CN116829723A - 基于鸡贫血病毒（cav）的载体 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及用于制备CA载体的组合物及其用途。
Description
背景技术
鸡贫血病毒(CAV)是环病毒(Gyrovirus)属的无包膜单链DNA病毒，其感染鸡。CAV基因组编码三个开放阅读框，这三个开放阅读框编码VP1、VP2和VP3(也称为凋亡蛋白)。VP1是负责衣壳组装的主要组分。
发明内容
本披露提供了用于感染或调节哺乳动物或鸟类细胞的载体、其他组合物和相关方法。一般而言，本文披露的载体包括包含CAV序列或与其同源的序列的遗传元件，以及蛋白质性外部。在一些实施例中，遗传元件被包含CAV衣壳蛋白的蛋白质性外部或CAV衣壳包封。
本披露还提供了用于产生CA载体(例如，合成的CA载体)的核酸构建体，这些CA载体可以用作递送媒剂，例如，用于将遗传物质、用于将效应物(例如有效载荷)、或者用于将治疗剂或治疗性效应物递送至真核细胞(例如，哺乳动物细胞或组织，例如人细胞或人组织)。通常，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列与CAV基因组(例如，CAV 5'UTR、重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2基因、凋亡蛋白基因、VP1、3'UTR、GC富集区、聚A信号序列(例如，如本文所述)或其功能片段中的一个或多个)的核酸序列具有实质性的(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。在一些实施例中，CA载体还包含蛋白质性外部，该蛋白质性外部包含多肽，该多肽与鸡贫血病毒(CAV)VP1分子具有实质性的(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。
在一些实施例中，CA载体包含封装在蛋白质性外部(例如，包含CAV衣壳蛋白(例如，CAV VP1蛋白或由CAV VP1核酸编码的多肽)的蛋白质性外部，例如，如本文所述)中的遗传元件(例如，包含或编码效应物，例如，外源或内源效应物，例如，治疗性效应物的遗传元件)。在一些实施例中，蛋白质性外部能够将遗传元件引入细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，人细胞)中。在一些实施例中，CA载体是包含蛋白质性外部的感染性媒剂或颗粒，该蛋白质性外部包含由CAV VP1核酸编码的多肽(例如，如本文所述)。本披露的CA载体的遗传元件通常是环状和/或单链DNA分子(例如，环状和单链)。在一些实施例中，遗传元件包括与包封它的蛋白质性外部结合的蛋白结合序列，或与之相连的多肽，这可能有助于将遗传元件包封在蛋白质性外部内，和/或相对于其他核酸而言，将遗传元件富集在蛋白质性外部内。
在一些情况下，使用如本文所述的遗传元件构建体来提供遗传元件。一般而言，遗传元件构建体包含对应于被包封在蛋白质性外部以形成CA载体的遗传元件序列的核酸序列。在一些情况下，遗传元件构建体是环状或线性的。在一些情况下，遗传元件是环状的。在一些情况下，遗传元件是单链的。在一些情况下，遗传元件是双链的。在一些情况下，遗传元件是DNA。在一些实施例中，可以通过遗传元件构建体中的遗传元件序列的滚环复制来产生适合包封在蛋白质性外部中的遗传元件。
在一些情况下，遗传元件包含或编码效应物(例如，核酸效应物，例如非编码RNA，或多肽效应物，例如，蛋白质)，例如，所述效应物可以在细胞(例如靶细胞)中表达。在一些实施例中，效应物是治疗剂或治疗性效应物，例如，如本文所述的。在一些实施例中，效应物是内源的或外源的，例如，对于野生型CAV和/或对于靶细胞。在一些实施例中，效应物对于野生型CAV和/或对于靶细胞是外源的。在一些实施例中，CA载体可以通过接触细胞并将编码效应物的遗传元件引入细胞中，从而将效应物递送到细胞内，使得效应物由细胞产生或表达。在某些情况下，效应物对于靶细胞是内源的(例如，由CA载体以增加的量提供)。在其他情况下，效应物对于靶细胞是外源的。在一些情况下，效应物可以调节细胞的功能或调节(例如，增加或减少)细胞中靶分子的活性或水平。例如，效应物可以降低细胞中靶蛋白的水平。在另一个实例中，效应物可以增加细胞中靶蛋白的水平。在一些实施例中，CA载体可以在体内递送和表达效应物，例如外源蛋白。例如，CA载体可用于将遗传物质递送至靶细胞、组织或受试者；将效应物递送至靶细胞、组织或受试者；或者用于治疗疾病和障碍，例如通过将可作为治疗剂起作用的效应物递送至所期望的细胞、组织或受试者。
在一些实施例中，本文描述的方法和组合物(例如，遗传元件构建体)可用于例如在宿主细胞中产生合成的CA载体。合成的CA载体与野生型病毒(例如，野生型CAV，例如，本文所述)相比具有至少一个结构差异，例如，相对于野生型病毒基因组的遗传元件的差异和/或相对于野生型病毒的结构蛋白(例如，蛋白质性外部中的蛋白质，例如，衣壳蛋白，例如，VP1分子)的差异。在一些实施例中，差异包括相对于野生型病毒的缺失、插入、取代或其他修饰(例如，酶促修饰)中的一个或多个。通常，合成CA载体包括包封在蛋白质性外部(例如，包含CAV VP1分子)内的外源遗传元件，其可用于将遗传元件或在其中编码的(例如，多肽或核酸效应物)效应物(例如，外源效应物或内源效应物)递送至真核(例如，人)细胞中。
在一方面，本披露提供了CA载体，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应物(例如内源或外源效应物)的序列，和蛋白结合序列(例如，外壳蛋白结合序列，如包装信号)；以及(ii)蛋白质性外部；其中将该遗传元件包封在蛋白质性外部(例如，衣壳)内。在一些实施例中，CA载体能够将遗传元件递送至真核(例如，哺乳动物，如人)细胞中。在一些实施例中，遗传元件是单链和/或环状DNA。可替代地或组合地，遗传元件具有以下特性中的一种、两种、三种或所有：是环状的，是单链的，它整合到细胞基因组中的频率低于进入细胞的遗传元件的约0.0001％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％，和/或它以少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个拷贝/基因组整合到靶细胞的基因组中。在一些实施例中，整合频率是通过对从游离载体中分离出来的基因组DNA进行定量凝胶纯化测定来确定的，例如，如Wang等人中所述(2004,Gene Therapy[基因治疗],11:711-721,其通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，将遗传元件包封在蛋白质性外部内。在一些实施例中，CA载体能够将遗传元件递送到真核细胞中。在一些实施例中，遗传元件包含核酸序列(例如，300-4000个核苷酸之间的核酸序列，例如，300-3500个核苷酸之间、300-3000个核苷酸之间、300-2500个核苷酸之间、300-2000个核苷酸之间核苷酸、300-1500个核苷酸之间、1000-4000个核苷酸之间、2000-4000个核苷酸之间、1000-3000个核苷酸之间、2000-2500个核苷酸之间、或2000-3000个核苷酸之间)，该核酸序列与野生型CAV的序列(例如，如本文所述的野生型CAV序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。在一些实施例中，遗传元件包含与CAV序列(例如，如本文所述的野生型CAV序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核酸序列(例如，至少300个核苷酸、500个核苷酸、1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸、2500个核苷酸、3000个核苷酸或更多个核苷酸的核酸序列)。在一些实施例中，核酸序列经过密码子优化，例如，用于在哺乳动物(如，人)细胞中表达。在一些实施例中，核酸序列中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子经过密码子优化，例如，用于在哺乳动物(如，人)细胞中表达。
在一些实施例中，本文所述的遗传元件构建体包含串联排列的遗传元件序列的第一拷贝(例如，突变鸡贫血病毒(CAV)基因组)和遗传元件序列的第二拷贝的至少一部分(例如，CAV基因组或其片段)。具有这样的结构的遗传元件构建体在本文中通常称为串联构建体。这样的串联构建体用于产生CA载体遗传元件。在一些情况下，遗传元件序列的第一拷贝和遗传元件序列的第二拷贝可以在遗传酸构建体上彼此紧邻。在其他情况下，遗传元件序列的第一拷贝和遗传元件序列的第二拷贝可以隔开，例如，由间隔序列隔开。在一些实施例中，遗传元件序列的第二拷贝或其部分包含上游复制促进序列(uRFS)，例如，如本文所述的。在一些实施例中，遗传元件序列的第二拷贝或其部分包含下游复制促进序列(dRFS)，例如，如本文所述的。在一些实施例中，uRFS和/或dRFS包含复制起点(ORI)(例如，哺乳动物ORI或昆虫ORI)或其部分。在一些实施例中，uRFS和/或dRFS不包含复制起点。在一些实施例中，uRFS和/或dRFS包含发夹环(例如，在5’UTR中)。在一些实施例中，与缺乏遗传元件的第二拷贝或其部分但在其他方面类似的构建体相比，串联构建体产生更高水平的遗传元件。在不受理论束缚的情况下，在一些实施例中，本文所述的串联构建体可以通过滚环式复制进行复制。在一些实施例中，串联构建体是质粒。
在一些情况下，串联构建体可以包括遗传元件序列的第一拷贝和遗传元件序列的第二拷贝，或其部分(例如，uRFS或dRFS)。应当理解的是，第二拷贝可以是第一拷贝的相同拷贝或其部分，或者可以包含一个或多个序列差异，例如置换。在一些情况下，遗传元件序列的第二拷贝或其部分(例如，uRFS)相对于遗传元件序列的第一拷贝位于5’方向。在一些情况下，遗传元件序列的第二拷贝或其部分(例如，dRFS)相对于遗传元件序列的第一拷贝位于3’方向。在一些情况下，遗传元件序列的第二拷贝或其部分和遗传元件序列的第一拷贝在串联构建体中彼此相邻。在一些情况下，遗传元件序列的第二拷贝或其部分和遗传元件序列的第一拷贝可以隔开，例如，由间隔序列隔开。
在一些实施例中，本文所述的串联构建体可用于产生包含衣壳(例如，包含指CAVORF如VP1、多肽的衣壳)的感染性(例如，对人细胞具有感染性)CA载体、媒剂或颗粒的遗传元件，该衣壳封装遗传元件，该遗传元件包含与衣壳结合的蛋白结合序列和编码治疗性效应物的异源(针对CAV而言)序列。在实施例中，CA载体能够将遗传元件递送至哺乳动物(例如，人)细胞中。在一些实施例中，遗传元件与野生型CAV基因组序列具有小于约6％(例如，小于10％、9％、8％、7％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％或更小)的同一性。在一些实施例中，遗传元件与野生型CAV基因组序列具有不超过1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％或6％的同一性。在一些实施例中，遗传元件与野生型CAV具有至少约2％到至少约5.5％(例如，2％至5％、3％至5％、4％至5％)的同一性。在一些实施例中，遗传元件具有大于约2000、3000、4000、4500或5000个核苷酸的非病毒序列(例如，非CAV基因组序列)。在一些实施例中，遗传元件具有大于约2000至5000、2500至4500、3000至4500、2500至4500、3500或4000、4500(例如，约3000至4500)个核苷酸的非病毒序列(例如，非CAV基因组序列)。在一些实施例中，遗传元件是单链环状DNA。可替代地或组合地，遗传元件具有以下特性中的一种、两种或三种：是环状的，是单链的，它以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、或2％的频率整合进入细胞的基因组中，它以小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个拷贝/基因组整合进入靶细胞的基因组中或以少于进入细胞的遗传元件的约0.0001％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合(例如，相对于来自细胞裂解物的遗传元件序列比较进入基因组DNA的整合频率)。在一些实施例中，整合频率是通过对从游离载体中分离出来的基因组DNA进行定量凝胶纯化测定来确定的，例如，如Wang等人中所述(2004,Gene Therapy[基因治疗],11:711-721,其通过引用以其全文并入本文)。
在本文的系统和方法的一些实施例中，通过将作为遗传元件或遗传元件构建体(例如，串联构建体)的第一核酸分子和编码蛋白质性外部(例如，衣壳蛋白)的第二核酸分子引入细胞来制备CA载体。在一些实施例中，第一核酸分子和第二核酸分子相互连接(例如，在本文所述的遗传元件构建体中，例如，以顺式相互连接)。在一些实施例中，第一核酸分子和第二核酸分子是分开的(例如，以反式分开)。在一些实施例中，第一核酸分子是质粒、粘粒、杆粒、微环或人工染色体。在一些实施例中，第二核酸分子是质粒、粘粒、杆粒、微环或人工染色体。在一些实施例中，第二核酸分子整合到宿主细胞的基因组中。
在一些实施例中，该方法进一步包括，将第一核酸分子和/或第二核酸分子引入宿主细胞中。在一些实施例中，在引入第一核酸分子之前、同时或之后，将第二核酸分子引入宿主细胞中。在其他实施例中，第二核酸分子整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，第二核酸分子是或包含辅助构建体、辅助病毒或其他辅助载体或者是其部分。
在一些实施例中，如本文所述的CAV或CA载体可用作有效的递送媒剂，用于将作用剂如本文所述的效应物引入靶细胞中，例如，待接受治疗的受试者中的靶细胞。
在一些实施例中，本文所述的CA载体包含含有多肽(例如，合成的多肽，例如，VP1分子)的蛋白质性外部，该多肽包含(例如，串联)：
(i)第一区，其包含精氨酸富集区，例如，包含至少60％、70％或80％碱性残基(例如，精氨酸、赖氨酸或其组合)的至少约40个氨基酸的序列，
(ii)第二区，其包含胶冻卷结构域，例如包含至少6个β链的序列，例如，6、7或8个β链排列成两个反平行的β折叠，它们通过疏水界面堆积在一起，和
(iii)任选地，其中该多肽具有与例如本文所述的野生型CAV VP1蛋白存在小于100％、99％、98％、95％、90％、85％、80％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所述的CA载体包含含有多肽的蛋白质性外部，该多肽包含以下中的任何一个或多个(例如，1、2、3、4个或所有)：
(i)核定位信号(NLS)，该核定位信号包含氨基酸序列RRARRPRGRFYAFRRGR，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)核定位信号(NLS)，该核定位信号包含氨基酸序列KRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(iii)核输出号(NES)，该核输出信号包含氨基酸序列IFLTEGLIL，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(iv)核输出号(NES)，该核输出信号包含氨基酸序列LKEFLLASMNL，与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(v)核输出号(NES)，该核输出信号包含氨基酸序列ELDTNFFTLYVAQ，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
例如，如Cheng等人所述(2019,Virol.J.[病毒学杂志]16:45所述；将其通过引用以其全文并入本文)。
在一方面，本发明的特征在于包含遗传元件序列的分离的核酸分子(例如，遗传元件构建体)，该遗传元件序列包含与编码效应物例如有效载荷的序列可操作地连接的启动子元件，以及外壳蛋白结合序列。在一些实施例中，外壳蛋白结合序列包括与例如本文披露的CAV的5’UTR序列存在至少75％(至少80％、85％、90％、95％、97％、100％)同一性的序列。在实施例中，遗传元件是单链DNA，是环状的，以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、或2％的频率整合，和/或以小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个拷贝/基因组整合进入靶细胞的基因组中或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合。在一些实施例中，整合频率是通过对从游离载体中分离出来的基因组DNA进行定量凝胶纯化测定来确定的，例如，如Wang等人中所述(2004,Gene Therapy[基因治疗],11:711-721,其通过引用以其全文并入本文)。在实施例中，效应物并非源自TTV，也不是SV40-miR-S1。在实施例中，核酸分子不包含TTMV-LY2的多核苷酸序列。在实施例中，启动子元件指导效应物在真核(例如哺乳动物，例如人)细胞中的表达。在实施例中，效应物是哺乳动物核酸或多肽(例如，哺乳动物(例如人)多肽或核酸)。
在一些实施例中，核酸分子是环状的。在一些实施例中，核酸分子是线性的。在一些实施例中，本文所述的核酸分子包含一个或多个经修饰的核苷酸(例如碱基修饰、糖修饰或主链修饰)。
在一些实施例中，核酸分子包含编码VP1分子(例如，CAV VP1蛋白，例如，如本文所述)的序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码VP2分子(例如，CAV VP2蛋白，例如，如本文所述)的序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码凋亡蛋白分子(例如，CAV凋亡蛋白，例如，如本文所述)的序列。在一方面，本发明的特征在于遗传元件，其包含以下中的一种、两种或三种：(i)启动子元件和编码效应物例如外源或内源效应物的序列；(ii)至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100或150个核苷酸，其与野生型CAV序列具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；或至少100(例如，至少300、500、1000、1500)个连续核苷酸，其与野生型CAV序列具有至少72％(例如，至少72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及(iii)蛋白结合序列，例如外壳蛋白结合序列，并且其中遗传元件构建体是单链DNA；并且其中遗传元件构建体是环状的，以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、或2％频率整合，和/或以小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个拷贝/基因组整合进入靶细胞的基因组中。在一些实施例中，编码效应物(例如，外源或内源效应物，例如，如本文所述)的遗传元件是经密码子优化的。在一些实施例中，遗传元件是环状的。在一些实施例中，遗传元件是线性的。在一些实施例中，本文所述的遗传元件包含一个或多个经修饰的核苷酸(例如碱基修饰、糖修饰或主链修饰)。在一些实施例中，遗传元件包含编码VP1分子(例如，CAV VP1蛋白，例如，如本文所述)的序列。在一些实施例中，遗传元件包含编码VP2分子(例如，CAV VP2蛋白，例如，如本文所述)的序列。在一些实施例中，遗传元件包含编码凋亡蛋白分子(例如，CAV凋亡蛋白，例如，如本文所述)的序列。
在一方面，本发明的特征在于宿主细胞，其包含如本文所述的串联构建体。在一些实施例中，宿主细胞包含：(a)核酸分子，其包含编码VP1分子、VP2分子或凋亡蛋白分子中的一个或多个的序列(例如，编码本文所述的CAV VP1多肽的序列)，例如，其中核酸分子是质粒、是病毒核酸、或整合到染色体中；和(b)遗传元件，其中该遗传元件包含(i)可操作地连接至编码效应物(例如，外源效应物或内源效应物)的核酸序列(例如，DNA序列)的启动子元件和(ii)结合(a)的多肽的蛋白结合序列，其中任选地，该遗传元件不编码VP1多肽(例如，VP1蛋白)。例如，宿主细胞包含以顺式(均是同一核酸分子的一部分)或反式(各自是不同核酸分子的一部分)存在的(a)和(b)。在实施例中，(b)的遗传元件是环状单链DNA。在一些实施例中，宿主细胞是生产细胞系，例如，如本文所述的。在一些实施例中，宿主细胞是贴壁的或悬浮的，或者二者兼有。在一些实施例中，宿主细胞或辅助细胞在微载剂中生长。在一些实施例中，宿主细胞或辅助细胞符合cGMP生产规范。在一些实施例中，宿主细胞或辅助细胞在适合促进细胞生长的培养基中生长。在某些实施例中，一旦宿主细胞或辅助细胞已经充分生长(例如，达到适当的细胞密度)，就可以将培养基更换为适于宿主细胞或辅助细胞产生CA载体的培养基。
在一方面，本发明的特征在于药物组合物，其包含如本文所述的CA载体(例如，合成的CA载体)。在实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在实施例中，药物组合物包含单位剂量，该单位剂量包含每千克目标受试者约105-1014(例如，约106-1013、107-1012、108-1011或109-1010)个基因组当量的CA载体。在一些实施例中，包含制剂的药物组合物在可接受的期限和温度范围内是稳定的，和/或与所期望的施用途径和/或该施用途径所需的任何装置(例如，针头或注射器)相容。在一些实施例中，将药物组合物配制用于作为单剂量或多剂量施用。在一些实施例中，将药物组合物在施用场所配制，例如由医疗保健专业人员配制。在一些实施例中，药物组合物包含所期望的浓度的CA载体基因组或基因组当量(例如，由每体积的基因组数量来定义)。
在一方面，本发明的特征在于包含CA载体的药物组合物，其中该组合物满足21C.F.R.§§610.12和610.13的要求。例如，药物组合物可具有以下特征中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个：
(i)基本上没有外源因子，
(ii)基本上没有致热物质，
(iii)含有等于或少于对照参考或规范(例如美国药典(USP)或FDA内毒素污染参考标准)的内毒素，
(iv)含有等于或少于对照参考或规范(例如美国药典(USP)或FDA支原体污染参考标准)的支原体，
(v)含有比对照参考标准更少的宿主细胞DNA，例如，少于10ng宿主细胞DNA/剂量，少于5ng宿主细胞DNA/剂量，
(vi)含有比对照参考标准更少的宿主细胞蛋白(HCP)，例如少于100ng/mL、少于50ng/mL和/或少于10ng/剂量、少于5ng/剂量，
(vii)含有比阈值量更少的非感染性颗粒，例如，满足非感染性颗粒相对于感染性颗粒的预定释放规范，例如，颗粒比感染性单位<2000:1、<1000:1、<500:1，<300:1、<200:1、<100:1或<50:1，和/或
(viii)包含比阈值量更少的空衣壳(即，缺少基因组)，例如，满足空衣壳的预定释放规范。
在一方面，本发明的特征在于治疗受试者中疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如，合成CA载体，例如，如本文所述的。
在一方面，本发明的特征在于将效应物或有效载荷(例如，内源或外源效应物)递送至细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如合成的CA载体，例如，如本文所述的，其中该CA载体包含编码该效应物的核酸序列。在实施例中，有效载荷是核酸。在实施例中，有效载荷是多肽。
在一方面，本发明的特征在于将CA载体递送至细胞的方法，该方法包括使该CA载体(例如合成的CA载体，例如，如本文所述)与细胞(例如真核细胞，如哺乳动物细胞)进行接触，例如，在体内或离体条件下进行接触。
在一方面，本发明的特征在于制备CA载体如合成的CA载体的方法。
该方法包括：
(a)提供宿主细胞，其包含：
(i)第一核酸分子，该第一核酸分子包含例如本文所述的CA载体的遗传元件的核酸序列的第一拷贝，和CA载体的遗传元件的核酸序列的第二拷贝或其一部分(例如uRFS或dRFS)；以及
(ii)第二核酸分子，该第二核酸分子编码指CAV VP1多肽，或者选自VP1、VP2或凋亡蛋白分子的氨基酸序列中的一个或多个，例如，如本文所述的，或与其具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列；以及
(b)在适于遗传元件的核酸序列的第一拷贝复制(例如，滚环式复制)的条件下培养宿主细胞，从而产生遗传元件；
任选地，(c)在适于将遗传元件包封在蛋白质性外部(例如，包含由第二核酸分子编码的多肽)中的条件下培养宿主细胞，并且
任选地(d)从该细胞或细胞培养物收获CA载体。
在另一方面，本发明的特征在于生产CA载体组合物的方法，该方法包括以下(a)、(b)、(c)和(d)中的一项或多项(例如，所有)：
a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含，例如表达CA载体，例如本文所述的合成的CA载体的一个或多个组分(例如，所有组分)；
b)在适合从该宿主细胞产生CA载体制剂的条件下培养该宿主细胞，其中该制剂的CA载体包含封装该遗传元件(例如，如本文所述)的蛋白质性外部(例如，包含CA载体VP1多肽)，从而制备CA载体制剂；
任选地，c)从该宿主细胞收获这些CA载体，
以及
任选地，d)配制CA载体制剂，例如，作为适于向受试者施用的药物组合物。
例如，在该制造方法中提供的宿主细胞包含(a)包含编码本文所述的CAV VP1多肽的序列的核酸，其中该核酸是质粒、病毒核酸或基因组，或整合到辅助细胞染色体中；和(b)能够产生遗传元件的串联构建体，其中该遗传元件包含(i)可操作地连接至编码效应物(例如，外源效应物或内源效应物)的核酸序列(例如，DNA序列)的启动子元件和(ii)结合(a)的多肽的蛋白结合序列(例如包装信号)，其中该宿主细胞包括以顺式或以反式的(a)和(b)。在实施例中，(b)的遗传元件是环状单链DNA。在一些实施例中，宿主细胞是生产细胞系。
在一些实施例中，将CA载体的组分在产生时引入宿主细胞中(例如，通过瞬时转染)。在一些实施例中，宿主细胞稳定表达CA载体的组分(例如，其中将编码CA载体组分的一种或多种核酸引入宿主细胞或其祖细胞中，例如，通过稳定转染)。
在一方面，本发明的特征在于生产CA载体组合物的方法，该方法包括：a)提供本文所述的多个CA载体，或本文所述的CA载体制剂；和b)配制CA载体或其制剂，例如，作为适于向受试者施用的药物组合物。
在一方面，本发明的特征在于制备包含CA载体的宿主细胞的方法，该宿主细胞是例如第一宿主细胞或生产细胞，例如第一宿主细胞群，该方法包括将能够产生遗传元件的串联构建体(例如，如本文所述)引入宿主细胞中并在适于产生CA载体的条件下培养该宿主细胞。在实施例中，该方法进一步包括将辅助物，例如辅助病毒引入宿主细胞中。在实施例中，引入包括用CA载体对宿主细胞进行转染(例如，化学转染)或电穿孔。
在一方面，本发明的特征在于制备CA载体的方法，该方法包括提供包含CA载体(例如本文所述的CA载体)的宿主细胞，例如第一宿主细胞或生产细胞，并从该宿主细胞中纯化该CA载体。在一些实施例中，该方法进一步包括，在提供步骤之前，使宿主细胞与串联构建体或CA载体，例如本文所述的串联构建体或CA载体进行接触，并在适于产生CA载体的条件下孵育宿主细胞。在实施例中，宿主细胞是上述制备宿主细胞的方法中描述的第一宿主细胞或生产细胞。在实施例中，从宿主细胞中纯化CA载体包括裂解宿主细胞。
在一些实施例中，该方法进一步包括使由第一宿主细胞或生产细胞产生的CA载体与第二宿主细胞进行接触的第二步骤，该第二宿主细胞是例如允许细胞，例如，第二宿主细胞群。在一些实施例中，该方法进一步包括在适于产生CA载体的条件下孵育第二宿主细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括从第二宿主细胞中纯化CA载体，例如，从而产生CA载体种子群。在实施例中，从第二宿主细胞群中产生的CA载体比从第一宿主细胞群中产生的CA载体多出至少约2-100倍。在实施例中，从第二宿主细胞中纯化CA载体包括裂解第二宿主细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括使由第二宿主细胞产生的CA载体与第三宿主细胞进行接触的第三步骤，该第三宿主细胞是例如允许细胞，例如，第三宿主细胞群。在一些实施例中，该方法进一步包括在适于产生CA载体的条件下孵育第三宿主细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括从第三宿主细胞中纯化CA载体，例如，从而产生CA载体储备物群体。在实施例中，从第三宿主细胞中纯化CA载体包括裂解第三宿主细胞。在实施例中，从第三宿主细胞群中产生的CA载体比从第二宿主细胞群中产生的CA载体多出至少约2-100倍。
在一些实施例中，宿主细胞在适合促进细胞生长的培养基中生长。在某些实施例中，一旦宿主细胞已经充分生长(例如，达到适当的细胞密度)，就可以将培养基更换为适于宿主细胞产生CA载体的培养基。在一些实施例中，在与第二宿主细胞接触之前，将由宿主细胞产生的CA载体从宿主细胞中分离出来(例如，通过裂解宿主细胞)。在一些实施例中，使由宿主细胞产生的CA载体与第二宿主细胞进行接触，而无需中间的纯化步骤。
在一方面，本发明的特征在于制备药用CA载体制剂的方法。所述方法包括(a)制备如本文所述的CA载体制剂，(b)针对以下一种或多种药物质量控制参数评估所述制剂(例如，药物CA载体制剂、CA载体种子群体或CA载体储备物群体)：同一性、纯度、滴度、效力(例如，以每个CA载体颗粒的基因组当量)和/或例如来自CA载体所包含的遗传元件的核酸序列，和(c)配制用于评估的药物用途的制剂满足预定标准，例如，满足药物规范。在一些实施例中，评价鉴别包括评价(例如，确认)CA载体遗传元件的序列，例如，编码效应物的序列。在一些实施例中，评价纯度包括评价杂质的量，例如，支原体、内毒素、宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、动物源性的工艺杂质(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、可复制型因子(RCA)，例如可复制型病毒或不必要的CA载体(例如，除了所期望的CA载体(例如本文所述合成的CA载体)之外的CA载体)、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和聚集体。在一些实施例中，评价滴度包括评价制剂中功能性与非功能性(例如，感染性与非感染性)CA载体的比率(例如，通过HPLC进行评价)。在一些实施例中，评价效力包括评价制剂中可检测到的CA载体功能(例如，其中编码的效应物或基因组当量的表达和/或功能)水平。
在实施例中，配制的制剂基本上不含病原体、宿主细胞污染物或杂质；具有预定水平的非感染性颗粒或预定比率的颗粒:感染单位(例如，<300:1、<200:1、<100:1或<50:1)。
在一些实施例中，可以在单个批次中产生多个CA载体。在实施例中，可以评价在该批次中产生的CA载体的水平(例如，单独或一起评价)。
在一方面，本发明的特征在于宿主细胞，其包含：
(i)第一核酸分子，其包含如本文所述的串联构建体，和
(ii)任选地，第二核酸分子，其编码选自VP1、VP2或凋亡蛋白分子的氨基酸序列中的一个或多个，例如，如本文所述的，或与其具有至少约70％(例如，至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一方面，本发明的特征在于一种反应混合物，其包含本文所述的CA载体和编码外部蛋白的多核苷酸(例如，能够结合外壳蛋白结合序列的外壳蛋白，以及任选的脂质包膜)、编码复制蛋白(例如，聚合酶)的多核苷酸或其任何组合。
在一些实施例中，CA载体(例如，合成的CA载体)是分离出来的，例如，从宿主细胞中分离出来和/或从溶液的其他成分(例如，上清液)中分离出来。在一些实施例中，CA载体(例如，合成的CA载体)是经纯化的，例如，从溶液(例如，上清液)中纯化。在一些实施例中，相对于溶液中的其他成分，CA载体在溶液中是经富集的。
在任何前述CA载体、组合物或方法的一些实施例中，提供CA载体包括从组合物中分离(例如，收获)CA载体，该组合物包含CA载体产生细胞，例如，如本文所述的。在其他实施例中，提供CA载体包括获得CA载体或其制剂，例如，从第三方获得。
在任何前述CA载体、组合物或方法的一些实施例中，遗传元件包含CA载体基因组，例如，如根据本文所述的方法鉴定的基因组。在实施例中，遗传元件能够进行自我复制和/或自我扩增。在实施例中，遗传元件不能进行自我复制和/或自我扩增。在实施例中，遗传元件能够以反式复制和/或扩增。
任何前述CA载体、组合物或方法的其他特征包括以下列举的实施例中的一个或多个。
本领域技术人员将会认识到，或者仅使用常规实验就能够确定本文所述本发明的具体实施例的许多等同形式。这样的等同形式意在由以下列举的实施例所涵盖。
列举的实施例
1.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
特异性结合CAV衣壳多肽(例如，CAV VP1分子)的蛋白质结合序列，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)。
2.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
蛋白质结合序列；
其中该遗传元件能够被CAV VP1分子包装(例如，特异性包装)。
3.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
特异性结合CAV衣壳多肽的蛋白质结合序列；
其中该外源效应物：
(a)针对在人细胞中表达而经过密码子优化，
(b)是人多肽或核酸，
(c)结合人多肽或核酸，或
(d)在人细胞中具有活性，例如，调节(例如，增加或减少)人细胞中人基因的活性和/或水平)。
4.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该蛋白质结合序列包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
5.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
与SEQ ID NO:1的核苷酸1-374具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列和/或与SEQ ID NO:100的核苷酸2195-2319具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
6.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
与CAV基因组序列(例如，如本文所述)的连续部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500或3,000个核苷酸。
7.如实施例6所述的遗传元件，其包含与CAV基因组序列(例如，如本文所述)的连续部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的至少1,000个核苷酸。
8.一种遗传元件，其包含：
特异性结合CAV衣壳多肽的蛋白质结合序列，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)，
其中该遗传元件不包含以下的一个或多个：
(i)全长CAV VP1基因(例如，其中该遗传元件包含该CAV VP1基因的一个或多个片段，例如，CAV VP1基因序列的少于约500、400、300、200或100个核苷酸)；
(ii)全长CAV VP2基因(例如，其中该遗传元件包含该CAV VP2基因的一个或多个片段，例如，CAV VP2基因序列的少于约500、400、300、200或100个核苷酸)；或
(ii)全长CAV凋亡蛋白基因(例如，其中该遗传元件包含该CAV凋亡蛋白基因的一个或多个片段，例如，CAV凋亡蛋白基因序列的少于约500、400、300、200或100个核苷酸)。
9.一种遗传元件，其包含：
特异性结合CAV衣壳多肽的蛋白质结合序列，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)，
其中该遗传元件包含以下的一个或多个：
(i)非功能性CAV VP1基因或其片段(例如，至少25、50、100、200、300、400、500个或更多个bp的连续片段)，例如，在CAV VP1编码序列的序列内，例如，在该CAV VP1编码序列的5’末端包含终止密码子；
(ii)非功能性CAV VP2基因或其片段(例如，至少25、50、100、200、300、400、500个或更多个bp的连续片段)，例如，在CAV VP2编码序列的序列内，例如，在该CAV VP2编码序列的5’末端包含终止密码子；或
(ii)非功能性CAV凋亡蛋白基因或其片段(例如，至少25、50、100、200、300、400、500个或更多个bp的连续片段)，例如，在CAV凋亡蛋白编码序列的序列内，例如，在该CAV凋亡蛋白编码序列的5’末端包含终止密码子。
10.如实施例8或9所述的遗传元件，其中该蛋白质结合序列包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAAC CCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTC AATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
11.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该遗传元件不包含功能性CAV凋亡蛋白基因。
12.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该遗传元件不包含功能性CAVVP1基因、功能性CAV VP2基因或功能性CAV凋亡蛋白基因。
13.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该遗传元件不包含截短的CAVVP1基因(例如，包含在CAV VP1编码序列中的小于1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30或20个核苷酸的连续序列)。
14.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该遗传元件不包含截短的CAVVP2基因(例如，包含在CAV VP2编码序列中的小于600、500、400、300、200、100、50、40、30或20个核苷酸的连续序列)。
15.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该遗传元件不包含截短的CAV凋亡蛋白基因(例如，包含在CAV凋亡蛋白编码序列中的小于350、300、200、100、50、40、30或20个核苷酸的连续序列)。
16.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其进一步包含启动子元件和编码效应物(例如，外源效应物，例如，治疗性效应物)的核酸序列。
17.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下之一或两者：
与SEQ ID NO:10的核苷酸1-606的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、601、602、603、604、605或606个核苷酸，和/或
与SEQ ID NO:10的核苷酸2195-2319的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105、110、115、120、121、122、123或124个核苷酸。
18.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含CAV UTR，例如CAV 5'UTR(例如，如表1A、1B或2-13的任一个中所列)，或与其具有至少有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
19.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含全长CAV VP1基因。
20.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含全长CAV VP2基因。
21.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含全长CAV凋亡蛋白基因。
22.如实施例1-18、20或21中任一项所述的遗传元件，其不包含全长CAV VP1基因。
23.如实施例22所述的遗传元件，其包含来自该CAV VP1基因的5’末端的1-10、10-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900，或900-1000个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
24.如实施例22或23所述的遗传元件，其包含来自该CAV VP1基因的3’末端的1-10、10-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900，或900-1000个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
25.如实施例22或23所述的遗传元件，其包含CAV VP1基因序列的少于1349、1340、1330、1320、1310、1300、1250、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
26.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含全长CAV VP2基因。
27.如实施例26所述的遗传元件，其包含来自CAV VP2基因的5'末端的少于226、220、210、200、190、180、170、160、150、100、50、40、30、20、10或5个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
28.如实施例26或27所述的遗传元件，其包含来自CAV VP2基因的3'末端的少于226、220、210、200、190、180、170、160、150、100、50、40、30、20、10或5个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
29.如实施例26或27所述的遗传元件，其包含CAV VP2基因序列的少于650、640、630、620、610、600、550、500、450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、100、50、40、30、29、28、27或26个核苷酸。
30.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含全长CAV凋亡蛋白基因。
31.如实施例30所述的遗传元件，其包含来自CAV凋亡蛋白基因的5'末端的1-10、10-50、50-100、100-200、200-300或300-350个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
32.如实施例30或31所述的遗传元件，其包含来自CAV凋亡蛋白基因的3'末端的1-10、10-50、50-100、100-200、200-300或300-350个核苷酸，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
33.如实施例30或31所述的遗传元件，其包含CAV凋亡蛋白基因序列的少于365、360、350、340、330、320、310、300、250、200、150、100、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个核苷酸。
34.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其长度为1,000-1,500、1,500-2,000或2,000-2,500，或少于2,500、2,400、2,300、2,200、2,100或2,000个核苷酸。
35.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其是DNA，例如单链DNA。
36.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其是环状的或线性的。
37.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其使用环化的双链DNA产生，例如，其中该环化的DNA通过体外环化产生。
38.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其使用串联核酸构建体产生。
39.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其中该启动子元件对于CAV是内源的。
40.如实施例1-38中任一项所述的遗传元件，其中该启动子元件对于CAV是外源的。
41.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
42.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-374，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
43.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸138-254，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
44.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸255-260，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
45.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸317-322，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
46.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸374-1024，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
47.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸480-845，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
48.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸847-2196，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
49.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸2197-2313，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
50.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸2200-2266，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
51.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸2281-2286，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
52.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸1-374，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
53.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸138-254，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
54.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸255-260，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
55.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸317-322，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
56.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸374-1024，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
