KR20230093326A - 닭 빈혈 바이러스(cav)-기반 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 CA벡터를 제조하기 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
닭 빈혈 바이러스(CAV)는 닭을 감염시키는 자이로바이러스(Gyrovirus) 속의 비-외피(non-enveloped), 단일 가닥 DNA 바이러스이다. CAV 게놈은 VP1, VP2, 및 VP3(또한 아폽틴(Apoptin)으로 불림)을 인코딩하는 3개의 오픈 리딩 프레임을 인코딩한다. VP1은 캡시드 조립을 담당하는 주요 구성성분이다.
본 개시내용은 포유동물 또는 조류 세포를 감염시키거나 조절하기 위한 벡터, 기타 조성물, 및 관련 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 벡터는 CAV 서열, 또는 이와 상동성을 가지는 서열을 포함하는 유전 요소, 및 단백질성 외부를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 CAV 캡시드 단백질을 포함하는 단백질성 외부 또는 CAV 캡시드에 의해 봉입된다.
본 개시내용은 또한, 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포 또는 조직, 예를 들어 인간 세포 또는 인간 조직)에, 예를 들어 유전 물질을 운반하거나, 이펙터, 예를 들어 페이로드(payload)를 운반하거나, 또는 치료제 또는 치료용 이펙터를 운반하기 위한 운반 비히클로서 사용될 수 있는 CA벡터(CAVector)(예를 들어, 합성 CA벡터)를 생성하기 위한 작제물을 제공한다. 일반적으로, CA벡터는 CAV 게놈의 핵산 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV 5' UTR, 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2 유전자, 아폽틴 유전자, VP1, 3' UTR, GC-풍부 영역, 폴리A 신호 서열, 또는 이의 기능적 단편 중 하나 이상)에 대하여 실질적인(예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 또한 닭 빈혈 바이러스(CAV) VP1 분자에 대하여 실질적인(예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 단백질성 외부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV 캡시드 단백질, 예를 들어 CAV VP1 단백질 또는 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부)에 캡슐화된 유전 요소(예를 들어, 이펙터, 예를 들어 외인성 또는 내인성 이펙터, 예를 들어 치료용 이펙터를 포함하거나 인코딩하는 유전 요소)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 유전 요소를 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포) 내로 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 CAV VP1 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부를 포함하는 감염성 비히클 또는 입자이다. 본 개시내용의 CA벡터의 유전 요소는 통상적으로 환형 및/또는 단일-가닥 DNA 분자(예를 들어, 환형 및 단일 가닥)이다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 이를 봉입하는 단백질성 외부, 또는 이에 부착된 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하며, 이는 단백질성 외부 내의 유전 요소의 봉입 및/또는 단백질성 외부 내에서 다른 핵산에 비해 유전 요소의 농축을 용이하게 할 수 있다.
일부 예에서, 유전 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 유전 요소 작제물을 사용하여 제공된다. 일반적으로, 유전 요소 작제물은 CA벡터를 형성하기 위해 단백질성 외부로 봉입된 유전 요소의 서열에 해당하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 유전 요소 작제물은 환형 또는 선형이다. 일부 예에서, 유전 요소는 환형이다. 일부 예에서, 유전 요소는 단일-가닥이다. 일부 예에서, 유전 요소는 이중-가닥이다. 일부 예에서, 유전 요소는 DNA이다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부에 봉입하기에 적합한 유전 요소는 유전 요소 작제물에서 유전 요소 서열의 회전환 복제(rolling circle replication)를 통해 생성될 수 있다.
일부 예에서, 유전 요소는, 예를 들어 세포(예를 들어, 표적 세포)에서 발현될 수 있는, 이펙터(예를 들어, 핵산 이펙터, 예컨대 비-코딩 RNA, 또는 폴리펩티드 이펙터, 예를 들어 단백질)를 포함하거나 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이펙터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 치료제 또는 치료용 이펙터이다. 일부 구현예에서, 이펙터는, 예를 들어 야생형 CAV 및/또는 표적 세포에 대하여, 내인성 또는 외인성이다. 일부 구현예에서, 이펙터는 야생형 CAV 및/또는 표적 세포에 대하여 외인성이다. 일부 구현예에서, CA벡터는 세포와 접촉시키고, 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 세포 내로 도입하여, 이펙터가 세포에 의해 제조되거나 발현되게 함으로써 이펙터를 세포 내로 운반할 수 있다. 특정 예에서, 이펙터는 표적 세포에 대하여 내인성이다(예를 들어, CA벡터에 의해 증가된 양으로 제공됨). 다른 예에서, 이펙터는 표적 세포에 대해 외인성이다. 이펙터는 일부 예에서, 세포의 기능을 조절하거나, 세포 내의 표적 분자의 활성 또는 수준을 조절할 수 있다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킬 수 있다). 예를 들어, 이펙터는 세포 내의 표적 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 이펙터는 세포 내의 표적 단백질의 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 생체 내에서 이펙터, 예를 들어 외인성 단백질을 운반하고 발현할 수 있다. CA벡터는, 예를 들어 유전 물질을 표적 세포, 조직, 또는 대상체로 운반하기 위해; 이펙터를 표적 세포, 조직, 또는 대상체로 운반하기 위해; 또는 예를 들어 요망되는 세포, 조직, 또는 대상체에서 치료제로서 작용할 수 있는 이펙터를 운반함으로써, 질환 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물(예를 들어, 유전 요소 작제물)은, 예를 들어 숙주 세포에서, 합성 CA벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 합성 CA벡터는 야생형 바이러스(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV)와 비교하여 적어도 하나의 구조적 차이, 예를 들어 야생형 바이러스의 게놈에 비해 유전 요소의 차이 및/또는 야생형 바이러스에 비해 구조적 단백질(예를 들어, 단백질성 외부의 단백질, 예를 들어 캡시드 단백질, 예를 들어 VP1 분자)의 차이를 갖는다. 일부 구현예에서, 차이는 야생형 바이러스에 비해 결실, 삽입, 치환, 또는 기타 변형(예를 들어, 효소적 변형) 중 하나 이상을 포함한다. 일반적으로, 합성 CA벡터는 단백질성 외부(예를 들어, CAV VP1 분자를 포함함) 내에 봉입된 외인성 유전 요소를 포함하며, 이는 유전 요소 또는 그 내에 인코딩된 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 이펙터)를 진핵(예를 들어, 인간) 세포 내로 운반하기 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 (i) 프로모터 요소, 및 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열, 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 CA벡터를 제공하며; 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 캡시드) 내에 봉입된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소를 진핵(예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간) 세포 내로 운반할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 단일-가닥 및/또는 환형 DNA이다. 대안적으로 또는 조합하여, 유전 요소는 하기 특성 중 1, 2, 3개, 또는 전부를 갖는다: 환형이고/이거나, 단일-가닥이고/이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 미만의 빈도로 세포의 게놈 내로 통합되고/되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합됨. 일부 구현예에서, 통합 빈도는, 예를 들어 문헌[Wang et al., 2004, Gene Therapy 11: 711-721](본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 자유 벡터에서 분리된 게놈 DNA의 정량적 겔 정제 분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 야생형 CAV의 서열, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 야생형 CAV 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어, 300 내지 4000개 뉴클레오티드, 예를 들어 300 내지 3500개 뉴클레오티드, 300 내지 3000개 뉴클레오티드, 300 내지 2500개 뉴클레오티드, 300 내지 2000개 뉴클레오티드, 300 내지 1500개 뉴클레오티드, 1000 내지 4000개 뉴클레오티드, 2000 내지 4000개 뉴클레오티드, 1000 내지 3000개 뉴클레오티드, 2000 내지 2500개 뉴클레오티드, 또는 2000 내지 3000개 뉴클레오티드의 핵산 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 야생형 CAV 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 야생형 CAV 서열)의 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어, 적어도 300개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 1000개 뉴클레오티드, 1500개 뉴클레오티드, 2000개 뉴클레오티드, 2500개 뉴클레오티드, 3000개 뉴클레오티드 또는 그 이상의 핵산 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은, 예를 들어 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 발현을 위하여 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열 내의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 코돈은, 예를 들어 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 발현을 위하여 코돈-최적화된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유전 요소 작제물은 나란히 배열된 유전 요소 서열의 제1 카피(예를 들어, 돌연변이체 닭 빈혈 바이러스(CAV) 게놈) 및 유전 요소 서열의 제2 카피의 적어도 일부(예를 들어, CAV 게놈 또는 이의 단편)를 포함한다. 이러한 구조를 갖는 유전 요소 작제물은 일반적으로 본 명세서에서 탠덤 작제물로 지칭된다. 이러한 탠덤 작제물은 CA벡터 유전 요소를 생성하는 데 사용된다. 유전 요소 서열의 제1 카피 및 유전 요소 서열의 제2 카피는, 일부 예에서 유전 산 작제물에서 서로 바로 인접할 수 있다. 다른 예에서, 유전 요소 서열의 제1 카피 및 유전 요소 서열의 제2 카피는, 예를 들어 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피, 또는 이의 일부는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 상류 복제-촉진 서열(uRFS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피, 또는 이의 일부는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 하류 복제-촉진 서열(dRFS)을 포함한다. 일부 구현예에서, uRFS 및/또는 dRFS는 복제 원점(ORI)(예를 들어, 포유동물 ORI 또는 곤충 ORI) 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, uRFS 및/또는 dRFS는 복제 원점을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, uRFS 및/또는 dRFS는 (예를 들어, 5' UTR에) 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 구현예에서, 탠덤 작제물은 유전 요소의 제2 카피 또는 이의 일부가 결여된 다른 유사한 작제물보다 더 높은 수준의 유전 요소를 생성한다. 이론에 구속되고자 하지 않지만, 본 명세서에 기재된 탠덤 작제물은, 일부 구현예에서 회전환 복제에 의해 복제할 수 있다. 일부 구현예에서, 탠덤 작제물은 플라스미드이다.
탠덤 작제물은, 일부 예에서, 유전 요소 서열의 제1 카피 및 유전 요소 서열의 제2 카피, 또는 이의 일부(예를 들어, uRFS 또는 dRFS)를 포함할 수 있다. 제2 카피는 제1 카피와 동일한 카피 또는 이의 일부일 수 있거나, 하나 이상의 서열 차이, 예를 들어 치환을 포함할 수 있음이 이해된다. 일부 예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피 또는 이의 일부(예를 들어, uRFS)는 유전 요소 서열의 제1 카피에 대해 5'에 위치한다. 일부 예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피 또는 이의 일부(예를 들어, dRFS)는 유전 요소 서열의 제1 카피에 대해 3'에 위치한다. 일부 예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피 또는 이의 일부 및 유전 요소 서열의 제1 카피는 탠덤 작제물에서 서로 인접해 있다. 일부 예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피 또는 이의 일부 및 유전 요소 서열의 제1 카피는, 예를 들어 스페이서 서열에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 탠덤 작제물은 치료용 이펙터를 인코딩하는 (CAV에 대한) 이종 서열 및 캡시드에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 캡슐화하는 캡시드(예를 들어, CAV ORF, 예를 들어 VP1, 폴리펩티드를 포함하는 캡시드)를 포함하는 (예를 들어, 인간 세포에 대한) 감염성 CA벡터, 비히클, 또는 입자의 유전 요소를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소를 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포 내로 운반할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 야생형 CAV 게놈 서열에 대하여 약 6% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 미만 또는 그 이하)의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 야생형 CAV 게놈 서열에 대하여 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5% 또는 6% 이하의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 야생형 CAV에 대하여 적어도 약 2% 내지 적어도 약 5.5%(예를 들어, 2 내지 5%, 3% 내지 5%, 4% 내지 5%)의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2000, 3000, 4000, 4500, 또는 5000개 초과의 비-바이러스 서열(예를 들어, 비 CAV 게놈 서열)의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2000 내지 5000, 2500 내지 4500, 3000 내지 4500, 2500 내지 4500, 3500 또는 4000, 4500개(예를 들어, 약 3000 내지 4500개) 초과의 비-바이러스 서열(예를 들어, 비 CAV 게놈 서열)의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 단일-가닥, 환형 DNA이다. 대안적으로 또는 조합하여, 유전 요소는 하기 특성 중 1, 2, 3개, 또는 전부를 갖는다: 환형이거나, 단일 가닥이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 미만의 빈도로 세포의 게놈 내로 통합되고/되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합되거나, (예를 들어, 세포 용해물로부터의 유전 요소 서열에 대한 게놈 DNA 내로의 통합 빈도를 비교함으로써) 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 미만의 빈도로 통합됨. 일부 구현예에서, 통합 빈도는, 예를 들어 문헌[Wang et al., 2004, Gene Therapy 11: 711-721](본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 자유 벡터에서 분리된 게놈 DNA의 정량적 겔 정제 분석에 의해 결정된다.
