４０、１３３０、１３２０、１３１０、１３００、１２５０、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、若しくは１未満のヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態２２又は２３の遺伝子エレメント。
２６．完全長ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
２７．ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子の５’末端から２２６、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、若しくは５未満のヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態２６の遺伝子エレメント。
２８．ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子の３’末端から２２６、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、若しくは５未満のヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態２６又は２７の遺伝子エレメント。
２９．ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子配列の６５０、６４０、６３０、６２０、６１０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１００、５０、４０、３０、２９、２８、２７、又は２６未満のヌクレオチドを含む、実施形態２６又は２７の遺伝子エレメント。
３０．完全長ＣＡＶアポプチン遺伝子を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
３１．ＣＡＶアポプチン遺伝子の５’末端から１～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、若しくは３００～３５０ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態３０の遺伝子エレメント。
３２．ＣＡＶアポプチン遺伝子の３’末端から１～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、若しくは３００～３５０ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態３０又は３１の遺伝子エレメント。
３３．ＣＡＶアポプチン遺伝子配列の３６５、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、又は１未満のヌクレオチドを含む、実施形態３０又は３１の遺伝子エレメント。
３４．１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、若しくは２，０００～２，５００、又は２，５００、２，４００、２，３００、２，２００、２，１００、若しくは２，０００未満のヌクレオチドの長さである、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
３５．ＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡである、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
３６．環状又は線状である、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
３７．環状化された二本鎖ＤＮＡを使用して産生された、例えば、環状化されたＤＮＡがインビトロ環状化によって産生された、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
３８．タンデム核酸構築物を使用して産生された、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
３９．プロモーターエレメントがＣＡＶに対して内因性である、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４０．プロモーターエレメントがＣＡＶに対して外因性である、実施形態１～３８のいずれかの遺伝子エレメント。
４１．核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４２．配列番号１のヌクレオチド１～３７４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４３．配列番号１のヌクレオチド１３８～２５４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４４．配列番号１のヌクレオチド２５５～２６０、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４５．配列番号１のヌクレオチド３１７～３２２、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４６．配列番号１のヌクレオチド３７４～１０２４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４７．配列番号１のヌクレオチド４８０～８４５、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４８．配列番号１のヌクレオチド８４７～２１９６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
４９．配列番号１のヌクレオチド２１９７～２３１３、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５０．配列番号１のヌクレオチド２２００～２２６６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５１．配列番号１のヌクレオチド２２８１～２２８６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５２．配列番号１のヌクレオチド１～３７４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５３．配列番号１のヌクレオチド１３８～２５４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５４．配列番号１のヌクレオチド２５５～２６０、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５５．配列番号１のヌクレオチド３１７～３２２、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５６．配列番号１のヌクレオチド３７４～１０２４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５７．配列番号１のヌクレオチド４８０～８４５、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５８．配列番号１のヌクレオチド８４７～２１９６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
５９．配列番号１のヌクレオチド２１９７～２３１３、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６０．配列番号１のヌクレオチド２２００～２２６６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６１．配列番号１のヌクレオチド２２８１～２２８６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６２．配列番号１０のヌクレオチド１～６０６及び／又はヌクレオチド１５９５～２３１９、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６３．配列番号１０のヌクレオチド１～８０６及び／又はヌクレオチド１７９５～２３１９年、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６４．配列番号１０のヌクレオチド１～１００６及び／又はヌクレオチド１９９５～２３１９、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６５．配列番号１０のヌクレオチド１～１２０６及び／又はヌクレオチド２１９５～２３１９、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６６．配列番号１０のヌクレオチド１～３７９、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６７．配列番号１０のヌクレオチド３８０～１０３０、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６８．配列番号１０のヌクレオチド４８５～８５１、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
６９．配列番号１０のヌクレオチド８５３～２２０２、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７０．配列番号１０のヌクレオチド２２０３～２３１９、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７１．配列番号１０のヌクレオチド１３８～２５４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７２．配列番号１０のヌクレオチド２５５～２６０、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７３．配列番号１０のヌクレオチド３１７～３２２、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７４．配列番号１０のヌクレオチド３７４～１０２４、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７５．配列番号１０のヌクレオチド４８０～８４５、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７６．配列番号１０のヌクレオチド８４７～２１９６、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７７．配列番号１０のヌクレオチド２１９７～２３１３、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７８．配列番号１０のヌクレオチド２１９７～２３１３、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
７９．野生型ＣＡＶゲノム（例えば、表１に示されるような、Ｃｕｘｈａｖｅｎ １単離物ゲノム）からの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８０．ＣＡＶ単離物１５３５ＴＷゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８１．ＣＡＶ単離物Ｎ５ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８２．ＣＡＶ単離物１６２３ＴＷゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８３．ＣＡＶ単離物ＣＡＶ－ＥＧ－７ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８４．ＣＡＶ単離物ＨＬＪ１５１０８ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８５．ＣＡＶ単離物ＬＮ１４０２ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８６．ＣＡＶ単離物ＧＤ－Ｆ－１２ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８７．ＣＡＶ単離物ＧＸ１８０５ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８８．ＣＡＶ単離物ＪＬ１４０２６ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
８９．ＣＡＶ単離物ＨＢ１５１７ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９０．ＣＡＶ単離物Ｎ１ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９１．ＣＡＶ単離Ｎ２ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９２．ＣＡＶ単離物ＨＮ１５０４ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９３．ＣＡＶ単離Ｎ３ゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９４．鳥類ジャイロウイルス（例えば、ＣＡＶ関連鳥類ジャイロウイルス、例えば、ＣＡＶ関連鳥類ジャイロウイルス２、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿０１５３９６の配列を有する）からの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９５．表１７に列挙されるＣＡＶゲノムからの反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２、アポプチン、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ全て）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９６．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９７．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質のアルギニンリッチ領域をコードする核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９８．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質のゼリーロールドメインをコードする核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
９９．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１００．アミノ酸配列Ｉ９４ＣＮＣＧＱＦＲＫＨ１０３をコードする核酸配列を含まない、実施形態９９の遺伝子エレメント。
１０１．アミノ酸配列ＷＬＲＥＣＳＲＳＨＡＫＩＣＮＣＧＱＦＲＫＨをコードする核酸配列を含まない、実施形態９９又は１００の遺伝子エレメント。
１０２．金属イオン配位部位（例えば、Ｚｎ２＋配位部位）を形成するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含まない、実施形態１００又は１０１の遺伝子エレメント。
１０３．ＣＡＶアポプチンタンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含まない、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１０４．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１０５．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質がアルギニンリッチ領域を含む、実施形態１０４の遺伝子エレメント。
１０６．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質がゼリーロールドメインを含む、実施形態１０４又は１０５の遺伝子エレメント。
１０７．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、１つ以上のＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１０４～１０６のいずれかの遺伝子エレメント。
１０８．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、アミノ酸配列ＲＲＡＲＲＰＲＧＲＦＹＡＦＲＲＧＲ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１０４～１０７のいずれかの遺伝子エレメント。
１０９．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、アミノ酸配列ＲＲＲＹＫＦＲＨＲＲＱＲＹＲＲＲＡＦＲＫＨ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１０４～１０８のいずれかの遺伝子エレメント。
１１０．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、アミノ酸配列ＳＲＲＳＦＮＨＨＫＡＲＧＡＧＤＰＫ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１０４～１０９のいずれかの遺伝子エレメント。
１１１．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、１つ以上（例えば、２つ）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、実施形態１０４～１１０のいずれかの遺伝子エレメント。
１１２．ＮＬＳが、アミノ酸配列ＲＲＡＲＲＰＲＧＲＦＹＡＦＲＲＧＲＷＨＨ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１１の遺伝子エレメント。
１１３．ＮＬＳが、アミノ酸配列ＫＲＬＲＲＲＹＫＦＲＨＲＲＲＱＲＹＲＲＲＡＦＲＫ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１１の遺伝子エレメント。
１１４．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、１つ以上（例えば、２つ又は３つ）の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む、実施形態１０４～１１３のいずれかの遺伝子エレメント。
１１５．ＮＥＳが、アミノ酸配列ＩＦＬＴＥＧＬＩＬ、又はそれと１、２、３、４、若しくは５以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１４の遺伝子エレメント。
１１６．ＮＥＳが、アミノ酸配列ＬＫＥＦＬＬＡＳＭＮＬ、又はそれと１、２、３、４、若しくは５以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１４の遺伝子エレメント。
１１７．ＮＥＳが、アミノ酸配列ＥＬＤＴＮＦＦＴＬＹＶＡＱ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１４の遺伝子エレメント。
１１８．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１１９．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質又はその機能断片が、アミノ酸配列
を含む、実施形態１１８の遺伝子エレメント。
を含む、実施形態１１８の遺伝子エレメント。
１２０．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質又はその機能断片が、アミノ酸配列ＷＸ７ＨＸ３ＣＸＣＸ５Ｈを含む、実施形態１１８の遺伝子エレメント。
１２１．各Ｘが任意のアミノ酸であり得る、実施形態１２２０の遺伝子エレメント。
１２２．各Ｘｎがｎ個のアミノ酸を含む、実施形態１２０又は１２１の遺伝子エレメント。
１２３．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質又はその機能断片が、アミノ酸配列ＷＬＲＥＣＳＲＳＨＡＫＩＣＮＣＧＱＦＲＫＨを含む、実施形態１１８～１２２のいずれかの遺伝子エレメント。
１２４．アミノ酸配列のシステイン及びヒスチジン残基が、金属イオン配位部位（例えば、Ｚｎ２＋配位部位）を形成する、実施形態１１９～１２３のいずれかの遺伝子エレメント。
１２５．ＣＡＶアポプチンタンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント。
１２６．前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメントの核酸配列を含む核酸構築物。
１２７．ＤＮＡ、例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡである、実施形態１２６の核酸構築物。
１２８．核酸構築物の複製、例えば、細菌細胞における複製に適した骨格領域を含む、実施形態１２６又は１２７の核酸構築物。
１２９．骨格領域が、複製起点及び選択マーカーの一方又は両方を含む、実施形態１２８の核酸構築物。
１３０．遺伝子エレメントとタンデムに配置されたＣＡＶタンデム領域をさらに含み、ＣＡＶタンデム領域が、ＣＡＶゲノム若しくはその断片、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１２６～１２９のいずれかの核酸構築物。
１３１．遺伝子エレメントが、ＣＡＶタンデム領域に対して３’に位置する、実施形態１３０の核酸構築物。
１３２．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復（又はその断片、例えば、反復の１、２、３、４、又は５を含む断片）、プロモーター、オープンリーディングフレーム、及びヘアピンを含む、実施形態１３１の核酸構築物。
１３３．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のプロモーター、オープンリーディングフレーム、及びヘアピンを含む、実施形態１３１の核酸構築物。
１３４．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のオープンリーディングフレーム及びヘアピンを含む、実施形態１３１の核酸構築物。
１３５．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のオープンリーディングフレームの断片（例えば、オープンリーディングフレームの最も３’側の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、又は５００ヌクレオチドを含む、例えば、オープンリーディングフレームの３’断片）及びヘアピンを含む、実施形態１３１の核酸構築物。
１３６．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復（又はその断片、例えば、反復の１、２、３、４、又は５を含む断片）を含まない、実施形態１３１の核酸構築物。
１３７．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復及び／又はプロモーターを含まない、実施形態１３１の核酸構築物。
１３８．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、及び／又はオープンリーディングフレームを含まない、実施形態１３１の核酸構築物。
１３９．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、及び／又はオープンリーディングフレームの少なくとも１つの断片（例えば、オープンリーディングフレームの最も３’側の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、又は５００ヌクレオチドを含む、例えばオープンリーディングフレームの３’断片）及びヘアピンを含まない、実施形態１３１のヌクレオチド酸構築。
１４０．遺伝子エレメントが、ＣＡＶタンデム領域に対して５’に位置する、実施形態１３０の核酸構築物。
１４１．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、オープンリーディングフレーム、及びヘアピンを含む、実施形態１４０の核酸構築物。
１４２．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、及びオープンリーディングフレームを含む、実施形態１４０の核酸構築物。
１４３．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、及びオープンリーディングフレームの断片（例えば、オープンリーディングフレームの最も５’側の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、又は５００ヌクレオチドを含む、例えば、オープンリーディングフレームの５’断片）を含む、実施形態１４０の核酸構築物。
１４４．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復を含む、実施形態１４０の核酸構築物。
１４５．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復の断片を含む、実施形態１４０の核酸構築物。
１４６．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のヘアピンを含まない、実施形態１４０の核酸構築物。
１４７．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のオープンリーディングフレーム及び／又はヘアピンを含まない、実施形態１４０の核酸構築物。
１４８．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のオープンリーディングフレームの断片（例えば、オープンリーディングフレームの最も５’側の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、又は５００ヌクレオチドを含む、例えば、オープンリーディングフレームの５’断片）及び／又はヘアピンを含まない、実施形態１４０の核酸構築物。
１４９．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列のプロモーター、オープンリーディングフレーム、及び／又はヘアピンを含まない、実施形態１４０の核酸構築物。
１５０．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、オープンリーディングフレーム、及び／又はヘアピンを含まない、実施形態１４０の核酸構築物。
１５１．ＣＡＶタンデム領域が、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列の反復、プロモーター、オープンリーディングフレーム、及び／又はヘアピンの断片を含まない、実施形態１４０の核酸構築物。
１５２．ＣＡＶタンデム領域が、野生型ＣＡＶゲノム配列（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような）の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２１００、２２００、２３００、２３１０、２３１１、若しくは２３１２連続ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの核酸構築物。
１５３．ＣＡＶタンデム領域が、野生型ＣＡＶゲノム配列（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような）の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２１００、２２００、２３００、２３１０、２３１１、若しくは２３１２の連続ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの核酸構築物。
１５４．ＣＡＶタンデム領域が、野生型ＣＡＶゲノム配列（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような）の１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、２３００～２３１０、又は２３１０～２３１３の連続ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの核酸構築物。
１５５．以下の１つ、２つ、又は３つ全てを含む核酸構築物（例えばプラスミド）：
（ａ）ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｂ）ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；及び／又は
（ｃ）ＣＡＶアポプチン遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；
ここで、核酸構築物はＣＡＶパッケージングシグナルを含まず、及び／又は核酸構築物はＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージングされることができない。
（ａ）ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｂ）ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；及び／又は
（ｃ）ＣＡＶアポプチン遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；
ここで、核酸構築物はＣＡＶパッケージングシグナルを含まず、及び／又は核酸構築物はＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージングされることができない。
１５６．ＣＡＶパッケージングシグナルが、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態１５５の核酸構築物。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態１５５の核酸構築物。
１５７．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含む、実施形態１５５の核酸構築物。
１５８．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質がアルギニンリッチ領域を含む、実施形態１５７の核酸構築物。
１５９．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質がゼリーロールドメインを含む、実施形態１５７又は１５８の核酸構築物。
１６０．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、１つ以上のＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１５７～１５９のいずれかの核酸構築物。
１６１．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、アミノ酸配列ＲＲＡＲＲＰＲＧＲＦＹＡＦＲＲＧＲ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１５７～１６０のいずれかの核酸構築物。
１６２．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、アミノ酸配列ＲＲＲＹＫＦＲＨＲＲＱＲＹＲＲＲＡＦＲＫＨ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１５７～１６１のいずれかの核酸構築物。
１６３．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、アミノ酸配列ＳＲＲＳＦＮＨＨＫＡＲＧＡＧＤＰＫ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合モチーフを含む、実施形態１５７～１６２のいずれかの核酸構築物。
１６４．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、１つ以上（例えば、２つ）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、実施形態１５７～１６３のいずれかの核酸構築物。
１６５．ＮＬＳが、アミノ酸配列ＲＲＡＲＲＰＲＧＲＦＹＡＦＲＲＧＲＷＨＨ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６４の核酸構築物。
１６６．ＮＬＳが、アミノ酸配列ＫＲＬＲＲＲＹＫＦＲＨＲＲＲＱＲＹＲＲＲＡＦＲＫ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６４の核酸構築物。
１６７．ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質が、１つ以上（例えば、２つ又は３つ）の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む、実施形態１５７～１６６のいずれかの核酸構築物。
１６８．ＮＥＳが、アミノ酸配列ＩＦＬＴＥＧＬＩＬ、又はそれと１、２、３、４、若しくは５以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６７の核酸構築物。
１６９．ＮＥＳが、アミノ酸配列ＬＫＥＦＬＬＡＳＭＮＬ、又はそれと１、２、３、４、若しくは５以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６７の核酸構築物。
１７０．ＮＥＳが、アミノ酸配列ＥＬＤＴＮＦＦＴＬＹＶＡＱ、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６７の核酸構築物。
１７１．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質、又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの核酸構築物。
１７２．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質又はその機能断片が、アミノ酸配列
を含む、実施形態１７１の核酸構築物。
を含む、実施形態１７１の核酸構築物。
１７３．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質又はその機能断片が、アミノ酸配列ＷＸ７ＨＸ３ＣＸＣＸ５Ｈを含む、実施形態１７１の核酸構築物。
１７４．ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質又はその機能断片が、アミノ酸配列ＷＬＲＥＣＳＲＳＨＡＫＩＣＮＣＧＱＦＲＫＨを含む、実施形態１７１又は１７２の核酸構築物。
１７５．アミノ酸配列のシステイン及びヒスチジン残基が金属イオン配位部位（例えば、Ｚｎ２＋配位部位）を形成する、実施形態１７２～１７４のいずれかの核酸構築物。
１７６．ＣＡＶアポプチンタンパク質又はその機能断片若しくは変異体をコードする核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの核酸構築物。
１７７．実施形態２１ａの核酸構築物及び前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメントを含む宿主細胞（例えば、鳥類細胞、例えば、ＭＤＣＣ細胞、例えば、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞）。
１７８．ａ）ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部；
ｂ）（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）ＣＡＶ ＶＰ１分子に特異的に結合するタンパク質結合配列を含む遺伝子エレメント
を含むＣＡＶベクター。
ｂ）（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）ＣＡＶ ＶＰ１分子に特異的に結合するタンパク質結合配列を含む遺伝子エレメント
を含むＣＡＶベクター。
１７９．遺伝子エレメントが、実施形態１～１２５のいずれかによる遺伝子エレメントである、実施形態７８のＣＡＶベクター。
１８０．タンパク質結合配列が、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態７８のＣＡＶベクター。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態７８のＣＡＶベクター。
１８１．以下を含むＣＡＶベクター：
ａ）実施形態１～１２５のいずれかの遺伝子エレメント、及び
ｂ）タンパク質性外部、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部。
ａ）実施形態１～１２５のいずれかの遺伝子エレメント、及び
ｂ）タンパク質性外部、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部。
１８２．以下を含むＣＡＶベクター：
ａ）実施形態１～１２５のいずれかの遺伝子エレメント、及び
ｂ）カプシド、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むカプシド。
ａ）実施形態１～１２５のいずれかの遺伝子エレメント、及び
ｂ）カプシド、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むカプシド。
１８３．遺伝子エレメントがＣＡＶ ＵＴＲ、例えば、ＣＡＶ ５’ＵＴＲ（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は２～１３のいずれかに列挙される）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかのＣＡＶベクター。
１８４．遺伝子エレメントに結合したＣＡＶ ＶＰ１
を含む複合体であって、
遺伝子エレメントが、（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）タンパク質結合配列を含む、複合体。
を含む複合体であって、
遺伝子エレメントが、（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）タンパク質結合配列を含む、複合体。
１８５．以下を含む複合体：
前述の実施形態のいずれかによる遺伝子エレメント、及び
遺伝子エレメントに結合したカプシドタンパク質（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）。
前述の実施形態のいずれかによる遺伝子エレメント、及び
遺伝子エレメントに結合したカプシドタンパク質（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）。
１８６．遺伝子エレメントが、前述の実施形態のいずれかによる遺伝子エレメントであり；及び／又は
複合体が無細胞系にある、実施形態１８４又は１８５の複合体。
複合体が無細胞系にある、実施形態１８４又は１８５の複合体。
１８７．タンパク質結合配列が、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態１８４～１８６のいずれかの複合体。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態１８４～１８６のいずれかの複合体。
１８８．遺伝子エレメントがＣＡＶ ＵＴＲ、例えば、ＣＡＶ ５’ＵＴＲ（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は２～１３のいずれかに列挙される）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１８４～１８７のいずれかの複合体。
１８９．外因性エフェクターを標的細胞（例えば、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達する方法であって、実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを細胞に導入することを含む、方法。
１９０．エンドサイトーシスの阻害剤、例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソアを投与することを含まない、実施形態１８９の方法。
１９１．エンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与することを含まない、実施形態１８９又は１９０の方法。
１９２．標的細胞がエンドサイトーシスによってＣＡＶベクターを取り込む、実施形態１８９～１９１のいずれかの方法。
１９３．外因性エフェクターを標的細胞（例えば、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達する方法であって、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書のＣＡＶベクターを細胞に導入することを含み、細胞がエンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソア）と接触しない、方法。
１９４．外因性エフェクターを標的細胞（例えば、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達する方法であって、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書のＣＡＶベクターを細胞に導入することを含み、細胞がエンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンと接触しない、方法。
１９５．外因性エフェクターを標的細胞（例えば、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達する方法であって：
（ａ）ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば、抗ＣＡＶ抗体、例えば、ＣＡＶ中和抗体の存在について、標的細胞、又は標的細胞を含む対象を評価すること；及び
（ｂ）実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを細胞に導入すること
を含む、方法。
（ａ）ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば、抗ＣＡＶ抗体、例えば、ＣＡＶ中和抗体の存在について、標的細胞、又は標的細胞を含む対象を評価すること；及び
（ｂ）実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを細胞に導入すること
を含む、方法。
１９６．ＣＡＶを受容するための対象を選択する方法であって、ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば、抗ＣＡＶ抗体、例えば、ＣＡＶ中和抗体の存在について対象を評価することを含む、方法。
１９７．それを必要とする対象において生物学的活性を調節する方法であって、実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを対象に導入することを含み、例えば、疾患又は障害が癌である、方法。
１９８．エンドサイトーシスの阻害剤、例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソアを投与することを含まない、実施形態１９７の方法。
１９９．エンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与することを含まない、実施形態１９７又は１９８の方法。
２００．標的細胞がエンドサイトーシスによってＣＡＶベクターを取り込む、実施形態１９７～１９９のいずれかの方法。
２０１．それを必要とする対象において生物学的活性を調節する方法であって、対象にＣＡＶベクター、例えば、本明細書のＣＡＶベクターを投与することを含み、対象はエンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソア）を投与されない、方法。
２０２．それを必要とする対象において生物活性を調節する方法であって、対象にＣＡＶベクター、例えば、本明細書のＣＡＶベクターを投与することを含み、対象はエンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与されない、方法。
２０３．それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって、対象に、実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを投与することを含み、例えば、疾患又は障害が癌である、方法。
２０４．エンドサイトーシスの阻害剤、例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソアを投与することを含まない、実施形態２０３の方法。
２０５．エンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与することを含まない、実施形態２０３又は２０４の方法。
２０６．標的細胞がエンドサイトーシスによってＣＡＶベクターを取り込む、実施形態２０３～２０５のいずれかの方法。
２０７．それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって、対象にＣＡＶベクター、例えば本明細書に記載のＣＡＶベクターを投与することを含み、対象はエンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナミン阻害剤、例えばダイナソア）を投与されない、方法。
２０８．それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって、対象にＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクターを投与することを含み、対象はエンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与されない、方法。
２０９．それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって：
（ａ）ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば、抗ＣＡＶ抗体、例えば、ＣＡＶ中和抗体の存在について対象を評価すること；及び
（ｂ）実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを対象に投与すること
を含む、方法。
（ａ）ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば、抗ＣＡＶ抗体、例えば、ＣＡＶ中和抗体の存在について対象を評価すること；及び
（ｂ）実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを対象に投与すること
を含む、方法。
２１０．エンドサイトーシスの阻害剤、例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソアを投与することを含まない、実施形態２０９の方法。
２１１．エンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与することを含まない、実施形態２０９又は２１０の方法。
２１２．標的細胞がエンドサイトーシスによってＣＡＶベクターを取り込む、実施形態２０９～２１１のいずれかの方法。
２１３．それを必要とする対象にワクチン接種する方法であって、対象に、実施形態１７８～２８３のいずれかのＣＡＶベクターを投与することを含み、外因性エフェクターが感染性因子（例えば、ウイルス又は細菌）からの抗原を含む、方法。
２１４．エンドサイトーシスの阻害剤、例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソアを投与することを含まない、実施形態２１３の方法。
２１５．エンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与することを含まない、実施形態２１３又は２１４の方法。
２１６．標的細胞がエンドサイトーシスによってＣＡＶベクターを取り込む、実施形態２１３～２１５のいずれかの方法。
２１７．それを必要とする対象にワクチン接種する方法であって、対象にＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクターを投与することを含み、対象がエンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソア）を投与されず、外因性エフェクターが感染性因子（例えば、ウイルス又は細菌）からの抗原を含む、方法。
２１８．それを必要とする対象にワクチン接種する方法であって、対象にＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクターを投与することを含み、対象がエンドソーム酸性化の阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又はクロロキンを投与されず、外因性エフェクターが感染性因子（例えば、ウイルス又は細菌）からの抗原を含む、方法。
２１９．標的細胞がリンパ系細胞（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞）、上皮細胞、肺細胞、又は線維芽細胞である、実施形態１８９～２１８のいずれかの方法。
２２０．標的細胞がヒト細胞である、実施形態１８９～２１９のいずれかの方法。
２２１．標的細胞が動物（例えば、農業動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、バイソン、又はラクダ）からの細胞である、実施形態１８９～２１９のいずれかの方法。
２２２．動物が鳥類動物（例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、エミュー、又はダチョウ）である、実施形態２２１の方法。
２２３．標的細胞がインビボ又はインビトロである、実施形態１８９～２２２のいずれかの実施形態の方法。
２２４．ＣＡＶベクターが約１～１０（例えば、約２～４、例えば、約３）、１０～５０、５０～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～５０００、５０００～１０，０００、１０，０００～５０，０００、又は５０，０００～１００，０００のＭＯＩで送達される、実施形態１８９～２２３のいずれかの方法。
２２５．外因性エフェクターがナノルシフェラーゼで置き換えられる場合、ＣＡＶベクターはインビトロで複数の標的細胞にナノルシフェラーゼを送達することができ、例えば、実施例５のアッセイにおいて、少なくとも約１０４、１０５、１０６、若しくは１０７、又は約１０４～１０５、１０５～１０６、若しくは１０６～１０７の発光をもたらす、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２２６．ヒト細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞）に、例えば、実施例３のアッセイにおいて、ＭＤＣＣ細胞への結合に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、又は４０％のｖｇで結合することができる、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２２７．遺伝子エレメントが、対照ベクターよりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００倍多い外因性エフェクターのコピーを産生する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２２８．対照ベクターが野生型ＣＡＶゲノム（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかに列挙されるような）を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２２９．対照ベクターがＣＡＶ以外のウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶゲノム又はレンチウイルスゲノム）を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２３０．対照ベクターが、ＣＡＶ配列を欠くことを除いて遺伝子エレメントと同一である、実施形態２２９の遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２３１．遺伝子エレメントが、細胞あたり少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、又は１００，０００，０００コピーの外因性エフェクターを産生する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＮＡベクター、又は方法。
２３２．外因性エフェクターが、標的細胞に対して内因性の対応する分子と同じ配列、又は該分子に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を有し、標的細胞において発現される外因性エフェクターのレベルは、対応する内因性分子の量よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００、５０，０００、又は１００，０００倍大きい、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、又は方法。
２３３．ＣＡＶベクターの作製方法であって：
ａ）前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメントを含む宿主細胞を提供すること、及び
ｂ）タンパク質性外部（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部）内への遺伝子エレメントの閉じ込めに適した条件下で宿主細胞をインキュベートすること、
を含み、
それによってＣＡＶベクターを作製する、方法。
ａ）前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメントを含む宿主細胞を提供すること、及び
ｂ）タンパク質性外部（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部）内への遺伝子エレメントの閉じ込めに適した条件下で宿主細胞をインキュベートすること、
を含み、
それによってＣＡＶベクターを作製する、方法。
２３４．宿主細胞がＣＡＶベクターを上清中に放出する（例えば、宿主細胞がＣＡＶベクターを上清中に分泌する、及び／又は宿主細胞が、例えばＳＤＳ、例えば０．５％ ＳＤＳ中で溶解される）、実施形態２３３の方法。
２３５．宿主細胞からの上清（例えば、宿主細胞から分泌された上清及び／又は宿主細胞の溶解から得られた上清）からＣＡＶベクターを回収することを含む、実施形態２３３又は２３４の方法。
２３６．宿主細胞からの溶解物からＣＡＶベクターを回収することを含む、実施形態２３３～２３５のいずれかの方法。
２３７．上清又は溶解物がヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）で処理される、実施形態２３５又は２３６の方法。
２３８．上清又は溶解物が（例えば、０．４５μｍフィルターを通して濾過される、実施形態２３５～２３７のいずれかの方法。
２３９．上清又は溶解物が、例えば、ショ糖クッション（例えば、２０％ショ糖クッション）を通して超遠心分離される、実施形態２３５～２３８のいずれかの方法。
２４０．上清又は溶解物がＣｓＣｌ勾配に通される、実施形態２３５～２３９のいずれかの方法。
２４１．上清又は溶解物が、分画及び／又は透析される、実施形態２３５～２４０のいずれかの方法。
２４２．宿主細胞が、１つ以上の追加のＯＲＦ（例えば、１つ以上の追加のＣＡＶ ＯＲＦ、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、又はアポプチンの１つ以上）をコードする１つ以上の追加の核酸をさらに含む、実施形態２３５～２４１のいずれかの方法。
２４３．前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメントを含む宿主細胞（例えば、脊椎動物細胞、例えば、（ｉ）哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞；又は（ｉｉ）鳥類細胞、例えば、ニワトリ細胞）、又は遺伝子エレメントを含む核酸構築物。
２４４．ＣＡＶ ＶＰ１分子又はＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸をさらに含む、実施形態２４３の宿主細胞。
２４５．実施形態１７８～１８３のいずれかのＣＡＶベクターを含む宿主細胞。
２４６．以下を含む宿主細胞：
ａ）ＣＡＶ ＶＰ１分子、又はＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸；並びに
ｂ）遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含む核酸構築物であって、遺伝子エレメントが（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）タンパク質結合配列を含み、例えば、遺伝子エレメントが前述の実施形態のいずれかによる遺伝子エレメントである、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含む核酸構築物。
ａ）ＣＡＶ ＶＰ１分子、又はＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸；並びに
ｂ）遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含む核酸構築物であって、遺伝子エレメントが（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）タンパク質結合配列を含み、例えば、遺伝子エレメントが前述の実施形態のいずれかによる遺伝子エレメントである、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含む核酸構築物。
２４７．タンパク質結合配列が、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態２４６の宿主細胞。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、実施形態２４６の宿主細胞。
２４８．複合体がインビトロであり、例えば、複合体が実質的に無細胞の組成物中にある、実施形態１８４～１８８のいずれかの複合体。
２４９．複合体が細胞、例えば、宿主細胞、例えば、ヘルパー細胞内、例えば、細胞の核内にある、実施形態１８４～１８８又は２４８のいずれかの複合体。
２５０．ＣＡＶ ＶＰ１分子がタンパク質性外部の一部である、実施形態１８４～１８８、２４８、又は２４９のいずれかの複合体。
２５１．遺伝子エレメントが複製を受けている、実施形態１８４～１８８又は２４８～２５０のいずれかの複合体。
２５２．複合体がＣＡＶベクター中にある、実施形態１８４～１８８又は２４８～２５１のいずれかの複合体。
２５３．実施形態２４３～２５２のいずれかの宿主細胞を作製する方法であって、遺伝子エレメントを細胞に導入することを含み、例えば、遺伝子エレメントを細胞に導入することが、遺伝子エレメントを含む核酸構築物を細胞に導入することを含む、方法。
２５４．ＶＰ１分子をコードする核酸を細胞に導入することをさらに含む、実施形態２５３の方法。
２５５．タンパク質結合配列が、例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性で、ＣＡＶカプシドポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）に特異的に結合する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２５６．遺伝子エレメントがＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージング（例えば、特異的にパッケージング）され得る、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２５７．外因性エフェクターが：
（ａ）ヒト細胞での発現に最適化されたコドンである、
（ｂ）ヒトポリペプチド又は核酸である、
（ｃ）ヒトポリペプチド又は核酸に結合する、又は
（ｄ）ヒト細胞において活性を有する、例えば、ヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／又はレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる））
前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
（ａ）ヒト細胞での発現に最適化されたコドンである、
（ｂ）ヒトポリペプチド又は核酸である、
（ｃ）ヒトポリペプチド又は核酸に結合する、又は
（ｄ）ヒト細胞において活性を有する、例えば、ヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／又はレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる））
前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２５８．タンパク質性外部がＣＡＶ ＶＰ１分子を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２５９．タンパク質性外部におけるタンパク質の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）がＣＡＶ ＶＰ１分子を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６０．遺伝子エレメント又は核酸構築物が、野生型ＣＡＶゲノム配列（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような）の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２１００、２２００、２３００、２３１０、２３１１、若しくは２３１２連続ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６１．遺伝子エレメント又は核酸構築物が、野生型ＣＡＶゲノム配列（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７のいずれかにおいて例えば本明細書に記載されるような）の１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、２３００～２３１０、若しくは２３１０～２３１３連続ヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６２．遺伝子エレメント又は核酸構築物が、例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム配列に対して欠失（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド）を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６３．遺伝子エレメント又は核酸構築物が、例えば、本明細書に記載されるような、例えば核酸配列
を含むＣＡＶパッケージングシグナル、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
を含むＣＡＶパッケージングシグナル、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６４．エフェクターがｍｉＲＮＡを含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６５．エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡが宿主遺伝子を標的とし、例えば、遺伝子の発現を調節し、例えば、遺伝子の発現を増加又は減少させる、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６６．エフェクターがｍｉＲＮＡを含み、宿主遺伝子の発現を減少させる、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６７．エフェクターが、約２０～２００、３０～１８０、４０～１６０、５０～１４０、又は６０～１２０ヌクレオチド長の核酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６８．エフェクターをコードする核酸配列が、約２０～２００、３０～１８０、４０～１６０、５０～１４０、又は６０～１２０ヌクレオチド長である、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２６９．エフェクターをコードする配列が、少なくとも約１００ヌクレオチドのサイズを有する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７０．エフェクターをコードする配列が、約１００～約５０００ヌクレオチドのサイズを有する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７１．エフェクターをコードする配列が、約１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、又は１５００～２０００ヌクレオチドのサイズを有する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７２．遺伝子エレメントが一本鎖である、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７３．遺伝子エレメントが環状である、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７４．遺伝子エレメントがＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡである、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７５．ＣＡＶベクターが、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞に接触する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７６．ＣＡＶベクターが複製欠損である、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７７．ＣＡＶベクターが、対象に静脈内、腹腔内、筋肉内、又は網膜下に投与される、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７８．ＣＡＶベクターが、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は網膜下投与のために製剤化される、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２７９．ＣＡＶベクターが対象（例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象）における細胞又は組織に送達される、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８０．細胞又は組織が、血液、肝臓、脾臓、肺、心臓、卵巣、筋肉、脳、腎臓、及び／又は網膜から選択される、実施形態２７９の遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８１．遺伝子エレメント、核酸構築物、又はＣＡＶベクターが、例えば、実施例１２の方法に従って、等量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２）又はＡＡＶベクターよりも少ない中和抗体応答を誘導する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８２．遺伝子エレメント、核酸構築物、又はＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、例えば、実施例１２の方法に従って、等量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２）又はＡＡＶベクターが試験対象に筋肉内投与された場合に誘導される５０％ＧＭＴ未満の５０％幾何平均中和相互力価（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｔｉｔｅｒ）（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８３．遺伝子エレメント、核酸構築物、又はＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、約３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、又は６４０未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８４．遺伝子エレメント、核酸構築物、又はＣＡＶベクターが、対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、約１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３１０、又は３２０未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８５．遺伝子エレメント、核酸構築物、又はＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に静脈内又は腹腔内投与された場合、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、又は１６０以下の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８６．ＣＡＶベクターが、それを必要とする対象に、静脈内、腹腔内、又は筋肉内投与される、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８７．ＣＡＶベクターがインビトロで集合する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８８．インビトロ集合が、ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部内に遺伝子エレメント（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター遺伝子エレメント）を閉じ込めることを含む、実施形態２８７の遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２８９．インビトロ集合が、ＶＰ１分子を遺伝子エレメントと接触させることをさらに含む、実施形態２８８の遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２９０．遺伝子エレメント、核酸構築物、又はＣＡＶベクターが、複数回用量（例えば、本明細書に記載されるように、別々に投与される用量）での投与に適しているほど十分に低い中和抗体応答を誘導する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞。