57.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸480-845，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
58.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸847-2196，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
59.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸2197-2313，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
60.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸2200-2266，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
61.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:1的核苷酸2281-2286，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
62.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸1-606和/或核苷酸1595-2319，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
63.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸1-806和/或核苷酸1795-2319，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
64.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸1-1006和/或核苷酸1995-2319，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
65.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸1-1206和/或核苷酸2195-2319，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
66.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸1-379，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
67.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸380-1030，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
68.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸485-851，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
69.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸853-2202，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
70.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸2203-2319，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
71.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸138-254，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
72.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸255-260，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
73.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸317-322，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
74.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸374-1024，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
75.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸480-845，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
76.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸847-2196，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
77.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸2197-2313，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
78.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含SEQ ID NO:10的核苷酸2197-2313，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
79.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自野生型CAV基因组(例如，Cuxhaven 1分离株基因组，例如，如表1所示)的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
80.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株1535TW基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
81.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部8个)：来自CAV分离株N5基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
82.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株1623TW基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
83.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株CAV-EG-7基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
84.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株HLJ15108基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
85.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株LN1402基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
86.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株GD-F-12基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
87.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株GX1805基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
88.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株JL14026基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
89.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株HB1517基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
90.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株N1基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
91.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株N2基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
92.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株HN1504基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
93.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自CAV分离株N3基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
94.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自鸟类环病毒(例如，CAV相关的鸟类环病毒，例如，CAV相关的鸟类环病毒2，例如，具有NCBI登录号NC_015396的序列)的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
95.根据前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含以下中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)：来自表17中所列的CAV基因组的重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2、凋亡蛋白、VP1、3'UTR和/或GC富集区或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
96.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含编码CAV VP1蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
97.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含编码CAV VP1蛋白的精氨酸富集区的核酸序列。
98.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含编码CAV VP1蛋白的胶冻卷结构域的核酸序列。
99.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含编码CAV VP2蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
100.如实施例99所述的遗传元件，其不包含编码氨基酸序列I94CNCGQFRKH103的核酸序列。
101.如实施例99或100所述的遗传元件，其不包含编码氨基酸序列WLRECSRSHAKICNCGQFRKH的核酸序列。
102.如实施例100或101所述的遗传元件，其不包含编码形成金属离子配位点(例如，Zn2+配位点)的氨基酸序列的核酸序列。
103.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其不包含编码CAV凋亡蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
104.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含编码CAV VP1蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
105.如实施例104所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含精氨酸富集区。
106.如实施例104或105所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含胶冻卷结构域。
107.如实施例104-106中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含一个或多个DNA结合基序。
108.如实施例104-107中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含DNA结合基序，该DNA结合基序包含氨基酸序列RRARRPRGRFYAFRRGR，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列。
109.如实施例104-108中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含DNA结合基序，该DNA结合基序包含氨基酸序列RRRYKFRHRRQRYRRRAFRKH，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列。
110.如实施例104-109中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含DNA结合基序，该DNA结合基序包含氨基酸序列SRRSFNHHKARGAGDPK，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列。
111.如实施例104-110中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含一个或多个(例如，两个)核定位信号(NLS)。
112.如实施例111所述的遗传元件，其中该NLS包含氨基酸序列RRARRPRGRFYAFRRGRWHH，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列，
113.如实施例111所述的遗传元件，其中该NLS包含氨基酸序列KRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列，
114.如实施例104-113中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP1蛋白包含一个或多个(例如，两个或三个)核输出信号(NES)。
115.如实施例114所述的遗传元件，其中该NES包含氨基酸序列IFLTEGLIL，或与其具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列，
116.如实施例114所述的遗传元件，其中该NES包含氨基酸序列LKEFLLASMNL，或与其具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列，
117.如实施例114所述的遗传元件，其中该NES包含氨基酸序列ELDTNFFTLYVAQ，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列，
118.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含编码CAV VP2蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
119.如实施例118所述的遗传元件，其中该CAV VP2蛋白或其功能片段包含氨基酸序列I94CNCGQFRKH103。
120.如实施例118所述的遗传元件，其中该CAV VP2蛋白或其功能片段包含氨基酸序列WX7HX3CXCX5H。
121.如实施例1220所述的遗传元件，其中每个X可以是任何氨基酸。
122.如实施例120或121所述的遗传元件，其中每个Xn包含n个氨基酸。
123.如实施例118-122中任一项所述的遗传元件，其中该CAV VP2蛋白或其功能片段包含氨基酸序列WLRECSRSHAKICNCGQFRKH。
124.如实施例119-123中任一项所述的遗传元件，其中该氨基酸序列的半胱氨酸和组氨酸残基形成金属离子配位点(例如，Zn2+配位点)。
125.如前述实施例中任一项所述的遗传元件，其包含编码CAV凋亡蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
126.一种核酸构建体，其包含如前述实施例中任一项所述的遗传元件的核酸序列。
127.如实施例126所述的核酸构建体，其是DNA，例如单链或双链DNA。
128.如实施例126或127所述的核酸构建体，其包含适于该核酸构建体复制，例如适于在细菌细胞中复制的主链区。
129.如实施例128所述的核酸构建体，其中该主链区包含复制起点和选择性标志之一或两者。
130.如实施例126-129中任一项的核酸构建体，其进一步包含与该遗传元件串联放置的CAV串联区，其中该CAV串联区包含CAV基因组或其片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
131.如实施例130所述的核酸构建体，其中该遗传元件相对于该CAV串联区位于3’。
132.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列(或其片段，例如包含这些重复序列中的1、2、3、4或5个的片段)、启动子、开放阅读框和发夹。
133.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的启动子、开放阅读框和发夹。
134.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的开放阅读框和发夹。
135.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的开放阅读框的片段(例如，开放阅读框的3'片段，例如，包含开放阅读框的5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个或500个最3’的核苷酸)和发夹。
136.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列(或其片段，例如包含这些重复序列中的1、2、3、4或5个的片段)。
137.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列和/或启动子。
138.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列、启动子和/或开放阅读框。
139.如实施例131所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列、启动子、和/或开放阅读框的至少一个片段(例如，开放阅读框的3'片段，例如，包含开放阅读框的5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个或500个最3’的核苷酸)和发夹。
140.如实施例130所述的核酸构建体，其中该遗传元件相对于该CAV串联区位于5’。
141.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列、启动子、开放阅读框和发夹。
142.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列、启动子和开放阅读框。
143.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列、启动子、和开放阅读框的片段(例如，开放阅读框的5'片段，例如，包含开放阅读框的5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个或500个最5’的核苷酸)。
144.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列。
145.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列的片段。
146.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的发夹。
147.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的开放阅读框和/或发夹。
148.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的开放阅读框的片段(例如，开放阅读框的5'片段，例如，包含开放阅读框的5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个或500个最5’的核苷酸)和/或发夹。
149.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的启动子、开放阅读框和发夹。
150.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列、启动子、开放阅读框和发夹。
151.如实施例140所述的核酸构建体，其中该CAV串联区不包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的重复序列的片段、启动子、开放阅读框和发夹。
152.如前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2100个、2200个、2300个、2310个、2311个或2312个连续核苷酸，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
153.如前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的不超过10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2100个、2200个、2300个、2310个、2311个或2312个连续核苷酸，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
154.如前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV串联区包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2310或2310-2313个连续核苷酸，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
155.一种核酸构建体(例如，质粒)，其包含以下中的一个、两个或所有三个：
(a)CAV VP1基因，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；
(b)CAV VP2基因，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；和/或
(c)CAV凋亡蛋白基因，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；
其中该核酸构建体不包含CAV包装信号，和/或其中该核酸构建体不能被CAV VP1分子包装。
156.如实施例155所述的核酸构建体，其中该CAV包装信号包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAAC CCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTC AATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
157.如实施例155所述的核酸构建体，其包含编码CAV VP1蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
158.如实施例157所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含精氨酸富集区。
159.如实施例157或158所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含胶冻卷结构域。
160.如实施例157-159中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含一个或多个DNA结合基序。
161.如实施例157-160中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含DNA结合基序，该DNA结合基序包含氨基酸序列RRARRPRGRFYAFRRGR，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列。
162.如实施例157-161中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含DNA结合基序，该DNA结合基序包含氨基酸序列RRRYKFRHRRQRYRRRAFRKH，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列。
163.如实施例157-162中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含DNA结合基序，该DNA结合基序包含氨基酸序列SRRSFNHHKARGAGDPK，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列。
164.如实施例157-163中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含一个或多个(例如，两个)核定位信号(NLS)。
165.如实施例164所述的核酸构建体，其中该NLS包含氨基酸序列RRARRPRGRFYAFRRGRWHH，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列，
166.如实施例164所述的核酸构建体，其中该NLS包含氨基酸序列KRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列，
167.如实施例157-166中任一项所述的核酸构建体，其中该CAV VP1蛋白包含一个或多个(例如，两个或三个)核输出信号(NES)。
168.如实施例167所述的核酸构建体，其中该NES包含氨基酸序列IFLTEGLIL，或与其具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列，
169.如实施例167所述的核酸构建体，其中该NES包含氨基酸序列LKEFLLASMNL，或与其具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列，
170.如实施例167所述的核酸构建体，其中该NES包含氨基酸序列ELDTNFFTLYVAQ，或与其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列，
171.如前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其包含编码CAV VP2蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
172.如实施例171所述的核酸构建体，其中该CAV VP2蛋白或其功能片段包含氨基酸序列I94CNCGQFRKH103。
173.如实施例171所述的核酸构建体，其中该CAV VP2蛋白或其功能片段包含氨基酸序列WX7HX3CXCX5H。
174.如实施例171或172所述的核酸构建体，其中该CAV VP2蛋白或其功能片段包含氨基酸序列WLRECSRSHAKICNCGQFRKH。
175.如实施例172-174中任一项所述的核酸构建体，其中该氨基酸序列的半胱氨酸和组氨酸残基形成金属离子配位点(例如，Zn2+配位点)。
176.如前述实施例中任一项所述的核酸构建体，其包含编码CAV凋亡蛋白或其功能片段或变体的核酸序列。
177.一种宿主细胞(例如，鸟类细胞，例如，MDCC细胞，例如，MDCC-MSB1细胞)，该宿主细胞包含如实施例21a所述的核酸构建体和如前述实施例中任一项所述的遗传元件。
178.一种CA载体，其包含：
a)包含CAV VP1分子的蛋白质性外部；
b)遗传元件，其包含：(i)启动子元件，(ii)编码外源效应物的核酸序列，和(iii)特异性结合该CAV VP1分子的蛋白质结合序列。
179.如实施例78所述的CA载体，其中该遗传元件是如实施例1-125中任一项所述的遗传元件。
180.如实施例78所述的CA载体，其中该蛋白质结合序列包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCC CCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAAT AAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
181.一种CA载体，其包含：
a)如实施例1-125中任一项所述的遗传元件，和
b)蛋白质性外部，例如包含CAV VP1分子的蛋白质性外部。
182.一种CA载体，其包含：
a)如实施例1-125中任一项所述的遗传元件，和
b)衣壳，例如包含CAV VP1分子的衣壳。
183.如前述实施例中任一项所述的CA载体，其中该遗传元件包含CAV UTR，例如CAV 5'UTR(例如，如表1A、1B或2-13的任一个中所列)，或与其具有至少有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
184.一种复合物，其包含：
与遗传元件结合的CAV VP1分子，
其中该遗传元件包含：(i)启动子元件，(ii)编码外源效应物的核酸序列，和(iii)蛋白质结合序列。
185.一种复合物，其包含：
如前述实施例中任一项所述的遗传元件，和
与该遗传元件结合的衣壳蛋白(例如CAV VP1分子)。
186.如实施例184或185所述的复合物，其中该遗传元件是如前述实施例中任一项所述的遗传元件；和/或
其中该复合物在无细胞系统中。
187.如实施例184-186中任一项所述的复合物，其中所述蛋白结合序列包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCC TTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATA GCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
188.如实施例184-187中任一项所述的复合物，其中该遗传元件包含CAV UTR，例如CAV 5'UTR(例如，如表1A、1B或2-13的任一个中所列)，或与其具有至少有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
189.一种将外源效应物递送至靶细胞(例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的方法，该方法包括将如实施例178-183中任一项所述的CA载体引入该细胞中。
190.如实施例189所述的方法，其中该方法不包括施用内吞作用抑制剂，例如动力蛋白抑制剂，例如Dynasore。
191.如实施例189或190所述的方法，其中该方法不包括施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
192.如实施例189-191中任一项所述的方法，其中该靶细胞通过内吞作用摄取该CA载体。
193.一种将外源效应物递送至靶细胞(例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的方法，该方法包括将CA载体，例如本文所述的CA载体引入该细胞，其中该细胞未与内吞作用抑制剂(例如，动力蛋白抑制剂，例如Dynasore)接触。
194.一种将外源效应物递送至靶细胞(例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的方法，该方法包括将CA载体，例如本文所述的CA载体引入该细胞，其中该细胞未与内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹接触。
195.一种将外源效应物递送至靶细胞(例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的方法，该方法包括：
(a)评估该靶细胞或包含该靶细胞的受试者是否存在针对CAV的不需要的免疫响应，例如抗CAV抗体，例如CAV中和性抗体；以及
(b)将如实施例178-183中任一项所述的CA载体引入该细胞中。
196.一种选择受试者以接受CA载体的方法，该方法包括评估该受试者是否存在针对CAV的不需要的免疫响应，例如抗CAV抗体，例如CAV中和性抗体。
197.一种在有需要的受试者中调节生物活性的方法，该方法包括向该受试者中引入如实施例178-183中任一项所述的CA载体，例如，其中该疾病或障碍是癌症。
198.如实施例197所述的方法，其中该方法不包括施用内吞作用抑制剂，例如动力蛋白抑制剂，例如Dynasore。
199.如实施例197或198所述的方法，其中该方法不包括施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
200.如实施例197-199中任一项所述的方法，其中该靶细胞通过内吞作用摄取该CA载体。
201.一种在有需要的受试者中调节生物活性的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如本文所述的CA载体，其中未向该受试者施用内吞作用抑制剂(例如，动力蛋白抑制剂，例如Dynasore)。
202.一种在有需要的受试者中调节生物活性的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如本文所述的CA载体，其中未向该受试者施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
203.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者中引入如实施例178-183中任一项所述的CA载体，例如，其中该疾病或障碍是癌症。
204.如实施例203所述的方法，其中该方法不包括施用内吞作用抑制剂，例如动力蛋白抑制剂，例如Dynasore。
205.如实施例203或204所述的方法，其中该方法不包括施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
206.如实施例203-205中任一项所述的方法，其中该靶细胞通过内吞作用摄取该CA载体。
207.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如本文所述的CA载体，其中未向该受试者施用内吞作用抑制剂(例如，动力蛋白抑制剂，例如Dynasore)。
208.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如本文所述的CA载体，其中未向该受试者施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
209.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括：
(a)评估该受试者是否存在针对CAV的不需要的免疫响应，例如抗CAV抗体，例如CAV中和性抗体；以及
(b)向受试者施用如实施例178-183中任一项所述的CA载体。
210.如实施例209所述的方法，其中该方法不包括施用内吞作用抑制剂，例如动力蛋白抑制剂，例如Dynasore。
211.如实施例209或210所述的方法，其中该方法不包括施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
212.如实施例209-211中任一项所述的方法，其中该靶细胞通过内吞作用摄取该CA载体。
213.一种对有需要的受试者接种疫苗的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例178-283中任一项所述的CA载体，其中外源效应物包含来自感染性病原体(例如，病毒或细菌)的抗原。
214.如实施例213所述的方法，其中该方法不包括施用内吞作用抑制剂，例如动力蛋白抑制剂，例如Dynasore。
215.如实施例213或214所述的方法，其中该方法不包括施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹。
216.如实施例213-215中任一项所述的方法，其中该靶细胞通过内吞作用摄取该CA载体。
217.一种对有需要的受试者接种疫苗的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如本文所述的CA载体，其中未向该受试者施用内吞作用抑制剂(例如，动力蛋白抑制剂，例如Dynasore)，并且其中外源效应物包含来自感染性病原体(例如，病毒或细菌)的抗原。
218.一种对有需要的受试者接种疫苗的方法，该方法包括向该受试者施用CA载体，例如本文所述的CA载体，其中未向该受试者施用内体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1(BafA1)或氯喹，并且其中外源效应物包含来自感染性病原体(例如，病毒或细菌)的抗原。
219.如实施例189-218中任一项所述的方法，其中该靶细胞是淋巴样细胞(例如，B细胞或T细胞)、上皮细胞、肺细胞或成纤维细胞。
220.如实施例189-219中任一项所述的方法，其中该靶细胞是人细胞。
221.如实施例189-219中任一项所述的方法，其中该靶细胞是来自动物(例如农业动物，例如牛、绵羊、猪、山羊、马、野牛或骆驼)的细胞。
222.如实施例221所述的方法，其中该动物是鸟类动物(例如，火鸡、鸡、鹌鹑、鸸鹋或鸵鸟)。
223.如实施例189-222中任一项所述的方法，其中该靶细胞是在体内或体外。
224.如实施例189-223中任一项所述的方法，其中该CA载体以约1-10(例如，约2-4，例如，约3)、10-50、50-100、100-500、500-1000、1000-5000、5000-10,000、10,000-50,000或50,000-100,000的MOI递送。
225.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中如果该外源效应物被纳米萤光素酶替代，则该CA载体可以在体外将纳米萤光素酶递送至多个靶细胞，导致至少约104、105、106或107，或约104-105、105-106或106-107的发光，例如在实例5的测定中。
226.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其可以结合人细胞(例如Raji细胞)，例如，以相对于与MDCC细胞结合至少10％、20％、30％或40％的vg，例如在实例3的测定中。
227.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中该遗传元件产生比对照载体多至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、500、1000、10,000倍的该外源效应物的拷贝。
228.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中该对照载体包含野生型CAV基因组(例如，如本文所述，例如，如表1A、1B或表17中任一个所列)。
229.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中该对照载体包含除CAV之外的病毒基因组(例如，AAV基因组或慢病毒基因组)。
230.如实施例229所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中该对照载体与该遗传元件相同，只是缺少任何CAV序列。
231.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中该遗传元件产生该外源效应物的至少100、200、300、400、500、1000、5000、10,000、50,000、100,000、1,000,000、10,000,000、50,000,000或100,000,000个拷贝/细胞。
232.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体或方法，其中该外源效应物具有与该靶细胞的对应的内源分子相同的序列，或与该靶细胞的对应的内源分子具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，并且其中该靶细胞中表达的外源效应物的水平为对应的内源分子的量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10,000倍、50,000倍或100,000倍。
233.一种制备CA载体的方法，该方法包括：
a)提供包含如前述实施例中任一项所述的遗传元件的宿主细胞，以及
b)在适合将该遗传元件包封在蛋白质性外部(例如，包含CAV VP1分子的蛋白质性外部)的条件下孵育该宿主细胞，
从而制备该CA载体。
234.如实施例233所述的方法，其中该宿主细胞将CA载体释放到上清液中(例如，其中该宿主细胞将该CA载体分泌到上清液中和/或其中该宿主细胞被裂解，例如在SDS中，例如0.5％ SDS中)。
235.如实施例233或234所述的方法，其包括从来自该宿主细胞的上清液(例如，从该宿主细胞分泌的上清液和/或从该宿主细胞的裂解获得的上清液)收获该CA载体。
236.如实施例233-235中任一项所述的方法，其包括从来自该宿主细胞的裂解物收获该CA载体。
237.如实施例235或236所述的方法，其中用核酸酶(例如，benzonase)处理该上清液或裂解物。
238.如实施例235-237中任一项所述的方法，其中过滤该上清液或裂解物(例如，通过0.45μm过滤器)。
239.如实施例235-238中任一项所述的方法，其中将该上清液或裂解物超速离心，例如通过蔗糖垫(例如，20％蔗糖垫)。
240.如实施例235-239中任一项所述的方法，其中使该上清液或裂解物通过CsCl梯度。
241.如实施例235-240中任一项所述的方法，其中该上清液或裂解物被分级和/或透析。
242.如实施例235-241中任一项所述的方法，其中该宿主细胞进一步包含一个或多个另外的核酸，其编码一个或多个另外的ORF(例如，一个或多个另外的CAV ORF，例如CAVVP1、VP2或凋亡蛋白中的一个或多个)。
243.一种宿主细胞(例如，脊椎动物细胞，例如，(i)哺乳动物细胞，例如人细胞；或(ii)鸟类细胞，例如鸡细胞)，其包含如前述实施例中任一项所述的遗传元件，或含有该遗传元件的核酸构建体。
244.如实施例243所述的宿主细胞，其进一步包含CAV VP1分子或编码该CAV VP1分子的核酸。
245.一种宿主细胞，其包含如实施例178-183中任一项所述的CA载体。
246.一种宿主细胞，其包含：
a)CAV VP1分子，或编码该CAV VP1分子的核酸；以及
b)遗传元件或包含该遗传元件的核酸构建体，其中该遗传元件包含(i)启动子元件，(ii)编码外源效应物的核酸序列，和(iii)蛋白质结合序列，例如，其中该遗传元件是如前述实施例中任一项所述的遗传元件。
247.如实施例246所述的宿主细胞，其中该蛋白质结合序列包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACC CCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCA ATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
248.如实施例184-188中任一项所述的复合物，其中所述复合物是体外的，例如，其中所述复合物处于基本上无细胞的组合物中。
249.如实施例184-188或248中任一项所述的复合物，其中所述复合物在细胞中，例如宿主细胞，例如辅助细胞，例如在细胞核中。
250.如实施例184-188、248或249中任一项所述的复合物，其中该CAV VP1分子是蛋白质性外部的一部分。
251.如实施例184-188或248-250中任一项所述的复合物，其中该遗传元件正在经历复制。
252.如实施例184-188或248-251中任一项所述的复合物，其中该复合物在CA载体中。
253.一种制备如实施例243-252中任一项所述的宿主细胞的方法，该方法包括将遗传元件引入细胞，例如，其中将该遗传元件引入该细胞包括将包含该遗传元件的核酸构建体引入该细胞。
254.如实施例253所述的方法，其进一步包括将编码VP1分子的核酸引入该细胞中。
255.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该蛋白质结合序列特异性结合CAV衣壳多肽(例如，CAV VP1分子)，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)。
256.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件能够被CAV VP1分子包装(例如，特异性包装)。
257.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中外源效应物：
(a)针对在人细胞中表达而经过密码子优化，
(b)是人多肽或核酸，
(c)结合人多肽或核酸，或
(d)在人细胞中具有活性，例如，调节(例如，增加或减少)人细胞中人基因的活性和/或水平)。
258.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该蛋白质性外部包含CAV VP1分子。
259.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该蛋白质性外部中至少60％(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％或100％)的蛋白质包含CAV VP1分子。
260.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件或核酸构建体包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如，在表1A、1B或17中任一个所述)的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2100个、2200个、2300个、2310个、2311个或2312个连续核苷酸，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
261.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件或核酸构建体包含野生型CAV基因组序列(例如，如本文所述，例如表1A、1B或17中任一个所述)的1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2310或2310-2313个连续核苷酸，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
262.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件或核酸构建体相对于例如如本文所述的野生型CAV基因组序列包含缺失(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个核苷酸缺失)。
263.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件或核酸构建体包含CAV包装信号，例如，如本文所述，例如包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGG CTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCA GACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCG CACTATC(SEQ ID NO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