본 명세서의 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소 또는 유전 요소 작제물, 예를 들어 탠덤 작제물인 제1 핵산 분자, 및 단백질성 외부, 예를 들어 캡시드 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 세포 내로 도입함으로써 제조된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전 요소 작제물에서, 예를 들어 시스로) 서로 부착된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 (예를 들어, 트랜스로) 분리되어 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 분자는 플라스미드, 코스미드, 박미드, 미니서클, 또는 인공 염색체이다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 플라스미드, 코스미드, 박미드, 미니서클, 또는 인공 염색체이다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈에 통합된다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 제1 핵산 분자 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 숙주 세포 내로 도입된다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 헬퍼 작제물, 헬퍼 바이러스 또는 다른 헬퍼 벡터이거나 이를 포함하거나 이의 일부이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV 또는 CA벡터는 작용제, 예컨대 본 명세서에 기재된 이펙터를 표적 세포, 예를 들어 치료될 대상체의 표적 세포에 도입하기 위한 효과적인 운반 비히클로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터는 하기를 (예를 들어, 연속하여) 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 합성 폴리펩티드, 예를 들어 VP1 분자)를 포함하는 단백질성 외부를 포함한다:
(i) 아르기닌-풍부 영역, 예를 들어 적어도 60%, 70%, 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신, 또는 이의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개의 아미노산의 서열을 포함하는 제1 영역,
(ii) 젤리-롤(jelly-roll) 도메인, 예를 들어 소수성 계면을 가로질러 함께 패킹되는 2개의 역평행 베타 시트에 배열된 적어도 6개의 베타 가닥, 예를 들어 6, 7 또는 8개의 베타 가닥을 포함하는 서열을 포함하는 제2 영역, 및
(iii) 선택적으로 폴리펩티드는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV VP1 단백질에 대하여 100%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가짐.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터는, 예를 들어 문헌[Cheng et al., 2019, Virol. J. 16:45](본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 하기 중 임의의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4개, 또는 전부)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부를 포함한다:
(i) 아미노산 서열 RRARRPRGRFYAFRRGR, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 핵 국재화 신호(NLS);
(ii) 아미노산 서열 KRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 핵 국재화 신호(NLS);
(iii) 아미노산 서열 IFLTEGLIL, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 핵외 수송 신호(NES);
(iv) 아미노산 서열 LKEFLLASMNL, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 핵외 수송 신호(NES);
(v) 아미노산 서열 ELDTNFFTLYVAQ, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 핵외 수송 신호(NES).
일 양태에서, 본 발명은 이펙터, 예를 들어 페이로드를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소, 및 외부 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소의 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 유전 요소 작제물)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 외부 단백질 결합 서열은, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은, CAV의 5'UTR 서열에 대하여 적어도 75%(적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100%) 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, 유전 요소는 단일-가닥 DNA이고/이거나, 환형이고/이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 미만의 빈도로 통합되고/되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합되거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 미만의 빈도로 통합된다. 일부 구현예에서, 통합 빈도는, 예를 들어 문헌[Wang et al., 2004, Gene Therapy 11: 711-721](본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 자유 벡터에서 분리된 게놈 DNA의 정량적 겔 정제 분석에 의해 결정된다. 구현예에서, 이펙터는 TTV로부터 기원하지 않으며, SV40-miR-S1이 아니다. 구현예에서, 핵산 분자는 TTMV-LY2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 프로모터 요소는 진핵(예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간) 세포에서 이펙터의 발현을 지시한다. 구현예에서, 이펙터는 포유동물 핵산 또는 폴리펩티드(예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간의 폴리펩티드 또는 핵산)이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 환형이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 선형이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 염기 변형, 당 변형, 또는 백본 변형)를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 VP1 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 VP2 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP2 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 아폽틴 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV 아폽틴 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소 및 이펙터, 예를 들어 외인성 또는 내인성 이펙터를 인코딩하는 서열; (ii) 야생형 CAV 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 또는 150개 뉴클레오티드; 또는 야생형 CAV 서열에 대하여 적어도 72%(예를 들어, 적어도 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 100개(예를 들어, 적어도 300, 500, 1000, 1500개)의 인접 뉴클레오티드; 및 (iii) 단백질 결합 서열, 예를 들어 외부 단백질 결합 서열 중 1, 2, 또는 3개를 포함하는 유전 요소를 특징으로 하며, 유전 요소 작제물은 단일-가닥 DNA이고; 유전 요소 작제물은 환형이고/환형이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 또는 2% 미만의 빈도로 통합되고/통합되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 이펙터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 외인성 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 유전 요소는 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 환형이다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 선형이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유전 요소는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 염기 변형, 당 변형, 또는 백본 변형)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 VP1 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 VP2 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP2 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 아폽틴 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV 아폽틴 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 탠덤 작제물을 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는, (a) VP1 분자, VP2 분자, 또는 아폽틴 분자 중 하나 이상을 인코딩하는 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAV VP1 폴리펩티드를 인코딩하는 서열)을 포함하되, 예를 들어 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 염색체에 통합되는 핵산 분자; 및 (b) (i) 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소, 및 (ii) (a)의 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하되, 선택적으로 유전 요소는 VP1 폴리펩티드(예를 들어, VP1 단백질)를 인코딩하지 않는다. 예를 들어, 숙주 세포는 (a) 및 (b)를 시스(동일한 핵산 분자의 두 부분) 또는 트랜스(상이한 핵산 분자의 각각의 부분)로 포함한다. 구현예에서, (b)의 유전 요소는 환형, 단일-가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 제조(manufacturing) 세포주이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 부착성이거나, 현탁액 중에 존재하거나, 둘 다이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 마이크로캐리어에서 성장된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 cGMP 제조 실무와 양립 가능하다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 세포 성장을 촉진시키기에 적합한 배지 중에서 성장된다. 특정 구현예에서, 일단 숙주 세포 또는 헬퍼 세포가 (예를 들어, 적절한 세포 밀도로) 충분히 성장하면, 배지를 숙주 세포 또는 헬퍼 세포에 의한 CA벡터의 생성에 적합한 배지로 교체할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터(예를 들어, 합성 CA벡터)를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 구현예에서, 약제학적 조성물은 표적 대상체 킬로그램당 약 105 내지 1014개(예를 들어, 약 106 내지 1013, 107 내지 1012, 108 내지 1011, 또는 109 내지 1010개)의 게놈 당량의 CA벡터를 포함하는 단위 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 허용 가능한 기간 및 온도에 걸쳐 안정하고/하거나 요망되는 투여 경로 및/또는 투여 경로가 필요로 할 임의의 디바이스, 예를 들어, 니들(needle) 또는 주사기와 병용 가능하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 단회 용량 또는 다회 용량으로서의 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 투여 장소에서, 예를 들어 의료 전문가(healthcare professional)에 의해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 (예를 들어, 부피당 게놈의 수에 의해 정의된 바와 같은) 요망되는 농도의 CA벡터 게놈 또는 게놈 당량을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CA벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 하며, 조성물은 21 C.F.R. §§610.12 및 610.13의 요건을 충족한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 하기 특성 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 8개 전부를 가질 수 있다:
(i)
실질적으로 외래성 물질(adventitious agent)이 결여됨,
(ii)
실질적으로 발열성 물질이 결여됨,
(iii)
대조군 참조 또는 규격, 예를 들어 내독소 오염에 대한 미국 약전(USP) 또는 FDA 참조 표준물과 같거나 그보다 더 적은 내독소를 함유함,
(iv)
대조군 참조 또는 규격, 예를 들어 마이코플라스마 오염에 대한 미국 약전(USP) 또는 FDA 참조 표준물과 같거나 그보다 더 적은 마이코플라스마를 함유함,
(v)
대조군 참조 표준물보다 더 적은 숙주 세포 DNA, 예를 들어 용량당 10 ng 미만의 숙주 세포 DNA, 용량당 5 ng 미만의 숙주 세포 DNA를 함유함,
(vi)
대조군 참조 표준물보다 더 적은 숙주 세포 단백질(HCP), 예를 들어 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 및/또는 10 ng/용량 미만, 5 ng/용량 미만을 함유함,
(vii)
임계량 미만의 비-감염성 입자를 함유함, 예를 들어 감염성 입자에 비하여 비-감염성 입자에 대해 사전결정된 방출 규격, 예를 들어 입자 대 감염성 유닛이 2000:1 미만, 1000:1 미만, 500:1 미만, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만인 것을 충족함, 및/또는
(viii)
임계량 미만의 빈 캡시드(즉, 게놈이 결여됨)를 함유함, 예를 들어 빈 캡시드에 대해 사전결정된 방출 규격을 충족함.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료 방법을 특징으로 하며, 방법은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 세포, 조직 또는 대상체에 운반하는 방법을 특징으로 하며, 방법은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, CA벡터는 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 페이로드는 핵산이다. 구현예에서, 페이로드는 폴리펩티드이다.
일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터를, 예를 들어 생체 내에서 또는 생체 외에서, 세포, 예를 들어 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포로 CA벡터를 운반하는 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a)
(i) 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터의 유전 요소의 핵산 서열의 제1 카피, 및 CA벡터의 유전 요소의 핵산 서열의 제2 카피, 또는 이의 일부(예를 들어, uRFS 또는 dRFS)를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
(ii) CAV VP1 폴리펩티드, 또는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, VP1, VP2, 또는 아폽틴 분자로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나 이상, 또는 이에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 제2 핵산 분자
를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 숙주 세포를 유전 요소의 핵산 서열의 제1 카피의 복제(예를 들어, 회전환 복제)에 적합한 조건 하에서 배양하여, 유전 요소를 생성하는 단계;
선택적으로 (c) 단백질성 외부(예를 들어, 제2 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함함)의 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
선택적으로 (d) CA벡터를 세포 또는 세포 배양물로부터 수확하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a), (b), (c), 및 (d) 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함하는, CA벡터 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 한다:
a) 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터 중 하나 이상의 구성성분(예를 들어, 구성성분의 전부)을 포함하는, 예를 들어 발현하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
b) 숙주 세포를 숙주 세포로부터 CA벡터의 제제를 생성하기에 적합한 조건 하에서 배양하되, 제제의 CA벡터는 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 캡슐화하는 단백질성 외부(예를 들어, CA벡터 VP1 폴리펩티드를 포함함)를 포함하여, CA벡터의 제제를 제조하는 단계;
선택적으로, c) 숙주 세포로부터 CA벡터를 수확하는 단계,
및
선택적으로, d) 예를 들어 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서, CA벡터의 제제를 제형화하는 단계.
예를 들어, 이 제조 방법에서 제공되는 숙주 세포는 (a) 본 명세서에 기재된 CAV VP1 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하되, 핵산은 플라스미드이거나, 바이러스 핵산 또는 게놈이거나, 헬퍼 세포 염색체에 통합되는 핵산; 및 (b) 유전 요소를 생성할 수 있는 탠덤 작제물을 포함하되, 유전 요소는 (i) 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소, 및 (i) (a)의 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열(예를 들어, 패키징 신호)을 포함하고, 숙주 세포는 (a) 및 (b)를 시스 또는 트랜스로 포함한다. 구현예에서, (b)의 유전 요소는 환형, 단일-가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 제조 세포주이다.
일부 구현예에서, CA벡터의 구성성분은 생성 시에 (예를 들어, 일시적 형질감염에 의해) 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CA벡터의 구성성분을 안정하게 발현한다(예를 들어, CA벡터의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은, 예를 들어 안정한 형질감염에 의해 숙주 세포 또는 이의 자손 내로 도입됨).
일 양태에서, 본 발명은 a) 본 명세서에 기재된 복수의 CA벡터, 또는 본 명세서에 기재된 CA벡터의 제제를 제공하는 단계; 및 b) CA벡터 또는 이의 제제를, 예를 들어 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, CA벡터 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 CA벡터를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포, 예를 들어 제1 숙주 세포의 집단을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 방법은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 유전 요소를 생성할 수 있는 탠덤 작제물을 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 숙주 세포를 CA벡터를 생성하기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 방법은 헬퍼, 예를 들어 헬퍼 바이러스를, 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예에서, 도입하는 단계는 CA벡터를 이용한 숙주 세포의 형질감염(예를 들어, 화학적 형질감염) 또는 전기천공법을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포를 제공하는 단계, 및 숙주 세포로부터 CA벡터를 정제하는 단계를 포함하는, CA벡터를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 방법은 상기 제공하는 단계 이전에, 숙주 세포를, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 탠덤 작제물 또는 CA벡터와 접촉시키는 단계, 및 숙주 세포를 CA벡터를 생성하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예에서, 숙주 세포는 상기 숙주 세포의 제조 방법에 기재된 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포이다. 구현예에서, 숙주 세포로부터 CA벡터를 정제하는 단계는 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포에 의해 생성되는 CA벡터를 제2 숙주 세포, 예를 들어 허용 세포, 예를 들어 제2 숙주 세포의 집단과 접촉시키는 제2 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 숙주 세포를 CA벡터를 생성하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 숙주 세포로부터 CA벡터를 정제함으로써, 예를 들어 CA벡터 시드 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예에서, 제1 숙주 세포의 집단으로부터보다 제2 숙주 세포의 집단으로부터 적어도 약 2 내지 100배 더 많은 CA벡터가 생성된다. 구현예에서, 제2 숙주 세포로부터 CA벡터를 정제하는 단계는 제2 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 숙주 세포에 의해 생성되는 CA벡터를 제3 숙주 세포, 예를 들어 허용 세포, 예를 들어 제3 숙주 세포의 집단과 접촉시키는 제2 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제3 숙주 세포를 CA벡터를 생성하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제3 숙주 세포로부터 CA벡터를 정제함으로써, 예를 들어 CA벡터 스톡(stock) 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예에서, 제3 숙주 세포로부터 CA벡터를 정제하는 단계는 제3 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함한다. 구현예에서, 제2 숙주 세포의 집단으로부터보다 제3 숙주 세포의 집단으로부터 적어도 약 2 내지 100배 더 많은 CA벡터가 생성된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 세포 성장을 촉진시키기에 적합한 배지 중에서 성장된다. 특정 구현예에서, 일단 숙주 세포가 (예를 들어, 적절한 세포 밀도로) 충분히 성장하면, 배지를 숙주 세포에 의한 CA벡터의 생성에 적합한 배지로 교체할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에 의해 생성되는 CA벡터는 제2 숙주 세포와의 접촉 이전에 (예를 들어, 숙주 세포를 용해시킴으로써) 숙주 세포로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에 의해 생성되는 CA벡터는 개재되는 정제 단계 없이 제2 숙주 세포와 접촉된다.