２９１．エフェクター又はペイロード（例えば、内因性又は外因性エフェクター）を細胞、組織、又は対象に送達する方法であって、有効量のＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、合成ＣＡＶベクター）を細胞、組織、又は対象に投与することを含み、
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、例えば、実施例１２の方法に従って、等量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２）又はＡＡＶベクターが試験対象に筋肉内導入された場合に誘導されるものよりも低い中和抗体応答を誘導する、方法。
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、例えば、実施例１２の方法に従って、等量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２）又はＡＡＶベクターが試験対象に筋肉内導入された場合に誘導されるものよりも低い中和抗体応答を誘導する、方法。
２９２．エフェクター又はペイロード（例えば、内因性又は外因性エフェクター）を細胞、組織、又は対象に送達する方法であって、有効量のＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、合成ＣＡＶベクター）を細胞、組織、又は対象に投与することを含み、
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、例えば、実施例１２の方法に従って、等量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２）又はＡＡＶベクターが試験対象に筋肉内導入された場合に誘導される５０％ＧＭＴ未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内投与された場合、例えば、実施例１２の方法に従って、等量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２）又はＡＡＶベクターが試験対象に筋肉内導入された場合に誘導される５０％ＧＭＴ未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
２９３．エフェクター又はペイロード（例えば、内因性又は外因性エフェクター）を、それを必要とする細胞、組織、又は対象に送達する方法であって、有効量のＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、合成ＣＡＶベクター）を細胞、組織、又は対象に投与することを含み、
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内に導入された場合、約３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、又は６４０未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内に導入された場合、約３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、又は６４０未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
２９４．エフェクター又はペイロード（例えば、内因性又は外因性エフェクター）を、それを必要とする細胞、組織、又は対象に送達する方法であって、有効量のＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、合成ＣＡＶベクター）を細胞、組織、又は対象に投与することを含み、
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内に導入された場合、約１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３１０、又は３２０未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に筋肉内に導入された場合、約１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３１０、又は３２０未満の５０％幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
２９５．エフェクター又はペイロード（例えば、内因性又は外因性エフェクター）を、それを必要とする細胞、組織、又は対象に送達する方法であって、有効量のＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、合成ＣＡＶベクター）を細胞、組織、又は対象に投与することを含み、
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に静脈内又は腹腔内導入された場合、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０以下の５０％の幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
ＣＡＶベクターが、エフェクター又はペイロードをコードする核酸配列を含み、
ＣＡＶベクターが、試験対象（例えば、マウス）に静脈内又は腹腔内導入された場合、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０以下の５０％の幾何平均中和相互力価（５０％ＧＭＴ）を有する中和抗体応答を誘導する、方法。
２９６．ＣＡＶベクターが、それを必要とする対象に、静脈内、腹腔内、又は筋肉内投与される、実施形態２９１～２９５のいずれかの方法。
２９７．投与によって誘導される中和抗体のレベルが、実施例１２の方法に従って決定される、実施形態２９１～２９６のいずれかの方法。
２９８．投与によって誘導される中和抗体のレベルが、ＣＡＶベクターを投与された対象から得られた試料（例えば、血清試料）中の中和抗体のレベルを評価することを含む方法に従って決定される、実施形態２９１～２９６のいずれかの方法。
２９９．評価することが、試料をインビトロで試験細胞と、レポーター（例えば、蛍光又は発光レポーター、例えば、ナノルシフェラーゼ）をコードする遺伝子エレメントを含む試験ＣＡＶベクターと接触させること、及び試料の非存在下で試験ＣＡＶベクターと接触させた他の類似の試験細胞と比較して、試験細胞におけるレポーターのレベル又は活性を測定することを含む、実施形態２９８の方法。
３００．ＣＡＶベクターが、複数回用量（例えば、本明細書に記載のように、例えば別々に投与される用量）での投与に適しているほど十分に低い中和抗体応答を誘導する、実施形態２９１～２９９のいずれかの方法。
３０１．前述の実施形態のいずれかの遺伝子エレメント、核酸構築物、ＣＡＶベクター、複合体、方法、又は宿主細胞、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。
３０２．医薬組成物のｐＨが、約５．０～５．５、５．５～６．０、６．０～６．５、６．５～７．０、７．０～７．４、７．４～７．６、又は７．６～８．０である、実施形態３０１の医薬組成物。
３０３．組成物が、２５～３０℃、３０～３５℃、３５～４０℃、４０～４５℃、４５～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～６５℃、又は６５～７０℃の温度である、実施形態３０１～３０２のいずれかの医薬組成物。
３０４．組成物が、１～５℃、５～１０℃、１０～１５℃、１５～２０℃、又は２０～２５℃の温度である、実施形態３０１～３０３のいずれかの医薬組成物。
３０５．組成物が約４℃の温度である、実施形態３０１～３０４のいずれかの医薬組成物。
３０６．ＣＡＶベクターを含む組成物を保存する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物を、１～５℃、５～１０℃、１０～１５℃、１５～２０℃、又は２０～２５℃の温度で、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、若しくは２年の期間、又は約１～２週間、２～３週間、３～４週間、１～２ヶ月、２～３ヶ月、３～４ヶ月、４～５ヶ月、５～６ヶ月、６～７ヶ月、７～８ヶ月、８～９ヶ月、９～１０ヶ月、１０～１１ヶ月、１１～１２ヶ月、１２～１８ヶ月、１８～２４ヶ月、若しくは２～３年の期間、維持することを含む、方法。
３０７．組成物が１～５℃（例えば、４℃）の温度に維持される、実施形態３０６の方法。
３０８．組成物が、少なくとも６ヶ月間、前記温度に維持される、実施形態３０６又は３０７の方法。
３０９．ＣＡＶベクターを含む組成物を冷却する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物の温度を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０℃まで、又は１～５℃間（例えば、約４℃）まで低下させることを含む、方法。
３１０．低下させる工程の前の組成物の温度が、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、３７、若しくは４０℃、又は１０～１５℃、１５～２０℃、２０～２５℃、２５～３０℃、３０～３５℃、３５～３７℃、若しくは３７～４０℃（例えば、約２５℃）である、実施形態３０９の組成物。
３１１．ＣＡＶベクターを含む組成物を加熱する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物の温度を、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０℃まで、又は２０～２５℃若しくは２５～３０℃（例えば、約２５℃）まで上昇させることを含む、方法。
３１２．上昇させる工程の前の組成物の温度が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０℃未満、又は１～５℃若しくは５～１０℃（例えば、約４℃）である、実施形態３１１の方法。
３１３．ＣＡＶベクターを含む組成物を加熱する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物の温度を、約３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０℃まで、又は３０～３５℃若しくは３５～４０℃（例えば、約３７℃）まで上昇させることを含む、方法。
３１４．組成物が、実施形態３０１～３０５のいずれかの医薬組成物である、実施形態３０６～３１３のいずれかの方法。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
別に定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に挙げる全部の刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。加えて、材料、方法、及び例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図するものではない。
特許又は出願書類は、色彩を付して作成された少なくとも１つの図面を含む。彩色図面を有するこの特許又は特許出願公開の写しは、請求及び必要な手数料の納付によって、特許商標庁が提供する。
本発明の実施形態についての以下の詳細な説明は、添付の図面と一緒に読めば、より明瞭に理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、図面には、本明細書で例示される実施形態を示す。しかしながら、本発明が、図面に示す実施形態の正確な配置及び有用性に限定されないことは理解すべきである。
定義
具体的な実施形態に関して、いくつかの図を参照にしながら本発明を説明するが、本発明は、特許請求の範囲を除いて、それらに限定されない。以下に記載する用語は、別に指示されない限り、概してそれらの一般的意味で理解すべきである。
具体的な実施形態に関して、いくつかの図を参照にしながら本発明を説明するが、本発明は、特許請求の範囲を除いて、それらに限定されない。以下に記載する用語は、別に指示されない限り、概してそれらの一般的意味で理解すべきである。
「含む」という用語が本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、これは、他の要素を排除しない。本発明の目的のために、「から構成される」という用語は、「を含む」という用語の好ましい実施形態であると考えられる。以後、或る群が、少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくは、これらの実施形態のみから構成される１群を開示するとも理解すべきである。
単数名詞、例えば、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」若しくは「その（ｔｈｅ）」を示す際に、不定冠詞又は定冠詞が使用される場合、これは、別のことが特に記載されない限り、複数の当該名詞を包含する。
「治療、調節などを目的とする化合物、組成物、生成物など」という表現は、それ自体で、治療、調節など、明示される目的に好適な化合物、組成物、生成物などを指すと理解すべきである。「治療、調節などを目的とする化合物、組成物、生成物など」の表現は、さらに、実施形態として、こうした化合物、組成物、生成物などが、治療、調節などに使用されることも開示される。
「・・・に使用するための化合物、組成物、生成物など」、「・・・のための薬剤、医薬組成物、獣医学組成物、診断用組成物などの製造における化合物、組成物、生成物などの使用」、又は「・・・薬剤としての使用のための、化合物、組成物、生成物など」という表現は、こうした化合物、組成物、生成物などが、ヒト又は動物身体に対して実施され得る治療方法で使用されることが意図されることを示す。それらは、治療方法などに関する実施形態及び請求項の同等の開示物として考えられる。実施形態又は請求項は、従って、「疾患への罹患が疑われるヒト又は動物の治療に使用するための化合物」を指す場合、これはまた、「疾患への罹患が疑われるヒト又は動物の治療を目的とする薬剤の製造における化合物の使用」又は「疾患への罹患が疑われるヒト又は動物に化合物を投与することによる治療方法」の開示であるともみなされる。「治療、調節などを目的とする化合物、組成物、生成物など」という表現は、それ自体で、治療、調節などの明示される目的に好適な化合物、組成物、生成物などを指すと理解すべきである。
以後、用語、値、数などの例が括弧内に付与される場合、これは、括弧内に記載される例が、実施形態を構成し得ることを示すものとして理解すべきである。いくつかの事例において、「複数の実施形態では、核酸分子は、表１Ａのヌクレオチド配列をコードするＣＡＶ ＶＰ１に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む」と記載されている場合、一部の実施形態は、表１Ａに記載の核酸配列をコードするＶＰ１に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子に関する。
用語「増幅」は、本明細書で使用される場合、核酸分子若しくはその一部の１つ又は複数の追加のコピー（例えば、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント領域）を産生するための核酸分子若しくはその一部の複製を指す。一部の実施形態では、増幅は核酸配列の部分的複製をもたらす。一部の実施形態では、増幅はローリングサークル複製を介して起こる。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＶベクター」という用語は、タンパク質性外部に閉じ込められた遺伝子エレメント、例えば環状ＤＮＡを含むビヒクルを指し、例えば、遺伝子エレメントは、タンパク質性外部によりＤＮアーゼ Ｉによる消化から実質的に保護され、遺伝子エレメント及びタンパク質性外部の一方又は両方は、ＣＡＶ成分（例えば、本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶ配列の断片又はホモログ）を含む。「合成ＣＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、概して、天然に存在しない、例えば、野生型ウイルス（例えば、本明細書に記載の野生型ＣＡＶ）と異なる配列を有するＣＡＶベクターを指す。一部の実施形態では、合成ＣＡＶベクターは、操作されているか、又は組換え体であり、例えば、野生型ウイルスゲノム（例えば、本明細書に記載の野生型ＣＡＶゲノム）に対して相違又は修飾を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、タンパク質性外部内に閉じ込められたとは、タンパク質性外部による１００％の被覆、並びに１００％未満の被覆、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％以下の被覆を包含する。例えば、遺伝子エレメントが、例えば、宿主細胞内への進入前に、タンパク質性外部内に保持されているかＤＮＡｓｅ Ｉによる消化から保護されている限り、間隙又は不連続（例えば、タンパク質性外部を水、イオン、ペプチド、又は小分子に対して透過性にするもの）が、タンパク質性外部中に存在してもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは精製され、例えば、これは、元の供給源から分離される、且つ／又は他の構成体を実質的に含まない（＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％）。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメントを標的細胞に導入することができる（例えば、感染を介して）。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、感染性合成ＣＡＶウイルス粒子である。「ＣＡＶ成分」は、本明細書で使用される場合、一般に、ＣＡＶゲノムによってコードされるか、若しくはＣＡＶゲノムに含まれるポリペプチド若しくは核酸分子の活性をそれぞれ含む、及び／又はＣＡＶゲノム、例えば、野生型ＣＡＶゲノム（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７に列挙されるような）若しくはＣＡＶゲノムに含まれる核酸エレメントによってコードされるポリペプチド、若しくはその機能断片に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列をそれぞれ含む、ポリペプチド又は核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖若しくはその断片を指す。用語「抗体分子」は、完全長抗体及び抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）を包含する。一部の実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、抗体分子は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、この場合、上記複数の配列の第１免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１エピトープに対して結合特異性を有し、上記複数の配列の第２免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２エピトープに対して結合特異性を有する。実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体分子は、一般に、第１エピトープに対して結合特異性を有する第１免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２エピトープに対して結合特異性を有する第２免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「下流複製促進配列」（ｄＲＦＳ）は、遺伝子エレメント配列の下流に位置する場合（例えば、遺伝子エレメントがｄＲＦＳに対して５’である場合）、ｄＲＦＳの非存在下での他の類似の遺伝子エレメント配列と比較して、遺伝子エレメント配列の複製を増加させる、遺伝子エレメント配列の断片（例えば、本明細書に記載されるような）を指す。一般に、得られる複製鎖は、タンパク質性外部に閉じ込められてＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような）を形成することができる機能的遺伝子エレメントである。一部の実施形態では、ｄＲＦＳは、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＣＡＶ Ｒｅｐタンパク質）の置換部位を含む。一部の実施形態では、ｄＲＦＳは、ＣＡＶ ３’ＵＴＲ配列若しくはその断片、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列）を含む。一部の実施形態では、ｄＲＦＳは、５’ＵＴＲ（例えば、ヘアピンループを含む）を含む。一部の実施形態では、ｄＲＦＳは複製起点を含む。
本明細書で使用される場合、「上流複製促進配列」（ｕＲＦＳ）は、遺伝子エレメント配列の上流に位置する（例えば、遺伝子エレメントがｕＲＦＳに対して３’である）場合、ｕＲＦＳの非存在下での他の類似の遺伝子エレメント配列と比較して、遺伝子エレメント配列の複製を増加させる、遺伝子エレメントの配列の断片（例えば、本明細書に記載されるような）を指す。一般に、得られる複製鎖は、タンパク質性外部に閉じ込められてＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような）を形成することができる機能的遺伝子エレメントである。一部の実施形態では、ｕＲＦＳは、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＣＡＶ Ｒｅｐタンパク質）の結合部位及び／又は認識部位を含む。一部の実施形態では、ｕＲＦＳは、ＣＡＶ ５’ＵＴＲ配列若しくはその断片、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列）を含む。一部の実施形態では、ｕＲＦＳは、５’ＵＴＲ（例えば、ヘアピンループを含む）を含む。一部の実施形態では、ｕＲＦＳは複製起点を含む。
本明細書で使用される場合、「コード化する」核酸は、アミノ酸配列又は機能性ポリヌクレオチド（例えば、ノンコーディングＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ）をコード化する核酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、「外性」物質（例えば、エフェクター、核酸（例えば、ＲＮＡ）、遺伝子、ペイロード、タンパク質）は、対応する野生型ウイルス、例えば、例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶに含まれないか、又はそれによってコード化されない物質を指す。一部の実施形態では、外性物質は、天然に存在するタンパク質又は核酸に対して改変された（例えば、挿入、欠失、若しくは置換により）配列を有するタンパク質又は核酸のように、天然に存在しない。一部の実施形態では、外生物質は、宿主細胞中に天然に存在しない。一部の実施形態では、外性物質は、宿主細胞中に天然に存在するが、ウイルスに対しては外性である。一部の実施形態では、外性物質は、宿主細胞中に天然に存在するが、所望のレベルで、又は所望の時点に存在しない。一部の実施形態では、外因性因子は、標的細胞中に天然に存在しない。一部の実施形態では、外因性因子は、標的細胞中に天然に存在するが、ウイルスに対して外因性である。一部の実施形態では、外因性因子は、標的細胞中に天然に存在するが、所望のレベル又は所望の時間には存在しない。実施形態において、外因性因子の標的細胞への導入は、標的細胞中の因子の非天然レベル（例えば、細胞中の因子の内因性レベルよりも高いレベル）をもたらす。
「異種」物質又はエレメント（例えば、エフェクター、核酸配列、アミノ酸配列）は、別の物質又はエレメント（例えば、エフェクター、核酸配列、アミノ酸配列）に関して本明細書に使用される場合、例えば、野生型ウイルス、例えば、ＣＡＶに天然では一緒に存在しない物質又はエレメントを指す。一部の実施形態では、異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（例えば、ＣＡＶに天然に存在する配列）と同じ核酸中に存在し得る。一部の実施形態では、異種物質又はエレメントは、ＣＡＶベクターの他の（残りの）エレメントの基材であるＣＡＶに対して外性である。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子エレメント」は、例えば、本明細書に記載されるＣＡＶベクターを形成するために、タンパク質性外部内に閉じ込められているか、又は閉じ込めることができる（例えば、ＤＮＡｓｅ Ｉ消化から保護するために）核酸分子を指す。遺伝子エレメントをネイキッドＤＮＡとして産生し、任意選択で、さらにタンパク質性外部へとアセンブルすることが理解される。また、ＣＡＶベクターは、その遺伝子エレメントを細胞内に挿入することができ、それにより遺伝子エレメントは細胞内に存在するため、タンパク質性外部が必ずしも細胞に進入するわけではないことも理解される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、エフェクター（例えば、外因性エフェクター）をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは一本鎖である。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは環状である。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）の１つ以上の配列、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶからのパッケージングシグナルを含む。
本明細書で使用される場合、「遺伝子エレメント構築物」は、少なくとも１つ（例えば、２つ）の遺伝子エレメント配列、又はその断片を含む核酸構築物（例えば、プラスミド、バクミド、コスミド、又はミニサークル）を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載のタンデム構築物は、タンデムに配置された（例えば、本明細書に記載されるように）２つ以上の遺伝子エレメント配列又はその断片を含む遺伝子エレメント構築物である。一部の実施形態において、遺伝子エレメント構築物は、少なくとも１つの完全長遺伝子エレメント配列を含む。一部の実施形態において、遺伝子エレメントは、完全長遺伝子エレメント配列と、部分的遺伝子エレメント配列とを含む。一部の実施形態において、遺伝子エレメントは、２つ以上の部分的遺伝子エレメント配列（例えば、５’から３’への順番に、５’トランケート型遺伝子エレメント配列が３’トランケート型遺伝子エレメント配列とタンデムで並んだもの）を含む。
用語「遺伝子エレメント領域」は、本明細書で使用される場合、遺伝子エレメントの配列を含む構築物の領域を指す。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域は、タンパク質性外部によって閉じ込められ、それによってＣＡＶベクターを形成するのに十分な野生型ＣＡＶ配列又はその断片と同一性を有する配列（例えば、野生型ＣＡＶ配列又はその断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列）を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント領域は、例えば、本明細書に記載されるようなタンパク質結合配列（例えば、本明細書に記載される５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／若しくはＧＣリッチ領域、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域は、ローリングサークル複製を受けることができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域はｕＲＦＳを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域はｄＲＦＳを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントはＲｅｐタンパク質結合部位を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントはＲｅｐタンパク質置換部位を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域を含む構築物はタンパク質性外部に閉じ込められないが、構築物から産生される遺伝子エレメントはタンパク質性外部に閉じ込めることができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域を含む構築物は、第２のｕＲＦＳ又は第２のｄＲＦＳをさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント領域を含む構築物は、ベクター骨格をさらに含む。
ＶＰ１－、ＶＰ２－、若しくはアポプチン－コード遺伝子、又はその断片に関して本明細書で使用される場合、「非機能性」は、その野生型対応物と比較して、タンパク質を産生しないか、又は少なくとも１つの活性（例えば、全ての活性）を欠くタンパク質を産生する遺伝子又はその断片を指す。一部の実施形態では、非機能性遺伝子は、未熟終止コドンを含む。一部の実施形態では、非機能性遺伝子は、フレームシフト突然変異を含む。一部の実施形態では、非機能性遺伝子は、開始コドンを欠く。一部の実施形態では、活性は、結合活性又は酵素活性である。
本明細書で使用される場合、完全長タンパク質又はポリペプチドの「機能断片」は、完全長タンパク質又はポリペプチドの１つ以上の活性（例えば、全ての活性）を有し、完全長タンパク質又はポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００アミノ酸）を欠くポリペプチドを指す。一部の実施形態では、活性は、結合活性又は酵素活性である。本明細書で使用される場合、タンパク質に結合する完全長核酸配列の「機能断片」は、完全長核酸配列によって結合される少なくとも１つのタンパク質に結合する核酸配列を指す。一部の実施形態では、完全長核酸配列は、例えば、本明細書に記載されるような５’ＵＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「プロモーターエレメント」という用語は、プロモーターの機能性を有する配列を含む調節核酸配列を指す。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、本明細書に記載のプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターエレメントの下流の核酸配列からＲＮＡ分子を転写することができるように、ＲＮＡポリメラーゼ分子に結合し、且つ／又はそれを動員する。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、例えば本明細書に記載されるような、構成的プロモーター、細胞特異的プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、例えば、本明細書に記載されるような誘導性プロモーターを含む。
本明細書で使用される場合、「ＶＰ１分子」という用語は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ１タンパク質、又はその機能断片の活性及び／又は構造的特徴を有するポリペプチドを指す。ＶＰ１分子は、いくつかの例では、を含む第１の領域のうちの１つ以上（例えば、１、２、３又は４つ）を含み得る。いくつかの例において、ＶＰ１分子は、Ｎ末端からＣ末端の順に、第１、第２、第３、及び第４の領域を含む。ＶＰ１分子は、いくつかの例では、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチドを含み得る。ＶＰ１分子は、いくつかの例では、例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質由来の異種配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、ＣＡＶゲノム（例えば、本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム）によってコードされる。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１核酸（例えば、例えば本明細書に記載されるようなＶＰ１遺伝子）によってコードされるポリペプチドである。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、スプライス変異体であるか、又は翻訳後修飾を含む。
本明細書で使用される場合、「ＶＰ２分子」という用語は、ＣＡＶ ＶＰ２タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ２タンパク質、又はその機能断片の活性及び／又は構造的特徴を有するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ＶＰ２分子は、ＣＡＶゲノム（例えば、本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム）によってコードされる。一部の実施形態では、ＶＰ２分子は、ＣＡＶ ＶＰ２核酸（例えば、例えば本明細書に記載されるようなＶＰ２遺伝子）によってコードされるポリペプチドである。一部の実施形態では、ＶＰ２分子は、スプライス変異体であるか、又は翻訳後修飾を含む。
本明細書で使用される場合、「アポプチン分子」という用語は、ＣＡＶアポプチンタンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＡＶアポプチンタンパク質、又はその機能断片の活性及び／又は構造的特徴を有するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、アポプチン分子は、ＣＡＶゲノム（例えば、本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶゲノム）によってコードされる。一部の実施形態では、アポプチン分子は、ＣＡＶアポプチン核酸（例えば、アポプチン遺伝子）によってコードされるポリペプチドである。一部の実施形態では、アポプチン分子は、スプライス変異体であるか、又は翻訳後修飾を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＶカプシドポリペプチド」という用語は、野生型ＣＡＶのカプシド中に存在するポリペプチド、又は前記ポリペプチドの活性及び／若しくは構造的特徴を有するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ＣＡＶカプシドポリペプチドはＶＰ１分子である。
本明細書で使用される場合、「ＶＰ１核酸」という用語は、ＶＰ１分子又はその逆相補体をコードする核酸を指す。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一部の実施形態では、ＶＰ１核酸は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１遺伝子を含む。「ＶＰ１遺伝子」は一般に、野生型ＶＰ１分子又はその逆相補体をコードする核酸配列を指す。一部の実施形態では、ＶＰ１遺伝子はセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１遺伝子はアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１遺伝子は二本鎖である。
本明細書で使用される場合、「ＶＰ２核酸」という用語は、ＶＰ２分子又はその逆相補体をコードする核酸を指す。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一部の実施形態では、ＶＰ２核酸は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ２遺伝子を含む。「ＶＰ２遺伝子」は一般に、野生型ＶＰ２分子又はその逆相補体をコードする核酸配列を指す。一部の実施形態では、ＶＰ２遺伝子はセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＰ２遺伝子はアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ＶＰ２遺伝子は二本鎖である。
本明細書で使用される場合、「アポプチン核酸」という用語は、アポプチン分子又はその逆相補体をコードする核酸を指す。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一部の実施形態では、アポプチン核酸は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶアポプチン遺伝子を含む。「アポプチン遺伝子」は一般に、野生型アポプチン分子又はその逆相補体をコードする核酸配列を指す。一部の実施形態では、アポプチン遺伝子はセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アポプチン遺伝子はアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アポプチン遺伝子は二本鎖である。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＶゲノム配列」という用語は、例えば本明細書に記載されるような野生型ＣＡＶ由来の完全長ゲノム配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む核酸配列を指す。一部の実施形態では、ＣＡＶゲノムは、本明細書に記載されるＣＡＶゲノム配列（例えば、表１Ａ及び１Ｂ又は表１７のいずれかに列挙される野生型ＣＡＶゲノム配列）を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＶ ＵＴＲ」という用語は、ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７に列挙されるような、例えば、野生型ＣＡＶ）由来の非翻訳領域（ＵＴＲ）配列（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの配列）、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む核酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、「タンパク質性外部」という用語は、主に（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％）タンパク質である外部構成エレメントを指す。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、核酸分子、例えば、本明細書に記載されるような遺伝子エレメントを閉じ込める。一部の実施形態では、タンパク質性外部はカプシドを含む。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、ウイルス粒子のカプシド又はその一部を形成する。
本明細書で使用される場合、「タンパク質結合配列」という用語は、タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなタンパク質性外部の成分に結合する（例えば、特異的に結合する）ことができる核酸配列を指す。一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質性外部内へのタンパク質結合配列を含む遺伝子エレメントの閉じ込めを促進するのに十分な親和性でタンパク質性外部の成分に結合する。一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質性外部タンパク質に直接結合する。一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質性外部タンパク質に間接的に結合する（例えば、タンパク質結合配列は、タンパク質性外部タンパク質に関連するタンパク質、核酸分子、又は他の部分に結合する）。
本明細書で使用される場合、用語「調節核酸」は、発現産物をコード化するＤＮＡ配列の発現、例えば、転写及び／又は翻訳を修飾する核酸配列を指す。複数の実施形態では、発現産物は、ＲＮＡ又はタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、標的遺伝子産物の転写を修飾する核酸配列を指す。一部の実施形態では、調節配列は、プロモーター又はエンハンサーである。
本明細書で使用される場合、用語「Ｒｅｐ」又は「複製タンパク質」は、ウイルスゲノム複製を促進するたんぱく質、例えば、ウイルスタンパク質を指す。一部の実施形態では、複製タンパク質は、ＣＡＶＲｅｐタンパク質である。
本明細書で使用される場合、用語「Ｒｅｐ結合部位」は、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＣＡＶＲｅｐタンパク質）によって認識され、結合される核酸分子内の核酸配列を指す。一部の実施形態では、Ｒｅｐ結合部位は、５’ＵＴＲ（例えば、ヘアピンループを構成する）を含む。一部の実施形態では、Ｒｅｐ結合部位は、複製起点（ＯＲＩ）を含む。
本明細書で使用される場合、用語「Ｒｅｐ置換部位」は、Ｒｅｐ置換部位に達した際に、核酸分子を放出するために、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＣＡＶＲｅｐタンパク質）を核酸分子と関連させる（例えば、それに結合させる）ことができる核酸分子内の核酸配列を指す。一部の実施形態では、Ｒｅｐ置換部位は、５’ＵＴＲ（例えば、ヘアピンループを構成する）を含む。一部の実施形態では、Ｒｅｐ置換部位は、複製起点（ＯＲＩ）を含む。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、非特異的対照分子（例えば、タンパク質結合配列を欠く核酸）よりも強く第２の分子（例えば、タンパク質結合配列を含む核酸、例えば、パッケージングシグナル）に結合する第１の分子（例えば、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１タンパク質）を指す。一部の実施形態では、第１の分子は、非特異的対照分子への検出可能なレベルの結合を示す。一部の実施形態では、第２の分子に対する第１の分子のＫＤは、非特異的対照分子に対する第１の分子のＫＤよりも、５、１０、２０、５０、又は１００倍低い。
本明細書で使用される場合、「実質的に非病原性の」生物、粒子、又は構成体は、例えば、宿主生物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに許容され難い疾患又は病的状態を誘発若しくは誘導しない生物、粒子（例えば、本明細書に記載の例えばウイルス若しくはＣＡＶベクター）、又はそれらの構成体を指す。一部の実施形態では、被験者に対するＣＡＶベクターの投与によって、標準治療の一部として許容可能な若干の反応又は副作用が起こり得る。
本明細書で使用される場合、「非病原性」は、例えば、宿主生物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに許容され難い疾患又は病的状態を誘発若しくは誘導しない生物又はその構成体を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に非統合性の」遺伝子エレメントは、宿主細胞（例えば、真核細胞）又は生物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に進入する遺伝子エレメントの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、若しくは１％未満が、ゲノムに組み込まれる遺伝子エレメント、例えば、ウイルス又はＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるもの）内の遺伝子エレメントを指す。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、宿主細胞のゲノムに検出可能な程度で組み込まれない。一部の実施形態では、ゲノム内への遺伝子エレメントの組み込みは、本明細書に記載の技術、例えば、核酸シークエンシング、ＰＣＲ検出及び／又は核酸ハイブリダイゼーションを用いて検出することができる。一部の実施形態では、組み込み頻度は、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：７１１－７２１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、遊離ベクターから分離されたゲノムＤＮＡの定量的ゲル精製アッセイによって決定される。
本明細書で使用される「部分配列」は、より大きな核酸配列又はアミノ酸配列にそれぞれ含まれている核酸配列又はアミノ酸配列を指す。一部の事例において、部分配列は、より大きな配列のドメイン又は機能性断片を含み得る。一部の事例において、部分配列は、より大きな配列から単離されたとき、より大きな配列の残りと一緒に存在する場合に部分配列によって形成される二次及び／又は三次構造と類似する、二次及び／又は三次構造を形成することができるより大きな配列の断片を含み得る。一部の事例では、部分配列は、別の配列（例えば、より大きな配列の残りに対して外性の配列又は異種の配列を含む部分配列、例えば、異なるＣＡＶ由来の対応する部分配列）で置換することができる。
本発明は、概して、ＣＡＶベクター、例えば合成ＣＡＶベクターに、及びその使用に関する。本開示は、ＣＡＶベクター、ＣＡＶベクターを含む組成物、及びＣＡＶベクターを作製する方法又は使用する方法を提供する。ＣＡＶベクターは、一般に、例えば、治療薬を真核細胞に送達するための送達ビヒクルとして有用である。一般に、ＣＡＶベクターは、タンパク質性外部に閉じ込められた、核酸配列（例えば、エフェクター、例えば、外因性エフェクター若しくは内在性エフェクターをコード化する）を含む遺伝子エレメントを含有し得る。ＣＡＶベクターは、ＣＡＶ配列（例えば、本明細書に記載の通り）と比較して、配列（例えば、本明細書に記載される領域又はドメイン）の１つ又は複数の欠失を含んでもよい。ＣＡＶベクターは、例えば、細胞を含む被験者の疾患又は障害を治療する目的で、遺伝子エレメント、又はそこでコード化されるエフェクター（例えば、本明細書に記載される、例えばポリペプチド若しくは核酸エフェクター）を真核細胞に送達するためのビヒクルとして使用することができる。
目次
Ｉ．ＣＡＶベクターを作製するための組成物及び方法
Ａ．ＣＡＶベクターのコンポーネントと集合
ｉ．ＣＡＶベクターの集合のためのＶＰ１分子
ｉｉ．ＣＡＶベクターの集合のためのＶＰ２分子
Ｂ．遺伝子エレメント構築物
ｉ．プラスミド
ｉｉ．環状遺伝子エレメント構築物
ｉｉｉ．インビトロ環状化
ｉｖ．シス／トランス構築物
ｖ．発現カセット
ｖｉ．遺伝子エレメント構築物の設計及び産生
Ｃ．エフェクター
Ｄ．宿主細胞
ｉ．宿主細胞への遺伝子エレメントの導入
ｉｉ．シス又はトランスにおいてＣＡＶタンパク質を提供するための方法
ｉｉｉ．ヘルパー
ｉｖ．例示的な細胞型
Ｅ．培養条件
Ｆ．回収及び精製
ＩＩ．ＣＡＶベクター
Ａ．ＣＡＶ
Ｂ．ＶＰ１分子
Ｃ．ＶＰ２分子
Ｄ．遺伝子エレメント
Ｅ．タンパク質結合配列
Ｆ．５’ＵＴＲ領域
Ｇ．ＧＣリッチ領域
Ｈ．エフェクター
Ｉ．調節配列
Ｊ．複製タンパク質
Ｋ．その他の配列
Ｌ．タンパク質性外部
ＩＩＩ．遺伝子エレメント構築物
ＩＶ．組成物
Ｖ．宿主細胞
ＶＩ．使用方法
ＶＩＩ．投与／送達
Ｉ．ＣＡＶベクターを作製するための組成物及び方法
Ａ．ＣＡＶベクターのコンポーネントと集合
ｉ．ＣＡＶベクターの集合のためのＶＰ１分子
ｉｉ．ＣＡＶベクターの集合のためのＶＰ２分子
Ｂ．遺伝子エレメント構築物
ｉ．プラスミド
ｉｉ．環状遺伝子エレメント構築物
ｉｉｉ．インビトロ環状化
ｉｖ．シス／トランス構築物
ｖ．発現カセット
ｖｉ．遺伝子エレメント構築物の設計及び産生
Ｃ．エフェクター
Ｄ．宿主細胞
ｉ．宿主細胞への遺伝子エレメントの導入
ｉｉ．シス又はトランスにおいてＣＡＶタンパク質を提供するための方法
ｉｉｉ．ヘルパー
ｉｖ．例示的な細胞型
Ｅ．培養条件
Ｆ．回収及び精製
ＩＩ．ＣＡＶベクター
Ａ．ＣＡＶ
Ｂ．ＶＰ１分子
Ｃ．ＶＰ２分子
Ｄ．遺伝子エレメント
Ｅ．タンパク質結合配列
Ｆ．５’ＵＴＲ領域
Ｇ．ＧＣリッチ領域
Ｈ．エフェクター
Ｉ．調節配列
Ｊ．複製タンパク質
Ｋ．その他の配列
Ｌ．タンパク質性外部
ＩＩＩ．遺伝子エレメント構築物
ＩＶ．組成物
Ｖ．宿主細胞
ＶＩ．使用方法
ＶＩＩ．投与／送達
Ｉ．ＣＡＶベクターを作製するための組成物及び方法
本開示は、いくつかの態様において、例えば本明細書に記載されるような、ＣＡＶベクターを産生するために使用され得る遺伝子エレメント構築物を提供する。
本開示は、いくつかの態様において、例えば本明細書に記載されるような、ＣＡＶベクターを産生するために使用され得る遺伝子エレメント構築物を提供する。
ＣＡＶベクターの構成体及びアセンブリ
本明細書の組成物及び方法は、ＣＡＶベクターを産生するために使用することができる。本明細書に記載されるように、ＣＡＶベクターは、一般に、タンパク質性外部内（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化されるポリペプチドを含む）に閉じ込められた遺伝子エレメント（例えば、本明細書に記載される５’ＵＴＲ領域を含む、例えば、一本鎖、環状ＤＮＡ分子）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶ ＯＲＦ（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチンのうちの１つ又は複数）をコード化する１つ又は複数の配列を含む。本明細書で使用される場合、ＣＡＶ ＯＲＦ又はＯＲＦ分子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）は、本明細書に記載されるように、対応するＣＡＶ ＯＲＦ配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶＶ Ｐ１をコード化する配列、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ゼリーロール領域）を含む。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、ＣＡＶ ＶＰ１核酸（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片）によってコード化されるポリペプチドを含む。
本明細書の組成物及び方法は、ＣＡＶベクターを産生するために使用することができる。本明細書に記載されるように、ＣＡＶベクターは、一般に、タンパク質性外部内（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化されるポリペプチドを含む）に閉じ込められた遺伝子エレメント（例えば、本明細書に記載される５’ＵＴＲ領域を含む、例えば、一本鎖、環状ＤＮＡ分子）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶ ＯＲＦ（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチンのうちの１つ又は複数）をコード化する１つ又は複数の配列を含む。本明細書で使用される場合、ＣＡＶ ＯＲＦ又はＯＲＦ分子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）は、本明細書に記載されるように、対応するＣＡＶ ＯＲＦ配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶＶ Ｐ１をコード化する配列、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ゼリーロール領域）を含む。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、ＣＡＶ ＶＰ１核酸（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片）によってコード化されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えば、本明細書に記載されるような）をタンパク質性外部（例えば、本明細書に記載されるような）内に閉じ込めることによってアセンブルされる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主細胞（例えば、本明細書に記載されるような）中のタンパク質性外部内に閉じ込められる。一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質性外部に含まれる１つ又は複数のポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化されるポリペプチド、例えば、ＶＰ１分子）を発現する。例えば、一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコード化する核酸配列、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、野生型ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化される野生型ＣＡＶＶＰ１タンパク質若しくはポリペプチド）のスプライス変異体若しくは機能性断片を含む。複数の実施形態では、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコード化する核酸配列は、宿主細胞中に含まれる遺伝子エレメント構築物（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス、ミニサークル、バクミド、又は人工染色体）中に含まれる。複数の実施形態では、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコード化する核酸配列は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、遺伝子エレメント及び／又は遺伝子エレメントの配列を含む遺伝子エレメント構築物を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、プラスミド、ウイルス核酸、ミニサークル、バクミド、又は人工染色体から選択される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント構築物から切り取られ、任意選択で、二本鎖型から一本鎖型に変換される（例えば、変性によって）。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント構築物中の鋳型配列に基づいてポリメラーゼによって生成される。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、遺伝子エレメント配列の一本鎖コピーを作り出し、これは任意選択で環状化され、本明細書に記載される遺伝子エレメントを形成することができる。他の実施形態において、遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメントの核酸配列をインビトロで環状化することによって作製される二本鎖ミニサークルである。実施形態において、インビトロ環状化（ＩＶＣ）ミニサークルは宿主細胞に導入され、そこで本明細書に記載されるとおりのタンパク質性外部への封入に好適な一本鎖遺伝子エレメントに変換される。
例えば、ＣＡＶベクターのアセンブリのためのＶＰ１分子
ＣＡＶベクターは、例えば、遺伝子エレメントをタンパク質性外部内に閉じ込めることによって作製することができる。ＣＡＶベクターのタンパク質性外部は、一般に、ＣＡＶ ＶＰ１核酸（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片）によってコード化されるポリペプチドを含む。複数の実施形態では、タンパク質性外部は、ＣＡＶ ＶＰ１アルギニンリッチ領域、及び／又はゼリーロール領域のうちの１つ又は両方を含む。一部の実施形態では、タンパク性外層は、ＣＡＶ ＶＰ１ゼリーロール領域（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。一部の実施形態では、タンパク性外層は、ＣＡＶ ＶＰ１アルギニンリッチ領域（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。
ＣＡＶベクターは、例えば、遺伝子エレメントをタンパク質性外部内に閉じ込めることによって作製することができる。ＣＡＶベクターのタンパク質性外部は、一般に、ＣＡＶ ＶＰ１核酸（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片）によってコード化されるポリペプチドを含む。複数の実施形態では、タンパク質性外部は、ＣＡＶ ＶＰ１アルギニンリッチ領域、及び／又はゼリーロール領域のうちの１つ又は両方を含む。一部の実施形態では、タンパク性外層は、ＣＡＶ ＶＰ１ゼリーロール領域（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。一部の実施形態では、タンパク性外層は、ＣＡＶ ＶＰ１アルギニンリッチ領域（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＶＰ１分子及び／又はＶＰ１分子をコード化する核酸を含む。一般に、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ１タンパク質）の構造特徴及び／若しくは活性を有するポリペプチド、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ１タンパク質）と比べて短縮を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、若しくは７００のアミノ酸だけ短縮されている。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１タンパク質に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＶＰ１分子は一般に、例えば、その中のタンパク質結合配列において、ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子エレメント）などの核酸分子に結合することができる。
理論に拘束されることを望むものではないが、ＶＰ１分子は、例えば、タンパク質性外部（例えば、本明細書に記載されるような）を形成するために、他のＶＰ１分子に結合することが可能であり得る。そのようなＶＰ１分子は、キャプシドを形成するための能力を有するものとして記載され得る。一部の実施形態において、タンパク質性外部は、核酸分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント、例えば、本明細書に記載されるとおりのタンデム構築物を使用して作製されるもの）を封入し得る。一部の実施形態において、複数のＶＰ１分子が多量体を形成してもよく、例えば、それによってタンパク質性外部を作製し得る。一部の実施形態において、多量体はホモ多量体であってもよい。他の実施形態において、多量体はヘテロ多量体であってもよい。
例えば、ＣＡＶベクターの集合のための他のＣＡＶポリペプチド
一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物又は方法を使用してＣＡＶベクターを産生することは、ＣＡＶ ＶＰ２分子（例えば、本明細書に記載されるような）、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片の発現を伴い得る。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片、及び／若しくは ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する核酸を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片、及び／若しくはＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する核酸を含まない。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターを産生することは、ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片の発現を含むが、ＶＰ２分子はＣＡＶベクター中には組み込まれない。
一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物又は方法を使用してＣＡＶベクターを産生することは、ＣＡＶ ＶＰ２分子（例えば、本明細書に記載されるような）、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片の発現を伴い得る。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片、及び／若しくは ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する核酸を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片、及び／若しくはＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する核酸を含まない。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターを産生することは、ＶＰ２分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片の発現を含むが、ＶＰ２分子はＣＡＶベクター中には組み込まれない。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物又は方法を使用してＣＡＶを産生することは、ＣＡＶアポプチン分子（例えば、本明細書に記載されるような）、又はそのスプライス変異体若しくは機能断片の発現を含み得る。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、アポプチン分子、若しくはそのスプライス変異体若しくは機能断片、及び／又はアポプチン分子、若しくはそのスプライス変異体若しくは機能断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、アポプチン分子、若しくはそのスプライス変異体若しくは機能断片、及び／又はアポプチン分子、若しくはそのスプライス変異体若しくは機能断片をコードする核酸を含まない。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターを産生することは、アポプチン分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能断片の発現を含むが、アポプチン分子はＣＡＶベクターに組み込まれない。
例えば、ＣＡＶベクターのアセンブリのための遺伝子エレメント構築物
本明細書に記載されるＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント領域及び任意選択でベクター骨格などの他の配列を含む遺伝子エレメント構築物から産生されてもよい。一般に、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ５’ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメントがタンパク質性外部内に閉じ込められ得る宿主細胞への遺伝子エレメントの配列の送達に好適な任意の遺伝子エレメント構築物であり得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、線状核酸分子である。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、環状核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような、例えば本明細書に記載されるような、プラスミド、バクミド、又はミニサークル）である。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、バキュロウイルス配列を含む（例えば、遺伝子エレメント構築物を含む昆虫細胞が遺伝子エレメント構築物の遺伝子エレメント配列又はその断片を含むバキュロウイルスを産生することができるように）。遺伝子エレメント構築物は、一部の実施形態では、二本鎖であり得る。他の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖である。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント領域及び任意選択でベクター骨格などの他の配列を含む遺伝子エレメント構築物から産生されてもよい。一般に、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ５’ＵＴＲ（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメントがタンパク質性外部内に閉じ込められ得る宿主細胞への遺伝子エレメントの配列の送達に好適な任意の遺伝子エレメント構築物であり得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、線状核酸分子である。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、環状核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような、例えば本明細書に記載されるような、プラスミド、バクミド、又はミニサークル）である。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、バキュロウイルス配列を含む（例えば、遺伝子エレメント構築物を含む昆虫細胞が遺伝子エレメント構築物の遺伝子エレメント配列又はその断片を含むバキュロウイルスを産生することができるように）。遺伝子エレメント構築物は、一部の実施形態では、二本鎖であり得る。他の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖である。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメント配列の１コピーを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント配列の複数のコピー（例えば、遺伝子エレメント配列の２つのコピー）を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、遺伝子エレメント配列の１つの完全長コピー及び少なくとも１つの部分的遺伝子エレメント配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列の２つのコピー（例えば、完全長及び／又は部分的遺伝子エレメント配列）は、遺伝子エレメント構築物内にタンデムに配置される（例えば、本明細書に記載のように）。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＶベクターの複製及び増殖（例えば、細胞培養系中での）のための方法を提供し、これは以下のステップ：（ａ）遺伝子エレメント（例えば、線状化）をＣＡＶベクター感染に感受性の細胞株中に導入する（例えば、トランスフェクトする）ステップと、（ｂ）細胞を採取し、任意選択で遺伝子エレメントの存在を示す細胞を単離するステップと、（ｃ）実験条件及び遺伝子発現に応じて、ステップ（ｂ）で得られた細胞を培養する（例えば、少なくとも３日間、例えば、少なくとも１週間以上）ステップと、（ｄ）例えば、本明細書に記載されるように、ステップ（ｃ）の細胞を採取するステップと、のうちの１つ又は複数を含み得る。
プラスミド