264.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该效应物包含miRNA。
265.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该效应物例如miRNA靶向宿主基因，例如调节该基因的表达，例如增加或减少该基因的表达。
266.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该效应物包含miRNA，并且减少宿主基因的表达。
267.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该效应物包含长度为约20-200、30-180、40-160、50-140或60-120个核苷酸的核酸序列。
268.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中编码该效应物的核酸序列的长度为约20-200、30-180、40-160、50-140或60-120个核苷酸。
269.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中编码该效应物的序列具有至少约100个核苷酸的大小。
270.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中编码该效应物的序列的大小为约100至约5000个核苷酸。
271.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中编码该效应物的序列的大小为约100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500或1500-2000个核苷酸。
272.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件是单链的。
273.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件是环状的。
274.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件是DNA，例如单链DNA。
275.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该CA载体在体外、离体、或体内与细胞接触。
276.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该CA载体是复制缺陷型的。
277.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中将该CA载体静脉内、腹膜内、肌内或视网膜下施用给受试者。
278.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中将该CA载体配制用于静脉内、腹膜内、肌内或视网膜下施用。
279.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中将该CA载体递送至受试者(例如，哺乳动物受试者，例如，人受试者)中的细胞或组织。
280.如实施例279所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该细胞或组织选自血液、肝、脾、肺、心脏、卵巢、肌肉、脑、肾和/或视网膜。
281.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件、核酸构建体或CA载体诱导的中和性抗体响应小于等量腺相关病毒(AAV，例如，AAV2)或AAV载体的中和性抗体响应，例如，根据实例12的方法。
282.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中当肌内施用于测试受试者(例如，小鼠)时该遗传元件、核酸构建体或CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于当肌内施用于测试受试者时由等量腺相关病毒(AAV，例如，AAV2)或AAV载体诱导的50％ GMT，例如，根据实例12的方法。
283.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中当肌内施用于测试受试者(例如，小鼠)时该遗传元件、核酸构建体或CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于约320、321、322、323、324、325、330、340、350、360、370、380、390、400、450、500、550、600、610、620、630、635、636、637、638、639或640。
284.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中当肌内施用于测试受试者(例如，小鼠)时该遗传元件、核酸构建体或CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于约160、170、180、190、200、250、300、310或320。
285.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中当静脉内或腹膜内施用于测试受试者(例如，小鼠)时该遗传元件、核酸构建体或CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于或等于约20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160。
286.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中将该CA载体静脉内、腹膜内或肌内施用至有需要的受试者。
287.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该CA载体在体外组装。
288.如实施例287所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该体外组装包括将遗传元件(例如，如本文所述的CA载体遗传元件)包封在包含VP1分子的蛋白质性外部内。
289.如实施例288所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该体外组装进一步包括使该VP1分子与该遗传元件接触。
290.如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，其中该遗传元件、核酸构建体或CA载体诱导足够低的中和性抗体响应以适合于以多剂量(例如，分开施用的剂量，例如，如本文所述)施用。
291.一种将效应物或载荷(例如，内源或外源效应物)递送至细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用有效量的CA载体(例如，合成的CA载体，例如，如本文所述)，
其中该CA载体包含编码该效应物或载荷的核酸序列，并且
其中该CA载体在肌内施用于测试受试者(例如小鼠)时诱导的中和性抗体响应比等量的腺相关病毒(AAV，例如AAV2)或AAV载体肌内引入受试者时诱导的中和性抗体响应更低，例如，根据实例12的方法。
292.一种将效应物或载荷(例如，内源或外源效应物)递送至细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用有效量的CA载体(例如，合成的CA载体，例如，如本文所述)，
其中该CA载体包含编码该效应物或载荷的核酸序列，并且
其中当肌内施用于测试受试者(例如，小鼠)时该CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于当肌内引入测试受试者时由等量腺相关病毒(AAV，例如，AAV2)或AAV载体诱导的50％ GMT，例如，根据实例12的方法。
293.一种将效应物或载荷(例如，内源或外源效应物)递送至有需要的细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用有效量的CA载体(例如，合成的CA载体，例如，如本文所述)，
其中该CA载体包含编码该效应物或载荷的核酸序列，并且
其中当肌内引入测试受试者(例如，小鼠)时该CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于约320、321、322、323、324、325、330、340、350、360、370、380、390、400、450、500、550、600、610、620、630、635、636、637、638、639或640。
294.一种将效应物或载荷(例如，内源或外源效应物)递送至有需要的细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用有效量的CA载体(例如，合成的CA载体，例如，如本文所述)，
其中该CA载体包含编码该效应物或载荷的核酸序列，并且
其中当肌内引入测试受试者(例如，小鼠)时该CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于约160、170、180、190、200、250、300、310或320。
295.一种将效应物或载荷(例如，内源或外源效应物)递送至有需要的细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用有效量的CA载体(例如，合成的CA载体，例如，如本文所述)，
其中该CA载体包含编码该效应物或载荷的核酸序列，并且
其中当静脉内或腹膜内引入测试受试者(例如，小鼠)时该CA载体诱导的中和性抗体响应的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)小于或等于约20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160。
296.如实施例291-295中任一项所述的方法，其中将该CA载体静脉内、腹膜内或肌内施用给有需要的受试者。
297.如实施例291-296中任一项所述的方法，其中根据如实例12的方法确定由该施用诱导的中和性抗体水平。
298.如实施例291-296中任一项所述的方法，其中根据方法确定由该施用诱导的中和性抗体水平，该方法包括评估从施用该CA载体的受试者获得的样品(例如，血清样品)中的中和性抗体水平。
299.如实施例298所述的方法，其中该评估包括使该样品与体外测试细胞和包含编码报告基因(例如，荧光或发光报告基因，例如，纳米萤光素酶)的遗传元件的测试CA载体接触，并与在没有该样品的情况下与该测试CA载体接触的在其他方面类似的测试细胞相比测量该报告基因在该测试细胞中的水平或活性。
300.如实施例291-299中任一项所述的方法，其中该CA载体诱导足够低的中和性抗体响应以适合以多剂量(例如，分开施用的剂量，例如，如本文所述)施用。
301.一种药物组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的遗传元件、核酸构建体、CA载体、复合物、方法或宿主细胞，以及药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
302.如实施例301所述的药物组合物，其中该药物组合物的pH是约5.0-5.5、5.5-6.0、6.0-6.5、6.5-7.0、7.0-7.4、7.4-7.6或7.6-8.0。
303.如实施例301-302中任一项所述的药物组合物，其中该组合物处于25-30℃、30-35℃、35-40℃、40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃、60-65℃或65-70℃的温度。
304.如实施例301-303中任一项所述的药物组合物，其中该组合物处于1-5℃、5-10℃、10-15℃、15-20℃或20-25℃的温度。
305.如实施例301-304中任一项所述的药物组合物，其中该组合物处于约4℃的温度。
306.一种储存包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物维持在1-5℃、5-10℃、10-15℃、15-20℃或20-25℃的温度持续至少约1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或2年的时间，或约1-2周、2-3周、3-4周、1-2个月、2-3个月、3-4个月、4-5个月、5-6个月、6-7个月、7-8个月、8-9个月、9-10个月、10-11个月、11-12个月、12-18个月、18-24个月或2-3年的时间。
307.如实施例306所述的方法，其中该组合物维持在1-5℃的温度(例如，约4℃)。
308.如实施例306或307所述的方法，其中该组合物维持在该温度持续至少6个月。
309.一种冷却包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物的温度降低至约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃，或1-5℃(例如，约4℃)。
310.如实施例309所述的方法，其中在该降低步骤之前该组合物的温度是至少约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃，或10-15℃、15-20℃、20-25℃、25-30℃、30-35℃、35-37℃或37-40℃(例如，约25℃)。
311.一种加热包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物的温度升高至约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，或20-25℃或25-30℃(例如，约25℃)。
312.如实施例311所述的方法，其中在该升高步骤之前该组合物的温度小于约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃，或1-5℃或5-10℃(例如，约4℃)。
313.一种加热包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物的温度升高至约35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，或30℃-35℃或35℃-40℃(例如，约37℃)。
314.如实施例306-313中任一项所述的方法，其中该组合物是如实施例301-305中任一项所述的药物组合物。
根据说明书和附图并且根据权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其全文并入。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，而并非意在进行限制。
附图说明
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图1的一系列图显示只有用体外环化(IVC)的CAV DNA转染的细胞能够经重复传代产生增加的CAV基因组滴度，作为传代数(P0、P1、P2和P4)的函数。相比之下，p637阴性对照样品(由VP1缺失的野生型CAV组成)和质粒CAV样品显示经重复传代降低的滴度。传代P1和P2通过蛋白质印迹分析，仅显示CAV VP2和VP3(又名凋亡蛋白)在IVC CAV样品中的表达。进行了传代P3但未进行分析。
图2的一系列图显示了在暴露于传代P2裂解物的细胞中发现的构建体的总DNA拷贝，这些裂解物来自接受IVC CAV DNA的细胞相比于接受阴性对照质粒p637的细胞。该图显示qPCR结果证实，当衍生自被IVC CAV DNA转染的细胞时，与P2裂解物(输入)相比，P3材料(输出)增加了CAV DNA拷贝，但被阴性对照质粒p637转染情况下没有增加。
图3的图显示来自传代P3的裂解物的qPCR分析。使用CsCl对来自P3细胞的裂解物进行等密度离心，并通过qPCR分析所得级分。在1.32g/mL的峰密度下检测到CAV DNA。
图4的图显示感染后不同时间的CAV拷贝数。通过等密度离心分离后，纯化的CAV(标记为IVC)或模拟感染的细胞裂解物(Neg)被透析，如图所示用培养基稀释并添加至新鲜的MDCC-MSB1细胞。每天取样，并通过qPCR定量CAV拷贝数。
图5的一系列电子显微照片显示从合成的基因组DNA中拯救的CAV颗粒。比例尺表示每个图像的放大倍数。箭头表示左侧图像中可见的一些CAV颗粒。经测量，颗粒的直径约为24nm。
图6A的图显示示例性CAV串联构建体的示意图。pRTx-966包括(i)重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子、ORF和发夹。pRTx-1113包括(i)截短的重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子、ORF和发夹。pRTx-1114包括(i)进一步截短的重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子、ORF和发夹。pRTx-1115包括(i)启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子、ORF和发夹。pRTx-1116包括(i)ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子、ORF和发夹。pRTx-1117包括(i)截短的ORF区，其仅包含该区的3'片段，和发夹，以及(ii)重复序列、启动子、ORF和发夹。pRTx-1118包括(i)重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子和ORF。pRTx-1119包括(i)重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列、启动子和截短的ORF区，其仅包含该区的5'片段。pRTx-1120包括(i)重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)重复序列。pRTx-1118包括(i)重复序列、启动子、ORF和发夹，以及(ii)截短的重复序列区。
图6B的图显示对用图6A所示的CAV串联构建体转染的细胞悬浮液进行的CAVqPCR。在P0第2天、P0第3天和P1第2天收集200ul细胞悬浮液。提取病毒DNA，并通过qPCR对CAV基因组进行定量。
图6C的图显示了来自用图6A所示的CAV串联构建体转染的细胞的样品的DNA印迹。在P1第2天收集样品。从10ml培养物裂解细胞沉淀。提取DNA并用切割主链(B)或非复制质粒(D，DpnI)的酶消化。
图7的图显示CAV与人细胞系结合。y轴表示针对MDCC细胞对照归一化的CAV病毒基因组(vg)。每个圆圈代表生物学重复。误差条代表标准偏差。如所示，在人细胞系中，CAV与Raji细胞的结合最为强烈，其次是EKVX细胞、MRC5细胞和MCF7细胞。
图8A-8B的一系列图显示CAV的基因组组织和一组示例性CA载体。(A)按比例绘制的WT CAV基因组的线性化表示，包括5'UTR、VP2开放阅读框、凋亡蛋白开放阅读框、VP1开放阅读框和3'UTR。CAV基因组长度为2.3kb。(B)生成和测试的各种CA载体构建体的线性化表示。对于每个CA载体，将纳米萤光素酶(nLuc)报告盒插入CAV基因组，替换与报告盒长度相等的基因组片段，如所示。纳米萤光素酶报告基因包含SV40启动子、纳米萤光素酶ORF和SV40终止子序列。此图中所示的示例性CA载体的序列列于表2-9中。
图9A-9C的一系列图显示用CA载体上清液转导MDCC细胞。(A)转导测定的示意图。简而言之，将1e5个细胞与CA载体上清液一起孵育30分钟，然后进行三次洗涤和第0天发光测量。24小时后，再次洗涤细胞三次，获得第1天的发光测量值。再过24小时后，再次洗涤细胞三次，获得第2天的发光测量值。(B)使用CA载体+pRTX-637的阴性对照转导。如图所示，在第0天、第1天或第2天的阴性对照样品中均未检测到发光。(C)在与pRTX-966(全串联CAV构建体)共转染的细胞中产生的CA载体转导。使用具有多重比较的双向ANOVA计算显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001)。nLuc4、nLuc5和nLuc7 CA载体在第2天显示发光显著增加。从第1天开始，nLuc6 CA载体显示发光显著增加。
图10A-10B的一系列图显示了从上清液纯化CA载体及其在归一化的转导测定中的分析。(A)纯化的CA载体颗粒上的DNA酶保护测定。用或不用DNA酶处理纯化的颗粒，然后使用nluc探针通过qPCR对基因组进行定量。(B)归一化的CA载体基因组的转导测定。CA载体nLuc4、nLuc5、nLuc6和nLuc7在第2天显示出增加的纳米萤光素酶发光。
图11A-11B是显示CA载体对人细胞的转导的一系列图。(A)MOI为3时Jurkat细胞的CA载体转导。(B)MOI为3时Raji细胞的CA载体转导。使用具有多重比较的双向ANOVA计算显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001)。
图12的表显示产生携带nLuc转基因的CA载体、野生型CAV(阴性对照)或AAV2(阳性对照)的细胞的滴度、内毒素水平和BCA水平。
图13A-13C的一系列图显示CA载体被VP1中和性抗体中和。(A)WT CAV中和测定。(B)鸡血清中的中和性抗体特异性识别VP1。(C)用鸡血清而非IVIG中和CA载体。
图14的图显示含有完整WT CAV基因组(pCAV)的质粒与使用其中缺失VP1的CAV基因组的样品相比拯救Nluc6 CA载体的产生。添加VP1中和性抗体阻止了这种拯救。
图15A-15C的一系列图显示了示例性串联构建体的质粒图谱，每个构建体包含串联排列的CAV和/或CA载体遗传元件区。每个构建体包括氨苄青霉素抗性盒和复制起点。图15A显示pCAV-nLuc6_CAV的质粒图谱，其序列以注释形式列于表14中。该构建体包括CA载体遗传元件序列，该序列按从5'到3'的顺序包含CAV重复序列、非活性CAV VP编码序列、SV40p_nLuc插入序列和CAV发夹序列。CA载体遗传元件序列相对于野生型CAV遗传元件序列位于5'，按顺序从5'到3'，包括CAV重复序列、CAV VP编码序列和CAV发夹序列。图15B显示pCAV-nLuc6_CAVΔ3NCR的质粒图谱，其序列以注释形式列于表15中。该构建体包括相同的nLuc6 CA载体遗传元件序列，其相对于仅包含CAV重复序列和CAV VP编码序列的截短的野生型CAV遗传元件序列位于5’。图15C显示了pCAV-nLuc6_CAVΔPromΔORFsΔ3NCR的质粒图谱(其后半部分被图示为“CAVΔΔΔ”)，其序列以注释形式列于表16中。该构建体包括相同的nLuc6 CA载体遗传元件序列，其相对于仅包含CAV重复序列的截短的野生型CAV遗传元件序列位于5’端。
图16A-16D的一系列图表显示在施用野生型CAV、编码纳米萤光素酶的CA载体或编码纳米萤光素酶的AAV2的小鼠的指定组织中检测到的nLuc拷贝或野生型CAV基因组拷贝的水平。
如图所示，图17A-17C的一系列图显示CA载体或AAV2的体外中和测定结果。图17A显示肌内施用nLucCA载体、野生型CAV或AAV2-nLuc的小鼠中CA载体的中和，或鸡血清对CA载体的中和。图17B显示肌内施用nLucCA载体、野生型CAV或AAV2-nLuc的小鼠中AAV2的中和，或鸡血清对CA载体的中和。图17C显示了接受指定载体的小鼠中CAV(中间栏)或AAV2(右栏)的50％ GMT(代表几何平均中和倒数滴度)。
图18的一系列图显示CAV VP1蛋白在体外组装成病毒样颗粒(VLP)结构。
图19A-19D的一系列图显示CA载体具有CAV样密度并且被免疫血清而不是人血清样品中和。(A)CAV野生型和载体颗粒在氯化铯线性梯度中超速离心后的密度以及CAV和纳米萤光素酶(Nluc)扩增子的抗DNA酶qPCR。(B)透析后，在将载体添加到细胞后几分钟内(第0天)或48小时后(第2天)，针对MDCC-MSB1细胞的转导来测定组A中显示的梯度级分。(-)表示阴性对照。(C)很容易观察到鸡免疫血清对CA载体的中和，而除了一个样品(供体38)中的微弱信号外，没有检测到人IVIG和单独人血清样品的中和作用。(D)AAV2-nluc被IVIG和10个单独人血清样品中的3个中和，但不被鸡血清中和。
图20的一系列图表显示在肌肉注射后3周通过qPCR检测小鼠组织中的CA载体转基因nLuc。注射后3周通过qPCR检测小鼠组织中的CA载体转基因nLuc。每个符号代表一个小鼠。水平线是每个值的几何平均值，误差条表示几何标准差。通过各种途径(SR、IV、IP、IM)向小鼠施用指定的样品，并在3周后收集它们的组织。
图21A-21C的一系列图显示CA载体进入细胞是动力蛋白和pH依赖性过程。(A)常见病毒进入途径的图示，指示了在不同步骤起作用的抑制剂。(B)MDCC-MSB1细胞在感染前用指定浓度的抑制剂或DMSO对照进行预处理。然后在存在抑制剂的情况下转导细胞，并在20小时后读取发光。(C)为了比较，使用用抑制剂或DMSO对照预处理的Expi293细胞类似地研究了AAV2-nluc进入的抑制。每个符号代表两个生物学重复之一。PM：质膜。
图22A-22B的图显示CA载体在高达65℃时和在4℃储存时保持转导效力。(A)CA载体nLuc6在指定温度孵育15分钟，并在向MDCC-MSB1细胞添加经热处理的病毒后36小时通过发光测定法测量残余转导效力。每个符号代表一个样品。中和样品(NAb)被包括作为阴性对照，以及无载体对照(-)。(B)通过等密度CsCl离心和透析纯化的CA载体悬浮液在4℃在缓冲盐水中储存6个月，并测定转导活性。0、3和6个月时的转导测定在指定的MOI按时间顺序显示，包括未感染的阴性对照。
图23A-23C的一系列图显示使用串联质粒时CA载体的回收。图23A的图描绘串联质粒。图23B的图描绘在DNA酶处理后载体基因组的定量。图23C的图显示表明载体颗粒能够转导的发光的增加。
当结合附图阅读时，将会更好地理解以下对本发明实施例的详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了现在举例说明的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于附图中所示实施例的精确布置及手段。
具体实施方式
定义
本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但本发明并不限于此，而是仅由权利要求书来限定。除非另有说明，否则通常应以其通常意义来理解下文中所阐述的术语。
在本说明书和权利要求书中使用术语“包含”时，它并不排除其他要素。出于本发明的目的，术语“由......组成”被认为是术语“包含......”的优选实施例。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施例，则这应理解为优选地还披露了仅由这些实施例组成的组。
当提及单数名词时，如果使用了不定冠词或定冠词，例如“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”或“该(the)”，这包括该名词的复数，除非另有明确说明。
词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指定的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”另外作为实施例披露了这样的化合物、组合物、产物等用于治疗、调节等。
词语“用于......的化合物、组合物、产物等”、“化合物、组合物、产物等在生产用于......的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等中的用途”或“用作药物......的化合物、组合物、产物等”表示这些化合物、组合物、产物等将用于可在人体或动物体上实施的治疗方法中。它们被认为是关于治疗方法等的实施例和权利要求的等同披露。因此，如果实施例或权利要求是指“用于治疗疑似患有某种疾病的人或动物的化合物”，则这也被认为是披露了“化合物在生产用于治疗疑似患有某种疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有某种疾病的人或动物施用化合物的治疗方法”。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指定的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。
如果在下文的括号中提供了术语、值、数量等的实例，则这应理解为表示在括号中提及的实例可以构成实施例。在一些情况下，如果指出“在实施例中，核酸分子包含与表1A的CAV VP1编码核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列”，则一些实施例涉及包含与表1A的VP1编码核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列的核酸分子。
如本文所用的术语“扩增”，指的是核酸分子或其部分的复制，以产生一个或多个另外拷贝的该核酸分子或其部分(例如，遗传元件或遗传元件区)。在一些实施例中，扩增导致核酸序列的部分复制。在一些实施例中，扩增经由滚环式复制进行。
如本文所用，术语“CA载体”是指一种媒剂，其包含包封在蛋白质性外部中的遗传元件，例如，环状DNA，例如，该遗传元件基本上被蛋白质性外部保护而免于被DNA酶I消化，并且该遗传元件和该蛋白质性外部中的一者或两者包含CAV组分(例如，野生型CAV序列的片段或同系物，例如，如本文所述)。如本文所用的“合成的CA载体”通常指的是非天然存在的CA载体，例如，其具有与野生型病毒(例如，如本文所述的野生型CAV)不同的序列。在一些实施例中，合成的CA载体是工程化的或重组的，例如，其包含遗传元件，该遗传元件包含相对于野生型病毒基因组(例如，如本文所述的野生型CAV基因组)的差异或修饰。在一些实施例中，包封在蛋白质性外部内涵盖100％的蛋白质性外部覆盖率，以及小于100％的覆盖，例如95％、90％、85％、80％、70％、60％、50％或更少。例如，蛋白质性外部可能存在缺口或间断(例如，这使得蛋白质性外部对水、离子、肽或小分子具有可渗透性)，只要遗传元件保留在蛋白质性外部中或免受DNA酶I的酶切，例如，在进入宿主细胞之前。在一些实施例中，将CA载体纯化，例如，将其从其原始来源中分离和/或基本上不含(>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)其他组分。在一些实施例中，CA载体能够将遗传元件引入靶细胞中(例如，经由感染)。在一些实施例中，CA载体是感染性的合成的CAV病毒颗粒。如本文所用，“CAV组分”通常是指多肽或核酸分子，其分别包含由CAV基因组编码或包含的多肽或核酸分子的活性，和/或分别包含与CAV基因组，例如，野生型CAV基因组(例如，如本文所述，例如，如表1A、1B或17中所列)编码的多肽或包含在CAV基因组中的核酸元件具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，或其功能片段。
如本文所用的，术语“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”涵盖全长抗体和抗体片段(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，该抗体分子包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，而该多个中第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体分子的特征通常在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
如本文所用的，“下游复制促进序列”(dRFS)指的是(例如，如本文所述的)遗传元件序列的片段，当其位于遗传元件序列的下游时(例如，相对于dRFS，遗传元件位于5’)，与不存在dRFS但在其他方面类似的遗传元件序列相比，增加遗传元件序列的复制。一般而言，由此产生的复制链是功能性遗传元件，其可以包封在蛋白质性外部中，以形成CA载体(例如，如本文所述)。在一些实施例中，dRFS包含Rep蛋白(例如，CAV Rep蛋白)的移位位点。在一些实施例中，dRFS包含CAV 3’UTR序列或其片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，dRFS包含5’UTR(例如，包含发夹环)。在一些实施例中，dRFS包含复制起点。
如本文所用的，“上游复制促进序列”(uRFS)指的是(例如，如本文所述的)遗传元件序列的片段，当其位于遗传元件序列的上游时(例如，相对于uRFS，遗传元件位于3’)，与不存在uRFS但在其他方面类似的遗传元件序列相比，增加遗传元件序列的复制。一般而言，由此产生的复制链是功能性遗传元件，其可以包封在蛋白质性外部中，以形成CA载体(例如，如本文所述)。在一些实施例中，uRFS包含Rep蛋白(例如，CAV Rep蛋白)的结合和/或识别位点。在一些实施例中，uRFS包含CAV 5’UTR序列或其片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，uRFS包含5’UTR(例如，包含发夹环)。在一些实施例中，uRFS包含复制起点。
如本文所用的，“编码......”的核酸是指编码氨基酸序列或功能性多核苷酸(例如，非编码RNA，例如siRNA或miRNA)的核酸序列。
如本文所用的“外源”作用剂(例如，效应物、核酸(例如，RNA)、基因、有效载荷、蛋白质)是指不由相应的野生型病毒(例如如本文所述的野生型CAV)包含或编码的作用剂。在一些实施例中，外源作用剂不是天然存在的，例如具有相对于天然存在的蛋白质或核酸而言发生改变(例如，通过插入、缺失或置换)的序列的蛋白质或核酸。在一些实施例中，外源作用剂并非天然存在于宿主细胞中。在一些实施例中，外源作用剂天然存在于宿主细胞中，但对病毒而言是外源的。在一些实施例中，外源作用剂天然存在于宿主细胞中，但是不以期望的水平或在期望的时间存在。在一些实施例中，外源作用剂并非天然存在于靶细胞中。在一些实施例中，外源作用剂天然存在于靶细胞中，但对病毒而言是外源的。在一些实施例中，外源作用剂天然存在于靶细胞中，但是不以期望的水平或在期望的时间存在。在实施例中，将外源药剂引入靶细胞导致靶细胞中药剂的非天然水平(例如，高于细胞中药剂的内源水平的水平)。
如本文中针对另一种作用剂或元件(例如，效应物、核酸序列、氨基酸序列)所用的“异源”作用剂或元件(例如，效应物、核酸序列、氨基酸序列)，指的是并非天然存在于一起的作用剂或元件，例如，在野生型病毒，如CAV中。在一些实施例中，异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(例如，天然存在于CAV中的序列)存在于同一核酸中。在一些实施例中，相对于CA载体的其他(例如，其余的)元件所基于的CAV而言，异源作用剂或元件是外源的。
如本文所用的，术语“遗传元件”指的是核酸分子，其包封在或可以包封在蛋白质性外部内(例如，蛋白质性外部保护其免受DNA酶I的酶切)，例如，以形成如本文所述的CA载体。应当理解的是，遗传元件可以作为裸DNA产生，并且任选地进一步组装到蛋白质性外部中。还应理解的是，CA载体可将其遗传元件插入细胞中，其结果是遗传元件存在于细胞中，而蛋白质性外部不一定进入细胞。在一些实施例中，遗传元件包含编码效应物(例如，外源效应物)的核酸序列。在一些实施例中，遗传元件是单链的。在一些实施例中，遗传元件是环状的。在一些实施例中，遗传元件包含CAV的一个或多个序列(例如，如本文所述)，例如，来自如本文所述的CAV的包装信号。
如本文所用的，“遗传元件构建体”指的是包含至少一个(例如，两个)遗传元件序列或其片段的核酸构建体(例如，质粒、杆粒、粘粒或微环)。在一些实施例中，如本文所述的串联构建体是包含串联排列的两个或更多个遗传元件序列或其片段的遗传元件构建体(例如，如本文所述)。在一些实施例中，遗传元件构建体包含至少一个全长遗传元件序列。在一些实施例中，遗传元件包括全长遗传元件序列和部分遗传元件序列。在一些实施例中，遗传元件包含两个或更多个部分遗传元件序列(例如，按照5’至3’的顺序，5’-截短型遗传元件序列与3’-截短型遗传元件序列串联排列)。
如本文所用的术语“遗传元件区”指的是包含遗传元件序列的构建体区。在一些实施例中，遗传元件区包含与野生型CAV序列或其片段具有足够同一性的序列，由蛋白质性外部包封，从而形成CA载体(例如，与野生型CAV序列或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列)。在实施例中，遗传元件区包含蛋白结合序列，例如，如本文所述的(例如，如本文所述的5’UTR、3’UTR和/或GC富集区，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列)。在一些实施例中，遗传元件区可以进行滚环式复制。在一些实施例中，遗传元件区包含uRFS。在一些实施例中，遗传元件区包含dRFS。在一些实施例中，遗传元件包含Rep蛋白结合位点。在一些实施例中，遗传元件包含Rep蛋白移位位点。在一些实施例中，包含遗传元件区的构建体没有包封在蛋白质性外部中，但是由构建体产生的遗传元件可以包封在蛋白质性外部中。在一些实施例中，包含遗传元件区的构建体进一步包含第二uRFS或第二dRFS。在一些实施例中，包含遗传元件区的构建体进一步包含载体主链。
如本文所用，关于VP1-、VP2-或凋亡蛋白编码基因或其片段，“非功能性”是指不产生蛋白质的基因或其片段，或产生与其野生型对应物相比缺乏至少一种活性(例如，所有活性)的蛋白质的基因或其片段。在一些实施例中，非功能性基因包含提前终止密码子。在一些实施例中，非功能性基因包含移码突变。在一些实施例中，非功能性基因缺少起始密码子。在一些实施例中，活性是结合活性或酶促活性。
如本文所用，全长蛋白质或多肽的“功能片段”是指具有全长蛋白质或多肽的一种或多种活性(例如，所有活性)并且相对于全长蛋白质或多肽缺乏至少一个氨基酸(例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、125个、150个、175个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个氨基酸)的多肽。在一些实施例中，活性是结合活性或酶促活性。如本文所用，结合蛋白质的全长核酸序列的“功能片段”是指结合至少一个被全长核酸序列结合的蛋白质的核酸序列。在一些实施例中，全长核酸序列包含5’UTR序列，例如，如本文所述。
如本文所用，术语“启动子元件”是指包含具有启动子功能的序列的调节性核酸序列。在一些实施例中，启动子元件包含如本文所述的启动子。在一些实施例中，启动子元件结合和/或募集RNA聚合酶分子，例如使得RNA聚合酶可以从启动子元件下游的核酸序列转录RNA分子。在一些实施例中，启动子元件包含组成型启动子、细胞特异性启动子或组织特异性启动子，例如，如本文所述。在一些实施例中，启动子元件包含诱导型启动子，例如，如本文所述。
如本文所用，术语“VP1分子”是指具有CAV VP1蛋白(例如，如本文所述的CAV VP1蛋白)的活性和/或结构特征的多肽，或其功能片段。在一些情况下，VP1分子可以包含以下中一种或多种(例如，1、2、3或4种)：第一区，其包含。在一些情况下，VP1分子按照从N末端到C末端的顺序包含该第一、第二、第三和第四区。在一些情况下，VP1分子可以包含由CAV VP1核酸编码的多肽。在一些情况下，VP1分子可以进一步包含异源序列，例如来自CAV VP1蛋白(例如如本文所述)的异源序列。在一些实施例中，VP1分子由CAV基因组(例如，野生型CAV基因组，例如，如本文所述)编码。在一些实施例中，VP1分子是由CAV VP1核酸(例如，VP1基因，例如，如本文所述)编码的多肽。在一些实施例中，VP1分子是剪接变体或包含翻译后修饰。
如本文所用，术语“VP2分子”是指具有CAV VP2蛋白(例如，如本文所述的CAV VP2蛋白)的活性和/或结构特征的多肽，或其功能片段。在一些实施例中，VP2分子由CAV基因组编码(例如，野生型CAV基因组，例如，如本文所述)。在一些实施例中，VP2分子是由CAV VP2核酸(例如，VP2基因，例如，如本文所述)编码的多肽。在一些实施例中，VP2分子是剪接变体或包含翻译后修饰。
如本文所用，术语“凋亡蛋白分子”是指具有CAV凋亡蛋白(例如，如本文所述的CAV凋亡蛋白)的活性和/或结构特征的多肽，或其功能片段。在一些实施例中，凋亡蛋白分子由CAV基因组(例如，野生型CAV基因组，例如，如本文所述)编码。在一些实施例中，凋亡蛋白分子是由CAV凋亡蛋白核酸(例如，凋亡蛋白基因)编码的多肽。在一些实施例中，凋亡蛋白分子是剪接变体或包含翻译后修饰。
如本文所用，术语“CAV衣壳多肽”是指存在于野生型CAV衣壳中的多肽，或具有所述多肽的活性和/或结构特征的多肽。在一些实施例中，CAV衣壳多肽是VP1分子。
如本文所用，术语“VP1核酸”是指编码VP1分子或其反向互补序列的核酸。核酸可以是单链或双链的。在一些实施例中，VP1核酸包含CAV VP1基因，例如，如本文所述。“VP1基因”通常是指编码野生型VP1分子或其反向互补序列的核酸序列。在一些实施例中，VP1基因包含有义链。在一些实施例中，VP1基因包含反义链。在一些实施例中，VP1基因是双链的。
如本文所用，术语“VP2核酸”是指编码VP2分子或其反向互补序列的核酸。核酸可以是单链或双链的。在一些实施例中，VP2核酸包含CAV VP2基因，例如，如本文所述。“VP2基因”通常是指编码野生型VP2分子或其反向互补序列的核酸序列。在一些实施例中，VP2基因包含有义链。在一些实施例中，VP2基因包含反义链。在一些实施例中，VP2基因是双链的。
如本文所用，术语“凋亡蛋白核酸”是指编码凋亡蛋白分子或其反向互补序列的核酸。核酸可以是单链或双链的。在一些实施例中，凋亡蛋白核酸包含CAV凋亡蛋白基因，例如，如本文所述。“凋亡蛋白基因”通常是指编码野生型凋亡蛋白分子或其反向互补序列的核酸序列。在一些实施例中，凋亡蛋白基因包含有义链。在一些实施例中，凋亡蛋白基因包含反义链。在一些实施例中，凋亡蛋白基因是双链的。
如本文所用，术语“CAV基因组序列”是指包含来自野生型CAV的全长基因组序列(例如，如本文所述)的核酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，CAV基因组包含如本文所述的CAV基因组序列(例如，野生型CAV基因组序列，例如，如表1A和1B或表17中的任一个所列)。
如本文所用，术语“CAV UTR”是指包含来自CAV(例如，野生型CAV，例如，如本文所述，例如，如表1A、1B或17中所列)的非翻译区(UTR)序列(例如，5'UTR或3'UTR的序列)或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的核酸序列。
如本文所用的，术语“蛋白质性外部”是指主要(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)是蛋白质的外壳组分。在一些实施例中，蛋白质性外部包封核酸分子，例如，如本文所述的遗传元件。在一些实施例中，蛋白质性外部包含衣壳。在一些实施例中，蛋白质性外部形成病毒颗粒的衣壳或其一部分。
如本文所用，术语“蛋白质结合序列”是指能够结合(例如，特异性结合)蛋白质的核酸序列，例如蛋白质性外部的组分，例如，如本文所述。在一些实施例中，蛋白质结合序列以足够的亲和力结合蛋白质性外部的组分以促进包含蛋白质结合序列的遗传元件包封在蛋白质性外部内。在一些实施例中，蛋白质结合序列直接结合蛋白质性外部蛋白质。在一些实施例中，蛋白质结合序列间接结合蛋白质性外部蛋白质(例如，蛋白质结合序列结合与蛋白质性外部蛋白质相关联的蛋白质、核酸分子或其他部分)。
如本文所用的，术语“调节性核酸”是指修饰编码表达产物的DNA序列的表达，例如转录和/或翻译的核酸序列。在实施例中，表达产物包括RNA或蛋白质。
如本文所用的，术语“调节性序列”是指修饰靶基因产物的转录的核酸序列。在一些实施例中，调节性序列是启动子或增强子。
如本文所用的，术语“Rep”或“复制蛋白”指的是促进病毒基因组复制的蛋白质，例如，病毒蛋白。在一些实施例中，复制蛋白是CAV Rep蛋白。
如本文所用的，术语“Rep结合位点”指的是核酸分子内的核酸序列，其由Rep蛋白(例如，CAV Rep蛋白)识别和结合。在一些实施例中，Rep结合位点包含5’UTR(例如，包含发夹环)。在一些实施例中，Rep结合位点包含复制起点(ORI)。
如本文所用的，术语“Rep移位位点”指的是核酸分子内的核酸序列，其能够引起与该核酸分子相关的(例如，结合的)Rep蛋白(例如，CAV Rep蛋白)在到达Rep移位位点时释放该核酸分子。在一些实施例中，Rep移位位点包含5’UTR(例如，包含发夹环)。在一些实施例中，Rep移位位点包含复制起点(ORI)。
如本文所用，术语“特异性结合”是指第一分子(例如，衣壳蛋白，例如，VP1蛋白)与第二分子(例如，包含蛋白质结合序列(例如，包装信号)的核酸)的结合比与非特异性对照分子(例如，缺乏蛋白质结合序列的核酸)的结合更强。在一些实施例中，第一分子显示出可检测水平的与非特异性对照分子的结合。在一些实施例中，第一分子对第二分子的KD比第一分子对非特异性对照分子的KD低5、10、20、50或100倍。
如本文所用的，“基本上非致病性”生物体、颗粒或组分是指不会导致或诱发不可接受的疾病或致病性状况的生物体、颗粒(例如，病毒或CA载体，例如，如本文所述)或其组分，例如，在宿主生物体，例如哺乳动物，如人中。在一些实施例中，向受试者施用CA载体可导致轻微的反应或副作用，作为标准治疗的一部分，这些反应或副反应是可以接受的。
如本文所用的，术语“非致病性”是指不会导致或诱发不可接受的疾病或致病性状况的生物体或其组分，例如，在宿主生物体，例如，哺乳动物，如人中。
如本文所用的，“基本上非整合的”遗传元件是指遗传元件，例如，病毒或CA载体中的遗传元件，例如，如本文所述的，其中进入宿主细胞(例如，真核细胞)或生物体(例如，哺乳动物，如人)的遗传元件中低于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％整合到基因组中。在一些实施例中，无法检测到遗传元件整合到基因组中，例如，宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，可以使用如本文所述的技术，例如，核酸测序、PCR检测和/或核酸杂交，来检测遗传元件整合到基因组中。在一些实施例中，整合频率是通过对从游离载体中分离出来的基因组DNA进行定量凝胶纯化测定来确定的，例如，如Wang等人中所述(2004,Gene Therapy[基因治疗],11:711-721,其通过引用以其全文并入本文)。
如本文所用的“子序列”是指分别包含在较大核酸序列或氨基酸序列中的核酸序列或氨基酸序列。在一些情况下，子序列可以包含较大序列的结构域或功能片段。在一些情况下，子序列可以包含较大序列的片段，当从较大序列中分离出来时，该片段能够形成二级和/或三级结构，类似于当与较大序列的其余部分一起存在时由该子序列形成的二级和/或三级结构。在一些情况下，子序列可以替换为另一序列(例如，包含外源序列或对较大序列的其余部分而言异源的序列的子序列，例如，来自不同CAV的相应子序列)。
本发明总体上涉及CA载体，例如合成的CA载体，及其用途。本披露提供CA载体、包含CA载体的组合物以及制备或使用CA载体的方法。CA载体通常用作递送媒剂，例如，用于将治疗剂递送至真核细胞。一般而言，CA载体将包括遗传元件，该遗传元件包含包封在蛋白质性外部内的核酸序列(例如，编码效应物，例如，外源效应物或内源效应物)。相对于CAV序列(例如，如本文所述)，CA载体可包括序列(例如，如本文所述的区或结构域)的一个或多个缺失。CA载体可以用作媒剂，用于将遗传元件或其中编码的效应物(例如，多肽或核酸效应物，例如，如本文所述)递送到真核细胞中，例如，用以治疗包含这些细胞的受试者中的疾病或障碍。
目录
I.用于制备CA载体的组合物和方法
A.CA载体的组分和组装
i.用于组装CA载体的VP1分子
ii.用于组装CA载体的VP2分子
B.遗传元件构建体
i.质粒
ii.环状遗传元件构建体
iii.体外环化
iv.顺式/反式构建体
v.表达盒
vi.遗传元件构建体的设计和产生
C.效应物
D.宿主细胞
i.将遗传元件引入宿主细胞中
ii.用于以顺式或反式提供一个或多个CAV蛋白的方法
iii.辅助物
iv.示例性细胞类型
E.培养条件
F.收获和纯化
II.CA载体
A.CAV
B.VP1分子
C.VP2分子
D.遗传元件
E.蛋白结合序列
F.5'UTR区
G.GC富集区
H.效应物
I.调节性序列
J.复制蛋白
K.其他序列
L.蛋白质性外部
III.遗传元件构建体
IV.组合物
V.宿主细胞
VI.使用方法
VII.施用/递送
I.用于制备CA载体的组合物和方法
在一些方面，本披露内容提供了可用于产生CA载体(例如，如本文所述)的遗传元件构建体。
CA载体的组分和组装
本文的组合物和方法可用于产生CA载体。如本文所述的，CA载体通常包含包封在蛋白质性外部(例如，包含由CAV VP1核酸编码的多肽，例如，如本文所述)内的遗传元件(例如，单链环状DNA分子，例如，包含如本文所述的5’UTR区)。在一些实施例中，遗传元件包含一个或多个编码CAV ORF(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白中的一个或多个)的序列。如本文所用，CAV ORF或ORF分子(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白)包括多肽，该多肽包含与例如本文所述的相应CAV ORF序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在实施例中，遗传元件包含编码CAV VP1或者其剪接变体或功能片段(例如，胶冻卷区，例如，如本文所述)的序列。在一些实施例中，蛋白质性外部包含由CAV VP1核酸编码的多肽(例如，CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段)。