일 양태에서, 본 발명은 약제학적 CA벡터 제제를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터 제제를 제조하는 단계, (b) 제제(예를 들어, 약제학적 CA벡터 제제, CA벡터 시드 집단 또는 CA벡터 스톡 집단)를 하나 이상의 약제학적 품질 관리 파라미터, 예를 들어 아이덴티티, 순도, 역가, 효력(예를 들어, CA벡터 입자당 게놈 당량), 및/또는 예를 들어 CA벡터에 의해 포함되는 유전 요소로부터의 핵산 서열에 대하여 평가하는 단계, 및 (c) 평가가 사전결정된 기준을 만족시키는, 예를 들어 약제학적 규격을 만족시키는 약제학적 사용을 위한 제제를 제형화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 아이덴티티를 평가하는 것은 CA벡터의 유전 요소의 서열, 예를 들어 이펙터를 인코딩하는 서열을 평가하는 것(예를 들어, 확인하는 것)을 포함한다. 일부 구현예에서, 순도를 평가하는 것은 불순물, 예를 들어 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 작용제(RCA), 예를 들어 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 CA벡터(예를 들어, 요망되는 CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 합성 CA벡터 이외의 CA벡터), 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래성 물질 및 응집물의 양을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 역가를 평가하는 것은 (예를 들어, HPLC에 의해 평가되는 바와 같은) 제제 내의 기능성 대 비-기능성(예를 들어, 감염성 대 비-감염성) CA벡터의 비를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 효력을 평가하는 것은 제제에서 검출 가능한 CA벡터 기능(예를 들어, 그 내에 인코딩된 이펙터의 발현 및/또는 기능 또는 게놈 당량)의 수준을 평가하는 것을 포함한다.
구현예에서, 제형화된 제제는 병원체, 숙주 세포 오염물질 또는 불순물이 실질적으로 없거나; 사전결정된 비-감염성 입자의 수준 또는 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만)를 갖는다.
일부 구현예에서, 다수의 CA벡터가 단일의 배치(batch)에서 생성될 수 있다. 구현예에서, 배치에서 생성되는 CA벡터의 수준이 (예를 들어, 개별적으로 또는 함께) 평가될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다:
(i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 탠덤 작제물을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
(ii) 선택적으로, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, VP1, VP2, 또는 아폽틴 분자로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 CA벡터 및 외부 단백질(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합할 수 있는 외부 단백질, 및 선택적으로 지질 외피)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 복제 단백질(예를 들어, 중합효소)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 반응 혼합물을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, CA벡터(예를 들어, 합성 CA벡터)는 단리되며, 예를 들어 숙주 세포로부터 단리되고/되거나 용액(예를 들어, 상청액) 중 다른 구성요소로부터 단리된다. 일부 구현예에서, CA벡터(예를 들어, 합성 CA벡터)는, 예를 들어 용액(예를 들어, 상청액)으로부터 정제된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 용액 중 다른 구성요소에 비하여 용액 중에서 농축된다.
상기 CA벡터, 조성물 또는 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, CA벡터를 제공하는 것은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터-생성 세포를 포함하는 조성물로부터 CA벡터를 분리하는 것(예를 들어, 수확하는 것)을 포함한다. 다른 구현예에서, CA벡터를 제공하는 것은, 예를 들어 제3자로부터 CA벡터 또는 이의 제제를 수득하는 것을 포함한다.
상기 CA벡터, 조성물 또는 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 유전 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법에 따라 확인되는 바와 같은, CA벡터 게놈을 포함한다. 구현예에서, 유전 요소는 자가-복제할 수 있고/있거나 자가-증폭할 수 있다. 구현예에서, 유전 요소는 자가-복제할 수 없고/없거나 자가-증폭할 수 없다. 구현예에서, 유전 요소는 트랜스로 복제할 수 있고/있거나 증폭될 수 있다.
상기 CA벡터, 조성물 또는 방법 중 임의의 것의 추가의 특징은 하기 열거된 구현예 중 하나 이상을 포함한다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 열거된 구현예에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
열거된 구현예
1.
프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
예를 들어 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드(예를 들어, CAV VP1 분자)에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하는 유전 요소.
2.
프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
단백질 결합 서열
을 포함하며, CAV VP1 분자에 의해 패키징(예를 들어, 특이적으로 패키징)될 수 있는, 유전 요소.
3.
프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
CAV 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하는 유전 요소로서, 외인성 이펙터는 하기와 같은, 유전 요소:
(a) 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화됨,
(b) 인간 폴리펩티드 또는 핵산,
(c) 인간 폴리펩티드 또는 핵산에 결합함, 또는
(d) 인간 세포에서 활성을 가짐(예를 들어 인간 세포에서 인간 유전자의 활성 및/또는 수준을 조절함(예를 들어, 증가시키거나 감소시킴)).
4.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단백질 결합 서열은 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, 유전 요소.
5.
프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
서열번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 374에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및/또는 서열번호 100의 뉴클레오티드 2195 내지 2319에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열
을 포함하는 유전 요소.
6.
프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 인접 부분에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 또는 3,000개 뉴클레오티드
를 포함하는 유전 요소.
7.
구현예 6에 있어서, CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 인접 부분에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 1,000개 뉴클레오티드를 포함하는, 유전 요소.
8.
예를 들어 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하는 유전 요소로서, 하기 중 하나 이상을 포함하지 않는, 유전 요소:
(i) 전장 CAV VP1 유전자(예를 들어, 유전 요소는 CAV VP1 유전자, 예를 들어 약 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만 뉴클레오티드의 CAV VP1 유전자 서열의 하나 이상의 단편을 포함함);
(ii) 전장 CAV VP2 유전자(예를 들어, 유전 요소는 CAV VP2 유전자, 예를 들어 약 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만 뉴클레오티드의 CAV VP2 유전자 서열의 하나 이상의 단편을 포함함); 또는
(ii) 전장 CAV 아폽틴 유전자(예를 들어, 유전 요소는 CAV 아폽틴 유전자, 예를 들어 약 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만 뉴클레오티드의 CAV 아폽틴 유전자 서열의 하나 이상의 단편을 포함함).
9.
예를 들어 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 예를 들어 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하는 유전 요소로서, 하기 중 하나 이상을 포함하는, 유전 요소:
(i) 예를 들어 CAV VP1 코딩 서열의 5' 말단에서, 예를 들어 CAV VP1 코딩 서열의 서열 내에 있는 정지 코돈을 포함하는, 비기능적 CAV VP1 유전자 또는 이의 단편(예를 들어, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 bp 또는 그 이상의 인접 단편);
(ii) 예를 들어 CAV VP2 코딩 서열의 5' 말단에서, 예를 들어 CAV VP2 코딩 서열의 서열 내에 있는 정지 코돈을 포함하는, 비기능적 CAV VP2 유전자 또는 이의 단편(예를 들어, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 bp 또는 그 이상의 인접 단편); 또는
(ii) 예를 들어 CAV 아폽틴 코딩 서열의 5' 말단에서, 예를 들어 CAV 아폽틴 코딩 서열의 서열 내에 있는 정지 코돈을 포함하는, 비기능적 CAV 아폽틴 유전자 또는 이의 단편(예를 들어, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 bp 또는 그 이상의 인접 단편).
10.
구현예 8 또는 9에 있어서, 단백질 결합 서열은 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, 유전 요소.
11.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 기능적 CAV 아폽틴 유전자를 포함하지 않는, 유전 요소.
12.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 기능적 CAV VP1 유전자, 기능적 CAV VP2 유전자, 또는 기능적 CAV 아폽틴 유전자를 포함하지 않는, 유전 요소.
13.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 절단된 CAV VP1 유전자(예를 들어, CAV VP1 코딩 서열에 포함된 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 또는 20개 미만 뉴클레오티드의 인접 서열)를 포함하지 않는, 유전 요소.
14.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 절단된 CAV VP2 유전자(예를 들어, CAV VP2 코딩 서열에 포함된 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 또는 20개 미만 뉴클레오티드의 인접 서열)를 포함하지 않는, 유전 요소.
15.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 절단된 CAV 아폽틴 유전자(예를 들어, CAV 아폽틴 코딩 서열에 포함된 350, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 또는 20개 미만 뉴클레오티드의 인접 서열)를 포함하지 않는, 유전 요소.
16.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 프로모터 요소, 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터, 예를 들어 치료용 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 유전 요소.
17.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 유전 요소:
서열번호 10의 뉴클레오티드 1 내지 606의 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 또는 606개 뉴클레오티드, 및/또는
서열번호 10의 뉴클레오티드 2195 내지 2319의 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 121, 122, 123, 또는 124개 뉴클레오티드.
18.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV UTR, 예를 들어 CAV 5' UTR(예를 들어, 표 1A, 1B, 또는 2 내지 13 중 임의의 것에 열거된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
19.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 전장 CAV VP1 유전자를 포함하는, 유전 요소.
20.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 전장 CAV VP2 유전자를 포함하는, 유전 요소.
21.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 전장 CAV 아폽틴 유전자를 포함하는, 유전 요소.
22.
구현예 1 내지 18, 20, 또는 21 중 어느 하나에 있어서, 전장 CAV VP1 유전자를 포함하지 않는, 유전 요소.
23.
구현예 22에 있어서, CAV VP1 유전자의 5' 말단으로부터 1 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000개 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
24.
구현예 22 또는 23에 있어서, CAV VP1 유전자의 3' 말단으로부터 1 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000개 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
25.
구현예 22 또는 23에 있어서, CAV VP1 유전자 서열의 1349, 1340, 1330, 1320, 1310, 1300, 1250, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 미만의 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
26.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 전장 CAV VP2 유전자를 포함하지 않는, 유전 요소.
27.
구현예 26에 있어서, CAV VP2 유전자의 5' 말단으로부터 226, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5개 미만의 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
28.
구현예 26 또는 27에 있어서, CAV VP2 유전자의 3' 말단으로부터 226, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5개 미만의 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
29.
구현예 26 또는 27에 있어서, CAV VP2 유전자 서열의 650, 640, 630, 620, 610, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 100, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 또는 26개 미만의 뉴클레오티드를 포함하는, 유전 요소.
30.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 전장 CAV 아폽틴 유전자를 포함하지 않는, 유전 요소.
31.
구현예 30에 있어서, CAV 아폽틴 유전자의 5' 말단으로부터 1 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 또는 300 내지 350개 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
32.
구현예 30 또는 31에 있어서, CAV 아폽틴 유전자의 3' 말단으로부터 1 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 또는 300 내지 350개 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 유전 요소.
33.
구현예 30 또는 31에 있어서, CAV 아폽틴 유전자 서열의 365, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 미만의 뉴클레오티드를 포함하는, 유전 요소.
34.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 길이가 1,000 내지 1,500, 1,500 내지 2,000, 또는 2,000 내지 2,500개, 또는 2,500, 2,400, 2,300, 2,200, 2,100, 또는 2,000개 미만의 뉴클레오티드인, 유전 요소.
35.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, DNA, 예를 들어 단일 가닥 DNA인, 유전 요소.
36.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 환형 또는 선형인, 유전 요소.
37.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 환화된 이중-가닥 DNA를 사용하여 생성되고, 예를 들어 환화된 DNA는 시험관 내 환화에 의해 생성된, 유전 요소.
38.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 탠덤 핵산 작제물을 사용하여 생성된, 유전 요소.
39.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 프로모터 요소는 CAV에 대해 내인성인, 유전 요소.
40.
구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 프로모터 요소는 CAV에 대해 외인성인, 유전 요소.
41.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, 유전 요소.
42.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 374, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
43.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 138 내지 254, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
44.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 255 내지 260, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
45.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 317 내지 322, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
46.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 374 내지 1024, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
47.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 480 내지 845, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
48.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 847 내지 2196, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
49.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 2197 내지 2313, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
50.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 2200 내지 2266, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
51.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 2281 내지 2286, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
52.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 374, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
53.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 138 내지 254, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
54.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 255 내지 260, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
55.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 317 내지 322, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
56.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 374 내지 1024, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
57.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 480 내지 845, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
58.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 847 내지 2196, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
59.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 2197 내지 2313, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
60.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 2200 내지 2266, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
61.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 2281 내지 2286, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
62.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 1 내지 606 및/또는 뉴클레오티드 1595 내지 2319, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
63.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 1 내지 806 및/또는 뉴클레오티드 1795 내지 2319, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
64.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 1 내지 1006 및/또는 뉴클레오티드 1995 내지 2319, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
65.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 1 내지 1206 및/또는 뉴클레오티드 2195 내지 2319, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
66.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 1 내지 379, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
67.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 380 내지 1030, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
68.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 485 내지 851, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
69.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 853 내지 2202, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
70.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 2203 내지 2319, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
71.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 138 내지 254, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
72.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 255 내지 260, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
73.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 317 내지 322, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
74.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 374 내지 1024, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
75.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 480 내지 845, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
76.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 847 내지 2196, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
77.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 2197 내지 2313, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
78.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 2197 내지 2313, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
79.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 야생형 CAV 게놈(예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같은, 예를 들어 Cuxhaven 1 단리물 게놈) 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
80.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 1535TW 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
81.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 N5 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
82.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 1623TW 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
83.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 CAV-EG-7 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
84.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 HLJ15108 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
85.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 LN1402 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
86.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 GD-F-12 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
87.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 GX1805 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
88.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 JL14026 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
89.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 HB1517 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
90.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 N1 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
91.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 N2 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
92.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 HN1504 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
93.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 단리물 N3 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
94.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 조류 자이로바이러스(예를 들어, CAV-관련 조류 자이로바이러스, 예를 들어 CAV-관련 조류 자이로바이러스 2, 예를 들어 NCBI 수탁 번호 NC_015396의 서열을 갖는 것) 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
95.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표 17에 열거된 CAV 게놈 유래의 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2, 아폽틴, VP1, 3' UTR, 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 전부), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
96.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
97.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질의 아르기닌-풍부 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
98.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질의 젤리-롤 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
99.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
100.
구현예 99에 있어서, 아미노산 서열 I94CNCGQFRKH103을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
101.
구현예 99 또는 100에 있어서, 아미노산 서열 WLRECSRSHAKICNCGQFRKH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
102.