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、プラスミドである。プラスミドは、一般に、本明細書に記載される遺伝子エレメントの配列並びに宿主細胞における複製に好適な複製起点（例えば、細菌細胞における複製のための細菌複製起点）及び選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むであろう。一部の実施形態では、遺伝子エレメントの配列は、プラスミドから切り取ることができる。一部の実施形態では、プラスミドは、細菌細胞中の複製が可能である。一部の実施形態では、プラスミドは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における複製が可能である。一部の実施形態では、プラスミドは、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、若しくは５０００ｂｐの長さである。一部の実施形態では、プラスミドは、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、若しくは１０，０００ｂｐ未満の長さである。一部の実施形態では、プラスミドは、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～４０００、若しくは４０００～５０００ｂｐの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ミニサークルを形成するためにプラスミドから切り取ることができる（例えば、インビトロ環状化によって）。複数の実施形態では、遺伝子エレメントの切り取りは、遺伝子エレメント配列をプラスミド骨格から分離する（例えば、遺伝子エレメントを細菌骨格から分離する）。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、プラスミドである。プラスミドは、一般に、本明細書に記載される遺伝子エレメントの配列並びに宿主細胞における複製に好適な複製起点（例えば、細菌細胞における複製のための細菌複製起点）及び選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むであろう。一部の実施形態では、遺伝子エレメントの配列は、プラスミドから切り取ることができる。一部の実施形態では、プラスミドは、細菌細胞中の複製が可能である。一部の実施形態では、プラスミドは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における複製が可能である。一部の実施形態では、プラスミドは、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、若しくは５０００ｂｐの長さである。一部の実施形態では、プラスミドは、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、若しくは１０，０００ｂｐ未満の長さである。一部の実施形態では、プラスミドは、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～４０００、若しくは４０００～５０００ｂｐの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ミニサークルを形成するためにプラスミドから切り取ることができる（例えば、インビトロ環状化によって）。複数の実施形態では、遺伝子エレメントの切り取りは、遺伝子エレメント配列をプラスミド骨格から分離する（例えば、遺伝子エレメントを細菌骨格から分離する）。
環状遺伝子エレメント構築物
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、例えば、骨格を欠いている（例えば、細菌複製起点及び／又は選択可能マーカーを欠いている）環状遺伝子エレメント構築物である。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、二本鎖環状遺伝子エレメント構築物である。複数の実施形態では、二本鎖環状遺伝子エレメント構築物は、例えば、本明細書に記載されるようなインビトロ環状化（ＩＶＣ）によって産生される。複数の実施形態では、二本鎖環状遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入されることができ、その中で、それは、例えば、本明細書に記載されるような一本鎖環状遺伝子エレメントに変換され得るか、又はそれを生成するための鋳型として使用され得る。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、プラスミド骨格又はその機能性断片を含まない。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、少なくとも２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、若しくは４５００ｂｐの長さである。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５５００、若しくは６０００ｂｐ未満の長さである。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、２３００～２４００、２４００～２５００、２５００～２６００、２６００～２７００、２７００～２８００、２８００～２９００、２９００～３０００、３０００～３１００、３１００～３２００、３２００～３３００、３３００～３４００、３４００～３５００、３５００～３６００、３６００～３７００、３７００～３８００、３８００～３９００、３９００～４０００、４０００～４１００、４１００～４２００、４２００～４３００、４３００～４４００，若しくは４４００～４５００ｂｐの長さである。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、ミニサークルである。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、例えば、骨格を欠いている（例えば、細菌複製起点及び／又は選択可能マーカーを欠いている）環状遺伝子エレメント構築物である。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、二本鎖環状遺伝子エレメント構築物である。複数の実施形態では、二本鎖環状遺伝子エレメント構築物は、例えば、本明細書に記載されるようなインビトロ環状化（ＩＶＣ）によって産生される。複数の実施形態では、二本鎖環状遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入されることができ、その中で、それは、例えば、本明細書に記載されるような一本鎖環状遺伝子エレメントに変換され得るか、又はそれを生成するための鋳型として使用され得る。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、プラスミド骨格又はその機能性断片を含まない。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、少なくとも２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、若しくは４５００ｂｐの長さである。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５５００、若しくは６０００ｂｐ未満の長さである。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、２３００～２４００、２４００～２５００、２５００～２６００、２６００～２７００、２７００～２８００、２８００～２９００、２９００～３０００、３０００～３１００、３１００～３２００、３２００～３３００、３３００～３４００、３４００～３５００、３５００～３６００、３６００～３７００、３７００～３８００、３８００～３９００、３９００～４０００、４０００～４１００、４１００～４２００、４２００～４３００、４３００～４４００，若しくは４４００～４５００ｂｐの長さである。一部の実施形態では、環状遺伝子エレメント構築物は、ミニサークルである。
インビトロ環状化
場合によっては、タンパク質性外部にパッケージ化される遺伝子エレメントは、一本鎖環状ＤＮＡである。遺伝子エレメントは、場合によっては、一本鎖環状ＤＮＡ以外の形態を有する遺伝子エレメント構築物を介して宿主細胞中に導入されてもよい。例えば、遺伝子エレメント構築物は、二本鎖環状ＤＮＡであってもよい。二本鎖環状ＤＮＡは、次いで、宿主細胞（例えば、ローリングサークル複製に好適な酵素、例えば、ＣＡＶＲｅｐタンパク質を含む宿主細胞）中で一本鎖環状ＤＮＡに変換され得る。一部の実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように、インビトロ環状化（ＩＶＣ）によって産生される。
場合によっては、タンパク質性外部にパッケージ化される遺伝子エレメントは、一本鎖環状ＤＮＡである。遺伝子エレメントは、場合によっては、一本鎖環状ＤＮＡ以外の形態を有する遺伝子エレメント構築物を介して宿主細胞中に導入されてもよい。例えば、遺伝子エレメント構築物は、二本鎖環状ＤＮＡであってもよい。二本鎖環状ＤＮＡは、次いで、宿主細胞（例えば、ローリングサークル複製に好適な酵素、例えば、ＣＡＶＲｅｐタンパク質を含む宿主細胞）中で一本鎖環状ＤＮＡに変換され得る。一部の実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように、インビトロ環状化（ＩＶＣ）によって産生される。
概して、インビトロ環状化ＤＮＡ構築物は、パッケージングしようとする遺伝子エレメントの配列を含むプラスミドを消化することにより、遺伝子エレメント配列を線状ＤＮＡ分子として切り出すことによって作製し得る。次いで、得られた線状ＤＮＡは、例えば、ＤＮＡリガーゼを使用して連結され、二本鎖環状ＤＮＡを形成することができる。場合によっては、インビトロ環状化によって産生された二本鎖環状ＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるようなローリングサークル複製を受けることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、インビトロ環状化は、更なる修飾なしにローリングサークル複製を受けることができる二本鎖ＤＮＡ構築物をもたらし、それによって、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶベクターにパッケージ化されるのに好適なサイズの一本鎖環状ＤＮＡを産生することが可能になると考えられる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物は、プラスミド（例えば、細菌プラスミド）よりも小さい。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物は、プラスミド（例えば、細菌プラスミド）から切り取られ、次いで、例えば、インビトロ環状化によって環状化される。
シス／トランス構築物
一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物は、１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦ、例えば、タンパク質性外部成分（例えば、本明細書に記載されるとおりの、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチド）をコードする１つ以上の配列を含む。例えば、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸配列を含み得る。かかる遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメント及び１つ又は複数のＣＡＶ ＯＲＦを宿主細胞にシスで導入するのに好適であり得る。他の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物は、１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦ、例えば、タンパク質性外部成分（例えば、本明細書に記載されるとおりの、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチド）をコードする配列を含まない。例えば、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸配列を含まなくてもよい。かかる遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメントを宿主細胞に導入するのに好適であってよく、ここで１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦはトランスで（例えば、ＣＡＶ ＯＲＦのうちの１つ以上をコードする第２の遺伝子エレメント構築物の導入によるか、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるＣＡＶ ＯＲＦカセットによって）提供されることになる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物は、１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦ、例えば、タンパク質性外部成分（例えば、本明細書に記載されるとおりの、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチド）をコードする１つ以上の配列を含む。例えば、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸配列を含み得る。かかる遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメント及び１つ又は複数のＣＡＶ ＯＲＦを宿主細胞にシスで導入するのに好適であり得る。他の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物は、１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦ、例えば、タンパク質性外部成分（例えば、本明細書に記載されるとおりの、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチド）をコードする配列を含まない。例えば、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコードする核酸配列を含まなくてもよい。かかる遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメントを宿主細胞に導入するのに好適であってよく、ここで１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦはトランスで（例えば、ＣＡＶ ＯＲＦのうちの１つ以上をコードする第２の遺伝子エレメント構築物の導入によるか、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるＣＡＶ ＯＲＦカセットによって）提供されることになる。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する配列（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ゼリーロール領域）を含む。実施形態では、遺伝子エレメントの配列を含まない遺伝子エレメントの一部は、ＣＡＶ ＶＰ１分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する配列を含む（例えば、プロモーター及びＣＡＶ ＶＰ１分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片をコード化する配列を含むカセットで）。さらなる実施形態では、遺伝子エレメントの配列を含む構築物の部分は、ＣＡＶ ＶＰ１分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能断片（例えば本明細書に記載されるような、例えばゼリーロール領域）をコードする配列を含む。実施形態では、タンパク質性外部内へのそのような遺伝子エレメントの閉じ込め（例えば、本明細書に記載されるような）は、複製コンピテントＣＡＶベクター（例えば、細胞に感染すると、さらなる遺伝子エレメント構築物、例えば、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦをコードするものを細胞に導入することなく、細胞がＣＡＶベクターの追加のコピーを産生することを可能にするＣＡＶベクター）を産生する。
他の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶ ＶＰ１分子、又はそのスプライス変異体若しくは機能断片（例えば本明細書に記載されるような、例えばゼリーロール領域）をコードする配列を含まない。実施形態では、タンパク質性外部内へのそのような遺伝子エレメントの閉じ込め（例えば、本明細書に記載されるような）は、複製不能ＣＡＶベクター（例えば、細胞に感染すると、例えば、本明細書に記載されるような１つ以上のＣＡＶ ＯＲＦをコードする１つ以上の追加の構築物の非存在下で、感染細胞が追加のＣＡＶベクターを産生することを可能にしないＣＡＶベクター）を産生する。
発現カセット
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ポリペプチド又はノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ）の発現のための１つ又は複数のカセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、エフェクター（例えば、外性若しくは内在性エフェクター）、例えば、本明細書に記載されるポリペプチド又はノンコーディングＲＮＡの発現のためのカセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶタンパク質（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン、又はその機能性断片）の発現のためのカセットを含む。発現カセットは、一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列内に位置し得る。複数の実施形態では、エフェクターのための発現カセットは、遺伝子エレメント配列内に位置する。複数の実施形態では、ＣＡＶタンパク質のための発現カセットは、遺伝子エレメント配列内に位置する。他の実施形態では、発現カセットは、遺伝子エレメントの配列の外側の遺伝子エレメント構築物内の位置に（例えば、骨格中に）配置されている。実施形態では、ＣＡＶタンパク質のための発現カセットは、遺伝子エレメントの配列の外側の遺伝子エレメント構築物内の位置に（例えば、骨格中に）配置されている。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ポリペプチド又はノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ）の発現のための１つ又は複数のカセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、エフェクター（例えば、外性若しくは内在性エフェクター）、例えば、本明細書に記載されるポリペプチド又はノンコーディングＲＮＡの発現のためのカセットを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶタンパク質（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン、又はその機能性断片）の発現のためのカセットを含む。発現カセットは、一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列内に位置し得る。複数の実施形態では、エフェクターのための発現カセットは、遺伝子エレメント配列内に位置する。複数の実施形態では、ＣＡＶタンパク質のための発現カセットは、遺伝子エレメント配列内に位置する。他の実施形態では、発現カセットは、遺伝子エレメントの配列の外側の遺伝子エレメント構築物内の位置に（例えば、骨格中に）配置されている。実施形態では、ＣＡＶタンパク質のための発現カセットは、遺伝子エレメントの配列の外側の遺伝子エレメント構築物内の位置に（例えば、骨格中に）配置されている。
ポリペプチド発現カセットは、一般に、プロモーターとポリペプチド、例えば、エフェクター（例えば、本明細書に記載される外性若しくは内在性エフェクター）又はＣＡＶタンパク質をコード化するコード配列（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン、又はその機能性断片をコード化する配列）と、を含む。ポリペプチド発現カセット中に含まれ得る（例えば、ポリペプチドの発現を駆動するために）例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＰＧＫ、ＥＦ１ａ、又はＳＶ４０）、細胞若しくは組織特異的プロモーター（例えば、骨格筋α－アクチンプロモーター、ミオシン軽鎖２Ａプロモーター、ジストロフィンプロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター、肝臓アルブミンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、オステオカルシンプロモーター、骨シアロタンパク質プロモーター、ＣＤ２プロモーター、免疫グロブリン重鎖プロモーター、Ｔ細胞受容体ａ鎖プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、又はニューロフィラメント軽鎖プロモーター）、並びに誘導性プロモーター（例えば、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、テトラサイクリン抑制性系、テトラサイクリン誘導性系、ＲＵ４８６誘導性系、ラパマイシン誘導性系）、例えば、本明細書に記載されるものなどが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、発現カセットは、例えば、本明細書に記載されるようなエンハンサーをさらに含む。
遺伝子エレメント構築物の設計及び産生
遺伝子エレメント構築物を合成するための様々な方法が利用可能である。例えば、遺伝子エレメント構築物の配列は、合成するのが容易であるより小さな重複片（例えば、約１００ｂｐ～約１０ｋｂの範囲のセグメント又は個々のＯＲＦ）に分割され得る。これらのＤＮＡセグメントは、重複一本鎖オリゴヌクレオチドのセットから合成される。得られた重複シントン（ｓｙｎｔｈｏｎｓ）は、次いで、ＤＮＡのより大きな片、例えば、遺伝子エレメント構築物にアセンブルされる。セグメント又はＯＲＦは、例えば、インビトロ組換え又はライゲーションを可能にするための５’及び３’末端でのユニークな制限部位によって遺伝子エレメント構築物にアセンブルされ得る。
遺伝子エレメント構築物を合成するための様々な方法が利用可能である。例えば、遺伝子エレメント構築物の配列は、合成するのが容易であるより小さな重複片（例えば、約１００ｂｐ～約１０ｋｂの範囲のセグメント又は個々のＯＲＦ）に分割され得る。これらのＤＮＡセグメントは、重複一本鎖オリゴヌクレオチドのセットから合成される。得られた重複シントン（ｓｙｎｔｈｏｎｓ）は、次いで、ＤＮＡのより大きな片、例えば、遺伝子エレメント構築物にアセンブルされる。セグメント又はＯＲＦは、例えば、インビトロ組換え又はライゲーションを可能にするための５’及び３’末端でのユニークな制限部位によって遺伝子エレメント構築物にアセンブルされ得る。
遺伝子エレメント構築物は、構築物配列をオリゴ長断片にパースし、配列空間の複雑さを考慮に入れる合成のための好適な設計条件を作り出す設計アルゴリズムを用いて合成することができる。次いで、オリゴは、半導体ベースの高密度チップ上で化学合成され、ここでは、チップ当たり２００，０００を超える個々のオリゴが合成される。オリゴは、ＢｉｏＦａｂ（登録商標）などのアセンブリ技法を用いてアセンブルされ、より小さなオリゴからより長いＤＮＡセグメントを構築する。これは、並行して行われるため、数百から数千の合成ＤＮＡセグメントが一度に構築される。
各遺伝子エレメント構築物又は遺伝子エレメント構築物のセグメントは、配列確認され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ又はＤＮＡのハイスループットシーケンシングは、生物学的工程（例えば、ｍｉＲＮＡ発現又は対立遺伝子変動性（ＳＮＰ検出））の監視を可能にする、ＡｎｙＤｏｔ．チップ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行うことができる。他のハイスループットシーケンシングシステムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ Ｆｅｂ．２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ Ｍａｒ．２０００；及びＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：６８２－６８６，Ｊａｎｕａｒｙ ２００３；並びに米国特許出願公開第２００３００４４７８１号明細書、及び同第２００６／００７８９３７号明細書に開示されるものが挙げられる。全体としてそのようなシステムは、核酸の分子に対して測定される重合配列を介しての塩基の一時的付加によって、複数の塩基を有する標的核酸分子を配列決定することを伴い、すなわち、核酸重合酵素の配列決定される鋳型核酸分子に対する活性は、リアルタイムで監視される。一部の実施形態では、ショットガンシーケンシングが実施される。
遺伝子エレメント構築物は、複製又はパッケージングのための因子が遺伝子エレメントに対してシス若しくはトランスで供給され得るように設計することができる。例えば、シスで供給される場合、遺伝子エレメントは、例えば本明細書に記載されるような、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチンをコード化する１つ又は複数の遺伝子を含み得る。一部の実施形態では、複製及び／又はパッケージングシグナルは、例えば、増幅及び／又は包膜（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）を誘導するために、遺伝子エレメント中に組み込まれ得る。一部の実施形態では、エフェクターは、ゲノム内の特定の部位に挿入される。一部の実施形態では、１つ又は複数のウイルスＯＲＦは、エフェクターで置き換えられる。
別の例では、複製又はパッケージング因子がトランスで供給される場合、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチンのうちの１つ又は複数をコード化する遺伝子を欠く可能性があり、このタンパク質は、例えば、別の核酸によって供給されてもよい。一部の実施形態では、最小限のシスシグナル（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／又はＧＣリッチ領域）が遺伝子エレメント内に存在する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、複製又はパッケージング因子（例えば、レプリカーゼ及び／又はキャプシドタンパク質）をコード化しない。そのような因子は、一部の実施形態では、１つ又は複数の核酸（例えば、ウイルス核酸、プラスミド、又は宿主細胞ゲノム中に組み込まれた核酸）によって供給され得る。一部の実施形態では、第２の核酸は、増幅及び／又はパッケージングを誘導するのに十分なタンパク質及び／又はＲＮＡを発現するが、それら自体のパッケージングシグナルを欠如し得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメント及び第２の核酸は、宿主細胞中に導入され（例えば、同時に若しくは順次に）、遺伝子エレメントの増幅及び／又はパッケージングをもたらすが、第２の核酸の増幅及び／又はパッケージングはもたらさない。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、コンピュータ支援設計ツールを使用して設計されてもよい。
遺伝子エレメント構築物のような核酸分子を作製する一般的な方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
ローリングサークル増幅
理論に束縛されることを望むものではないが、ローリングサークル増幅は、遺伝子エレメント領域に対して５’に位置する（又はその５’領域内にある）Ｒｅｐ結合部位（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、５’ＵＴＲを含み、例えば、ヘアピンループ及び／又は複製起点を含む）に結合するＲｅｐタンパク質を介して起こり得る。次いで、Ｒｅｐタンパク質は遺伝子エレメント領域を通って進行し、遺伝子エレメントの合成をもたらし得る。次いで、放出された遺伝子エレメントを環状化し、次いで、タンパク質性外部内に閉じ込めて、ＣＡＶベクターを形成することができる。
理論に束縛されることを望むものではないが、ローリングサークル増幅は、遺伝子エレメント領域に対して５’に位置する（又はその５’領域内にある）Ｒｅｐ結合部位（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、５’ＵＴＲを含み、例えば、ヘアピンループ及び／又は複製起点を含む）に結合するＲｅｐタンパク質を介して起こり得る。次いで、Ｒｅｐタンパク質は遺伝子エレメント領域を通って進行し、遺伝子エレメントの合成をもたらし得る。次いで、放出された遺伝子エレメントを環状化し、次いで、タンパク質性外部内に閉じ込めて、ＣＡＶベクターを形成することができる。
タンデム構築物
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、タンデム構築物である。本明細書に記載されるようなタンデム構築物は一般に、第１の遺伝子エレメント領域を含み、これは、遺伝子エレメント構築物の残りに連結されず、及び／又は環状の一本鎖ＤＮＡ分子に変換されない場合、タンパク質性外部内に閉じ込められ得、それによってＣＡＶベクターを産生する。タンデム構築物は、第２の遺伝子エレメント領域又はその一部をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンデム構築物は、例えばローリングサークル増幅によって、タンパク質性外部（例えば、ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチドを含む）内への閉じ込めに適した遺伝子エレメントを産生するために使用することができる。一部の実施形態では、タンパク質性外部内への閉じ込めに適した遺伝子エレメントは、第１の遺伝子エレメント領域のローリングサークル増幅を介して産生される。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、タンデム構築物である。本明細書に記載されるようなタンデム構築物は一般に、第１の遺伝子エレメント領域を含み、これは、遺伝子エレメント構築物の残りに連結されず、及び／又は環状の一本鎖ＤＮＡ分子に変換されない場合、タンパク質性外部内に閉じ込められ得、それによってＣＡＶベクターを産生する。タンデム構築物は、第２の遺伝子エレメント領域又はその一部をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンデム構築物は、例えばローリングサークル増幅によって、タンパク質性外部（例えば、ＶＰ１核酸によってコードされるポリペプチドを含む）内への閉じ込めに適した遺伝子エレメントを産生するために使用することができる。一部の実施形態では、タンパク質性外部内への閉じ込めに適した遺伝子エレメントは、第１の遺伝子エレメント領域のローリングサークル増幅を介して産生される。
一部の実施形態では、タンデム構築物は、遺伝子エレメント配列の第１のコピー（例えば、遺伝子エレメント領域）及び遺伝子エレメント配列の第２のコピーの少なくとも一部（例えば、ｕＲＦＳ又はｄＲＦＳを含む）を含む遺伝子エレメント構築物である。一部の実施形態では、第２のコピーは、遺伝子エレメントの完全配列を含む。一部の実施形態では、第２のコピーは、遺伝子エレメントの部分配列（例えば、遺伝子エレメント配列の５’末端又は３’末端からの、遺伝子エレメント配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）を含む。一部の実施形態では、第１のコピーの遺伝子エレメント配列及び第２のコピーの遺伝子エレメント配列は、同じ遺伝子エレメント配列（例えば、同じＣＡＶ配列）であるか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、第１のコピーの遺伝子エレメント配列及び第２のコピーの遺伝子エレメント配列は、異なる遺伝子エレメント配列であるか、又はそれに由来する（例えば、異なるＣＡＶ由来の配列）。一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列の第１のコピー及び遺伝子エレメント配列の第２のコピーは、遺伝子エレメント構築物上で互いに隣接して配置される。他の実施形態では、遺伝子エレメント配列の第１のコピー及び遺伝子エレメント配列の第２のコピーは、例えば、スペーサー領域によって分離され得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー又はその一部（例えば、ｕＲＦＳを含む）は、遺伝子エレメント配列の第１のコピーに対して５’に位置する。一部の実施形態では、遺伝子エレメント配列の第２のコピー又はその一部（例えば、ｄＲＦＳを含む）は、遺伝子エレメント配列の第１のコピーに対して３’に位置する。
エフェクター
本明細書に記載の組成物及び方法は、例えば、本明細書に記載されるような、エフェクター（例えば、外因性エフェクター若しくは内在性エフェクター）をコード化する配列を含むＣＡＶベクターの遺伝子エレメントを産生するために使用することができる。エフェクターは、場合によっては、内在性エフェクター若しくは外因エフェクターであり得る。一部の実施形態では、エフェクターは、治療用エフェクターである。一部の実施形態では、エフェクターは、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、治療用ポリペプチド若しくはペプチド）を含む。一部の実施形態では、エフェクターは、ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、エフェクターは、調節核酸、例えば、本明細書に記載されるようなものを含む。
本明細書に記載の組成物及び方法は、例えば、本明細書に記載されるような、エフェクター（例えば、外因性エフェクター若しくは内在性エフェクター）をコード化する配列を含むＣＡＶベクターの遺伝子エレメントを産生するために使用することができる。エフェクターは、場合によっては、内在性エフェクター若しくは外因エフェクターであり得る。一部の実施形態では、エフェクターは、治療用エフェクターである。一部の実施形態では、エフェクターは、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、治療用ポリペプチド若しくはペプチド）を含む。一部の実施形態では、エフェクターは、ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、エフェクターは、調節核酸、例えば、本明細書に記載されるようなものを含む。
一部の実施形態では、エフェクターコード化配列は、例えば、ノンコーディング領域で、例えば、オープンリーディングフレームの３’及び遺伝子エレメントのＧＣリッチ領域の５’に配置されたノンコーディング領域で、ＴＡＴＡボックスの上流の５’ノンコーディング領域において、５’ＵＴＲにおいて、ポリ－Ａシグナルの下流の、若しくはＧＣリッチ領域の上流の３’ノンコーディング領域において、遺伝子エレメント中に挿入され得る。一部の実施形態では、エフェクターコード化配列は、例えば、コード配列において（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチンをコード化する配列において）、遺伝子エレメント中に挿入され得る。一部の実施形態では、エフェクターコード化配列は、オープンリーディングフレームの全部又は一部に置き換わる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、エフェクターコード化配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、プロモーター若しくはエンハンサー）を含む。
一部の実施形態では、エフェクターを含む遺伝子エレメントが本明細書に記載の遺伝子エレメント構築物（例えば、タンデム構築物）から、例えば、その上に配置された遺伝子エレメント配列のローリングサークル複製によって産生される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、エフェクターコード配列の正確に１つのコピーを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、エフェクターコード配列の２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のコピーを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、エフェクターコード配列の１つの完全長コピー及びエフェクターコード配列の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上）の部分コピー（例えば、エフェクターコード配列の５’切断又は３’切断を含む部分コピー）を含む。
宿主細胞
本明細書に記載のＣＡＶベクターは、例えば、宿主細胞中で産生され得る。一般に、ＣＡＶベクター遺伝子エレメントとＣＡＶベクタータンパク質性外部の構成体（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化されるポリペプチド又はＣＡＶ ＶＰ１分子）とを含む宿主細胞が提供される。次いで、宿主細胞は、遺伝子エレメントのタンパク質性外部内の閉じ込めに好適な条件下で（例えば、本明細書に記載される培養条件で）インキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＡＶベクターの宿主細胞からの放出、例えば、周辺の上清中への放出に好適な条件下でさらにインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、細胞溶解物からのＣＡＶベクターの採取のために溶解される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、高い細胞密度まで増殖された宿主細胞株に導入され得る。
本明細書に記載のＣＡＶベクターは、例えば、宿主細胞中で産生され得る。一般に、ＣＡＶベクター遺伝子エレメントとＣＡＶベクタータンパク質性外部の構成体（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化されるポリペプチド又はＣＡＶ ＶＰ１分子）とを含む宿主細胞が提供される。次いで、宿主細胞は、遺伝子エレメントのタンパク質性外部内の閉じ込めに好適な条件下で（例えば、本明細書に記載される培養条件で）インキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＡＶベクターの宿主細胞からの放出、例えば、周辺の上清中への放出に好適な条件下でさらにインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、細胞溶解物からのＣＡＶベクターの採取のために溶解される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、高い細胞密度まで増殖された宿主細胞株に導入され得る。
遺伝子エレメントの宿主細胞中への導入
遺伝子エレメント、又は遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入され得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントそれ自体が、宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントの配列を含む遺伝子エレメント構築物（例えば、本明細書に記載されるような）が宿主細胞中に導入される。遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、例えば、当該技術分野において既知の方法を使用して、宿主細胞中に導入することができる。例えば、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、トランスフェクション（例えば、安定なトランスフェクション又は一過性トランスフェクション）によって、宿主細胞中に導入することができる。複数の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、リポフェクタミントランスフェクションによって宿主細胞中に導入される。複数の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、エレクトロポレーションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、遺伝子銃を使用して宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、ヌクレオフェクションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、ＰＥＩトランスフェクションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態において、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞を、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物を含むウイルスベクターと接触させることによって、宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主細胞を、遺伝子エレメントを含むＣＡＶベクターと接触させることによって、宿主細胞に導入される
遺伝子エレメント、又は遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入され得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントそれ自体が、宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントの配列を含む遺伝子エレメント構築物（例えば、本明細書に記載されるような）が宿主細胞中に導入される。遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、例えば、当該技術分野において既知の方法を使用して、宿主細胞中に導入することができる。例えば、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、トランスフェクション（例えば、安定なトランスフェクション又は一過性トランスフェクション）によって、宿主細胞中に導入することができる。複数の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、リポフェクタミントランスフェクションによって宿主細胞中に導入される。複数の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、エレクトロポレーションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、遺伝子銃を使用して宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、ヌクレオフェクションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、ＰＥＩトランスフェクションによって宿主細胞中に導入される。一部の実施形態において、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞を、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物を含むウイルスベクターと接触させることによって、宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主細胞を、遺伝子エレメントを含むＣＡＶベクターと接触させることによって、宿主細胞に導入される
実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入されると、複製することができる。実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主細胞中に導入されると、遺伝子エレメント構築物から産生され得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、遺伝子エレメント構築物を鋳型として使用して、ポリメラーゼにより宿主細胞中で産生される。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含むベクターは、ＣＡＶベクターの発現を達成するために、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株中に導入される（例えば、トランスフェクトされる）。この目的のために、ＣＡＶベクターポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株が、適切な宿主細胞として利用され得る。宿主細胞は、他のウイルス機能又は追加の機能を提供するために同様に操作されてもよい。
本明細書に開示されるＣＡＶベクターを調製するために、遺伝子エレメント構築物を用いて、複製及び産生に必要なＣＡＶベクタータンパク質並びに機能を提供する細胞をトランスフェクトすることができる。或いは、細胞は、本明細書に開示される遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含むベクターによるトランスフェクション前に、トランスフェクション中に、又はトランスフェクション後にＣＡＶベクタータンパク質並びに機能を提供する第２の構築物（例えば、ウイルス）でトランスフェクトされてもよい。一部の実施形態では、第２の構築物は、不完全なウイルス粒子の補完産生に有用であり得る。第２の構築物（例えば、バクミド）は、例えば、その後の遺伝子導入体ウイルスの選択を可能にする、宿主域制限又は温度感受性などの条件付き増殖欠陥を有し得る。一部の実施形態では、第２の構築物は、ＣＡＶベクターの発現を達成するために、宿主細胞によって利用される１つ又は複数の複製タンパク質を提供し得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つ又は複数の複製タンパク質などのウイルスタンパク質をコード化するベクターでトランスフェクトされ得る。一部の実施形態では、第２の構築物は、抗ウイルス感受性を含む。
本明細書に開示される遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含むベクターは、場合によっては、当該技術分野において既知の技術を使用して複製され、ＣＡＶベクターに産生することができる。例えば、様々なウイルス培養法は、例えば、米国特許第４，６５０，７６４号明細書；米国特許第５，１６６，０５７号明細書；米国特許第５，８５４，０３７号明細書；欧州特許公開第ＥＰ０７０２０８５Ａ１号明細書；米国特許出願第０９／１５２，８４５号明細書；ＰＣＴ９７／１２０３２号；同第９６／３４６２５号；欧州特許公開第ＥＰ－Ａ７８０４７５号明細書；９９／０２６５７号；同第９８／５３０７８号；同第９８／０２５３０号；同第９９／１５６７２号；同第９８／１３５０１号；同第９７／０６２７０号；及びＥＰＯ７８０４７ＳＡ１に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＣＡＶタンパク質をシス又はトランスで提供するための方法
一部の実施形態（例えば、本明細書に記載のシス実施形態）では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＯＲＦ（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン、又はその機能性断片）のためのコード配列を含む１つ又は複数の発現カセットをさらに含む。実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片のためのコード配列を含む発現カセットを含む。エフェクター並びに１つ又は複数のＣＡＶ ＯＲＦのための発現カセットを含むそのような遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入され得る。そのような遺伝子エレメント構築物を含む宿主細胞は、場合によっては、追加の遺伝子エレメント構築物又は宿主細胞ゲノム中への発現カセットの組み込みを必要とすることなく、遺伝子エレメント及びタンパク質性外部のための構成体、並びにタンパク質性外部内の遺伝子エレメントの閉じ込めのための構成体を産生することができる。言い換えれば、そのような遺伝子エレメント構築物は、例えば、本明細書に記載されるように、宿主細胞におけるシスＣＡＶベクター産生方法に使用することができる。
一部の実施形態（例えば、本明細書に記載のシス実施形態）では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＯＲＦ（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン、又はその機能性断片）のためのコード配列を含む１つ又は複数の発現カセットをさらに含む。実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片のためのコード配列を含む発現カセットを含む。エフェクター並びに１つ又は複数のＣＡＶ ＯＲＦのための発現カセットを含むそのような遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入され得る。そのような遺伝子エレメント構築物を含む宿主細胞は、場合によっては、追加の遺伝子エレメント構築物又は宿主細胞ゲノム中への発現カセットの組み込みを必要とすることなく、遺伝子エレメント及びタンパク質性外部のための構成体、並びにタンパク質性外部内の遺伝子エレメントの閉じ込めのための構成体を産生することができる。言い換えれば、そのような遺伝子エレメント構築物は、例えば、本明細書に記載されるように、宿主細胞におけるシスＣＡＶベクター産生方法に使用することができる。
一部の実施形態（例えば、本明細書に記載のトランス実施形態）では、遺伝子エレメントは、１つ又は複数のＣＡＶ ＯＲＦ（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン、又はその機能性断片）のためのコード配列を含む発現カセットを含まない。実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、バクミドではない。複数の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、ＣＡＶ ＶＰ１、又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片のためのコード配列を含む発現カセットを含まない。エフェクターのための発現カセットを含むが、１つ又は複数のＣＡＶ ＯＲＦ（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１又はそのスプライス変異体若しくは機能性断片）のための発現カセットを欠くそのような遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞中に導入され得る。そのような遺伝子エレメント構築物を含む宿主細胞は、場合によっては、ＣＡＶベクターの１つ又は複数の構成体（例えば、タンパク質性外部タンパク質）の産生のために、追加の遺伝子エレメント構築物又は宿主細胞ゲノムへの発現カセットの組み込みを必要とする。一部の実施形態では、そのような遺伝子エレメント構築物を含む宿主細胞は、ＣＡＶ ＶＰ１分子をコード化する追加の核酸構築物の非存在下では、遺伝子エレメントをタンパク質性外部内に閉じ込めることができない。言い換えれば、そのような遺伝子エレメント構築物は、例えば、本明細書に記載されるように宿主細胞におけるトランスＣＡＶベクター産生方法に使用することができる。
ヘルパー
一部の実施形態において、宿主細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物又は遺伝子エレメントを含む宿主細胞）にヘルパー構築物が導入される。一部の実施形態において、ヘルパー構築物は、遺伝子エレメント構築物の導入前に宿主細胞に導入される。一部の実施形態において、ヘルパー構築物は、遺伝子エレメント構築物の導入と同時に宿主細胞に導入される。一部の実施形態において、ヘルパー構築物は、遺伝子エレメント構築物の導入後に宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、ヘルパー構築物は、ヘルパー構築物を含むヘルパーウイルスを介して宿主細胞に導入される。
一部の実施形態において、宿主細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物又は遺伝子エレメントを含む宿主細胞）にヘルパー構築物が導入される。一部の実施形態において、ヘルパー構築物は、遺伝子エレメント構築物の導入前に宿主細胞に導入される。一部の実施形態において、ヘルパー構築物は、遺伝子エレメント構築物の導入と同時に宿主細胞に導入される。一部の実施形態において、ヘルパー構築物は、遺伝子エレメント構築物の導入後に宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、ヘルパー構築物は、ヘルパー構築物を含むヘルパーウイルスを介して宿主細胞に導入される。
例示的な細胞型
ＣＡＶベクターの産生に適した例示的な宿主細胞としては、限定するものではないが、真核細胞（例えば、鳥類細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞）が挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞又は細胞株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、鳥類細胞又は細胞株（例えば、ニワトリ細胞若しくは細胞株、例えば、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞；又はアヒル細胞若しくは細胞株、例えば、ＥＢ６６細胞若しくはＡＧＥ．ＣＲ細胞）である。一部の実施形態において、細胞は、免疫細胞又は細胞株、例えば、Ｔ細胞又は細胞株、癌細胞株、肝細胞又は細胞株、ニューロン、グリア細胞、皮膚細胞、上皮細胞、間葉細胞、血液細胞、内皮細胞、眼細胞、胃腸細胞、祖先細胞、前駆細胞、幹細胞、肺細胞、心臓細胞、又は筋細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、又は昆虫細胞）である。
ＣＡＶベクターの産生に適した例示的な宿主細胞としては、限定するものではないが、真核細胞（例えば、鳥類細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞）が挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞又は細胞株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、鳥類細胞又は細胞株（例えば、ニワトリ細胞若しくは細胞株、例えば、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞；又はアヒル細胞若しくは細胞株、例えば、ＥＢ６６細胞若しくはＡＧＥ．ＣＲ細胞）である。一部の実施形態において、細胞は、免疫細胞又は細胞株、例えば、Ｔ細胞又は細胞株、癌細胞株、肝細胞又は細胞株、ニューロン、グリア細胞、皮膚細胞、上皮細胞、間葉細胞、血液細胞、内皮細胞、眼細胞、胃腸細胞、祖先細胞、前駆細胞、幹細胞、肺細胞、心臓細胞、又は筋細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、又は昆虫細胞）である。
一部の実施形態において、宿主細胞は、リンパ系細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｔ細胞又は不死化Ｔ細胞である。実施形態において、宿主細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。実施形態において、宿主細胞は、ＭＯＬＴ－４細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｂ細胞又は不死化Ｂ細胞である。実施形態において、宿主細胞は、Ｒａｊｉ細胞である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、遺伝子エレメント構築物、例えば、タンデム構築物（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。
実施形態において、宿主細胞は、Ｒａｊｉ細胞、ＥＫＶＸ細胞、ＭＲＣ５細胞、又はＭＣＦ７細胞である。実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、Ａ５４９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞、又はＷｉ３８細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、非ヒト霊長類細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ－１細胞、又はＬＬＣＭＫ２細胞）である。一部の実施形態において、宿主細胞は、マウス細胞（例えば、ＭｃＣｏｙ細胞）である。一部の実施形態において、宿主細胞は、ハムスター細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＢＨＫ２１細胞）である。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＡＲＣ－１４５、ＭＤＢＫ、ＲＫ－１３、又はＥＥＬ細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、上皮細胞（例えば、上皮系統の細胞株）である。
一部の実施形態において、ＣＡＶベクターは、連続動物細胞株（例えば、逐次増殖させることのできる不死化細胞株）において培養される。本発明の一実施形態によれば、細胞株には、ブタ細胞株が含まれ得る。本発明との関連において想定される細胞株には、限定はされないが、ブタ腎臓上皮細胞株ＰＫ－１５及びＳＫ、骨髄単核細胞株３Ｄ４／３１並びに精巣細胞株ＳＴなど、不死化ブタ細胞株が含まれる。
培養条件
遺伝子エレメント及びタンパク質性外部の構成体を含む宿主細胞は、遺伝子エレメントのタンパク質性外部の閉じ込めに好適な条件下でインキュベートされ、それによってＣＡＶベクターを産生することができる。好適な培養条件には、例えば、記載されるものが挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、液体培地（例えば、ＲＰＭＩ（例えば、ＦＢＳ、例えば、１０％ ＦＢＳで補充された）、ＥＸ－ＣＥＬＬ ＥＢｘ ＧＲＯ－Ｉ無血清（ｓｅｒｕｍｅ）培地（例えば、１－グルタミンで補充された）、ＨｙＣｌｏｎｅ ＣＤＭ４Ａｖｉａｎ培地（例えば、１－グルタミンで補充された）、Ｏｐｔｉｐｒｏ ＳＦＭ、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（ＴＮＭ－ＦＨ）、ＩＰＬ－４１、ＴＣ－１００、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ＳＦ－９００ ＩＩ ＳＦＭ、又はＥＸＰＲＥＳＳ－ＦＩＶＥ（商標）ＳＦＭ）中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、接着培養中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、浮遊培養中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、チューブ、ボトル、マイクロキャリア、又はプラスコ中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、皿又はウェル（例えば、プレート上のウェル）中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の増殖に好適な条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞中で産生されたＣＡＶベクターを周辺の上清中に放出するために、宿主細胞に好適な条件下でインキュベートされる。
遺伝子エレメント及びタンパク質性外部の構成体を含む宿主細胞は、遺伝子エレメントのタンパク質性外部の閉じ込めに好適な条件下でインキュベートされ、それによってＣＡＶベクターを産生することができる。好適な培養条件には、例えば、記載されるものが挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、液体培地（例えば、ＲＰＭＩ（例えば、ＦＢＳ、例えば、１０％ ＦＢＳで補充された）、ＥＸ－ＣＥＬＬ ＥＢｘ ＧＲＯ－Ｉ無血清（ｓｅｒｕｍｅ）培地（例えば、１－グルタミンで補充された）、ＨｙＣｌｏｎｅ ＣＤＭ４Ａｖｉａｎ培地（例えば、１－グルタミンで補充された）、Ｏｐｔｉｐｒｏ ＳＦＭ、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（ＴＮＭ－ＦＨ）、ＩＰＬ－４１、ＴＣ－１００、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ＳＦ－９００ ＩＩ ＳＦＭ、又はＥＸＰＲＥＳＳ－ＦＩＶＥ（商標）ＳＦＭ）中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、接着培養中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、浮遊培養中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、チューブ、ボトル、マイクロキャリア、又はプラスコ中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、皿又はウェル（例えば、プレート上のウェル）中でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の増殖に好適な条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞中で産生されたＣＡＶベクターを周辺の上清中に放出するために、宿主細胞に好適な条件下でインキュベートされる。
本発明によるＣＡＶベクター含有細胞培養物の産生は、異なるスケールで（例えば、フラスコ、ローラーボトル、又はバイオリアクター中で）行うことができる。感染される細胞の培養に使用される培地は、一般に、細胞生存能力に必要な標準栄養素を含むがまた、細胞型に依存する追加の栄養素を含んでもよい。任意選択で、培地は、無タンパク質及び／又は無血清であり得る。細胞型に応じて、細胞は、浮遊状態で又は基材上で培養され得る。一部の実施形態では、異なる培地が宿主細胞の増殖のために、またＣＡＶベクターの産生のために使用される。
採取及び精製
宿主細胞によって産生されたＣＡＶベクターは、例えば、当該技術分野において既知の方法に従って採取することができる。例えば、培養中で宿主細胞によって周辺の上清中に放出されたＣＡＶベクターは、上清から採取することができる。一部の実施形態では、上清は、宿主細胞から分離されてＣＡＶベクターを得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、採取前に又は採取中に溶解される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞溶解物から採取される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞溶解物及び上清の両方から採取される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターの精製及び単離は、例えば、Ｒｉｎａｌｄｉ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），３ｒｄ ｅｄ．２０１４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ウイルス産生における既知の方法に従って実施される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、生物物理学的特性、例えば、サイズ、密度、電荷に基づく溶質の分離によって回収及び／又は精製され得る。一実施形態では、ＣＡＶベクターは、密度勾配遠心分離及び／又は超遠心分離、例えば、ショ糖密度勾配遠心分離又は塩化セシウム密度勾配遠心分離によって、細胞又は細胞培養物から精製される。例えば、ＣＡＶベクター調製物は、（ａ）任意選択で宿主細胞培養物から宿主細胞を溶解すること、（ｂ）任意選択で宿主細胞培養物から細胞残屑を除去して細胞培養物の可溶性画分を生成すること、（ｃ）可溶性画分に対して密度勾配遠心分離及び／又は超遠心分離を実施すること、並びに（ｄ）密度勾配から濃縮ＣＡＶベクター調製物を収集することによって、濃縮又は精製される。ショ糖クッション遠心分離／超遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は接線流濾過などの他の工程を、製剤用賦形剤との製剤化の前に実施することができる。
宿主細胞によって産生されたＣＡＶベクターは、例えば、当該技術分野において既知の方法に従って採取することができる。例えば、培養中で宿主細胞によって周辺の上清中に放出されたＣＡＶベクターは、上清から採取することができる。一部の実施形態では、上清は、宿主細胞から分離されてＣＡＶベクターを得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、採取前に又は採取中に溶解される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞溶解物から採取される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞溶解物及び上清の両方から採取される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターの精製及び単離は、例えば、Ｒｉｎａｌｄｉ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），３ｒｄ ｅｄ．２０１４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ウイルス産生における既知の方法に従って実施される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、生物物理学的特性、例えば、サイズ、密度、電荷に基づく溶質の分離によって回収及び／又は精製され得る。一実施形態では、ＣＡＶベクターは、密度勾配遠心分離及び／又は超遠心分離、例えば、ショ糖密度勾配遠心分離又は塩化セシウム密度勾配遠心分離によって、細胞又は細胞培養物から精製される。例えば、ＣＡＶベクター調製物は、（ａ）任意選択で宿主細胞培養物から宿主細胞を溶解すること、（ｂ）任意選択で宿主細胞培養物から細胞残屑を除去して細胞培養物の可溶性画分を生成すること、（ｃ）可溶性画分に対して密度勾配遠心分離及び／又は超遠心分離を実施すること、並びに（ｄ）密度勾配から濃縮ＣＡＶベクター調製物を収集することによって、濃縮又は精製される。ショ糖クッション遠心分離／超遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は接線流濾過などの他の工程を、製剤用賦形剤との製剤化の前に実施することができる。
採取されたＣＡＶベクターは、例えば、ＣＡＶベクター調製物を作り出すために精製及び／又は濃縮され得る。一部の実施形態では、採取されたＣＡＶベクターは、例えば、ウイルス粒子を精製するための当該技術分野において既知の方法（例えば、沈降、クロマトグラフィー、及び／又は限外濾過による精製）を使用して、採取溶液中に存在する他の構成成分又は汚染物資から単離される。一部の実施形態では、精製ステップは、血清、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、遺伝子エレメントを欠く粒子、及び／又は調製物からのフェノールレッドのうちの１つ又は複数を除去するステップを含む。一部の実施形態では、採取されたＣＡＶベクターは、例えば、ウイルス粒子を濃縮するために、当該技術分野において既知の方法を使用して、採取溶液中に存在する他の構成成分又は汚染物質に対して濃縮される。
一部の実施形態では、得られた調製物又は調製物を含む医薬組成物は、許容される期間及び温度で安定しており、且つ／又は所望の投与経路及び／又はこの投与経路が必要とする任意のデバイス、例えば、注射針若しくは注射器と適合性である。
ＩＩ．ＣＡＶベクター
一部の態様において、本明細書に記載される発明は、ＣＡＶベクターの組成物及び使用及び作成方法、ＣＡＶベクター製剤、並びに治療用組成物を含む。一部の実施形態において、ＣＡＶベクターは、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物を使用して作成される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ）、或いは他の実質的に非病原性のウイルス、例えば、共生ウイルス、片利共生ウイルス、ネイティブウイルスをベースとする配列、構造、及び／又は機能を含む１つ又は複数の核酸若しくはポリペプチド、又はその断片若しくは一部を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベースのＣＡＶベクターは、そのＣＡＶに対して外性の少なくとも１つのエレメント、例えば、外因性エフェクター又はＣＡＶベクターの遺伝子エレメント内に配置される外因性エフェクターをコード化する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベースのＣＡＶベクターは、ＣＡＶ由来の別のエレメントとは異種の少なくとも１つのエレメント、例えば、別の連結核酸配列に対して異種であるエフェクターコード化核酸配列、例えば、プロモーターエレメントなどを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えば、環状ＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含み、これは遺伝子エレメントの残り及び／又はタンパク質性外部（例えば、本明細書に記載される、例えば、エフェクターをコード化する外性エレメント）に対して異種である少なくとも１つのエレメントを含む。ＣＡＶベクターは、宿主、例えば、ヒトへのペイロードの送達ビヒクル（例えば、実質的に非病原性送達ビヒクル）であってもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で複製することができる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において、実質的に非病原性であり、且つ／又は実質的に非総合作用性である。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、複製欠損である。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、複製可能である。