在一些实施例中，通过将遗传元件(例如，如本文所述)包封在蛋白质性外部(例如，如本文所述)内来组装CA载体。在一些实施例中，将遗传元件包封在宿主细胞(例如，如本文所述)的蛋白质性外部内。在一些实施例中，宿主细胞表达蛋白质性外部中包含的一种或多种多肽(例如，由CAV VP1核酸编码的多肽，如VP1分子)。例如，在一些实施例中，宿主细胞包含编码CAV VP1分子，例如，CAV VP1多肽(例如，野生型CAV VP1蛋白或由野生型CAVVP1核酸编码的多肽，例如，如本文所述)的剪接变体或功能片段的核酸序列。在实施例中，编码CAV VP1分子的核酸序列包含在宿主细胞中包含的遗传元件构建体(例如，质粒、病毒载体、病毒、小环、杆粒或人工染色体)中。在实施例中，编码CAV VP1分子的核酸序列被整合到宿主细胞的基因组中。
在一些实施例中，宿主细胞包含遗传元件和/或包含遗传元件序列的遗传元件构建体。在一些实施例中，遗传元件构建体选自质粒、病毒核酸、微环、杆粒或人工染色体。在一些实施例中，将遗传元件从遗传元件构建体上切离，并且任选地，从双链形式转化为单链形式(例如，通过变性)。在一些实施例中，遗传元件是通过聚合酶根据遗传元件构建体中的模板序列生成的。在一些实施例中，聚合酶产生遗传元件序列的单链拷贝，其可以任选地进行环化以形成如本文所述的遗传元件。在其他实施例中，遗传元件构建体是通过在体外将遗传元件的核酸序列环化而产生的双链微环。在实施例中，将体外环化的(IVC)微环引入宿主细胞中，在那里它转化成适于包封在蛋白质性外部中的单链遗传元件，如本文所述。
VP1分子，例如用于组装CA载体的VP1分子
例如，可以通过将遗传元件包封在蛋白质性外部内来制备CA载体。CA载体的蛋白质性外部通常包含由CAV VP1核酸编码的多肽(例如，CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段，例如，如本文所述)。在实施例中，蛋白质性外部包含CAV VP1精氨酸富集区和/或胶冻卷区中的一个或两个。在一些实施例中，蛋白质性外部包含CAV VP1胶冻卷区(例如，如本文所述)。在一些实施例中，蛋白质性外部包含CAV VP1精氨酸富集区(例如，如本文所述)。
在一些实施例中，CA载体包含VP1分子和/或编码VP1分子的核酸。一般而言，VP1分子包括具有CAV VP1蛋白(例如，如本文所述的CAV VP1蛋白)的结构特征和/或活性的多肽或其功能片段。在一些实施例中，VP1分子包含相对于CAV VP1蛋白(例如，如本文所述的CAVVP1蛋白)的截短。在一些实施例中，VP1分子是截短了至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700个氨基酸的CAV VP1蛋白。在一些实施例中，VP1分子包含与CAV VP1蛋白(例如，如本文所述)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。VP1分子通常可以结合核酸分子，例如DNA(例如，遗传元件，例如，如本文所述)，例如在其中的蛋白质结合序列处结合。
不希望受到理论的束缚，VP1分子可能能够与其他VP1分子结合，例如，以形成蛋白质性外部(例如，如本文所述)。可以将这样的VP1分子描述为具有形成衣壳的能力。在一些实施例中，蛋白质性外部可以包封核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件，例如，使用如本文所述的串联构建体产生的遗传元件)。在一些实施例中，多个VP1分子可形成多聚体，例如，以产生蛋白质性外部。在一些实施例中，多聚体可以是同型多聚体。在其他实施例中，多聚体可以是异型多聚体。
其他CAV多肽，例如用于组装CA载体的其他CAV多肽
在一些实施例中，使用本文所述的组合物或方法产生CA载体可能涉及表达CAVVP2分子(例如，如本文所述)或者其剪接变体或功能片段。在一些实施例中，CA载体包含VP2分子或者其剪接变体或功能片段，和/或编码VP2分子或者其剪接变体或功能片段的核酸。在一些实施例中，CA载体不包含VP2分子或者其剪接变体或功能片段，和/或编码VP2分子或者其剪接变体或功能片段的核酸。在一些实施例中，产生CA载体包括VP2分子或者其剪接变体或功能片段的表达，但是该VP2分子未并入CA载体中。
在一些实施例中，使用本文所述的组合物或方法产生CA载体可能涉及表达CAV凋亡蛋白分子(例如，如本文所述)或者其剪接变体或功能片段。在一些实施例中，CA载体包含凋亡蛋白分子或者其剪接变体或功能片段，和/或编码凋亡蛋白分子或者其剪接变体或功能片段的核酸。在一些实施例中，CA载体不包含凋亡蛋白分子或者其剪接变体或功能片段，和/或编码凋亡蛋白分子或者其剪接变体或功能片段的核酸。在一些实施例中，产生CA载体包括凋亡蛋白分子或者其剪接变体或功能片段的表达，但是该凋亡蛋白分子未并入CA载体中。
遗传元件构建体，例如，用于组装CA载体的遗传元件构建体
如本文所述的CA载体的遗传元件可以从包含遗传元件区和任选的其他序列如载体主链的遗传元件构建体产生。一般而言，遗传元件构建体包含CAV 5’UTR(例如，如本文所述)。遗传元件构建体可以是适于将遗传元件序列递送到宿主细胞中的任何遗传元件构建体，其中该遗传元件可以包封在蛋白质性外部内。在一些实施例中，遗传元件构建体包含启动子。在一些实施例中，遗传元件构建体是线性核酸分子。在一些实施例中，遗传元件构建体是环状核酸分子(例如，质粒、杆粒或微环，例如，如本文所述)。在一些实施例中，遗传元件构建体包含杆状病毒序列(例如，使得包含遗传元件构建体的昆虫细胞可以产生包含遗传元件构建体的遗传元件序列或其片段的杆状病毒)。在一些实施例中，遗传元件构建体可以是双链的。在其他实施例中，遗传元件是单链的。在一些实施例中，遗传元件构建体包含DNA。在一些实施例中，遗传元件构建体包含RNA。在一些实施例中，遗传元件构建体包含一个或多个经修饰的核苷酸。
在一些实施例中，遗传元件构建体包含一个拷贝的遗传元件序列。在一些实施例中，遗传元件包含多个拷贝的遗传元件序列(例如，两个拷贝的遗传元件序列)。在一些实施例中，遗传元件包含一个全长拷贝的遗传元件序列和至少一个部分遗传元件序列。在一些实施例中，两个拷贝的遗传元件序列(例如，全长和/或部分遗传元件序列)串联定位在遗传元件构建体(例如，如本文所述)内。
在一些方面，本披露内容提供了用于复制和繁殖如本文所述的CA载体的方法(例如，在细胞培养系统中)，该方法可以包括以下步骤中的一个或多个：(a)将遗传元件(例如，线性化遗传元件)引入(例如，转染入)对CA载体感染敏感的细胞系中；(b)收获这些细胞，并且任选地分离出显示存在遗传元件的细胞；(c)根据实验条件和基因表达，培养在步骤(b)中获得的细胞(例如，持续至少三天，如至少一周或更长时间)；以及(d)收获步骤(c)的细胞，例如，如本文所述的。
质粒
在一些实施例中，遗传元件构建体是质粒。质粒通常包含如本文所述的遗传元件序列以及适于在宿主细胞中复制的复制起点(例如，用于在细菌细胞中复制的细菌复制起点)和选择性标志(例如，抗生素抗性基因)。在一些实施例中，可以将遗传元件序列从质粒上切离。在一些实施例中，质粒能够在细菌细胞中复制。在一些实施例中，质粒能够在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中复制。在一些实施例中，质粒的长度为至少300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000bp。在一些实施例中，质粒的长度小于600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000bp。在一些实施例中，质粒的长度为300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-4000或4000-5000bp。在一些实施例中，例如，可以将遗传元件从质粒上切离(例如，通过体外环化)，以形成微环，例如，如本文所述的微环。在实施例中，遗传元件的切离将遗传元件序列从质粒主链中分离出来(例如，将遗传元件从细菌主链中分离出来)。
环状遗传元件构建体
在一些实施例中，遗传元件构建体是环状遗传元件构建体，例如，缺少主链(例如，缺少细菌复制起点和/或选择性标志)。在实施例中，遗传元件是双链环状遗传元件构建体。在实施例中，通过体外环化(IVC)，例如，如本文所述的体外环化(IVC)来产生双链环状遗传元件构建体。在实施例中，可以将双链环状遗传元件构建体引入宿主细胞中，在宿主细胞中它可以转化为单链环状遗传元件或用作生成单链环状遗传元件的模板，例如，如本文所述的。在一些实施例中，环状遗传元件构建体不包含质粒主链或其功能片段。在一些实施例中，环状遗传元件构建体的长度为至少2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500bp。在一些实施例中，环状遗传元件构建体的长度小于2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5500或6000bp。在一些实施例中，环状遗传元件构建体的长度介于2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、2900-3000、3000-3100、3100-3200、3200-3300、3300-3400、3400-3500、3500-3600、3600-3700、3700-3800、3800-3900、3900-4000、4000-4100、4100-4200、4200-4300、4300-4400或4400-4500bp之间。在一些实施例中，环状遗传元件构建体是微环。
体外环化
在一些情况下，要包装到蛋白质性外部内的遗传元件是单链环状DNA。在一些情况下，可以经由具有不同于单链环状DNA的形式的遗传元件构建体将遗传元件引入宿主细胞中。例如，遗传元件构建体可以是双链环状DNA。双链环状DNA然后可以在宿主细胞中转化为单链环状DNA(例如，宿主细胞包含适合滚环复制的酶，例如CAV Rep蛋白)。在一些实施例中，通过体外环化(IVC)，例如，如本文所述的体外环化(IVC)，来产生双链环状DNA。
一般而言，体外环化的DNA构建体可以通过酶切包含待包装的遗传元件序列的质粒来产生，使得将遗传元件序列作为线性DNA分子而切离。然后，可以连接由此产生的线性DNA，例如，使用DNA连接酶，以形成双链环状DNA。在一些情况下，由体外环化产生的双链环状DNA可以进行滚环式复制，例如，如本文所述的。不希望受到理论的束缚，设想体外环化产生双链DNA构建体，该构建体可以进行滚环式复制而无需进一步修饰，从而能够产生合适大小的单链环状DNA以包装到CA载体(例如，如本文所述)中。在一些实施例中，双链DNA构建体比质粒(例如，细菌质粒)小。在一些实施例中，将双链DNA构建体从质粒(例如，细菌质粒)上切离，然后进行环化，例如，通过体外环化。
顺式/反式构建体
在一些实施例中，如本文所述的遗传元件构建体包含一个或多个编码一种或多种CAV ORF，例如，蛋白质性外部组分(例如，由CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白核酸(例如，如本文所述)中的一个或多个编码的多肽)的序列。例如，遗传元件构建体可以包含编码CAV VP1分子的核酸序列。这样的遗传元件构建体可适于将遗传元件和一个或多个CAV ORF以顺式引入宿主细胞中。在其他实施例中，如本文所述的遗传元件构建体不包含编码一个或多个CAVORF，例如，蛋白质性外部组分(例如，由CAV VP1核酸编码的多肽，例如，如本文所述)的序列。例如，遗传元件构建体可以不包含编码CAV VP1分子的核酸序列。这样的遗传元件构建体可适用于将遗传元件引入宿主细胞中，其中一种或多种CAV ORF以反式提供(例如，经由引入编码一个或多个CAV ORF的第二遗传元件构建体，或者经由整合到宿主细胞基因组中的CAV ORF盒)。
在一些实施例中，遗传元件构建体包含编码CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段(例如，胶冻卷区，例如，如本文所述)的序列。在实施例中，不包含遗传元件序列的遗传元件部分包含编码CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段的序列(例如，在包含启动子和编码CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段的序列的盒中)。在另外的实施例中，包含遗传元件序列的构建体部分包含编码CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段(例如，胶冻卷区，例如，如本文所述)的序列。在实施例中，将这样的遗传元件包封在蛋白质性外部中(例如，如本文所述)产生了可复制型组分CA载体(例如，CA载体在感染细胞后，使细胞能够产生另外拷贝的CA载体，而无需将另外的遗传元件构建体，例如，编码一个或多个如本文所述的CAV ORF的遗传元件构建体引入细胞中)。
在其他实施例中，遗传元件不包含编码CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段(例如，胶冻卷区，例如，如本文所述)的序列。在实施例中，将这样的遗传元件包封在蛋白质性外部中(例如，如本文所述)产生了非复制型CA载体(例如，CA载体在感染细胞后，不能使受感染细胞产生另外的CA载体，例如，在缺乏一种或多种另外构建体(例如，编码一种或多种如本文所述的CAV ORF)的情况下)。
表达盒
在一些实施例中，遗传元件构建体包含一个或多个用于表达多肽或非编码RNA(例如，miRNA或siRNA)的盒。在一些实施例中，遗传元件构建体包含用于表达效应物(例如，外源或内源效应物)，例如，如本文所述的多肽或非编码RNA的盒。在一些实施例中，遗传元件构建体包含用于表达CAV蛋白(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白或其功能片段)的盒。在一些实施例中，表达盒可以位于遗传元件序列内。在实施例中，效应物的表达盒位于遗传元件序列内。在实施例中，CAV蛋白的表达盒位于遗传元件序列内。在其他实施例中，表达盒位于遗传元件序列之外的遗传元件构建体内的某个位置(例如，在主链中)。在实施例中，CAV蛋白的表达盒位于遗传元件序列之外的遗传元件构建体内的某个位置(例如，在主链中)。
多肽表达盒通常包含启动子和编码多肽的编码序列(例如，编码CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白或其功能片段的序列)，该多肽例如是效应物(例如，如本文所述的外源或内源效应物)或CAV蛋白。可以包含在多肽表达盒中的示例性启动子(例如，以驱动多肽的表达)包括但不限于组成型启动子(例如，CMV、RSV、PGK、EF1a或SV40启动子)、细胞或组织特异性启动子(例如，骨骼肌α-肌动蛋白启动子、肌球蛋白轻链2A启动子、抗肌萎缩蛋白启动子、肌肉型肌酸激酶启动子、肝白蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子、骨钙素启动子、骨唾液酸蛋白启动子、CD2启动子、免疫球蛋白重链启动子、T细胞受体α链启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子或神经丝蛋白轻链启动子)以及诱导型启动子(例如，锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子；地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子系统、四环素阻遏系统、四环素诱导系统、RU486诱导系统、雷帕霉素诱导系统)，例如，如本文所述的。在一些实施例中，表达盒进一步包含增强子，例如，如本文所述的增强子。
遗传元件构建体的设计和产生
有多种方法可用于合成遗传元件构建体。例如，可以将遗传元件构建体序列分成更容易合成的更小的重叠片段(例如，范围为约100bp至约10kb的区段或单个ORF)。这些DNA区段由一组重叠的单链寡核苷酸合成。然后，将所得重叠合成子组装成较大的DNA片段，例如，遗传元件构建体。可以将区段或ORF组装成遗传元件构建体，例如，通过体外重组或在5’和3’端的独特限制性位点来实现连接。
可以用设计算法来合成遗传元件构建体，该设计算法将构建体序列解析为寡核苷酸长度的片段，考虑到序列空间的复杂性，从而为合成创造合适的设计条件。然后，在基于半导体的高密度芯片上以化学方式合成寡核苷酸，其中每个芯片上合成超过200,000个单独的寡核苷酸。通过组装技术，如来组装这些寡核苷酸，以由较小的寡核苷酸构建更长的DNA区段。这是以并行方式完成的，因此一次构建成百上千个合成的DNA区段。
可以对每个遗传元件构建体或遗传元件构建体的区段进行序列验证。在一些实施例中，可以使用AnyDot.chips(德国Genovoxx公司)对RNA或DNA进行高通量测序，其允许监测生物学过程(例如，miRNA表达或等位基因变异性(SNP检测))。其他高通量测序系统包括在以下文献中披露的系统：Venter,J.等人,Science[科学]2001年2月16日；Adams,M.等人,Science[科学]2000年3月24日；和M.J,Levene等人Science[科学]299:682-686,2003年1月；以及美国申请公布号20030044781和2006/0078937。总体而言，这样的系统涉及对具有多个碱基的靶核酸分子进行测序，方法是经由在核酸分子上测量的聚合反应临时添加碱基，即实时跟踪待测序的模板核酸分子上的核酸聚合酶的活性。在一些实施例中，进行鸟枪法测序。
可以设计遗传元件构建体，使得可以相对于遗传元件，以顺式或反式提供用于复制或包装的因子。例如，当以顺式提供时，遗传元件可以包含一个或多个编码CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白(例如，如本文所述)的基因。在一些实施例中，复制和/或包装信号可以并入遗传元件中，例如，以诱导扩增和/或封装。在一些实施例中，可以将效应物插入基因组中的特定位点。在一些实施例中，将一种或多种病毒ORF替换为效应物。
在另一实例中，当复制或包装因子以反式提供时，遗传元件可能缺少编码CAVVP1、VP2和/或凋亡蛋白(例如，如本文所述)中的一个或多个的基因；该一种或多种蛋白质可以由例如另一核酸提供。在一些实施例中，遗传元件中存在极小的顺式信号(例如，5’UTR、3’UTR和/或GC富集区)。在一些实施例中，遗传元件不编码复制或包装因子(例如，复制酶和/或衣壳蛋白)。在一些实施例中，这样的因子可由一种或多种核酸(例如，病毒核酸、质粒或整合到宿主细胞基因组中的核酸)提供。在一些实施例中，第二核酸表达足以诱导扩增和/或包装的蛋白质和/或RNA，但可能缺乏它自身的包装信号。在一些实施例中，将遗传元件和第二核酸引入宿主细胞中(例如，同时进行或分别进行)，结果是遗传元件而非第二核酸的扩增和/或包装。
在一些实施例中，可以使用计算机辅助设计工具来设计遗传元件构建体。
制备核酸分子如遗传元件构建体的一般方法描述于，例如，Khudyakov&Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC出版社(2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具和应用](第一版),Academic Press[学术出版社](2013)；和Egli和Herdewijn,Chemistry and Biology ofArtificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH[威利-VCH出版社](2012)。
滚环扩增
不希望受到理论的束缚，滚环式扩增可能经由与相对于遗传元件区位于5’方向(或位于其5’区内)的Rep结合位点(例如，包含5’UTR，例如，包含发夹环和/或复制起点，例如，如本文所述)结合的Rep蛋白来进行。然后，Rep蛋白可以继续通过遗传元件区，引起遗传元件的合成。然后，可以将释放的遗传元件环化，随后将其包封在蛋白质性外部内，以形成CA载体。
串联构建体
在一些实施例中，遗传元件构建体是串联构建体。如本文所述的串联构建体通常包含第一遗传元件区，当其不与遗传元件构建体的其余部分相连和/或转化为环状单链DNA分子时，可以包封在蛋白质性外部内，从而产生CA载体。串联构建体可以进一步包含第二遗传元件区或其部分。在一些实施例中，本文所述的串联构建体可用于产生适于包封在蛋白质性外部(例如，包含由VP1核酸编码的多肽)中的遗传元件，例如，通过滚环式扩增。在一些实施例中，经由对第一遗传元件区进行滚环式扩增来产生适于包封在蛋白质性外部中的遗传元件。
在一些实施例中，串联构建体是包含遗传元件序列(例如，遗传元件区)的第一拷贝和遗传元件序列的第二拷贝的至少一部分(例如，包含uRFS或dRFS)的遗传元件构建体。在一些实施例中，第二拷贝包含遗传元件的全序列。在一些实施例中，第二拷贝包含遗传元件的部分序列(例如，遗传元件序列的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如，从遗传元件序列的5’端或3’端开始)。在一些实施例中，第一拷贝的遗传元件序列和第二拷贝的遗传元件序列是或者来源于相同的遗传元件序列(例如，相同的CAV序列)。在一些实施例中，第一拷贝的遗传元件序列和第二拷贝的遗传元件序列是或者来源于不同的遗传元件序列(例如，来自不同CAV的序列)。在一些实施例中，遗传元件序列的第一拷贝和遗传元件序列的第二拷贝在遗传元件构建体上彼此相邻定位。在其他实施例中，遗传元件序列的第一拷贝和遗传元件序列的第二拷贝可以隔开，例如，由间隔区隔开。在一些实施例中，遗传元件序列的第二拷贝或其部分(例如，包含uRFS)相对于遗传元件序列的第一拷贝位于5’方向。在一些实施例中，遗传元件序列的第二拷贝或其部分(例如，包含dRFS)相对于遗传元件序列的第一拷贝位于3’方向。
效应物
本文所述的组合物和方法可用于产生包含编码效应物(例如，外源效应物或内源效应物)，例如，如本文所述的效应物的序列的CA载体的遗传元件。在一些情况下，效应物可以是内源效应物或外源效应物。在一些实施例中，效应物是治疗性效应物。在一些实施例中，效应物包括多肽(例如，治疗性多肽或肽，例如，如本文所述)。在一些实施例中，效应物包括非编码RNA(例如，miRNA、siRNA、shRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA或gRNA)。在一些实施例中，效应物包括调节性核酸，例如，如本文所述的调节性核酸。
在一些实施例中，可以将效应物编码序列插入遗传元件中，例如，在非编码区，例如，位于开放阅读框的3'方向和遗传元件GC富集区的5'方向的非编码区、在TATA盒上游的5'非编码区中、在5’UTR中、在多A信号下游或GC富集区上游的3’非编码区中。在一些实施例中，可以将效应物编码序列插入遗传元件中，例如，在编码序列中(例如，在编码例如，如本文所述的CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白的序列中)。在一些实施例中，效应物编码序列替换开放阅读框的全部或一部分。在一些实施例中，遗传元件包含与效应物编码序列可操作地连接的调节性序列(例如，启动子或增强子，例如，如本文所述)。
在一些实施例中，包含效应物的遗传元件由如本文所述的遗传元件构建体(例如，串联构建体)产生，例如，通过对位于其上的遗传元件序列进行滚环式复制。在一些实施例中，遗传元件构建体仅包含一个拷贝的效应物编码序列。在一些实施例中，遗传元件构建体包含两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)拷贝的效应物编码序列。在一些实施例中，遗传元件构建体包含一个全长拷贝的效应物编码序列和至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)部分拷贝的效应物编码序列(例如，包含效应物编码序列的5’截短或3’截短的部分拷贝)。
宿主细胞
例如，可以在宿主细胞中产生本文所述的CA载体。一般而言，提供了宿主细胞，其包含CA载体遗传元件和CA载体蛋白质性外部的组分(例如，由指CAV VP1核酸编码的多肽或CAV VP1分子)。然后，在适于将遗传元件包封在蛋白质性外部内的条件(例如，如本文所述的培养条件)下孵育宿主细胞。在一些实施例中，在适于从宿主细胞中释放CA载体，例如，释放到周围上清液中的条件下进一步孵育宿主细胞。在一些实施例中，裂解宿主细胞以从细胞裂解物中收获CA载体。在一些实施例中，可以将CA载体引入生长至高细胞密度的宿主细胞系。
将遗传元件引入宿主细胞中
可以将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，将遗传元件本身引入宿主细胞中。在一些实施例中，将包含遗传元件序列的遗传元件构建体(例如，如本文所述)引入宿主细胞中。例如，可以使用本领域已知的方法将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。例如，可以通过转染(例如，稳定转染或瞬时转染)将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在实施例中，通过阳离子脂质体转染将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在实施例中，通过磷酸钙转染将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，通过电穿孔将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，使用基因枪将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，通过核转染将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，通过PEI转染将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，通过将宿主细胞与包含遗传元件或遗传元件构建体的病毒载体接触，将遗传元件或遗传元件构建体引入宿主细胞。在一些实施例中，通过使宿主细胞与包含遗传元件的CA载体接触，将遗传元件引入宿主细胞中。
在实施例中，一旦引入宿主细胞中，遗传元件构建体就能够复制。在实施例中，一旦引入宿主细胞中，遗传元件就可以由遗传元件构建体产生。在一些实施例中，遗传元件通过聚合酶在宿主细胞中产生，例如，使用遗传元件构建体作为模板。
在一些实施例中，将遗传元件或包含遗传元件的载体引入(例如，转染入)表达病毒聚合酶蛋白的细胞系中，以实现CA载体的表达。为此，可以将表达CA载体聚合酶蛋白的细胞系用作合适的宿主细胞。可以对宿主细胞进行类似地工程化，以提供其他病毒功能或其他功能。
为了制备本文披露的CA载体，可以使用遗传元件构建体来转染提供复制和产生所需的CA载体蛋白和功能的细胞。可替代地，可以在由本文披露的遗传元件或包含遗传元件的载体转染之前、期间或之后，用提供CA载体蛋白质和功能的第二构建体(例如，病毒)转染细胞。在一些实施例中，第二构建体可用于补充不完整病毒颗粒的产生。第二构建体(例如，病毒)可能具有条件性生长缺陷，如宿主范围局限性或温度敏感性，例如，这允许随后对转染子病毒进行选择。在一些实施例中，第二构建体可以提供一种或多种由宿主细胞利用的复制蛋白，以实现CA载体的表达。在一些实施例中，可以用编码病毒蛋白例如一种或多种复制蛋白的载体转染宿主细胞。在一些实施例中，第二构建体具有抗病毒敏感性。
在一些情况下，可以使用本领域已知的技术将本文披露的遗传元件或包含遗传元件的载体复制并产生到CA载体中。例如，在以下文献中描述了多种病毒培养方法：例如，美国专利号4,650,764；美国专利号5,166,057；美国专利号5,854,037；欧洲专利公开EP0702085 A1；美国专利申请系列号09/152,845；国际专利公开PCT WO 97/12032；WO 96/34625；欧洲专利公开EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO 98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；和EPO 780 47SA1，其各自通过引用以其全文并入本文。
用于以顺式或反式提供一个或多个CAV蛋白的方法
在一些实施例(例如，本文所述的顺式实施例)中，遗传元件构建体进一步包含一个或多个表达盒，这些表达盒包含CAV ORF(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白，或其功能片段)的编码序列。在实施例中，遗传元件构建体包含表达盒，该表达盒包含CAV VP1或者其剪接变体或功能片段的编码序列。可以将包含效应物以及一种或多种CAV ORF表达盒的这样的遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些情况下，包含这样的遗传元件构建体的宿主细胞能够产生用于蛋白质性外部的遗传元件和组分，以及用于将遗传元件包封在蛋白质性外部内的遗传元件和组分，而无需另外的遗传元件构建体或将表达盒整合到宿主细胞基因组中。换言之，这样的遗传元件构建体可用于在宿主细胞，例如，如本文所述的宿主细胞中的顺式CA载体产生方法。
在一些实施例(例如，本文所述的反式实施例)中，遗传元件不包含表达盒，该表达盒包含一种或多种CAV ORF(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白，或其功能片段)的编码序列。在实施例中，遗传元件构建体不包含表达盒，该表达盒包含CAV VP1或者其剪接变体或功能片段的编码序列。可以将包含效应物表达盒但缺少一个或多个CAV ORF(例如，CAV VP1或者其剪接变体或功能片段)表达盒的这样的遗传元件构建体引入宿主细胞中。在一些情况下，包含这样的遗传元件构建体的宿主细胞可能需要另外的遗传元件酸构建体或将表达盒整合到宿主细胞基因组中，以产生CA载体的一种或多种组分(例如，蛋白质性外部蛋白质)。在一些实施例中，在缺乏编码CAV VP1分子的另外核酸构建体的情况下，包含这样的遗传元件构建体的宿主细胞不能将遗传元件包封在蛋白质性外部内。换言之，这样的遗传元件构建体可用于在宿主细胞，例如，如本文所述的宿主细胞中的反式CA载体产生方法。
辅助物
在一些实施例中，将辅助构建体引入宿主细胞(例如，包含如本文所述的遗传元件构建体或遗传元件的宿主细胞)中。在一些实施例中，在引入遗传元件构建体之前，将辅助构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，在引入遗传元件构建体的同时，将辅助构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，在引入遗传元件构建体之后，将辅助构建体引入宿主细胞中。在一些实施例中，辅助构建体通过包含辅助构建体的辅助病毒被引入宿主细胞。
示例性细胞类型
适用于生产CA载体的示例性宿主细胞包括但不限于真核细胞(例如鸟类细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞)。在一些实施例中，宿主细胞是人细胞或细胞系。在一些实施例中，宿主细胞是鸟类细胞或细胞系(例如，鸡细胞或细胞系，例如，MDCC-MSB1细胞；或鸭细胞或细胞系，例如EB66细胞或AGE.CR细胞)。在一些实施例中，细胞是免疫细胞或细胞系，例如，T细胞或细胞系、癌细胞系、肝细胞或细胞系、神经细胞、神经胶质细胞、皮肤细胞、上皮细胞、间充质细胞、血细胞、内皮细胞、眼细胞、胃肠道细胞、祖细胞、前体细胞、干细胞、肺细胞、心肌细胞或肌肉细胞。在一些实施例中，宿主细胞是动物细胞(例如，小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞或昆虫细胞)。
在一些实施例中，宿主细胞是淋巴样细胞。在一些实施例中，宿主细胞是T细胞或永生化T细胞。在实施例中，宿主细胞是Jurkat细胞。在实施例中，宿主细胞是MOLT-4细胞。在一些实施例中，宿主细胞是B细胞或永生化B细胞。在实施例中，宿主细胞是Raji细胞。
在一些实施例中，宿主细胞包含遗传元件构建体，例如串联构建体(例如，如本文所述)。
在实施例中，宿主细胞是Raji细胞、EKVX细胞、MRC5细胞或MCF7细胞。在实施例中，宿主细胞是HEK293T细胞、HEK293F细胞、A549细胞、Jurkat细胞、Chang细胞、HeLa细胞Phoenix细胞、MRC-5细胞、NCI-H292细胞或Wi38细胞。在一些实施例中，宿主细胞是非人灵长类动物细胞(例如，Vero细胞、CV-1细胞或LLCMK2细胞)。在一些实施例中，宿主细胞是鼠类细胞(例如，McCoy细胞)。在一些实施例中，宿主细胞是仓鼠细胞(例如，CHO细胞或BHK 21细胞)。在一些实施例中，宿主细胞是MARC-145、MDBK、RK-13或EEL细胞。在一些实施例中，宿主细胞是上皮细胞(例如，上皮谱系的细胞系)。
在一些实施例中，CA载体在连续动物细胞系(例如，可以连续繁殖的永生化细胞系)中培养。根据本发明的一个实施例，细胞系可以包括猪细胞系。在本发明的背景下设想的细胞系包括永生化猪细胞系，如但不限于猪肾上皮细胞系PK-15和SK、单核髓系细胞系3D4/31和睾丸细胞系ST。
培养条件
包含遗传元件和蛋白质性外部组分的宿主细胞可以在适合将遗传元件包封在蛋白质性外部内的条件下孵育，从而产生CA载体。合适的培养条件包括所描述的那些。在一些实施例中，在液体培养基(例如，RPMI(例如，补充有FBS，例如，10％ FBS)、EX-CELL EBxGRO-I无血清培养基(例如，补充有l-谷氨酰胺)、HyClone CDM4鸟类培养基(例如，补充有l-谷氨酰胺)、Optipro SFM、格蕾丝补充培养基(Grace's Supplemented)(TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施耐德果蝇培养基(Schneider's Drosophila)、SF-900II SFM或EXPRESS-FIVETMSFM)中孵育宿主细胞。在一些实施例中，将宿主细胞以贴壁培养形式孵育。在一些实施例中，将宿主细胞以悬浮培养形式孵育。在一些实施例中，将宿主细胞在试管、瓶子、微载剂或烧瓶中孵育。在一些实施例中，将宿主细胞在培养皿或孔(例如，板上的孔)中孵育。在一些实施例中，在适于宿主细胞增殖的条件下孵育宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞在适合于宿主细胞将其中产生的CA载体释放到周围上清液中的条件下孵育。
根据本发明的含有CA载体的细胞培养物的生产可以以不同的规模进行(例如，在烧瓶、滚瓶或生物反应器中)。用于培养待感染细胞的培养基通常包含细胞存活所需的标准营养物质，但根据细胞类型还可以包含其他营养物质。任选地，培养基可以不含蛋白质和/或不含血清。根据细胞类型，可以将细胞悬浮培养或在基质上培养。在一些实施例中，不同的培养基用于宿主细胞的生长和CA载体的产生。
收获和纯化
可以例如根据本领域已知的方法收获由宿主细胞产生的CA载体。例如，可以从上清液中收获由培养的宿主细胞释放到周围上清液中的CA载体。在一些实施例中，将上清液与宿主细胞分离以获得CA载体。在一些实施例中，在收获之前或收获期间裂解宿主细胞。在一些实施例中，CA载体是从宿主细胞裂解物收获的。在一些实施例中，CA载体是从宿主细胞裂解物和上清液收获的。在一些实施例中，CA载体的纯化和分离是根据病毒生产中的已知方法进行的，例如以下中所述：Rinaldi等人,DNA Vaccines:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)[DNA疫苗：方法和方案(分子生物学方法)],第3版2014,Humana Press[胡马纳出版社](其通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，CA载体可以通过基于生物物理学特性例如大小、密度、电荷的溶质分离来收获和/或纯化。在一个实施例中，通过密度梯度离心和/或超速离心，例如蔗糖密度梯度离心或氯化铯密度梯度离心，从细胞或细胞培养物中纯化CA载体。例如，通过以下方式富集或纯化CA载体制剂：(a)任选地裂解宿主细胞培养物的宿主细胞，(b)任选地从宿主细胞培养物中去除细胞碎片以产生细胞培养物的可溶性级分，(c)对可溶性级分进行密度梯度离心和/或超速离心，以及(d)从密度梯度中收集富集的CA载体制剂。其他步骤，例如蔗糖垫离心/超速离心、离子交换色谱和/或切向流过滤，可以在用药物赋形剂配制之前进行。
收获的CA载体可以被纯化和/或富集，例如，以产生CA载体制剂。在一些实施例中，从收获溶液中存在的其他成分或污染物中分离出收获的CA载体，例如，使用本领域已知的纯化病毒颗粒的方法(例如，通过沉降、层析和/或超滤进行纯化)。在一些实施例中，纯化步骤包括从制剂中去除血清、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、缺少遗传元件的颗粒和/或酚红中的一种或多种。在一些实施例中，相对于收获溶液中存在的其他成分或污染物，富集收获的CA载体，例如，使用本领域已知的富集病毒颗粒的方法。
在一些实施例中，由此产生的制剂或包含该制剂的药物组合物在可接受的期限和温度范围内是稳定的，和/或与所期望的施用途径和/或该施用途径所期望的任何装置，例如，针头或注射器相容。
II.CA载体
在一些方面，本文所述的本发明包括使用和制备CA载体、CA载体制剂和治疗性组合物的组合物和方法。在一些实施例中，CA载体是使用本文所述的遗传元件构建体制成的。在一些实施例中，CA载体包含一种或多种核酸或多肽，这些核酸或多肽包含基于CAV(例如，如本文所述的CAV)或者其片段或部分或者其他基本上非致病性病毒(例如，共生病毒(symbiotic virus)、共栖病毒(commensal virus)、原生病毒)的序列、结构和/或功能。在一些实施例中，基于CAV的CA载体包含至少一个针对该CAV而言外源的元件，例如，外源效应物或编码位于CA载体的遗传元件内的外源效应物的核酸序列。在一些实施例中，基于CAV的CA载体包含至少一个针对来自该CAV的另一元件具有异源性的元件，例如，效应物编码核酸序列，其针对另一相连的核酸序列，如启动子元件，具有异源性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件(例如，环状DNA，例如，单链DNA)，其包含至少一个相对于该遗传元件的其余部分和/或蛋白质性外部而言具有异源性的元件(例如，编码效应物的外源元件，例如，如本文所述)。CA载体可以是用于使有效载荷进入宿主，例如人中的递送媒剂(例如，基本上非致病性递送媒剂)。在一些实施例中，CA载体能够在真核细胞例如哺乳动物细胞例如人细胞中复制。在一些实施例中，CA载体在哺乳动物(例如人)细胞中是基本上非致病性的和/或基本上非整合的。在一些实施例中，CA载体是复制缺陷的。在一些实施例中，CA载体具有复制能力。
在一方面，本发明包括CA载体，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件、编码效应物(例如，内源效应物或外源效应物，例如，有效载荷)的序列和蛋白结合序列(例如，外壳蛋白结合序列，例如，包装信号)，其中该遗传元件是单链DNA，并具有以下特性之一或二者：是环状的和/或整合到真核细胞基因组中的频率低于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％；以及(ii)蛋白质性外部；其中该遗传元件包封在该蛋白质性外部内；并且其中该CA载体能够将遗传元件递送到真核细胞中。
在一些实施例中，蛋白质结合序列包含包装信号，例如，适于允许将遗传元件包装到包含CAV VP1分子的蛋白质性外部内的包装信号。在实施例中，蛋白质结合序列(例如，包装信号)包含核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCC CCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATA AACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ IDNO:17)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其反向互补序列。
在本文描述的CA载体的一些实施例中，遗传元件以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合。在一些实施例中，施用给受试者的多个CA载体的少于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％的遗传元件将整合到受试者的一个或多个宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，CA载体(例如，如本文所述)群体的遗传元件整合到宿主细胞基因组中的频率低于同类的AAV病毒群体的频率，例如，其频率比同类的AAV病毒群体低约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
在一方面，本发明包括CA载体，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应物(例如，内源效应物或外源效应物，例如，有效载荷)的序列，以及蛋白结合序列(例如，外壳蛋白结合序列)，其中该遗传元件与野生型CAV序列(例如本文所述的野生型CAV序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及(ii)蛋白质性外部；其中该遗传元件包封在该蛋白质性外部内；并且其中该CA载体能够将遗传元件递送到真核细胞中。
在一个方面中，本发明包括CA载体，其包含：
a)遗传元件，其包含(i)编码外壳蛋白(例如，非致病性外壳蛋白)的序列，(ii)使该遗传元件与该非致病性外壳蛋白结合的外壳蛋白结合序列，和(iii)编码效应物(例如，内源效应物或外源效应物)的序列；以及
b)蛋白质性外部，其与该遗传元件相关联，例如，包裹、衣壳化或包封该遗传元件。
在一些实施例中，CA载体包括来自非包膜环状单链DNA病毒的序列或表达产物(或与其具有>70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同源性)。动物性环状单链DNA病毒通常是指感染真核非植物宿主并具有环状基因组的单链DNA(ssDNA)病毒亚群。因此，动物性环状ssDNA病毒可区别于感染原核生物的ssDNA病毒(即，微小噬菌体科和丝状噬菌体科)和感染植物的ssDNA病毒(即，双生病毒科和矮化病毒科)。它们也可区别于感染非植物真核生物的线性ssDNA病毒(即，细小病毒科)。
在一些实施例中，CA载体调节宿主细胞功能，例如，短暂或长期调节。在某些实施例中，细胞功能发生稳定改变，例如持续存在以下时间的调节：至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或者其间的任何时间。在某些实施例中，细胞功能发生短暂改变，例如持续存在以下时间的调节：不超过约30分钟至约7天，或不超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
在一些实施例中，遗传元件包括启动子元件。在实施例中，启动子元件选自RNA聚合酶II依赖性启动子、RNA聚合酶III依赖性启动子、PGK启动子、CMV启动子、EF-1α启动子、SV40启动子、CAGG启动子或UBC启动子、TTV病毒启动子、组织特异性启动子、U6(pollIII)、具有活化蛋白(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)的上游DNA结合位点的最小CMV启动子。在实施例中，启动子元件包含TATA盒。在实施例中，启动子元件对于野生型CAV(例如，如本文所述)而言是内源的。
在一些实施例中，遗传元件包括以下特征中的一种或多种：单链、环状、负链和/或DNA。在实施例中，遗传元件包括附加体。在一些实施例中，除效应物之外的遗传元件部分的组合大小为约1kb-5kb(例如，约2.8kb-4kb、约2.8kb-3.2kb、约3.6kb-3.9kb或约2.8kb-2.9kb)、小于约5kb(例如，小于约2.9kb、3.2kb、3.6kb、3.9kb或4kb)或至少100个核苷酸(例如，至少1kb)。在某些实施例中，遗传元件的不包括效应物的部分具有约0.5-1kb、1-1.5kb、1.5-2kb、2-2.5kb、2.5-3kb或3-3.5kb的组合大小。
在一些情况下，如本文所述的CA载体、包含CA载体的组合物、使用这样的CA载体的方法等部分基于实例，这些实例说明了不同的效应物(例如，miRNA(例如，针对IFN或miR-625)、shRNA等)和蛋白结合序列(例如，与衣壳蛋白如Q99153结合的DNA序列)如何与蛋白质性外部(例如，在Arch Virol[病毒学档案](2007)152:1961-1975中披露的衣壳)组合，以产生随后可用于将效应物递送至细胞(例如，动物细胞，例如，人细胞或非人动物细胞，如猪或小鼠细胞)的CA载体。在实施例中，效应物可以沉默某种因子如干扰素的表达。实例进一步描述了如何通过可以将效应物插入序列，例如，源自CAV的序列中来制备CA载体。正是基于这些实例，下文中的描述设想了实例中所考虑的具体发现和组合的各种变型。例如，技术人员将从实例中理解的是，特定miRNA仅用作效应物的实例，而其他效应物可以是例如其他调节性核酸或治疗性肽。类似地，实例中使用的特定衣壳可以替换为下文所述的基本上非致病性蛋白质。在实例中描述的特定CAV序列也可以替换为下文描述的CAV序列。这些考虑同样适用于蛋白结合序列、调节性序列如启动子等。独立于此，本领域技术人员将特别考虑与实例紧密相关的这些实施例。
在一些实施例中，将CA载体或CA载体中包含的遗传元件引入细胞(例如，人细胞)中。在一些实施例中，例如由CA载体的遗传元件编码的效应物(例如，RNA，例如miRNA)在细胞(例如，人细胞)中表达，例如，一旦将CA载体或遗传元件引入细胞中。在实施例中，将CA载体或其中包含的遗传元件引入细胞中例如通过改变细胞中靶分子的表达水平，来调节(例如，增加或减少)靶分子(例如，靶核酸，例如RNA，或靶多肽)在细胞中的水平。在实施例中，引入CA载体或其中包含的遗传元件，降低细胞产生的干扰素水平。在实施例中，将CA载体或其中包含的遗传元件引入细胞中，调节(例如，提高或降低)细胞的功能。在实施例中，将CA载体或其中包含的遗传元件引入细胞中，调节(例如，提高或降低)细胞的活力。在实施例中，将CA载体或其中包含的遗传元件引入细胞中，降低细胞(例如，癌细胞)的活力。
在一些实施例中，本文所述的CA载体(例如，合成的CA载体)诱发的抗体阳性率低于70％(例如，低于约60％、50％、40％、30％、20％或10％的抗体阳性率)。在实施例中，根据本领域已知的方法确定抗体阳性率。在实施例中，通过检测生物样品中针对CAV(例如，如本文所述)或基于其的CA载体的抗体来确定抗体阳性率，例如，根据在以下文献中描述的抗TTV抗体检测方法：Tsuda等人(1999；J.Virol.Methods[病毒学方法杂志]77:199-206；其通过引用并入本文)和/或根据在以下文献中描述的用于测定抗TTV IgG血清阳性率的方法：Kakkola等人(2008；Virology[病毒学]382:182-189；其通过引用并入本文)。还可以通过本领域用于检测抗病毒抗体的方法来检测针对CAV或基于其的CA载体的抗体，例如，检测抗AAV抗体的方法，例如，在以下文献中描述的方法：Calcedo等人(2013；Front.Immunol.[免疫学前沿]4(341):1-7；其通过引用并入本文)。
在一些实施例中，复制缺陷型、复制缺损型或非复制型遗传元件不编码遗传元件复制所需的所有必要机构或组分。在一些实施例中，复制缺陷型遗传元件不编码复制因子。在一些实施例中，复制缺陷型遗传元件不编码一个或多个ORF(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白，例如，如本文所述)。在一些实施例中，可以以反式提供不由遗传元件编码的机构或组分(例如，使用病毒或质粒，或者在也包含在宿主细胞和/或周围介质中(例如整合到宿主细胞的基因组中)的核酸中编码)，例如，使得复制缺陷型、复制缺损型或非复制型遗传元件可以在反式提供的机构或组分的存在下进行复制。
在一些实施例中，包装缺陷型、包装缺损型或包装无能型遗传元件不能被包装到蛋白质性外部(例如，其中蛋白质性外部包含衣壳或其部分，例如，包含由CAV VP1核酸编码的多肽，例如，如本文所述)中。在一些实施例中，与野生型CAV(例如，如本文所述)相比，包装缺陷型遗传元件被包装到蛋白质性外部中的效率低于10％(例如，低于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％或0.001％)。在一些实施例中，即使在存在允许包装野生型CAV遗传元件(例如，如本文所述)的因子(例如，VP1、VP2和/或凋亡蛋白)的情况下，包装缺陷型遗传元件也不能被包装到蛋白质性外部中。在一些实施例中，即使在存在允许包装野生型CAV遗传元件(例如，如本文所述)的因子(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白)的情况下，与野生型CAV(例如，如本文所述)相比，包装缺损型遗传元件被包装到蛋白质性外部中的效率也低于10％(例如，低于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％或0.001％)。