구현예 100 또는 101에 있어서, 금속 이온 배위 부위(예를 들어, Zn2+ 배위 부위)를 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
103.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 아폽틴 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 유전 요소.
104.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
105.
구현예 104에 있어서, CAV VP1 단백질은 아르기닌-풍부 영역을 포함하는, 유전 요소.
106.
구현예 104 또는 105에 있어서, CAV VP1 단백질은 젤리-롤 도메인을 포함하는, 유전 요소.
107.
구현예 104 내지 106 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 하나 이상의 DNA-결합 모티프를 포함하는, 유전 요소.
108.
구현예 104 내지 107 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 아미노산 서열 RRARRPRGRFYAFRRGR, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 모티프를 포함하는, 유전 요소.
109.
구현예 104 내지 108 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 아미노산 서열 RRRYKFRHRRQRYRRRAFRKH, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 모티프를 포함하는, 유전 요소.
110.
구현예 104 내지 109 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 아미노산 서열 SRRSFNHHKARGAGDPK, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 모티프를 포함하는, 유전 요소.
111.
구현예 104 내지 110 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2개)의 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는, 유전 요소.
112.
구현예 111에 있어서, NLS는 아미노산 서열 RRARRPRGRFYAFRRGRWHH, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전 요소.
113.
구현예 111에 있어서, NLS는 아미노산 서열 KRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전 요소.
114.
구현예 104 내지 113 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2 또는 3개)의 핵외 수송 신호(NES)를 포함하는, 유전 요소.
115.
구현예 114에 있어서, NES는 아미노산 서열 IFLTEGLIL, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전 요소.
116.
구현예 114에 있어서, NES는 아미노산 서열 LKEFLLASMNL, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전 요소.
117.
구현예 114에 있어서, NES는 아미노산 서열 ELDTNFFTLYVAQ, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전 요소.
118.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
119.
구현예 118에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편은 아미노산 서열 I94 CNCGQFRKH103을 포함하는, 유전 요소.
120.
구현예 118에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편은 아미노산 서열 WX7HX3CXCX5H을 포함하는, 유전 요소.
121.
구현예 1220에 있어서, 각각의 X는 임의의 아미노산일 수 있는, 유전 요소.
122.
구현예 120 또는 121에 있어서, 각각의 Xn은 n개의 아미노산을 포함하는, 유전 요소.
123.
구현예 118 내지 122 중 어느 하나에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편은 아미노산 서열 WLRECSRSHAKICNCGQFRKH를 포함하는, 유전 요소.
124.
구현예 119 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 서열의 시스테인 및 히스티딘 잔기는 금속 이온 배위 부위(예를 들어, Zn2+ 배위 부위)를 형성하는, 유전 요소.
125.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 아폽틴 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소.
126.
상기 구현예 중 어느 하나의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
127.
구현예 126에 있어서, DNA, 예를 들어 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA인, 핵산 작제물.
128.
구현예 126 또는 127에 있어서, 핵산 작제물의 복제에, 예를 들어 박테리아 세포에서의 복제에 적합한 백본 영역을 포함하는, 핵산 작제물.
129.
구현예 128에 있어서, 백본 영역은 복제 원점 및 선택 가능한 마커 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 핵산 작제물.
130.
구현예 126 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소와 나란히 배치된 CAV 탠덤 영역을 추가로 포함하며, CAV 탠덤 영역은 CAV 게놈 또는 이의 단편, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
131.
구현예 130에 있어서, 유전 요소는 CAV 탠덤 영역에 대해 3'에 위치하는, 핵산 작제물.
132.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부(또는 이의 단편, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 반복부를 포함하는 단편), 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및 헤어핀을 포함하는, 핵산 작제물.
133.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및 헤어핀을 포함하는, 핵산 작제물.
134.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임, 및 헤어핀을 포함하는, 핵산 작제물.
135.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임의 단편(예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 3' 말단, 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 또는 500개 3'-최말단 뉴클레오티드를 포함함) 및 헤어핀을 포함하는, 핵산 작제물.
136.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부(또는 이의 단편, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 반복부를 포함하는 단편)를 포함하지 않는, 핵산 작제물.
137.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부 및/또는 프로모터를 포함하지 않는, 핵산 작제물.
138.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 및/또는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
139.
구현예 131에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 및/또는 적어도 오픈 리딩 프레임의 단편(예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 3' 말단, 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 또는 500개 3'-최말단 뉴클레오티드를 포함함) 및 헤어핀을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
140.
구현예 130에 있어서, 유전 요소는 CAV 탠덤 영역에 대해 5'에 위치하는, 핵산 작제물.
141.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및 헤어핀을 포함하는, 핵산 작제물.
142.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 및 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 핵산 작제물.
143.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 및 오픈 리딩 프레임의 단편(예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 5' 단편, 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 또는 500개 5'-최말단 뉴클레오티드를 포함함)을 포함하는, 핵산 작제물.
144.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부를 포함하는, 핵산 작제물.
145.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부의 단편을 포함하는, 핵산 작제물.
146.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 헤어핀을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
147.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임 및/또는 헤어핀을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
148.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 오픈 리딩 프레임의 단편(예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 5' 단편, 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 또는 500개 5'-최말단 뉴클레오티드를 포함함) 및/또는 헤어핀을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
149.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및/또는 헤어핀을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
150.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및/또는 헤어핀을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
151.
구현예 140에 있어서, CAV 탠덤 영역은, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열의 반복부, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 및/또는 헤어핀의 단편을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
152.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 탠덤 영역은 야생형 CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같음)의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2310, 2311, 또는 2312개 인접 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
153.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 탠덤 영역은 야생형 CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같음)의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2310, 2311, 또는 2312개 이하의 인접 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
154.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 탠덤 영역은 야생형 CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같음)의 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 2300 내지 2310, 또는 2310 내지 2313개 인접 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
155.
(a) CAV VP1 유전자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
(b) CAV VP2 유전자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및/또는
(c) CAV 아폽틴 유전자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열
중 1, 2개, 또는 3개 전부를 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드)로서,
CAV 패키징 신호를 포함하지 않고/않거나, CAV VP1 분자에 의해 패키징될 수 없는, 핵산 작제물.
156.
구현예 155에 있어서, CAV 패키징 신호는 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, 핵산 작제물.
157.
구현예 155에 있어서, CAV VP1 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
158.
구현예 157에 있어서, CAV VP1 단백질은 아르기닌-풍부 영역을 포함하는, 핵산 작제물.
159.
구현예 157 또는 158에 있어서, CAV VP1 단백질은 젤리-롤 도메인을 포함하는, 유전 요소.
160.
구현예 157 내지 159 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 하나 이상의 DNA-결합 모티프를 포함하는, 핵산 작제물.
161.
구현예 157 내지 160 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 아미노산 서열 RRARRPRGRFYAFRRGR, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 모티프를 포함하는, 핵산 작제물.
162.
구현예 157 내지 161 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 아미노산 서열 RRRYKFRHRRQRYRRRAFRKH, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 모티프를 포함하는, 핵산 작제물.
163.
구현예 157 내지 162 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 아미노산 서열 SRRSFNHHKARGAGDPK, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 모티프를 포함하는, 핵산 작제물.
164.
구현예 157 내지 163 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2개)의 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는, 핵산 작제물.
165.
구현예 164에 있어서, NLS는 아미노산 서열 RRARRPRGRFYAFRRGRWHH, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
166.
구현예 164에 있어서, NLS는 아미노산 서열 KRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRK, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
167.
구현예 157 내지 166 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2 또는 3개)의 핵외 수송 신호(NES)를 포함하는, 핵산 작제물.
168.
구현예 167에 있어서, NES는 아미노산 서열 IFLTEGLIL, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
169.
구현예 167에 있어서, NES는 아미노산 서열 LKEFLLASMNL, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
170.
구현예 167에 있어서, NES는 아미노산 서열 ELDTNFFTLYVAQ, 또는 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
171.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
172.
구현예 171에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편은 아미노산 서열 I94 CNCGQFRKH103을 포함하는, 핵산 작제물.
173.
구현예 171에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편은 아미노산 서열 WX7HX3CXCX5H를 포함하는, 핵산 작제물.
174.
구현예 171 또는 172에 있어서, CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편은 아미노산 서열 WLRECSRSHAKICNCGQFRKH를 포함하는, 핵산 작제물.
175.
구현예 172 내지 174 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열의 시스테인 및 히스티딘 잔기는 금속 이온 배위 부위(예를 들어, Zn2+ 배위 부위)를 형성하는, 핵산 작제물.
176.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CAV 아폽틴 단백질, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
177.
구현예 21a의 핵산 작제물 및 상기 구현예 중 어느 하나의 유전 요소를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 조류 세포, 예를 들어 MDCC 세포, 예를 들어 MDCC-MSB1 세포).
178.
a) CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
b) (i) 프로모터 요소, (ii) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) CAV VP1 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소
를 포함하는 CA벡터.
179.
구현예 78에 있어서, 유전 요소는 구현예 1 내지 125 중 어느 하나에 따른 유전 요소인, CA벡터.
180.
구현예 78에 있어서, 단백질 결합 서열은 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, CA벡터.
181.
a) 구현예 1 내지 125 중 어느 하나의 유전 요소, 및
b) 단백질성 외부, 예를 들어 CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하는 CA벡터.
182.
a) 구현예 1 내지 125 중 어느 하나의 유전 요소, 및
b) 캡시드, 예를 들어 CAV VP1 분자를 포함하는 캡시드
를 포함하는 CA벡터.
183.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 CAV UTR, 예를 들어 CAV 5' UTR(예를 들어, 표 1A, 1B, 또는 2 내지 13 중 임의의 것에 열거된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, CA벡터.
184.
유전 요소에 결합된 CAV VP1 분자
를 포함하는 복합체로서,
유전 요소는 (i) 프로모터 요소, (ii) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) 단백질 결합 서열을 포함하는, 복합체.
185.
상기 구현예 중 어느 하나에 따른 유전 요소, 및
유전 요소에 결합된 캡시드 단백질(예를 들어, CAV VP1 분자)
을 포함하는 복합체.
186.
구현예 184 또는 185에 있어서, 유전 요소는 상기 구현예 중 어느 하나에 따른 유전 요소이고/이거나;
복합체는 무세포 시스템에 존재하는, 복합체.
187.
구현예 184 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 단백질 결합 서열은 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, 복합체.
188.
구현예 184 내지 187 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 CAV UTR, 예를 들어 CAV 5' UTR(예를 들어, 표 1A, 1B, 또는 2 내지 13 중 임의의 것에 열거된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 복합체.
189.
구현예 178 내지 183 중 어느 하나의 CA벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 외인성 이펙터를 표적 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)로 운반하는 방법.
190.
구현예 189에 있어서, 방법은 엔도시토시스의 저해제, 예를 들어 디나민(dynamin) 저해제, 예를 들어 디나소어(Dynasore)를 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
191.
구현예 189 또는 190에 있어서, 방법은 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신(Bafilomycin) A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
192.
구현예 189 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 엔도시토시스에 의해 CA벡터를 흡수하는, 방법.
193. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되, 세포는 엔도시토시스의 저해제(예를 들어, 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어)와 접촉되지 않는, 외인성 이펙터를 표적 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)로 운반하는 방법.
194. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되, 세포는 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸과 접촉되지 않는, 외인성 이펙터를 표적 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)로 운반하는 방법.
195.
(a) CAV에 대한 원치 않는 면역 반응, 예를 들어 항-CAV 항체, 예를 들어 CAV 중화 항체의 존재에 대하여, 표적 세포, 또는 표적 세포를 포함하는 대상체를 평가하는 단계; 및
(b) 구현예 178 내지 183 중 어느 하나의 CA벡터를 세포 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 외인성 이펙터를 표적 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)로 운반하는 방법.
196.
CAV에 대한 원치 않는 면역 반응, 예를 들어 항-CAV 항체, 예를 들어 CAV 중화 항체의 존재에 대하여 대상체를 평가하는 단계를 포함하는, CA벡터를 받기 위한 대상체를 선택하는 방법.
197.
구현예 178 내지 183 중 어느 하나의 CA벡터를 대상체 내로 도입하는 단계를 포함하되, 질환 또는 장애는 암인, 생물학적 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 생물학적 활성을 조절하는 방법.
198.
구현예 197에 있어서, 방법은 엔도시토시스의 저해제, 예를 들어 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어를 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
199.
구현예 197 또는 198에 있어서, 방법은 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
200.
구현예 197 내지 199 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 엔도시토시스에 의해 CA벡터를 흡수하는, 방법.
201. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에게 엔도시토시스의 저해제(예를 들어, 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어)를 투여하지 않는, 생물학적 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 생물학적 활성을 조절하는 방법.
202. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에게 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하지 않는, 생물학적 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 생물학적 활성을 조절하는 방법.
203.
구현예 178 내지 183 중 어느 하나의 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 질환 또는 장애는 암인, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
204.
구현예 203에 있어서, 방법은 엔도시토시스의 저해제, 예를 들어 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어를 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
205.
구현예 203 또는 204에 있어서, 방법은 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
206.
구현예 203 내지 205 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 엔도시토시스에 의해 CA벡터를 흡수하는, 방법.
207. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에게 엔도시토시스의 저해제(예를 들어, 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어)를 투여하지 않는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
208. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에게 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하지 않는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
209.
(a) CAV에 대한 원치 않는 면역 반응, 예를 들어 항-CAV 항체, 예를 들어 CAV 중화 항체의 존재에 대하여, 대상체를 평가하는 단계; 및
(b) 구현예 178 내지 183 중 어느 하나의 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
210.
구현예 209에 있어서, 방법은 엔도시토시스의 저해제, 예를 들어 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어를 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
211.
구현예 209 또는 210에 있어서, 방법은 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
212.
구현예 209 내지 211 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 엔도시토시스에 의해 CA벡터를 흡수하는, 방법.