一部の態様において、本明細書に記載される発明は、ＣＡＶベクターの組成物及び使用及び作成方法、ＣＡＶベクター製剤、並びに治療用組成物を含む。一部の実施形態において、ＣＡＶベクターは、本明細書に記載されるとおりの遺伝子エレメント構築物を使用して作成される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ）、或いは他の実質的に非病原性のウイルス、例えば、共生ウイルス、片利共生ウイルス、ネイティブウイルスをベースとする配列、構造、及び／又は機能を含む１つ又は複数の核酸若しくはポリペプチド、又はその断片若しくは一部を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベースのＣＡＶベクターは、そのＣＡＶに対して外性の少なくとも１つのエレメント、例えば、外因性エフェクター又はＣＡＶベクターの遺伝子エレメント内に配置される外因性エフェクターをコード化する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベースのＣＡＶベクターは、ＣＡＶ由来の別のエレメントとは異種の少なくとも１つのエレメント、例えば、別の連結核酸配列に対して異種であるエフェクターコード化核酸配列、例えば、プロモーターエレメントなどを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えば、環状ＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含み、これは遺伝子エレメントの残り及び／又はタンパク質性外部（例えば、本明細書に記載される、例えば、エフェクターをコード化する外性エレメント）に対して異種である少なくとも１つのエレメントを含む。ＣＡＶベクターは、宿主、例えば、ヒトへのペイロードの送達ビヒクル（例えば、実質的に非病原性送達ビヒクル）であってもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で複製することができる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において、実質的に非病原性であり、且つ／又は実質的に非総合作用性である。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、複製欠損である。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、複製可能である。
一態様では、本発明は、以下：（ｉ）プロモーターエレメントと、エフェクター（例えば、内在性エフェクター又は外因性エフェクター、例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであり、さらには、以下の特性：環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で、真核細胞のゲノム中に組み込まれる、の一方又は両方を有する、遺伝子エレメント；並びに（ｉｉ）タンパク質性外部を含むＣＡＶベクターを含み、ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外部内に閉じ込められており；且つＣＡＶベクターは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。
一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部への遺伝子エレメントのパッケージングを可能にするのに適したパッケージングシグナルを含む。実施形態において、タンパク質結合配列（例えば、パッケージングシグナル）は、核酸配列
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む。
、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、又はその逆相補体を含む。
本明細書に記載されるＣＡＶベクターの一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる。一部の実施形態では、被験者に投与される複数のＣＡＶベクターからの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、若しくは５％未満の遺伝子エレメントが、被験者の１つ又は複数の宿主細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載のとおり、ＣＡＶベクターの集団の遺伝子エレメントは、ＡＡＶウイルスの同等集団の頻度よりも低い頻度で、例えば、ＡＡＶウイルスの同等集団の頻度より約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、若しくはそれ以上低い頻度で、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
一態様では、本発明は、以下：（ｉ）プロモーターエレメントと、エフェクター（例えば、内在性エフェクター又は外因性エフェクター、例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、野生型ＣＡＶ配列、例えば、本明細書に記載の野生型ＣＡＶ配列に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する遺伝子エレメント：及び（ｉｉ）タンパク質性外部を含むＣＡＶベクターを含み、ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外部内に閉じ込められており；且つＣＡＶベクターは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。
一態様では、本発明は、以下：
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター（例えば、内在性又は外因性エフェクター）をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び
ｂ）遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜し、カプシド化し、又は閉じ込めるタンパク質性外部
を含むＣＡＶベクターを含む。
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター（例えば、内在性又は外因性エフェクター）をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び
ｂ）遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜し、カプシド化し、又は閉じ込めるタンパク質性外部
を含むＣＡＶベクターを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、非包膜、環状、一本鎖ＤＮＡウイルス由来の（又はそれに対して＞７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を有する）配列若しくは発現産物を含む。動物環状一本鎖ＤＮＡウイルスは、一般に、真核非植物宿主に感染し、環状ゲノムを有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の亜群を指す。従って、動物環状ｓｓＤＮＡウイルスは、原核生物に感染するｓｓＤＮＡウイルス（すなわち、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）及びイノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ））、並びに植物に感染するｓｓＤＮＡウイルス（すなわち、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）及びナノウイルス科（Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ））から識別可能である。これらはまた、非植物真核細胞に感染する線状ｓｓＤＮＡウイルス（すなわち、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ））からも識別可能である。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞の機能を例えば、一過性又は長期に調節する。いくつかの実施形態では、細胞の機能は安定に改変され、例えば、調節は少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、６０日、若しくはそれ以上又はこれらの間の任意の時間にわたって持続する。いくつかの実施形態では、細胞の機能は、一過性改変され、例えば、調節は、約３０分～約７日以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、又はこれらの間の任意の時間にわたって持続する。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、プロモーターエレメントを含む。複数の実施形態では、プロモーターエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧＧプロモーター、又はＵＢＣプロモーター、ＴＴＶウイルスプロモーター、アクチベータタンパク質（ＴｅｔＲ－ＶＰ１６、Ｇａｌ４－ＶＰ１６、ｄＣａｓ９－ＶＰ１６など）の上流ＤＮＡ結合部位を有する組織特異的、Ｕ６（ｐｏｌｌＩＩＩ）、最小ＣＭＶプロモーターから選択される。複数の実施形態では、プロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックスを含む。複数の実施形態では、プロモーターエレメントは、例えば、本明細書に記載される野生型ＣＡＶに対して内在性である。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴：一本鎖、環状、マイナス鎖、及び／又はＤＮＡのうち１つ又は複数を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、エピソームを含む。一部の実施形態では、エフェクターを除く遺伝子エレメントの部分は、約１～５ｋｂ（例えば、約２．８～４ｋｂ、約２．８～３．２ｋｂ、約３．６～３．９ｋｂ、又は約２．８～２．９ｋｂ）、約５ｋｂ未満（例えば、約２．９ｋｂ、３．２ｋｂ、３．６ｋｂ、３．９ｋｂ、若しくは４ｋｂ未満）、又は少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、少なくとも１ｋｂ）の合計サイズを有する。特定の実施形態では、エフェクターを除く遺伝子エレメントの部分は、約０．５～１ｋｂ、１～１．５ｋｂ、１．５～２ｋｂ、２～２．５ｋｂ、２．５～３ｋｂ、又は３～３．５ｋｂの複合サイズを有する。
本明細書に記載されるＣＡＶベクター、ＣＡＶベクターを含む組成物、こうしたＣＡＶベクターを使用する方法などは、一部の事例において、異なるエフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡ（例えば、ＩＦＮ若しくはｍｉＲ－６２５に対する）、ｓｈＲＮＡなどと、タンパク質結合配列、例えば、Ｑ９９１５３などのキャプシドタンパク質に結合するＤＮＡ配列を、タンパク質性外部、例えば、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：１９６１－１９７５に開示されるキャプシドと組み合わせて、ＣＡＶベクターを産生させる（次に、これは、エフェクターを細胞（例えば、動物細胞、例えば、ヒト細胞又はブタ若しくはマウス細胞などのヒト以外の細胞）に送達するために使用することができる）方法を説明する実施例に部分的に基づく。実施形態では、エフェクターは、インターフェロンなどの因子の発現を抑制することができる。実施例はさらに、いかにして、例えば、ＣＡＶ由来の配列にエフェクターを挿入することにより、ＣＡＶベクターを製造することができるかも説明する。これらの実施例に基づいて、以下の説明は、特定の知見の様々な変形及び実施例で検討される組み合わせを考慮する。例えば、当業者は、実施例から、特定のｍｉＲＮＡがエフェクターのほんの１例として使用されること、及びその他のエフェクターが、例えば、他の調節核酸又は治療用ペプチドであってもよいことを理解されるであろう。同様に、本実施例で使用される特定のキャプシドの代わりに、本明細書に後述する実質的に非病原性のタンパク質を使用してもよい。また、本実施例に記載する特定のＣＡＶ配列の代わりに、本明細書に後述するＣＡＶ配列を使用してもよい。これらの検討事項は、タンパク質結合配列、プロモーターなどの調節配列などにも同様に適用される。それらから独立に、当業者は、本実施例に密接に関連するこうした実施形態を特に考慮するであろう。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、又はＣＡＶベクターに含まれる遺伝子エレメントを細胞（例えば、ヒト細胞）に導入する。一部の実施形態では、例えば、ＣＡＶベクター又は遺伝子エレメントが細胞に一旦導入されると、例えば、ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントによりコード化されたエフェクター（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ）は、細胞（例えば、ヒト細胞）において発現される。実施形態では、ＣＡＶベクター、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、例えば、細胞による標的分子の発現レベルを改変することによって、細胞中の標的分子（例えば、標的核酸、例えば、ＲＮＡ、若しくは標的ポリペプチド）のレベルを調節（例えば、増大若しくは低減）する。実施形態では、ＣＡＶベクター、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの導入は、細胞により産生されたインターフェロンのレベルを低減する。実施形態では、ＣＡＶベクター、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、細胞の機能を調節（例えば、増大若しくは低減）する。実施形態では、ＣＡＶベクター、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、細胞の生存能を調節（例えば、増大若しくは低減）する。実施形態では、ＣＡＶベクター、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、細胞（例えば、癌細胞）の生存能を低減する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＶベクター（例えば、合成ＣＡＶベクター）は、７０％未満の抗体陽性率（例えば、約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満の抗体陽性率）を誘導する。実施形態では、抗体陽性率は、当技術分野で公知の方法に従って測定される。実施形態では、抗体陽性率は、例えば、Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７７：１９９－２０６；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＴＴＶ抗体検出法及び／又はＫａｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２００８；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８２：１８２－１８９；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＴＴＶ ＩｇＧ血清陽性率を決定する方法に従って、生体サンプル中のＣＡＶ（例えば、本明細書に記載のとおり）又はそれに基づくＣＡＶベクターに対する抗体を検出することにより測定される。さらに、ＣＡＶ又はそれに基づくＣＡＶベクターに対する抗体は、抗ウイルス抗体を検出するための当技術分野の方法、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３；Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（３４１）：１－７；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＡＡＶ抗体を検出する方法により検出することもできる。
一部の実施形態では、複製欠損、複製欠陥、又は複製不全遺伝子エレメントは、遺伝子エレメントの複製に必要な機構又は成分の全てをコード化しない。一部の実施形態では、複製欠損遺伝子エレメントは、複製因子をコード化しない。一部の実施形態では、複製欠損遺伝子エレメントは、１つ若しくは複数のＯＲＦ（例えば、本明細書に記載される、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはアポプチン）をコード化しない。一部の実施形態では、遺伝子エレメントによりコードされない機構又は成分はトランスで提供されてもよく（例えば、ウイルス若しくはプラスミドを使用して、又は宿主細胞及び／若しくは周囲媒体によっても含まれる核酸中にコードされ、例えば、宿主細胞のゲノムに組み込まれて）、例えば、複製欠損、複製欠陥、又は複製不能な遺伝子エレメントは、トランスで提供される機構又は成分の存在下で複製を受けることができる。
一部の実施形態では、パッケージング欠損、パッケージング欠陥、又はパッケージング不能な遺伝子エレメントは、タンパク質性外部にパッケージングされることができない（例えば、タンパク質性外部は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１核酸によりコードされるポリペプチドを含む、カプシド又はその一部を含む）。一部の実施形態では、パッケージング欠損遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）と比較して１０％未満（例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、又は０．００１％未満）の効率でタンパク質性外部にパッケージングされる。一部の実施形態では、パッケージング欠損遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）の遺伝子エレメントのパッケージングを可能にする因子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）の存在下であっても、タンパク質性外部にパッケージングされることができない。一部の実施形態では、パッケージング欠損遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）の遺伝子エレメントのパッケージングを可能にするであろう因子（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）の存在下であっても、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）と比較して１０％未満（例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、又は０．００１％未満）の効率でタンパク質性外部にパッケージングされる。
一部の実施形態では、パッケージング可能遺伝子エレメントは、タンパク質性外部にパッケージングされることができる（例えば、タンパク質性外部は、例えば、本明細書に記載されるようなＶＰ１核酸によりコードされるポリペプチドを含む、カプシド又はその一部を含む）。一部の実施形態では、パッケージング可能遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）と比較して少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％以上）の効率でタンパク質性外部にパッケージングされる。一部の実施形態では、パッケージング可能遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）の遺伝子エレメントのパッケージングを可能にする因子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）の存在下でタンパク質性外部にパッケージングされることができる。一部の実施形態では、パッケージング可能遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）の遺伝子エレメントのパッケージングを可能にする因子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）の存在下で野生型ＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）と比較して少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％以上）の効率でタンパク質性外部にパッケージングされる。
ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶベクターは、野生型ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）由来の又はそれと類似の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、野生型ＣＡＶに対して外因性である１つ以上の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、野生型ＣＡＶに対して内因性である１つ以上の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶベクターにおける１つ以上の他の配列又は発現産物に対して異種性である１つ以上の配列又は発現産物を含む。ＣＡＶは、一般に、負の極性を有する一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する。ＣＡＶは、一般に、いずれのヒト疾患にも関連付けられていず、ヒト細胞に感染するとも考えられていない（例えば、Ｓｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ ２０１７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．４：１５９－１８０；及びＦａｔｏｂａ ａｎｄ Ａｄｅｌｅｋｅ ２０１９，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ６３：１９－２５参照；これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶベクターは、野生型ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）由来の又はそれと類似の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、野生型ＣＡＶに対して外因性である１つ以上の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、野生型ＣＡＶに対して内因性である１つ以上の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶベクターにおける１つ以上の他の配列又は発現産物に対して異種性である１つ以上の配列又は発現産物を含む。ＣＡＶは、一般に、負の極性を有する一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する。ＣＡＶは、一般に、いずれのヒト疾患にも関連付けられていず、ヒト細胞に感染するとも考えられていない（例えば、Ｓｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ ２０１７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．４：１５９－１８０；及びＦａｔｏｂａ ａｎｄ Ａｄｅｌｅｋｅ ２０１９，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ ６３：１９－２５参照；これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、アミノ酸配列若しくはその機能的断片、又は本明細書に記載されるアミノ酸配列の任意の１つ、例えばＣＡＶポリペプチド配列に対して少なくとも約６０％、７０％ ８０％、８５％、９０％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ核酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む１つ以上の核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子エレメント）、又はその断片を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶの５’ＵＴＲ、反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２遺伝子、アポプチン遺伝子、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、ＧＣリッチ領域、ポリＡシグナル配列、又はそれらの任意の組み合わせの１つ以上に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む１つ以上の核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子エレメント）を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるＣＡＶのいずれかのカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン配列をコードする配列を含む。実施形態では、核酸分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（又はスプライス変異体若しくはその機能的断片）又はＣＡＶ ＶＰ１核酸によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質をコードする配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表１の完全核酸配列Ａ、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ａの５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ａの反復領域ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＣＡＡＴシグナルヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ａのアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ａのアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ａの３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのＧＣリッチヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＡのポリＡシグナルヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＢのＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂのアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＢのＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＢのＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂのアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１ＢのＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表２の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２の完全核酸配列のヌクレオチド１～６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２の完全核酸配列のヌクレオチド９９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド７～９９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表２のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２のＶＰヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２のＶＰヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表２の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表３の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３の完全核酸配列のヌクレオチド１～２０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３の完全核酸配列のヌクレオチド１１９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド２０７～１１９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表３のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表３の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表４の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４の完全核酸配列のヌクレオチド１～４０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４の完全核酸配列のヌクレオチド１３９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド４０７～１３９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表４のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表４の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表５の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５の完全核酸配列のヌクレオチド１～６０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５の完全核酸配列のヌクレオチド１５９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド６０７～１５９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表５のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表５の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表６の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６の完全核酸配列のヌクレオチド１～８０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６の完全核酸配列のヌクレオチド１７９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド８０７～１７９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表６のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、に表６のＶＰ２ヌクレオチド配列対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表６の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表７の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７の完全核酸配列のヌクレオチド１～１００６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７の完全核酸配列のヌクレオチド１９９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド１００７～１９９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表７のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表７の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表８の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８の完全核酸配列のヌクレオチド１～１２０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８の完全核酸配列のヌクレオチド２１９５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド１２０７～２１９４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表８のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表８の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表９の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９の完全核酸配列のヌクレオチド１～１２７１に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド１２７２～２３１９、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、若しくは９５０～９８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表９のｎＬｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表９の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表１０の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０の完全核酸配列のヌクレオチド１～５４６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０の完全核酸配列のヌクレオチド２１３３～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド５４７～２１３４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、若しくは１５００～１５８７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表１０のｉＣＲＥインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１０の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表１１の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１の完全核酸配列のヌクレオチド１～６０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１の完全核酸配列のヌクレオチド１７９８～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド６０７～１７９７、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、若しくは１１００～１１９０ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表１１のＧＦＰインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１１の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表１２の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２の完全核酸配列のヌクレオチド１～６０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２の完全核酸配列のヌクレオチド２０１５～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド６０７～２０１４、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、若しくは１４００～１４０７ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表１２のＧｌｕｃインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１２の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
実施形態では、核酸分子は、表１３の完全核酸配列、又はその中の１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、１９００～２０００、２０００～２１００、２１００～２２００、２２００～２３００、若しくは２３００～２３１９ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３の完全核酸配列のヌクレオチド１～６０６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３の完全核酸配列のヌクレオチド１７９０～２３１９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１Ｂの完全核酸配列のヌクレオチド６０７～１７８９、又はその中の１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、若しくは１１００～１１８２ヌクレオチドの連続配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含まない。実施形態では、核酸分子は、表１３のｍＣｈｅｒｒｙインサートヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３の５’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３のＶＰ２ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３のアポプチンヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３のＶＰ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３のＶＰ２ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３のアポプチンヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３のＶＰ１ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、核酸分子は、表１３の３’ＵＴＲヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、アミノ酸配列若しくはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列、又は例えば、表１～１７のいずれかに列挙される配列に列挙され又はそれによりコードされる、本明細書に記載されるアミノ酸配列の任意の１つ、例えば、ＣＡＶアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、７０％ ８０％、８５％、９０％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば本明細書に記載されるようなＣＡＶ配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む１つ以上の核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子エレメント）、又はその断片を含む。実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに示すような配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される核酸配列を含む。実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに示すような配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、本明細書に記載されるＣＡＶのいずれかの５’ＵＴＲ、反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２遺伝子、アポプチン遺伝子、ＶＰ１、３’ＵＴＲ、ＧＣリッチ領域、ポリＡシグナル配列、又はそれらの任意の組み合わせの１つ以上に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子エレメント）を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるＣＡＶのいずれかのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１分子）、ＶＰ２分子、及び／又はアポプチン分子をコードする配列を含む。実施形態では、核酸分子は、ＣＡＶ ＶＰ１分子（例えば、表１～１７のいずれかに示されるようなＶＰ１アミノ酸配列、又は表１～１７のいずれかに示されるような核酸配列によりコードされるＶＰ１アミノ酸配列）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質をコードする配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに列挙されるＣＡＶゲノム配列によりコードされるＶＰ１分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに列挙されるＣＡＶゲノム配列によりコードされるＶＰ２分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに列挙されるＣＡＶゲノム配列によりコードされるアポプチン分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに列挙されるＣＡＶゲノム配列によりコードされるＶＰ１分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含まない遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに列挙されるＣＡＶゲノム配列によりコードされるＶＰ２分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含まない遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１～１７のいずれかに列挙されるＣＡＶゲノム配列によりコードされるアポプチン分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含まない遺伝子エレメントを含む。
実施形態において、キメラＣＡＶベクターは、複数の異なるＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）由来の配列を含む複数のポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）を含む。例えば、キメラＣＡＶベクターは、１つのＣＡＶ由来のＶＰ１分子（例えば、ＶＰ１分子、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１分子）及び異なるＣＡＶ由来の、又はそれと類似性を有するＶＰ２分子を含み得る。別の例では、キメラＣＡＶベクターは、１つのＣＡＶ由来の又はそれに類似する第１のＶＰ１分子と、異なるＣＡＶ由来の又はそれに類似する第２のＶＰ１分子とを含み得る。
一部の実施形態において、ＣＡＶベクターは、キメラポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）を含み、例えば、１つのＣＡＶ由来の少なくとも１つの部分（例えば、本明細書に記載されるような）及び異なるＣＡＶ由来の少なくとも１つの部分（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。実施形態では、ＣＡＶベクターは、１つのＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）からのＶＰ１分子の少なくとも１つの部分、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１分子と、異なるＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるような）からのＶＰ１分子の少なくとも１つの部分、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１分子と、を含むキメラＶＰ１分子を含む。実施形態では、キメラＶＰ１分子は、１つのＣＡＶからのＶＰ１ゼリーロールドメイン、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列と、異なるＣＡＶからのＶＰ１アミノ酸部分配列（例えば、本明細書に記載されるような）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列と、を含む。実施形態では、キメラＶＰ１分子は、１つのＣＡＶからのＶＰ１アルギニンリッチ領域、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列と、異なるＣＡＶからのＶＰ１アミノ酸部分配列（例えば、本明細書に記載されるような）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列と、を含む。
実施形態において、ＣＡＶベクターは、１つのＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるとおりの）からのＶＰ２分子、又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ２分子の少なくとも一部分と、異なるＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるとおりの）からのＶＰ２分子、又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ２分子の少なくとも一部分とを含むキメラＶＰ２分子を含む。実施形態において、ＣＡＶベクターは、１つのＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるとおりの）からのアポプチン分子、又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアポプチン分子の少なくとも一部分と、異なるＣＡＶ（例えば、本明細書に記載されるとおりの）からのアポプチン分子、又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアポプチン分子の少なくとも一部分とを含むキメラアポプチン分子を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載されるように、タンデム構築物を使用して産生され得る。ＣＡＶタンデム構築物配列の非限定的な例を、以下の表１４～１６に提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子エレメント構築物（例えば、タンデム構築物）は、表１４～１６のいずれかに列挙されるＣＡＶ遺伝子エレメント配列からの５’ＵＴＲ、反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２コード配列、アポプチンコード配列、ＶＰ１コード配列、３’ＵＴＲ、ＧＣリッチ領域、又はポリＡシグナル配列のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子エレメント構築物（例えば、タンデム構築物）は、表１４～１６のいずれかに列挙されるＣＡＶ遺伝子エレメント配列からのＶＰ１断片（例えば、無開始ＶＰ１断片）、ＶＰ２断片（例えば、無開始ＶＰ２断片）、及び／又はアポプチン断片（例えば、無開始アポプチン断片）のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子エレメント構築物（例えば、タンデム構築物）は、表１４～１６のいずれかに列挙されるトランデム（ｔｒａｎｄｅｍ）構築物配列からのプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）、ＳＶ４０ポリＡ配列、ヘアピン領域、複製起点（例えば、ｐＵＣ起点）、又は耐性遺伝子（例えば、ＡｍｐＲ遺伝子）のうちの１つ以上を含む。
その中に含まれる配列又はサブ配列が本明細書に記載される組成物及び方法において利用され得る（例えば、ＣＡＶベクターを産生するための遺伝子エレメント構築物の一部として、又は、例えば、本明細書に記載されるようなタンデム構築物における遺伝子エレメント配列として、ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントを形成するために）、さらなる例示的なＣＡＶゲノム配列は、以下の表１７に列挙される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列由来の５’ＵＴＲ、反復領域、ＣＡＡＴシグナル、ＴＡＴＡボックス、ＶＰ２コード配列、アポプチンコード配列、ＶＰ１コード配列、３’ＵＴＲ、ＧＣリッチ領域、若しくはポリＡシグナル配列、又はそれに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）を含む遺伝子エレメントを含む。
一部の実施形態において、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列によってコードされるＶＰ１分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列によってコードされるＶＰ２分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列によってコードされるアポプチン分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子エレメントを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列によってコードされるＶＰ１分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含まない遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列によってコードされるＶＰ２分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含まない遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、表１７に列挙されるＣＡＶゲノム配列によってコードされるアポプチン分子に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含まない遺伝子エレメントを含む。
ＶＰ１分子
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部を含む。一般に、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶＶＰ１タンパク質）の構造特徴及び／又は活性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ１タンパク質）と比べて短縮を含む。ＶＰ１分子は、例えば、タンパク質性外部（例えば、本明細書に記載されるような）、例えば、キャプシドを形成するために、他のＶＰ１分子に結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、核酸分子（例えば、本明細書に記載される遺伝子エレメント）を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、複数のＶＰ１分子は、例えば、タンパク質性外部を形成するために、多量体を形成し得る。一部の実施形態では、多量体は、ホモ多量体であってもよい。他の実施形態では、多量体は、ヘテロ多量体であってもよい。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部を含む。一般に、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶＶＰ１タンパク質）の構造特徴及び／又は活性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶ ＶＰ１タンパク質）と比べて短縮を含む。ＶＰ１分子は、例えば、タンパク質性外部（例えば、本明細書に記載されるような）、例えば、キャプシドを形成するために、他のＶＰ１分子に結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、核酸分子（例えば、本明細書に記載される遺伝子エレメント）を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、複数のＶＰ１分子は、例えば、タンパク質性外部を形成するために、多量体を形成し得る。一部の実施形態では、多量体は、ホモ多量体であってもよい。他の実施形態では、多量体は、ヘテロ多量体であってもよい。
ＶＰ１分子は、一部の実施形態において、以下：アルギニンリッチ領域、例えば、少なくとも６０％の塩基性残基（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の塩基性残基；例えば、６０％～９０％、６０％～８０％、７０％～９０％、若しくは７０～８０％の塩基性残基）を有する領域、及びゼリーロールドメインのうち１つ若しくは複数を含み得る。
アルギニンリッチ領域
アルギニンリッチ領域は、本明細書に記載されるアルギニンリッチ領域配列又は少なくとも６０％、７０％、若しくは８０％の塩基性残基（例えば、アルギニン、リシン、若しくはそれらの組合せ）を含む少なくとも約４０アミノ酸の配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する。
アルギニンリッチ領域は、本明細書に記載されるアルギニンリッチ領域配列又は少なくとも６０％、７０％、若しくは８０％の塩基性残基（例えば、アルギニン、リシン、若しくはそれらの組合せ）を含む少なくとも約４０アミノ酸の配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する。
ゼリーロールドメイン
ゼリーロールドメイン又は領域は、以下の特徴：
（ｉ）ゼリーロールドメインのアミノ酸の少なくとも３０％（例えば、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）が、１つ若しくは複数のβシートの部分である；
（ｉｉ）ゼリーロールドメインの二次構造が、少なくとも４つ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２）のβ鎖を含む；且つ／又は
（ｉｉｉ）ゼリーロールドメインの三次構造が、少なくとも２つ（例えば、２、３、若しくは４つ）のβシートを含む；且つ／又は
（ｉｖ）ゼリーロールドメインが、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、若しくは１０：１のβシート：αヘリックスの比を含む
のうち１つ若しくは複数（例えば、１、２、若しくは３）を含むポリペプチド（例えば、より大きなポリペプチドに含まれるドメイン又は領域）を含む（例えば、それから構成される）。
ゼリーロールドメイン又は領域は、以下の特徴：
（ｉ）ゼリーロールドメインのアミノ酸の少なくとも３０％（例えば、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）が、１つ若しくは複数のβシートの部分である；
（ｉｉ）ゼリーロールドメインの二次構造が、少なくとも４つ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２）のβ鎖を含む；且つ／又は
（ｉｉｉ）ゼリーロールドメインの三次構造が、少なくとも２つ（例えば、２、３、若しくは４つ）のβシートを含む；且つ／又は
（ｉｖ）ゼリーロールドメインが、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、若しくは１０：１のβシート：αヘリックスの比を含む
のうち１つ若しくは複数（例えば、１、２、若しくは３）を含むポリペプチド（例えば、より大きなポリペプチドに含まれるドメイン又は領域）を含む（例えば、それから構成される）。
特定の実施形態では、ゼリーロールドメインは、２つのβシートを含む。
特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）のβシートは、約８（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２）のβ鎖を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）のβシートは、８つのβ鎖を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）のβシートは、７つのβ鎖を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）のβシートは、６つのβ鎖を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）のβシートは、５つのβ鎖を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）のβシートは、４つのβ鎖を含む。
一部の実施形態では、ゼリーロールドメインは、第２βシートに対して逆平行配向の第１βシートを含む。特定の実施形態では、第１βシートは、約４つ（例えば、３、４、５、又は６つ）のβ鎖を含む。特定の実施形態では、第２βシートは、約４つ（例えば、３、４、５、又は６つ）のβ鎖を含む。複数の実施形態では、第１及び第２βシートは、合計で、約８（例えば、６、７、８、９、１０、１１、又は１２）のβ鎖を含む。
特定の実施形態では、ゼリーロールドメインは、キャプシドタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＶＰ１分子）の１成分である。特定の実施形態では、ゼリーロールドメインは、自己集合活性を有する。一部の実施形態では、ゼリーロールドメインを含むポリペプチドは、ゼリーロールドメインを含むポリペプチドの別のコピーに結合する。一部の実施形態では、第１ポリペプチドのゼリーロールドメインは、ポリペプチドの第２コピーのゼリーロールドメインに結合する。
例示的なＶＰ１配列
例示的なＣＡＶ ＶＰ１アミノ酸配列、及び例示的なＶＰ１ドメインの配列としては、表１～１７に列挙されるＶＰ１核酸配列によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、ＶＰ１分子）は、例えば、表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子又はその機能断片に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子のアルギニンリッチ領域に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＰ１分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば、表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子のゼリーロールドメインに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＰ１分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば、表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子、又はその機能断片に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＰ１分子をコードする核酸分子（例えば、遺伝子エレメント）を含む。
例示的なＣＡＶ ＶＰ１アミノ酸配列、及び例示的なＶＰ１ドメインの配列としては、表１～１７に列挙されるＶＰ１核酸配列によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、ＶＰ１分子）は、例えば、表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子又はその機能断片に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子のアルギニンリッチ領域に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＰ１分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば、表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子のゼリーロールドメインに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＰ１分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、例えば、表１～１７のいずれかに記載されるような、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１分子、又はその機能断片に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＰ１分子をコードする核酸分子（例えば、遺伝子エレメント）を含む。
一部の実施形態では、１つ以上のＣＡＶ ＶＰ１サブ配列は、アルギニン（Ａｒｇ）リッチドメイン及び／若しくはゼリーロールドメイン（例えば、表１～１７のいずれかに列挙される）、又はそれに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列の１つ以上を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、異なるＣＡＶからの複数のサブ配列（例えば、本明細書の任意の表に列挙されるＣＡＶサブ配列から選択される、アルギニンリッチ領域配列及び／又はゼリーロールドメイン配列などのＶＰ１サブ配列の任意の組み合わせ）を含む。
一部の実施形態では、ＶＰ１分子は、例えば、本明細書に記載される（例えば、表１Ａ、１Ｂ、又は１７に列挙される）野生型ＶＰ１タンパク質と比較して、少なくとも１つの差異（例えば、突然変異、化学修飾、又はエピジェネティック変化）を含む。
遺伝子エレメント
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えばＣＡＶカプシドタンパク質、例えばＶＰ１分子を含む、タンパク質性外部に閉じ込められた遺伝子エレメント）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴のうち１つ若しくは複数を有する：宿主細胞のゲノムと実質的に相互作用しない、エピソーム核酸である、一本鎖ＤＮＡである、環状である、約１～１０ｋｂである、細胞の核内に存在する、内在性タンパク質によって結合され得る、宿主又は標的細胞の遺伝子、活性、若しくは機能をターゲティングするポリペプチド若しくは核酸（例えば、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などのエフェクターを産生する及び／又はコード化する。一実施形態では、遺伝子エレメントは、実質的に非相互作用性ＤＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、パッケージングシグナル、例えば、本明細書に記載のタンパク質結合配列、例えば、カプシドタンパク質に結合する配列を含む。一部の実施形態では、パッケージングシグナルは、配列番号１７の核酸配列を含む。一部の実施形態では、パッケージング又はキャプシド結合配列の外部で、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ核酸配列に対して７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の配列同一性を有し、例えば、本明細書に、例えば表１～１７のいずれかに記載されるＣＡＶ核酸配列に対して７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の配列同一性を有する。一部の実施形態では、パッケージング又はキャプシド結合配列の外部で、遺伝子エレメントは、ＣＡＶ核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、若しくは１００個未満の連続したヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、遺伝子エレメントは、プロモーター配列と、治療用エフェクターをコード化する配列と、キャプシド結合タンパク質と、を含む環状の一本鎖ＤＮＡである。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメント（例えばＣＡＶカプシドタンパク質、例えばＶＰ１分子を含む、タンパク質性外部に閉じ込められた遺伝子エレメント）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴のうち１つ若しくは複数を有する：宿主細胞のゲノムと実質的に相互作用しない、エピソーム核酸である、一本鎖ＤＮＡである、環状である、約１～１０ｋｂである、細胞の核内に存在する、内在性タンパク質によって結合され得る、宿主又は標的細胞の遺伝子、活性、若しくは機能をターゲティングするポリペプチド若しくは核酸（例えば、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などのエフェクターを産生する及び／又はコード化する。一実施形態では、遺伝子エレメントは、実質的に非相互作用性ＤＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、パッケージングシグナル、例えば、本明細書に記載のタンパク質結合配列、例えば、カプシドタンパク質に結合する配列を含む。一部の実施形態では、パッケージングシグナルは、配列番号１７の核酸配列を含む。一部の実施形態では、パッケージング又はキャプシド結合配列の外部で、遺伝子エレメントは、野生型ＣＡＶ核酸配列に対して７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の配列同一性を有し、例えば、本明細書に、例えば表１～１７のいずれかに記載されるＣＡＶ核酸配列に対して７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の配列同一性を有する。一部の実施形態では、パッケージング又はキャプシド結合配列の外部で、遺伝子エレメントは、ＣＡＶ核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、若しくは１００個未満の連続したヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、遺伝子エレメントは、プロモーター配列と、治療用エフェクターをコード化する配列と、キャプシド結合タンパク質と、を含む環状の一本鎖ＤＮＡである。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、２０ｋｂ未満（例えば、約１９ｋｂ、１８ｋｂ、１７ｋｂ、１６ｋｂ、１５ｋｂ、１４ｋｂ、１３ｋｂ、１２ｋｂ、１１ｋｂ、１０ｋｂ、９ｋｂ、８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ未満）の長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、独立に、又は加えて、１０００ｂ超（例えば、少なくとも約１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ以上）の長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約２．５～４．６、２．８～４．０、３．０～３．８、又は３．２～３．７ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約１．５～２．０、１．５～２．５、１．５～３．０、１．５～３．５、１．５～３．８、１．５～３．９、１．５～４．０、１．５～４．５、又は１．５～５．０ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約２．０～２．５、２．０～３．０、２．０～３．５、２．０～３．８、２．０～３．９、２．０～４．０、２．０～４．５、又は２．０～５．０ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約２．５～３．０、２．５～３．５、２．５～３．８、２．５～３．９、２．５～４．０、２．５～４．５、又は２．５～５．０ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメ５ントは、約３．０～５．０、３．５～５．０、４．０～５．０、又は４．５～５．０ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約１．５～２．０、２．０～２．５、２．５～３．０、３．０～３．５、３．１～３．６、３．２～３．７、３．３～３．８、３．４～３．９、３．５～４．０、４．０～４．５ｋｂ、又は４．５～５．０ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約３．６～３．９ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約２．８～２．９ｋｂの長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約２．０～３．２ｋｂの長さを有する。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載の特徴、例えば、実質的に非病原性のタンパク質をコード化する配列、タンパク質結合配列、調節核酸をコード化する１つ又は複数の配列、１つ又は複数の調節配列、複製タンパク質をコード化する１つ又は複数の配列、及び他の配列のうちの１つ又は複数を含む。