在一些实施例中，可包装型遗传元件可被包装到蛋白质性外部(例如，其中蛋白质性外部包含衣壳或其部分，例如，包含由VP1核酸编码的多肽，例如，如本文所述)中。在一些实施例中，与野生型CAV(例如，如本文所述)相比，可包装型遗传元件被包装到蛋白质性外部中的效率为至少20％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更高)。在一些实施例中，在存在允许包装野生型CAV遗传元件(例如，如本文所述)的因子(例如，VP1、VP2和/或凋亡蛋白)的情况下，可包装型遗传元件可以被包装到蛋白质性外部中。在一些实施例中，在存在允许包装野生型CAV遗传元件(例如，如本文所述)的因子(例如，VP1、VP2和/或凋亡蛋白)的情况下，与野生型CAV(例如，如本文所述)相比，可包装型遗传元件被包装到蛋白质性外部中的效率为至少20％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更高)。
鸡贫血病毒(CAV)
在一些实施例中，CA载体，例如，如本文所述，包含衍生自或类似于野生型鸡贫血病毒(CAV)的序列或表达产物。在一些实施例中，CA载体包括相对于野生型CAV是外源的一个或多个序列或表达产物。在一些实施例中，CA载体包括相对于野生型CAV是内源的一个或多个序列或表达产物。在一些实施例中，CA载体包括一个或多个相对于CA载体中一个或多个其他序列或表达产物而言具有异源性的序列或表达产物。CAV通常具有负极性的单链环状DNA基因组。CAV通常与任何人疾病无关，也不被认为会感染人细胞(参见，例如，Shulman和Davidson 2017,Ann.Rev.Virol.[病毒学年度评论]4:159-180；以及Fatoba和Adeleke2019,Acta Virologica[病毒学学报]63:19-25；其中每一个都通过引用以其全文并入本文)。
在一些实施例中，遗传元件包含编码以下的核苷酸序列：氨基酸序列或其功能片段或与本文所述的氨基酸序列中任一个(例如CAV多肽序列)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施例中，如本文所述的CA载体包含一种或多种核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)，这些核酸分子包含与CAV核酸序列(例如，如本文所述)或者其片段具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施例中，如本文所述的CA载体包含一种或多种核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)，这些核酸分子包含与以下中的一个或多个具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列：CAV(例如，如本文所述)的5’UTR、重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2基因、凋亡蛋白基因、VP1、3’UTR、GC富集区、聚A信号序列或其任意组合。在一些实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白(例如本文所述的任何CAV的VP1、VP2和/或凋亡蛋白序列)的序列。在实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白的序列，该衣壳蛋白包含与CAV VP1蛋白(或者其剪接变体或功能片段)或由CAV VP1核酸编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表1A的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的重复区核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的CAAT信号核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的TATA盒核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表1A的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表1A的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表1A的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表1A的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的GC富集核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1A的聚A信号核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表1B的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表1B的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1B的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1B的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1B的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表1B的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表1B的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表1B的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表1B的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表2的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的完整核酸序列的核苷酸1-6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的完整核酸序列的核苷酸995-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸7-994具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表2的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表2的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表2的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表2的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表2的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表3的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的完整核酸序列的核苷酸1-206具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的完整核酸序列的核苷酸1195-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸207-1194具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表3的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表3的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表3的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表3的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表4的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的完整核酸序列的核苷酸1-406具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的完整核酸序列的核苷酸1395-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸407-1394具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表4的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表4的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表4的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表4的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表4的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表5的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的完整核酸序列的核苷酸1-606具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的完整核酸序列的核苷酸1595-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸607-1594具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表5的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表5的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表5的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表5的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表6的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的完整核酸序列的核苷酸1-806具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的完整核酸序列的核苷酸1795-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸807-1794具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表6的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表6的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表6的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表6的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表6的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表7的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的完整核酸序列的核苷酸1-1006具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的完整核酸序列的核苷酸1995-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸1007-1994具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表7的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表7的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表7的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表7的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表8的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的完整核酸序列的核苷酸1-1206具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的完整核酸序列的核苷酸2195-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸1207-2194具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表8的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表8的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表8的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表8的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表8的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表9的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的完整核酸序列的核苷酸1-1271具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸1272-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950或950-987个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的nLuc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表9的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表9的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表9的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表9的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表10的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的完整核酸序列的核苷酸1-546具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的完整核酸序列的核苷酸2133-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸547-2134具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500或1500-1587个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的iCRE插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表10的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表10的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表10的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表10的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表10的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表11的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的完整核酸序列的核苷酸1-606具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的完整核酸序列的核苷酸1798-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸607-1797具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950、950-1000、1000-1100或1100-1190个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的GFP插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表11的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表11的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表11的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表11的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表12的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的完整核酸序列的核苷酸1-606具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的完整核酸序列的核苷酸2015-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸607-2014具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400或1400-1407个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的Gluc插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表12的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表12的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表12的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表12的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表12的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表13的完整核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300或2300-2319个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的完整核酸序列的核苷酸1-606具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的完整核酸序列的核苷酸1790-2319具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子不包含与表1B的完整核酸序列的核苷酸607-1789具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列或其中连续10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-950、950-1000、1000-1100或1100-1182个核苷酸的序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的mCherry插入核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的5'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的VP2核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的凋亡蛋白核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的VP1核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表13的VP2核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表13的凋亡蛋白核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含编码多肽的核酸序列，该多肽与由表13的VP1核苷酸序列编码的多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，核酸分子包含与表13的3'UTR核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，遗传元件包含编码以下的核苷酸序列：氨基酸序列或其功能片段或与文中所述的氨基酸序列中任一个(例如，CAV氨基酸序列(例如表1-17中任一个中所列的序列或由这些表中任一个中所列的序列编码的序列))具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施例中，如本文所述的CA载体包含一种或多种核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)，这些核酸分子包含与CAV序列(例如，如本文所述)或者其片段具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在实施例中，CA载体包含选自如表1-17中任一个所示的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的核酸序列。在实施例中，CA载体包含多肽，该多肽包含由如表1-17中任一个所示的序列编码的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施例中，如本文所述的CA载体包含一种或多种核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)，这些核酸分子包含与以下中的一个或多个具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列：本文所述任何CAV的5’UTR、重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2基因、凋亡蛋白基因、VP1、3’UTR、GC富集区、聚A信号序列或其任意组合。在一些实施例中，核酸分子包含编码本文所述的任何CAV的衣壳蛋白(例如，VP1分子)、VP2分子和/或凋亡蛋白分子的序列。在实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白的序列，该衣壳蛋白包含与CAV VP1分子(例如表1-17中任一个所示的VP1氨基酸序列，或由表1-17中任一个所示的核酸序列编码的VP1氨基酸序列)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含编码多肽的核酸序列，该多肽与表1-17中任一个中所列的CAV基因组序列编码的VP1分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含编码多肽的核酸序列，该多肽与表1-17中任一个中所列的CAV基因组序列编码的VP2分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含编码多肽的核酸序列，该多肽与表1-17中任一个中所列的CAV基因组序列编码的凋亡蛋白分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件不包含编码以下多肽的核酸序列，该多肽与表1-17中任一个中所列的CAV基因组序列编码的VP1分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件不包含编码以下多肽的核酸序列，该多肽与表1-17中任一个中所列的CAV基因组序列编码的VP2分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件不包含编码以下多肽的核酸序列，该多肽与表1-17中任一个中所列的CAV基因组序列编码的凋亡蛋白分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
表1A.示例性鸡贫血病毒(CAV)核酸序列
名称 CAV分离株Cuxhaven 1
属/分支 环病毒
登录号 M55918
全序列：2313bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
5'UTR 1–374
重复区 138–254
CAAT信号 255–260
TATA盒 317–322
VP2 374–1024
凋亡蛋白 480–845
VP1 847–2196
3’UTR 2197–2313
GC富集区 2200–2266
聚A信号序列 2281-2286
表1B.替代性示例性鸡贫血病毒(CAV)核酸序列
名称 CAV分离株Cuxhaven 1
属/分支 环病毒
登录号 M55918
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
5'UTR 1–379
VP2 380–1030
凋亡蛋白 485–851
VP1 853–2202
3’UTR 2203–2319
表2.CAV-nLuc1核酸序列
名称 CAV-nLuc1突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 7–994
5'UTR 1–6
VP2 995–1030
凋亡蛋白 N/A
VP1 995–2202
3’UTR 2203–2319
表3.CAV-nLuc2核酸序列
名称 CAV-nLuc2突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 207–1194
5'UTR 1–206
VP2 N/A
凋亡蛋白 N/A
VP1 1194–2202
3’UTR 2203–2319
表4.CAV-nLuc3核酸序列
名称 CAV-nLuc3突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 407–1394
5'UTR 1–379
VP2 380–406
凋亡蛋白 N/A
VP1 1394–2202
3’UTR 2203–2319
表5.CAV-nLuc4核酸序列
名称 CAV-nLuc4突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 607–1594
5'UTR 1–379
VP2 380–606
凋亡蛋白 486–606
VP1 1595–2202
3’UTR 2203–2319
表6.CAV-nLuc5核酸序列
名称 CAV-nLuc5突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 807–1794
5'UTR 1–379
VP2 380–806
凋亡蛋白 486–806
VP1 1795–2202
3’UTR 2203–2319
表7.CAV-nLuc6核酸序列
名称 CAV-nLuc6突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 1007–1994
5'UTR 1–379
VP2 380–1006
凋亡蛋白 486–851
VP1 853–1006；1995–2202
3’UTR 2203–2319
表8.CAV-nLuc7核酸序列
名称 CAV-nLuc7突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围nLuc插入物 1207–21945'UTR 1–379VP2 380–1030
凋亡蛋白 486–851
VP1 853–1206；2195–2202
3’UTR 2203–2319
表9.CAV-nLuc8核酸序列
名称 CAV-nLuc8突变体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
nLuc插入物 1272–2319
5'UTR 1–379
VP2 380–1030
凋亡蛋白 486–851
VP1 853–1271
3’UTR N/A
表10.CRE-CA载体核酸序列
名称 CRE-CA载体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
iCRE插入物 547–2134
5'UTR 1–379
VP2 380–546
凋亡蛋白 486–546
VP1 2135–2202
3’UTR 2203–2319
表11.GFP-CA载体核酸序列
名称 GFP-CA载体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
GFP插入物 607–1797
5'UTR 1–379
VP2 380–606
凋亡蛋白 486–606
VP1 1798–2202
3’UTR 2203–2319
表12.Gluc-CA载体核酸序列
名称 Gluc-CA载体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
Gluc插入物 607–2014
5'UTR 1–379
VP2 380–606
凋亡蛋白 486–606
VP1 2015–2202
3’UTR 2203–2319
表13.mCherry-CA载体核酸序列
名称 mCherry-CA载体
属/分支 环病毒
全序列：2319bp
/>
注释：
推定的结构域 碱基范围
mCherry插入物 607–1789
5'UTR 1–379
VP2 380–606
凋亡蛋白 486–606
VP1 1790–2202
3’UTR 2203–2319
在实施例中，嵌合CA载体包含多个多肽(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白)，该多个多肽包含来自多个不同CAV(例如，如本文所述)的序列。例如，嵌合CA载体可以包含来自一个CAV的VP1分子(例如，VP1分子，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％的氨基酸序列同一性的VP1分子)和来自不同CAV或与不同CAV具有相似性的VP2分子。在另一个实例中，嵌合CA载体可以包含来自或类似于一个CAV的第一VP1分子和来自或类似于不同CAV的第二VP1分子。
在一些实施例中，CA载体包含嵌合多肽(例如，CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白)，例如，包含来自一种CAV(例如，如本文所述)的至少一个部分和来自不同CAV(例如，如本文所述)的至少一个部分。在实施例中，CA载体包含嵌合VP1分子，该嵌合VP1分子包含来自一种CAV(例如，如本文所述)的VP1分子或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的VP1分子的至少一个部分，和来自不同CAV(例如，如本文所述)的VP1分子或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的VP1分子的至少一个部分。在实施例中，嵌合VP1分子包含来自一种CAV的VP1胶冻卷结构域，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；和来自不同CAV的VP1氨基酸子序列(例如，如本文所述)或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在实施例中，嵌合VP1分子包含来自一种CAV的VP1精氨酸富集区，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；和来自不同CAV的VP1氨基酸子序列(例如，如本文所述)或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在实施例中，CA载体包含嵌合VP2分子，其包含来自一种CAV(例如，如本文所述)的VP2分子或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的VP2分子的至少一个部分，和来自不同CAV(例如，如本文所述)的VP2分子或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的VP2分子的至少一个部分。在实施例中，CA载体包含嵌合凋亡蛋白分子，其包含来自一种CAV(例如，如本文所述)的凋亡蛋白分子或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的凋亡蛋白分子的至少一个部分，和来自不同CAV(例如，如本文所述)的凋亡蛋白分子或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的凋亡蛋白分子的至少一个部分。
在一些实施例中，可以使用串联构建体(例如，如本文所述)产生CA载体。下表14-16提供了CAV串联构建体序列的非限制性实例。在一些实施例中，本文所述的遗传元件构建体(例如，串联构建体)包含来自表14-16中的任一个中所列的CAV遗传元件序列的5'UTR、重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2编码序列、凋亡蛋白编码序列、VP1编码序列、3'UTR、GC富集区或聚A信号序列中的一个或多个。在一些实施例中，本文所述的遗传元件构建体(例如，串联构建体)包含来自表14-16中的任一个中所列的CAV遗传元件序列的VP1片段(例如，无起始(start-less)VP1片段)、VP2片段(例如，无起始VP2片段)和/或凋亡蛋白片段(例如，无起始凋亡蛋白片段)中的一个或多个。在一些实施例中，本文所述的遗传元件构建体(例如，串联构建体)包含来自表14-16中的任一个中所列的串联构建体序列的启动子(例如，SV40启动子)、SV40聚A序列、发夹区、复制起点(例如，pUC起点)或抗性基因(例如，AmpR基因)中的一个或多个。
表14.示例性CAV串联质粒pCAV-nLuc6_CAV
序列：6794bp
/>
/>
/>
/>
注释：
名称 起始 结束
CA载体-nLuc6 1 2319
CAV重复区 144 260
无起始VP2片段 380 1006
无起始VP3(凋亡蛋白) 486 851
无起始VP1上游片段 853 1006
SV40启动子 1007 1350
NanoLuc 1357 1872
SV40聚(A) 1873 1994
下游VP1片段 1995 2202
发夹区 2206 2272
CAV(wt) 2320 4638
CAV重复区 2463 2579
VP2 2699 3349
VP3(凋亡蛋白) 2805 3170
VP1 3172 4521
发夹区 4525 4591
pUC起点 4770 5443
AmpR基因 5588 6547
表15.示例性CAV串联质粒pCAV-nLuc6_CAVΔ3NCR序列：6673bp
/>
/>
/>
注释：
名称 起始 结束CA载体-nLuc6 1 2319
CAV重复区 144 260
无起始VP2片段 380 1006无起始VP3(凋亡蛋白) 486 851
无起始VP1上游片段 853 1006
SV40启动子 1007 1350
NanoLuc 1357 1872
SV40聚(A) 1873 1994
下游VP1片段 1995 2202
发夹区 2206 2272
CAVΔ3NCR 2320 4521
CAV重复区 2463 2579
VP2 2699 3349
VP3(凋亡蛋白) 2805 3170
VP1 3172 4521
pUC起点 4653 5326
AmpR基因 5471 6430
表16.示例性CAV串联质粒pCAV-nLuc6_CAVΔPromΔORFΔ3NCR序列：4793bp
/>
/>
/>
注释：
名称 起始 结束
CA载体-nLuc6 1 2319
CAV重复区 144 260
无起始VP2片段 380 1006
无起始VP3(凋亡蛋白) 486 851
无起始VP1上游片段 853 1006
SV40启动子 1007 1350
NanoLuc 1357 1872
SV40聚(A) 1873 1994
下游VP1片段 1995 2202
发夹区 2206 2272
CAV-ΔPromΔORFΔ3NCR 2320 2641
CAV重复区 2463 2579
pUC起点 2773 3446
AmpR基因 3591 4550
下表17中列出了另外的示例性CAV基因组序列，其中包含的序列或子序列可用于本文所述的组合物和方法中(例如，以形成CA载体的遗传元件，作为用于产生CA载体的遗传元件构建体的一部分，或作为串联构建体中的遗传元件序列，例如，如本文所述)。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含以下中的一个或多个(例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)：来自表17中所列的CAV基因组序列的5'UTR、重复区、CAAT信号、TATA盒、VP2编码性序列、凋亡蛋白编码性序列、VP1编码性序列、3'UTR、GC富集区或聚A信号序列或与其具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含编码多肽的核酸序列，该多肽与表17中所列的CAV基因组序列编码的VP1分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含编码多肽的核酸序列，该多肽与表17中所列的CAV基因组序列编码的VP2分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件包含编码多肽的核酸序列，该多肽与表17中所列的CAV基因组序列编码的凋亡蛋白分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件不包含编码以下多肽的核酸序列，该多肽与表17中所列的CAV基因组序列编码的VP1分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件不包含编码以下多肽的核酸序列，该多肽与表17中所列的CAV基因组序列编码的VP2分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，CA载体包含遗传元件，该遗传元件不包含编码以下多肽的核酸序列，该多肽与表17中所列的CAV基因组序列编码的凋亡蛋白分子具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
表17.示例性野生型CAV分离株的列表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
VP1分子
在一些实施例中，CA载体包含含有CAV VP1分子的蛋白质性外部。一般而言，VP1分子包括具有CAV VP1蛋白(例如，如本文所述的CAV VP1蛋白)的结构特征和/或活性的多肽。在一些实施例中，VP1分子包含相对于CAV VP1蛋白(例如，如本文所述的CAV VP1蛋白)的截短。VP1分子可能能够与其他VP1分子结合，例如，以形成蛋白质性外部(例如，如本文所述的蛋白质性外部)，例如，衣壳。在一些实施例中，蛋白质性外部可以包封核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)。在一些实施例中，多个VP1分子可形成多聚体，例如以形成蛋白质性外部。在一些实施例中，多聚体可以是同型多聚体。在其他实施例中，多聚体可以是异型多聚体。
在一些实施例中，VP1分子可以包含以下中的一个或多个：精氨酸富集区，例如，具有至少60％碱性残基(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％碱性残基；例如，60％-90％、60％-80％、70％-90％或70％-80％碱性残基)的区和胶冻卷结构域。
精氨酸富集区
精氨酸富集区与本文所述的精氨酸富集区序列或者包含至少60％、70％或80％碱性残基(例如，精氨酸、赖氨酸或其组合)的至少约40个氨基酸的序列具有至少70％(例如，至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。
胶冻卷结构域
胶冻卷结构域或区包含(例如，由其组成)具有以下特征中一种或多种(例如，1、2或3种)的多肽(例如，较大多肽中包含的结构域或区)：
(i)胶冻卷结构域的至少30％(例如，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或更多)的氨基酸是一个或多个β-折叠的部分；
(ii)胶冻卷结构域的二级结构包含至少四个(例如，至少4、5、6、7、8、9、10、11或12个)个β-链；和/或
(iii)胶冻卷结构域的三级结构包含至少两个(例如，至少2、3或4个)β-折叠；和/或
(iv)胶冻卷结构域包含β-折叠与α-螺旋的比例为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在某些实施例中，胶冻卷结构域包含两个β-折叠。
在某些实施例中，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)β-折叠包含约八个(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12个)β-链。在某些实施例中，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)β-折叠包含八个β-链。在某些实施例中，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)β-折叠包含七个β-链。在某些实施例中，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)β-折叠包含六个β-链。在某些实施例中，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)β-折叠包含五个β-链。在某些实施例中，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)β-折叠包含四个β-链。
在一些实施例中，胶冻卷结构域包含与第二β-折叠反向平行取向的第一β-折叠。在某些实施例中，第一β-折叠包含约四个(例如，3、4、5或6个)β-链。在某些实施例中，第二β-折叠包含约四个(例如，3、4、5或6个)β-链。在实施例中，第一和第二β-折叠总共包含约八个(例如，6、7、8、9、10、11或12个)β-链。
在某些实施例中，胶冻卷结构域是衣壳蛋白(例如，如本文所述的VP1分子)的组分。在某些实施例中，胶冻卷结构域具有自组装活性。在一些实施例中，包含胶冻卷结构域的多肽与另一拷贝的包含胶冻卷结构域的多肽结合。在一些实施例中，第一多肽的胶冻卷结构域与该多肽的第二拷贝的胶冻卷结构域结合。
示例性VP1序列
示例性CAV VP1氨基酸序列和示例性VP1结构域的序列包括但不限于由表1-17中所列的VP1核酸序列编码的序列。在一些实施例中，本文所述的多肽(例如，VP1分子)包含与一个或多个CAV VP1分子(例如，如表1-17中任一个所述的)或其功能片段具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的CA载体包含VP1分子，该VP1分子包含与一个或多个CAV VP1分子(例如，如表1-17中任一个所述)的精氨酸富集区具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的CA载体包含VP1分子，该VP1分子包含与一个或多个CAV VP1分子(例如，如表1-17中任一个所述)的胶冻卷结构域具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的CA载体包含编码VP1分子的核酸分子(例如，遗传元件)，该VP1分子包含与一个或多个CAV VP1分子(例如，如表1-17中任一个所述)或其功能片具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，一个或多个CAV VP1子序列包含以下中的一个或多个：精氨酸(Arg)富集结构域和/或胶冻卷结构域(例如，如表1-17中任一个所列)，或与其具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，VP1分子包含来自不同CAV的多个子序列(例如，选自本文任何表中所列的CAV子序列的VP1子序列的任何组合，如精氨酸富集区序列和/或胶冻卷结构域序列)。
在一些实施例中，VP1分子包含相对于野生型VP1蛋白(例如，如本文所述(例如，如表1A、1B或17中所列))的至少一个差异(例如，突变、化学修饰或表观遗传改变)。
遗传元件
在一些实施例中，CA载体包含遗传元件(例如，包封在蛋白质性外部(例如，包含CAV衣壳蛋白，例如VP1分子)中的遗传元件)。在一些实施例中，遗传元件具有以下特征中的一种或多种：基本上不与宿主细胞的基因组整合，是附加型核酸，是单链DNA，是环状的，为约1至10kb，存在于细胞核内，可以由内源蛋白质结合，产生和/或编码效应物，例如靶向宿主或靶细胞的基因、或活动或功能的多肽或核酸(例如，RNA、iRNA、微RNA)。在一个实施例中，遗传元件是基本上非整合的DNA。在一些实施例中，遗传元件包含包装信号，例如本文所述的蛋白质结合序列，例如结合衣壳蛋白的序列。在一些实施例中，包装信号包含SEQ IDNO:17的核酸序列。在一些实施例中，在包装或衣壳结合序列之外，遗传元件与野生型CAV核酸序列具有小于70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％序列同一性，例如，与CAV核酸序列(例如，如本文所述(例如表1-17中任一个所述))具有小于70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％序列同一性。在一些实施例中，在包装或衣壳结合序列之外，遗传元件具有与CAV核酸序列至少70％、75％、80％、8％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的少于500、450、400、350、300、250、200、150或100个连续核苷酸。在某些实施例中，遗传元件是包含启动子序列、编码治疗性效应物和衣壳结合蛋白的序列的环状单链DNA。
在一些实施例中，遗传元件的长度小于20kb(例如，小于约19kb、18kb、17kb、16kb、15kb、14kb、13kb、12kb、11kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb或更小)。在一些实施例中，独立地或附加地，遗传元件的长度大于1000b(例如，至少约1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.5kb-4.6kb、2.8kb-4.0kb、3.0kb-3.8kb或3.2kb-3.7kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约1.5kb-2.0kb、1.5kb-2.5kb、1.5kb-3.0kb、1.5kb-3.5kb、1.5kb-3.8kb、1.5kb-3.9kb、1.5kb-4.0kb、1.5kb-4.5kb或1.5kb-5.0kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.0kb-2.5kb、2.0kb-3.0kb、2.0kb-3.5kb、2.0kb-3.8kb、2.0kb-3.9kb、2.0kb-4.0kb、2.0kb-4.5kb或2.0kb-5.0kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.5kb-3.0kb、2.5kb-3.5kb、2.5kb-3.8kb、2.5kb-3.9kb、2.5kb-4.0kb、2.5kb-4.5kb或2.5kb-5.0kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约3.0kb-5.0kb、3.5kb-5.0kb、4.0kb-5.0kb或4.5kb-5.0kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约1.5kb-2.0kb、2.0kb-2.5kb、2.5kb-3.0kb、3.0kb-3.5kb、3.1kb-3.6kb、3.2kb-3.7kb、3.3kb-3.8kb、3.4kb-3.9kb、3.5kb-4.0kb、4.0kb-4.5kb或4.5kb-5.0kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约3.6-3.9kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.8-2.9kb。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.0-3.2kb。