213.
구현예 178 내지 283 중 어느 하나의 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 외인성 이펙터는 감염원(infectious agent)(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아) 유래의 항원을 포함하는, 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 백신접종을 하는 방법.
214.
구현예 213에 있어서, 방법은 엔도시토시스의 저해제, 예를 들어 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어를 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
215.
구현예 213 또는 214에 있어서, 방법은 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하는 것을 포함하지 않는, 방법.
216.
구현예 213 내지 215 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 엔도시토시스에 의해 CA벡터를 흡수하는, 방법.
217. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에게 엔도시토시스의 저해제(예를 들어, 디나민 저해제, 예를 들어 디나소어)를 투여하지 않고, 외인성 이펙터는 감염원(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아) 유래의 항원을 포함하는, 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 백신접종을 하는 방법.
218. CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에게 엔도솜 산성화의 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1(BafA1) 또는 클로로퀸을 투여하지 않고, 외인성 이펙터는 감염원(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아) 유래의 항원을 포함하는, 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 백신접종을 하는 방법.
219.
구현예 189 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 림프계 세포(예를 들어, B 세포 또는 T 세포), 상피 세포, 폐 세포, 또는 섬유아세포인, 방법.
220.
구현예 189 내지 219 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 인간 세포인, 방법.
221.
구현예 189 내지 219 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 동물(예를 들어, 농업 동물, 예를 들어 소, 양, 돼지, 염소, 말, 들소, 또는 낙타) 유래의 세포인, 방법.
222.
구현예 221에 있어서, 동물은 조류 동물(예를 들어, 칠면조, 닭, 메추라기, 에뮤, 또는 타조)인, 방법.
223.
구현예 189 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 생체 내 또는 시험관 내에 있는, 방법.
224.
구현예 189 내지 223 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 약 1 내지 10(예를 들어, 약 2 내지 4, 예를 들어 약 3), 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 5000, 5000 내지 10,000, 10,000 내지 50,000, 또는 50,000 내지 100,000의 MOI로 전달되는, 방법.
225.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터가 나노-루시퍼라제로 대체되는 경우, CA벡터는 시험관 내에서 복수의 표적 세포로 나노-루시퍼라제를 운반하여, 예를 들어 실시예 5의 분석에서, 적어도 약 104, 105, 106, 또는 107, 또는 약 104 내지 105, 105 내지 106, 또는 106 내지 107의 발광을 초래하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
226.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 실시예 3의 분석에서, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 또는 40%의 MDCC 세포에 대한 결합에 상대적인 vg로, 인간 세포(예를 들어, Raji 세포)에 결합할 수 있는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
227.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 대조군 벡터보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 500, 1000, 10,000배 더 많은 외인성 이펙터의 카피를 생성하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
228.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 대조군 벡터는 야생형 CAV 게놈(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 열거된 바와 같음)을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
229.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 대조군 벡터는 CAV 이외의 바이러스 게놈(예를 들어, AAV 게놈 또는 렌티바이러스 게놈)을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
230.
구현예 229에 있어서, 대조군 벡터는 임의의 CAV 서열이 결여된 것을 제외하고 유전 요소와 동일한, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
231.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 세포당 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10,000, 50,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 50,000,000, 또는 100,000,000개 카피의 외인성 이펙터를 생성하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
232.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 표적 세포에 대해 내인성인 상응하는 분자와 동일한 서열, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖고, 표적 세포에서 발현되는 외인성 이펙터의 수준은 상응하는 내인성 분자의 양보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, 5000, 10,000, 50,000, 또는 100,000배 더 많은, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 또는 방법.
233.
a) 상기 구현예 중 어느 하나의 유전 요소를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및
b) 숙주 세포를 단백질성 외부(예를 들어, CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부)의 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 CA벡터를 제조하는, CA벡터를 제조하는 방법.
234.
구현예 233에 있어서, 숙주 세포는 CA벡터를 상청액으로 방출하는(예를 들어, 숙주 세포 세포는 CA벡터를 상청액으로 분비하고/하거나 숙주 세포는, 예를 들어 SDS, 예를 들어 0.5% SDS에서 용해되는), 방법.
235.
구현예 233 또는 234에 있어서, 숙주 세포 유래의 상청액(예를 들어, 숙주 세포로부터 분비된 상청액 및/또는 숙주 세포의 용해로부터 수득된 상청액)으로부터 CA벡터를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
236.
구현예 233 내지 235 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포 유래의 용해물로부터 CA벡터를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
237. 구현예 235 또는 236에 있어서, 상청액 또는 용해물은 뉴클레아제(예를 들어, 벤조나제)로 처리되는, 방법.
238. 구현예 235 내지 237 중 어느 하나에 있어서, 상청액 또는 용해물은 (예를 들어, 0.45 μm 필터를 통해) 여과되는, 방법.
239. 구현예 235 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 상청액 또는 용해물은, 예를 들어 수크로스 쿠션(예를 들어, 20% 수크로스 쿠션)을 통해 초원심분리되는, 방법.
240. 구현예 235 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 상청액 또는 용해물은 CsCl 구배를 통해 이동되는, 방법.
241. 구현예 235 내지 240 중 어느 하나에 있어서, 상청액 또는 용해물은 분별 및/또는 투석되는, 방법.
242. 구현예 235 내지 241 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 하나 이상의 추가 ORF(예를 들어, 하나 이상의 추가 CAV ORF, 예를 들어 CAV VP1, VP2, 또는 아폽틴 중 하나 이상)를 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산을 추가로 포함하는, 방법.
243.
상기 구현예 중 어느 하나의 유전 요소, 또는 유전 요소를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 (i) 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포; 또는 (ii) 조류 세포, 예를 들어 닭 세포).
244.
구현예 243에 있어서, CAV VP1 분자 또는 CAV VP1 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 숙주 세포.
245.
구현예 178 내지 183 중 어느 하나의 CA벡터를 포함하는 숙주 세포.
246.
a) CAV VP1 분자, 또는 CAV VP1 분자를 인코딩하는 핵산; 및
b) 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 핵산 작제물이되, 유전 요소는 (i) 프로모터 요소, (ii) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) 단백질 결합 서열을 포함하며, 예를 들어 유전 요소는 상기 구현예 중 어느 하나에 따른 유전 요소인, 핵산 작제물
을 포함하는 숙주 세포.
247.
구현예 246에 있어서, 단백질 결합 서열은 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, 숙주 세포.
248. 구현예 184 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 복합체는 시험관 내에 있고, 예를 들어 복합체는 실질적으로 무세포 조성물 중에 있는, 복합체.
249. 구현예 184 내지 188 또는 248 중 어느 하나에 있어서, 복합체는 세포, 예를 들어 숙주 세포, 예를 들어 헬퍼 세포, 예를 들어 세포의 핵 내에 있는, 복합체.
250. 구현예 184 내지 188, 248, 또는 249 중 어느 하나에 있어서, CAV VP1 분자는 단백질성 외부의 일부인, 복합체.
251. 구현예 184 내지 188 또는 248 내지 250 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 복제를 겪고 있는, 복합체.
252. 구현예 184 내지 188 또는 248 내지 251 중 어느 하나에 있어서, 복합체는 CA벡터 내에 있는, 복합체.
253.
구현예 243 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 예를 들어 유전 요소를 세포 내로 도입하는 것은 유전 요소를 포함하는 핵산 작제물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
254.
구현예 253에 있어서, VP1 분자를 인코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
255.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단백질 결합 서열은 예를 들어, 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드(예를 들어, CAV VP1 분자)에 특이적으로 결합하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
256.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 CAV VP1 분자에 의해 패키징(예를 들어, 특이적으로 패키징)될 수 있는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
257.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 하기와 같은, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포:
(a) 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화됨,
(b) 인간 폴리펩티드 또는 핵산,
(c) 인간 폴리펩티드 또는 핵산에 결합함, 또는
(d) 인간 세포에서 활성을 가짐(예를 들어 인간 세포에서 인간 유전자의 활성 및/또는 수준을 조절함(예를 들어, 증가시키거나 감소시킴)).
258.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단백질성 외부는 CAV VP1 분자를 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
259.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단백질성 외부에서 단백질의 적어도 60%(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)는 CAV VP1 분자를 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
260.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소 또는 핵산 작제물은 야생형 CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같음)의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2310, 2311, 또는 2312개 인접 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
261.
상기 구현예 중 임의의 것에 있어서, 유전 요소 또는 핵산 작제물은 야생형 CAV 게놈 서열(예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같음)의 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 2300 내지 2310, 또는 2310 내지 2313개 인접 뉴클레오티드, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
262.
상기 구현예 중 임의의 것에 있어서, 유전 요소 또는 핵산 작제물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 게놈 서열에 비해 결실(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000개 뉴클레오티드의 결실)을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
263.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소 또는 핵산 작제물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함하는, CAV 패키징 신호를 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
264. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터는 miRNA를 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
265. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터, 예를 들어 miRNA는 숙주 유전자를 표적화하고, 예를 들어 유전자의 발현을 조절하고, 예를 들어 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
266. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터는 miRNA를 포함하고, 숙주 유전자의 발현을 감소시키는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
267. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터는 길이가 약 20 내지 200, 30 내지 180, 40 내지 160, 50 내지 140, 또는 60 내지 120개 뉴클레오티드인 핵산 서열을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
268. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열은 길이가 약 20 내지 200, 30 내지 180, 40 내지 160, 50 내지 140, 또는 60 내지 120개 뉴클레오티드인, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
269. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 크기를 갖는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
270. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 약 100 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 크기를 갖는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
271. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 약 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 또는 1500 내지 2000개 뉴클레오티드의 크기를 갖는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
272. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 단일-가닥인, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
273. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 환형인, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
274. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 DNA, 예를 들어 단일-가닥 DNA인, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
275. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 세포와 접촉되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
276. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 복제-결핍인, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
277.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 망막하로 대상체에게 투여되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
278.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 망막하 투여용으로 제형화되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
279.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예를 들어 인간 대상체)에서 세포 또는 조직으로 운반되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
280.
구현예 279에 있어서, 세포 또는 조직은 혈액, 간, 비장, 폐, 심장, 난소, 근육, 뇌, 신장, 및/또는 망막으로부터 선택되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
281.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소, 핵산 작제물, 또는 CA벡터는, 예를 들어 실시예 12의 방법에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV, 예를 들어 AAV2) 또는 AAV 벡터의 동등한 양보다 더 적은 중화 항체 반응을 유도하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
282.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소, 핵산 작제물, 또는 CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에게 근육내로 투여될 때, 예를 들어 실시예 12의 방법에 따라서, 테스트 대상체에게 근육내로 투여될 때 아데노-연관 바이러스(AAV, 예를 들어 AAV2) 또는 AAV 벡터의 동등한 양에 의해 유도되는 50% GMT(50% geometric mean neutralizing reciprocal titer; 50% 기하 평균 중화 역가의 역수)보다 더 작은 50% GMT를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
283.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소, 핵산 작제물, 또는 CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에게 근육내로 투여될 때, 약 320, 321, 322, 323, 324, 325, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 635, 636, 637, 638, 639, 또는 640 미만의 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
284.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소, 핵산 작제물, 또는 CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에게 근육내로 투여될 때, 약 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 310, 또는 320 미만의 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
285.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소, 핵산 작제물, 또는 CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에게 정맥내 또는 복강내로 투여될 때, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160 이하의 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
286.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 정맥내, 복강내, 또는 근육내로 투여를 필요로 하는 대상체에게 투여되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
287.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 시험관 내에서 조립되는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
288.
구현예 287에 있어서, 시험관 내 조립은 VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부 내에 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터 유전 요소)를 봉입하는 것을 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
289.
구현예 288에 있어서, 시험관 내 조립은 VP1 분자를 유전 요소와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
290.
상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소, 핵산 작제물, 또는 CA벡터는 다회 용량(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 개별적으로 투여되는 용량)으로 투여하기에 적합하도록 충분히 낮은 중화 항체 반응을 유도하는, 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포.
291.
유효량의 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 합성 CA벡터)를 세포, 조직, 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 세포, 조직, 또는 대상체에 운반하는 방법으로서,
CA벡터는 이펙터 또는 페이로드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
CA벡터는 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에게 근육내로 투여될 때, 예를 들어 실시예 12의 방법에 따라서, 테스트 대상체에 근육내로 도입될 때 아데노-연관 바이러스(AAV, 예를 들어 AAV2) 또는 AAV 벡터의 동등한 양에 의해 유도되는 것보다 더 작은 중화 항체 반응을 유도하는, 방법.
292.
유효량의 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 합성 CA벡터)를 세포, 조직, 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 세포, 조직, 또는 대상체에 운반하는 방법으로서,
CA벡터는 이펙터 또는 페이로드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
CA벡터는 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에게 근육내로 투여될 때, 예를 들어 실시예 12의 방법에 따라서, 테스트 대상체에 근육내로 도입될 때 아데노-연관 바이러스(AAV, 예를 들어 AAV2) 또는 AAV 벡터의 동등한 양에 의해 유도되는 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)보다 더 작은 50% GMT를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 방법.
293.
유효량의 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 합성 CA벡터)를 세포, 조직, 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 필요로 하는 세포, 조직, 또는 대상체에 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 운반하는 방법으로서,
CA벡터는 이펙터 또는 페이로드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에 근육내로 도입될 때, 약 320, 321, 322, 323, 324, 325, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 635, 636, 637, 638, 639, 또는 640 미만의 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 방법.
294.
유효량의 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 합성 CA벡터)를 세포, 조직, 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 필요로 하는 세포, 조직, 또는 대상체에 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 운반하는 방법으로서,
CA벡터는 이펙터 또는 페이로드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에 근육내로 도입될 때, 약 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 310, 또는 320 미만의 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 방법.
295.