実施形態では、遺伝子エレメントは、二本鎖環状ＤＮＡから産生される（例えば、インビトロ環状化により産生される）。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、二本鎖環状ＤＮＡからのローリングサークル複製により産生される。実施形態では、ローリングサークル複製は、細胞（例えば、宿主細胞、例えば鳥類細胞（例えばＭＤＣＣ細胞）、又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ａ５４９細胞、若しくはＪｕｒｋａｔ細胞）中で起こる。実施形態では、遺伝子エレメントは、細胞中のローリングサークル複製により指数関数的に増幅し得る。実施形態では、遺伝子エレメントは、細胞中のローリングサークル複製により線形増幅し得る。実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡ又は遺伝子エレメントは、細胞中のローリングサークル複製により、初期量の少なくとも２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１８、若しくは１０２４倍以上を産生することができる。実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡは、例えば、本明細書に記載の通り、細胞内に導入された。
一部の実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡ及び／又は遺伝子エレメントは、１つ又は複数の細菌プラスミドエレメント（例えば、細菌複製起点若しくは選択マーカー、例えば、細菌耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含まない。一部の実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡ及び／又は遺伝子エレメントは、細菌プラスミドバックボーンを含まない。
ある実施形態では、本発明は、（ｉ）実質的に非病原性の外部タンパク質と、（ｉｉ）実質的に非病原性の外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸と、をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を含む遺伝子エレメントを含む。こうした実施形態では、遺伝子エレメントは、ネイティブウイルス配列（例えば、本明細書に記載される、例えばネイティブＣＡＶ配列）と比較して、ヌクレオチド配列のいずれか１つに対し少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する１つ若しくは複数の配列を含み得る。
タンパク質結合配列
多くのウイルスによって使用される戦略は、ウイルスキャプシドタンパク質が、そのゲノム内の特定のタンパク結合配列を認識することである。例えば、酵母のＬ－Ａウイルスなどの非分節型ゲノムを有するウイルスの場合、ゲノムの５’末端に二次構造（ステムループ）と特定の配列があり、その両方がウイルスキャプシドタンパク質との結合に使用される。しかし、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（インフルエンザ）、ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅ）及びアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）など、分節型ゲノムを有するウイルスは、ゲノムセグメントの各々をパッケージングする必要がある。一部のウイルスは、ウイルスがそれぞれゲノム分子の１つを含有するのを促進するために、セグメントの相補性領域を使用する。他のウイルスは、様々なセグメントの各々に対して特定の結合部位を有する。例えば、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｆｅｂ；２０（１）：１１４－１２０；及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３），７７（２４），１３０３６－１３０４１を参照されたい。
多くのウイルスによって使用される戦略は、ウイルスキャプシドタンパク質が、そのゲノム内の特定のタンパク結合配列を認識することである。例えば、酵母のＬ－Ａウイルスなどの非分節型ゲノムを有するウイルスの場合、ゲノムの５’末端に二次構造（ステムループ）と特定の配列があり、その両方がウイルスキャプシドタンパク質との結合に使用される。しかし、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（インフルエンザ）、ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅ）及びアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）など、分節型ゲノムを有するウイルスは、ゲノムセグメントの各々をパッケージングする必要がある。一部のウイルスは、ウイルスがそれぞれゲノム分子の１つを含有するのを促進するために、セグメントの相補性領域を使用する。他のウイルスは、様々なセグメントの各々に対して特定の結合部位を有する。例えば、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｆｅｂ；２０（１）：１１４－１２０；及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３），７７（２４），１３０３６－１３０４１を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質性外部に含まれるタンパク質（例えば、カプシドタンパク質、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）に結合するタンパク質結合配列をコードする。一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、遺伝子エレメントをタンパク質性外部にパッケージングすることを容易にする。一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質性外部に含まれるタンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、核酸配列
を有するタンパク質結合配列、又はその逆相補体を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載されるような、例えば表１～１７のいずれかに記載されるような、ＣＡＶ配列の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はＧＣリッチドメインに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するタンパク質結合配列を含む。
を有するタンパク質結合配列、又はその逆相補体を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載されるような、例えば表１～１７のいずれかに記載されるような、ＣＡＶ配列の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はＧＣリッチドメインに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するタンパク質結合配列を含む。
５’ＵＴＲ領域
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような核酸分子（例えば、遺伝子エレメント、遺伝子エレメント構築物、又は遺伝子エレメント領域）は、例えば、本明細書に記載されるような５’ＵＴＲ配列（例えば、表１～１６のいずれかに、又は表１７に列挙されるＣＡＶゲノムの５’ＵＴＲ）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような核酸分子（例えば、遺伝子エレメント、遺伝子エレメント構築物、又は遺伝子エレメント領域）は、例えば、本明細書に記載されるような５’ＵＴＲ配列（例えば、表１～１６のいずれかに、又は表１７に列挙されるＣＡＶゲノムの５’ＵＴＲ）、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。
実施形態において、５’ＵＴＲ配列は、表１Ａに列挙される５’ＵＴＲの核酸配列、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、表１Ａに列挙される５’ＵＴＲに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態において、５’ＵＴＲ配列は、表１Ｂに列挙される５’ＵＴＲの核酸配列、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、表１Ｂに列挙される５’ＵＴＲに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態において、５’ＵＴＲ配列は、表１７に列挙されるＣＡＶゲノムの５’ＵＴＲの核酸配列、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、表１７に列挙されるＣＡＶゲノムの５’ＵＴＲに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
ＧＣリッチ領域
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のＧＣ含有量を有する核酸配列（例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００ヌクレオチドの長さを有する連続配列）を含む。実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、本明細書に記載されるＣＡＶゲノムのＧＣリッチ配列（例えば、表１Ａ若しくは１Ｂ、又は表１７に列挙される）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有する核酸配列（例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００ヌクレオチドの長さを有する連続配列）を含む。一部の実施形態では、ＧＣリッチ領域は、ヘアピンを形成する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のＧＣ含有量を有する核酸配列（例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００ヌクレオチドの長さを有する連続配列）を含む。実施形態では、遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント構築物は、本明細書に記載されるＣＡＶゲノムのＧＣリッチ配列（例えば、表１Ａ若しくは１Ｂ、又は表１７に列挙される）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有する核酸配列（例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００ヌクレオチドの長さを有する連続配列）を含む。一部の実施形態では、ＧＣリッチ領域は、ヘアピンを形成する。
エフェクター
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、エフェクター、例えば、機能的エフェクター、例えば、内因性エフェクター又は外因性エフェクター、例えば、治療用エフェクターをコードする１つ以上の配列を含み得る。一部の実施形態では、エフェクターは、ポリペプチド又は核酸である。一部の実施形態では、エフェクターは、以下の特性のうちの１つ以上を有する：（ｉ）ヒト細胞における発現のために最適化されたコドン、（ｉｉ）ヒトポリペプチド若しくは核酸である、（ｉｉｉ）ヒトポリペプチド若しくは核酸に結合する、又は（ｉｖ）ヒト細胞における活性を有する、例えばヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／若しくはレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる）。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、エフェクター、例えば、機能的エフェクター、例えば、内因性エフェクター又は外因性エフェクター、例えば、治療用エフェクターをコードする１つ以上の配列を含み得る。一部の実施形態では、エフェクターは、ポリペプチド又は核酸である。一部の実施形態では、エフェクターは、以下の特性のうちの１つ以上を有する：（ｉ）ヒト細胞における発現のために最適化されたコドン、（ｉｉ）ヒトポリペプチド若しくは核酸である、（ｉｉｉ）ヒトポリペプチド若しくは核酸に結合する、又は（ｉｖ）ヒト細胞における活性を有する、例えばヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／若しくはレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる）。
エフェクターは、例えば、酵素活性、遺伝子発現、細胞シグナル伝達、及び細胞若しくは器官機能を増大又は低減するなど、生物活性を調節することができる。エフェクター活性はまた、調節タンパク質と結合して、転写又は翻訳などの調節因子の活性を調節することも含み得る。エフェクター活性は、さらにアクチベーター又はインヒビター機能も含み得る。例えば、エフェクターは、酵素活性を誘導し得る。一部の実施形態では、エフェクターは酵素を含む。一部の実施形態では、外因性エフェクターは、感染性因子（例えば、ウイルス又は細菌）由来の抗原を含む。一部の実施形態では、エフェクターは、細胞傷害性又は細胞溶解性のＲＮＡ又はタンパク質である。一部の実施形態では、機能的核酸は非コードＲＮＡである。一部の実施形態では、機能的核酸はコードＲＮＡである。一部の実施形態では、エフェクターは、酵素中の基質親和性増大をトリガーし、例えば、フルクトース２，６－ビスホスフェートは、ホスホフルクトキナーゼ１を活性化して、インスリンに応答する糖分解の速度を高める。別の例では、エフェクターは、基質が受容体に結合するのを阻害して、その活性化を遮断することができ、例えば、ナルトレキソン及びナロキソンは、オピオイド受容体に、それらを活性化することなく結合して、受容体が、オピオイドに結合する能力を遮断する。エフェクター活性はまた、タンパク質安定性／分解及び／又は転写物安定性／分解の調節も含み得る。例えば、タンパク質は、分解のためにそれらをマーキングするタンパク質上の、ポリペプチド補因子、ユビキチンにより、分解の目的でターゲティングされ得る。別の例では、エフェクターは、酵素の活性部位を遮断することにより酵素活性を阻害し、例えば、メトトレキサートは、テトラヒドロ葉酸の構造類似体、すなわち、天然基質の１０００倍超強度にジヒドロ葉酸レダクターゼに結合して、ヌクレオチド塩基合成を阻害する酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの補酵素である。
一部の実施形態では、エフェクターをコード化する配列は、遺伝子エレメント内の一部であり、例えば本明細書に記載の挿入部位に挿入され得る。実施形態では、エフェクターをコード化する配列は、遺伝子エレメント内のノンコーディング領域、例えば、オープンリーディングフレームの３’側及び遺伝子エレメントのＧＣリッチ領域の５’側に位置するノンコーディング領域、ＴＡＴＡボックス上流の５’ノンコーディング領域、５’ＵＴＲ、ポリ－Ａシグナル３’ノンコーディング領域下流、又はＧＣリッチ領域上流の３’ノンコーディング領域に挿入される。一部の実施形態では、エフェクターをコードする配列は、オープンリーディングフレーム（例えば、本明細書に記載のＯＲＦ、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はアポプチン）の一部又は全部を置き換える。
一部の実施形態では、エフェクターをコードする配列は、１００～２０００、１００～１０００、１００～５００、１００～２００、２００～２０００、２００～１０００、２００～５００、５００～１０００、５００～２０００、又は１０００～２０００年ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、エフェクターをコードする配列は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、又は２０００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、エフェクターは、例えば、本明細書に記載されるような核酸又はタンパク質ペイロードである。
調節核酸
一部の実施形態では、エフェクターは調節核酸である。調節核酸は、内在性遺伝子及び／又は外性遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、調節核酸は、宿主遺伝子をターゲティングする。調節核酸として、限定はされないが、外性遺伝子とハイブリダイズする核酸（例えば、本明細書の他所に記載するｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外性核酸とハイブリダイズする核酸、ＲＮＡとハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨害する核酸、ＲＮＡ翻訳を妨害する核酸、分解のターゲティングなどによってＲＮＡを安定化する、若しくは不安定化する核酸、並びにＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられる。実施形態では、調節核酸は、ｍｉＲＮＡをコード化する。一部の実施形態では、調節核酸は、野生型ＣＡＶに対して内在性である。一部の実施形態では、調節核酸は、野生型ＣＡＶに対して外性である。
一部の実施形態では、エフェクターは調節核酸である。調節核酸は、内在性遺伝子及び／又は外性遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、調節核酸は、宿主遺伝子をターゲティングする。調節核酸として、限定はされないが、外性遺伝子とハイブリダイズする核酸（例えば、本明細書の他所に記載するｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外性核酸とハイブリダイズする核酸、ＲＮＡとハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨害する核酸、ＲＮＡ翻訳を妨害する核酸、分解のターゲティングなどによってＲＮＡを安定化する、若しくは不安定化する核酸、並びにＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられる。実施形態では、調節核酸は、ｍｉＲＮＡをコード化する。一部の実施形態では、調節核酸は、野生型ＣＡＶに対して内在性である。一部の実施形態では、調節核酸は、野生型ＣＡＶに対して外性である。
一部の実施形態では、調節核酸は、典型的に５～５００塩基対（具体的なＲＮＡ構造に応じて、例えば、ｍｉＲＮＡ５～３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２００～５００ｂｐ）を含有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含み、細胞内の発現された標的遺伝子中のコード配列と同一（若しくは相補的な）又はほぼ同一の（若しくは実質的に相補的な）核酸塩基配列、或いは細胞内の発現された標的遺伝子をコード化する配列を有し得る。
一部の実施形態では、調節核酸は、核酸配列、例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコード化する核酸を含む。ｇＲＮＡの短い合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するために必要な「スカフォールド」配列と、ゲノム標的に対するユーザ設定の約２０ヌクレオチドのターゲティング配列から構成され得る。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド）の長さを有するように設計され、標的化核酸配列に対して相補的である。カスタムｇＲＮＡ生成装置及びアルゴリズムが、効果的なガイドＲＮＡの設計で使用するために市販されている。また、遺伝子編集は、キメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いて達成されており、これは、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、且つ、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合する）と少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のためにターゲティングされる配列にヌクレアーゼを誘導する）の両方を含有する操作（合成）シングルＲＮＡ分子である。また、化学的に修飾されたｓｇＲＮＡも、ゲノム編集に効果的であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
調節核酸は、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はリプレッサーに隣接する、若しくはその内部の配列）を認識するｇＲＮＡを含む。
いくつかの調節核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスによって遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５～５０塩基対（例えば、約１８～２５塩基対）を含有し、且つ細胞内の発現された標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有する、ＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子として、限定はされないが、以下：低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックス、及びダイサー基質が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書及び同第８，５１３，２０７号明細書）。
長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチド超の非タンパク質コード転写物として定義される。この幾分任意の制限によって、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び他の低分子ＲＮＡなどの小さい調節ＲＮＡからｌｎｃＲＮＡを区別する。一般に、ｌｎｃＲＮＡの大部分（約７８％）は、組織特異的として特徴付けられる。隣接するタンパク質コード遺伝子に対して反対方向に転写される分岐ｌｎｃＲＮＡ（哺乳動物ゲノムの全ｌｎｃＲＮＡの相当の割合、約２０％を占める）は、恐らく隣接遺伝子の転写を調節すると考えられる。
遺伝子エレメントは、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全部若しくは断片に対して実質的に相補的、若しくは完全に相補的な配列を有する調節核酸をコード化する。調節核酸は、特定の遺伝子の新生核ＲＮＡ転写物が転写のためのｍＲＮＡへと成熟するのを阻止するために、イントロンとエキソンの間の境界で配列を補完することができる。特定の遺伝子に相補的な調節核酸は、その遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズして、その翻訳を阻止する。アンチセンス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその誘導体若しくはハイブリッドであってよい。
目的の転写物とハイブリダイズする調節核酸の長さは、５～３０ヌクレオチド、約１０～３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチドであってよい。標的転写物に対する調節核酸の同一性の割合は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であるべきである。
遺伝子エレメントは、調節核酸、例えば、標的遺伝子の約５～約２５の連続ヌクレオチドと同一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコード化し得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡをターゲティングし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０～７０％（約３０～６０％、約４０～６０％、又は約４５％～５５％）のＧＣ含有率を含み、例えば、標準ＢＬＡＳＴ検索により決定される場合、それを導入しようとする哺乳動物のゲノム内の標的以外のいずれのヌクレオチド配列に対しても高い同一性（％）を持たない。
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ １１６：２８１－２９７，２００４）のプロセシング経路中の中間体と類似する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、その逆も同様である（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９：１３２７－１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：４３８－４４２，２００３）。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡとは異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。その代わり、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解によりタンパク質産生を低減する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：４０３４－４０３９，２００６）。既知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位をターゲティングすると思われる（Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８－１３，２００６；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３３：７６９－７７３，２００５）。この領域は、シード領域として知られる。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるため、外性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対してシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：１９９－２０４，２００６。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強度の下方制御を付与する（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：４３８－４４２，２００３）。
既知のｍｉＲＮＡ配列表は、中でも、ウェルカム・トラスト・サンガー・インスティチュート（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ペン・センター・フォア・バイオインフォマティクス（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、メモリアル・スローン。ケタリング・癌センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、及び欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などの研究機関により維持されているデータベースに見出すことができる。既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及びコグネイト結合部位も関連文献に十分に記載されている。ＲＮＡｉ分子は、当技術分野で公知の技術によって容易に設計及び作製される。加えて、有効且つ特異的な配列モチーフを見出す可能性を高める計算ツールもある（Ｌａｇａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０１５，１２６９：３９３－４１２）。
調節核酸は、遺伝子によりコード化されるＲＮＡの発現を調節することができる。一部の実施形態では、複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有しているため、調節核酸は、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスをターゲティングするように設計することができる。一部の実施形態では、調節核酸は、様々な遺伝子標的の間で共有されるか、又は特定の遺伝子標的についてユニークな配列に対して相補性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、調節核酸は、いくつかの遺伝子の間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域をターゲティングして、これにより、遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子イソ型、スプライス変異体、突然変異型遺伝子など）をターゲティングするように設計することができる。一部の実施形態では、調節核酸は、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に対してユニークな配列をターゲティングするように設計することができる。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、１つ又は複数の遺伝子の発現を調節する調節核酸をコード化する１つ又は複数の配列を含んでもよい。
一部の実施形態では、本明細書の他の箇所に記載するｇＲＮＡを、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ系の一環として使用する。遺伝子編集の目的で、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含有するようにＣＡＶベクターを設計してもよい；例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３０８を参照されたい。一般に、ｇＲＮＡの少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、Ｃａｓ９媒介ＤＮＡ切断を可能にし；Ｃｐｆ１の場合、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが必要である。
治療用エフェクター（例えば、ペプチド若しくはポリペプチド）
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、治療用発現配列、例えば、治療用ペプチド若しくはポリペプチドをコード化する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコード化する配列を含む。治療用タンパク質のいくつかの例としては、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体（例えば、少なくとも重鎖又は軽鎖をコード化する１つ又は複数のポリペプチド）、転写因子、受容体（例えば、膜受容体）、リガンド、膜輸送体、分泌タンパク質、ペプチド、担体タンパク質、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、又はそれらの構成体が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、治療用発現配列、例えば、治療用ペプチド若しくはポリペプチドをコード化する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコード化する配列を含む。治療用タンパク質のいくつかの例としては、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体（例えば、少なくとも重鎖又は軽鎖をコード化する１つ又は複数のポリペプチド）、転写因子、受容体（例えば、膜受容体）、リガンド、膜輸送体、分泌タンパク質、ペプチド、担体タンパク質、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、又はそれらの構成体が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ペプチド、例えば、治療用ペプチドをコード化する配列を含む。ペプチドは、直鎖状又は分岐状であってもよい。ペプチドは、約５～約５００アミノ酸、約１５～約４００アミノ酸、約２０～約３２５アミノ酸、約２５～約２５０アミノ酸、約５０～約２００アミノ酸、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有する。ペプチドのいくつかの例には、蛍光タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生理活性ペプチドからの合成又は類似体ペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、標的化又は細胞傷害性ペプチド、分解又は自己破壊ペプチド、及び分解又は自己破壊ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の本発明において有用なペプチドには、抗原結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディも含まれる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３参照）。そのような抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、又は細胞小器官内抗原に結合し得る。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、小ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体をコードする配列を含む。そのような治療薬は一般に、約５，０００グラム／モル未満の分子量、約２，０００グラム／モル未満の分子量、約１，０００グラム／モル未満の分子量、約５００グラム／モル未満の分子量、並びにそのような化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態を有する。そのような治療薬には、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子、及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得るが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、特定の位置、組織、又は細胞を標的とすることができるリガンドに連結されたポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、治療用発現配列によってコード化されるポリペプチドは、上記のいずれかのその機能変異体若しくは断片、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって本明細書の表中に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質であり得る。
一部の実施形態では、治療用発現配列は、上記のいずれかに結合する抗体若しくは抗体断片、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって本明細書の表中に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質に対する抗体をコード化し得る。本明細書の用語「抗体」は広義で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。「抗体断片」は、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖を含み、抗原に結合する分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦＶ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な細胞内ポリペプチドエフェクター
一部の実施形態では、エフェクターは、サイトゾルポリペプチド又はサイトゾルペプチドを含む。一部の実施形態では、エフェクターは、ＤＰＰ－４阻害剤、ＧＬＰ－１シグナル伝達のアクチベーター、又は好中球エラスターゼの阻害剤であるサイトゾルペプチドを含む。一部の実施形態では、エフェクターは、成長因子若しくはその受容体（例えば、ＦＧＦ受容体、例えば、ＦＧＦＲ３）のレベル又は活性を増加させる。一部の実施形態では、エフェクターは、ｎ－ｍｙｃ相互作用タンパク質活性の阻害剤（例えば、ｎ－ｍｙｃ相互作用タンパク質阻害剤）；ＥＧＦＲ活性の阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）；ＩＤＨ１及び／又はＩＤＨ２活性の阻害剤（例えば、ＩＤＨ１阻害剤及び／又はＩＤＨ２阻害剤）；ＬＲＰ５及び／又はＤＫＫ２活性の阻害剤（例えば、ＬＲＰ５及び／又はＤＫＫ２阻害剤）；ＫＲＡＳ活性の阻害剤；ＨＴＴ活性のアクチベーター；若しくはＤＰＰ－４活性の阻害剤（例えば、ＤＰＰ－４阻害剤）を含む。
一部の実施形態では、エフェクターは、サイトゾルポリペプチド又はサイトゾルペプチドを含む。一部の実施形態では、エフェクターは、ＤＰＰ－４阻害剤、ＧＬＰ－１シグナル伝達のアクチベーター、又は好中球エラスターゼの阻害剤であるサイトゾルペプチドを含む。一部の実施形態では、エフェクターは、成長因子若しくはその受容体（例えば、ＦＧＦ受容体、例えば、ＦＧＦＲ３）のレベル又は活性を増加させる。一部の実施形態では、エフェクターは、ｎ－ｍｙｃ相互作用タンパク質活性の阻害剤（例えば、ｎ－ｍｙｃ相互作用タンパク質阻害剤）；ＥＧＦＲ活性の阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）；ＩＤＨ１及び／又はＩＤＨ２活性の阻害剤（例えば、ＩＤＨ１阻害剤及び／又はＩＤＨ２阻害剤）；ＬＲＰ５及び／又はＤＫＫ２活性の阻害剤（例えば、ＬＲＰ５及び／又はＤＫＫ２阻害剤）；ＫＲＡＳ活性の阻害剤；ＨＴＴ活性のアクチベーター；若しくはＤＰＰ－４活性の阻害剤（例えば、ＤＰＰ－４阻害剤）を含む。
一部の実施形態では、エフェクターは、調節細胞内ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、調節細胞内ポリペプチドは、標的細胞に対して内在性である１つ又は複数の分子（例えば、タンパク質又は核酸）に結合する。一部の実施形態では、調節細胞内ポリペプチドは、標的細胞に対して内在性である１つ又は複数の分子（例えば、タンパク質又は核酸）のレベル又は活性を増加させる。一部の実施形態では、調節細胞内ポリペプチドは、標的細胞に対して内在性である１つ又は複数の分子（例えば、タンパク質又は核酸）のレベル又は活性を減少させる。
例示的な分泌ポリペプチドエフェクター
例示的な分泌治療薬が、例えば、以下の表で本明細書に記載される。
例示的な分泌治療薬が、例えば、以下の表で本明細書に記載される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ａのサイトカイン、又はその機能変異体、例えば、ホモログ（例えば、オーソログ若しくはパラログ）又はその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって、表５０に列挙されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、同じ条件下で同じ受容体への対応する野生型サイトカインのＫｄよりも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％以下高い若しくは低いＫｄを有する対応するサイトカイン受容体に結合する。一部の実施形態では、エフェクターは、第１の領域（例えば、表１８Ａのサイトカインポリペプチド又は機能変異体若しくは断片）と、第２の異種領域とを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１の領域は、表１８Ａの第１のサイトカインポリペプチドである。一部の実施形態では、第２の領域は、表１８Ａの第２のサイトカインポリペプチドであり、ここで第１及び第２のサイトカインポリペプチドは、野生型細胞中で互いにサイトカインヘテロ二量体を形成する。一部の実施形態では、表１８Ａのポリペプチド又はその機能変異体は、シグナル配列、例えば、エフェクターに対して内在性であるシグナル配列、又は異種シグナル配列を含む。一部の実施形態では、表１８Ａのサイトカイン、又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、本明細書に記載の疾患又は障害の治療に使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ａのサイトカインに結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ａのサイトカイン受容体に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、抗体分子は、シグナル配列を含む。
例示的なサイトカイン及びサイトカイン受容体は、例えば、その中の表Ｉを含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｋｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ（ｆｒｏｍ ＩＬ－１ ｔｏ ＩＬ－３８），ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β，ａｎｄ ＴＮＦ－α：Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ”Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６ Ｖｏｌｕｍｅ １３８，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ９８４－１０１０に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｂのホルモン、又はその機能変異体、例えば、ホモログ（例えば、オーソログ若しくはパラログ）又はその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって、表５１に列挙されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、同じ条件下で同じ受容体への対応する野生型ホルモンのＫｄよりも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％以下高いＫｄを有する対応する受容体に結合する。一部の実施形態では、表１８Ｂのポリペプチド又はその機能変異体は、シグナル配列、例えば、エフェクターに対して内在性であるシグナル配列、又は異種シグナル配列を含む。一部の実施形態では、表１８Ｂのホルモン又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、本明細書に記載の疾患又は障害の治療のために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｂのホルモンに結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｂのホルモン受容体に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、抗体分子は、シグナル配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｃの成長因子、又はその機能変異体、例えば、ホモログ（例えば、オーソログ若しくはパラログ）又はその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって、表５２に列挙されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、同じ条件下で同じ受容体への対応する野生型成長因子のＫｄよりも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％以下高いＫｄを有する対応する受容体に結合する。一部の実施形態では、表１８Ｃのポリペプチド又はその機能変異体は、シグナル配列、例えば、エフェクターに対して内在性であるシグナル配列、又は異種シグナル配列を含む。一部の実施形態では、表１８Ｃの成長因子又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、本明細書に記載の疾患又は障害の治療のために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｃの成長因子に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｃの成長因子受容体に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、抗体分子は、シグナル配列を含む。
例示的な成長因子及び成長因子受容体は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｆｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｆｒｅｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１８Ｄのポリペプチド、又はその機能変異体、例えば、ホモログ（例えば、オーソログ若しくはパラログ）又はその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって、表５３に列挙されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、例えば、野生型タンパク質よりも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％以下低い割合で、対応する野生型タンパク質と同じ反応を触媒する。一部の実施形態では、表１８Ｄのポリペプチド又はその機能変異体は、シグナル配列、例えば、エフェクターに対して内在性であるシグナル配列、又は異種シグナル配列を含む。一部の実施形態では、表１８Ｄのポリペプチド、又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、表１８Ｄの疾患又は障害の治療のために使用される。
例示的なタンパク質補充治療薬
例示的なタンパク質補充治療薬は、例えば、以下の表で本明細書に記載される。
例示的なタンパク質補充治療薬は、例えば、以下の表で本明細書に記載される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１９Ａの酵素、又はその機能変異体、例えば、ホモログ（例えば、オーソログ若しくはパラログ）又はその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって、表５４に列挙されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、例えば、野生型タンパク質よりも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％以下低い割合で、対応する野生型タンパク質と同じ反応を触媒する。一部の実施形態では、表１９Ａの酵素又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、表１９Ａの疾患又は障害の治療のために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ウリジン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼ又はその機能変異体を標的細胞、例えば、肝臓細胞に送達するために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＯＣＡ１又はその機能変異体を標的細胞、例えば、網膜細胞に送達するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、又はその機能変異体を含む。一部の実施形態では、エリスロポエチン、又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、赤血球生成を刺激するために使用される。一部の実施形態では、エリスロポエチン、又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、疾患又は障害、例えば、貧血の治療のために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＥＰＯ又はその機能変異体を、標的細胞、例えば、赤血球に送達させるために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、表１９Ｂのポリペプチド、又はその機能変異体、例えば、ホモログ（例えば、オーソログ若しくはパラログ）又はその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって、表１９Ｂに列挙されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、表１９Ｂのポリペプチド、又はその機能変異体をコード化するＣＡＶベクターは、表１９Ｂの疾患又は障害の治療のために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＳＭＮ又はその機能変異体を、標的細胞、例えば、脊髄及び／又は運動ニューロンの細胞に送達させるために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、マイクロジストロフィンを標的細胞、例えば、筋細胞に送達させるために使用される。
例示的なマイクロジストロフィンは、Ｄｕａｎ，“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＡＶ Ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ ＴｈｅｒａｐｙＦｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｏｃｔ ３；２６（１０）：２３３７－２３５６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．０７．０１１．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊｕｌ １７に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、凝固因子、例えば、本明細書のいずれかの表（例えば表１９Ａ又は表１９Ｂ）に列挙される凝固因子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、変異すると、リソソーム蓄積症を引き起こすタンパク質、例えば、本明細書のいずれかの表（例えば表１９Ａ又は表１９Ｂ）に列挙されるタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、輸送タンパク質、例えば、本明細書のいずれかの表（例えば表１９Ａ又は表１９Ｂ）に列挙される輸送タンパク質を含む。
一部の実施形態では、野生型タンパク質の機能変異体は、野生型タンパク質の１つ若しくは複数の活性を有するタンパク質を含み、例えば、機能変異体は、例えば、野生型タンパク質より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％低い割合で、対応する野生型タンパク質と同じ反応を触媒する。一部の実施形態では、機能変異体は、例えば、同じ条件下の同じ結合パートナーに対して、対応する野生型タンパク質のＫｄより多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％高いＫｄで、野生型タンパク質によって結合されるものと同じ結合パートナーに結合する。一部の実施形態では、機能変異体は、野生型ポリペプチドのそれと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、機能変異体は、対応する野生型タンパク質のホモログ（例えば、オーソログ又はパラログ）を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合物は、対応する野生型タンパク質、第２、異種領域に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する第１領域を含む。一部の実施形態では、機能変異体は、対応する野生型タンパク質の断片を含むか、又はそれから構成される。
再生、修復、及び線維化因子
本明細書に記載の治療用ポリペプチドはまた、例えば、表５６に開示されるような成長因子、又はその機能変異体、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって表５６に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質を含む。また、そのような成長因子に対する抗体若しくはその断片、又は再生及び修復を促進するｍｉＲＮＡも含まれる。
本明細書に記載の治療用ポリペプチドはまた、例えば、表５６に開示されるような成長因子、又はその機能変異体、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって表５６に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質を含む。また、そのような成長因子に対する抗体若しくはその断片、又は再生及び修復を促進するｍｉＲＮＡも含まれる。
形質転換因子
本明細書に記載の治療用ポリペプチドはまた、形質転換因子、例えば、繊維芽細胞を分化細胞に形質転換するタンパク質因子、例えば、表５７に開示される因子又はその機能変異体、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって表５７に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質を含む。
本明細書に記載の治療用ポリペプチドはまた、形質転換因子、例えば、繊維芽細胞を分化細胞に形質転換するタンパク質因子、例えば、表５７に開示される因子又はその機能変異体、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって表５７に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質を含む。
細胞再生を刺激するタンパク質
本明細書に記載の治療用ポリペプチドはまた、細胞再生を刺激するタンパク質、例えば、表５８に開示されるタンパク質又はその機能変異体、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって表５８に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質を含む。
本明細書に記載の治療用ポリペプチドはまた、細胞再生を刺激するタンパク質、例えば、表５８に開示されるタンパク質又はその機能変異体、例えば、そのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを参照することによって表５８に開示されるタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６７％、９８％、９９％の同一性を有するタンパク質を含む。
ＳＴＩＮＧモジュレータエフェクター
一部の実施形態では、本明細書に記載の分泌エフェクターは、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳシグナル伝達を調節する。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧモジュレータは、ポリペプチド、例えば、ウイルスポリペプチド又はその機能変異体である。例えば、エフェクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ ａ ｂｏｔｔｌｅ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ ＳＴＩＮＧ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌｕｍｅ ２５，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１４，Ｐａｇｅｓ ６６９－６７９に記載されるＳＴＩＮＧモジュレータ（例えば、阻害剤）を含んでもよい。追加のＳＴＩＮＧモジュレータ（例えば、アクチベータ）は、例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．“ＳＴＩＮＧ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ－ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１５ Ａｕｇ；６４（８）：１０５７－６６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２－０１５－１７１３－５．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｍａｙ １９；Ｂｏｓｅ“ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ：Ｊｅｋｙｌｌ ａｎｄ Ｈｙｄｅ Ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ”Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１７ Ｎｏｖ；１８（１１）：２４５６；及びＦｕ ｅｔ ａｌ．“ＳＴＩＮＧ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃａｎ ｃｕｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ”Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ａｐｒ １５；７（２８３）：２８３ｒａ５２に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載の分泌エフェクターは、ＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳシグナル伝達を調節する。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧモジュレータは、ポリペプチド、例えば、ウイルスポリペプチド又はその機能変異体である。例えば、エフェクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ ａ ｂｏｔｔｌｅ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ ＳＴＩＮＧ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌｕｍｅ ２５，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１４，Ｐａｇｅｓ ６６９－６７９に記載されるＳＴＩＮＧモジュレータ（例えば、阻害剤）を含んでもよい。追加のＳＴＩＮＧモジュレータ（例えば、アクチベータ）は、例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．“ＳＴＩＮＧ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ－ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１５ Ａｕｇ；６４（８）：１０５７－６６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２－０１５－１７１３－５．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｍａｙ １９；Ｂｏｓｅ“ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ：Ｊｅｋｙｌｌ ａｎｄ Ｈｙｄｅ Ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ”Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１７ Ｎｏｖ；１８（１１）：２４５６；及びＦｕ ｅｔ ａｌ．“ＳＴＩＮＧ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃａｎ ｃｕｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ”Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ａｐｒ １５；７（２８３）：２８３ｒａ５２に記載されている。
ペプチドの一部の例として、限定はされないが、蛍光タグ若しくはマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド及び分解若しくは自滅ペプチドが挙げられる。また、本明細書に記載される本発明で有用なペプチドとして、抗原結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照）。こうした抗原結合ペプチドは、サイトゾル抗原、核抗原、又はオルガネラ内抗原に結合し得る。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体をコード化する配列を含む。そのような治療薬は、一般に、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、モル当たり約５００グラム未満の分子量、並びにこのような化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態を有する。このような治療薬としては、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成粒子、及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、特定の場所、組織、又は細胞を標的化することができるリガンドに連結したポリペプチドを含む。
遺伝子編集成分
ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、遺伝子編集システムの成分をコードする１つ以上の遺伝子を含み得る。例示的な遺伝子編集システムとしては、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ジーンライター（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ）、逆転写酵素、エピジェネティック修飾子、リコンビナーゼ、及び転写アクチベーター様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１．７（２０１３）：３９７－４０５に記載され；遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ方法は、例えば、Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ２０１６ Ｏｃｔ；４６：１－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｎａｒｅｐ．２０１６．０７．００４；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４，ｐｐ．１１５－１２４に記載されている。遺伝子編集及び遺伝子書き込みシステムの非限定的な例は、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２０２０／０４７１２４号パンフレット（例えば、そこに開示される任意の配列）及びＡｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、遺伝子編集システムの成分をコードする１つ以上の遺伝子を含み得る。例示的な遺伝子編集システムとしては、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ジーンライター（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ）、逆転写酵素、エピジェネティック修飾子、リコンビナーゼ、及び転写アクチベーター様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１．７（２０１３）：３９７－４０５に記載され；遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ方法は、例えば、Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ２０１６ Ｏｃｔ；４６：１－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｎａｒｅｐ．２０１６．０７．００４；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４，ｐｐ．１１５－１２４に記載されている。遺伝子編集及び遺伝子書き込みシステムの非限定的な例は、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２０２０／０４７１２４号パンフレット（例えば、そこに開示される任意の配列）及びＡｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、非長末端反復（ＬＴＲ）レトロトランスポゾン（例えば、アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）タイプ又は制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）タイプ）由来の１つ以上のエレメントを含む、ジーンライター（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ）をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ジーンライターは、レトロトランスポザーゼを含む。一部の実施形態では、遺伝子ライターは、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写ドメイン、及び／又はエンドヌクレアーゼドメインのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載の遺伝子エレメントによってコードされ得るジーンライター、逆転写酵素、及びリコンビナーゼの例は、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２０２０／０４７１２４号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、初めは、細菌及び古細菌で発見された適応防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連又は「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９若しくはＣｐｆ１）と呼ばれるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて、外来ＤＮＡを切断する。典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいてエンドヌクレアーゼは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ配列をターゲティングする配列特異的なノンコーディング「ガイドＲＮＡ」により、標的ヌクレオチド配列（例えば、ゲノム内で配列編集しようとする部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ－ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。あるクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。ｃｒＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」、典型的には、標的ＤＮＡ配列に対応する約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列を含む。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して、部分的に二本鎖の構造を形成する領域も含有し、これはＲＮａｓｅＩＩＩにより切断されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成される。次に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを指令して、標的ＤＮＡ配列を認識させ、切断させる。標的ＤＮＡ配列は、一般に、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的な「プロトスペーサ隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）に隣接していなければならない；しかし、ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体に出現する。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの遺伝子を含む。例えば、様々な原核生物種から同定されるいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例としては、５’－ＮＧＧ（化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’－ＮＮＡＧＡＡ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’－ＮＧＧＮＧ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）、及び５’－ＮＮＮＧＡＴＴ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰＡＭ部位、例えば、５’－ＮＧＧに結合しており、ＰＡＭ部位（その５’側）から上流の３ヌクレオチド位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば、５’－ＴＴＮと結合している。Ｃｐｆ１はまた、５’－ＣＴＡ ＰＡＭモチーフを認識することができる。Ｃｐｆ１は、４－又は５－ヌクレオチド５’オーバーハングを伴うオフセット又はスタッガー二本鎖切断を導入し、例えば、コード鎖のＰＡＭ部位（その３’側）から下流の１８ヌクレオチドで、且つ相補鎖のＰＡＭ部位から下流の２３ヌクレオチドに位置する５－ヌクレオチドオフセット又はスタッガーカットで標的ＤＮＡを切断することにより、標的ＤＮＡを切断し；こうしたオフセット切断によって生じた５－ヌクレオチドオーバーハングは、平滑末端切断されたＤＮＡでの挿入と比較して、相同組換えによるＤＮＡ挿入による正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１を参照されたい。