在一些实施例中，遗传元件包含本文所述的一种或多种特征，例如，编码基本上非致病性蛋白的序列、蛋白结合序列、编码调节性核酸的一个或多个序列、一个或多个调节性序列、编码复制蛋白的一个或多个序列，以及其他序列。
在实施例中，遗传元件是由双链环状DNA产生的(例如，通过体外环化产生)。在一些实施例中，遗传元件是由双链环状DNA通过滚环式复制产生的。在实施例中，滚环复制发生在细胞(例如，宿主细胞，例如，鸟类细胞(例如，MDCC细胞)或哺乳动物细胞，例如，人细胞，例如，HEK293T细胞、A549细胞或Jurkat细胞)中。在实施例中，遗传元件可以在细胞中通过滚环式复制进行指数扩增。在实施例中，遗传元件可以在细胞中通过滚环式复制进行线性扩增。在实施例中，双链环状DNA或遗传元件能够在细胞中通过滚环式复制产生原始数量的至少2、4、8、16、32、64、128、256、518、1024倍或更多倍。在实施例中，将双链环状DNA引入细胞，例如，如本文所述的细胞中。
在一些实施例中，双链环状DNA和/或遗传元件不包含一个或多个细菌质粒元件(例如细菌复制起点或选择性标志，例如细菌抗性基因，例如氨苄青霉素抗性基因)。在一些实施例中，双链环状DNA和/或遗传元件不包含细菌质粒主链。
在一个实施例中，本发明包括遗传元件，该遗传元件包含编码(i)基本上非致病性外壳蛋白，(ii)使该遗传元件结合至该基本上非致病性外壳蛋白的外壳蛋白结合序列，以及(iii)调节性核酸的核酸序列(例如，DNA序列)。在这样的实施例中，遗传元件可包含一个或多个与天然病毒序列(例如，天然CAV序列，例如，如本文所述)的任一个核苷酸序列具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的序列。
蛋白结合序列
许多病毒采用的策略是病毒衣壳蛋白识别其基因组中的特定蛋白结合序列。例如，在具有不分节段基因组的病毒(例如酵母的L-A病毒)中，在基因组的5'端存在二级结构(茎环)和特异性序列，它们都用于结合病毒衣壳蛋白。然而，具有分节段基因组的病毒，如呼肠孤病毒科(Reoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(流感病毒)、布尼亚病毒(Bunyaviruses)和沙粒病毒(Arenaviruses)，需要包装每个基因组节段。一些病毒利用节段的互补区来协助病毒包括每个基因组分子中的一个。其他病毒对于每个不同的节段都具有特定的结合位点。例如，参见Curr Opin Struct Biol.[当代结构生物学观点]2010年2月；20(1):114-120；和Journal of Virology[病毒学杂志](2003),77(24),13036-13041。
在一些实施例中，遗传元件编码蛋白质结合序列，其结合包含在蛋白质性外部(例如衣壳蛋白，例如CAV VP1分子)中的蛋白质。在一些实施例中，蛋白结合序列有助于将遗传元件包装到蛋白质性外部中。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合包含在蛋白质性外部中的蛋白质的精氨酸富集区。在一些实施例中，遗传元件包含具有核酸序列AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCC CCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATA AACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(SEQ ID NO:17)或其反向互补序列的蛋白结合序列。在一些实施例中，遗传元件包含与CAV序列的5’UTR、3’UTR或GC富集结构域(例如，如本文所述(例如表1-17中任一个所述))具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白结合序列。
5’UTR区
在一些实施例中，如本文所述的核酸分子(例如，遗传元件、遗传元件构建体或遗传元件区)包含5’UTR序列(例如，如本文所述(例如，表1-16中任一个所述，或表17中所列的CAV基因组的5’UTR))或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在实施例中，5’UTR序列包含表1A中所列的5’UTR的核酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，核酸分子包含与表1A中所列的5’UTR具有至少95％序列同一性的核酸序列。在实施例中，5’UTR序列包含表1B中所列的5’UTR的核酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，核酸分子包含与表1B中所列的5’UTR具有至少95％序列同一性的核酸序列。在实施例中，5’UTR序列包含表17中所列的CAV基因组的5'UTR的核酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，核酸分子包含与表17中所列的CAV基因组的5'UTR具有至少95％序列同一性的核酸序列。
GC富集区
在一些实施例中，本文所述的遗传元件或遗传元件构建体包含GC含量为至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列(例如，长度为10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150或150-200个核苷酸的连续序列)。在实施例中，遗传元件或遗传元件构建体包含核酸序列(例如，长度为10-20个、20-30个、30-40个、40-50个、50-60个、60-70个、70-80个、80-90个、90-100个、100-150个或150-200个核苷酸的连续序列)，该核酸序列与本文所述的CAV基因组的GC富集序列(例如，在表1A或1B中，或如表17中所列)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。在一些实施例中，GC富集区形成发夹。
效应物
在一些实施例中，遗传元件可包括一个或多个编码效应物的序列，这些效应物是例如，功能性效应物，例如内源效应物或外源效应物，例如治疗性效应物。在一些实施例中，效应物是多肽或核酸。在一些实施例中，效应物具有以下特性中的一个或多个：(i)为在人细胞中表达而经过密码子优化，(ii)是人多肽或核酸，(iii)结合人多肽或核酸，或(iv)在人细胞中具有活性，例如，调节(例如，增加或减少)人细胞中人基因的活性和/或水平)。
效应物可以调节生物活性，例如增加或降低酶活性、基因表达、细胞信号传导以及细胞或器官功能。效应物活性还可包括结合调节性蛋白以调节调节子的活性，例如转录或翻译。效应物活性还可以包括激活或抑制功能。例如，效应物可以诱导酶活性。在一些实施例中，效应物包括酶。在一些实施例中，外源效应物包含来自感染性病原体(例如，病毒或细菌)的抗原。在一些实施例中，效应物是细胞毒性或细胞溶解性RNA或蛋白质。在一些实施例中，功能性核酸是非编码RNA。在一些实施例中，功能性核酸是编码RNA。在一些实施例中，效应物触发酶中增加的底物亲和力，例如，果糖2,6-二磷酸激活磷酸果糖激酶1并增加糖酵解响应于胰岛素的速率。在另一实例中，效应物可以抑制底物与受体的结合并抑制其激活，例如，纳曲酮和纳洛酮结合阿片受体而不激活它们，并阻断受体结合阿片类物质的能力。效应物活性还可以包括调节蛋白质的稳定性/降解和/或转录本的稳定性/降解。例如，多肽辅因子(即泛素)可以将蛋白质定向到蛋白质上用于降解，从而标志它们进行降解。在另一实例中，效应物通过阻断酶的活性位点来抑制酶活性，例如，甲氨蝶呤是四氢叶酸(一种二氢叶酸还原酶的辅酶)的结构类似物，其与二氢叶酸还原酶的结合力比天然底物高1000倍，并抑制核苷酸碱基合成。
在一些实施例中，编码效应物的序列是遗传元件的一部分，例如，它可以在如本文所述的插入位点处插入。在实施例中，在非编码区处将编码效应物的序列插入遗传元件中，例如，位于开放阅读框的3'和遗传元件的GC富集区的5'的非编码区，在TATA盒上游的5'非编码区中，在5’UTR中，在多A信号下游或GC富集区上游的3'非编码区中。在一些实施例中，编码效应物的序列替代部分或全部开放阅读框(例如，如本文所述的ORF，例如CAV VP1、VP2和/或凋亡蛋白)。
在一些实施例中，编码效应物的序列包括100-2000、100-1000、100-500、100-200、200-2000、200-1000、200-500、500-1000、500-2000或1000-2000个核苷酸。在一些实施例中，编码效应物的序列包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个核苷酸。在一些实施例中，效应物是核酸或蛋白有效载荷，例如，如本文所述的核酸或蛋白有效载荷。
调节性核酸
在一些实施例中，效应物是调节性核酸。调节性核酸修饰内源基因和/或外源基因的表达。在一个实施例中，调节性核酸靶向宿主基因。调节性核酸可包括但不限于与内源基因杂交的核酸(例如，如本文别处所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA)、与外源核酸(例如病毒DNA或RNA)杂交的核酸、与RNA杂交的核酸、干扰基因转录的核酸、干扰RNA翻译的核酸、稳定RNA或去稳定RNA的核酸(例如通过靶向降解的方式)，以及调节DNA或RNA结合因子的核酸。在实施例中，调节性核酸编码miRNA。在一些实施例中，针对野生型CAV而言，调节性核酸是内源的。在一些实施例中，针对野生型CAV而言，调节性核酸是外源的。
在一些实施例中，调节性核酸包含通常含有5-500个碱基对的RNA或RNA样结构(取决于特定的RNA结构，例如miRNA 5-30bp、lncRNA200-500bp)并且可以具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列或编码细胞内表达的靶基因的序列相同(或互补)或几乎相同(或基本上互补)的核碱基序列。
在一些实施例中，调节性核酸包含核酸序列，例如，指导RNA(gRNA)。在一些实施例中，DNA靶向部分包含指导RNA或编码指导RNA的核酸。gRNA，即一种短的合成RNA，可以由结合不完整效应部分所必需的“支架”序列和用户定义的用于基因组靶标的约20个核苷酸靶向序列组成。在实践中，通常将指导RNA序列设计为具有17-24个核苷酸(例如，19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制gRNA生成器和算法可通过商业途径获得，用于设计有效的指导RNA。使用嵌合性“单指导RNA”(“sgRNA”)也可以实现基因编辑，这是一种工程化(合成)的单一RNA分子，模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物，并同时含有tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶引导至被靶向序列进行编辑)。人们也已证明，在基因组编辑中，经化学修饰的sgRNA是有效的；参见，例如，Hendel等人(2015)Nature Biotechnol.[自然-生物技术],985-991。
调节性核酸包含识别特定DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)的gRNA。
某些调节性核酸可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。RNAi分子包含RNA或RNA样结构，其通常含有15-50个碱基对(如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、局部双链体(meroduplex)和dicer底物(美国专利号8,084,599、8,349,809和8,513,207)。
长非编码RNA(lncRNA)被定义为长于100个核苷酸的非蛋白质编码转录物。这种有些武断的限制将lncRNA与小型调节性RNA(例如微RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)及其他短RNA)区分开来。通常，大多数(约78％)的lncRNA的特征为组织特异性的。以与附近蛋白质编码基因相反的方向转录的发散lncRNA(占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％大比例)可能会调节附近基因的转录。
遗传元件可以编码具有与内源基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或片段基本上互补或完全互补的序列的调节性核酸。调节性核酸可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新生成的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特定基因互补的调节性核酸可与该基因的mRNA杂交并阻止其翻译。反义调节性核酸可以是DNA、RNA或其衍生物或杂合体。
与感兴趣的转录物杂交的调节性核酸的长度可以在5至30个核苷酸之间，在约10至30个核苷酸之间，或约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。调节性核酸与靶向转录物的同一性程度应为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
遗传元件可以编码调节性核酸，例如与靶基因的约5至约25个连续核苷酸相同的微小RNA(miRNA)分子。在一些实施例中，miRNA序列靶向mRNA并从二核苷酸AA开始，其GC含量为约30％-70％(约30％-60％、约40％-60％或约45％-55％)，并且例如，如通过标准BLAST搜索所确定的，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶标以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。
siRNA和shRNA类似于内源微RNA(miRNA)基因的处理途径中的中间体(Bartel,Cell[细胞]116:281-297,2004)。在一些实施例中，siRNA可以用作miRNA，反之亦然(Zeng等人,Mol Cell[分子细胞学]9:1327-1333,2002；Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。像siRNA一样，微RNA使用RISC来下调靶基因，但与siRNA不同，大多数动物性miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或多A(多腺苷酸)去除和mRNA降解降低蛋白质输出(Wu等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]103:4034-4039,2006)。已知的miRNA结合位点位于mRNA3’UTR内；miRNA似乎靶向与miRNA5'端的2-8个核苷酸几乎完全互补的位点(Rajewsky,Nat Genet[自然-遗传学]38增刊:S8-13,2006；Lim等人,Nature[自然]433:769-773,2005)。此区被称为种子区。由于siRNA和miRNA是可互换的，因此外源siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat Methods[自然-方法]3:199-204,2006。3'UTR内的多个靶位点会产生更强的下调(Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，这些组织如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial Sloan KetteringCancer Center)和欧洲分子生物学实验室(European Molecule Biology Laboratory)等。已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计及产生。另外，有一些计算工具可以增加找到有效和特异性序列基序的机会(Lagana等人,Methods Mol.Bio.[分子生物学方法],2015,1269:393-412)。
调节性核酸可以调节基因编码的RNA的表达。因为多个基因可以彼此共有一定程度的序列同源性，所以在一些实施例中，可以将调节性核酸设计为靶向具有足够序列同源性的一类基因。在一些实施例中，调节性核酸可含有与在不同基因靶之间共享的序列互补的或特定基因靶所特有的序列。在一些实施例中，可以将调节性核酸设计为靶向在几个基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，从而靶向基因家族中的几个基因(例如，不同的基因同工型、剪接变体、突变基因等)。在一些实施例中，可以将调节性核酸设计为靶向单一基因的特定RNA序列所特有的序列。
在一些实施例中，遗传元件可以包括一个或多个编码调节一个或多个基因表达的调节性核酸的序列。
在一个实施例中，将本文别处描述的gRNA用作CRISPR系统的一部分，用于基因编辑。出于基因编辑的目的，可以将CA载体设计为包括一个或多个与所期望的靶DNA序列相对应的指导RNA序列；参见，例如，Cong等人(2013)Science[科学],339:819–823；Ran等人(2013)Nature Protocols[自然-实验室指南],8:2281-2308。gRNA序列的至少约16或17个核苷酸通常允许Cas9介导的DNA裂解发生；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸来实现可检测的DNA裂解。
治疗性效应物(例如，肽或多肽)
在一些实施例中，遗传元件包含治疗性表达序列，例如编码治疗性肽或多肽的序列。在一些实施例中，遗传元件包括编码蛋白质，例如治疗性蛋白质的序列。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于激素、细胞因子、酶、抗体(例如，一种或多种编码至少重链或轻链的多肽)、转录因子、受体(例如，膜受体)、配体、膜转运蛋白、分泌型蛋白质、肽、载体蛋白、结构蛋白、核酸酶或其组分。
在一些实施例中，遗传元件包括编码肽，例如治疗性肽的序列。肽可以是直链或支链的。肽的长度为约5至约500个氨基酸、约15至约400个氨基酸、约20至约325个氨基酸、约25至约250个氨基酸、约50至约200个氨基酸或其间的任何范围。肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标志、抗原、肽治疗剂、天然生物活性肽的合成肽或肽类似物、激动肽或拮抗肽、抗微生物肽、靶向肽或细胞毒性肽、降解肽或自毁肽、以及多种降解肽或自毁肽。本文所述的可用于本发明的肽还包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:bigopportunities for small antibodies.[作为治疗剂的纳米抗体：小分子抗体的巨大机会]Drug Discov Today[当代药物发现]:21(7):1076-113)。这样的抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原或细胞器内抗原。
在一些实施例中，遗传元件包含编码小肽、肽模拟物(例如类肽)、氨基酸和氨基酸类似物的序列。这样的治疗剂通常具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量以及这样的化合物的盐类、酯类和其他药学上可接受的形式。这样的治疗剂可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。
在一些实施例中，本文所述的组合物或CA载体包括与能够靶向特定位置、组织或细胞的配体连接的多肽。
在一些实施例中，由治疗性表达序列编码的多肽可以是上述任一种的功能性变体或其片段，例如，与本文表中通过参考其UniProt ID披露的蛋白序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
在一些实施例中，治疗性表达序列可以编码结合上述任一种的抗体或抗体片段，例如，针对蛋白质的抗体，该蛋白质与本文表中通过参考其UniProt ID披露的蛋白序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性。本文中的术语“抗体”在最广义上使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所期望的抗原结合活性。“抗体片段”是指包含至少一条重链或轻链并结合抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
示例性细胞内多肽效应物
在一些实施例中，效应物包含胞质多肽或胞质肽。在一些实施例中，包含胞质肽的效应物是DPP-4抑制剂、GLP-1信号传导激活剂或中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂。在一些实施例中，效应物提高生长因子或其受体(例如FGF受体，例如FGFR3)的水平或活性。在一些实施例中，效应物包含n-myc相互作用蛋白活性的抑制剂(例如，n-myc相互作用蛋白抑制剂)；EGFR活性的抑制剂(例如，EGFR抑制剂)；IDH1和/或IDH2活性的抑制剂(例如，IDH1抑制剂和/或IDH2抑制剂)；LRP5和/或DKK2活性的抑制剂(例如，LRP5和/或DKK2抑制剂)；KRAS活性的抑制剂；HTT活性的激活剂；或DPP-4活性的抑制剂(例如DPP-4抑制剂)。
在一些实施例中，效应物包含调节性细胞内多肽。在一些实施例中，调节性细胞内多肽结合对靶细胞而言内源的一种或多种分子(例如，蛋白质或核酸)。在一些实施例中，调节性细胞内多肽提高对靶细胞而言内源的一种或多种分子(例如，蛋白质或核酸)的水平或活性。在一些实施例中，调节性细胞内多肽降低对靶细胞而言内源的一种或多种分子(例如，蛋白质或核酸)的水平或活性。
示例性分泌型多肽效应物
示例性的分泌型治疗剂在本文中描述，例如在下表中。
表18A.示例性细胞因子和细胞因子受体
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在一些实施例中，本文所述的效应物包括表18A的细胞因子或其功能性变体，例如，其同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)或片段。在一些实施例中，本文所述的效应物包括与表50中通过参考其UniProt ID列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体与相应细胞因子受体结合，在相同条件下，对于相同受体，其Kd比相应野生型细胞因子的Kd高或低不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，效应物包括融合蛋白，该融合蛋白包含第一区(例如，表18A的细胞因子多肽或者功能性变体或片段)和第二异源区。在一些实施例中，第一区是表18A的第一细胞因子多肽。在一些实施例中，第二区是表18A的第二细胞因子多肽，其中该第一和第二细胞因子多肽在野生型细胞中彼此形成细胞因子异二聚体。在一些实施例中，表18A的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如，对于效应物而言内源的信号序列，或异源信号序列。在一些实施例中，编码表18A的细胞因子或其功能性变体的CA载体用于治疗本文所述的疾病或障碍。
在一些实施例中，本文所述的效应物包含与表18A的细胞因子结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，本文所述的效应物包含与表18A的细胞因子受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
示例性细胞因子和细胞因子受体在以下文献中描述：例如，Akdis等人,“Interleukins(from IL-1to IL-38),interferons,transforming growth factorβ,andTNF-α:Receptors,functions,and roles in diseases[白细胞介素(从IL-1到IL-38)、干扰素、转化生长因子β和TNF-α：受体、功能和在疾病中的作用]”,2016年10月,第138卷,第4期,第984-1010页，该文献通过引用以其整体并入本文，包括其中的表I。
表18B.示例性多肽激素和受体
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在一些实施例中，本文所述的效应物包括表18B的激素或其功能性变体，例如，其同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)或片段。在一些实施例中，本文所述的效应物包括与表51中通过参考其UniProt ID列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体与相应受体结合，在相同条件下，对于相同受体，其Kd比相应野生型激素的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表18B的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如，对于效应物而言内源的信号序列，或异源信号序列。在一些实施例中，编码表18B的激素或其功能性变体的CA载体用于治疗本文所述的疾病或障碍。
在一些实施例中，本文所述的效应物包含与表18B的激素结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，本文所述的效应物包含与表18B的激素受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表18C.示例性生长因子
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在一些实施例中，本文所述的效应物包括表18C的生长因子或其功能性变体，例如，其同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)或片段。在一些实施例中，本文所述的效应物包括与表52中通过参考其UniProt ID列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体与相应受体结合，在相同条件下，对于相同受体，其Kd比相应野生型生长因子的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表18C的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如，对于效应物而言内源的信号序列，或异源信号序列。在一些实施例中，编码表18C的生长因子或其功能性变体的CA载体用于治疗本文所述的疾病或障碍。
在一些实施例中，本文所述的效应物包含与表18C的生长因子结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，本文所述的效应物包含与表18C的生长因子受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
示例性生长因子和生长因子受体在以下文献中描述：例如，Bafico等人,“Classification of Growth Factors and Their Receptors[生长因子及其受体的分类]”Holland-Frei Cancer Medicine.[Holland-Frei癌症医学]第6版，该文献通过引用以其全文并入本文。
表18D.凝血相关因子
在一些实施例中，本文所述的效应物包括表18D的多肽或其功能性变体，例如其同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)或片段。在一些实施例中，本文所述的效应物包括与表53中通过参考其UniProt ID列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体催化与相应野生型蛋白质相同的反应，例如，催化速率比野生型蛋白低不少于10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表18D的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如，对于效应物而言内源的信号序列，或异源信号序列。在一些实施例中，编码表18D的多肽或其功能性变体的CA载体用于治疗表18D的疾病或障碍。
示例性蛋白质替代治疗剂
本文例如在下表中描述了示例性蛋白质替代治疗剂。
表19A.示例性酶促效应物和相应适应症
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在一些实施例中，本文所述的效应物包括表19A的酶或其功能性变体，例如其同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)或片段。在一些实施例中，本文所述的效应物包括与表54中通过参考其UniProt ID列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体催化与相应野生型蛋白质相同的反应，例如，催化速率比野生型蛋白低不少于10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，编码表19A的酶或其功能性变体的CA载体用于治疗表19A的疾病或障碍。在一些实施例中，CA载体用于将尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶或其功能性变体递送至靶细胞，例如肝细胞。在一些实施例中，CA载体用于将OCA1或其功能性变体递送至靶细胞，例如视网膜细胞。
表19B.示例性非酶效应物和相应适应症
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在一些实施例中，本文所述的效应物包括促红细胞生成素(EPO)，例如人促红细胞生成素(hEPO)或其功能性变体。在一些实施例中，编码促红细胞生成素或其功能性变体的CA载体用于刺激红细胞生成。在一些实施例中，编码促红细胞生成素或其功能性变体的CA载体用于治疗疾病或障碍，例如贫血。在一些实施例中，使用CA载体将EPO或其功能性变体递送至靶细胞，例如红细胞。
在一些实施例中，本文所述的效应物包括表19B的多肽或其功能性变体，例如其同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)或片段。在一些实施例中，本文所述的效应物包括与表55中通过参考其UniProt ID列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，编码表19B的多肽或其功能性变体的CA载体用于治疗表19B的疾病或障碍。在一些实施例中，CA载体用于将SMN或其功能性变体递送至靶细胞，例如，脊髓和/或运动神经元的细胞。在一些实施例中，使用CA载体将微小抗肌萎缩蛋白递送至靶细胞，例如，肌细胞。
示例性微型抗肌营养不良蛋白在以下文献中描述：Duan,“Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.[系统性AAV微型抗肌营养不良蛋白基因疗法用于治疗杜氏肌营养不良症]”Mol Ther.[分子疗法]2018年10月3日；26(10):2337-2356.doi:10.1016/j.ymthe.2018.07.011.电子公开于2018年7月17日。
在一些实施例中，本文所述的效应物包含凝血因子，例如本文的任何表(例如，表19A或19B)中所列的凝血因子。在一些实施例中，本文所述的效应物包括蛋白质，该蛋白质在发生突变时会导致溶酶体贮积症，例如本文的任何表(例如，表19A或19B)中所列的蛋白质。在一些实施例中，本文所述的效应物包括转运蛋白，例如本文的任何表(例如，表19A或19B)中所列的转运蛋白。
在一些实施例中，野生型蛋白的功能性变体包括具有野生型蛋白的一种或多种活性的蛋白质，例如，功能性变体催化与相应野生型蛋白相同的反应，例如，其催化速率比野生型蛋白低不少于10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，功能性变体与野生型蛋白结合的相同结合配偶体结合，例如，在相同条件下，对于相同的结合配偶体，其Kd比相应野生型蛋白的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，功能性变体具有与野生型多肽的多肽序列存在至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。在一些实施例中，功能性变体包括相应野生型蛋白的同源物(例如直系同源物或旁系同源物)。在一些实施例中，功能性变体是融合蛋白。在一些实施例中，融合体包含与相应野生型蛋白具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第一区，和第二异源区。在一些实施例中，功能性变体包含相应野生型蛋白的片段或由其组成。
再生因子、修复因子和纤维化因子
本文所述的治疗性多肽还包括生长因子(例如，如在表56中所披露的)或者其功能性变体，例如，与表56中通过参考其UniProt ID所披露的蛋白序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。还包括针对这样的生长因子的抗体或其片段，或者促进再生及修复的miRNA。
表56.示例性再生因子、修复因子和纤维化因子
转化因子
本文所述的治疗性多肽还包括转化因子，例如，将成纤维细胞转化为分化细胞的蛋白质因子，例如，表57中披露的因子或其功能性变体，例如，与表57中通过参考其UniProtID所披露的蛋白序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
表57.示例性转化因子
刺激细胞再生的蛋白质
本文所述的治疗性多肽还包括刺激细胞再生的蛋白质，例如，表58中披露的蛋白质或其功能性变体，例如，与表58中通过参考其UniProt ID所披露的蛋白序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
表58.示例性的刺激细胞再生的蛋白质
STING调节效应物
在一些实施例中，本文所述的分泌型效应物调节STING/cGAS信号传导。在一些实施例中，STING调节剂是多肽，例如病毒多肽或其功能性变体。例如，效应物可以包含以下文献中描述的STING调节剂(例如，抑制剂)：Maringer等人“Message in a bottle:lessonslearned from antagonism of STING signalling during RNA virus infection[瓶中信息：从RNA病毒感染期间STING信号传导的拮抗中学到的经验教训]”Cytokine&GrowthFactor Reviews[细胞因子与生长因子评论],第25卷,第6期,2014年12月,第669-679页，该文献通过引用以其全文并入本文。另外的STING调节剂(例如，活化剂)在以下文献中描述：Wang等人“STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptidevaccines in melanoma-bearing mice.[STING活化剂c-di-GMP增强肽疫苗对携带黑色素瘤的小鼠的抗肿瘤作用]”Cancer Immunol Immunother.[癌症免疫学与免疫疗法]2015年8月；64(8):1057-66.doi:10.1007/s00262-015-1713-5.电子公开于2015年5月19日；Bose“cGAS/STING Pathway in Cancer:Jekyll and Hyde Story of Cancer Immune Response[癌症中的cGAS/STING通路：Jekyll和Hyde癌症免疫响应的故事]”Int J Mol Sci.[国际分子科学杂志]2017年11月；18(11):2456；以及Fu等人“STING agonist formulated cancervaccines can cure established tumors resistant to PD-1blockade[STING激动剂配制的癌症疫苗可以治愈对PD-1阻断有抵抗力的既定肿瘤]”Sci Transl Med.[科学转化医学杂志]2015年4月15日；7(283):283ra52，其中的每一个通过引用以其全文并入本文。
肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标志、抗原、肽治疗剂、天然生物活性肽的合成肽或肽类似物、激动肽或拮抗肽、抗微生物肽、靶向肽或细胞毒性肽、降解肽或自毁肽、以及多种降解肽或自毁肽。本文所述的可用于本发明的肽还包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[作为治疗剂的纳米抗体：小分子抗体的巨大机会]Drug Discov Today[当代药物发现]:21(7):1076-113)。这样的抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原或细胞器内抗原。
在一些实施例中，遗传元件包含编码小肽、肽模拟物(例如类肽)、氨基酸和氨基酸类似物的序列。这样的治疗剂通常具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量以及这样的化合物的盐类、酯类和其他药学上可接受的形式。这样的治疗剂可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。
在一些实施例中，本文所述的组合物或CA载体包括与能够靶向特定位置、组织或细胞的配体连接的多肽。
基因编辑组分
CA载体的遗传元件可以包括一个或多个编码基因编辑系统的组分的基因。示例性基因编辑系统包括成簇调节性间隔短回文重复(CRISPR)系统、锌指核酸酶(ZFN)、基因编写器(Gene Writer)、逆转录酶、表观遗传修饰剂、重组酶和基于转录激活子样效应物的核酸酶(TALEN)。基于ZFN、TALEN和CRISPR的方法已在例如在Gaj等人Trends Biotechnol.[生物技术动向]31.7(2013):397-405中描述；CRISPR基因编辑方法例如在Guan等人,Application of CRISPR-Cas systemin gene therapy:Pre-clinical progress inanimal model.[CRISPR-Cas系统在基因治疗中的应用：动物模型中的临床前进展]DNARepair[DNA修复]2016年10月；46:1-8.doi:10.1016/J.dnarep.2016.07.004；Zheng等人,Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 systemin humancells[使用CRISPR/Cas9系统在人细胞中进行精确基因缺失和替换].BioTechniques[生物技术],第57卷,第3号,2014年9月,第115–124页中描述。基因编辑和基因编写系统的非限制性实例在例如PCT公开号WO 2020/047124(例如，其中公开的任何序列)和Anzalone等人2019,Nature[自然]576:149-157中有所描述(其中的每一个通过引用以其全文并入本文)。
在一些实施例中，遗传元件包含编码基因编写器的序列，例如，包含来自非长末端重复序列(LTR)逆转录转座子(例如，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE)型或限制酶样核酸内切酶(RLE)型)的一个或多个元件。在一些实施例中，基因编写器包含逆转录转座酶。在一些实施例中，基因编写器包含一个或多个DNA结合结构域、逆转录结构域和/或核酸内切酶结构域。可由本文所述的遗传元件编码的基因编写器、逆转录酶和重组酶的实例描述于例如PCT公开号WO 2020/047124(通过引用以其全文并入本文)中。
CRISPR系统是最初在细菌和古细菌中发现的自适应防御系统。CRISPR系统使用称为CRISPR相关或“Cas”核酸内切酶的RNA引导性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)来切割外来DNA。在典型的CRISPR/Cas系统中，核酸内切酶通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性、非编码“指导RNA”定向到靶核苷酸序列(例如，基因组中要进行序列编辑的位点)。已经鉴定了三类(I-III)CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单个Cas核酸内切酶(而不是多个Cas蛋白)。一种II类CRISPR系统包括II型Cas核酸内切酶，例如Cas9、CRISPR RNA(“crRNA”)和反式激活crRNA(“tracrRNA”)。crRNA含有“指导RNA”，即通常对应于靶DNA序列的约20个核苷酸的RNA序列。crRNA还含有与tracrRNA结合的区，以形成被RNA酶III切割的部分双链结构，产生crRNA/tracrRNA杂合体。然后，crRNA/tracrRNA杂合体指导Cas9核酸内切酶识别并切割靶DNA序列。靶DNA序列通常必须邻近针对给定Cas核酸内切酶而言具有特异性的“前间隔序列邻近基序”(“PAM”)；然而，PAM序列似乎遍布整个给定基因组。
在一些实施例中，CA载体包括CRISPR核酸内切酶的基因。例如，从不同原核物种鉴定的一些CRISPR核酸内切酶具有独特的PAM序列要求；PAM序列的实例包括5’-NGG(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、5’-NNAGAA(嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseria meningiditis))。一些核酸内切酶例如Cas9核酸内切酶与富含G的PAM位点例如5'-NGG有关，并在距PAM位点上游(5')3个核苷酸处对靶DNA进行平末端切割。另一个II类CRISPR系统包括V型核酸内切酶Cpf1，它比Cas9小；实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺旋菌属物种(Lachnospiraceaesp.))。Cpf1核酸内切酶与富含T的PAM位点例如5'-TTN相关。Cpf1也可以识别5'-CTA PAM基序。Cpf1通过引入具有4或5个核苷酸的5'突出端的错位或交错的双链断裂来切割靶DNA，例如切割如下靶DNA，该靶DNA中的5个核苷酸的错位或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(3’)18个核苷酸的位置处和距离互补链上的PAM位点下游23个核苷酸的位置处；由这样的错位裂解产生的5个核苷酸突出端使得通过同源重组的DNA插入比在平末端切割的DNA的插入更精确地进行基因组编辑。参见例如，Zetsche等人(2015)Cell[细胞],163:759-771。
在CA载体中可以包括多个CRISPR相关(Cas)基因。基因的具体实例是那些编码来自II类系统的Cas蛋白(包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3)的基因。在一些实施例中，CA载体包括编码Cas蛋白例如Cas9蛋白的基因，该Cas蛋白可以来自多种原核物种中的任一种。在一些实施例中，CA载体包括编码特定Cas蛋白例如特定Cas9蛋白的基因，选择该Cas蛋白以识别特定的前间隔序列邻近基序(PAM)序列。在一些实施例中，CA载体包括编码两种或更多种不同Cas蛋白的核酸，或者可以将两种或更多种Cas蛋白引入细胞、受精卵、胚胎或动物中，例如，以允许识别和修饰包含相同、相似或不同PAM基序的位点。在一些实施例中，CA载体包括编码具有失活核酸酶(例如，核酸酶缺损型Cas9)的修饰型Cas蛋白的基因。
尽管野生型Cas9蛋白在由gRNA靶向的特定DNA序列处产生双链断裂(DSB)，但已知许多具有改进功能的CRISPR核酸内切酶，例如：“切口酶”形式的Cas核酸内切酶(例如，Cas9)仅产生单链断裂；无催化活性的Cas核酸内切酶(例如，Cas9(“dCas9”))不切割靶DNA。可以将编码dCas9的基因与编码效应物结构域的基因融合，以抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa)靶基因的表达。例如，该基因可以编码Cas9与转录沉默子(例如KRAB结构域)或转录激活子的融合体(例如dCas9-VP64融合体)。可以包括编码与FokI核酸酶(“dCas9-FokI”)融合的无催化活性的Cas9(dCas9)的基因，以在与两个gRNA同源的靶序列处产生DSB。参见，例如，在Addgene储存库中披露并可公开获得的众多CRISPR/Cas9质粒(Addgene公司,02139马萨诸塞州剑桥市西德尼街75号550A室(75Sidney St.,Suite 550A,Cambridge,MA02139)；addgene.org/crispr/)。Ran等人(2013)Cell[细胞],154:1380-1389将引入两个独立的双链断裂(每个断裂被独立的指导RNA来指导)的“双切口酶”Cas9描述为实现了更准确的基因组编辑。
在美国专利申请公开2016/0138008A1和US2015/0344912 A1以及美国专利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965和8,906,616中披露了用于编辑真核生物基因的CRISPR技术。在美国专利申请公开2016/0208243A1中披露了Cpf1核酸内切酶和相应的指导RNA和PAM位点。
在一些实施例中，CA载体包含编码本文所述多肽(例如，靶向核酸酶，例如，Cas9，例如，野生型Cas9、切口酶型Cas9(例如Cas9 D10A)、催化失活Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1或C2C3)和gRNA的基因。编码核酸酶和一种或多种gRNA的基因的选择取决于靶向突变是否是核苷酸的缺失、置换或添加，例如，对靶向序列的核苷酸的缺失、置换或添加。编码与(一个或多个)效应物结构域(例如VP64)的全部或一部分(例如，其具有生物活性部分)相连的无催化活性的核酸内切酶(例如，催化失活Cas9(dCas9，例如D10A；H840A))的基因会产生可调节一个或多个靶核酸序列的活性和/或表达的嵌合蛋白。
在一些实施例中，CA载体包括编码dCas9与一个或多个效应物结构域的全部或一部分(例如，全长野生型效应物结构域，或者其片段或变体，例如，其具有生物活性部分)的融合体的基因，以产生可用于本文所述方法的嵌合蛋白。因此，在一些实施例中，CA载体包括编码dCas9-甲基化酶融合体的基因。在其他一些实施例中，CA载体包括编码dCas9酶与位点特异性gRNA的融合体的基因，以靶向内源基因。
在其他方面，CA载体包括编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个与dCas9融合的效应物结构域(全部或具有生物活性部分)的基因。
调节性序列
在一些实施例中，遗传元件包含与编码效应物的序列可操作地连接的调节性序列，例如启动子或增强子。
在一些实施例中，启动子包括与编码表达产物的DNA序列相邻的DNA序列。启动子可以可操作地连接至相邻的DNA序列。与不存在启动子时表达的产物的量相比，启动子通常增加DNA序列表达的产物的量。来自一种生物体的启动子可用于增强来自另一生物体的DNA序列的产物表达。例如，脊椎动物启动子可用于在脊椎动物中表达水母GFP。另外，一个启动子元件可以增加串联连接的多个DNA序列表达的产物的量。因此，一种启动子元件可以增强一种或多种产物的表达。多个启动子元件是本领域普通技术人员众所周知的。
在一个实施例中，期望高水平的组成型表达。这样的启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子/增强子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子(参见，例如，Boshart等人,Cell[细胞],41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