유효량의 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 합성 CA벡터)를 세포, 조직, 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 필요로 하는 세포, 조직, 또는 대상체에 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 운반하는 방법으로서,
CA벡터는 이펙터 또는 페이로드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
CA벡터는, 테스트 대상체(예를 들어, 마우스)에 정맥내 또는 복강내로 도입될 때, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160 이하의 50% GMT(50% 기하 평균 중화 역가의 역수)를 갖는 중화 항체 반응을 유도하는, 방법.
296.
구현예 291 내지 295 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 정맥내, 복강내, 또는 근육내로 CA벡터를 필요로 하는 대상체에게 투여되는, 방법.
297.
구현예 291 내지 296 중 어느 하나에 있어서, 투여에 의해 유도되는 중화 항체의 수준은 실시예 12의 방법에 따라 결정되는, 방법.
298.
구현예 291 내지 296 중 어느 하나에 있어서, 투여에 의해 유도되는 중화 항체의 수준은 CA벡터가 투여된 대상체로부터 수득한 샘플(예를 들어, 혈청 샘플)에서 중화 항체의 수준을 평가하는 것을 포함하는 방법에 따라 결정되는, 방법.
299.
구현예 298에 있어서, 평가는 샘플을 시험관 내에서 테스트 세포 및 리포터(예를 들어, 형광 또는 발광 리포터, 예를 들어 나노-루시퍼라제)를 인코딩하는 유전 요소를 포함하는 테스트 CA벡터와 접촉시키는 것, 및 샘플의 부재 하에 테스트 CA벡터와 접촉된 다른 유사한 테스트 세포와 비교하여 테스트 세포에서 리포터의 수준 또는 활성을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
300.
구현예 291 내지 299 중 어느 하나에 있어서, CA벡터는 다회 용량(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 개별적으로 투여되는 용량)으로 투여하기에 적합하도록 충분히 낮은 중화 항체 반응을 유도하는, 방법.
301.
상기 구현예 중 어느 하나의 유전 요소, 핵산 작제물, CA벡터, 복합체, 방법, 또는 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
302.
구현예 301에 있어서, 약제학적 조성물의 pH는 약 5.0 내지 5.5, 5.5 내지 6.0, 6.0 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.4, 7.4 내지 7.6, 또는 7.6 내지 8.0인, 약제학적 조성물.
303.
구현예 301 내지 302 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 25 내지 30℃, 30 내지 35℃, 35 내지 40℃, 40 내지 45℃, 45 내지 50℃, 50 내지 55℃, 55 내지 60℃, 60 내지 65℃, 또는 65 내지 70℃의 온도에 있는, 약제학적 조성물.
304.
구현예 301 내지 303 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 1 내지 5℃, 5 내지 10℃, 10 내지 15℃, 15 내지 20℃, 또는 20 내지 25℃의 온도에 있는, 약제학적 조성물.
305.
구현예 301 내지 304 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약 4℃의 온도에 있는, 약제학적 조성물.
306.
CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물을 1 내지 5℃, 5 내지 10℃, 10 내지 15℃, 15 내지 20℃, 또는 20 내지 25℃의 온도에서 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 2년의 기간, 또는 약 1 내지 2주, 2 내지 3주, 3 내지 4주, 1 내지 2개월, 2 내지 3개월, 3 내지 4개월, 4 내지 5개월, 5 내지 6개월, 6 내지 7개월, 7 내지 8개월, 8 내지 9개월, 9 내지 10개월, 10 내지 11개월, 11 내지 12개월, 12 내지 18개월, 18 내지 24개월, 또는 2 내지 3년의 기간 동안 유지하는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 보관하는 방법.
307.
구현예 306에 있어서, 조성물은 1 내지 5℃(예를 들어, 약 4℃)의 온도에서 유지되는, 방법.
308.
구현예 306 또는 307에 있어서, 조성물은 상기 온도에서 적어도 6개월 동안 유지되는, 방법.
309.
CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물의 온도를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10℃까지, 또는 1 내지 5℃(예를 들어, 약 4℃)까지 낮추는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 냉각시키는 방법.
310.
구현예 309에 있어서, 온도를 낮추는 단계 이전에 조성물의 온도는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 또는 40℃, 또는 10 내지 15℃, 15 내지 20℃, 20 내지 25℃, 25 내지 30℃, 30 내지 35℃, 35 내지 37℃, 또는 37 내지 40℃(예를 들어, 약 25℃)인, 방법.
311.
CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물의 온도를 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃까지, 또는 20 내지 25℃ 또는 25 내지 30℃(예를 들어, 약 25℃)까지 상승시키는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 가열하는 방법.
312.
구현예 311에 있어서, 온도를 상승시키는 단계 이전에 조성물의 온도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10℃ 미만, 또는 1 내지 5℃ 또는 5 내지 10℃(예를 들어, 약 4℃)인, 방법.
313.
CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물의 온도를 약 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40℃까지, 또는 30 내지 35℃ 또는 35 내지 40℃(예를 들어, 약 37℃)까지 상승시키는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 가열하는 방법.
314.
구현예 306 내지 313 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 구현예 301 내지 305 중 어느 하나의 약제학적 조성물인, 방법.
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도 1은 시험관 내 환화(in vitro circularized; IVC) CAV DNA로 형질감염된 세포만이 계대 수(P0, P1, P2, 및 P4)에 따라서, 반복 계대에 걸쳐 증가하는 역가의 CAV 게놈을 생성할 수 있음을 나타내는 일련의 다이어그램이다. 대조적으로, p637 음성 대조군 샘플(VP1에서 결실이 있는 야생형 CAV로 이루어짐) 및 플라스미드 CAV 샘플은 반복 계대에 걸쳐 감소하는 역가를 나타내었다. 계대 P1 및 P2를 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고 IVC CAV 샘플에서 CAV VP2 및 VP3(아폽틴으로도 알려짐)의 발현만을 나타내었다. 계대 P3을 수행하였지만 분석하지 않았다.
도 2는 IVC CAV DNA 대 음성 대조군 플라스미드 p637을 받은 세포 유래의 계대 P2 용해물에 노출된 세포에서 발견된 작제물의 총 DNA 카피를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 그래프는 P3 물질(배출)이 음성 대조군 플라스미드 p637에 의해서는 아니지만, IVC CAV DNA에 의해 형질감염된 세포로부터 유래될 때 P2 용해물(투입)과 비교하여 CAV DNA 카피를 증가시켰음을 확인하는 qPCR 결과를 나타낸다.
도 3은 계대 P3으로부터의 용해물의 qPCR 분석 결과를 나타내는 그래프이다. P3 세포로부터의 용해물에 대해 CsCl을 사용하여 등밀도 원심분리를 수행하고 생성된 분획을 qPCR로 분석하였다. CAV DNA는 1.32 g/mL의 피크 밀도에서 검출된다.
도 4는 감염 후 다양한 시간에서의 CAV 카피 수를 나타내는 그래프이다. 등밀도 원심분리에 의해 단리한 후, 정제된 CAV(IVC로 표지됨) 또는 허위-감염 세포 용해물(음성)을 투석하고, 표시된 바와 같이 배양 배지로 희석한 다음 신선한 MDCC-MSB1 세포에 첨가하였다. 샘플을 매일 취하고, CAV 카피 수를 qPCR로 정량화하였다.
도 5는 합성 게놈 DNA로부터 구제된 CAV 입자를 나타내는 일련의 전자 현미경 사진이다. 눈금 막대는 각각의 이미지의 배율을 표시한다. 화살표는 좌측 이미지에서 볼 수 있는 CAV 입자의 일부를 표시한다. 입자는 직경이 대략 24 mm인 것으로 측정되었다.
도 6a는 예시적인 CAV 탠덤 작제물의 개략도를 나타내는 다이어그램이다. pRTx-966은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1113은 (i) 절단된 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1114는 (i) 추가 절단된 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1115는 (i) 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1116은 (i) ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1117은 (i) 영역의 3' 단편만을 포함하는 절단된 ORF 영역, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1118은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, 및 ORF를 포함한다. pRTx-1119는 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, 영역의 5' 단편만을 포함하는 절단된 ORF 영역을 포함한다. pRTx-1120은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부를 포함한다. pRTx-1118은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 절단된 반복부 영역을 포함한다.
도 6b는 도 6a에 나타낸 CAV 탠덤 작제물로 형질감염된 세포 현탁액에 대한 CAV qPCR 결과를 나타내는 그래프이다. 200 ul의 세포 현탁액을 P0 제2일, P0 제3일, 및 P1 제2일에 수집하였다. 바이러스 DNA를 추출하고, DAV 게놈을 qPCR로 정량화하였다.
도 6c는 도 6a에 나타낸 CAV 탠덤 작제물로 형질감염된 세포 유래의 샘플에 대한 서던 블롯 결과를 나타내는 다이어그램이다. 샘플을 P1 제2일에 수집하였다. 세포 펠렛을 10 ml 배양물로부터 용해하였다. DNA를 추출하고 백본(B) 또는 비-복제 플라스미드(D, DpnI)를 절단하는 효소로 분해하였다.
도 7은 인간 세포주에 대한 CAV의 결합을 나타내는 그래프이다. y-축은 MDCC 세포 대조군에 대해 정규화된 CAV 바이러스 게놈(vg)을 표시한다. 각각의 원은 생물학적 복제물을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 인간 세포주 중에서, CAV는 Raji 세포에 가장 강하게 결합하였고, 그 다음으로는 EKVX 세포, MRC5 세포, 및 MCF7 세포에 강하게 결합하였다.
도 8a 내지 8b는 CAV의 게놈 구성 및 예시적인 CA벡터의 세트를 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 5' UTR, VP2 오픈 리딩 프레임, 아폽틴 오픈 리딩 프레임, VP1 오픈 리딩 프레임, 및 3' UTR을 포함하여, 단계적으로 도시한 WT CAV 게놈의 선형화된 표현. CAV 게놈은 길이가 2.3 kb이다. (b) 생성되고 테스트된 다양한 CA벡터 작제물의 선형화된 표현. 각각의 CA벡터에 대해, 나노-루시퍼라제(nLuc) 리포터 카세트를 CAV 게놈에 삽입하여, 나타낸 바와 같이, 리포터 카세트와 길이가 동일한 게놈의 단편으로 대체하였다. 나노-루시퍼라제 리포터는 SV40 프로모터, 나노-루시퍼라제 ORF, 및 SV40 종결자 서열을 포함한다. 이 도면에 나타낸 예시적인 CA벡터에 대한 서열은 표 2 내지 9에 열거되어 있다.
도 9a 내지 9c는 CA벡터 상청액을 이용한 MDCC 세포의 형질도입을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 형질도입 분석의 개략도. 요약하면, 1e5개 세포를 CA벡터 상청액과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 3회 세척하고 제0일에 발광을 측정하였다. 24시간 후, 세포를 3회 세척하고 제1일 발광 측정값을 수득하였다. 추가 24시간 후, 세포를 3회 세척하고 제2일 발광 측정값을 수득하였다. (b) CA벡터 + pRTX-637을 이용한 음성 대조군 형질도입. 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 샘플에서 제0일, 제1일, 또는 제2일 중 어느 날에도 발광이 검출되지 않았다. (c) pRTX-966(전체 탠덤 CAV 작제물)으로 동시-형질감염된 세포에서 생성된 CA벡터를 이용한 형질도입. 다중 비교와 함께 2원 ANOVA를 사용하여 유의성을 계산하였다(* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001). nLuc4, nLuc5, 및 nLuc7 CA벡터는 제2일에 발광의 유의한 증가를 나타내었다. nLuc6 CA벡터는 제1일부터 발광의 유의한 증가를 나타내었다.
도 10a 내지 10b는 정규화된 형질도입 분석에서 상청액으로부터의 CA벡터의 정제 및 이의 분석을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 정제된 CA벡터 입자에 대한 DNase 보호 분석. 정제된 입자를 DNase로 처리하거나 DNase 없이 처리한 다음, 게놈을 nluc 프로브를 사용하여 qPCR로 정량화하였다. (b) 정규화된 CA벡터 게놈을 이용한 형질도입 분석. CA벡터 nLuc4, nLuc5, nLuc6, 및 nLuc7은 제2일에 증가된 나노-루시퍼라제 발광을 나타내었다.
도 11a 내지 11b는 CA벡터에 의한 인간 세포의 형질도입을 나타내는 일련의 그래프이다. (a) MOI 3에서 Jurkat 세포의 CA벡터 형질도입. (b) MOI 3에서 Raji 세포의 CA벡터 형질도입. 다중 비교와 함께 2원 ANOVA를 사용하여 유의성을 계산하였다(* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001).
도 12는 nLuc 이식유전자를 보유하는 CA벡터, 야생형 CAV(음성 대조군), 또는 AAV2(양성 대조군)를 생성하는 세포에 대한 역가, 내독소 수준, 및 BCA 수준을 나타내는 표이다.
도 13a 내지 13c는 CA벡터가 VP1-중화 항체에 의해 중화됨을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) WT CAV를 이용한 중화 분석. (b) 닭 혈청의 중화 항체는 VP1을 특이적으로 인식한다. (c) IVIG가 아닌 닭 혈청을 이용한 CA벡터의 중화.
도 14는 VP1이 결실된 CAV 게놈을 사용하는 샘플과 비교하여 Nluc6 CA벡터 생성을 구제하는 전체 WT CAV 게놈(pCAV)을 포함하는 플라스미드를 나타내는 그래프이다. VP1-중화 항체의 첨가는 이러한 구제를 방지하였다.