様々なＣＲＩＳＰＲ結合（Ｃａｓ）遺伝子をＣＡＶベクターに含有させてもよい。遺伝子の具体的な例は、クラスＩＩシステムからのＣａｓタンパク質をコード化するものであり、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３が挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコード化する遺伝子を含み、これは、多様な原核生物種のいずれに由来するものでもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質をコード化する遺伝子を含み、これは、特定のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択される。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、２つ以上の異なるＣａｓタンパク質をコード化する核酸、又は２つ以上のＣａｓタンパク質を含み、例えば、同じ、類似する若しくは異なるＰＡＭモチーフを含む部位の認識及び修飾を可能にするために、ＣＡＶベクターを細胞、接合子、胚、又は動物に導入してもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９を含む修飾Ｃａｓタンパク質をコード化する遺伝子を含む。
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡによりターゲティングされた特定のＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するが、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが知られており、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の「ニッカーゼ」バージョンは、一本鎖切断しか生成せず；触媒能のないＣａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しない。ｄＣａｓ９をコード化する遺伝子を、エフェクタードメインをコード化する遺伝子と融合させて、標的遺伝子の発現を抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）することができる。例えば、遺伝子は、転写サイレンサー（例えば、ＫＲＡＢドメイン）又は転写アクチベーター（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合物）をコード化し得る。ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合した触媒能のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）をコード化する遺伝子（「ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ」）を含有させて、２つのｇＲＮＡに対して相同的な標的配列にＤＳＢを生成することができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅリポジトリ（Ａｄｄｇｅｎｅ，７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ．，Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９；ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／）に開示され、そこから一般に入手可能な多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。各々が個別のガイドＲＮＡにより指令される２つの個別の二本鎖切断を導入する「ダブルニッカーゼ」Ｃａｓ９は、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５４：１３８０－１３８９によって、より正確なゲノム編集を達成するものとして記載されている。
真核細胞の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、以下：米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８Ａ１号明細書及び同第２０１５／０３４４９１２Ａ１号明細書、並びに米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、及び同第８，９０６，６１６号明細書に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ並びに対応するガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位は、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３Ａ１号明細書に開示されている。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、標的化ヌクレアーゼをコード化する遺伝子、例えば、Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ）、不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３、及びｇＲＮＡを含む。ヌクレアーゼをコード化する遺伝子、及びｇＲＮＡの選択は、標的化突然変異がヌクレオチドの欠失、置換、又は付加、例えば、標的化配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、又は付加であるか否かによって決定される。（１つ又は複数の）エフェクタードメイン（例えば、ＶＰ６４）の全部又は一部（例えば、その生物活性部分）と係留された触媒能のないエンドヌクレアーゼ、例えば、不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）をコード化する遺伝子は、１つ又は複数の標的核酸配列の活性及び／又は発現を調節することができるキメラタンパク質を作製する。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、本明細書に記載の方法に有用なキメラタンパク質を作製するために、１つ又は複数のエフェクタードメインの全部又は一部（例えば、完全長野生型エフェクタードメイン、又はその断片若しくは変異体、例えば、その生物活性部分）とｄＣａｓ９の融合物をコード化する遺伝子を含む。従って、一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ｄＣａｓ９－メチラーゼ融合物をコード化する遺伝子を含む。他の一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、内在性遺伝子をターゲティングする部位特異的ｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９－酵素融合物をコード化する遺伝子を含む。
他の態様では、ＣＡＶベクターは、ｄＣａｓ９と融合した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のエフェクタードメイン（全部又は生物活性部分）をコード化する遺伝子を含む。
調節配列
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、調節配列、例えば、プロモーター又はエンハンサーを含み、エフェクターをコードする配列に作動可能に連結される。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、調節配列、例えば、プロモーター又はエンハンサーを含み、エフェクターをコードする配列に作動可能に連結される。
一部の実施形態では、プロモーターは、発現産物をコード化するＤＮＡに隣接して位置するＤＮＡ配列を含む。プロモーターは、隣接するＤＮＡ配列と作動可能に連結してもよい。プロモーターは、典型的に、プロモーターが存在しないときに発現された産物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現される産物の量を増加させる。１つの生物由来のプロモーターを使用して、別の生物に由来するＤＮＡ配列からの産物の発現を増大することができる。例えば、脊椎動物プロモーターは、脊椎動物においてクラゲＧＦＰの発現のために用いることができる。さらに、１つのプロモーターエレメントは、タンデムに結合した複数のＤＮＡ配列について発現される生成物の量を増加させることができる。従って、１つのプロモーターエレメントは、１つ又は複数の産物の発現を増大することができる。当業者には、複数のプロモーターエレメントが周知である。
一実施形態では、高レベルの構成性発現が要望される。こうしたプロモーターの例として、限定はしないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＶＳ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター／エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間体初期プロモーター／エンハンサー（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、細胞質βアクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。
別の実施形態では、誘導性プロモーターが要望される場合もある。誘導性プロモーターは、例えばシス又はトランスのいずれかで提供される、外部から供給される化合物により調節されるものであり、限定はしないが、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモータシステム（９８／１００８８号パンフレット）；テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）；また、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８））も参照）；ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７）］；並びにラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８－１０３２（１９９６））が挙げられる。本発明に関して有用となり得る他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理的状態、例えば、温度、急性相によって、又は複製細胞においてのみ調節されるものである。
一部の実施形態では、目的の遺伝子又は核酸配列のネイティブプロモータを使用する。ネイティブプロモータは、遺伝子又は核酸配列の発現が、ネイティブ発現を模倣すべきであることが要望される場合に使用することができる。ネイティブプロモータは、遺伝子又は他の核酸配列の発現を一過性若しくは発展的に、又は組織特異的に、又は特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合に使用することができる。別の実施形態では、ネイティブ発現を模倣するために、他のネイティブ発現制御エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を用いてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む。例えば、骨格筋での発現が要望される場合、筋肉において活性のプロモーターを用いることができる。こうしたものとして、骨格αアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコード化する遺伝子由来のプロモーター、並びに天然のプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーターが挙げられる。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１－２４５（１９９９）を参照されたい。組織特異的であるプロモーターの例は、中でも、以下のものについて知られている：肝臓アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２－９（１９９６）；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６）］、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７）；骨シアロタンパク質、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１：６５４－６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体ａ鎖）、神経（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３）；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１）；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５）］。
遺伝子エレメントは、エンハンサー、例えば、遺伝子をコード化するＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を含んでもよい。エンハンサーエレメントは、典型的に、プロモーターエレメントの上流に位置するか、又はコーディングＤＮＡ配列（例えば、１つ若しくは複数の産物に転写若しくは翻訳されたＤＮＡ配列）の下流、又はその内部に位置してもよい。従って、エンハンサーエレメントは、産物をコード化するＤＮＡ配列上流又は下流の１００塩基対、２００塩基対、若しくは３００塩基対若しくはそれ以上に位置することができる。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントによってもたらされる発現増大を上回って、ＤＮＡ配列から発現される組換え産物の量を増大することができる。複数のエンハンサーエレメントが当業者には容易に入手可能である。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載の発現産物をコード化する配列にフランキングする１つ又は複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載の発現産物をコード化する配列にフランキングする１つ又は複数の長末端反復（ＬＴＲ）を含む。用いることができるプロモーター配列の例として、限定はされないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）前初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）プロモーターが挙げられる。
複製タンパク質
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、１つ又は複数の複製タンパク質をコード化する配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ローリングサークル複製法、例えば、リーディング鎖の合成により複製することができ、ラギング鎖は結合されない。こうした実施形態では、ＣＡＶベクターは、３つの追加エレメント：ｉ）イニシエータタンパク質をコード化する遺伝子、ｉｉ）二本鎖起点、及びｉｉｉ）一本鎖起点を含む。複製タンパク質を含むローリングサークル複製（ＲＣＲ）タンパク質複合体は、リーディング鎖に結合して、複製起点を不安定化する。ＲＣＲ複合体は、ゲノムを切断して、自由３’ＯＨ末端を生成する。細胞ＤＮＡポリメラーゼは、自由３’ＯＨ末端からウイルスＤＮＡ複製を開始する。ゲノムが複製された後、ＲＣＲ複合体は、ループを共有結合により閉鎖する。これにより、環状プラス一本鎖親ＤＮＡ分子、及び親マイナス鎖と新しく合成されたプラス鎖とから構成される環状二本鎖ＤＮＡ分子の放出が起こる。一本鎖ＤＮＡ分子は、包膜されるか、又は第２ラウンドの複製に参加することができる。例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００９，６：６０ ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３－４２２Ｘ－６－６０を参照されたい。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントは、１つ又は複数の複製タンパク質をコード化する配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ローリングサークル複製法、例えば、リーディング鎖の合成により複製することができ、ラギング鎖は結合されない。こうした実施形態では、ＣＡＶベクターは、３つの追加エレメント：ｉ）イニシエータタンパク質をコード化する遺伝子、ｉｉ）二本鎖起点、及びｉｉｉ）一本鎖起点を含む。複製タンパク質を含むローリングサークル複製（ＲＣＲ）タンパク質複合体は、リーディング鎖に結合して、複製起点を不安定化する。ＲＣＲ複合体は、ゲノムを切断して、自由３’ＯＨ末端を生成する。細胞ＤＮＡポリメラーゼは、自由３’ＯＨ末端からウイルスＤＮＡ複製を開始する。ゲノムが複製された後、ＲＣＲ複合体は、ループを共有結合により閉鎖する。これにより、環状プラス一本鎖親ＤＮＡ分子、及び親マイナス鎖と新しく合成されたプラス鎖とから構成される環状二本鎖ＤＮＡ分子の放出が起こる。一本鎖ＤＮＡ分子は、包膜されるか、又は第２ラウンドの複製に参加することができる。例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００９，６：６０ ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３－４２２Ｘ－６－６０を参照されたい。
遺伝子エレメントは、ポリメラーゼ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼをコード化する配列を含んでもよい。
その他の配列
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、産物をコード化する核酸（例えば、リボザイム、タンパク質をコード化する治療用ｍＲＮＡ、外性遺伝子）をさらに含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、産物をコード化する核酸（例えば、リボザイム、タンパク質をコード化する治療用ｍＲＮＡ、外性遺伝子）をさらに含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主又は宿主細胞中のＣＡＶベクターの種及び／若しくは組織及び／若しくは細胞指向性（例えば、キャプシドタンパク質配列）、感染力（例えば、キャプシドタンパク質配列）、免疫抑制／活性化（例えば、調節核酸）、ウイルスゲノム結合及び／又はパッケージング、免疫回避（非免疫原性及び／又は寛容性）、薬物動態、エンドサイトーシス及び／又は細胞接着、核内進入、細胞内調節及び局在化、エキソサイトーシス調節、増殖、並びに核酸保護に影響を及ぼす１つ又は複数の配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸を含む他の配列を含んでもよい。他の配列として、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくはその他のＲＮＡｉ分子をコード化する配列を挙げることができる。一実施形態では、遺伝子エレメントは、調節核酸と同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座をターゲティングするために、ｓｉＲＮＡをコード化する配列を含む。一実施形態では、遺伝子エレメントは、調節核酸とは異なる遺伝子発現産物をターゲティングするために、ｓｉＲＮＡをコード化する配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下：１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡをコード化する配列、１つ若しくは複数の複製タンパク質をコード化する配列、外性遺伝子をコード化する配列、治療薬をコード化する配列、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をターゲティングする１つ若しくは複数の調節配列をコード化する配列、並びに治療用ｍＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列のうち１つ又は複数を含む。
他の配列は、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ、又はこれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
コードされた遺伝子
例えば、遺伝子エレメントは、シグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドを含んでもよい。例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドがある。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織若しくは細胞と比較して、疾患に罹患した組織由来の細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写若しくは翻訳産物をもたらしているあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であってもよいし；異常に低いレベルで発現される遺伝子であってもよく、その際、改変された発現は、疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、遺伝子プロセシング突然変異又は遺伝子変異とも呼ばれ、これは、疾患の直接の原因であるか、又は病因となる遺伝子との連関不均衡状態にある。
例えば、遺伝子エレメントは、シグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドを含んでもよい。例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドがある。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織若しくは細胞と比較して、疾患に罹患した組織由来の細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写若しくは翻訳産物をもたらしているあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であってもよいし；異常に低いレベルで発現される遺伝子であってもよく、その際、改変された発現は、疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、遺伝子プロセシング突然変異又は遺伝子変異とも呼ばれ、これは、疾患の直接の原因であるか、又は病因となる遺伝子との連関不均衡状態にある。
さらに、遺伝子エレメントは、本明細書の他所に記載する通り、ターゲティング部分をコード化することができる。これは、例えば、糖、糖脂質、又は抗体などのタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを挿入することによって達成することができる。当業者は、ターゲティング部分の更なる作製方法について周知している。
ウイルス配列
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、少なくとも１つのウイルス配列を含む。一部の実施形態では、これらの配列は、一本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、ＣＡＶ、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ゲノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｕｓ）、イノウイルス（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ミクロウイルス（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンプラウイルス（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｕｓ）、アスコウイルス（Ａｓｃｏｖｉｒｕｓ）、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、フセロウイルス（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、グロブロウイルス（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｕｓ）、グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトロサウイルス（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、リポスリックスウイルス（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ）、ニマウイルス（Ｎｉｍａｖｉｒｕｓ））、及びポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、ＲＮＡウイルス、例えば、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、トリコルナウイルス（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ）、パルティティウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、少なくとも１つのウイルス配列を含む。一部の実施形態では、これらの配列は、一本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、ＣＡＶ、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ゲノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｕｓ）、イノウイルス（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ミクロウイルス（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンプラウイルス（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｕｓ）、アスコウイルス（Ａｓｃｏｖｉｒｕｓ）、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、フセロウイルス（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、グロブロウイルス（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｕｓ）、グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトロサウイルス（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、リポスリックスウイルス（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ）、ニマウイルス（Ｎｉｍａｖｉｒｕｓ））、及びポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、ＲＮＡウイルス、例えば、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、トリコルナウイルス（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ）、パルティティウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、非病原性ウイルス、例えば、共生ウイルス、例えば、片利共生ウイルス、例えば、天然ウイルス、例えば、ＣＡＶ由来の１つ以上の配列を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＣＡＶのＣｕｘｈａｖｅｎ １単離物（例えば、表１Ａ又は１Ｂに列挙されるような）に対して相同性又は同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態では、非病原性ウイルスは、環状の負センスゲノム、例えばＣＡＶを有する非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する非病原性ウイルス由来の１つ以上の配列又は配列の断片を含み得る。
一部の実施形態では、組換えレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、欠損していることから、感染性粒子を産生するために補助を提供することができる。こうした補助は、例えば、ＬＴＲ内で調節配列の制御下、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の構造遺伝子全てをコード化するプラスミドを含む細胞を用いることによって提供することができる。本明細書に記載のＣＡＶベクターを複製するために好適な細胞株としては、当技術分野で公知の細胞株、例えば、Ａ５４９があり、これは、本明細書に記載されるように修飾することができる。前記遺伝子エレメントは、さらに、所望の遺伝子エレメントを同定することができるように、選択マーカーをコード化する遺伝子も含み得る。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、配列が、最初のヌクレオチド配列によりコード化されたポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるか、又はそうでなければ、本発明を実施する上で有用である限り、非サイレント突然変異、例えば、コード化されたポリペプチドにアミノ酸変化をもたらす塩基置換、欠失、又は付加を含む。これに関して、いくつかの保存的アミノ酸置換を実施することができ、これらは一般に、タンパク質機能全体を、例えば、陽荷電アミノ酸（及びその逆）、すなわち、リシン、アルギニン及びヒスチジンに関して；陰荷電アミノ酸（及びその逆）、すなわち、アスパラギン酸及びグルタミン酸に関して；並びにいくつかの中性荷電アミノ酸群（及びあらゆるケース、またその逆）、すなわち（１）アラニン及びセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジン、（３）システイン及びセリン、（４）グリシン及びプロリン、（５）イソロイシン、ロイシン及びバリン、（６）メチオニン、ロイシン及びイソロイシン、（７）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、及びチロシン、（８）セリン及びトレオニン、（９）トリプトファン及びチロシン、（１０）並びに例えば、チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンに関して、不活性化しないことが認められている。アミノ酸は、物理的特性並びに二次及び三次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸による１アミノ酸の置換として、当技術分野では認識されている。
一部の実施形態では、同一の若しくは指定パーセンテージのヌクレオチド、又は同一の（比較ウインドウ又は指定領域にわたる最大一致について比較し、アラインメントした場合、指定領域にわたって約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の同一性）アミノ酸残基を有する２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の同一性は、以下に記載するデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動アラインメント及び視覚検査によって測定することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照）。同一性はまた、試験配列の補体を指すこともあり、或いは補体に適用され得る。同一性はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含む。本明細書に記載するように、アルゴリズムはギャップなどを考慮する。同一性は、少なくとも約１０アミノ酸又はヌクレオチド長、約１５アミノ酸又はヌクレオチド長、約２０アミノ酸又はヌクレオチド長、約２５アミノ酸又はヌクレオチド長、約３０アミノ酸又はヌクレオチド長、約３５アミノ酸又はヌクレオチド長、約４０アミノ酸又はヌクレオチド長、約４５アミノ酸又はヌクレオチド長、約５０アミノ酸又はヌクレオチド長、若しくはそれ以上の領域にわたって存在し得る。遺伝コードが縮重しているため、相同ヌクレオチド配列は、任意の数のサイレント塩基変化を、すなわち、それでもなお同じアミノ酸をコード化するヌクレオチド置換を含み得る。
タンパク質性外部
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメントを閉じ込めるタンパク質性外部を含む。タンパク質性外部は、カプシドタンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１分子）を含むことができる。一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、本明細書に記載のカプシドタンパク質、例えば、本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１分子をコードするヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされるタンパク質に対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を有するカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、カプシドタンパク質のタンパク質又はその機能断片は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１核酸に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、カプシドタンパク質若しくはカプシドタンパク質の機能断片、又は本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１分子に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ＣＡＶベクターのタンパク質性外部は、一部の実施形態では、例えば、タンパク質性外部を形成するために自己集合し得るカプシドタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、例えば、タンパク質性外部を構成する正二十面体構造に自己集合し得る。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、例えば、合成ＣＡＶベクターは、遺伝子エレメントを閉じ込めるタンパク質性外部を含む。タンパク質性外部は、カプシドタンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１分子）を含むことができる。一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、本明細書に記載のカプシドタンパク質、例えば、本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１分子をコードするヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされるタンパク質に対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を有するカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、カプシドタンパク質のタンパク質又はその機能断片は、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＶ ＶＰ１核酸に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、カプシドタンパク質若しくはカプシドタンパク質の機能断片、又は本明細書に記載のＣＡＶ ＶＰ１分子に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ＣＡＶベクターのタンパク質性外部は、一部の実施形態では、例えば、タンパク質性外部を形成するために自己集合し得るカプシドタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、例えば、タンパク質性外部を構成する正二十面体構造に自己集合し得る。
一部の実施形態では、タンパク質性外部タンパク質は、ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントの配列によってコードされる（例えば、遺伝子エレメントとシスである）。他の実施形態では、タンパク質性外部タンパク質は、ＣＡＶベクターの遺伝子エレメントとは別個の核酸によってコードされる（例えば、遺伝子エレメントとトランスである）。
一部の実施形態では、配列同一性がより低いアミノ酸の範囲は、本明細書に記載の特性の１つ又は複数、及び細胞／組織／種特異性（例えば、向性）の相違をもたらし得る。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、タンパク性外層中に脂質が存在しない。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターには、脂質二重層、例えば、ウイルスエンベロープが存在しない。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターの内部は、タンパク性外層によって完全に（例えば、１００％）覆われている。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターの内部は、外部タンパク質によって１００％未満、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％以下の被覆率で覆われている。一部の実施形態では、タンパク性外層は、遺伝子エレメントが、ＣＡＶベクター内に保持されている限り、間隙又は不連続（例えば、水、イオン、ペプチド、又は小分子に対する透過性を可能にするもの）を含む。
一部の実施形態では、タンパク性外層は、宿主細胞内への遺伝子エレメントの進入を媒介するために、宿主細胞を特異的に認識及び／又はそれに結合する１つ若しくは複数のタンパク質又はポリペプチド、例えば、相補的タンパク質又はポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、タンパク質性外部は、例えば、本明細書に記載されるＶＰ１分子のアルギニンリッチ領域及び／又はゼリーロール領域を含む。一部の実施形態では、タンパク質性外部は、以下の：１つ又は複数のグリコシル化タンパク質、親水性ＤＮＡ－結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミン酸リッチ領域、Ｎ－末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ－末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ又は複数のジスルフィド架橋のうちの１つ又は複数を含む。例えば、タンパク質性外部は、例えば、本明細書に記載されるように、ＣＡＶ ＶＰ１核酸によってコード化されるタンパク質を含む。
一部の実施形態では、タンパク質性外部は、以下の特徴：二十面体対称、１つ又は複数の宿主細胞と相互作用して、宿主細胞内への進入を媒介する分子の認識及び／若しくはそれとの結合、脂質分子の欠失、炭水化物の欠失、ｐＨ及び温度安定性、界面活性剤抵抗性、及び宿主細胞において実質的に非病原性であることのうちの１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、タンパク質、例えば、実質的に非病原性のタンパク質及び／又はタンパク質性外部タンパク質は、１つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のグリコシル化アミノ酸を含む。一部の実施形態では、タンパク質、例えば、実質的に非病原性のタンパク質及び／又はタンパク質性外部タンパク質は、少なくとも１つの親水性ＤＮＡ結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミンリッチ領域、Ｎ末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ以上のジスルフィド架橋を含む。
ＩＩＩ．遺伝子エレメント構築物
本明細書に記載される遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント構築物（例えば、本明細書に記載されるようなタンデム構築物）に含まれ得る。
本明細書に記載される遺伝子エレメントは、遺伝子エレメント構築物（例えば、本明細書に記載されるようなタンデム構築物）に含まれ得る。
ある態様において、本発明は、（ｉ）非病原性外部タンパク質（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子又はそのスプライス変異体若しくは機能断片）をコードする配列、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合する外部タンパク質結合配列、及び（ｉｉｉ）エフェクターをコードする配列を含む遺伝子エレメント構築物を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、遺伝子エレメントの第２のコピー又はその断片（例えば、本明細書に記載されるようなｕＲＦＳ又はｄＲＦＳを含む）をさらに含むタンデム構築物である。
遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント内の配列のいずれかは、任意の好適な方法を用いて取得することができる。例えば、標準的技法を用いて、ウイルス配列を含む細胞からのライブラリーのスクリーニング、当該配列を含むことがわかっている遺伝子エレメント構築物からの配列の誘導、又は細胞及びそれを含有する組織からの直接の単離など、様々な組換え方法が当技術分野で公知である。これに代わり、又はこれと組み合わせて、遺伝子エレメントの一部又は全部は、クローニングではなく、合成により産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、調節エレメントと、標的遺伝子、及び相同性の核酸配列と、生存細胞内において及び／又は細胞内分子が標的細胞内に存在するときにリポータ分子の発現を誘発するための様々なリポータ構築物と、を含む。
リポータ遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定する、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、リポータ遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在しないか、又は発現されない遺伝子であり、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコード化する遺伝子である。リポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入されてから適切な時間後に検定する。好適なリポータ遺伝子としては、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコード化する遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現系は周知であり、公知の技法を用いて調製してもよいし、又は市販のものを取得することもできる。一般に、最も高レベルのリポータ遺伝子発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。こうしたプロモーター領域をリポータ遺伝子に結合させて、プロモーター駆動転写を調節する能力について物質を評価するために使用することができる。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント構築物は、宿主細胞において実質的に非病原性である、及び／又は実質的に非統合性である。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント酸構築物は、表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などのうち１つ又は複数を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上調節するのに十分な量で存在する。
ＩＶ．組成物
本明細書に記載のＣＡＶベクターはまた、例えば、本明細書に記載する通り、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と一緒に医薬組成物に含有させてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個のＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１０５～１０１５、１０５～１０１０、又は１０１０～１０１５個のＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１０８（例えば、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１０１０）ゲノム当量／ｍＬのＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、実施例１に記載のウイルス力価測定の方法に従って決定される場合、１０５～１０１０、１０６～１０１０、１０７～１０１０、１０８～１０１０、１０９～１０１０、１０５～１０６、１０５～１０７、１０５～１０８、１０５～１０９、１０５～１０１１、１０５～１０１２、１０５～１０１３、１０５～１０１４、１０５～１０１５、又は１０１０～１０１５ゲノム当量／ｍＬのＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりＣＡＶベクター中に含まれる少なくとも１、２、５、若しくは１０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、８，０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又はそれ以上の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分なＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりＣＡＶベクター中に含まれる少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は約１×１０４～１×１０５、１×１０４～１×１０６、１×１０４～１×１０７、１×１０５～１×１０６、１×１０５～１×１０７、又は１×１０６～１×１０７の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分なＣＡＶベクターを含む。
本明細書に記載のＣＡＶベクターはまた、例えば、本明細書に記載する通り、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と一緒に医薬組成物に含有させてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個のＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１０５～１０１５、１０５～１０１０、又は１０１０～１０１５個のＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１０８（例えば、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１０１０）ゲノム当量／ｍＬのＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、実施例１に記載のウイルス力価測定の方法に従って決定される場合、１０５～１０１０、１０６～１０１０、１０７～１０１０、１０８～１０１０、１０９～１０１０、１０５～１０６、１０５～１０７、１０５～１０８、１０５～１０９、１０５～１０１１、１０５～１０１２、１０５～１０１３、１０５～１０１４、１０５～１０１５、又は１０１０～１０１５ゲノム当量／ｍＬのＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりＣＡＶベクター中に含まれる少なくとも１、２、５、若しくは１０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、８，０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又はそれ以上の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分なＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりＣＡＶベクター中に含まれる少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は約１×１０４～１×１０５、１×１０４～１×１０６、１×１０４～１×１０７、１×１０５～１×１０６、１×１０５～１×１０７、又は１×１０６～１×１０７の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分なＣＡＶベクターを含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、以下の特徴：医薬組成物が、医薬又は適正製造基準（ＧＭＰ）を満たすこと；医薬組成物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作られること；医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、病原体を実質的に含まないこと；医薬組成物が、例えば、本明細書に記載する通り、予め定めた基準値を下回る混入物レベルを有する、例えば、混入物を実質的に含まないことのうち１つ又は複数を有する。
一部の実施形態では、医薬組成物は、閾値量を下回る１又は複数種の混入物を含む。医薬組成物において排除するか、又は最小限に抑えることが望ましい例示的な混入物として、限定はしないが、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、宿主細胞タンパク質、動物由来成分（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能ウイルス、非感染性粒子、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、外来性汚染生物、及び凝集体が挙げられる。複数の実施形態では、混入物は、宿主細胞ＤＮＡである。複数の実施形態では、組成物は、用量当たり約１０ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む。複数の実施形態では、組成物中の宿主細胞ＤＮＡのレベルは、宿主細胞ＤＮＡの濾過及び／又は酵素分解により低下させる。複数の実施形態では、医薬組成物は、１０重量％未満（例えば、約１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、若しくは０．１％未満）の混入物からなる。従って、本開示は、以下：外来性因子、発熱性物質、エンドトキシン、マイコプラズマ、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、非感染性粒子、又は空のカプシドのうちの１つ以上（１、２、３、４、５、６、７、又は８全て）についてＣＡＶベクター調製物を評価する工程を含む、本明細書に開示されるＣＡＶベクターを作製する方法を含む。
本開示は、いくつかの例において、本明細書に記載のＣＡＶベクター及び製剤用賦形剤を含む無菌の医薬組成物を含み、組成物は、２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ§§６１０．１２及び６１０．１３の要件を満たす。例えば、医薬組成物は、一部の実施形態では、以下の特徴のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つ全てを有し得る：
（ｉ）外来性因子を実質的に欠く、
（ｉｉ）発熱性物質を実質的に欠く、
（ｉｉｉ）対照参照若しくは規格、例えば、エンドトキシン汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のエンドトキシンを含む、
（ｉｖ）対照参照若しくは規格、例えば、マイコプラズマ汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のマイコプラズマを含む、
（ｖ）対照参照標準よりも少ない宿主細胞ＤＮＡ、例えば、１用量あたり１０ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、１用量あたり５ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む、
（ｖｉ）対照参照標準よりも少ない、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、及び／若しくは１０ｎｇ／用量未満、５ｎｇ／用量未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、
（ｖｉｉ）例えば、感染性粒子に対する非感染性粒子の所定の放出仕様を満たす、閾値量未満の非感染性粒子、例えば、粒子対感染単位＜２０００：１、＜１０００：１、＜５００：１、＜３００：１、＜２００：１、＜１００：１、若しくは＜５０：１の粒子を含む、並びに／又は
（ｖｉｉｉ）閾値量（ａｏｕｎｔ）未満の、例えば、空のカプシドについての所定の放出仕様を満たす、空のカプシド（ゲノムを欠く）を含む。
（ｉ）外来性因子を実質的に欠く、
（ｉｉ）発熱性物質を実質的に欠く、
（ｉｉｉ）対照参照若しくは規格、例えば、エンドトキシン汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のエンドトキシンを含む、
（ｉｖ）対照参照若しくは規格、例えば、マイコプラズマ汚染についての米国薬局方（ＵＳＰ）若しくはＦＤＡ参照標準以下のマイコプラズマを含む、
（ｖ）対照参照標準よりも少ない宿主細胞ＤＮＡ、例えば、１用量あたり１０ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、１用量あたり５ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む、
（ｖｉ）対照参照標準よりも少ない、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、及び／若しくは１０ｎｇ／用量未満、５ｎｇ／用量未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、
（ｖｉｉ）例えば、感染性粒子に対する非感染性粒子の所定の放出仕様を満たす、閾値量未満の非感染性粒子、例えば、粒子対感染単位＜２０００：１、＜１０００：１、＜５００：１、＜３００：１、＜２００：１、＜１００：１、若しくは＜５０：１の粒子を含む、並びに／又は
（ｖｉｉｉ）閾値量（ａｏｕｎｔ）未満の、例えば、空のカプシドについての所定の放出仕様を満たす、空のカプシド（ゲノムを欠く）を含む。
一態様では本明細書に記載する本発明は、以下：
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸をコード化する配列；及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜する又は閉じ込めるタンパク質性外部を含む遺伝子エレメントを含むＣＡＶベクター；並びに
ｂ）製剤用賦形剤
を含む医薬組成物を含む。
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸をコード化する配列；及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜する又は閉じ込めるタンパク質性外部を含む遺伝子エレメントを含むＣＡＶベクター；並びに
ｂ）製剤用賦形剤
を含む医薬組成物を含む。
小胞
一部の実施形態では、組成物は、さらに、担体構成体、例えば、マイクロ粒子、リポソーム、小胞、又はエキソソームを含む。一部の実施形態では、リポソームは、内部の水性コンパートメントを取り囲む単一若しくは多重膜脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層から構成される球体小胞構造を含む。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、一般に、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらの積荷を血漿酵素による分解から保護し、生体膜を介してそれらの積荷を輸送することができる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
一部の実施形態では、組成物は、さらに、担体構成体、例えば、マイクロ粒子、リポソーム、小胞、又はエキソソームを含む。一部の実施形態では、リポソームは、内部の水性コンパートメントを取り囲む単一若しくは多重膜脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層から構成される球体小胞構造を含む。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、一般に、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらの積荷を血漿酵素による分解から保護し、生体膜を介してそれらの積荷を輸送することができる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、数種の異なる脂質から作ることができるが；薬物担体としてのリポソームの作製にはリン脂質が最も一般的に使用されている。小胞として、限定はしないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢ（単独、又はＤＯＴＭＡを得るためにコレステロールと一緒に）、並びにコレステロール、ＤＯＴＡＰとコレステロール、ＤＯＴＩＭとコレステロール、及びＤＤＡＢとコレステロールが挙げられる。多重膜小胞脂質の調製方法は、当技術分野では公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重膜小胞脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込む）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて、振盪の形態で力を加えることにより、小胞形成を促進することもできる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込む）に記載されている通り、サイズが漸減するフィルターを介した押出により作ることができる。
本明細書に記載する通り、その構造及び／又は特性を修飾するために、添加物を小胞に添加してもよい。例えば、構造の安定化を助け、内部積荷の漏れを防ぐために、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを混合物に添加することができる。さらに、小胞は、水添卵ホスファチジルコリン若しくは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びリン酸ジセチルから作ることもできる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。また、小胞を合成中又は合成後に表面修飾して、レシピエント細胞上の反応基に相補的な反応基を含有させてもよい。こうした反応基としては、限定しないが、マレイミド基がある。一例として、例えば、限定はしないが、ＤＳＰＥ－ＭａＬ－ＰＥＧ２０００などのマレイミド共役リン脂質を含有するように、小胞を合成してもよい。
小胞製剤は、主として、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然のリン脂質及び脂質から構成され得る。リン脂質のみから構成される製剤は、血漿中で安定性が低い。しかし、コレステロールを用いた脂質膜の操作で、包膜された積荷の急速な放出を抑制するか、又は１，２－ジオレイオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）により安定性を高める（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
実施形態では、脂質を用いて、脂質マイクロ粒子を形成することができる。脂質として、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００及びコリピドジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧが挙げられ、自発的小胞形成手順を用いて製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照）。構成体モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ又はＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）であってよい。Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び海外で約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し、これらは、多様な態様の脂質マイクロ粒子及び脂質マイクロ粒子製剤に関し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照）、これらは全て、本発明に使用及び／又は適用することができる。
一部の実施形態では、マイクロ粒子は、ランダムな様式で配置される１つ又は複数の固体ポリマーを含む。マイクロ粒子は生分解性であり得る。生分解性マイクロ粒子は、例えば、限定はされないが、溶媒蒸発、ホットメルトマイクロカプセル化、溶媒除去、及び噴霧乾燥をはじめとする当技術分野で公知の方法を用いて、合成することができる。マイクロカプセルを合成する例示的な方法は、Ｂｅｒｓｈｔｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ４：１７８７－１７８７，２００８及び米国特許出願公開第２００８／００１４１４４ Ａ１号明細書に記載されており、マイクロカプセル合成に関する具体的な教示内容は、参照により本明細書に組み込む。
生分解性マイクロ粒子を形成するために使用することができる例示的な合成ポリマーとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：脂肪族ポリエステル、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、乳酸及びグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、並びにアルブミンなどの天然ポリマー、アルギン酸塩、並びにデキストラン及びセルロースなどの他の多糖類、コラーゲン、例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、並びに当業者により常用的に実施されるその他の修飾を含むそれらの化学誘導体）、アルブミン及びその他の親水性タンパク質、ゼイン及びその他のプロラミン並びに疎水性タンパク質、それらのコポリマー及び混合物。一般に、これらの材料は、酵素加水分解又は水への曝露、表面又はバルク浸食のいずれかにより分解する。
マイクロ粒子の直径は、０．１～１０００マイクロメートル（μｍ）の範囲である。一部の実施形態では、それらの直径は、１～７５０μｍ、又は５０～５００μｍ、又は１００～２５０μｍの範囲のサイズである。一部の実施形態では、それらの直径は、５０～１０００μｍ、５０～７５０μｍ、５０～５００μｍ、又は５０～２５０μｍの範囲のサイズである。一部の実施形態では、それらの直径は、．０５～１０００μｍ、１０～１０００μｍ、１００～１０００μｍ、又は５００～１０００μｍの範囲のサイズである。一部の実施形態では、それらの直径は、約０．５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約５５０μｍ、約６００μｍ、約６５０μｍ、約７００μｍ、約７５０μｍ、約８００μｍ、約８５０μｍ、約９００μｍ、約９５０μｍ、又は約１０００μｍである。マイクロ粒子に関して使用される場合、「約」という用語は、記載される絶対値の＋／－５％を意味する。
一部の実施形態では、リガンドは、粒子の表面に存在する、及び結合させようとするリガンド上に存在する官能化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル及びヒドロキシル）を介してマイクロ粒子の表面に共役させる。例えば、マイクロ粒子のエマルジョン調製工程中に、官能化学基と一緒に安定剤を組み込むことにより、官能基をマイクロ粒子内に導入することが可能である。