在另一个实施例中，可能期望诱导型启动子。诱导型启动子是由外源添加的化合物调节的启动子，例如，以顺式或反式提供的启动子，包括但不限于锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子；地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；四环素阻遏系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:5547-5551(1992))；四环素诱导系统(Gossen等人,Science[科学],268:1766-1769(1995)；还参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.[当代化学生物学观点],2:512-518(1998))；RU486诱导系统(Wang等人,Nat.Biotech.[自然-生物技术],15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.[基因治疗],4:432-441(1997))；和雷帕霉素诱导系统(Magari等人,J.Clin.Invest.[临床研究杂志],100:2865-2872(1997)；Rivera等人,Nat.Medicine.[自然-医学]2:1028-1032(1996))。可在这种情况下使用的其他类型的诱导型启动子是那些由特定的生理状态(例如温度、急性期或仅在复制细胞中)调节的启动子。
在一些实施例中，使用感兴趣基因或核酸序列的天然启动子。当期望基因或核酸序列的表达应模拟天然表达时，可以使用天然启动子。当基因或其他核酸序列的表达必须在时间或发育上，或者以组织特异性方式或响应于特定转录刺激而受到调节时，可以使用天然启动子。在另一个实施例中，也可以使用其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多腺苷酸化位点或Kozak共有序列来模拟天然表达。
在一些实施例中，遗传元件包含可操作地连接至组织特异性启动子的基因。例如，如果需要在骨骼肌中表达，则可以使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼肌α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌肉型肌酸激酶的基因的启动子，以及活性高于天然存在启动子的合成肌肉启动子。参见Li等人,Nat.Biotech.[自然-生物技术],17:241-245(1999)。已知的具有组织特异性的启动子的实例如下所示：肝白蛋白，Miyatake等人J.Virol.[病毒学杂志],71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,Gene Ther.[基因治疗]3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.[人基因治疗],7:1503-14(1996)，骨骼(骨钙素，Stein等人,Mol.Biol.Rep.[分子生物学报告],24:185-96(1997)；骨唾液酸蛋白，Chen等人,J.Bone Miner.Res.[骨与矿物质研究杂志]11:654-64(1996))，淋巴细胞(CD2，Hansal等人,J.Immunol.[免疫学杂志],161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)，神经元(神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol.[细胞与分子神经生物学],13:503-15(1993)；神经丝蛋白轻链基因，Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],88:5611-5(1991)；神经元特异性vgf基因，Piccioli等人,Neuron[神经元],15:373-84(1995)]；等。
遗传元件可包括增强子，例如与编码基因的DNA序列相邻的DNA序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，或者可以位于编码DNA序列(例如，转录或翻译成一种或多种产物的DNA序列)的下游或之内。因此，增强子元件可位于编码产物的DNA序列上游或下游的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多个碱基对。增强子元件可以增加DNA序列表达的重组产物的量，超出由启动子元件提供的增加的表达。对于本领域普通技术人员而言，多个增强子元件是容易获得的。
在一些实施例中，遗传元件包括位于编码本文所述的表达产物的序列侧翼的一个或多个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施例中，遗传元件包含位于编码本文所述的表达产物的序列侧翼的一个或多个长末端重复序列(LTR)。可以使用的启动子序列的实例包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒(Epstein-Barrvirus)立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。
复制蛋白
在一些实施例中，CA载体，例如合成的CA载体的遗传元件可包括编码一个或多个复制蛋白的序列。在一些实施例中，CA载体可以通过滚环式复制法进行复制，例如，前导链和后随链的合成是非偶联的。在这样的实施例中，CA载体包含三个另外元件：i)编码起始蛋白的基因，ii)双链起点，和iii)单链起点。包含复制蛋白的滚环式复制(RCR)蛋白复合物与前导链结合并使复制起点去稳定。RCR复合物切割基因组以产生游离的3'OH末端。细胞DNA聚合酶从游离的3'OH末端开始病毒DNA复制。复制基因组后，RCR复合物共价地闭合环。这导致释放出正的环状单链亲本DNA分子和由负的亲本链和新合成的正链组成的环状双链DNA分子。单链DNA分子可以被衣壳化或参与第二轮复制。参见例如Virology Journal[病毒学杂志]2009,6:60doi:10.1186/1743-422X-6-60。
遗传元件可包含编码聚合酶，例如RNA聚合酶或DNA聚合酶的序列。
其他序列
在一些实施例中，遗传元件还包括编码产物(例如核酶、编码蛋白质的治疗性mRNA、外源基因)的核酸。
在一些实施例中，遗传元件包括一个或多个影响CA载体在宿主或宿主细胞中以下功能的序列：物种和/或组织和/或细胞嗜性(例如，衣壳蛋白序列)、感染性(例如，衣壳蛋白序列)、免疫抑制/激活(例如，调节性核酸)、病毒基因组结合和/或包装、免疫逃逸(非免疫原性和/或耐受性)、药代动力学、胞吞作用和/或细胞附着、核进入、细胞内调节和定位、胞吐作用调节、增殖和核酸保护。
在一些实施例中，遗传元件可以包含其他序列，其包括DNA、RNA或人工核酸。其他序列可包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一个实施例中，遗传元件包括编码siRNA的序列，以靶向与调节性核酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一个实施例中，遗传元件包括编码siRNA的序列，以靶向与调节性核酸不同的基因表达产物。
在一些实施例中，遗传元件进一步包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一种或多种复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调节性序列(例如，启动子、增强子)、编码一个或多个靶向内源基因(siRNA、lncRNA、shRNA)的调节性序列的序列和编码治疗性mRNA或蛋白的序列。
其他序列的长度可为约2nt至约5000nt、约10nt至约100nt、约50nt至约150nt、约100nt至约200nt、约150nt至约250nt、约200至约300nt、约250nt至约350nt、约300nt至约500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt或其间的任何范围。
编码的基因
例如，遗传元件可以包括与信号传导生化通路相关的基因，例如与信号传导生化通路相关的基因或多核苷酸。实例包括与疾病相关的基因或多核苷酸。“与疾病相关的”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在患病组织衍生的细胞中以异常水平或异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。它可能是会以异常高水平表达的基因；它可能是会以异常低水平表达的基因，其中表达的改变与疾病的发生和/或进展相关。疾病相关基因也指具有一个或多个突变或遗传变异的基因，这些突变或遗传变异直接导致疾病病因或与导致疾病病因的一个或多个基因连锁不平衡。
此外，如本文其他地方所述，遗传元件可以编码靶向部分。这可以例如通过插入编码糖、糖脂或蛋白质例如抗体的多核苷酸来实现。本领域技术人员知道用于生成靶向部分的其他方法。
病毒序列
在一些实施例中，遗传元件包含至少一个病毒序列。在一些实施例中，该序列与来自单链DNA病毒，例如CAV、指环病毒、杆状DNA病毒(Bidnavirus)、圆环病毒(Circovirus)、双生病毒、基诺病毒(Genomovirus)、丝状病毒、微小病毒、矮化病毒、细小病毒和斯派拉病毒(Spiravirus)的一个或多个序列具有同源性或同一性。在一些实施例中，该序列与来自双链DNA病毒，例如腺病毒、瓶状病毒、囊泡病毒、非洲猪瘟病毒、杆状病毒、微小纺锤形噬菌体、球状病毒、滴状病毒、唾液腺肥大病病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、线头病毒和痘病毒的一个或多个序列具有同源性或同一性。在一些实施例中，序列与来自RNA病毒，例如甲病毒、真菌传杆状病毒、肝炎病毒、大麦病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、三角病毒(Tricornavirus)、风疹病毒、双RNA病毒、囊状病毒、分体病毒和呼肠病毒的一个或多个序列具有同源性或同一性。
在一些实施例中，遗传元件可包含来自非致病性病毒，例如共生病毒(symbioticvirus)，例如共栖病毒(commensal virus)，例如天然病毒，例如CAV的一个或多个序列。在一些实施例中，遗传元件可包含与CAV的Cuxhaven 1分离株(例如，如表1A或1B中所列)具有同源性或同一性的序列。在一些实施例中，非致病性病毒是具有环状负义基因组的无包膜单链DNA病毒，例如CAV。在一些实施例中，遗传元件可包含与本文所述核苷酸序列中任一个具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的来自非致病性病毒的一个或多个序列或序列的片段。
在一些实施例中，由于重组逆转录病毒是有缺陷的，因此可以提供协助以产生感染性颗粒。可以提供这样的协助，例如，通过使用含有质粒的细胞系，这些质粒编码在LTR内调节性序列的控制下的逆转录病毒的所有结构基因。用于复制本文所述的CA载体的合适细胞系包括本领域已知的细胞系，例如A549细胞，其可以如本文所述进行修饰。所述遗传元件可以另外含有编码选择性标志的基因，以便可以鉴定所期望的遗传元件。
在一些实施例中，遗传元件包括非沉默突变，例如导致编码的多肽中氨基酸差异的碱基置换、缺失或添加，只要序列与由第一核苷酸序列编码的多肽保持至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或以其他方式可用于实施本发明。在这方面，可以进行某些保守性氨基酸置换，通常认为这些置换不会使蛋白质的整体功能失活：例如对于带正电的氨基酸(反之亦然)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；对于带负电的氨基酸(反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；对于某些电中性氨基酸的组(在所有情况下，反之亦然)，(1)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸，(8)丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。氨基酸可以根据物理特性以及对二级和三级蛋白质结构的贡献进行分类。保守性置换在本领域中被认为是一个氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸置换。
在一些实施例中，具有相同或指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个核酸或多肽序列的同一性(例如，当在比较窗口或指定区内进行最大对应性比较和对齐时，在具体区内约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)可使用带有以下所述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过人工比对和目视检查(例如，参见NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或类似网站)进行测量。同一性也可以指或可以应用于测试序列的互补序列。同一性还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有置换的序列。如本文所述，算法考虑了空位和类似情况。同一性可以在长度为至少约10个氨基酸或核苷酸、长度为约15个氨基酸或核苷酸、长度为约20个氨基酸或核苷酸、长度为约25个氨基酸或核苷酸、长度为约30个氨基酸或核苷酸、长度为约35个氨基酸或核苷酸、长度为约40个氨基酸或核苷酸、长度为约45个氨基酸或核苷酸、长度为约50个氨基酸或核苷酸、或更多的区中存在。由于遗传密码是简并的，因此同源核苷酸序列可包括任何数目的“沉默”碱基改变，即仍然编码相同氨基酸的核苷酸置换。
蛋白质性外部
在一些实施例中，CA载体，例如合成的CA载体包含包封遗传元件的蛋白质性外部。蛋白质性外部可包含衣壳蛋白(例如，如本文所述的CAV VP1分子)。在一些实施例中，蛋白质是衣壳蛋白，例如，具有与由编码本文所述的衣壳蛋白(例如，CAV VP1分子，例如，如本文所述)的任一核苷酸序列编码的蛋白质存在至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，蛋白质或衣壳蛋白的功能片段由与CAV VP1核酸(例如，如本文所述)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CA载体包含编码衣壳蛋白或衣壳蛋白的功能片段或与如本文所述的CAV VP1分子具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的核苷酸序列。在一些实施例中，CA载体的蛋白质性外部可以包含可以自组装例如以形成蛋白质性外部的衣壳蛋白。在一些实施例中，衣壳蛋白可以自组装成二十面体结构，例如其构成蛋白质性外部。
在一些实施例中，蛋白质性外部蛋白质由CA载体的遗传元件的序列编码(例如，与遗传元件顺式)。在其他实施例中，蛋白质性外部蛋白质由独立于CA载体的遗传元件的核酸编码(例如，与遗传元件反式)。
在一些实施例中，序列同一性较低的氨基酸范围可以提供一种或多种本文所述的特性以及细胞/组织/物种特异性(例如，嗜性)的差异。
在一些实施例中，CA载体在蛋白质性外部中缺乏脂质。在一些实施例中，CA载体缺少脂质双层，例如病毒包膜。在一些实施例中，CA载体的内部完全被蛋白质性外部覆盖(例如，100％覆盖)。在一些实施例中，CA载体的内部低于100％由蛋白质性外部覆盖，例如，95％、90％、85％、80％、70％、60％、50％或更低的覆盖。在一些实施例中，蛋白质性外部包含缺口或间断，例如，允许对水、离子、肽或小分子具有渗透性，只要遗传元件还保留在CA载体中。
在一些实施例中，蛋白质性外部包含特异性识别和/或结合宿主细胞例如互补蛋白或多肽以介导遗传元件进入宿主细胞的一种或多种蛋白质或多肽。
在一些实施例中，蛋白质性外部包含精氨酸富集区和/或胶冻卷区，例如VP1分子的(例如，如本文所述)的精氨酸富集区和/或胶冻卷区。在一些实施例中，蛋白质性外部包含以下中的一种或多种：一种或多种糖基化蛋白、亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N末端聚精氨酸序列、可变区、C末端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列、以及一个或多个二硫键。例如，蛋白质性外部包含由CAV VP1核酸(例如，如本文所述)编码的蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质性外部包含以下特征中的一种或多种：二十面体对称、识别和/或结合与一种或多种宿主细胞分子相互作用以介导进入宿主细胞的分子、缺乏脂质分子、缺乏碳水化合物、具有pH和温度稳定性、耐去垢剂、以及在宿主中基本上具有非致病性。
在一些实施例中，蛋白质(例如基本上非致病性蛋白质和/或蛋白质性外部蛋白质)包含一个或多个糖基化氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化氨基酸。在一些实施例中，蛋白质(例如基本上非致病性蛋白质和/或蛋白质性外部蛋白质)包含至少一个亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N末端聚精氨酸序列、可变区、C末端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列和一个或多个二硫键。
III.遗传元件构建体
本文所述的遗传元件可以包含在遗传元件构建体(例如，串联构建体，例如，如本文所述)中。
在一个方面中，本发明包括遗传元件构建体，该构建体包含遗传元件，该遗传元件包含(i)编码非致病性外壳蛋白(例如，CAV VP1分子或者其剪接变体或功能片段)的序列、(ii)使该遗传元件与非致病性外壳蛋白结合的外壳蛋白结合序列和(iii)编码效应物的序列。在一些实施例中，遗传元件构建体是串联构建体，其进一步包含遗传元件的第二拷贝或其片段(例如，包含uRFS或dRFS，例如，如本文所述)。
遗传元件或遗传元件内的任何序列可以使用任何合适的方法获得。多种重组方法是本领域已知的，例如，使用标准技术，从含有病毒序列的细胞中筛选文库、从已知含有相同序列的遗传元件构建体中获得该序列、或者直接从含有相同序列的细胞和组织中分离出该序列。可替代地或组合地，遗传元件的部分或全部可以以合成方式产生，而不是进行克隆。
在一些实施例中，遗传元件构建体包括调节性元件、与靶基因同源的核酸序列、和各种报告构建体，用于在活细胞内和/或当细胞内分子存在于靶细胞内时引起报告分子的表达。
报告基因用于鉴定可能转染的细胞和评估调节性序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBSLetters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，将具有显示报告基因最高表达水平的最少5’侧翼区的构建体鉴定为启动子。这样的启动子区可以连接至报告基因，并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施例中，遗传元件构建体在宿主细胞中基本上是非致病性的和/或基本上不整合的。
在一些实施例中，遗传元件构建体的量足以调节表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等中的一种或多种至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。
IV.组合物
本文所述的CA载体还可以包含在具有药学上可接受的载剂或赋形剂(例如，如本文所述)的药物组合物中。在一些实施例中，药物组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个CA载体。在一些实施例中，药物组合物包含约105-1015、105-1010或1010-1015个CA载体。在一些实施例中，药物组合物包含约108(例如，约105、106、107、108、109或1010)个基因组当量/mL的CA载体。在一些实施例中，药物组合物包含105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、105-106、105-107、105-108、105-109、105-1011、105-1012、105-1013、105-1014、105-1015或1010-1015个基因组当量/mL的CA载体，例如，如根据实例1中描述的测量病毒滴度的方法测定。在一些实施例中，药物组合物包含足够的CA载体，以将包含在CA载体中的遗传元件的至少1、2、5或10、100、500、1000、2000、5000、8,000、1x 104、1x105、1x 106、1x 107个或更多个拷贝/细胞递送至真核细胞群。在一些实施例中，药物组合物包含足够的CA载体，以将包含在CA载体中的遗传元件的至少约1x 104、1x 105、1x 106、1x107、或约1x 104-1x 105、1x 104-1x 106、1x 104-1x 107、1x 105-1x 106、1x 105-1x 107、或1x106-1x 107个拷贝/细胞递送至真核细胞群。
在一些实施例中，药物组合物具有以下特征中的一种或多种：该药物组合物满足药物或良好生产规范(GMP)标准；该药物组合物是根据良好生产规范(GMP)制成的；该药物组合物具有低于预定参考值的病原体水平，例如基本上不含病原体；该药物组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物(例如，如本文所述)。
在一些实施例中，药物组合物包含低于阈值量的一种或多种污染物。在药物组合物中希望排除或降到最低限度的示例性污染物包括但不限于宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、宿主细胞蛋白、动物来源的组分(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、可复制型病毒、非感染性颗粒、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和聚集体。在实施例中，污染物是宿主细胞DNA。在实施例中，该组合物每剂包含低于约10ng的宿主细胞DNA。在实施例中，通过对宿主细胞DNA进行过滤和/或酶促降解来降低组合物中宿主细胞DNA的水平。在实施例中，按重量计，该药物组合物含有低于10％(例如，低于约10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％)的污染物。因此，本披露包括制备本文披露的CA载体的方法，该方法包括针对以下一个或多个(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个)评估CA载体制备的步骤：外源因子、致热物质、内毒素、支原体、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白、非感染性颗粒或空衣壳。
在一些情况下，本披露包括无菌药物组合物，其包含本文所述的CA载体和药物赋形剂，并且其中组合物满足21C.F.R.§§610.12和610.13的要求。例如，在一些实施例中，药物组合物可具有以下特征中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或所有8个：
(i)基本上没有外源因子，
(ii)基本上没有致热物质，
(iii)含有等于或少于对照参考或规范(例如美国药典(USP)或FDA内毒素污染参考标准)的内毒素，
(iv)含有等于或少于对照参考或规范(例如美国药典(USP)或FDA支原体污染参考标准)的支原体，
(v)含有比对照参考标准更少的宿主细胞DNA，例如，少于10ng宿主细胞DNA/剂量，少于5ng宿主细胞DNA/剂量，
(vi)含有比对照参考标准更少的宿主细胞蛋白(HCP)，例如少于100ng/mL、少于50ng/mL和/或少于10ng/剂量、少于5ng/剂量，
(vii)含有比阈值量更少的非感染性颗粒，例如，满足非感染性颗粒相对于感染性颗粒的预定释放规范，例如，颗粒比感染性单位<2000:1、<1000:1、<500:1，<300:1、<200:1、<100:1或<50:1，和/或
(viii)包含比阈值量更少的空衣壳(缺少基因组)，例如，满足空衣壳的预定释放规范。
在一个方面中，本文所述的本发明包括药物组合物，其包含：
a)包含遗传元件的CA载体，该遗传元件包含(i)编码非致病性外壳蛋白的序列，(ii)使该遗传元件与该非致病性外壳蛋白结合的外壳蛋白结合序列，和(iii)编码调节性核酸的序列；和蛋白质性外部，其与该遗传元件相关联，例如，包裹或包封该遗传元件；以及
b)药用赋形剂。
囊泡
在一些实施例中，组合物进一步包含载剂组分，例如微粒、脂质体、囊泡或外泌体。在一些实施例中，脂质体包含球形囊泡结构，该球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层组成。脂质体可以是阴离子型、中性的或阳离子型。脂质体通常具有生物相容性、无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶类的降解，并跨生物膜运输其载荷(对于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章编号469679,共12页,2011,doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成作为药物载剂的脂质体。囊泡可包括但不限于DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，单独使用或与胆固醇一起产生DOTMA和胆固醇、DOTAP和胆固醇、DOTIM和胆固醇以及DDAB和胆固醇。用于制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见，例如美国专利号6,693,086，其中涉及多层囊泡脂质制备的教导通过引用并入本文)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤压装置以振荡的形式施加力来加快囊泡的形成(对于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章编号469679,共12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，该文献关于挤出脂质制备的传授内容通过引用并入本文。
如本文所述，可将添加剂添加至囊泡以改变其结构和/或特性。例如，可以将胆固醇或鞘磷脂加入混合物中，以帮助稳定结构并防止内部货物泄漏。此外，可以由氢化的卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇和磷酸二鲸蜡酯制备囊泡。(对于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章编号469679,共12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。同样，囊泡可以在合成期间或之后进行表面修饰以包括与受体细胞上的反应性基团互补的反应性基团。这样的反应性基团包括但不限于马来酰亚胺基团。例如，可以合成囊泡以包括马来酰亚胺缀合的磷脂，例如但不限于DSPE-MaL-PEG2000。
囊泡配制品可以主要由天然磷脂和脂质(例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷脂)构成。仅由磷脂组成的配制品在血浆中不太稳定。然而，用胆固醇操纵脂质膜降低了封装的货物的快速释放，或者1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加了稳定性(对于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
在实施例中，脂质可用于形成脂质微粒。脂质包括但不限于DLin-KC2-DMA4、C12-200和可使用自发囊泡形成程序配制的共脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG(参见例如Novobrantseva,Molecular Therapy-Nucleic Acids[分子治疗-核酸](2012)1,e4；doi:10.1038/mtna.2011.3)。组分摩尔比可以为约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。Tekmira在美国和国外拥有一系列约95项同族专利，它们涉及脂质微粒和脂质微粒配制品的各个方面(参见，例如，美国专利号7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035；1519714；1781593和1664316)，所有这些都可以用于和/或适用于本发明。
在一些实施例中，微粒包含以随机方式排列的一种或多种固化聚合物。微粒可以是生物可降解型。生物可降解型微粒可以例如使用本领域已知的方法合成，包括但不限于溶剂蒸发、热熔微囊化、溶剂去除和喷雾干燥。Bershteyn等人,Soft Matter[软物质]4:1787-1787,2008和US2008/0014144A1中描述了用于合成微粒的示例性方法，其关于微粒合成的具体教导通过引用并入本文。
可用于形成生物可降解型微粒的示例性合成聚合物包括但不限于脂肪族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚酐、聚(原)酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(丙酸)和聚(丙交酯-己内酯)以及天然聚合物，例如白蛋白、藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物，包括化学基团的取代、添加，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、白蛋白和其他亲水蛋白、玉米蛋白和其他醇溶蛋白和疏水性蛋白质、共聚物及其混合物。通常，这些材料通过酶水解或暴露于水、通过表面或整体腐蚀而降解。
微粒的直径范围为0.1-1000微米(μm)。在一些实施例中，它们的直径的尺寸范围为1μm-750μm、或50μm-500μm、或100μm-250μm。在一些实施例中，它们的直径的尺寸范围为50μm-1000μm、50μm-750μm、50μm-500μm或50μm-250μm。在一些实施例中，它们的直径的尺寸范围是.05μm-1000μm、10μm-1000μm、100μm-1000μm或500μm-1000μm。在一些实施例中，它们的直径为约0.5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm、约600μm、约650μm、约700μm、约750μm、约800μm、约850μm、约900μm、约950μm或约1000μm。如微粒直径的上下文中所用，术语“约”是指所述绝对值的+/-5％。
在一些实施例中，配体经由存在于颗粒表面上并存在于待连接的配体上的官能化学基团(羧酸、醛、胺、巯基和羟基)与微粒表面缀合。可以通过例如在微粒的乳液制备期间，并入具有官能化学基团的稳定剂来将官能度引入微粒中。
将官能团引入微粒的另一实例是在微粒制备后，通过用均双官能或异双官能交联剂直接交联颗粒和配体。该程序可以使用合适的化学物质和一类交联剂(CDI、EDAC、戊二醛等，如下文更详细论述的)或在制备后经由对颗粒表面进行化学修饰将配体偶联至颗粒表面的任何其他交联剂。这还包括如下过程，通过该过程可以将两亲性分子(例如脂肪酸、脂质或功能性稳定剂)被动吸附并粘附到颗粒表面，从而引入官能性端基用于连接到配体上。
在一些实施例中，可以合成微粒以在其外表面上包含一个或多个靶向基团以靶向特定的细胞或组织类型(例如，心肌细胞)。这些靶向基团包括但不限于受体、配体、抗体等。这些靶向基团将其配偶体结合在细胞表面上。在一些实施例中，微粒将整合到构成细胞表面的脂质双层中，并且将线粒体递送至细胞中。
微粒还可在其最外表面上包含脂质双层。该双层可以由一个或多个相同或不同类型的脂质组成。实例包括但不限于磷脂，例如磷酸胆碱和磷酸肌醇。具体实例包括但不限于DMPC、DOPC、DSPC和各种其他脂质，例如本文针对脂质体所述的那些。
在一些实施例中，载剂包含例如本文所述的纳米颗粒。
在一些实施例中，本文所述的囊泡或微粒用诊断剂进行官能化。诊断剂的实例包括但不限于用于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单光子发射计算机化断层扫描、X射线、荧光检查和磁共振成像(MRI)的市售成像剂；和造影剂。在MRI中用作造影剂的合适材料的实例包括钆螯合物，以及铁、镁、锰、铜和铬。
载剂
本文所述的组合物(例如，药物组合物)可包含载剂、与载剂一起配制和/或在载剂中递送。在一个方面中，本发明包括组合物，例如药物组合物，其包含载剂(例如，囊泡、脂质体、脂质纳米颗粒、外泌体、红细胞、外泌体(例如哺乳动物或植物外泌体))、融合体，该载剂包含(例如，封装)本文所述的组合物(例如，本文所述的CA载体、CAV或遗传元件)。
在一些实施例中，本文所述的组合物和系统可以配制在脂质体或其他类似的囊泡中。一般而言，脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子型、中性的或阳离子型。脂质体通常具有以下特征中的一种或多种(例如，全部)：生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，可以保护其货物免受血浆酶的降解，并可以将其负载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of DrugDelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679；和Zylberberg&Matosevic.2016.Drug Delivery[药物递送],23:9,3319-3329,doi:10.1080/10717544.2016.1177136)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成作为药物载剂的脂质体。制备多层囊泡脂质的方法是已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过引用并入本文)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤压装置以振荡的形式施加力来加快囊泡的形成(对于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。如empleton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，挤出的脂质可以通过例如通过用于减小尺寸的过滤器挤出来制备。
脂质纳米颗粒(LNP)是为本文所述的药物组合物提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一实例。参见，例如，Gordillo-Galeano等人European Journal ofPharmaceutics and Biopharmaceutics[欧洲药剂学和生物药剂学杂志].第133卷,2018年12月,第285-308页。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了SLN的特征、改善了药物稳定性和负载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要部分。这些纳米颗粒可以有效地指导药物递送至特定靶标并且提高药物稳定性和药物可控释放。也可以采用脂质-聚合物纳米颗粒(PLN)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，而磷脂壳提供了良好的生物相容性。因此，这两种组分增加了药物封装率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见，例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
外泌体也可用作本文所述的组合物和系统的药物递送媒剂。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报英文版]第6卷,第4期,第287-296页；doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
离体分化的红细胞也可用作本文所述组合物的载剂。参见，例如，WO 2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；WO 2016183482；WO 2015153102；WO2018151829；WO 2018009838；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131–10136；美国专利9,644,180；Huang等人2017.Nature Communications[自然-通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131–10136。
融合体组合物，例如，如WO 2018208728中所述，也可用作载剂以递送本文所述的组合物。
组合
在一个方面中，本文所述的CA载体或包含CA载体的组合物还可包括一个或多个异源部分。在一个方面中，本文所述的CA载体或包含CA载体的组合物还可以以融合方式包含一个或多个异源部分。在一些实施例中，异源部分可以与遗传元件连接。在一些实施例中，异源部分可以作为CA载体的一部分包封在蛋白质性外部中。在一些实施例中，异源部分可以与CA载体一起施用。
在一个方面中，本发明包括细胞或组织，其包含本文所述的任一种CA载体和异源部分。
在另一方面，本发明包括药物组合物，其包含本文所述的CA载体和异源部分。
在一些实施例中，异源部分可以是病毒(例如，效应物(例如，药物、小分子)、靶向剂(例如，DNA靶向剂、抗体、受体配体)、标签(例如，荧光团、光敏剂例如KillerRed)或本文所述的编辑或靶向部分。在一些实施例中，本文所述的膜移位多肽与一个或多个异源部分连接。在一个实施例中，异源部分是小分子(例如，肽模拟物或分子量小于2000道尔顿的有机小分子)、肽或多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)、纳米颗粒、适体或药剂。
靶向部分
在一些实施例中，本文所述的组合物或CA载体可以进一步包含靶向部分，例如，特异性结合靶细胞上存在的感兴趣分子的靶向部分。靶向部分可以调节感兴趣分子或细胞的特定功能，调节特定分子(例如，酶、蛋白质或核酸)，例如通路中感兴趣分子下游的特定分子，或者特异性结合靶标以定位CA载体或遗传元件。例如，靶向部分可以包括与感兴趣的特定分子相互作用以提高、降低或以其他方式调节其功能的治疗剂。
标签部分或监测部分
在一些实施例中，本文所述的组合物或CA载体可以进一步包含标记或监测本文所述CA载体或遗传元件的标签。标签部分或监测部分可以通过化学剂或酶促裂解，例如蛋白水解或蛋白质内含子剪接而去除。亲和标签可用于使用亲和技术纯化标记的多肽。一些实例包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和多聚His标签。增溶标签可能有助于在分子伴侣缺陷型物种(例如大肠杆菌)中表达的重组蛋白，以协助蛋白质正确折叠并防止它们沉淀。一些实例包括硫氧还蛋白(TRX)和多聚NANP。标签部分或监测部分可以包括光敏标签，例如荧光。荧光标签可用于可视化。GFP及其变体是常用作荧光标签的一些实例。蛋白质标签可允许发生特定的酶促修饰(例如通过生物素连接酶进行生物素化)或化学修饰(例如与FlAsH-EDT2反应进行荧光成像)。通常将标签部分或监测部分组合，以便将蛋白质连接到多个其他组分。标签部分或监测部分也可以通过特异性蛋白水解或酶促裂解(例如通过TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa或肠肽酶)而去除。
纳米颗粒
在一些实施例中，本文所述的组合物或CA载体可以进一步包含纳米颗粒。纳米颗粒包括无机材料，这些无机材料的尺寸为约1至约1000纳米、约1至约500纳米、约1至约100nm、约50nm至约300nm、约75nm至约200nm、约100nm至约200nm，以及其间的任何范围。纳米颗粒通常具有纳米级尺寸的复合结构。在一些实施例中，纳米颗粒通常是球形的，尽管根据纳米颗粒的组成可能有不同的形态。纳米颗粒与纳米颗粒外部环境接触的部分通常被确定为纳米颗粒的表面。在本文所述的纳米颗粒中，尺寸限制可以限制在两个维度上，因此纳米颗粒包括直径为约1至约1000nm的复合结构，其中特定直径取决于纳米颗粒的组成和根据实验设计的纳米颗粒的预期用途。例如，用于治疗应用的纳米颗粒通常具有约200nm或更小的尺寸。
纳米颗粒的其他理想的特性，如表面电荷和空间稳定性，也可以根据感兴趣的具体应用而变化。在Davis等人,Nature[自然]2008第7卷,第771-782页；Duncan,Nature[自然]2006第6卷,第688-701页；和Allen,Nature[自然]2002第2卷第750-763页中描述了在临床应用(例如癌症治疗)中可能需要的示例性特性，每个文章均通过引用以其全文并入本文。技术人员在阅读本披露内容后可识别出其他特性。纳米颗粒的尺寸和特性可以通过本领域已知的技术来检测。检测颗粒尺寸的示例性技术包括但不限于动态光散射(DLS)和各种显微术，例如透射电子显微术(TEM)和原子力显微术(AFM)。检测颗粒形态的示例性技术包括但不限于TEM和AFM。检测纳米颗粒表面电荷的示例性技术包括但不限于ζ电位方法。适用于检测其他化学特性的其他技术包括通过1H、11B、和13C和19F NMR、UV/Vis和红外/拉曼光谱和荧光光谱(当纳米颗粒与荧光标志组合使用时)和技术人员可以鉴定的其他技术。
V.宿主细胞
本发明进一步涉及包含CA载体、CAV、遗传元件或遗传元件构建体(例如，如本文所述)的宿主或宿主细胞。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、鸟类(例如鸡)、哺乳动物(例如，人)或其他生物体或者细胞。在某些实施例中，如本文所证实的，所提供的CA载体感染一系列不同的宿主细胞。靶宿主细胞包括中胚层、内胚层或外胚层来源的细胞。靶宿主细胞包括例如上皮细胞、肌肉细胞、白细胞(例如，淋巴细胞)、肾组织细胞、肺组织细胞。
在一些实施例中，宿主或宿主细胞接触(例如，感染)CA载体。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，例如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中CA载体的量。在某些实施例中，确定了培养物中CA载体生长的时间曲线。
在一些实施例中，CA载体，例如，如本文所述的CA载体是可遗传的。在一些实施例中，CA载体在体液和/或细胞中从母细胞直线传递给子细胞。在一些实施例中，来自原始宿主细胞的子细胞包含CA载体。在一些实施例中，母细胞将CA载体传递给子细胞的效率为至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％，或者从宿主细胞到子细胞的传递效率为至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，宿主细胞中的CA载体在减数分裂期间的传递效率为至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，宿主细胞中的CA载体在有丝分裂期间的传递效率为至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，细胞中CA载体的传递效率为约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％或其间的任何百分比。
在一些实施例中，CA载体在宿主细胞内复制。在一个实施例中，CA载体能够在哺乳动物细胞，例如人细胞中复制。在其他实施例中，CA载体为复制缺陷型或非复制型。
虽然在一些实施例中，CA载体在宿主细胞中复制，但CA载体不整合到宿主的基因组中，例如，与宿主的染色体整合。在一些实施例中，CA载体的重组频率(例如，与宿主染色体的重组频率)可以忽略不计。在一些实施例中，CA载体的重组频率(例如，与宿主染色体)例如低于约1.0cM/Mb、0.9cM/Mb、0.8cM/Mb、0.7cM/Mb、0.6cM/Mb、0.5cM/Mb、0.4cM/Mb、0.3cM/Mb、0.2cM/Mb、0.1cM/Mb或更低。
VI.使用方法
本文所述的CA载体和包含CA载体的组合物可用于例如在有需要的受试者(例如，哺乳动物受试者，例如，人受试者)中治疗疾病、障碍或病症的方法中。本文所述的药物组合物的施用可以例如通过肠胃外(包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌内、腔内和皮下)施用。CA载体可以单独施用或配制成药物组合物。
CA载体可以以单位剂量组合物，例如单位剂量肠胃外组合物的形式施用。这样的组合物通常通过混合来制备，并且可以适于肠胃外施用。这样的组合物可以是例如可注射和可输注的溶液剂或混悬剂或栓剂或气雾剂的形式。
在一些实施例中，施用CA载体或包含其的组合物(例如，如本文所述)可导致将CA载体所包含的遗传元件递送至(例如，受试者中的)靶细胞。
本文所述的CA载体或其组合物，例如，包含效应物(例如，内源效应物或外源效应物)，可用于将效应物递送至细胞、组织或受试者。在一些实施例中，CA载体或其组合物用于将效应物递送至骨髓、血液、心脏、GI或皮肤。通过施用本文所述的CA载体组合物来递送效应物可以调节(例如，提高或降低)细胞、组织或受试者中非编码RNA或多肽的表达水平。以这种方式调节表达水平可能导致效应物所递送到的细胞中功能性活动的改变。在一些实施例中，调节的功能性活动本质上可以是酶促性、结构性或调节性。
在一些实施例中，在递送到细胞中后24小时(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、30天或1个月)，CA载体或其拷贝可在细胞中检测到。在实施例中，CA载体或其组合物介导对靶细胞的作用，并且该作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4周，或者1、2、3、6或12个月。在一些实施例中(例如，其中CA载体或其组合物包含编码外源蛋白的遗传元件)，该作用持续少于1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4周，或者1、2、3、6或12个月。
可以用本文所述的CA载体或包含该CA载体的组合物治疗的疾病、障碍和病症的实例包括但不限于：免疫障碍、干扰素病(例如，I型干扰素病)、传染病、炎性障碍、自身免疫性病症、癌症(例如实体瘤，例如肺癌、非小细胞肺癌，例如，表达对mIR-625作出响应的基因(例如，胱天蛋白酶-3)的肿瘤)和胃肠道障碍。在一些实施例中，CA载体调节(例如，提高或降低)与CA载体接触的细胞中的活动或功能。在一些实施例中，CA载体调节(例如，提高或降低)与CA载体接触的细胞中分子(例如，核酸或蛋白质)的水平或活性。在一些实施例中，CA载体降低了与CA载体接触的细胞(例如，癌细胞)的活力，例如，降低了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些实施例中，CA载体包含效应物，例如miRNA，如miR-625，其降低了与CA载体接触的细胞(例如癌细胞)的活力，例如，降低了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些实施例中，CA载体例如通过提高胱天蛋白酶-3的活性增加与CA载体接触的细胞(例如，癌细胞)的凋亡，例如，增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些实施例中，CA载体包含效应物，例如，miRNA，如miR-625，其例如通过提高胱天蛋白酶-3活性增加了与CA载体接触的细胞(例如癌细胞)的凋亡，例如，增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
VII.施用/递送
可以将组合物(例如，包含如本文所述的CA载体的药物组合物)配制成包括药学上可接受的赋形剂(例如，如本文所述)。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗性和/或预防性活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可在以下文献中找到药剂的配制和/或生产中的总体考虑：例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,Lippincott Williams&Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过引用并入本文)。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用至人的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，这样的组合物通常适合于施用至任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适合于施用于各种动物而对适合于施用于人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可仅通过普通实验(如果有的话)来设计和/或进行此种修饰。我们设想向其施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述的药物组合物的配制品可通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。