도 15a 내지 15c는 나란히 배열된 CAV 및/또는 CA벡터 유전 요소 영역을 각각 포함하는 예시적인 탠덤 작제물에 대한 플라스미드 지도를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 각각의 작제물은 암피실린 내성 카세트 및 복제 원점을 포함한다. 도 15a는 pCAV-nLuc6_CAV에 대한 플라스미드 지도를 나타내며, 이의 서열은 표 14에 주석이 달린 형태로 열거되어 있다. 이 작제물은 5'에서 3'의 순서로, CAV 반복부, 불활성 CAV VP-인코딩 서열, SV40p_nLuc 삽입부, 및 CAV 헤어핀 서열을 포함하는, CA벡터 유전 요소 서열을 포함한다. CA벡터 유전 요소 서열은 5'에서 3'의 순서로, CAV 반복부, CAV VP-인코딩 서열, 및 CAV 헤어핀 서열을 포함하는 야생형 CAV 유전 요소 서열에 대해 5'에 위치한다. 도 15b는 pCAV-nLuc6_CAVΔ3NCR에 대한 플라스미드 지도를 나타내며, 이의 서열은 표 15에 주석이 달린 형태로 열거되어 있다. 이 작제물은 CAV 반복부 및 CAV VP-인코딩 서열만을 포함하는 절단된 야생형 CAV 유전 요소 서열에 대해 5'에 위치하는 동일한 nLuc6 CA벡터 유전 요소 서열을 포함한다. 도 15c는 pCAV-nLuc6_CAVΔPromΔORFsΔ3NCR(이의 후반부는 "CAVΔΔΔ"로 도식화됨)에 대한 플라스미드 지도를 나타내며, 이의 서열은 표 16에 주석이 달린 형태로 열거되어 있다. 이 작제물은 CAV 반복부만을 포함하는 절단된 야생형 CAV 유전 요소 서열에 대해 5'에 위치하는 동일한 nLuc6 CA벡터 유전 요소 서열을 포함한다.
도 16a 내지 16d는 야생형 CAV, 나노-루시퍼라제를 인코딩하는 CA벡터, 또는 나노-루시퍼라제를 인코딩하는 AAV2를 투여한 마우스의 표시된 조직에서 검출된 nLuc 카피 또는 야생형 CAV 게놈 카피의 수준을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 17a 내지 17c는 표시된 바와 같이, CA벡터 또는 AAV2에 대한 시험관 내 중화 분석의 결과를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 도 17a는 nLuc CA벡터, 야생형 CAV, 또는 AAV2-nLuc를 근육내로 투여한 마우스에서 CA벡터의 중화, 또는 닭 혈청에 의한 CA벡터의 중화를 나타낸다. 도 17b는 nLuc CA벡터, 야생형 CAV, 또는 AAV2-nLuc를 근육내로 투여한 마우스에서 AAV2의 중화, 또는 닭 혈청에 의한 CA벡터의 중화를 나타낸다. 도 17c는 표시된 벡터를 받은 마우스에서 CAV(중간 컬럼) 또는 AAV2(우측 컬럼)에 대한 50% GMT(기하 평균 중화 역가의 역수를 의미함)를 나타낸다.
도 18은 시험관 내에서 바이러스-유사 입자(VLP) 구조로의 CAV VP1 단백질의 조립을 나타내는 일련의 다이어그램이다.
도 19a 내지 19d는 CA벡터가 CAV-유사 밀도를 갖고 면역 혈청에 의해 중화되지만 인간 혈청 샘플에 의해서는 중화되지 않음을 나타내는 일련의 그래프이다. (a) 염화세슘 선형 구배에서 초원심분리 및 CAV 및 나노루시퍼라제(Nluc) 앰플리콘의 DNase-내성 qPCR 후 CAV 야생형 및 벡터 입자의 밀도. (b) 투석 후, 패널 A에 나타낸 구배 분획을 세포에 벡터를 첨가하고 수 분 이내에(제0일) 또는 48시간 후에(제2일) MDCC-MSB1 세포의 형질도입에 대하여 평가하였다. (-)는 음성 대조군을 표시한다. (c) 닭 면역 혈청에 의한 CA벡터의 중화는 쉽게 관찰되는 반면, 인간 IVIG 및 개별 인간 혈청 샘플에 의한 중화는 하나의 샘플(공여자 38)에서의 약한 신호를 제외하고 검출될 수 없다. (d) AAV2-nluc는 IVIG 및 10개의 개별 인간 혈청 샘플 중 3개에 의해 중화되지만, 닭 혈청에 의해서는 중화되지 않는다.
도 20은 근육내 주사 3주 후 qPCR에 의한 마우스 조직에서 CA벡터 이식유전자 nLuc의 검출을 나타내는 일련의 그래프이다. 주사 3주 후 qPCR에 의한 마우스 조직에서 CA벡터 이식유전자 nLuc의 검출. 각각의 기호는 한 마리의 마우스를 나타낸다. 수평선은 각각의 값의 기하 평균이고 오차 막대는 기하 표준 편차를 나타낸다. 다양한 경로(SR, IV, IP, IM)로 표시된 샘플을 마우스에게 투여하고 이의 조직을 3주 후에 수집하였다.
도 21a 내지 21c는 세포 내로의 CA벡터 유입이 디나민-의존적 및 pH-의존적 과정임을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 상이한 단계에서 작용하는 저해제를 나타내는 일반적인 바이러스 유입 경로의 예시. (b) MDCC-MSB1 세포를 감염 이전에 표시된 농도로 저해제 또는 DMSO 대조군으로 전처리하였다. 그 다음 세포를 저해제의 존재 하에 형질도입하고 20시간 후에 발광을 판독하였다. (c) 비교를 위해, 저해제 또는 DMSO 대조군으로 전처리된 Expi293 세포를 사용하여 AAV2-nluc 유입의 억제를 유사하게 연구하였다. 각각의 기호는 2개의 생물학적 복제물 중 하나를 나타낸다. PM: 원형질막.
도 22a 내지 22b는 최대 65℃까지 및 4℃에서 보관 시 CA벡터가 형질도입 효력을 유지함을 나타내는 그래프이다. (a) CA벡터 nLuc 6을 표시된 온도에서 15분 동안 인큐베이션하고, MDCC-MSB1 세포에 열-처리 바이러스를 첨가하고 36시간 후에 잔여 형질도입 효력을 발광 분석으로 측정하였다. 각각의 기호는 하나의 샘플을 나타낸다. 중화 샘플(NAb)을 음성 대조군뿐만 아니라, 벡터가 없는 대조군(-)으로 포함하였다. (b) 등밀도 CsCl 원심분리 및 투석에 의해 정제된 CA벡터 현탁액을 완충 식염수에 4℃에서 6개월 동안 보관하고 형질도입 활성에 대해 분석하였다. 0, 3, 및 6개월째의 형질도입 분석은 표시된 MOI에서 감염되지 않은 음성 대조군을 포함하여 시간 순으로 나타나 있다.
도 23a 내지 23c는 탠덤 플라스미드를 사용하여 CA벡터의 회수를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 도 23a는 탠덤 플라스미드를 도시하는 다이어그램이다. 도 23b는 DNase 처리 후 벡터 게놈의 정량화를 도시하는 그래프이다. 도 23c는 벡터 입자가 형질도입될 수 있음을 입증하는 발광 증가를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 구현예에 대한 하기의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽으면 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시 목적을 위하여, 본 명세서에 예시된 구현예가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 구현예의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
도 1은 시험관 내 환화(in vitro circularized; IVC) CAV DNA로 형질감염된 세포만이 계대 수(P0, P1, P2, 및 P4)에 따라서, 반복 계대에 걸쳐 증가하는 역가의 CAV 게놈을 생성할 수 있음을 나타내는 일련의 다이어그램이다. 대조적으로, p637 음성 대조군 샘플(VP1에서 결실이 있는 야생형 CAV로 이루어짐) 및 플라스미드 CAV 샘플은 반복 계대에 걸쳐 감소하는 역가를 나타내었다. 계대 P1 및 P2를 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고 IVC CAV 샘플에서 CAV VP2 및 VP3(아폽틴으로도 알려짐)의 발현만을 나타내었다. 계대 P3을 수행하였지만 분석하지 않았다.
도 2는 IVC CAV DNA 대 음성 대조군 플라스미드 p637을 받은 세포 유래의 계대 P2 용해물에 노출된 세포에서 발견된 작제물의 총 DNA 카피를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 그래프는 P3 물질(배출)이 음성 대조군 플라스미드 p637에 의해서는 아니지만, IVC CAV DNA에 의해 형질감염된 세포로부터 유래될 때 P2 용해물(투입)과 비교하여 CAV DNA 카피를 증가시켰음을 확인하는 qPCR 결과를 나타낸다.
도 3은 계대 P3으로부터의 용해물의 qPCR 분석 결과를 나타내는 그래프이다. P3 세포로부터의 용해물에 대해 CsCl을 사용하여 등밀도 원심분리를 수행하고 생성된 분획을 qPCR로 분석하였다. CAV DNA는 1.32 g/mL의 피크 밀도에서 검출된다.
도 4는 감염 후 다양한 시간에서의 CAV 카피 수를 나타내는 그래프이다. 등밀도 원심분리에 의해 단리한 후, 정제된 CAV(IVC로 표지됨) 또는 허위-감염 세포 용해물(음성)을 투석하고, 표시된 바와 같이 배양 배지로 희석한 다음 신선한 MDCC-MSB1 세포에 첨가하였다. 샘플을 매일 취하고, CAV 카피 수를 qPCR로 정량화하였다.
도 5는 합성 게놈 DNA로부터 구제된 CAV 입자를 나타내는 일련의 전자 현미경 사진이다. 눈금 막대는 각각의 이미지의 배율을 표시한다. 화살표는 좌측 이미지에서 볼 수 있는 CAV 입자의 일부를 표시한다. 입자는 직경이 대략 24 mm인 것으로 측정되었다.
도 6a는 예시적인 CAV 탠덤 작제물의 개략도를 나타내는 다이어그램이다. pRTx-966은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1113은 (i) 절단된 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1114는 (i) 추가 절단된 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1115는 (i) 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1116은 (i) ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1117은 (i) 영역의 3' 단편만을 포함하는 절단된 ORF 영역, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀을 포함한다. pRTx-1118은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, 및 ORF를 포함한다. pRTx-1119는 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부, 프로모터, 영역의 5' 단편만을 포함하는 절단된 ORF 영역을 포함한다. pRTx-1120은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 반복부를 포함한다. pRTx-1118은 (i) 반복부, 프로모터, ORF, 및 헤어핀, 그리고 (ii) 절단된 반복부 영역을 포함한다.
도 6b는 도 6a에 나타낸 CAV 탠덤 작제물로 형질감염된 세포 현탁액에 대한 CAV qPCR 결과를 나타내는 그래프이다. 200 ul의 세포 현탁액을 P0 제2일, P0 제3일, 및 P1 제2일에 수집하였다. 바이러스 DNA를 추출하고, DAV 게놈을 qPCR로 정량화하였다.
도 6c는 도 6a에 나타낸 CAV 탠덤 작제물로 형질감염된 세포 유래의 샘플에 대한 서던 블롯 결과를 나타내는 다이어그램이다. 샘플을 P1 제2일에 수집하였다. 세포 펠렛을 10 ml 배양물로부터 용해하였다. DNA를 추출하고 백본(B) 또는 비-복제 플라스미드(D, DpnI)를 절단하는 효소로 분해하였다.
도 7은 인간 세포주에 대한 CAV의 결합을 나타내는 그래프이다. y-축은 MDCC 세포 대조군에 대해 정규화된 CAV 바이러스 게놈(vg)을 표시한다. 각각의 원은 생물학적 복제물을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 인간 세포주 중에서, CAV는 Raji 세포에 가장 강하게 결합하였고, 그 다음으로는 EKVX 세포, MRC5 세포, 및 MCF7 세포에 강하게 결합하였다.
도 8a 내지 8b는 CAV의 게놈 구성 및 예시적인 CA벡터의 세트를 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 5' UTR, VP2 오픈 리딩 프레임, 아폽틴 오픈 리딩 프레임, VP1 오픈 리딩 프레임, 및 3' UTR을 포함하여, 단계적으로 도시한 WT CAV 게놈의 선형화된 표현. CAV 게놈은 길이가 2.3 kb이다. (b) 생성되고 테스트된 다양한 CA벡터 작제물의 선형화된 표현. 각각의 CA벡터에 대해, 나노-루시퍼라제(nLuc) 리포터 카세트를 CAV 게놈에 삽입하여, 나타낸 바와 같이, 리포터 카세트와 길이가 동일한 게놈의 단편으로 대체하였다. 나노-루시퍼라제 리포터는 SV40 프로모터, 나노-루시퍼라제 ORF, 및 SV40 종결자 서열을 포함한다. 이 도면에 나타낸 예시적인 CA벡터에 대한 서열은 표 2 내지 9에 열거되어 있다.
도 9a 내지 9c는 CA벡터 상청액을 이용한 MDCC 세포의 형질도입을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 형질도입 분석의 개략도. 요약하면, 1e5개 세포를 CA벡터 상청액과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 3회 세척하고 제0일에 발광을 측정하였다. 24시간 후, 세포를 3회 세척하고 제1일 발광 측정값을 수득하였다. 추가 24시간 후, 세포를 3회 세척하고 제2일 발광 측정값을 수득하였다. (b) CA벡터 + pRTX-637을 이용한 음성 대조군 형질도입. 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 샘플에서 제0일, 제1일, 또는 제2일 중 어느 날에도 발광이 검출되지 않았다. (c) pRTX-966(전체 탠덤 CAV 작제물)으로 동시-형질감염된 세포에서 생성된 CA벡터를 이용한 형질도입. 다중 비교와 함께 2원 ANOVA를 사용하여 유의성을 계산하였다(* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001). nLuc4, nLuc5, 및 nLuc7 CA벡터는 제2일에 발광의 유의한 증가를 나타내었다. nLuc6 CA벡터는 제1일부터 발광의 유의한 증가를 나타내었다.