マイクロ粒子に官能基を導入する別の例は、粒子製造後の工程中に、ホモ又はヘテロ官能性架橋剤を用いて、粒子とリガンドを直接架橋することによるものである。この手順では、好適なケミストリー及び１クラスの架橋剤（以下にさらに詳細に述べる通り、ＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒドなど）又は製造後の粒子の化学修飾によって粒子表面にリガンドを結合させる任意の他の架橋剤を使用してよい。これはまた、脂肪酸、脂質又は官能性安定化剤などの両親媒性分子を粒子表面に受動的に吸着及び付着させ、これにより、リガンドに係留させるための官能性末端基を導入し得るプロセスも含む。
一部の実施形態では、マイクロ粒子は、特定の細胞又は組織タイプ（例えば、心筋細胞）をターゲティングさせるために、その外側表面に１つ又は複数のターゲティング基を含むように合成してもよい。これらのターゲティング基として、限定はしないが、受容体、リガンド、抗体などが挙げられる。これらのターゲティング基は、細胞表面上のそのパートナーに結合する。一部の実施形態では、細胞表面を含む脂質二重層内にマイクロ粒子を組み込み、ミトコンドリアを細胞に送達する。
マイクロ粒子はまた、その最も外側表面に脂質二重層を含んでもよい。この二重層は、同じ又は異なるタイプの１つ又は複数の脂質から構成されてもよい。例として、限定はしないが、ホスホコリン及びホスホイノシトールなどのリン脂質が挙げられる。具体的な例として、限定はしないが、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、並びにリポソーム用に本明細書に記載するものなど、様々な他の脂質が挙げられる。
一部の実施形態では、担体は、例えば、本明細書に記載の通り、ナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載する小胞又はマイクロ粒子を診断薬で官能化する。診断薬の例として、限定はされないが、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層法（ＣＡＴ）、単光子放射断層撮影、Ｘ線、蛍光分析、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用される市販のイメージング剤；並びに造影剤が挙げられる。ＭＲＩでの造影剤として使用するのに好適な材料の例としては、ガドリニウムキレート、並びに鉄、マグネシウム、マンガン、銅及びクロミウムが挙げられる。
担体
本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、担体を含む、担体と一緒に製剤化される、及び／又は担体を用いて送達され得る。一態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶベクター、ＣＡＶ、若しくは遺伝子エレメント）を含む（例えば、包膜する）担体（例えば、小胞、リポソーム、脂質ナノ粒子、エキソソーム、赤血球、エキソソーム（例えば、哺乳動物若しくは植物エキソソーム）、フソソーム）を含む組成物、例えば、医薬組成物を包含する。
本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、担体を含む、担体と一緒に製剤化される、及び／又は担体を用いて送達され得る。一態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載されるＣＡＶベクター、ＣＡＶ、若しくは遺伝子エレメント）を含む（例えば、包膜する）担体（例えば、小胞、リポソーム、脂質ナノ粒子、エキソソーム、赤血球、エキソソーム（例えば、哺乳動物若しくは植物エキソソーム）、フソソーム）を含む組成物、例えば、医薬組成物を包含する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び系は、リポソーム又は他の類似の小胞内に製剤化することができる。一般に、リポソームは、内部の水性コンパートメントを取り囲む単一若しくは多重膜脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層から構成される球体小胞構造を含む。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、一般に、以下の特徴のうち１つ又は複数（例えば、全て）を有する：生体適合性、非毒性、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達することができる、それらの積荷を血漿酵素による分解から保護することができる、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を介してそれらの積荷を輸送することができる（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９；及びＺｙｌｂｅｒｂｅｒｇ ＆ Ｍａｔｏｓｅｖｉｃ．２０１６．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２３：９，３３１９－３３２９，ｄｏｉ：１０．１０８０／１０７１７５４４．２０１６．１１７７１３６を参照）。
小胞は、数種の様々な脂質から作ることができるが；薬物担体としてのリポソームの作製にはリン脂質が最も一般的に使用されている。多重膜小胞脂質の調製方法は、公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重膜小胞脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込む）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて、振盪の形態で力を加えることにより、小胞形成を促進することもできる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されている通り、サイズが漸減するフィルターを介した押出により作ることができる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、本明細書に記載される医薬組成物の生体適合性且つ生分解性送達系を提供する担体のもう１つの例である。例えば、Ｇｏｒｄｉｌｌｏ－Ｇａｌｅａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．Ｖｏｌｕｍｅ １３３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１８，Ｐａｇｅｓ ２８５－３０８を参照されたい。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、改変された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）であり、これは、ＳＬＮの特徴を保持し、薬剤安定性を改善すると共に、薬剤漏出を防ぐ。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬剤送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的への薬剤送達を効果的に指令し、薬剤安定性及び薬剤放出制御を改善する。また、リポソームとポリマーを組み合わせた新しいタイプの担体である、脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）を使用してもよい。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの相補的な利点を備えている。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは、優れた生体適合性を付与する。このように、２つの成分が、薬剤包膜効率を高め、表面修飾を促進して、水溶性薬剤の漏出を防ぐ。論文については、例えば、Ｌｉ ｅｔ Ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
また、本明細書に記載される組成物及び系の薬剤送達ビヒクルとして、エキソソームを使用することもできる。論文については、例えば、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
さらに、本明細書に記載される組成物の担体として、エクスビボ分化赤血球を使用することもできる。例えば、以下：２０１５０７３５８７号パンフレット；同第２０１７１２３６４６号パンフレット；同第２０１７１２３６４４号パンフレット；同第２０１８１０２７４０号パンフレット；同第２０１６１８３４８２号パンフレット；同第２０１５１５３１０２号パンフレット；同第２０１８１５１８２９号パンフレット；同第２０１８００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。
また、本明細書に記載の組成物を送達するための担体として、例えば、２０１８２０８７２８号パンフレットに記載されているフソソーム組成物を使用してもよい。
組合せ
一態様では、本明細書に記載するＣＡＶベクター又はＣＡＶベクターを含む組成物は、さらに１つ又は複数の異種部分を含んでもよい。一態様では、本明細書に記載のＣＡＶベクター又はＣＡＶベクターを含む組成物はまた、融合物中に１つ又は複数の異種部分を含み得る。一部の実施形態では、異種部分は、遺伝子エレメントと連結されていてもよい。一部の実施形態では、異種部分は、ＣＡＶベクターの一部としてタンパク性外層内に閉じ込めてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターと一緒に異種部分を投与してもよい。
一態様では、本明細書に記載するＣＡＶベクター又はＣＡＶベクターを含む組成物は、さらに１つ又は複数の異種部分を含んでもよい。一態様では、本明細書に記載のＣＡＶベクター又はＣＡＶベクターを含む組成物はまた、融合物中に１つ又は複数の異種部分を含み得る。一部の実施形態では、異種部分は、遺伝子エレメントと連結されていてもよい。一部の実施形態では、異種部分は、ＣＡＶベクターの一部としてタンパク性外層内に閉じ込めてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターと一緒に異種部分を投与してもよい。
一態様では、本発明は、ＣＡＶベクターのいずれか１つと本明細書に記載の異種部分を含む細胞又は組織を含む。
別の態様では、本発明は、ＣＡＶベクターと本明細書に記載の異種部分を含む医薬組成物を含む。
一部の実施形態では、異種部分は、ウイルス（例えば、エフェクター（例えば、薬物、小分子）、ターゲティング剤（例えば、ＤＮＡターゲティング剤、抗体、受容体リガンド）、タグ（例えば、蛍光団、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄなどの感光剤）、又は本明細書に記載の編集若しくはターゲティング部分であってもよい。一部の実施形態では、本発明に記載の膜転位ポリペプチドは、１つ又は複数の異種部分に連結される。一実施形態では、異種部分は、小分子（例えば、ペプチド模倣物又は分子量２０００ダルトン未満の有機小分子）、ペプチド若しくはポリペプチド（例えば、抗体若しくはその抗原結合断片）、ナノ粒子、アプタマー、又は薬物（ｐｈａｒｍａｃｏａｇｅｎｔ）である。
ターゲティング部分
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、さらに、ターゲティング部分、例えば、標的細胞上に存在する目的の分子に特異的に結合するターゲティング部分を含み得る。ターゲティング部分は、目的の分子又は細胞の特定の機能を調節し、特定の分子（例えば、酵素、タンパク質若しくは核酸）、例えば、経路内の目的の分子の下流の特定の分子を調節する、又は標的に特異的に結合して、ＣＡＶベクター若しくは遺伝子エレメントを局在化することができる。例えば、ターゲティング部分は、目的の特定の分子と相互作用して、その機能を増大、低減、又はそうでなければ調節する治療薬を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、さらに、ターゲティング部分、例えば、標的細胞上に存在する目的の分子に特異的に結合するターゲティング部分を含み得る。ターゲティング部分は、目的の分子又は細胞の特定の機能を調節し、特定の分子（例えば、酵素、タンパク質若しくは核酸）、例えば、経路内の目的の分子の下流の特定の分子を調節する、又は標的に特異的に結合して、ＣＡＶベクター若しくは遺伝子エレメントを局在化することができる。例えば、ターゲティング部分は、目的の特定の分子と相互作用して、その機能を増大、低減、又はそうでなければ調節する治療薬を含み得る。
タグ付け又はモニタリング部分
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、さらに、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターを標識若しくはモニターするためのタグを含み得る。タグ付け又はモニタリング部分は、化学物質又は酵素切断、例えば、タンパク質分解若しくはインテインスプライシングにより除去可能であってもよい。アフィニティタグは、アフィニティ技術を用いてタグ付けされたポリペプチドを精製するのに有用となり得る。いくつかの例として、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びポリ（Ｈｉｓ）タグが挙げられる。可溶化タグは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのシャペロン欠失種に発現される組換えタンパク質が、タンパク質の適正な折り畳みを補助し、それらが沈殿するのを防ぐのを助ける上で有用となり得る。いくつかの例として、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。タグ付け又はモニタリング部分は、感光性タグ、例えば、蛍光を含んでもよい。蛍光タグは、視覚化に有用である。ＧＦＰ及びその変異体が、蛍光タグとして一般に用いられるいくつかの例である。タンパク質タグは、特定の酵素修飾（ビオチンリガーゼによるビオチン化など）又は化学修飾（蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２との反応など）を起こすことが可能である。タグ付け又はモニタリング部分は、タンパク質を複数の他の構成体とつなげるために、結合させることが多い。タグ付け又はモニタリング部分は、また、特定のタンパク質分解又は酵素切断（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、Ｘａ因子又はエンテロペプチダーゼによる）によって除去することもできる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、さらに、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターを標識若しくはモニターするためのタグを含み得る。タグ付け又はモニタリング部分は、化学物質又は酵素切断、例えば、タンパク質分解若しくはインテインスプライシングにより除去可能であってもよい。アフィニティタグは、アフィニティ技術を用いてタグ付けされたポリペプチドを精製するのに有用となり得る。いくつかの例として、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びポリ（Ｈｉｓ）タグが挙げられる。可溶化タグは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのシャペロン欠失種に発現される組換えタンパク質が、タンパク質の適正な折り畳みを補助し、それらが沈殿するのを防ぐのを助ける上で有用となり得る。いくつかの例として、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。タグ付け又はモニタリング部分は、感光性タグ、例えば、蛍光を含んでもよい。蛍光タグは、視覚化に有用である。ＧＦＰ及びその変異体が、蛍光タグとして一般に用いられるいくつかの例である。タンパク質タグは、特定の酵素修飾（ビオチンリガーゼによるビオチン化など）又は化学修飾（蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２との反応など）を起こすことが可能である。タグ付け又はモニタリング部分は、タンパク質を複数の他の構成体とつなげるために、結合させることが多い。タグ付け又はモニタリング部分は、また、特定のタンパク質分解又は酵素切断（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、Ｘａ因子又はエンテロペプチダーゼによる）によって除去することもできる。
ナノ粒子
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、さらに、ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子としては、約１～約１０００ナノメートル、約１～約５００ナノメートル、約１～約１００ｎｍ、約５０～約３００ｎｍ、約７５～約２００ｎｍ、及び約１００～約２００ｎｍ、並びにこれらの間の任意の範囲のサイズを有する無機材料が挙げられる。ナノ粒子は、一般に、ナノ単位の寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的に球体であるが、ナノ粒子組成物に応じて様々な形態が可能である。ナノ粒子に対して外部の環境と接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面として識別される。本明細書に記載するナノ粒子の場合、サイズ制限を２つの寸法に限定することができ、そのため、ナノ粒子は、約１～約１０００ｎｍの直径を有する複合構造を含み、ここで、具体的な直径は、ナノ粒子組成物及び実験設計に従うナノ粒子の意図される使用に応じて変わる。例えば、治療用途に使用されるナノ粒子は、典型的に、約２００ｎｍ以下のサイズを有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はＣＡＶベクターは、さらに、ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子としては、約１～約１０００ナノメートル、約１～約５００ナノメートル、約１～約１００ｎｍ、約５０～約３００ｎｍ、約７５～約２００ｎｍ、及び約１００～約２００ｎｍ、並びにこれらの間の任意の範囲のサイズを有する無機材料が挙げられる。ナノ粒子は、一般に、ナノ単位の寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的に球体であるが、ナノ粒子組成物に応じて様々な形態が可能である。ナノ粒子に対して外部の環境と接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面として識別される。本明細書に記載するナノ粒子の場合、サイズ制限を２つの寸法に限定することができ、そのため、ナノ粒子は、約１～約１０００ｎｍの直径を有する複合構造を含み、ここで、具体的な直径は、ナノ粒子組成物及び実験設計に従うナノ粒子の意図される使用に応じて変わる。例えば、治療用途に使用されるナノ粒子は、典型的に、約２００ｎｍ以下のサイズを有する。
表面電荷及び立体安定化といったナノ粒子の追加的な望ましい特性も、意図される具体的な用途を考慮して変わり得る。臨床用途に望ましいと考えられる例示的な特性は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２００８ ｖｏｌ．７，ｐａｇｅｓ７７１－７８２；Ｄｕｎｃａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２００６ ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ ６８８－７０１；及びＡｌｌｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２００２ ｖｏｌ．２ ｐａｇｅｓ７５０－７６３に記載されており、これらの各々は、全体を参照により本明細書に組み込む。追加特性は、当業者が、本開示を読んで確認することができる。ナノ粒子の寸法及び特性を検出するための例示的な技術として、限定はされないが、動的光散乱法（ＤＬＳ）並びに透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）及び原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）などの種々の顕微鏡検査が挙げられる。粒子形態を検出するための例示的な技術として、限定はされないが、ＴＥＭ及びＡＦＭが挙げられる。ナノ粒子の表面電荷を検出するための例示的な技術として、限定はされないが、ゼータ電位法がある。他の化学的特性を検出するための別の技術は、１Ｈ、１１Ｂ、及び１３Ｃ及び１９ＦＮＭＲによるもの、ＵＶ／Ｖｉｓ及び赤外／ラマン分光法及び蛍光分光法（ナノ粒子を蛍光標識と組み合わせて使用する場合）、並びに当業者により確認可能なそれ以外の技術を含む。
Ｖ．宿主細胞
本発明はさらに、例えば本明細書に記載されるような、ＣＡＶベクター、ＣＡＶ、遺伝子エレメント、又は遺伝子エレメント構築物を含む宿主又は宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、鳥類（例えば、ニワトリ）、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物若しくは細胞である。特定の実施形態では、本明細書で確認されるように、提供されるＣＡＶベクターはある範囲の異なる宿主細胞に感染する。標的宿主細胞は、中胚葉、内胚葉、又は外胚葉起源の細胞を含む。標的宿主細胞としては、例えば、上皮細胞、筋細胞、白血球（例えば、リンパ球）、腎組織細胞、肺組織細胞が挙げられる。
本発明はさらに、例えば本明細書に記載されるような、ＣＡＶベクター、ＣＡＶ、遺伝子エレメント、又は遺伝子エレメント構築物を含む宿主又は宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、鳥類（例えば、ニワトリ）、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物若しくは細胞である。特定の実施形態では、本明細書で確認されるように、提供されるＣＡＶベクターはある範囲の異なる宿主細胞に感染する。標的宿主細胞は、中胚葉、内胚葉、又は外胚葉起源の細胞を含む。標的宿主細胞としては、例えば、上皮細胞、筋細胞、白血球（例えば、リンパ球）、腎組織細胞、肺組織細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主若しくは宿主細胞を、ＣＡＶベクターと接触（例えば、ＣＡＶベクターに感染）させる。一部の実施形態では、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主におけるＣＡＶベクターの量は、投与後の任意の時点で測定することができる。ある特定の実施形態では、培養物中のＣＡＶベクター増殖の経過時間を測定する。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるＣＡＶベクターは、遺伝性である。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、体液及び／又は細胞中で母から子に線形伝達される。一部の実施形態では、元の宿主細胞由来の娘細胞は、ＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、母は子に、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の効率でＣＡＶベクターを伝達し、又は宿主細胞から娘細胞に、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の伝達効率でＣＡＶベクターを伝達する。一部の実施形態では、宿主細胞中のＣＡＶベクターは、減数分裂中に、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の伝達効率を有する。一部の実施形態では、宿主細胞中のＣＡＶベクターは、有糸分裂中に、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の伝達効率を有する。一部の実施形態では、細胞中のＣＡＶベクターは、約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％、若しくはこれらの間の任意のパーセンテージの伝達効率を有する。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞内で複製する。一実施形態では、ＣＡＶベクターは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製することができる。他の実施形態では、ＣＡＶベクターは複製欠損か、複製不全である。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主細胞において複製するが、ＣＡＶベクターは、宿主のゲノム中に、例えば、宿主の染色体と統合しない。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、例えば、宿主の染色体と、無視できる程度の組換え頻度を有する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、例えば、宿主の染色体と、例えば、約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍ未満、若しくはそれ以下の組換え頻度を有する。
ＶＩ．使用方法
本明細書に記載のＣＡＶベクター及びＣＡＶベクターを含む組成物は、例えば、それを必要とする被験者（例えば、哺乳動物被験者、例えば、ヒト被験者）の疾患、障害、又は状態を治療する方法に用いることができる。本明細書に記載の医薬組成物の投与は、例えば、非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、体腔内、及び皮下を含む）投与により実施してよい。ＣＡＶベクターは、単独で投与されてもよく、又は医薬組成物として製剤化されてもよい。
本明細書に記載のＣＡＶベクター及びＣＡＶベクターを含む組成物は、例えば、それを必要とする被験者（例えば、哺乳動物被験者、例えば、ヒト被験者）の疾患、障害、又は状態を治療する方法に用いることができる。本明細書に記載の医薬組成物の投与は、例えば、非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、体腔内、及び皮下を含む）投与により実施してよい。ＣＡＶベクターは、単独で投与されてもよく、又は医薬組成物として製剤化されてもよい。
ＣＡＶベクターは、単位用量非経口組成物などの単位用量組成物の形態で投与してもよい。こうした組成物は、一般に、混合により調製した後、非経口投与のために好適に適合させることができる。こうした組成物は、例えば、注射液及び注入液若しくは懸濁液又は座薬又はエアゾールの形態であってもよい。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター又は例えば、本明細書に記載する通り、これを含む組成物の投与により、例えば、被験者の標的細胞に対して、ＣＡＶベクターに含まれる遺伝子エレメントの送達を達成することができる。
例えば、エフェクター（内在性若しくは外因性エフェクター）を含む、本明細書に記載のＣＡＶベクター又はその組成物は、細胞、組織、又は被験者にエフェクターを送達するために使用することができる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクター又はその組成物を用いて、骨髄、血液、心臓、胃腸又は皮膚にエフェクターを送達する。本明細書に記載のＣＡＶベクター組成物の投与によるエフェクターの送達によって、細胞、組織、又は被験者におけるノンコーディングＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルを調節（例えば、増大若しくは低減）することができる。この様式での発現レベルの調節は、エフェクターが送達される細胞の機能活性の改変をもたらし得る。一部の実施形態では、調節される機能活性は、天然の酵素、構造、又は調節活性であってよい。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクター、又はそのコピーは、細胞内への送達から２４時間（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、３０日、又は１ヵ月）後に細胞内で検出可能である。実施形態では、ＣＡＶベクター又はその組成物は、標的細胞に対する作用を媒介し、その作用は、少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、２、３、若しくは４週間、又は１、２、３、６、若しくは１２ヵ月間持続する。一部の実施形態（例えば、ＣＡＶベクター又はその組成物が、外性タンパク質をコード化する遺伝子エレメントを含む）では、作用は、１、２、３、４、５、６、若しくは７日、２、３、若しくは４週間、又は１、２、３、６、若しくは１２ヵ月間未満持続する。
本明細書に記載のＣＡＶベクター、又はＣＡＶベクターを含む組成物を用いて治療することができる疾患、障害、及び状態の例として、限定はしないが、以下：免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、炎症性障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌、非小細胞肺癌、例えば、ｍＩＲ－６２５、例えば、カスパーゼ－３に対して応答性の遺伝子を発現する腫瘍）、及び胃腸障害が挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶベクターを接触させた細胞の活性又は機能を調節（例えば、増大若しくは低減）する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶベクターを接触させた細胞中の分子（例えば、核酸若しくはタンパク質）のレベル又は活性を調節（例えば、増大若しくは低減）する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶベクターを接触させた細胞、例えば、癌細胞の生存能を例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－６２５を含み、これは、ＣＡＶベクターを接触させた細胞、例えば、癌細胞の生存能を例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、ＣＡＶベクターを接触させた細胞、例えば、癌細胞のアポトーシスを、例えば、カスパーゼ－３活性を増大することにより、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上増大する。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－６２５を含み、これは、ＣＡＶベクターを接触させた細胞、例えば、癌細胞のアポトーシスを例えば、カスパーゼ－３活性を増大することにより、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上増大する。
ＶＩＩ．投与／送達
組成物（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクターを含む医薬組成物）は、例えば本明細書に記載の薬学的に許容される賦形剤を含むように、製剤化してもよい。医薬組成物は、任意選択で、１つ又は複数の追加活性物質、例えば、治療及び／又は予防に有効な物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、滅菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。医薬剤の製剤化及び／又は製造に関する一般指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
組成物（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクターを含む医薬組成物）は、例えば本明細書に記載の薬学的に許容される賦形剤を含むように、製剤化してもよい。医薬組成物は、任意選択で、１つ又は複数の追加活性物質、例えば、治療及び／又は予防に有効な物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、滅菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。医薬剤の製剤化及び／又は製造に関する一般指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、当業者には、こうした組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、ヒト以外の動物、例えば、ヒト以外の哺乳動物への投与に好適であることは理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にする目的での、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾は十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験を行うだけで、こうした修飾を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が考慮される被験者として、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／若しくはラットを含む哺乳動物；並びに／又は商業関連のトリ、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／若しくはシチメンチョウを含むトリが挙げられる。
本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の分野で公知の、又は以後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ若しくは複数の他の補助成分と結合させるステップ、並びに必要な場合及び／又は望ましい場合、次に、生成物を分割、造形及び／又は包装するステップを含む。
一態様では、本発明は、ＣＡＶベクターを被験者に送達する方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載のＣＡＶベクターを含む医薬組成物を、被験者に送達するステップを含む。一部の実施形態では、投与されたＣＡＶベクターは、被験者において複製する（例えば、被験者のウイルス集団の一部となる）。
医薬組成物は、野生型若しくはネイティブウイルスエレメント及び／又は修飾ウイルスエレメントを含み得る。ＣＡＶベクターは、１つ又は複数のＣＡＶ配列（例えば、核酸配列若しくはそのアミノ酸配列をコード化する核酸配列）、又はそれに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列を含み得る。ＣＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載の通り、１つ又は複数のＣＡＶ配列（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１核酸配列）に対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子を含み得る。ＣＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載の通り、ＣＡＶアミノ酸配列（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子のアミノ酸配列）に対して、少なくとも約約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸分子を含み得る。ＣＡＶベクターは、例えば、本明細書に記載の通り、ＣＡＶアミノ酸配列（例えば、ＣＡＶＶＰ１分子のアミノ酸配列）に対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、内在性遺伝子及びタンパク質発現を、参照標準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上増大する（刺激する）上で十分である。ある特定の実施形態では、ＣＡＶベクターは、内在性遺伝子及びタンパク質発現を、参照基準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上低減する（阻害する）上で十分である。
一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、宿主若しくは宿主細胞において１つ又は複数のウイルス特性、例えば、向性、感染力、免疫抑制／活性化を、参照基準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上阻害／増強する。
一部の実施形態では、ウイルス遺伝子情報に示されていない１つ又は複数のウイルス株をさらに含む医薬組成物を被験者に投与する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＶベクターを含む医薬組成物は、ウイルス感染を調節する上で十分な用量及び時間で投与される。ウイルス感染のいくつかの非限定的な例を以下に挙げる；アデノ関連ウイルス、アイチウイルス（Ａｉｃｈｉ ｖｉｒｕｓ）、オーストラリアコウモリ・リッサウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂａｔ ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、バンナウイルス（Ｂａｎｎａ ｖｉｒｕｓ）、バーマ森林ウイルス（Ｂａｒｍａｈ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ブンヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ ｖｉｒｕｓ）、ブンヤウイルス・ラ・クロス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ）、カンジキウサギブンヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅ）、オナガザルヘルペスウイルス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、チャンディプラウイルス（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）、コーサウイルスＡ（Ｃｏｓａｖｉｒｕｓ Ａ）、牛痘ウイルス（Ｃｏｗｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、コサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、クリミア－コンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ－Ｃｏｎｇｏ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ），デング熱ウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、ドーリウイルス（Ｄｈｏｒｉ ｖｉｒｕｓ）、デュグベウイルス（Ｄｕｇｂｅ ｖｉｒｕｓ）、デュベンヘイジウイルス（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヨーロッパコウモリ・リッサウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢ ｖｉｒｕｓ Ｃ／Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ ｖｉｒｕｓ）、ハンターンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ ｖｉｒｕｓ）、ヘンドラウイルス（Ｈｅｎｄｒａ ｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ）、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ）、ウマポックスウイルス（Ｈｏｒｓｅｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ヒトアデノウイルス（Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒトアストロウイルス（Ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ヒトエンテロウイルス６８（Ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ６８）、ヒトエンテロウイルス７０（Ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７０）、ヒトヘルペスウイルス１型（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １）、ヒトヘルペスウイルス２型（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２）、ヒトヘルペスウイルス６型（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ６）、ヒトヘルペスウイルス７型（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ７）、ヒトヘルペスウイルス８型（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ８）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルス１型（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １）、ヒトパピローマウイルス２型（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ２）、ヒトパピローマウイルス１６型（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １６）、ヒトパピローマウイルス１８型（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １８）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｂ１９）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ヒトライノウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ ＳＡＲｓ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヒトスプマレトロウイルス（Ｈｕｍａｎ ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトＴ－リンパ好性ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ヒトトロウイルス（Ｈｕｍａｎ ｔｏｒｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、イスファンウイルス（Ｉｓｆａｈａｎ ｖｉｒｕｓ）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、フニンアレナウイルス（Ｊｕｎｉｎ ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩ Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ ｖｉｒｕｓ）、ラゴスコウモリウイルス（Ｌａｇｏｓ ｂａｔ ｖｉｒｕｓ）、レイク・ビクトリア・マーブルグウイルス（Ｌａｋｅ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）、ランガトウイルス（Ｌａｎｇａｔ ｖｉｒｕｓ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ ｖｉｒｕｓ）、ローズデールウイルス（Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ ｖｉｒｕｓ）、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌ ｖｉｒｕｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、メンゴ脳心筋炎ウイルス（Ｍｅｎｇｏ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（Ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、モコラウイルス（Ｍｏｋｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、伝染性軟属腫ウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ ｖｉｒｕｓ）、サル痘ウイルス（Ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ニューヨークウイルス（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｖｉｒｕｓ）、ニパウイルス（Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ）、ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ）、オニョン－ニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）、オルフウイルス（Ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ）、オロポーシャウイルス（Ｏｒｏｐｏｕｃｈｅ ｖｉｒｕｓ）、ピチンデウイルス（Ｐｉｃｈｉｎｄｅ ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、プンタ・トロ・フレボウイルス（Ｐｕｎｔａ ｔｏｒｏ ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）、プーマラウイルス（Ｐｕｕｍａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ ｖａｌｌｅｙ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ロサウイルスＡ（Ｒｏｓａｖｉｒｕｓ Ａ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ａ）、ロタウイルスＢ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ｂ）、ロタウイルスＣ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ｃ）、ルベラウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ）、サギヤマウイルス（Ｓａｇｉｙａｍａ ｖｉｒｕｓ）、サリウイルスＡ（Ｓａｌｉｖｉｒｕｓ Ａ）、砂バエ熱シチリアウイルス（Ｓａｎｄｆｌｙ ｆｅｖｅｒ ｓｉｃｉｌｉａｎ ｖｉｒｕｓ）、サッポロウイルス（Ｓａｐｐｏｒｏ ｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ソウルウイルス（Ｓｅｏｕｌ ｖｉｒｕｓ）、サル泡沫状ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、サルウイルス５型（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）、サウサンプトンウイルス（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介ポワッサンウイルス（Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）、トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）、トスカーナウイルス（Ｔｏｓｃａｎａ ｖｉｒｕｓ）、ウークニエミウイルス（Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉ ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ－ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）、天然痘ウイルス（Ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、水痘性口炎（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、ヤバサル腫瘍ウイルス（Ｙａｂａ ｍｏｎｋｅｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）、ヤバ様疾患ウイルス（Ｙａｂａ－ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、及びジカウイルス（Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ）。いくつかの実施形態では、ＣＡＶベクターは、被験者に既に存在するウイルスを、参照標準と比較して、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上駆逐及び／又は移動させる上で十分である。いくつかの実施形態では、ＣＡＶベクターは、慢性又は急性ウイルス感染と競合する上で十分である。いくつかの実施形態では、ＣＡＶベクターは、ウイルス感染（例えば、プロウイルス感染）から防御するために予防的に投与してもよい。一部の実施形態では、ＣＡＶベクターは、（例えば、表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上）調節するのに十分な量で存在する。一部の実施形態では、治療、治療すること、及びその同類語は、例えば、疾患、病的状態、又は障害を回復させる、改善する、安定化させる、予防する若しくは治すという目的での被検者の医療管理（例えば、ＣＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるＣＡＶベクターを投与することによって）を含む。一部の実施形態では、治療は、積極的治療（疾患、病的状態、又は障害を回復させることを目的とする治療）、原因治療（関連する疾患、病的状態、又は障害の原因に向けられる治療）、緩和治療（症状の緩和のために設計された治療）、予防的治療（関連する疾患、病的状態、又は障害の発症を予防し、最小限に抑え、又は部分的若しくは完全に阻害することを目的とする治療）、及び／又は支持療法（別の治療法を補完するために採用された治療）を含む。
再投与
本明細書に記載のＣＡＶベクターは、いくつかの例では、複数回用量（例えば、別々に投与される用量）で投与され得る送達ビヒクルとして使用され得る。理論に束縛されることを望まないが、一部の実施形態では、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような）は、比較的低い免疫応答（例えば、例えば、実施例１２において観察されるような、５０％ ＧＭＴ値として測定されるように）を誘導し、例えば、１つ以上のＣＡＶベクターによる対象の反復投与（例えば、同じＣＡＶベクター又は異なるＣＡＶベクターの複数回用量）を可能にする。一態様では、本発明は、対象に第１の複数のＣＡＶベクターを投与し、次いで第２の複数のＣＡＶベクターを投与することを含む、エフェクターを送達する方法を提供する。一部の実施形態では、第２の複数のＣＡＶベクターは、第１の複数のＣＡＶベクターと同じタンパク質性外部を含む。別の態様では、本発明は、エフェクターを受容するための対象（例えば、ヒト対象）を選択する方法を提供し、ここで対象は、エフェクターをコードする遺伝子エレメントを含む第１の複数のＣＡＶベクターを以前に受容したか、又は受容したと同定され、該方法は、エフェクター（例えば、第１の複数のＣＡＶベクターの遺伝子エレメントによってコードされるものと同じエフェクター、又は第１の複数のＣＡＶベクターの遺伝子エレメントによってコードされるものとは異なるエフェクター）をコードする遺伝子エレメントを含む第２の複数のＣＡＶベクターを受容するための対象を選択することを含む。別の態様では、本発明は、第２の複数のＣＡＶベクターを受容するのに適した対象（例えば、ヒト対象）を同定する方法を提供し、該方法は、エフェクターをコードする遺伝子エレメントを含む第１の複数のＣＡＶベクターを以前に受容した対象を同定することを含み、第１の複数のＣＡＶベクターを受容したと同定されている対象は、その対象が第２の複数のＣＡＶベクターを受容するのに適していることを示す。
本明細書に記載のＣＡＶベクターは、いくつかの例では、複数回用量（例えば、別々に投与される用量）で投与され得る送達ビヒクルとして使用され得る。理論に束縛されることを望まないが、一部の実施形態では、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載されるような）は、比較的低い免疫応答（例えば、例えば、実施例１２において観察されるような、５０％ ＧＭＴ値として測定されるように）を誘導し、例えば、１つ以上のＣＡＶベクターによる対象の反復投与（例えば、同じＣＡＶベクター又は異なるＣＡＶベクターの複数回用量）を可能にする。一態様では、本発明は、対象に第１の複数のＣＡＶベクターを投与し、次いで第２の複数のＣＡＶベクターを投与することを含む、エフェクターを送達する方法を提供する。一部の実施形態では、第２の複数のＣＡＶベクターは、第１の複数のＣＡＶベクターと同じタンパク質性外部を含む。別の態様では、本発明は、エフェクターを受容するための対象（例えば、ヒト対象）を選択する方法を提供し、ここで対象は、エフェクターをコードする遺伝子エレメントを含む第１の複数のＣＡＶベクターを以前に受容したか、又は受容したと同定され、該方法は、エフェクター（例えば、第１の複数のＣＡＶベクターの遺伝子エレメントによってコードされるものと同じエフェクター、又は第１の複数のＣＡＶベクターの遺伝子エレメントによってコードされるものとは異なるエフェクター）をコードする遺伝子エレメントを含む第２の複数のＣＡＶベクターを受容するための対象を選択することを含む。別の態様では、本発明は、第２の複数のＣＡＶベクターを受容するのに適した対象（例えば、ヒト対象）を同定する方法を提供し、該方法は、エフェクターをコードする遺伝子エレメントを含む第１の複数のＣＡＶベクターを以前に受容した対象を同定することを含み、第１の複数のＣＡＶベクターを受容したと同定されている対象は、その対象が第２の複数のＣＡＶベクターを受容するのに適していることを示す。
一部の実施形態では、第２の複数のＣＡＶベクターは、第１の複数のＣＡＶベクターのＣＡＶベクターと共通する少なくとも１つの表面エピトープを有するタンパク質性外部を含む。一部の実施形態では、第１の複数のＣＡＶベクター及び第２の複数のＣＡＶベクターは、同じエフェクターをコードする遺伝子エレメントを保有する。一部の実施形態では、第１の複数のＣＡＶベクター及び第２の複数のＣＡＶベクターは、異なるエフェクターをコードする遺伝子エレメントを保有する。
一部の実施形態では、第２の複数は、第１の複数とほぼ同じ量及び／又は濃度のＣＡＶベクターを含み（例えば、投与時に対象の体重に対して正規化された場合）、例えば、第２の複数は、投与時に対象の体重に対して正規化された場合、第１の複数におけるＣＡＶベクターの数の９０～１１０％、例えば、９５～１０５％を含む。一部の実施形態では、第１の複数は、第２の複数よりも多い投与量のＣＡＶベクターを含み、例えば、第１の複数は、第２の複数よりも多い量及び／又は濃度のＣＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、第１の複数は、第２の複数よりも低い投与量のＣＡＶベクターを含み、例えば、第１の複数は、第２の複数よりも少ない量及び／又は濃度のＣＡＶベクターを含む。
一部の実施形態では、対象は、第１及び第２の複数のＣＡＶベクターの投与の間に、例えば、第１の複数のＣＡＶベクター又はその子孫の存在（例えば、持続性）について評価される。一部の実施形態では、対象は、第１の複数のＣＡＶベクター又はその子孫の存在が検出されない場合、第２の複数のＣＡＶベクターを投与される。
一部の実施形態では、第２の複数は、対象への第１の複数の投与の少なくとも１、２、３、若しくは４週間後、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月後、又は１、２、３、４、５、１０、若しくは２０年後に、対象に投与される。一部の実施形態では、第２の複数は、対象への第１の複数の投与の１～２週間、２～３週間、３～４週間、１～２ヶ月、３～４ヶ月、４～５ヶ月、５～６ヶ月、６～７ヶ月、７～８ヶ月、８～９ヶ月、９～１０ヶ月、１０～１１ヶ月、１１～１２ヶ月、１～２年、２～３年、３～４年、４～５年、５～１０年、又は１０～２０年後に、対象に投与される。一部の実施形態では、本方法は、反復用量のアネロベクター（ａｎｅｌｌｏｖｅｃｔｏｒ）を少なくとも１、２、３、４、又は５年間にわたって投与することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、第１の複数の投与後、及び第２の複数の投与前に、以下の１つ以上を評価することをさらに含む：
ａ）対象におけるエフェクターのレベル若しくは活性（例えば、タンパク質エフェクターを検出することによって、例えば、ＥＬＩＳＡによって；核酸エフェクターを検出することによって、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによって、又はエフェクターの下流効果、例えば、エフェクターによって影響を受ける内因性遺伝子のレベルを検出することによって）；
ｂ）対象における第１の複数のＣＡＶベクターのレベル若しくは活性（例えば、ＣＡＶベクターのＶＰ１のレベルを検出することによって）；
ｃ）アネロベクターが治療のために投与された対象における疾患の存在、重篤度、進行、若しくは徴候若しくは症状；及び／又は
ｄ）ＣＡＶ若しくはＣＡＶベクターに対する免疫応答、例えば中和抗体の存在若しくはレベル。
ａ）対象におけるエフェクターのレベル若しくは活性（例えば、タンパク質エフェクターを検出することによって、例えば、ＥＬＩＳＡによって；核酸エフェクターを検出することによって、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによって、又はエフェクターの下流効果、例えば、エフェクターによって影響を受ける内因性遺伝子のレベルを検出することによって）；
ｂ）対象における第１の複数のＣＡＶベクターのレベル若しくは活性（例えば、ＣＡＶベクターのＶＰ１のレベルを検出することによって）；
ｃ）アネロベクターが治療のために投与された対象における疾患の存在、重篤度、進行、若しくは徴候若しくは症状；及び／又は
ｄ）ＣＡＶ若しくはＣＡＶベクターに対する免疫応答、例えば中和抗体の存在若しくはレベル。
一部の実施形態では、方法は、例えば、本明細書に記載されるように、第３、第４、第５、及び／又はさらに複数のＣＡＶベクターを対象に投与することをさらに含む。
一部の実施形態では、第１の複数及び第２の複数は、同じ投与経路、例えば、静脈内投与を介して投与される。一部の実施形態では、第１の複数及び第２の複数は、異なる投与経路を介して投与される。一部の実施形態では、第１及び第２の複数は、同じ実体（例えば、同じ医療提供者）によって投与される。一部の実施形態では、第１及び第２の複数は、異なる実体（例えば、異なる医療提供者）によって投与される。
本明細書で引用する全ての参照文献及び刊行物は参照により本明細書に組み込むものとする。
本発明のいくつかの実施形態を更に詳しく説明するために、以下の実施例を提供するが、これらは、本発明の範囲を何ら制限することは意図されず；それらの例示的な性質から、当業者には周知の他の手順、方法、又は技術が代替的に使用され得ることは理解されよう。
目次
実施例１：組換え合成ＣＡＶのレスキュー及び鳥類細胞における継代
実施例２：タンデムＣＡＶ構築物
実施例３：鳥類及びヒト細胞へのＣＡＶ結合
実施例４：例示的なＣＡＶベクター遺伝子エレメントの設計及び構築
実施例５：野生型ＣＡＶを用いたＣＡＶベクターのレスキュー
実施例６：上清からのＣＡＶベクターの精製
実施例７：ＣＡＶベクターは、ヒト細胞に形質導入する
実施例８：中和抗体に対するＣＡＶベクターの耐性
実施例９：野性型ＣＡＶを使用しないＣＡＶベクターの産生
実施例１０：マウスへの注射のためのｎＬｕｃ ＣＡＶベクターの産生
実施例１１：マウスへのＣＡＶベクターのインビボ投与、結果として、複数の器官におけるペイロードＤＮＡの送達
実施例１２：ＣＡＶベクター対ＡＡＶ２を受容するマウスにおける免疫原性
実施例１３：ＣＡＶ様粒子（ＶＬＰ）は、精製カプシドタンパク質からインビトロで集合する
実施例１４：ＣＡＶベクターは、後期エンドソーム経路を介してＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に進入する
実施例１５：熱処理後及び４℃での保存後のＣＡＶベクター生存率
実施例１６：タンデムプラスミドを用いたＣＡＶベクターの回収
実施例１：組換え合成ＣＡＶのレスキュー及び鳥類細胞における継代
実施例２：タンデムＣＡＶ構築物
実施例３：鳥類及びヒト細胞へのＣＡＶ結合
実施例４：例示的なＣＡＶベクター遺伝子エレメントの設計及び構築
実施例５：野生型ＣＡＶを用いたＣＡＶベクターのレスキュー
実施例６：上清からのＣＡＶベクターの精製
実施例７：ＣＡＶベクターは、ヒト細胞に形質導入する
実施例８：中和抗体に対するＣＡＶベクターの耐性
実施例９：野性型ＣＡＶを使用しないＣＡＶベクターの産生
実施例１０：マウスへの注射のためのｎＬｕｃ ＣＡＶベクターの産生
実施例１１：マウスへのＣＡＶベクターのインビボ投与、結果として、複数の器官におけるペイロードＤＮＡの送達
実施例１２：ＣＡＶベクター対ＡＡＶ２を受容するマウスにおける免疫原性
実施例１３：ＣＡＶ様粒子（ＶＬＰ）は、精製カプシドタンパク質からインビトロで集合する
実施例１４：ＣＡＶベクターは、後期エンドソーム経路を介してＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に進入する
実施例１５：熱処理後及び４℃での保存後のＣＡＶベクター生存率
実施例１６：タンデムプラスミドを用いたＣＡＶベクターの回収
実施例１：組換え合成ＣＡＶのレスキュー及び鳥類細胞における継代
この実施例では、組換え合成ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）を合成ゲノムから作製した。合成ゲノムから生存ＣＡＶをレスキューするために、ＣＡＶプラスミドＤＮＡをインビトロ環状化（ＩＶＣ）してベクター骨格を除去し、ニワトリ細胞にトランスフェクトし、得られた感染細胞を新鮮な細胞に繰り返し継代した。簡潔に述べると、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を、ｐ６３７（Ｎｅｇ）、ｐＣＡＶ、又はｐＣＡＶ－ＩＶＣ構築物でエレクトロポレーションした。細胞を、非感染ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を含む新鮮な培地に分割し、その後、４８時間毎に細胞を分割した。繰返し分割工程は、継代０（Ｐ０）、継代１（Ｐ１）、継代２（Ｐ２）、及びそれ以降を生じた。対照ＤＮＡ（以下に記載）を同様に処理して、環状二本鎖ＣＡＶゲノムＤＮＡが細胞に提供された場合にのみウイルス回収が検出されたことを示した（図１及び４）。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、感染細胞の顕微鏡検査、濃縮ウイルス懸濁液の電子顕微鏡検査、及びウェスタンブロッティングを用いて、ＣＡＶが細胞内で複製していることを示した。
この実施例では、組換え合成ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）を合成ゲノムから作製した。合成ゲノムから生存ＣＡＶをレスキューするために、ＣＡＶプラスミドＤＮＡをインビトロ環状化（ＩＶＣ）してベクター骨格を除去し、ニワトリ細胞にトランスフェクトし、得られた感染細胞を新鮮な細胞に繰り返し継代した。簡潔に述べると、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を、ｐ６３７（Ｎｅｇ）、ｐＣＡＶ、又はｐＣＡＶ－ＩＶＣ構築物でエレクトロポレーションした。細胞を、非感染ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を含む新鮮な培地に分割し、その後、４８時間毎に細胞を分割した。繰返し分割工程は、継代０（Ｐ０）、継代１（Ｐ１）、継代２（Ｐ２）、及びそれ以降を生じた。対照ＤＮＡ（以下に記載）を同様に処理して、環状二本鎖ＣＡＶゲノムＤＮＡが細胞に提供された場合にのみウイルス回収が検出されたことを示した（図１及び４）。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、感染細胞の顕微鏡検査、濃縮ウイルス懸濁液の電子顕微鏡検査、及びウェスタンブロッティングを用いて、ＣＡＶが細胞内で複製していることを示した。
二本鎖ゲノムを調製する
野生型ＣＡＶ株Ｃｕｘｈａｖｅｎ １のゲノムを、２，３１９ｂｐのＥｃｏＲＩ断片としてインビトロで合成し、次いでこれをプラスミドｐＵＣ５７にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＲＴｘ－７０８）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖させ、標準的な方法に従って精製した。プラスミド（７５μｇ）をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで消化し、アガロースゲルから２．３ｋｂバンドを切り出した。Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＣＡＶゲノムｄｓＤＮＡを抽出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いたライゲーション反応を５ｍＬの容量で行って、ＣＡＶ二本鎖ゲノムを環状化した。１６℃で２４時間インキュベートした後、ＤＮＡを標準的な方法に従ってエタノール沈殿させ、１００μＬの水に再懸濁した。ＤＮＡ溶液をＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に対して１時間透析した（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔｓ １０，０００ ＭＷＣＯ、１０－１００μｌ Ｃａｔ＃ ６９５７６）。
野生型ＣＡＶ株Ｃｕｘｈａｖｅｎ １のゲノムを、２，３１９ｂｐのＥｃｏＲＩ断片としてインビトロで合成し、次いでこれをプラスミドｐＵＣ５７にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＲＴｘ－７０８）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖させ、標準的な方法に従って精製した。プラスミド（７５μｇ）をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで消化し、アガロースゲルから２．３ｋｂバンドを切り出した。Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＣＡＶゲノムｄｓＤＮＡを抽出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いたライゲーション反応を５ｍＬの容量で行って、ＣＡＶ二本鎖ゲノムを環状化した。１６℃で２４時間インキュベートした後、ＤＮＡを標準的な方法に従ってエタノール沈殿させ、１００μＬの水に再懸濁した。ＤＮＡ溶液をＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に対して１時間透析した（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔｓ １０，０００ ＭＷＣＯ、１０－１００μｌ Ｃａｔ＃ ６９５７６）。
２つの陰性対照ＤＮＡ試料も調製した。１つの陰性対照はＣＡＶゲノムプラスミドｐＲＴｘ－７０８であり、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの精製後、上記のように細菌骨格を除去するために処理されなかった。別の陰性対照は、カプシドタンパク質ＶＰ１をコードする遺伝子が欠失したプラスミドｐＲＴｘ－６３７であった。
ＣＡＶゲノムのトランスフェクション
それぞれの条件について、２．５ｕｇのＤＮＡを１０６の生きたＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞（ＡＴＣＣ）（すなわち約２．５ｐｇ／細胞）に加え、大型キュベット（１０６細胞／キュベット）を有する４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）及びプログラムＤＳ－１３７を用いたエレクトロポレーションによって、製造業者の説明書に従って送達した。各条件について、トランスフェクトした細胞を推奨されるように回収し、Ｔ２５フラスコ中に１０％ ＦＢＳを含有する５ｍＬのＲＰＭＩの最終培養容量に移した。トランスフェクトした細胞を、加湿した４０℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で２～３日間増殖させた。この工程の生成物は、本明細書では継代０（Ｐ０）と称される。
それぞれの条件について、２．５ｕｇのＤＮＡを１０６の生きたＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞（ＡＴＣＣ）（すなわち約２．５ｐｇ／細胞）に加え、大型キュベット（１０６細胞／キュベット）を有する４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）及びプログラムＤＳ－１３７を用いたエレクトロポレーションによって、製造業者の説明書に従って送達した。各条件について、トランスフェクトした細胞を推奨されるように回収し、Ｔ２５フラスコ中に１０％ ＦＢＳを含有する５ｍＬのＲＰＭＩの最終培養容量に移した。トランスフェクトした細胞を、加湿した４０℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で２～３日間増殖させた。この工程の生成物は、本明細書では継代０（Ｐ０）と称される。
トランスフェクト／感染細胞の採取及び継代