在一个方面中，本发明的特征在于向受试者递送CA载体的方法。该方法包括向受试者施用包含如本文所述CA载体的药物组合物。在一些实施例中，所施用的CA载体在受试者中复制(例如，成为受试者病毒组的一部分)。
药物组合物可以包含野生型或天然病毒元件和/或修饰的病毒元件。CA载体可以包括一个或多个CAV序列(例如，核酸序列或编码其氨基酸序列的核酸序列)或与其具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的序列。CA载体可包含核酸分子，该核酸分子包含与例如如本文所述的一个或多个CAV序列(例如，CAV VP1核酸序列)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的核酸序列。CA载体可以包含编码氨基酸序列的核酸分子，该氨基酸序列与例如如本文所述的CAV氨基酸序列(例如，CAV VP1分子的氨基酸序列)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性。CA载体可以包含多肽，该多肽包含与例如如本文所述的CAV氨基酸序列(例如，CAVVP1分子的氨基酸序列)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CA载体足以增加(刺激)内源基因和蛋白的表达，例如，与参考(例如健康对照)相比，增加(刺激)了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在某些实施例中，CA载体足以减少(抑制)内源基因和蛋白的表达，例如，与参考(例如健康对照)相比，减少(抑制)了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
在一些实施例中，CA载体在宿主或宿主细胞中抑制/增强一种或多种病毒特性，例如，嗜性、感染性、免疫抑制/激活，例如，与参考(例如健康对照)相比，抑制/增强了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
在一些实施例中，向受试者施用的药物组合物，该药物组合物进一步包含一种或多种在病毒遗传信息中未表示的病毒株。
在一些实施例中，以足以调节病毒感染的剂量和时间施用包含本文所述的CA载体的药物组合物。病毒感染的一些非限制性实例包括腺相关病毒、爱知病毒(Aichi virus)、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、BK多瘤病毒、版纳病毒(Banna virus)、巴马森林病毒(Barmahforest virus)、布尼亚韦拉病毒(Bunyamwera virus)、布尼亚病毒属拉克罗斯病毒(Bunyavirus La Crosse)、布尼亚病毒属雪鞋野兔病毒(Bunyavirus snowshoe hare)、猕猴疱疹病毒(Cercopithecine herpesvirus)、钱迪普拉病毒(Chandipura virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、库赛病毒(Cosavirus)A种、牛痘病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒、多里病毒(Dhori virus)、杜贝病毒(Dugbe virus)、杜文海病毒(Duvenhage virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equineencephalitis virus)、伊波拉病毒(Ebolavirus)、埃可病毒(Echovirus)、脑心肌炎病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、GB病毒C型/庚型肝炎病毒、汉坦病毒(Hantaan virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、马痘病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠病毒68型、人肠病毒70型、人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒1型、人乳头瘤病毒2型、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人副流感病毒、人细小病毒B19型、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人SARS冠状病毒、人泡沫逆转录病毒(spumaretrovirus)、人嗜T淋巴细胞病毒、人环曲病毒(torovirus)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、JC多瘤病毒、日本脑炎病毒、呼宁砂粒病毒(Junin arenavirus)、KI多瘤病毒、昆津病毒(Kunjin virus)、拉各斯蝙蝠病毒、维多利亚湖马尔堡病毒(Lake Victoriamarburgvirus)、兰加特病毒(Langat virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、洛兹达雷病毒(Lordsdale virus)、跳跃病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、马秋波病毒(Machupovirus)、马亚罗病毒(Mayaro virus)、MERS冠状病毒、麻疹病毒、门戈脑心肌炎病毒(Mengoencephalomyocarditis virus)、默克尔细胞多瘤病毒、莫科拉病毒(Mokola virus)、传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus)、猴痘病毒、腮腺炎病毒、墨累谷脑炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、纽约病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong-nyong virus)、羊口疮病毒(Orf virus)、奥罗普切病毒(Oropouche virus)、皮钦德病毒(Pichinde virus)、脊髓灰质炎病毒、庞塔托鲁静脉病毒(Punta toro phlebovirus)、普马拉病毒(Puumala virus)、狂犬病病毒、裂谷热病毒、玫瑰病毒(Rosavirus)A种、罗斯河病毒、轮状病毒A种、轮状病毒B种、轮状病毒C种、风疹病毒、鹭山病毒(Sagiyama virus)、萨里病毒(Salivirus)A种、白蛉热西西里病毒、札幌病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、汉城病毒、猴泡沫病毒、猿猴病毒5型、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、南安普顿病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱传波瓦桑病毒(Tick-borne powassan virus)、细环病毒、托斯卡纳病毒(Toscana virus)、乌库涅米病毒(Uukuniemi virus)、痘苗病毒、水痘-带状疱疹病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水疱性口炎病毒、西部马脑炎病毒、WU多瘤病毒、西尼罗河病毒、亚巴猴肿瘤病毒、亚巴样病病毒、黄热病毒和寨卡病毒(Zika Virus)。在某些实施例中，CA载体足以胜过和/或替换已经存在于受试者中的病毒，例如，与参考相比，胜过和/或替换了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在某些实施例中，CA载体足以与慢性或急性病毒感染竞争。在某些实施例中，可预防性施用CA载体以保护免受病毒感染(例如，益生病毒(provirotic))。在一些实施例中，CA载体的量足以调节(例如，表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。在一些实施例中，治疗(treatment)、进行治疗(treating)及其同源词包括对受试者的医疗管理(例如，通过施用CA载体，例如，如本文所述制备的CA载体)，例如，旨在改善、缓解、稳定、预防或治愈疾病、病理状况或障碍。在一些实施例中，治疗包括积极治疗(旨在改善疾病、病理状况或障碍的治疗)、因果治疗(针对相关疾病、病理状况或障碍的原因的治疗)、姑息治疗(旨在缓解症状的治疗)、预防性治疗(旨在预防、最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍的发生的治疗)和/或支持性治疗(用来补充另一种疗法的治疗)。
再给药
在一些情况下，本文所述的CA载体可以用作可以以多个剂量(例如，分开施用的剂量)施用的递送媒剂。虽然不希望受理论的束缚，但在一些实施例中，CA载体(例如，如本文所述)诱导相对低的免疫响应(例如，以50％ GMT值测量，例如，如在实例12中所观察到的)，例如，从而允许用一个或多个CA载体重复向受试者给药(例如，相同CA载体或不同CA载体的多个剂量)。在一方面，本发明提供了一种递送效应物的方法，该方法包括向受试者施用第一多个CA载体，然后施用第二多个CA载体。在一些实施例中，第二多个CA载体包含与第一多个CA载体相同的蛋白质性外部。在另一个方面，本发明提供了一种选择受试者(例如，人受试者)以接受效应物的方法，其中该受试者先前接受过或被鉴定为已经接受过包含编码效应物的遗传元件的第一多个CA载体，其中该方法涉及选择该受试者以接受包含编码效应物(例如，与该第一多个CA载体的遗传元件所编码的效应物相同，或与该第一多个CA载体的遗传元件所编码的效应物不同)的遗传元件的第二多个CA载体。在另一个方面，本发明提供了一种将受试者(例如，人受试者)鉴定为适合于接受第二多个CA载体的方法，该方法包括鉴定先前已经接受过包含编码效应物的遗传元件的第一多个CA载体的受试者，其中被鉴定为已经接受过该第一多个CA载体的该受试者表明该受试者适合于接受该第二多个CA载体。
在一些实施例中，第二多个CA载体包含与第一多个CA载体的CA载体具有至少一个共同的表面表位的蛋白质性外部。在一些实施例中，第一多个CA载体和第二多个CA载体携带编码相同效应物的遗传元件。在一些实施例中，第一多个CA载体和第二多个CA载体携带编码不同效应物的遗传元件。
在一些实施例中，该第二多个包含与该第一多个大约相同数量和/或浓度的CA载体(例如，当相比于施用时受试者的体重归一化时)，例如，该第二多个包含该第一多个中CA载体数量的90-110％，例如，95-105％(例如，当相比于施用时受试者的体重归一化时)。在一些实施例中，其中第一多个与第二多个相比包含更大剂量的CA载体，例如，其中该第一多个相对于该第二多个包含更大量和/或浓度的CA载体。在一些实施例中，其中第一多个与第二多个相比包含更低剂量的CA载体，例如，其中该第一多个相对于该第二多个包含更低量和/或浓度的CA载体。
在一些实施例中，在施用该第一多个CA载体和该第二多个CA载体之间对该受试者进行评估，例如，评估是否存在该第一多个CA载体或其子代(例如其持久性)。在一些实施例中，如果未检测到来自第一多个CA载体或其子代的存在，则向受试者施用第二多个CA载体。
在一些实施例中，向受试者施用该第一多个CA载体后至少1、2、3或4周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或者1、2、3、4、5、10或20年，再向受试者施用第二多个CA载体。在一些实施例中，向受试者施用第一多个CA载体后1-2周、2-3周、3-4周、1-2个月、3-4个月、4-5个月、5-6个月、6-7个月、7-8个月、8-9个月、9-10个月、10-11个月、11-12个月、1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-10年或10-20年，再向受试者施用第二多个CA载体。在一些实施例中，方法包括在至少1、2、3、4或5年的时间内施用重复剂量的CA载体。
在一些实施例中，该方法还包括在施用第一多个CA载体之后和施用第二多个CA载体之前评估以下一项或多项：
a)该效应物在该受试者中的水平或活性(例如，通过检测蛋白质效应物，例如，通过ELISA；通过检测核酸效应物，例如，通过RT-PCR，或者通过检测该效应物的下游效应，例如，受该效应物影响的内源基因的水平)；
b)该第一多个CA载体在该受试者中的水平或活性(例如，通过检测该CA载体的VP1的水平)；
c)施用该CA载体进行治疗的该受试者中疾病的存在、严重性、进展或者迹象或症状；和/或
d)免疫响应的存在或水平，例如针对CAV或CA载体的中和性抗体。
在一些实施例中，该方法还包括向受试者施用第三多个、第四多个、第五多个和/或另外多个例如如本文所述CA载体。
在一些实施例中，第一多个和第二多个通过相同的施用途径施用，例如静脉内施用。在一些实施例中，第一多个和第二多个通过不同的施用途径施用。在一些实施例中，第一和第二多个由同一实体(例如，同一医疗保健提供者)施用。在一些实施例中，第一和第二多个由不同的实体(例如，不同的医疗保健提供者)施用。
本文引用的所有参考文献和出版物都特此通过引用并入。
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非意在限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实例
目录
实例1：重组合成的CAV的拯救和在鸟类细胞中的传代
实例2：串联CAV构建体
实例3：CAV与鸟类和人细胞的结合
实例4：示例性CA载体遗传元件的设计和构建
实例5：使用野生型CAV拯救CA载体
实例6：从上清液纯化CA载体
实例7：CA载体转导人细胞
实例8：CA载体对中和性抗体的抗性
实例9：没有野生型CAV时CA载体的生产
实例10：用于注射到小鼠中的nLucCA载体的生产
实例11：在小鼠体内施用CA载体，导致在多个器官中递送有效载荷DNA
实例12：接受CA载体相比于AAV2的小鼠的免疫原性
实例13：CAV样颗粒(VLP)在体外从纯化的衣壳蛋白组装
实例14：CA载体通过晚期内体途径进入MDCC-MSB1细胞
实例15：热处理后和4℃储存后的CA载体活力
实例16：使用串联质粒回收CA载体
实例1：重组合成的CAV的拯救和在鸟类细胞中的传代
在本实例中，重组合成的鸡贫血病毒(CAV)是从合成的基因组产生的。为了从合成的基因组中拯救可行的CAV，CAV质粒DNA在体外环化(IVC)以去除载体主链，转染到鸡细胞中，并将由此产生的感染细胞反复传代到新鲜细胞中。简而言之，将MDCC-MSB1细胞用p637(Neg)、pCAV或pCAV-IVC构建体进行电穿孔。将细胞分开到含有未感染的MDCC-MSB1细胞的新鲜培养基中，随后每48小时分开细胞。重复的分开步骤产生传代0(P0)、传代1(P1)、传代2(P2)和更多等等。对对照DNA(如下所述)进行类似处理以显示只有在向细胞提供环状双链CAV基因组DNA时才检测到病毒回收(图1和4)。使用定量PCR(qPCR)、受感染细胞的显微镜检查、浓缩病毒悬浮液的电子显微镜检查和蛋白质印迹来显示CAV在细胞中复制。
制备双链基因组
野生型CAV株Cuxhaven 1的基因组在体外作为2,319bp EcoRI片段合成，然后将其克隆到质粒pUC57中。将所得质粒(pRTx-708)在大肠杆菌中繁殖，并根据标准方法进行纯化。用EcoRI和PvuI消化质粒(75μg)，并从琼脂糖凝胶上切下2.3kb条带。使用凝胶纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取CAV基因组dsDNA，并使用T4 DNA连接酶(NEB)以5mL体积进行连接反应以环化CAV双链基因组。在16℃孵育24小时后，根据标准方法对DNA进行乙醇沉淀，并重悬浮于100μL水中。将DNA溶液用超纯水透析1小时(Slide-A-Lyzer小型透析装置，10,000MWCO，10-100μl Cat#69576)。
还制备了两个阴性对照DNA样品。一个阴性对照是CAV基因组质粒pRTx-708，它在从大肠杆菌中纯化后，没有进行如上所述的去除细菌主链的处理。另一个阴性对照是质粒pRTx-637，其中编码衣壳蛋白VP1的基因被缺失。
CAV基因组的转染
对于每种情况，将2.5ug DNA添加到106个活MDCC-MSB1细胞(ATCC)中，或约2.5pg/细胞，并使用4D-Nucleofector系统(龙沙公司(Lonza))通过电穿孔用大比色皿(106个细胞/比色皿)和程序DS-137遵循制造商的说明进行递送。对于每种情况，转染的细胞均按建议回收，并转移至T25烧瓶中含有10％ FBS的最终培养体积为5mL的RPMI中。将转染的细胞在加湿的40℃/5％ CO2培养箱中培养2至3天。该步骤的产物在本文中称为传代0(P0)。
转染/感染的细胞的收获和传代
通过取2等份细胞悬浮液来收获P0细胞悬液(约5mL)用于qPCR和蛋白质印迹分析，然后将1.5mL细胞悬浮液转移到新的烧瓶中，并使用最终体积为7mL的新鲜细胞将细胞计数提高到2x 105个细胞/mL，然后在40℃和5％ CO2下孵育。该过程重复4个传代。
测量病毒滴度
通过将200μL裂解缓冲液和25μL蛋白酶K直接添加到样品管中，使用PureLink病毒DNA/RNA试剂盒(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))纯化细胞悬浮液样品(200μL)。根据制造商的建议，使用赛默飞世尔公司TaqMan试剂和QuantStudio实时qPCR仪器进行的TaqManqPCR评估了拷贝数/ml。
使用的引物和探针：
CAV Fwd：5'-TTGGAAACCCCTCACTGCAGAG-3’
CAV Rev：5'-CTGAATTGTCCGCAGTTGCAG-3'
CAV VP1探针：5'-6FAM-CTGGAATTACAATCACTCTAT-MGBNFQ-3'
对来自传代0、1、2和4(P1-4；图1)的样品进行分析。只有最初用IVC CAV DNA转染的细胞的样品经传代数显示CAV拷贝增加。这表明发生了CAV DNA的复制和向新鲜细胞的传递。
通过蛋白质印迹检测病毒蛋白
为分析CAV蛋白表达，将每个样品的30ul使用SDS样品缓冲液并煮沸10分钟进行还原和变性。然后将样品加载到BOLT 4-12％ Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔公司)上，并按照供应商的建议电泳40分钟。凝胶在水中洗涤5分钟，然后使用iBlot2系统转移到硝酸纤维素膜上。将膜用TBS-T洗涤5分钟，并用Li-Cor TBS封闭缓冲液封闭1小时。通过将封闭的膜与兔抗凋亡蛋白(VP3；艾博抗公司(Abcam)，Ab193612)和抗VP2血清(库萨比奥技术公司(Cusabio Technology)，CSB-PA302471LA01CID)在4℃下在TBS封闭缓冲液中以1:100稀释16小时来进行检测。洗涤后，将山羊抗兔IRDye680二抗(LI-COR Biotechnology)应用于膜上，洗涤，然后使用Li-Cor Odyssey仪器成像。图1显示衍生自IVC CAV转染的细胞(P0)的P1和P2细胞对两种CAV蛋白均呈阳性，但衍生自其他转染的样品则不然。
感染的细胞的表征
通过相差显微镜观察来自P4的细胞样品以检查细胞形态。IVC CAV样品中的细胞经常被发现增大并具有多个细胞质内含物，这与外观正常的对照样品中的细胞形成对比。
拯救的CAV的分离
在单独的实验中，如上所述，MDCC-MSB1细胞被转染并传代两次至P2。在通过电穿孔将CAV IVC或p637转染到MDCC-MSB1细胞后，将转染的细胞传代两次(P0到P2；每48小时分开到具有未感染的MDCC-MSB1细胞的新鲜培养基中)，并将P2处所产生的传代细胞通过冻融裂解以产生裂解物，用于感染新鲜的MDCC-MSB1细胞。从这些细胞收获的病毒对应于P3。来自CAV IVC或阴性对照细胞的细胞悬浮液通过冻融裂解并应用于新鲜细胞，然后在40℃和5％ CO2下孵育3天。孵育后，通过相差显微镜检查细胞，仅在感染了CAV IVC衍生的裂解物的细胞中显示出明显的细胞病变效应。特别是，暴露于衍生自p637的P2的细胞显示出正常形态，而暴露于衍生自IVC CAV DNA的P2的细胞则显示出受感染细胞的典型形态。基于P2和P3等分试样的qPCR分析，仅在接受CAV IVC衍生的裂解物的细胞中，CAV基因组拷贝数从P2(在图2中标记为“输入”)到P3(“输出”)增加。这些观察结果与产生感染性CAV的CAV IVCDNA一致。
将CAV感染的P3细胞悬浮液用0.5％ Triton X-100裂解，用Benzonase处理，并经由超速离心沉降通过20％蔗糖垫进行沉淀。然后将再悬浮的沉淀物应用于线性CsCl梯度以进行等密度超速离心，并从梯度中收集级分以通过qPCR(图3)和感染性(图4)进行表征。检测到CAV基因组拷贝在密度梯度中达到峰值，约1.32g/mL(图3)。
峰值级分与相邻的两个级分汇集，透析以去除CsCl，并将所得纯化的病毒悬浮液在5000倍或50,000倍稀释后添加到新鲜细胞中。使用以相同方式稀释的阴性对照裂解物平行进行模拟纯化和感染。阴性对照的稀释液均未显示感染迹象，如通过6天内每天采集的细胞培养样品的qPCR测量的(图4)。然而，用5000倍CAV稀释液感染的培养物样品在2天后开始明显呈阳性。这证实了感染性CAV衍生自合成的IVC DNA转染的MDCC-MSB1细胞。
电子显微镜
将MDCC-MSB1细胞用CAV感染，进行孵育和处理，基本上如Todd等人1990所述。将病毒悬浮液通过负染色电子显微镜成像，显示出大量病毒颗粒(图5)。
实例2：串联CAV构建体
生成了一系列示例性CAV串联构建体(图6A)。简而言之，串联构建体包含质粒主链，以及两个完整的CAV基因组拷贝，或一个完整拷贝和一个部分拷贝。通过核转染将每个CAV串联构建体引入MDCC-MSB1细胞。这就是P0培养。在核转染后第2天和第3天收集200μl细胞悬浮液用于下游qPCR。第3天，将细胞悬浮液以1:10的比例传代到新鲜的MDCC-MSB1细胞中，开始P1培养。在P1培养的第2天，收集200μl悬浮液用于qPCR，沉淀剩余细胞用于DNA提取和蛋白质印迹。使用CAV探针对P0和P1培养样品进行qPCR。pRTX-1114-1116传代后观察到复制增加。对于pRTX1113、1118和1119，观察到较小的增加(图6B)。通过蛋白质印迹分析来自P1样品的细胞沉淀。经主链切割或DpnI消化的DNA在凝胶上运行，转移到膜上，并用由针对CAV的随机六聚体制备的生物素标记探针和梯带(ladders)进行探测。添加了链霉亲和素-IRDye-800，结果在LiCor Odyssey上成像。该实验的结果与qPCR数据一致。除了包含pRTX-1117和pRTX-1121的泳道外，在所有泳道中都观察到dsDNA环(图6C)。带是DpnI抗性的，这表明基因组的复制。还回收了野生型CAV病毒。
这些结果表明，将CAV基因组的完整拷贝或部分拷贝添加到包含主链和完整CAV基因组的质粒会增加病毒滴度。
实例3：CAV与鸟类和人细胞的结合
筛选了CAV结合一组人细胞系的能力。MCF-7(人乳腺癌)、MRC5(肺成纤维细胞)、EKVX(肺腺癌)、Raji(B淋巴母细胞)、Jurkat(T淋巴母细胞)和MDCC(鸡淋巴母细胞，阳性对照)细胞一式两份进行测试。对于每种细胞类型，将2x 105个细胞与CAV(MOI＝1.5个CAV颗粒/细胞)在4℃孵育一小时。将细胞洗涤两次，并进行胰蛋白酶对照，其中每种情况都用胰蛋白酶处理以去除结合的病毒体并建立背景。提取DNA，并进行qPCR以确定与每种细胞类型结合的病毒基因组的数量。减去胰蛋白酶背景，并将值绘制为相对于MDCC对照归一化的结合百分比(图7)。结果表明CAV与Raji细胞和EKVX细胞结合。这些数据表明CAV可以特异性结合人细胞，与CAV能够进入人细胞相一致。
实例4：示例性CA载体遗传元件的设计和构建
为了生成推定的载体，使用扫描方法分析CAV基因组以发现病毒复制和包装所需的区。简而言之，将988bp报告基因盒以交错的200bp间距插入CAV基因组(图8A-8B)。包含SV40启动子、纳米萤光素酶(nLuc)ORF和SV40终止子的报告基因替换了CAV基因组的相应区，从而保持了野生型CAV基因组的长度。总共设计了八个nLuc插入构建体，如图8A所示。每个nLuc构建体的序列显示在上表2-9中。化学地合成构建体，克隆到pUC57-mini质粒中，从质粒主链进行限制性酶切，然后体外环化(IVC)。这些质粒随后可用于生产工程改造的基于CAV的遗传元件，以测试它们被包装到蛋白质性外部内的能力，从而形成工程改造的CAV载体(本文称为CA载体)。
实例5：使用野生型CAV拯救CA载体
本实例展示了向包含外源基因的CA载体反式提供CAV蛋白。由此产生的CA载体能够将外源基因递送至靶细胞。
通过体外环化(IVC)产生如实例4所述设计的CA载体基因组，然后与编码串联CAV基因组的质粒(pRTX-966)或编码部分CAV基因组的质粒(其中VP1编码区被缺失但VP2和VP3被保留)(pRTX-637)以1:1的比例共转染到MDCC-MSB1细胞中。作为对照，WT CAV IVC也与pRTX-966或pRTX-637共转染。将5x 106个总细胞通过核转染在每种条件下进行转染，并在含有10％ FBS的25mL RPMI中孵育。3天后，确认nLuc的产生，收获细胞悬浮液，并通过离心澄清上清液。然后通过0.2μm过滤器过滤澄清的上清液。
为了测试是否发生了载体拯救，将过滤的上清液与1x 105个MDCC-MSB1细胞在48孔板中孵育30分钟，然后洗涤三次。然后测量发光以确定转导是否发生(第0天)，以及之后以24小时为增量(第1天和第2天)(图9A)进行确定。第0天的读数提供了nLuc背景的测量值，而第1天和第2天的读数测量了转导产生的nLuc。在测量发光之前，将转导的细胞用PBS洗涤三次以减少样品中的背景nLuc。对裂解的细胞进行发光测量以富集nLuc信号。在对照样品(pRTX-637)中，从第0天到第2天发光没有增加，表明在VP1不存在的情况下没有形成载体(图9B)。在用串联CAV共转染的样品中，从第0天到第2天观察到CAV-nLuc4、5和7的发光增加，并且观察到CAV-nLuc6从第0天到第1天的发光增加(图9C)。这表明这些IVC CA载体基因组能够在存在来自串联基因组的WT CAV的情况下进行复制和包装。此外，CAV-nLuc1、2、3或8的发光没有增加表明这些构建体中被CA载体插入片段破坏的区在复制和/或包装中起着必要的作用。
实例6：从上清液纯化CA载体
为浓缩上清液CA载体颗粒并进一步减少残留nluc，将10ml CA载体上清液铺在20％蔗糖垫上并以31,000rpm离心3小时以沉淀病毒和载体颗粒。去除上清液和蔗糖，将沉淀重悬浮于PBS中过夜。使用CAV和CA载体探针对重悬浮的沉淀物进行DNA酶保护测定。这证实了以约1x 108载体/ml的浓度成功纯化了CA载体颗粒(图10A)。使用CA载体DNA酶保护测定作为指导，使用3个CA载体基因/细胞组的归一化量转导MDCC-MSB1细胞。将3x 105个CA载体基因组与1x 105个MDCC-MSB1细胞在48孔板中孵育30分钟或48小时，并在3次PBS洗涤步骤后测量发光以确定是否转导发生。第0天的结果表明背景nLuc信号降低(图10B)。此外，第2天的结果证实CAV-nLuc4-7产生了转导MDCC-MSB1细胞的载体。第2天的发光值在CAV-nluc4-7之间相似，表明这些载体以相似的效率转导细胞。这一结果还定义了窗口，其跨越nluc4的纳米萤光素酶盒的5'最末端和构建体nluc7中的盒的3'最末端，其中可以将转基因插入CAV基因组中，以成功回收具有转导能力的载体。
实例7：CA载体转导人细胞
在本实例中，评估了CA载体是否可以转导Raji或Jurkat细胞。CAV-nluc4和CAV-nluc6用作测试对象，CAV-nluc1、CAV WT和p637+nluc6用作预期的阴性对照。模拟转导的细胞也用作进一步的阴性对照。将3x 105个CA载体基因组与1x 105个Raji或Jurkat细胞在48孔板中孵育30分钟或48小时，并在3次PBS洗涤步骤后测量发光以确定是否转导发生。在Raji细胞中，从第0天到第2天，在用CAV-nluc4和CAV-nluc6而不是阴性对照转导的细胞中发光增加(图11B)。用CAV n-Luc4和CAV-nLuc6转导的Jurkat细胞也显示从第0天到第2天发光增加(图11A)。这些数据表明CA载体能够转导人细胞。
在第二实例中，使用CA载体-nLuc在低(<10)感染复数(MOI)下并使用次优启动子，在大量细胞系中进行了转导筛选。筛选显示，在这些条件下，MOI为3，在淋巴样细胞中检测到转导，包括MOLT-4细胞(从第0天到第2天发光增加约2.5X)、Jurkat细胞(从第0天到第2天发光增加约0-2.5X)和Raji细胞(从第0天到第2天发光增加约4-13X)。
实例8：CA载体对中和性抗体的抗性
鸡血清中CA载体对人IVIG的抗性和VP1特异性抗体对CA载体的中和
我们评估了CA载体是否被抗VP1抗体中和。发现来自两个独立来源的鸡血清含有针对CAV的VP1衣壳蛋白的中和性抗体。CAV与鸡血清或针对VP1肽产生的抗VP1抗体一起孵育。由于许多鸡都接种了CAV疫苗，因此假设鸡血清会中和CAV。此外，预计抗VP1肽抗体不会中和CAV，因为它们基于不具有构象相关性的肽。孵育后，接种细胞并在7天后测量总病毒基因组。发现鸡血清中和了CAV，而抗VP1肽抗体则没有(图13A)。为了证明中和是由于中和鸡血清中的VP1抗体，使用鸡血清作为抗体来源对纯化的CAV颗粒进行了蛋白质印迹。观察到的条带与抗VP1抗体检测到的条带一致，表明中和是由于VP1特异性抗体引起的(图13B)。为了表明CA载体被VP1衣壳化，我们测试了鸡血清中的中和性抗体是否可以阻断CA载体转导。CA载体与鸡血清、非中和性VP1抗体或人静脉内免疫球蛋白(IVIG)一起孵育。然后进行转导测定。鸡血清中和了CA载体转导，而抗VP1抗体和IVIG则没有(图13C)。这表明CA载体转导是通过VP1介导的，并且CA载体是衣壳化的病毒载体。
CA载体对中和性人抗体的抗性
通过在氯化铯(CsCl)中等密度离心纯化颗粒来进行进一步表征(图19A)。DNA酶保护的载体拷贝(纳米萤光素酶扩增子)中的峰与qPCR确定的野生型CAV颗粒中的峰重合，对应于约1.29g/mL的密度。级分被透析并发现转导细胞，产生与观察到的qPCR滴度成比例的纳米萤光素酶发光信号(图19B)。
为了进一步探究CA载体对人抗体中和的敏感性，对10个人血清样品以及阳性和阴性对照进行了测定。与最初的IVIG观察一致，10个样品中只有一个在大于1:10的稀释度下显示出任何中和迹象(图19C)。相比之下，编码相同纳米萤光素酶盒的腺相关病毒2(AAV2)载体用相同的血清和对照样品进行了测定，并显示根据基于先前公布的数据的预期被中和(图19D)。10个供体血清中的三个在大于1:10稀释情况下中和了AAV2载体，并且1:1250稀释的IVIG也有效地中和了该载体。
实例9：没有野生型CAV时CA载体的生产
本实例证明了CAV蛋白反式提供给包含外源基因的CA载体，导致CA载体制剂不可检测地包含野生型CAV。由此产生的CA载体能够将外源基因递送至靶细胞。
如以上实例中所述，通过将表达纳米萤光素酶报告基因的体外环化(IVC)的CA载体DNA与编码串联CAV基因组的质粒共转染，已经基于CAV(CA载体)产生了病毒载体。从细胞上清液和裂解物中，回收了真正的CA载体，但由于CAV串联基因组，所得制剂可能包括WTCAV颗粒。在此之后，努力生产纯CA载体，没有WT CAV。代替串联CAV质粒，细胞转染了编码完整CAV基因组(pCAV)的质粒，该质粒表达CAV蛋白但不能制造包装的颗粒。据推测，来自其天然启动子的CAV蛋白的表达将足以复制和包装共转染的CA载体DNA。作为阴性对照，CA载体IVC与质粒CAV共转染，其中VP1编码区已被删除(pΔVP1)。因此，阴性对照不会产生包装的CA载体。
在将pCAV和CA载体nLuc6 IVC转染到MDCC-MSB1细胞后3天，收集并裂解细胞沉淀，并通过在20％蔗糖垫上超速离心进行部分纯化。将离心后的沉淀重悬浮于PBS中，并对MDCC-MSB1细胞进行转导测定。为了确认可能观察到的任何转导信号是由于VP1衣壳化载体引起的，两种情况都用来自鸡血清的VP1中和性抗体(NAb)进行了处理。在进行转导之前，将样品与或不与VP1中和性抗体一起预孵育。在转导后30分钟或2天收集样品以测量发光变化作为转导读数。
阴性对照pΔVP1没有拯救CA载体(图14)。从第0天到第2天，在pCAV+nLuc6样品中观察到发光增加25倍，并且该信号被中和性抗体阻断，表明pCAV成功拯救了CA载体。至少根据三项证据，该样品中不应该有任何复制的CAV。首先，pCAV转染一直显示缺乏野生型CAV回收。其次，在qPCR测定中未检测到过量的DNA酶保护的CAV基因组。第三，当将野生型CAV添加到CA载体样品中时，观察到的发光信号会增加。
实例10：用于注射到小鼠中的nLucCA载体的生产
在本实例中，生成了携带nLuc转基因的CA载体并将其注射到小鼠体内。简而言之，用nLuc6CA载体构建体(如本文所述，例如表7)或CAV(阴性对照)转染3e8个MDCC-MSB1细胞。用AAV2构建体转染Expi293细胞作为阳性对照。转染的细胞在3升培养基中生长3天。去除上清液并将细胞沉淀在0.5％ SDS中裂解并用benzonase处理以消化未保护的核酸。然后将裂解的沉淀物通过0.45μm过滤器。经过滤的裂解物通过20％蔗糖垫以31,000rpm超速离心三小时，重悬浮过夜，然后运行通过CsCl线性梯度。然后对样品进行分级分离，对级分进行透析，然后对所得浓缩物进行定量。进行了质量检查。所得制剂的滴度和内毒素水平示于图12。
实例11：在小鼠体内施用CA载体，导致在多个器官中递送有效载荷DNA
在本实例中，携带纳米萤光素酶(nLuc)载荷的CA载体在体内被递送到小鼠组织中。简而言之，小鼠接受了相当剂量的(i)野生型CAV(WT)和携带编码纳米萤光素酶(Nluc)载荷的遗传元件的CA载体的混合物，或(ii)单独的野生型CAV，或(iii)也对nLuc载荷进行编码的AAV2。测试了多种递送途径，包括视网膜下(SR)、IV、IP和IM(如下表23所示)。
为了评估CAV和/或CA载体的组织分布，注射后3周处死动物，并收集各种组织(血液、肝、脾、肺、心脏、卵巢、肌肉、脑、肾和视网膜)。从组织中提取总DNA，并通过qPCR评估CA载体基因组(使用nLuc探针)或CAV WT病毒基因组。相对于AAV2 IM组(图16A和16C)，我们检测到通过IV和IP途径接受CA载体的小鼠的脾和肝中CA载体水平升高(nLuc拷贝数/μgDNA)。此外，我们在施用CAV WT或CA载体(包括通过IV和IP)的小鼠的肝和脾中检测到野生型CAV基因组(图16B和16D)。我们还在肌肉、视网膜、心脏和卵巢中观察到了类似的信号，但脑中没有。以与施用途径一致的模式在组织中检测到载体(图20)。这些数据表明CA载体DNA在小鼠中体内递送成功。
表23.小鼠中CA载体和对照的施用剂量和途径
实例12：接受CA载体相比于AAV2的小鼠的免疫原性
在本实例中，如实例11所述，针对CAV或AAV2的抗体响应评估通过肌内(IM)施用接受野生型CAV、CA载体或AAV2的小鼠。使用依赖于检测来自编码的nLuc转基因的发光信号的体外中和测定法测量针对CAV或AAV2的抗体响应。当样品中存在针对施用的载体(即CAV或AAV2)的中和性抗体时，载体产生的发光会减少。简而言之，将来自处死后小鼠的血清样品热灭活并连续稀释。为了比较CAV和AAV2的相对免疫原性，绘制了通过IM途径接受CAV或AAV2的小鼠的中和测量值(发光在倒置的y轴上)(图17A)。
鸡血清在所有测试的稀释度下诱导CA载体的完全中和，而预计不会引发CAV抗体的AAV2-nluc IM阴性对照则没有诱导(图19A)。值得注意的是，来自接受CA载体和CAV WTIM的小鼠的血清没有中和CA载体。相比之下，IM给予AAV2的动物产生高水平的抗AAV2中和性抗体，与人IVIG中存在的滴度相当(图17B和17C)。AAV2-nLuc低剂量和高剂量动物的50％几何平均中和倒数滴度(50％ GMT)分别为320和640，而人IVIG为1,280。通过其他途径，CA载体和CAV WT引发较低水平的中和性抗体。对于IV施用的CAV，观察到的最高滴度是160。这些数据表明，当肌内注射时，CA载体的免疫原性低于AAV2载体。
实例13：CAV样颗粒(VLP)在体外从纯化的衣壳蛋白组装
在本实例中，CAV衣壳蛋白VP1的体外颗粒形成如图18顶部的工作流程所示进行了评估。简而言之，重组VP1(rVp1)在哺乳动物细胞中与CAV VP2共表达，并通过N末端亲和标签(图18，小图2)随后通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯化。VP1以对应于野生型CAV病毒保留体积的保留体积从SEC洗脱(图18，分图3)。通过电子显微镜在VP1 SEC级分中观察到类似于CAV的颗粒(图18，分图4)。推定的VP1 VLP的大小与野生型CAV颗粒大致相同，并表现出与野生型CAV病毒相同的喇叭形刺突特征(图18，分图5)。这些结果表明CAV VP1蛋白可以在体外组装成病毒样颗粒。
实例14：CA载体通过晚期内体途径进入MDCC-MSB1细胞
在本实例中，评估了CAV病毒进入细胞的机制。通过发光测定法检测CA载体转导能够评估四种已知抑制不同病毒进入途径的化合物的作用。测试的化合物包括巨胞饮抑制剂盐酸阿米洛利(EIPA)和红海海绵素B(LatB)、抑制内吞作用早期事件的dynasore和内体酸化抑制剂巴佛洛霉素A1(BafA1)(图21A)，评估了它们抑制转导的能力。在用CA载体进行20小时转导孵育之前15分钟和期间，将化合物或二甲基亚砜(DMSO)稀释剂对照加入MDCC-MSB1细胞。还进行了在Expi293细胞上使用AAV2-nLuc载体的对照实验。
测量发光以定量CA载体转导，表明相对于DMSO稀释剂对照，dynasore和BafA1导致信号下降超过千倍，而其他两种化合物的影响最小(图21B)。相比之下，AAV2-nluc被dynasore和BafA1抑制到相似的程度，并且被LatB抑制约3倍(图21C)。在没有任何病毒载体和DMSO的情况下，用每种进入抑制剂处理细胞，没有观察到明显的细胞死亡。
实例15：热处理后和4℃储存后的CA载体活力
为了评估CA载体的稳定性，确定了热稳定性和储存稳定性。通过20％蔗糖垫沉淀细胞裂解物、等密度CsCl离心和透析到含有二价阳离子和0.001％泊洛沙姆188的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来纯化载体。
在第一实例中，载体在40℃至95℃的温度范围内进行了十五分钟的热处理(图22A)。转导信号在55℃处理后没有变化，在65℃处理15分钟后减少10倍，并在75℃孵育后消除。包括中和对照(NAb)以排除任何虚假的发光信号。
在第二实例中，纯化的CA载体样品在样品耗尽之前在4℃下储存了六个月。在此期间，对该材料进行了转导效力的3次可比较测试。结果示于图22B。转导信号在此期间保持不变。
实例16：使用串联质粒回收CA载体
本实例描述了使用包含两个CA载体基因组拷贝的串联质粒构建体(pRTx-1580)来回收编码纳米萤光素酶(nLuc)基因的示例性CA载体。串联构建体的示意图显示在图23A中。第一基因组拷贝编码纳米萤光素酶转基因代替部分ORF，但保留病毒顺式元件和其余ORF。第二基因组拷贝是完整的CA载体基因组，除了缺失3'NCR。
为了评估该构建体是否可以产生载体，用串联载体构建体转染MDCC-MSB1细胞。转染后3天收获转染的细胞，并使用含有20mM Tris(pH 8.0)的0.5％ SDS裂解缓冲液在37℃下裂解30分钟。然后在37度下用100U/ml的benzonase处理裂解物20分钟，然后在10,000xg下澄清30分钟以沉淀细胞碎片。将澄清的裂解物进行蔗糖垫纯化。在DNA酶处理以去除残留的未衣壳化DNA后，通过qPCR在蔗糖垫纯化材料中定量载体和野生型基因组。
如图23B所示，回收了DNA酶保护的CA载体基因组拷贝，表明pRTx-1580串联载体构建体在MDCC-MSB1转染中保留了载体DNA复制和包装的能力。为了测试这些DNA酶保护的载体基因组是否可以转导，将蔗糖垫纯化的材料添加到MDCC-MSB1或ConA-B1-VICK细胞中。在MDCC-MSB1和ConA-B1-VICK转导中均观察到发光信号相比于背景明显增加(图23C)，表明pRTx-1580构建体产生了能够转导的载体颗粒。
Claims (26)
1.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
特异性结合CAV衣壳多肽(例如，CAV VP1分子)的蛋白质结合序列，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)。
2.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
蛋白质结合序列；
其中该遗传元件能够被CAV VP1分子包装(例如，特异性包装)。
3.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
特异性结合CAV衣壳多肽的蛋白质结合序列；
其中该外源效应物：
(a)针对在人细胞中表达而经过密码子优化，
(b)是人多肽或核酸，
(c)结合人多肽或核酸，或
(d)在人细胞中具有活性，例如，调节(例如，增加或减少)人细胞中人基因的活性和/或水平)。
4.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
与SEQ ID NO:1的核苷酸1-374具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列和/或与SEQ ID NO:100的核苷酸2195-2319具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
5.一种遗传元件，其包含：
启动子元件；
编码外源效应物(例如，治疗性外源效应物)的核酸序列，和
与a e的连续部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500或3,000个核苷酸。
6.一种遗传元件，其包含：
特异性结合CAV衣壳多肽的蛋白质结合序列，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)，
其中该遗传元件不包含以下的一个或多个：
(i)全长CAV VP1基因(例如，其中该遗传元件包含该CAV VP1基因的一个或多个片段，例如，CAV VP1基因序列的少于约500、400、300、200或100个核苷酸)；
(ii)全长CAV VP2基因(例如，其中该遗传元件包含该CAV VP2基因的一个或多个片段，例如，CAV VP2基因序列的少于约500、400、300、200或100个核苷酸)；或
(ii)全长CAV凋亡蛋白基因(例如，其中该遗传元件包含该CAV凋亡蛋白基因的一个或多个片段，例如，CAV凋亡蛋白基因序列的少于约500、400、300、200或100个核苷酸)。
7.一种遗传元件，其包含：
特异性结合CAV衣壳多肽的蛋白质结合序列，例如，亲和力/特异性小于约10μM(例如，小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μM，例如，小于约900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM)，
其中该遗传元件包含以下的一个或多个：
(i)非功能性CAV VP1基因或其片段(例如，至少25、50、100、200、300、400、500个或更多个bp的连续片段)，例如，在CAV VP1编码序列的序列内，例如，在该CAV VP1编码序列的5’末端包含终止密码子；
(ii)非功能性CAV VP2基因或其片段(例如，至少25、50、100、200、300、400、500个或更多个bp的连续片段)，例如，在CAV VP2编码序列的序列内，例如，在该CAV VP2编码序列的5’末端包含终止密码子；或
(ii)非功能性CAV凋亡蛋白基因或其片段(例如，至少25、50、100、200、300、400、500个或更多个bp的连续片段)，例如，在CAV凋亡蛋白编码序列的序列内，例如，在该CAV凋亡蛋白编码序列的5’末端包含终止密码子。
8.一种核酸构建体，其包含如权利要求1-7中任一项所述的遗传元件的核酸序列。
9.一种核酸构建体(例如，质粒)，其包含以下中的一个、两个或所有三个：
(a)CAV VP1基因，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；
(b)CAV VP2基因，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；和/或
(c)CAV凋亡蛋白基因，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；
其中该核酸构建体不包含CAV包装信号，和/或其中该核酸构建体不能被CAV VP1分子包装。
10.一种宿主细胞(例如，脊椎动物细胞，例如，(i)哺乳动物细胞，例如人细胞；或(ii)鸟类细胞，例如鸡细胞)，该宿主细胞包含如权利要求1-7中任一项所述的遗传元件，或如权利要求8或9所述的核酸构建体。
11.一种CA载体，其包含：
a)包含CAV VP1分子的蛋白质性外部；
b)遗传元件，其包含：(i)启动子元件，(ii)编码外源效应物的核酸序列，和(iii)特异性结合该CAV VP1分子的蛋白质结合序列。
12.一种CA载体，其包含：
a)如权利要求1-7中任一项所述的遗传元件，和
b)蛋白质性外部，例如包含CAV VP1分子的蛋白质性外部。
13.一种CA载体，其包含：
a)如权利要求1-7中任一项所述的遗传元件，和
b)衣壳，例如包含CAV VP1分子的衣壳。
14.一种复合物，其包含：
与遗传元件结合的CAV VP1分子，
其中该遗传元件包含：(i)启动子元件，(ii)编码外源效应物的核酸序列，和(iii)蛋白质结合序列。
15.一种将外源效应物递送至靶细胞(例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的方法，该方法包括将如权利要求11-13中任一项所述的CA载体引入该细胞中。
16.一种将外源效应物递送至靶细胞(例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的方法，该方法包括：
(a)评估该靶细胞或包含该靶细胞的受试者是否存在针对CAV的不需要的免疫响应，例如抗CAV抗体，例如CAV中和性抗体；以及
(b)将如权利要求11-13中任一项所述的CA载体引入该细胞中。
17.一种选择受试者以接受CA载体的方法，该方法包括评估该受试者是否存在针对CAV的不需要的免疫响应，例如抗CAV抗体，例如CAV中和性抗体。
18.一种在有需要的受试者中调节生物活性的方法，该方法包括向该受试者中引入如权利要求11-13中任一项所述的CA载体，例如，其中该疾病或障碍是癌症。
19.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者中引入如权利要求11-13中任一项所述的CA载体，例如，其中该疾病或障碍是癌症。
20.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括：
(a)评估该受试者是否存在针对CAV的不需要的免疫响应，例如抗CAV抗体，例如CAV中和性抗体；以及
(b)将如权利要求11-13中任一项所述的CA载体引入该受试者中。
21.一种给有需要的受试者接种疫苗的方法，该方法包括向该受试者中引入如权利要求11-13中任一项所述的CA载体，其中该外源效应物包含来自感染性病原体(例如，病毒或细菌)的抗原。
22.一种制备CA载体的方法，该方法包括：
a)提供包含如权利要求1-7中任一项所述的遗传元件的宿主细胞，以及
b)在适合将该遗传元件包封在蛋白质性外部(例如，包含CAV VP1分子的蛋白质性外部)的条件下孵育该宿主细胞，
从而制备该CA载体。
23.一种储存包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物维持在1-5℃、5-10℃、10-15℃、15-20℃或20-25℃的温度持续至少约1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或2年的时间，或约1-2周、2-3周、3-4周、1-2个月、2-3个月、3-4个月、4-5个月、5-6个月、6-7个月、7-8个月、8-9个月、9-10个月、10-11个月、11-12个月、12-18个月、18-24个月或2-3年的时间。
24.一种冷却包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物的温度降低至约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃，或1-5℃(例如，约4℃)。
25.一种加热包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物的温度升高至约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，或20-25℃或25-30℃(例如，约25℃)。
26.一种加热包含CA载体的组合物的方法，该方法包括将包含CA载体(例如，如本文所述的CA载体)的组合物的温度升高至约35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，或30℃-35℃或35℃-40℃(例如，约37℃)。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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