Ｐ０細胞懸濁液（約５ｍＬ）を、ｑＰＣＲ及びウェスタンブロット分析のために２アリコートの細胞懸濁液を取ることにより採取し、次いで、１．５ｍＬの細胞懸濁液を新しいフラスコに移し、７ｍＬの最終容量の新鮮な細胞を用いて細胞数を２×１０５細胞／ｍＬまで上げ、次いで、４０℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。このプロセスを４継代繰り返した。
Ｐ０細胞懸濁液（約５ｍＬ）を、ｑＰＣＲ及びウェスタンブロット分析のために２アリコートの細胞懸濁液を取ることにより採取し、次いで、１．５ｍＬの細胞懸濁液を新しいフラスコに移し、７ｍＬの最終容量の新鮮な細胞を用いて細胞数を２×１０５細胞／ｍＬまで上げ、次いで、４０℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。このプロセスを４継代繰り返した。
ウイルス力価の測定
細胞懸濁試料（２００μＬ）を、ＰｕｒｅＬｉｎｋウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、２００μＬの溶解緩衝液及び２５μＬのプロテイナーゼＫを試料管に直接添加することによって精製した。コピー／ｍｌを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ試薬及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムｑＰＣＲ機器を使用して、製造業者の推奨に従って実施したＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって評価した。
細胞懸濁試料（２００μＬ）を、ＰｕｒｅＬｉｎｋウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、２００μＬの溶解緩衝液及び２５μＬのプロテイナーゼＫを試料管に直接添加することによって精製した。コピー／ｍｌを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ試薬及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムｑＰＣＲ機器を使用して、製造業者の推奨に従って実施したＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって評価した。
使用したプライマー及びプローブ：
ＣＡＶ Ｆｗｄ：５’－ＴＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧ－３’
ＣＡＶ Ｒｅｖ：５’－ＣＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧ－３’
ＣＡＶ ＶＰ１プローブ：５’－６ＦＡＭ－ＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＣＴＡＴ－ＭＧＢＮＦＱ－３’
ＣＡＶ Ｆｗｄ：５’－ＴＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧ－３’
ＣＡＶ Ｒｅｖ：５’－ＣＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧ－３’
ＣＡＶ ＶＰ１プローブ：５’－６ＦＡＭ－ＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＣＴＡＴ－ＭＧＢＮＦＱ－３’
分析は、継代０、１、２、及び４（Ｐ１～４；図１）からの試料について行った。ＩＶＣ ＣＡＶ ＤＮＡで最初にトランスフェクトされた細胞からの試料のみが、継代数を超えるＣＡＶコピーの増加を示した。これは、ＣＡＶ ＤＮＡの複製及び新鮮な細胞への伝達が起こったことを示した。
ウェスタンブロットによりウイルスタンパク質を検出する
ＣＡＶタンパク質発現を分析するために、３０ｕｌの各試料を還元し、ＳＤＳ試料緩衝液を用いて変性させ、１０分間煮沸した。次いで、試料をＢＯＬＴ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上にロードし、供給業者によって推奨されるように４０分間電気泳動した。ゲルを水中で５分間洗浄し、ｉＢｌｏｔ２システムを用いてニトロセルロース膜に移した。膜をＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄し、Ｌｉ－Ｃｏｒ ＴＢＳブロッキング緩衝液で１時間ブロッキングした。ＴＢＳブロッキング緩衝液中で１：１００に希釈したウサギ抗アポプチン（ＶＰ３；Ａｂｃａｍ、Ａｂ１９３６１２）及び抗ＶＰ２血清（Ｃｕｓａｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＳＢ－ＰＡ３０２４７１ＬＡ０１ＣＩＤ）の混合物と共に、ブロッキングされた膜を４℃で１６時間インキュベートすることによって検出を行った。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ ６８０二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を膜に適用し、洗浄し、次いでＬｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ機器を用いて画像化した。図１は、ＩＶＣ ＣＡＶトランスフェクト細胞（Ｐ０）に由来するＰ１及びＰ２細胞が両方のＣＡＶタンパク質について陽性であったが、他のトランスフェクションに由来する試料については陽性でなかったことを示す。
ＣＡＶタンパク質発現を分析するために、３０ｕｌの各試料を還元し、ＳＤＳ試料緩衝液を用いて変性させ、１０分間煮沸した。次いで、試料をＢＯＬＴ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上にロードし、供給業者によって推奨されるように４０分間電気泳動した。ゲルを水中で５分間洗浄し、ｉＢｌｏｔ２システムを用いてニトロセルロース膜に移した。膜をＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄し、Ｌｉ－Ｃｏｒ ＴＢＳブロッキング緩衝液で１時間ブロッキングした。ＴＢＳブロッキング緩衝液中で１：１００に希釈したウサギ抗アポプチン（ＶＰ３；Ａｂｃａｍ、Ａｂ１９３６１２）及び抗ＶＰ２血清（Ｃｕｓａｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＳＢ－ＰＡ３０２４７１ＬＡ０１ＣＩＤ）の混合物と共に、ブロッキングされた膜を４℃で１６時間インキュベートすることによって検出を行った。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ ６８０二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を膜に適用し、洗浄し、次いでＬｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ機器を用いて画像化した。図１は、ＩＶＣ ＣＡＶトランスフェクト細胞（Ｐ０）に由来するＰ１及びＰ２細胞が両方のＣＡＶタンパク質について陽性であったが、他のトランスフェクションに由来する試料については陽性でなかったことを示す。
感染細胞の特徴付け
Ｐ４からの細胞試料を位相差顕微鏡で観察して、細胞形態を調べた。ＩＶＣ ＣＡＶ試料中の細胞は、正常な外観を有する対照試料由来の細胞とは対照的に、多くの場合、拡大され、複数の細胞質封入体を有することが見出された。
Ｐ４からの細胞試料を位相差顕微鏡で観察して、細胞形態を調べた。ＩＶＣ ＣＡＶ試料中の細胞は、正常な外観を有する対照試料由来の細胞とは対照的に、多くの場合、拡大され、複数の細胞質封入体を有することが見出された。
レスキューＣＡＶの単離
別個の実験において、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をトランスフェクトし、上記のようにＰ２に２回継代した。エレクトロポレーションによるＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞へのＣＡＶ ＩＶＣ又はｐ６３７のトランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞を２回継代し（Ｐ０からＰ２；４８時間毎に実施される非感染ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を有する新鮮な培地への分割）、得られたＰ２の継代細胞を凍結融解によって溶解して、新鮮なＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を感染させるために使用された溶解物を生成した。これらの細胞からのウイルス回収はＰ３に対応した。ＣＡＶ ＩＶＣ又は陰性対照細胞からの細胞懸濁液を、凍結融解に供することによって溶解し、新鮮な細胞に適用し、次いで、これを４０℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を位相差顕微鏡により検査し、ＣＡＶ ＩＶＣ由来溶解物に感染した細胞のみに明瞭な細胞変性効果を示した。特に、ｐ６３７に由来するＰ２に曝露された細胞は正常な形態を示したが、ＩＶＣ ＣＡＶ ＤＮＡに由来するＰ２に曝露された細胞は感染細胞に典型的な形態を示した。Ｐ２及びＰ３アリコートのｑＰＣＲ分析に基づいて、ＣＡＶゲノムコピーの数は、ＣＡＶ ＩＶＣ由来溶解物を受容した細胞においてのみ、Ｐ２（図２において「インプット」として標識される）からＰ３（「アウトプット」）に増加した。これらの観察は、感染性ＣＡＶを引き起こすＣＡＶ ＩＶＣ ＤＮＡと一致した。
別個の実験において、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をトランスフェクトし、上記のようにＰ２に２回継代した。エレクトロポレーションによるＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞へのＣＡＶ ＩＶＣ又はｐ６３７のトランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞を２回継代し（Ｐ０からＰ２；４８時間毎に実施される非感染ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を有する新鮮な培地への分割）、得られたＰ２の継代細胞を凍結融解によって溶解して、新鮮なＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を感染させるために使用された溶解物を生成した。これらの細胞からのウイルス回収はＰ３に対応した。ＣＡＶ ＩＶＣ又は陰性対照細胞からの細胞懸濁液を、凍結融解に供することによって溶解し、新鮮な細胞に適用し、次いで、これを４０℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を位相差顕微鏡により検査し、ＣＡＶ ＩＶＣ由来溶解物に感染した細胞のみに明瞭な細胞変性効果を示した。特に、ｐ６３７に由来するＰ２に曝露された細胞は正常な形態を示したが、ＩＶＣ ＣＡＶ ＤＮＡに由来するＰ２に曝露された細胞は感染細胞に典型的な形態を示した。Ｐ２及びＰ３アリコートのｑＰＣＲ分析に基づいて、ＣＡＶゲノムコピーの数は、ＣＡＶ ＩＶＣ由来溶解物を受容した細胞においてのみ、Ｐ２（図２において「インプット」として標識される）からＰ３（「アウトプット」）に増加した。これらの観察は、感染性ＣＡＶを引き起こすＣＡＶ ＩＶＣ ＤＮＡと一致した。
ＣＡＶ感染Ｐ３細胞懸濁液を０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００で溶解し、ベンゾナーゼで処理し、２０％ショ糖クッションを通して沈降超遠心分離によりペレット化した。次いで、再懸濁ペレットを、等密度超遠心分離のために線形ＣｓＣｌ勾配に適用し、勾配からの画分を、ｑＰＣＲ（図３）及び感染性（図４）による特徴付けのために回収した。ＣＡＶゲノムコピーは、約１．３２ｇ／ｍＬの密度勾配でピークに達することが検出された（図３）。
ピーク画分を隣接する２つの画分と共にプールし、透析してＣｓＣｌを除去し、得られた精製ウイルス懸濁液を５０００倍又は５０，０００倍希釈のいずれかの後に新鮮な細胞に添加した。同様に希釈した陰性対照溶解物を用いて、模擬精製及び感染を並行して行った。陰性対照のいずれの希釈も、６日間にわたって毎日採取された細胞培養試料のｑＰＣＲによって測定されるように、感染の徴候を示さなかった（図４）。しかしながら、５０００倍のＣＡＶ希釈で感染させた培養試料は、２日後に開始して明らかに陽性であった。これは、感染性ＣＡＶが合成ＩＶＣ ＤＮＡトランスフェクトＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に由来することを確認した。
電子顕微鏡検査
ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をＣＡＶで感染させ、本質的にＴｏｄｄ ｅｔ ａｌ．１９９０に記載されているようにインキュベートし、処理した。ウイルス懸濁液をネガティブ染色電子顕微鏡によって画像化し、多数のウイルス粒子を明らかにした（図５）。
ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をＣＡＶで感染させ、本質的にＴｏｄｄ ｅｔ ａｌ．１９９０に記載されているようにインキュベートし、処理した。ウイルス懸濁液をネガティブ染色電子顕微鏡によって画像化し、多数のウイルス粒子を明らかにした（図５）。
実施例２：タンデムＣＡＶ構築物
一連の例示的なＣＡＶタンデム構築物を作製した（図６Ａ）。簡潔に述べると、タンデム構築物は、プラスミド骨格、及びＣＡＶゲノムの２つの完全コピー、又は１つの完全コピー及び１つの部分コピーのいずれかを含んでいた。ＣＡＶタンデム構築物のそれぞれを、ヌクレオフェクションによってＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に導入した。これはＰ０培養物であった。ヌクレオフェクション後２日目及び３日目に、下流ｑＰＣＲのために２００μｌの細胞懸濁液を収集した。３日目に、細胞懸濁液を１：１０の比で新鮮なＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に継代して、Ｐ１培養を開始した。Ｐ１培養の２日目に、２００μｌの懸濁液をｑＰＣＲのために収集し、残りの細胞をＤＮＡ抽出及びサザンブロッティングのためにペレット化した。ＣＡＶプローブを用いてＰ０及びＰ１培養試料についてｑＰＣＲを行った。複製の増加は、ｐＲＴＸ－１１１４－１１１６の継代時に観察された。より小さい増加が、ｐＲＴＸ１１１３、１１１８、及び１１１９について観察された（図６Ｂ）。Ｐ１試料からの細胞ペレットをサザンブロッティングによって分析した。骨格切断又はＤｐｎＩ消化ＤＮＡをゲル上で泳動し、膜に移し、ＣＡＶ及びラダーに対するランダムヘキサマーによって作製されたビオチン標識プローブでプローブした。ストレプトアビジン－ＩＲＤｙｅ－８００を加え、結果をＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ上で画像化した。この実験の結果は、ｑＰＣＲデータと一致した。ｄｓＤＮＡサークルがｐＲＴＸ－１１１７及びｐＲＴＸ－１１２１を含有するレーンを除く全てのレーンで観察された（図６Ｃ）。バンドはＤｐｎＩ耐性であり、これはゲノムの複製を示した。野生型ＣＡＶウイルスも回収された。
一連の例示的なＣＡＶタンデム構築物を作製した（図６Ａ）。簡潔に述べると、タンデム構築物は、プラスミド骨格、及びＣＡＶゲノムの２つの完全コピー、又は１つの完全コピー及び１つの部分コピーのいずれかを含んでいた。ＣＡＶタンデム構築物のそれぞれを、ヌクレオフェクションによってＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に導入した。これはＰ０培養物であった。ヌクレオフェクション後２日目及び３日目に、下流ｑＰＣＲのために２００μｌの細胞懸濁液を収集した。３日目に、細胞懸濁液を１：１０の比で新鮮なＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に継代して、Ｐ１培養を開始した。Ｐ１培養の２日目に、２００μｌの懸濁液をｑＰＣＲのために収集し、残りの細胞をＤＮＡ抽出及びサザンブロッティングのためにペレット化した。ＣＡＶプローブを用いてＰ０及びＰ１培養試料についてｑＰＣＲを行った。複製の増加は、ｐＲＴＸ－１１１４－１１１６の継代時に観察された。より小さい増加が、ｐＲＴＸ１１１３、１１１８、及び１１１９について観察された（図６Ｂ）。Ｐ１試料からの細胞ペレットをサザンブロッティングによって分析した。骨格切断又はＤｐｎＩ消化ＤＮＡをゲル上で泳動し、膜に移し、ＣＡＶ及びラダーに対するランダムヘキサマーによって作製されたビオチン標識プローブでプローブした。ストレプトアビジン－ＩＲＤｙｅ－８００を加え、結果をＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ上で画像化した。この実験の結果は、ｑＰＣＲデータと一致した。ｄｓＤＮＡサークルがｐＲＴＸ－１１１７及びｐＲＴＸ－１１２１を含有するレーンを除く全てのレーンで観察された（図６Ｃ）。バンドはＤｐｎＩ耐性であり、これはゲノムの複製を示した。野生型ＣＡＶウイルスも回収された。
これらの結果は、ＣＡＶゲノムの完全な又は部分的なコピーを、骨格及び完全なＣＡＶゲノムを含むプラスミドに加えることが、ウイルス力価を増加させることを示す。
実施例３：鳥類及びヒト細胞へのＣＡＶ結合
ＣＡＶがヒト細胞株のパネルに結合する能力をスクリーニングした。ＭＣＦ－７（ヒト乳癌）、ＭＲＣ５（肺線維芽細胞）、ＥＫＶＸ（肺腺癌）、Ｒａｊｉ（Ｂリンパ芽球）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ芽球）、及びＭＤＣＣ（ニワトリリンパ芽球、陽性対照）細胞を２連で試験した。それぞれの細胞型について、２×１０５個の細胞を４℃で１時間、ＣＡＶ（ＭＯＩ＝細胞あたり１．５個のＣＡＶ）と共にインキュベートした。細胞を２回洗浄し、トリプシンコントロールを実施し、各条件をトリプシンで処理して、結合したビリオンを除去し、バックグラウンドを確立した。ＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、各細胞型に結合したウイルスゲノムの数を決定した。トリプシンバックグラウンドを減算し、ＭＤＣＣ対照に対して正規化された結合パーセンテージとして値をプロットした（図７）。結果は、ＣＡＶがＲａｊｉ細胞及びＥＫＶＸ細胞に結合することを示した。これらのデータは、ＣＡＶがヒト細胞に特異的に結合することができ、ＣＡＶがヒト細胞に進入することができることと一致することを示す。
ＣＡＶがヒト細胞株のパネルに結合する能力をスクリーニングした。ＭＣＦ－７（ヒト乳癌）、ＭＲＣ５（肺線維芽細胞）、ＥＫＶＸ（肺腺癌）、Ｒａｊｉ（Ｂリンパ芽球）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ芽球）、及びＭＤＣＣ（ニワトリリンパ芽球、陽性対照）細胞を２連で試験した。それぞれの細胞型について、２×１０５個の細胞を４℃で１時間、ＣＡＶ（ＭＯＩ＝細胞あたり１．５個のＣＡＶ）と共にインキュベートした。細胞を２回洗浄し、トリプシンコントロールを実施し、各条件をトリプシンで処理して、結合したビリオンを除去し、バックグラウンドを確立した。ＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、各細胞型に結合したウイルスゲノムの数を決定した。トリプシンバックグラウンドを減算し、ＭＤＣＣ対照に対して正規化された結合パーセンテージとして値をプロットした（図７）。結果は、ＣＡＶがＲａｊｉ細胞及びＥＫＶＸ細胞に結合することを示した。これらのデータは、ＣＡＶがヒト細胞に特異的に結合することができ、ＣＡＶがヒト細胞に進入することができることと一致することを示す。
実施例４：例示的なＣＡＶベクター遺伝子エレメントの設計及び構築
推定ベクターを作製するために、走査アプローチを用いてＣＡＶゲノムを分析し、ウイルス複製及びパッケージングに必要な領域を発見した。簡潔に述べると、９８８ｂｐのレポーターカセットを、２００ｂｐの互い違いの間隔でＣＡＶゲノムに挿入した（図８Ａ～８Ｂ）。ＳＶ４０プロモーター、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ＯＲＦ、及びＳＶ４０ターミネーターを含むレポーターは、ＣＡＶゲノムの対応する領域を置き換え、従って野生型ＣＡＶゲノム長を維持した。図８Ａに示すように、合計８個のｎＬｕｃ挿入構築物を設計した。各ｎＬｕｃ構築物の配列を上記の表２～９に示す。構築物を化学的に合成し、ｐＵＣ５７－ミニプラスミドにクローニングし、プラスミド骨格から制限消化し、インビトロ環状化（ＩＶＣ）した。次いで、これらのプラスミドを使用して、タンパク質性外部にパッケージングされるそれらの能力について試験される操作されたＣＡＶベースの遺伝子エレメントを産生し、それによって操作されたＣＡＶベクター（本明細書でＣＡＶベクターと称される）を形成することができる。
推定ベクターを作製するために、走査アプローチを用いてＣＡＶゲノムを分析し、ウイルス複製及びパッケージングに必要な領域を発見した。簡潔に述べると、９８８ｂｐのレポーターカセットを、２００ｂｐの互い違いの間隔でＣＡＶゲノムに挿入した（図８Ａ～８Ｂ）。ＳＶ４０プロモーター、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ＯＲＦ、及びＳＶ４０ターミネーターを含むレポーターは、ＣＡＶゲノムの対応する領域を置き換え、従って野生型ＣＡＶゲノム長を維持した。図８Ａに示すように、合計８個のｎＬｕｃ挿入構築物を設計した。各ｎＬｕｃ構築物の配列を上記の表２～９に示す。構築物を化学的に合成し、ｐＵＣ５７－ミニプラスミドにクローニングし、プラスミド骨格から制限消化し、インビトロ環状化（ＩＶＣ）した。次いで、これらのプラスミドを使用して、タンパク質性外部にパッケージングされるそれらの能力について試験される操作されたＣＡＶベースの遺伝子エレメントを産生し、それによって操作されたＣＡＶベクター（本明細書でＣＡＶベクターと称される）を形成することができる。
実施例５：野生型ＣＡＶを用いたＣＡＶベクターのレスキュー
この実施例は、外因性遺伝子を含むＣＡＶベクターへのＣＡＶタンパク質のトランスでの提供を実証する。得られたＣＡＶベクターは、外因性遺伝子を標的細胞に送達することができた。
この実施例は、外因性遺伝子を含むＣＡＶベクターへのＣＡＶタンパク質のトランスでの提供を実証する。得られたＣＡＶベクターは、外因性遺伝子を標的細胞に送達することができた。
実施例４に記載されるように設計されたＣＡＶベクターゲノムを、インビトロ環状化（ＩＶＣ）によって産生し、次いで、１：１の比で、タンデムＣＡＶゲノム（ｐＲＴＸ－９６６）をコードするプラスミド、又はＶＰ１コード領域が欠失しているがＶＰ２及びＶＰ３が保持されている部分的ＣＡＶゲノムをコードするプラスミド（ｐＲＴＸ－６３７）と共に、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に共トランスフェクトした。対照として、ＷＴ ＣＡＶ ＩＶＣもｐＲＴＸ－９６６又はｐＲＴＸ－６３７と共トランスフェクトした。５×１０６の全細胞を、条件毎にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、１０％ ＦＢＳを含む２５ｍＬのＲＰＭＩ中でインキュベートした。３日後、ｎＬｕｃの産生を確認し、細胞懸濁液を回収し、上清を遠心分離により清澄化した。次いで、清澄化した上清を０．２μｍフィルターで濾過した。
ベクターレスキューが起こったかどうかを試験するために、濾過した上清を１×１０５のＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞と共に４８ウェルプレート中で３０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した。次いで、発光を測定して、形質導入が起こったかどうか（０日目）、及びその後２４時間の増分（１日目及び２日目）を決定した（図９Ａ）。０日目の読み取りはｎＬｕｃバックグラウンドの測定値を提供し、一方、１日目及び２日目は形質導入から生成されたｎＬｕｃを測定した。発光を測定する前に、形質導入された細胞をＰＢＳで３回洗浄して、試料中のバックグラウンドｎＬｕｃを減少させた。発光測定はｎＬｕｃシグナルを富化するために、溶解細胞に対して行った。対照試料（ｐＲＴＸ－６３７）では、０日目から２日目まで発光の増加はなく、これはＶＰ１の非存在下ではベクターが形成されなかったことを示している（図９Ｂ）。タンデムＣＡＶを共トランスフェクトした試料では、ＣＡＶ－ｎＬｕｃ４、５、及び７について０日目から２日目まで発光の増加が観察され、ＣＡＶ－ｎＬｕｃ６について０日目から１日目までの増加が観察された（図９Ｃ）。これは、これらのＩＶＣ ＣＡＶベクターゲノムが、タンデムゲノムからのＷＴ ＣＡＶの存在下で複製及びパッケージングを受けることができることを示した。さらに、ＣＡＶ－ｎＬｕｃ１、２、３、又は８についての発光の増加がなかったことは、これらの構築物中のＣＡＶベクターインサートによって破壊された領域が複製及び／又はパッケージングにおいて必要な役割を果たすことを示唆する。
実施例６：上清からのＣＡＶベクターの精製
上清ＣＡＶベクター粒子を濃縮し、さらにキャリーオーバーｎｌｕｃを減少させるために、１０ｍｌのＣＡＶベクター上清を２０％ショ糖クッション上に重ね、３１，０００ｒｐｍで３時間遠心分離して、ウイルス及びベクター粒子をペレット化した。上清及びショ糖を除去し、ペレットをＰＢＳに一晩再懸濁した。ＣＡＶ及びＣＡＶベクターのためのプローブを使用して、再懸濁ペレットに対してＤＮアーゼ保護アッセイを実施した。これは、約１×１０８ベクター／ｍｌの濃度でのＣＡＶベクター粒子の精製の成功を確認した（図１０Ａ）。ガイドとしてＣＡＶベクターＤＮアーゼ保護アッセイを使用して、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を、細胞あたり３個のＣＡＶベクターゲノムの正規化された量を使用して形質導入した。３×１０５のＣＡＶベクターゲノムを１×１０５のＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞と共に４８ウェルプレート中で３０分又は４８時間インキュベートし、３回のＰＢＳ洗浄工程後に、形質導入が起こったかどうかを決定するために発光を測定した。０日目の結果は、バックグラウンドｎＬｕｃシグナルが減少したことを示した（図１０Ｂ）。さらに、２日目の結果は、ＣＡＶ－ｎＬｕｃ４～７がＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を形質導入したベクターを産生することを確認した。２日目の発光値は、ＣＡＶ－ｎｌｕｃ４～７間で同様であり、これらのベクターが同様の効率で細胞を形質導入したことを示した。この結果は、ｎｌｕｃ４のナノルシフェラーゼカセットの最も５’側の端部及び構築物ｎｌｕｃ７のカセットの最も３’側の端部にまたがるウインドウも定義し、トランスジーンをＣＡＶゲノムに挿入して、形質導入コンピテントベクターを首尾よく回収することができる。
上清ＣＡＶベクター粒子を濃縮し、さらにキャリーオーバーｎｌｕｃを減少させるために、１０ｍｌのＣＡＶベクター上清を２０％ショ糖クッション上に重ね、３１，０００ｒｐｍで３時間遠心分離して、ウイルス及びベクター粒子をペレット化した。上清及びショ糖を除去し、ペレットをＰＢＳに一晩再懸濁した。ＣＡＶ及びＣＡＶベクターのためのプローブを使用して、再懸濁ペレットに対してＤＮアーゼ保護アッセイを実施した。これは、約１×１０８ベクター／ｍｌの濃度でのＣＡＶベクター粒子の精製の成功を確認した（図１０Ａ）。ガイドとしてＣＡＶベクターＤＮアーゼ保護アッセイを使用して、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を、細胞あたり３個のＣＡＶベクターゲノムの正規化された量を使用して形質導入した。３×１０５のＣＡＶベクターゲノムを１×１０５のＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞と共に４８ウェルプレート中で３０分又は４８時間インキュベートし、３回のＰＢＳ洗浄工程後に、形質導入が起こったかどうかを決定するために発光を測定した。０日目の結果は、バックグラウンドｎＬｕｃシグナルが減少したことを示した（図１０Ｂ）。さらに、２日目の結果は、ＣＡＶ－ｎＬｕｃ４～７がＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞を形質導入したベクターを産生することを確認した。２日目の発光値は、ＣＡＶ－ｎｌｕｃ４～７間で同様であり、これらのベクターが同様の効率で細胞を形質導入したことを示した。この結果は、ｎｌｕｃ４のナノルシフェラーゼカセットの最も５’側の端部及び構築物ｎｌｕｃ７のカセットの最も３’側の端部にまたがるウインドウも定義し、トランスジーンをＣＡＶゲノムに挿入して、形質導入コンピテントベクターを首尾よく回収することができる。
実施例７：ＣＡＶベクターは、ヒト細胞に形質導入する
この実施例では、ＣＡＶベクターがＲａｊｉ又はＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入できるかどうかを評価した。試験対象としてＣＡＶ－ｎｌｕｃ４及びＣＡＶ－ｎｌｕｃ６を使用し、予想陰性対照としてＣＡＶ－ｎｌｕｃ１、ＣＡＶ ＷＴ及びｐ６３７＋ｎｌｕｃ ６を使用した。模擬形質導入細胞もまた、さらなる陰性対照として使用した。３×１０５のＣＡＶベクターゲノムを、１×１０５のＲａｊｉ又はＪｕｒｋａｔ細胞と共に４８ウェルプレート中で３０分又は４８時間インキュベートし、形質導入が起こったかどうかを決定するために、３回のＰＢＳ洗浄工程後に発光を測定した。Ｒａｊｉ細胞では、ＣＡＶ－ｎｌｕｃ４及びＣＡＶ－ｎｌｕｃ６で形質導入した細胞において、０日目から２日目まで発光の増加があったが、陰性対照ではなかった（図１１Ｂ）。ＣＡＶ ｎ－Ｌｕｃ４及びＣＡＶ－ｎＬｕｃ６で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞も、０日目から２日目まで発光の増加を示した（図１１Ａ）。これらのデータは、ＣＡＶベクターがヒト細胞を形質導入することができることを示した。
この実施例では、ＣＡＶベクターがＲａｊｉ又はＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入できるかどうかを評価した。試験対象としてＣＡＶ－ｎｌｕｃ４及びＣＡＶ－ｎｌｕｃ６を使用し、予想陰性対照としてＣＡＶ－ｎｌｕｃ１、ＣＡＶ ＷＴ及びｐ６３７＋ｎｌｕｃ ６を使用した。模擬形質導入細胞もまた、さらなる陰性対照として使用した。３×１０５のＣＡＶベクターゲノムを、１×１０５のＲａｊｉ又はＪｕｒｋａｔ細胞と共に４８ウェルプレート中で３０分又は４８時間インキュベートし、形質導入が起こったかどうかを決定するために、３回のＰＢＳ洗浄工程後に発光を測定した。Ｒａｊｉ細胞では、ＣＡＶ－ｎｌｕｃ４及びＣＡＶ－ｎｌｕｃ６で形質導入した細胞において、０日目から２日目まで発光の増加があったが、陰性対照ではなかった（図１１Ｂ）。ＣＡＶ ｎ－Ｌｕｃ４及びＣＡＶ－ｎＬｕｃ６で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞も、０日目から２日目まで発光の増加を示した（図１１Ａ）。これらのデータは、ＣＡＶベクターがヒト細胞を形質導入することができることを示した。
第２の実施例では、低（＜１０）感染多重度（ＭＯＩ）のＣＡＶベクター－ｎＬｕｃを使用し、準最適プロモーターを使用して、多数の細胞株において形質導入スクリーニングを実施した。スクリーニングは、これらの条件下、３のＭＯＩで、形質導入がＭＯＬＴ－４細胞（０日目から２日目までの約２．５Ｘの発光増加）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（０日目から２日目までの約０～２．５Ｘの発光増加）、及びＲａｊｉ細胞（０日目から２日目までの約４～１３Ｘの発光増加）を含むリンパ系細胞において検出されたことを示した。
実施例８：中和抗体に対するＣＡＶベクターの耐性
ヒトＩＶＩＧに対するＣＡＶベクターの耐性、及びニワトリ血清におけるＶＰ１特異的抗体によるＣＡＶベクターの中和
本発明者らは、ＣＡＶベクターが抗ＶＰ１抗体によって中和されるかどうかを評価した。２つの独立した供給源由来のニワトリ血清は、ＣＡＶのＶＰ１カプシドタンパク質に対する中和抗体を含有することが見出された。ＣＡＶを、ニワトリ血清又はＶＰ１ペプチドに対して産生された抗ＶＰ１抗体のいずれかとインキュベートした。多くのニワトリがＣＡＶに対してワクチン接種されるので、ニワトリ血清はＣＡＶを中和すると仮定された。さらに、抗ＶＰ１ペプチド抗体は、立体構造的に関連しないペプチドに基づくので、ＣＡＶを中和しないことが予想された。インキュベーション後、細胞を接種し、７日後に全ウイルスゲノムを測定した。ニワトリ血清はＣＡＶを中和するが、抗ＶＰ１ペプチド抗体は中和しないことが見出された（図１３Ａ）。中和がニワトリ血清中の中和ＶＰ１抗体によるものであることを証明するために、抗体源としてニワトリ血清を用いて精製ＣＡＶ粒子に対してウェスタンブロットを行った。抗ＶＰ１抗体によって検出されたものと一致するバンドが観察され、中和がＶＰ１特異的抗体によるものであることが示された（図１３Ｂ）。ＣＡＶベクターがＶＰ１によってカプシド化されたことを示すために、本発明者らは、ニワトリ血清中の中和抗体がＣＡＶベクター形質導入を遮断できるかどうかを試験した。ＣＡＶベクターを、ニワトリ血清、非中和ＶＰ１抗体、又はヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）と共にインキュベートした。次いで、形質導入アッセイを行った。ニワトリ血清はＣＡＶベクター形質導入を中和したが、抗ＶＰ１抗体及びＩＶＩＧは中和しなかった（図１３Ｃ）。これは、ＣＡＶベクターの形質導入がＶＰ１によって仲介され、ＣＡＶベクターがウイルスベクターによってカプシド化されたことを示している。
ヒトＩＶＩＧに対するＣＡＶベクターの耐性、及びニワトリ血清におけるＶＰ１特異的抗体によるＣＡＶベクターの中和
本発明者らは、ＣＡＶベクターが抗ＶＰ１抗体によって中和されるかどうかを評価した。２つの独立した供給源由来のニワトリ血清は、ＣＡＶのＶＰ１カプシドタンパク質に対する中和抗体を含有することが見出された。ＣＡＶを、ニワトリ血清又はＶＰ１ペプチドに対して産生された抗ＶＰ１抗体のいずれかとインキュベートした。多くのニワトリがＣＡＶに対してワクチン接種されるので、ニワトリ血清はＣＡＶを中和すると仮定された。さらに、抗ＶＰ１ペプチド抗体は、立体構造的に関連しないペプチドに基づくので、ＣＡＶを中和しないことが予想された。インキュベーション後、細胞を接種し、７日後に全ウイルスゲノムを測定した。ニワトリ血清はＣＡＶを中和するが、抗ＶＰ１ペプチド抗体は中和しないことが見出された（図１３Ａ）。中和がニワトリ血清中の中和ＶＰ１抗体によるものであることを証明するために、抗体源としてニワトリ血清を用いて精製ＣＡＶ粒子に対してウェスタンブロットを行った。抗ＶＰ１抗体によって検出されたものと一致するバンドが観察され、中和がＶＰ１特異的抗体によるものであることが示された（図１３Ｂ）。ＣＡＶベクターがＶＰ１によってカプシド化されたことを示すために、本発明者らは、ニワトリ血清中の中和抗体がＣＡＶベクター形質導入を遮断できるかどうかを試験した。ＣＡＶベクターを、ニワトリ血清、非中和ＶＰ１抗体、又はヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）と共にインキュベートした。次いで、形質導入アッセイを行った。ニワトリ血清はＣＡＶベクター形質導入を中和したが、抗ＶＰ１抗体及びＩＶＩＧは中和しなかった（図１３Ｃ）。これは、ＣＡＶベクターの形質導入がＶＰ１によって仲介され、ＣＡＶベクターがウイルスベクターによってカプシド化されたことを示している。
中和ヒト抗体に対するＣＡＶベクターの耐性
塩化セシウム（ＣｓＣｌ）中での等密度遠心分離によって粒子を精製することによって、さらなる特徴付けを行った（図１９Ａ）。ＤＮアーゼで保護されたベクターコピー（ナノルシフェラーゼアンプリコン）のピークはｑＰＣＲで測定した野生型ＣＡＶ粒子のピークと一致し、密度約１．２９ｇ／ｍＬに相当した。画分を透析し、細胞に形質導入することが見出され、観察されたｑＰＣＲ力価に比例するナノルシフェラーゼ発光シグナルが得られた（図１９Ｂ）。
塩化セシウム（ＣｓＣｌ）中での等密度遠心分離によって粒子を精製することによって、さらなる特徴付けを行った（図１９Ａ）。ＤＮアーゼで保護されたベクターコピー（ナノルシフェラーゼアンプリコン）のピークはｑＰＣＲで測定した野生型ＣＡＶ粒子のピークと一致し、密度約１．２９ｇ／ｍＬに相当した。画分を透析し、細胞に形質導入することが見出され、観察されたｑＰＣＲ力価に比例するナノルシフェラーゼ発光シグナルが得られた（図１９Ｂ）。
ヒト抗体による中和に対するＣＡＶベクターの感受性をさらに調べるために、１０個のヒト血清試料を陽性及び陰性対照と共にアッセイした。最初のＩＶＩＧ観察と一致して、１０個の試料のうちの１個のみが、１：１０を超える希釈で中和の任意の徴候を示した（図１９Ｃ）。比較により、同じナノルシフェラーゼカセットをコードするアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）ベクターを、同じ血清及び対照試料を用いてアッセイし、以前に公開されたデータに基づく予想に従って中和されることが示された（図１９Ｄ）。１０個のドナー血清のうちの３個は、１：１０を超える希釈でＡＡＶ２ベクターを中和し、ＩＶＩＧの１：１２５０希釈もベクターを強力に中和した。
実施例９：野性型ＣＡＶを使用しないＣＡＶベクターの産生
この実施例は、外因性遺伝子を含むＣＡＶベクターへのＣＡＶタンパク質のトランスの提供を実証し、野生型ＣＡＶを検出可能には含まないＣＡＶベクター調製物をもたらす。得られたＣＡＶベクターは、外因性遺伝子を標的細胞に送達することができた。
この実施例は、外因性遺伝子を含むＣＡＶベクターへのＣＡＶタンパク質のトランスの提供を実証し、野生型ＣＡＶを検出可能には含まないＣＡＶベクター調製物をもたらす。得られたＣＡＶベクターは、外因性遺伝子を標的細胞に送達することができた。
上記の実施例に記載したように、ウイルスベクターは、ナノルシフェラーゼレポーターを発現するインビトロ環状化（ＩＶＣ）ＣＡＶベクターＤＮＡを、タンデムＣＡＶゲノムをコードするプラスミドと共トランスフェクトすることによって、ＣＡＶ（ＣＡＶベクター）に基づいて産生された。細胞上清及び溶解物から、真正のＣＡＶベクターが回収されたが、得られた調製物はＣＡＶタンデムゲノムに起因するＷＴ ＣＡＶ粒子を含むことができた。これに続いて、ＷＴ ＣＡＶの非存在下で純粋なＣＡＶベクターを産生するための努力を行った。タンデムＣＡＶプラスミドの代わりに、ＣＡＶタンパク質を発現するが、パッケージングされた粒子を作製することができない完全ＣＡＶゲノム（ｐＣＡＶ）をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトした。それらの天然プロモーターからのＣＡＶタンパク質の発現は、共トランスフェクトされたＣＡＶベクターＤＮＡを複製及びパッケージングするのに十分であると仮定された。陰性対照として、ＣＡＶベクターＩＶＣを、ＶＰ１コード領域が欠失したプラスミドＣＡＶ（ｐΔＶＰ１）と共トランスフェクトした。従って、陰性対照は、パッケージングされたＣＡＶベクターをもたらさない。
ｐＣＡＶ及びＣＡＶベクターｎＬｕｃ６ ＩＶＣのＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞へのトランスフェクション後３日目に、細胞ペレットを回収し、溶解し、２０％ショ糖クッション上での超遠心分離によって部分精製を行った。遠心分離後のペレットをＰＢＳに再懸濁し、形質導入アッセイをＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に対して行った。観察された可能性のある任意の形質導入シグナルがＶＰ１カプシド化ベクターによるものであることを確認するために、両方の条件をニワトリ血清由来のＶＰ１中和抗体（ＮＡｂ）で処理した。形質導入を実施する前に、試料をＶＰ１中和抗体と共に、又はＶＰ１中和抗体なしでプレインキュベートした。試料を形質導入後３０分又は２日目に収集して、形質導入の読み取りとして発光の変化を測定した。
陰性対照であるｐΔＶＰ１はＣＡＶベクターをレスキューしなかった（図１４）。ｐＣＡＶ＋ｎＬｕｃ６試料において０日目から２日目まで発光の２５倍の増加が観察され、このシグナルは中和抗体によって遮断され、ｐＣＡＶがＣＡＶを成功裏にレスキューしたことを示した。少なくとも３ラインの証拠に基づいて、この試料中にはいかなる複製ＣＡＶも存在しなかった筈である。第１に、ｐＣＡＶトランスフェクションは、一貫して野生型ＣＡＶ回収の欠如を示した。第２に、過剰なＤＮアーゼ保護ＣＡＶゲノムは、ｑＰＣＲアッセイにおいて検出されなかった。第３に、観察された発光シグナルは、野生型ＣＡＶをＣＡＶベクター試料に添加した場合に増加した。
実施例１０：マウスへの注射のためのｎＬｕｃ ＣＡＶベクターの産生
この実施例では、ｎＬｕｃトランスジーンを保有するＣＡＶベクターを作製し、マウスに注射した。簡潔に述べると、３ｅ８ ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をｎＬｕｃ６ ＣＡＶベクター構築物（本明細書に、例えば、表７に記載）又はＣＡＶ（陰性対照）でトランスフェクトした。Ｅｘｐｉ２９３細胞を陽性対照としてＡＡＶ２構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を３リットルの培地中で３日間増殖させた。上清を除去し、細胞ペレットを０．５％ ＳＤＳに溶解し、ベンゾナーゼで処理して、保護されていない核酸を消化した。次いで、溶解したペレットを０．４５μｍフィルターに通した。濾過した溶解物を、２０％ショ糖クッションを通して３１，０００ｒｐｍで３時間超遠心分離し、一晩再懸濁し、次いでＣｓＣｌ線形勾配を通過させる。次いで、試料を分画し、画分を透析した後、得られた濃縮物を定量化した。品質チェックを実施した。得られた調製物の力価及びエンドトキシンレベルを図１２に示す。
この実施例では、ｎＬｕｃトランスジーンを保有するＣＡＶベクターを作製し、マウスに注射した。簡潔に述べると、３ｅ８ ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をｎＬｕｃ６ ＣＡＶベクター構築物（本明細書に、例えば、表７に記載）又はＣＡＶ（陰性対照）でトランスフェクトした。Ｅｘｐｉ２９３細胞を陽性対照としてＡＡＶ２構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を３リットルの培地中で３日間増殖させた。上清を除去し、細胞ペレットを０．５％ ＳＤＳに溶解し、ベンゾナーゼで処理して、保護されていない核酸を消化した。次いで、溶解したペレットを０．４５μｍフィルターに通した。濾過した溶解物を、２０％ショ糖クッションを通して３１，０００ｒｐｍで３時間超遠心分離し、一晩再懸濁し、次いでＣｓＣｌ線形勾配を通過させる。次いで、試料を分画し、画分を透析した後、得られた濃縮物を定量化した。品質チェックを実施した。得られた調製物の力価及びエンドトキシンレベルを図１２に示す。
実施例１１：マウスへのＣＡＶベクターのインビボ投与、結果として、複数の器官におけるペイロードＤＮＡの送達
この実施例では、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ペイロードを保有するＣＡＶベクターを、インビボでマウス組織に送達した。簡潔に述べると、マウスは、（ｉ）野生型ＣＡＶ（ＷＴ）と、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）ペイロードをコードする遺伝子エレメントを保有するＣＡＶベクターとの混合物、又は（ｉｉ）野生型ＣＡＶ単独、又は（ｉｉｉ）同様にｎＬｕｃペイロードをコードするＡＡＶ２のいずれかの同等の用量を受容した。網膜下（ＳＲ）、ＩＶ、ＩＰ、及びＩＭを含む様々な送達経路を試験した（下記の表２３に示す）。
この実施例では、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ペイロードを保有するＣＡＶベクターを、インビボでマウス組織に送達した。簡潔に述べると、マウスは、（ｉ）野生型ＣＡＶ（ＷＴ）と、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）ペイロードをコードする遺伝子エレメントを保有するＣＡＶベクターとの混合物、又は（ｉｉ）野生型ＣＡＶ単独、又は（ｉｉｉ）同様にｎＬｕｃペイロードをコードするＡＡＶ２のいずれかの同等の用量を受容した。網膜下（ＳＲ）、ＩＶ、ＩＰ、及びＩＭを含む様々な送達経路を試験した（下記の表２３に示す）。
ＣＡＶ及び／又はＣＡＶベクターの組織分布を評価するために、動物を注射の３週間後に屠殺し、様々な組織（血液、肝臓、脾臓、肺、心臓、卵巣、筋肉、脳、腎臓、及び網膜）を収集した。全ＤＮＡを組織から抽出し、ＣＡＶベクターゲノム（ｎＬｕｃプローブを使用）又はＣＡＶ ＷＴウイルスゲノムについてｑＰＣＲによって評価した。本発明者らは、ＡＡＶ２ ＩＭ群と比較して、ＩＶ及びＩＰ経路を介してＣＡＶベクターを受容したマウスの脾臓及び肝臓において、ＣＡＶベクターのレベルの上昇（ｎＬｕｃコピー／μｇ ＤＮＡ）を検出した（図１６Ａ及び１６Ｃ）。さらに、本発明者らは、ＣＡＶ ＷＴ又はＣＡＶベクターのいずれかを投与したマウスの肝臓及び脾臓において、ＩＶ及びＩＰを介するものを含めて、野生型ＣＡＶゲノムを検出した（図１６Ｂ及び１６Ｄ）。本発明者らはまた、筋肉、網膜、心臓、及び卵巣に同様のシグナルを観察したが、脳には観察しなかった。ベクターは、投与経路と一致するパターンで組織において検出された（図２０）。これらのデータは、マウスにおけるＣＡＶベクターＤＮＡのインビボ送達の成功を示す。
実施例１２：ＣＡＶベクター対ＡＡＶ２を受容するマウスにおける免疫原性
この実施例では、実施例１１に記載したように、筋肉内（ＩＭ）投与を介して野生型ＣＡＶ、ＣＡＶベクター、又はＡＡＶ２を受容したマウスを、ＣＡＶ又はＡＡＶ２に対する抗体応答について評価した。ＣＡＶ又はＡＡＶ２に対する抗体応答は、コードされたｎＬｕｃトランスジーンからの発光シグナルの検出に依存するインビトロ中和アッセイを用いて測定した。投与されたベクター（すなわち、ＣＡＶ又はＡＡＶ２）に対する中和抗体が試料中に存在する場合、ベクターによって生成される発光が減少する。簡潔に述べると、屠殺時にマウスから採取した血清試料を熱不活性化し、連続希釈した。ＣＡＶ及びＡＡＶ２の相対的免疫原性を比較するために、ＩＭ経路によってＣＡＶ又はＡＡＶ２を受容したマウスについて中和測定値をプロットした（逆ｙ軸に発光を示す）（図１７Ａ）。
この実施例では、実施例１１に記載したように、筋肉内（ＩＭ）投与を介して野生型ＣＡＶ、ＣＡＶベクター、又はＡＡＶ２を受容したマウスを、ＣＡＶ又はＡＡＶ２に対する抗体応答について評価した。ＣＡＶ又はＡＡＶ２に対する抗体応答は、コードされたｎＬｕｃトランスジーンからの発光シグナルの検出に依存するインビトロ中和アッセイを用いて測定した。投与されたベクター（すなわち、ＣＡＶ又はＡＡＶ２）に対する中和抗体が試料中に存在する場合、ベクターによって生成される発光が減少する。簡潔に述べると、屠殺時にマウスから採取した血清試料を熱不活性化し、連続希釈した。ＣＡＶ及びＡＡＶ２の相対的免疫原性を比較するために、ＩＭ経路によってＣＡＶ又はＡＡＶ２を受容したマウスについて中和測定値をプロットした（逆ｙ軸に発光を示す）（図１７Ａ）。
ニワトリ血清は、試験した全ての希釈でＣＡＶベクターの完全な中和を誘導したが、ＣＡＶに対する抗体を誘発しないと予想されるＡＡＶ２－ｎｌｕｃ ＩＭ陰性対照は誘導しなかった（図１９Ａ）。注目すべきことに、ＣＡＶベクター及びＣＡＶ ＷＴ ＩＭを受容したマウス由来の血清は、ＣＡＶベクターを中和しなかった。対照的に、ＡＡＶ２ ＩＭを付与された動物は、ヒトＩＶＩＧに存在する力価と同等に、ＡＡＶ２に対する高レベルの中和抗体を産生した（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。ＡＡＶ２－ｎＬｕｃ低用量及び高用量動物からの５０％幾何平均中和相反力価（５０％ ＧＭＴ）は、ヒトＩＶＩＧについての１，２８０と比較して、それぞれ３２０及び６４０であった。他の経路によって付与されると、ＣＡＶベクター及びＣＡＶ ＷＴは、より低いレベルの中和抗体を誘発した。観察された最高力価は、ＩＶ投与されたＣＡＶの１６０であった。これらのデータは、筋肉内投与された場合、ＣＡＶベクターがＡＡＶ２ベクターよりも免疫原性が低いことを示唆する。
実施例１３：ＣＡＶ様粒子（ＶＬＰ）は、精製カプシドタンパク質からインビトロで集合する
この実施例では、ＣＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１によるインビトロ粒子形成を、図１８の上部のワークフローに示すように評価した。簡潔に述べると、組換えＶＰ１（ｒＶｐ１）を、哺乳動物細胞においてＣＡＶ ＶＰ２と共発現させ、Ｎ末端親和性タグ（図１８、パネル２）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。ＶＰ１を、野生型ＣＡＶウイルスの保持容量に対応する保持容量でＳＥＣから溶出した（図１８、パネル３）。ＣＡＶと同様の粒子を、ＶＰ１ ＳＥＣ画分中で電子顕微鏡によって観察した（図１８、パネル４）。推定ＶＰ１ ＶＬＰは野生型ＣＡＶ粒子とほぼ同じサイズであり、野生型ＣＡＶウイルス上に存在する同じトランペット形状のスパイク特徴を示した（図１８、パネル５）。これらの結果は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質がインビトロでウイルス様粒子に集合し得ることを実証する。
この実施例では、ＣＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１によるインビトロ粒子形成を、図１８の上部のワークフローに示すように評価した。簡潔に述べると、組換えＶＰ１（ｒＶｐ１）を、哺乳動物細胞においてＣＡＶ ＶＰ２と共発現させ、Ｎ末端親和性タグ（図１８、パネル２）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。ＶＰ１を、野生型ＣＡＶウイルスの保持容量に対応する保持容量でＳＥＣから溶出した（図１８、パネル３）。ＣＡＶと同様の粒子を、ＶＰ１ ＳＥＣ画分中で電子顕微鏡によって観察した（図１８、パネル４）。推定ＶＰ１ ＶＬＰは野生型ＣＡＶ粒子とほぼ同じサイズであり、野生型ＣＡＶウイルス上に存在する同じトランペット形状のスパイク特徴を示した（図１８、パネル５）。これらの結果は、ＣＡＶ ＶＰ１タンパク質がインビトロでウイルス様粒子に集合し得ることを実証する。
実施例１４：ＣＡＶベクターは、後期エンドソーム経路を介してＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に進入する
この実施例では、細胞へのＣＡＶウイルス進入のメカニズムを評価した。発光アッセイによるＣＡＶベクター形質導入の検出は、ウイルス進入のための異なる経路を阻害することが知られている４つの化合物の効果の評価を可能にした。試験した化合物は、マクロピノサイトーシス阻害剤である塩酸アミロライド（ＥＩＰＡ）及びラトランクリンＢ（ＬａｔＢ）、エンドサイトーシスの初期事象を阻害するダイナソア、並びにエンドソーム酸性化の阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（図２１Ａ）を含み、形質導入を阻害するそれらの能力について評価した。化合物又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）希釈剤対照を、ＣＡＶベクターとの２０時間の形質導入インキュベーションの１５分前及びその間にＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に添加した。Ｅｘｐｉ２９３細胞に対するＡＡＶ２－ｎＬｕｃベクターを用いた対照実験も行った。
この実施例では、細胞へのＣＡＶウイルス進入のメカニズムを評価した。発光アッセイによるＣＡＶベクター形質導入の検出は、ウイルス進入のための異なる経路を阻害することが知られている４つの化合物の効果の評価を可能にした。試験した化合物は、マクロピノサイトーシス阻害剤である塩酸アミロライド（ＥＩＰＡ）及びラトランクリンＢ（ＬａｔＢ）、エンドサイトーシスの初期事象を阻害するダイナソア、並びにエンドソーム酸性化の阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（図２１Ａ）を含み、形質導入を阻害するそれらの能力について評価した。化合物又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）希釈剤対照を、ＣＡＶベクターとの２０時間の形質導入インキュベーションの１５分前及びその間にＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞に添加した。Ｅｘｐｉ２９３細胞に対するＡＡＶ２－ｎＬｕｃベクターを用いた対照実験も行った。
発光を測定してＣＡＶベクター形質導入を定量化し、ダイナソア及びＢａｆＡ１がＤＭＳＯ希釈剤対照と比較して１０００倍を超えるシグナルの低下を引き起こした一方で、他の２つの化合物は最小限の影響しか及ぼさなかったことを示した（図２１Ｂ）。比較して、ＡＡＶ２－ｎｌｕｃは、ダイナソア及びＢａｆＡ１によって同程度に阻害され、ＬａｔＢによって約３倍阻害された（図２１Ｃ）。細胞を、ウイルスベクター及びＤＭＳＯの非存在下で各進入阻害剤で処理し、有意な細胞死は観察されなかった。
実施例１５：熱処理後及び４℃での保存後のＣＡＶベクター生存率
ＣＡＶベクターの安定性を評価するために、熱安定性及び保存安定性を確認した。ベクターを、２０％ショ糖クッションを通した細胞溶解物の沈降、等密度ＣｓＣｌ遠心分離、並びに二価カチオン及び０．００１％ポロキサマー１８８を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への透析により精製した。
ＣＡＶベクターの安定性を評価するために、熱安定性及び保存安定性を確認した。ベクターを、２０％ショ糖クッションを通した細胞溶解物の沈降、等密度ＣｓＣｌ遠心分離、並びに二価カチオン及び０．００１％ポロキサマー１８８を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への透析により精製した。
第１の実施例では、ベクターの１５分間の熱処理を４０℃～９５℃の範囲の温度で実施した（図２２Ａ）。形質導入シグナルは、５５℃処理後に変化せず、６５℃で１５分後に１０倍減少し、７５℃でのインキュベーション後に消失した。中和対照（ＮＡｂ）を、いかなる偽発光シグナルも除外するために含めた。
第２の実施例では、精製ＣＡＶベクター試料を、試料が枯渇する前に６ヶ月間にわたって４℃で保存した。この時間の間に、形質導入能の３つの同等の試験を材料に対して実施した。結果を図２２Ｂに示す。この間、形質導入シグナルは変化しなかった。
実施例１６：タンデムプラスミドを用いたＣＡＶベクターの回収
この実施例は、２つのＣＡＶベクターゲノムコピーを含むタンデムプラスミド構築物（ｐＲＴｘ－１５８０）を用いた、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）遺伝子をコードする例示的なＣＡＶベクターの回収を記載する。タンデム構築物の概略図を図２３Ａに示す。第１のゲノムコピーは部分的ＯＲＦの代わりにナノルシフェラーゼトランスジーンをコードするが、ウイルスシスエレメント及びＯＲＦの残りの部分を保持する。第２のゲノムコピーは、３’ＮＣＲの欠失を除いて完全なＣＡＶベクターゲノムである。
この実施例は、２つのＣＡＶベクターゲノムコピーを含むタンデムプラスミド構築物（ｐＲＴｘ－１５８０）を用いた、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）遺伝子をコードする例示的なＣＡＶベクターの回収を記載する。タンデム構築物の概略図を図２３Ａに示す。第１のゲノムコピーは部分的ＯＲＦの代わりにナノルシフェラーゼトランスジーンをコードするが、ウイルスシスエレメント及びＯＲＦの残りの部分を保持する。第２のゲノムコピーは、３’ＮＣＲの欠失を除いて完全なＣＡＶベクターゲノムである。
この構築物がベクターをもたらすことができるかどうかを評価するために、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１細胞をタンデムベクター構築物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をトランスフェクションの３日後に回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）を含有する０．５％ ＳＤＳ溶解緩衝液を用いて３７℃で３０分間溶解した。次いで、溶解物を、１００Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼで２０分間、３７度で処理し、続いて、１０，０００ｘｇで３０分間、清澄化して、細胞残屑をペレット化した。清澄化された溶解物をショ糖クッション精製に供した。ベクター及び野生型ゲノムを、残存する非カプシド化ＤＮＡを除去するためのＤＮアーゼ処理後にｑＰＣＲによってショ糖クッション精製材料中で定量化した。
図２３Ｂに示すように、ＤＮアーゼ保護ＣＡＶベクターゲノムコピーが回収され、ｐＲＴｘ－１５８０タンデムベクター構築物が、ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１トランスフェクションにおけるベクターＤＮＡ複製及びパッケージングの能力を保持することを示した。これらのＤＮアーゼ保護ベクターゲノムが形質導入できるかどうかを試験するために、ショ糖クッション精製材料をＭＤＣＣ－ＭＳＢ１又はＣｏｎＡ－Ｂ１－ＶＩＣＫ細胞に加えた。バックグラウンドに対する発光シグナルの明らかな増加がＭＤＣＣ－ＭＳＢ１及びＣｏｎＡ－Ｂ１－ＶＩＣＫ形質導入の両方において観察され（図２３Ｃ）、これは、ｐＲＴｘ－１５８０構築物が形質導入が可能なベクター粒子を産生したことを示す。
Claims (26)
- 遺伝子エレメントであって：
プロモーターエレメントと；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列と、
例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性で、ＣＡＶカプシドポリペプチド（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子）に特異的に結合するタンパク質結合配列と
を含む、遺伝子エレメント。 - 遺伝子エレメントであって：
プロモーターエレメントと；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列と、
タンパク質結合配列と；
を含み、
前記遺伝子エレメントが、ＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージングされる（例えば、特異的にパッケージングされる）ことができる、遺伝子エレメント。 - 遺伝子エレメントであって：
プロモーターエレメントと；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列と、
ＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列と；
を含み、
前記外因性エフェクターが：
（ａ）ヒト細胞での発現に最適化されたコドンであるか、
（ｂ）ヒトポリペプチド若しくは核酸であるか、
（ｃ）ヒトポリペプチド若しくは核酸に結合するか、又は
（ｄ）ヒト細胞において活性を有する、例えばヒト細胞におけるヒト遺伝子の活性及び／若しくはレベルを調節する（例えば、増加又は減少させる）、
遺伝子エレメント。 - 遺伝子エレメントであって：
プロモーターエレメントと；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列と、
配列番号１のヌクレオチド１～３７４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は配列番号１００のヌクレオチド２１９５～２３１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列と
を含む、遺伝子エレメント。 - 遺伝子エレメントであって：
プロモーターエレメントと；
外因性エフェクター（例えば、治療用外因性エフェクター）をコードする核酸配列と、
ｅの連続部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、又は３，０００ヌクレオチドと
を含む、遺伝子エレメント。 - 遺伝子エレメントであって：
例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性でＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列を含み、
前記遺伝子エレメントは：
（ｉ）完全長ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子（例えば、前記遺伝子エレメントは、前記ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）；
（ｉｉ）完全長ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子（例えば、前記遺伝子エレメントは、前記ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）；又は
（ｉｉ）完全長ＣＡＶアポプチン遺伝子（例えば、前記遺伝子エレメントは、前記ＣＡＶアポプチン遺伝子の１つ以上の断片、例えば、ＣＡＶアポプチン遺伝子配列の約５００、４００、３００、２００、又は１００未満のヌクレオチドを含む）
の１つ以上を含まない、遺伝子エレメント。 - 遺伝子エレメントであって：
例えば、約１０μＭ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１μＭ未満、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭ未満）の親和性／特異性でＣＡＶカプシドポリペプチドに特異的に結合するタンパク質結合配列を含み、
前記遺伝子エレメントは：
（ｉ）例えば、ＣＡＶ ＶＰ１コード配列の配列内、例えば、前記ＣＡＶ ＶＰ１コード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子又はその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又はそれ以上のｂｐの連続断片）；
（ｉｉ）例えば、ＣＡＶ ＶＰ２コード配列の配列内、例えば、前記ＣＡＶ ＶＰ２コード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子又はその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又はそれ以上のｂｐの連続断片）；又は
（ｉｉ）例えば、ＣＡＶアポプチンコード配列の配列内、例えば、前記ＣＡＶアポプチンコード配列の５’末端に終止コドンを含む、非機能的ＣＡＶアポプチン遺伝子又はその断片（例えば、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又はそれ以上のｂｐの連続断片）
の１つ以上を含む、遺伝子エレメント。 - 請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子エレメントの核酸配列を含む核酸構築物。
- 核酸構築物（例えば、プラスミド）であって：
（ａ）ＣＡＶ ＶＰ１遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｂ）ＣＡＶ ＶＰ２遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；及び／又は
（ｃ）ＣＡＶアポプチン遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列；
の１つ、２つ、又は３つ全てを含み：
前記核酸構築物は、ＣＡＶパッケージングシグナルを含まず、及び／又は前記核酸構築物はＣＡＶ ＶＰ１分子によってパッケージングされることができない、核酸構築物。 - 請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子エレメントを含む宿主細胞（例えば脊椎動物細胞、例えば（ｉ）哺乳動物細胞、例えばヒト細胞；又は（ｉｉ）鳥類細胞、例えばニワトリ細胞）、又は請求項８若しくは９に記載の核酸構築物。
- ＣＡＶベクターであって：
ａ）ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部と；
ｂ）（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）前記ＣＡＶ ＶＰ１分子に特異的に結合するタンパク質結合配列を含む遺伝子エレメントと
を含む、ＣＡＶベクター。 - ＣＡＶベクターであって：
ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子エレメントと、
ｂ）タンパク質性外部、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部と
を含む、ＣＡＶベクター。 - ＣＡＶベクターであって：
ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子エレメントと、
ｂ）カプシド、例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むカプシドと
を含む、ＣＡＶベクター。 - 複合体であって：
遺伝子エレメントに結合したＣＡＶ ＶＰ１分子を含み、
前記遺伝子エレメントが：（ｉ）プロモーターエレメント、（ｉｉ）外因性エフェクターをコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）タンパク質結合配列を含む、複合体。 - 外因性エフェクターを標的細胞（例えば、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達する方法であって、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＶベクターを前記細胞に導入することを含む、方法。
- 外因性エフェクターを標的細胞（例えば脊椎動物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）に送達する方法であって：
（ａ）ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば抗ＣＡＶ抗体、例えばＣＡＶ中和抗体の存在について、前記標的細胞、又は前記標的細胞を含む対象を評価することと；
（ｂ）請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＶベクターを前記細胞に導入することと
を含む、方法。 - ＣＡＶベクターを受容する対象を選択する方法であって、ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば抗ＣＡＶ抗体、例えばＣＡＶ中和抗体の存在について前記対象を評価することを含む、方法。
- それを必要とする対象における生物学的活性を調節する方法であって、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＶベクターを前記対象に導入することを含み、例えば、疾患又は障害が癌である、方法。
- それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＶベクターを前記対象に導入することを含み、例えば、前記疾患又は障害が癌である、方法。
- それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって：
（ａ）ＣＡＶに対する望ましくない免疫応答、例えば抗ＣＡＶ抗体、例えばＣＡＶ中和抗体の存在について前記対象を評価することと；
（ｂ）請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＶベクターを前記対象に導入することと
を含む、方法。 - それを必要とする対象にワクチン接種する方法であって、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＶベクターを前記対象に導入することを含み、前記外因性エフェクターが感染性因子（例えば、ウイルス又は細菌）由来の抗原を含む、方法。
- ＣＡＶベクターの作製方法であって：
ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子エレメントを含む宿主細胞を提供することと、
ｂ）タンパク質性外部（例えば、ＣＡＶ ＶＰ１分子を含むタンパク質性外部）内への前記遺伝子エレメントの閉じ込めに適した条件下で前記宿主細胞をインキュベートすることと
を含み、
それによって前記ＣＡＶベクターを作製する、方法。 - ＣＡＶベクターを含む組成物を保存する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物を、１～５℃、５～１０℃、１０～１５℃、１５～２０℃、又は２０～２５℃の温度で、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、若しくは２年の期間、又は約１～２週間、２～３週間、３～４週間、１～２ヶ月、２～３ヶ月、３～４ヶ月、４～５ヶ月、５～６ヶ月、６～７ヶ月、７～８ヶ月、８～９ヶ月、９～１０ヶ月、１０～１１ヶ月、１１～１２ヶ月、１２～１８ヶ月、１８～２４ヶ月、若しくは２～３年の期間、維持することを含む、方法。
- ＣＡＶベクターを含む組成物を冷却する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物の温度を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０℃まで、又は１～５℃（例えば、約４℃）まで低下させることを含む、方法。
- ＣＡＶベクターを含む組成物を加熱する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物の温度を、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０℃まで、又は２０～２５℃若しくは２５～３０℃（例えば、約２５℃）まで上昇させることを含む、方法。
- ＣＡＶベクターを含む組成物を加熱する方法であって、ＣＡＶベクター（例えば、本明細書に記載のＣＡＶベクター）を含む組成物の温度を、約３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０℃まで、又は３０～３５℃若しくは３５～４０℃（例えば、約３７℃）まで上昇させることを含む、方法。
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