도 10a 내지 10b는 정규화된 형질도입 분석에서 상청액으로부터의 CA벡터의 정제 및 이의 분석을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 정제된 CA벡터 입자에 대한 DNase 보호 분석. 정제된 입자를 DNase로 처리하거나 DNase 없이 처리한 다음, 게놈을 nluc 프로브를 사용하여 qPCR로 정량화하였다. (b) 정규화된 CA벡터 게놈을 이용한 형질도입 분석. CA벡터 nLuc4, nLuc5, nLuc6, 및 nLuc7은 제2일에 증가된 나노-루시퍼라제 발광을 나타내었다.
도 11a 내지 11b는 CA벡터에 의한 인간 세포의 형질도입을 나타내는 일련의 그래프이다. (a) MOI 3에서 Jurkat 세포의 CA벡터 형질도입. (b) MOI 3에서 Raji 세포의 CA벡터 형질도입. 다중 비교와 함께 2원 ANOVA를 사용하여 유의성을 계산하였다(* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001).
도 12는 nLuc 이식유전자를 보유하는 CA벡터, 야생형 CAV(음성 대조군), 또는 AAV2(양성 대조군)를 생성하는 세포에 대한 역가, 내독소 수준, 및 BCA 수준을 나타내는 표이다.
도 13a 내지 13c는 CA벡터가 VP1-중화 항체에 의해 중화됨을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) WT CAV를 이용한 중화 분석. (b) 닭 혈청의 중화 항체는 VP1을 특이적으로 인식한다. (c) IVIG가 아닌 닭 혈청을 이용한 CA벡터의 중화.
도 14는 VP1이 결실된 CAV 게놈을 사용하는 샘플과 비교하여 Nluc6 CA벡터 생성을 구제하는 전체 WT CAV 게놈(pCAV)을 포함하는 플라스미드를 나타내는 그래프이다. VP1-중화 항체의 첨가는 이러한 구제를 방지하였다.
도 15a 내지 15c는 나란히 배열된 CAV 및/또는 CA벡터 유전 요소 영역을 각각 포함하는 예시적인 탠덤 작제물에 대한 플라스미드 지도를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 각각의 작제물은 암피실린 내성 카세트 및 복제 원점을 포함한다. 도 15a는 pCAV-nLuc6_CAV에 대한 플라스미드 지도를 나타내며, 이의 서열은 표 14에 주석이 달린 형태로 열거되어 있다. 이 작제물은 5'에서 3'의 순서로, CAV 반복부, 불활성 CAV VP-인코딩 서열, SV40p_nLuc 삽입부, 및 CAV 헤어핀 서열을 포함하는, CA벡터 유전 요소 서열을 포함한다. CA벡터 유전 요소 서열은 5'에서 3'의 순서로, CAV 반복부, CAV VP-인코딩 서열, 및 CAV 헤어핀 서열을 포함하는 야생형 CAV 유전 요소 서열에 대해 5'에 위치한다. 도 15b는 pCAV-nLuc6_CAVΔ3NCR에 대한 플라스미드 지도를 나타내며, 이의 서열은 표 15에 주석이 달린 형태로 열거되어 있다. 이 작제물은 CAV 반복부 및 CAV VP-인코딩 서열만을 포함하는 절단된 야생형 CAV 유전 요소 서열에 대해 5'에 위치하는 동일한 nLuc6 CA벡터 유전 요소 서열을 포함한다. 도 15c는 pCAV-nLuc6_CAVΔPromΔORFsΔ3NCR(이의 후반부는 "CAVΔΔΔ"로 도식화됨)에 대한 플라스미드 지도를 나타내며, 이의 서열은 표 16에 주석이 달린 형태로 열거되어 있다. 이 작제물은 CAV 반복부만을 포함하는 절단된 야생형 CAV 유전 요소 서열에 대해 5'에 위치하는 동일한 nLuc6 CA벡터 유전 요소 서열을 포함한다.
도 16a 내지 16d는 야생형 CAV, 나노-루시퍼라제를 인코딩하는 CA벡터, 또는 나노-루시퍼라제를 인코딩하는 AAV2를 투여한 마우스의 표시된 조직에서 검출된 nLuc 카피 또는 야생형 CAV 게놈 카피의 수준을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 17a 내지 17c는 표시된 바와 같이, CA벡터 또는 AAV2에 대한 시험관 내 중화 분석의 결과를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 도 17a는 nLuc CA벡터, 야생형 CAV, 또는 AAV2-nLuc를 근육내로 투여한 마우스에서 CA벡터의 중화, 또는 닭 혈청에 의한 CA벡터의 중화를 나타낸다. 도 17b는 nLuc CA벡터, 야생형 CAV, 또는 AAV2-nLuc를 근육내로 투여한 마우스에서 AAV2의 중화, 또는 닭 혈청에 의한 CA벡터의 중화를 나타낸다. 도 17c는 표시된 벡터를 받은 마우스에서 CAV(중간 컬럼) 또는 AAV2(우측 컬럼)에 대한 50% GMT(기하 평균 중화 역가의 역수를 의미함)를 나타낸다.
도 18은 시험관 내에서 바이러스-유사 입자(VLP) 구조로의 CAV VP1 단백질의 조립을 나타내는 일련의 다이어그램이다.
도 19a 내지 19d는 CA벡터가 CAV-유사 밀도를 갖고 면역 혈청에 의해 중화되지만 인간 혈청 샘플에 의해서는 중화되지 않음을 나타내는 일련의 그래프이다. (a) 염화세슘 선형 구배에서 초원심분리 및 CAV 및 나노루시퍼라제(Nluc) 앰플리콘의 DNase-내성 qPCR 후 CAV 야생형 및 벡터 입자의 밀도. (b) 투석 후, 패널 A에 나타낸 구배 분획을 세포에 벡터를 첨가하고 수 분 이내에(제0일) 또는 48시간 후에(제2일) MDCC-MSB1 세포의 형질도입에 대하여 평가하였다. (-)는 음성 대조군을 표시한다. (c) 닭 면역 혈청에 의한 CA벡터의 중화는 쉽게 관찰되는 반면, 인간 IVIG 및 개별 인간 혈청 샘플에 의한 중화는 하나의 샘플(공여자 38)에서의 약한 신호를 제외하고 검출될 수 없다. (d) AAV2-nluc는 IVIG 및 10개의 개별 인간 혈청 샘플 중 3개에 의해 중화되지만, 닭 혈청에 의해서는 중화되지 않는다.
도 20은 근육내 주사 3주 후 qPCR에 의한 마우스 조직에서 CA벡터 이식유전자 nLuc의 검출을 나타내는 일련의 그래프이다. 주사 3주 후 qPCR에 의한 마우스 조직에서 CA벡터 이식유전자 nLuc의 검출. 각각의 기호는 한 마리의 마우스를 나타낸다. 수평선은 각각의 값의 기하 평균이고 오차 막대는 기하 표준 편차를 나타낸다. 다양한 경로(SR, IV, IP, IM)로 표시된 샘플을 마우스에게 투여하고 이의 조직을 3주 후에 수집하였다.
도 21a 내지 21c는 세포 내로의 CA벡터 유입이 디나민-의존적 및 pH-의존적 과정임을 나타내는 일련의 다이어그램이다. (a) 상이한 단계에서 작용하는 저해제를 나타내는 일반적인 바이러스 유입 경로의 예시. (b) MDCC-MSB1 세포를 감염 이전에 표시된 농도로 저해제 또는 DMSO 대조군으로 전처리하였다. 그 다음 세포를 저해제의 존재 하에 형질도입하고 20시간 후에 발광을 판독하였다. (c) 비교를 위해, 저해제 또는 DMSO 대조군으로 전처리된 Expi293 세포를 사용하여 AAV2-nluc 유입의 억제를 유사하게 연구하였다. 각각의 기호는 2개의 생물학적 복제물 중 하나를 나타낸다. PM: 원형질막.
도 22a 내지 22b는 최대 65℃까지 및 4℃에서 보관 시 CA벡터가 형질도입 효력을 유지함을 나타내는 그래프이다. (a) CA벡터 nLuc 6을 표시된 온도에서 15분 동안 인큐베이션하고, MDCC-MSB1 세포에 열-처리 바이러스를 첨가하고 36시간 후에 잔여 형질도입 효력을 발광 분석으로 측정하였다. 각각의 기호는 하나의 샘플을 나타낸다. 중화 샘플(NAb)을 음성 대조군뿐만 아니라, 벡터가 없는 대조군(-)으로 포함하였다. (b) 등밀도 CsCl 원심분리 및 투석에 의해 정제된 CA벡터 현탁액을 완충 식염수에 4℃에서 6개월 동안 보관하고 형질도입 활성에 대해 분석하였다. 0, 3, 및 6개월째의 형질도입 분석은 표시된 MOI에서 감염되지 않은 음성 대조군을 포함하여 시간 순으로 나타나 있다.
도 23a 내지 23c는 탠덤 플라스미드를 사용하여 CA벡터의 회수를 나타내는 일련의 다이어그램이다. 도 23a는 탠덤 플라스미드를 도시하는 다이어그램이다. 도 23b는 DNase 처리 후 벡터 게놈의 정량화를 도시하는 그래프이다. 도 23c는 벡터 입자가 형질도입될 수 있음을 입증하는 발광 증가를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 구현예에 대한 하기의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽으면 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시 목적을 위하여, 본 명세서에 예시된 구현예가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 구현예의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
정의
본 발명은 특정 구현예에 대해 그리고 특정 도면을 참조하여 설명될 것이지만 본 발명은 이에 제한되지 않고, 청구범위에 의해서만 제한된다. 이하에 제시된 용어는 일반적으로 달리 지시되지 않는 한 그의 일반적인 의미로 이해되어야 한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위에서 "포함하는"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, "로 이루어지는"이라는 용어는 "로 구성되는"이라는 용어의 바람직한 구현예인 것으로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 개수의 구현예를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 또한 바람직하게는 이들 구현예만으로 이루어지는 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 언급할 때, 부정 관사 또는 정관사, 예를 들어, 하나의("a", "an") 또는 상기("the")가 사용되는 경우, 이는 그 밖의 어떤 것이 특별히 언급되지 않는 한, 그 명사의 복수형을 포함한다.
용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 표시된 치료, 조절 등의 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 추가로 일 구현예로서, 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 치료, 조절 등에 사용하기 위한 것임을 개시한다.
용어 "...에 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등", "...를 위한 의약, 약제학적 조성물, 수의학적 조성물, 진단적 조성물 등의 제조에서의 화합물, 조성물, 생성물 등의 용도", 또는 "의약으로서 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등..."은 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 인간 또는 동물 신체에서 실시될 수 있는 치료적 방법에 사용될 것임을 나타낸다. 그들은 치료 방법 등에 관한 구현예 및 청구범위의 동등한 개시로서 간주된다. 따라서, 구현예 또는 청구범위가 "질환을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하는 데 사용하기 위한 화합물"을 지칭한다면, 이는 또한 "질환을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 화합물의 용도" 또는 "질환을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물로의 화합물의 투여에 의한 치료 방법"의 개시인 것으로 간주된다. 용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 표시된 치료, 조절 등의 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
기간, 값, 수 등의 하기의 예가 괄호 안에 제공된다면, 이는 괄호 안에 언급된 예가 구현예를 구성할 수 있다는 표시로서 이해되어야 한다. 일부 예에서, "구현예에서, 핵산 분자가 표 1A의 CAV VP1-인코딩 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다"고 언급된다면, 일부 구현예는 표 1A에 열거된 바와 같은 VP1-인코딩 핵산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭"은 핵산 분자 또는 이의 일부(예를 들어, 유전 요소 또는 유전 요소 영역)의 하나 이상의 추가의 카피를 생성하기 위한 핵산 분자 또는 이의 일부의 복제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 증폭은 핵산 서열의 부분 복제를 초래한다. 일부 구현예에서, 증폭은 회전환 복제를 통해 발생한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CA벡터"는 단백질성 외부 내에 봉입된 유전 요소, 예를 들어 환형 DNA를 포함하는 비히클을 지칭하며, 예를 들어 유전 요소는 단백질성 외부에 의해 DNAse I을 이용한 분해로부터 실질적으로 보호되고, 유전 요소 및 단백질성 외부 중 하나 또는 둘 다는 CAV 구성성분(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV 서열의 단편 또는 상동체)을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "합성 CA벡터"는 일반적으로, 천연 발생이 아닌, 예를 들어 야생형 바이러스(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 야생형 CAV)에 비하여 상이한 서열을 갖는 CA벡터를 지칭한다. 일부 구현예에서, 합성 CA벡터는 엔지니어링되거나 또는 재조합이며, 예를 들어 야생형 바이러스 게놈(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 야생형 CAV 게놈)에 비하여 차이 또는 변형을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부 내의 봉입은 단백질성 외부에 의한 100% 커버리지, 및 100% 미만, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 그 이하의 커버리지를 포함한다. 유전 요소가, 예를 들어 숙주 세포로의 유입 이전에 단백질성 외부에 보유되거나 DNAse I을 이용한 분해로부터 보호되는 한, 예를 들어 (예를 들어, 단백질성 외부를 물, 이온, 펩티드 또는 소분자에 대해 투과 가능하게 만드는) 갭 또는 불연속부가 단백질성 외부에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 정제되며, 예를 들어 CA벡터는 이의 원래의 공급원으로부터 분리되고/되거나 다른 구성성분이 실질적으로 없다(50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과). 일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소를 (예를 들어, 감염을 통해) 표적 세포 내로 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 감염성 합성 CAV 바이러스 입자이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "CAV 구성성분"은 일반적으로 각각 CAV 게놈에 의해 인코딩되거나 이에 의해 포함되는 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 활성을 포함하고/하거나, 각각 CAV 게놈, 예를 들어 야생형 CAV 게놈(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17에 열거된 바와 같음) 또는 CAV 게놈에 포함되는 핵산 요소, 또는 이의 기능적 단편에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 단백질, 예를 들어 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "항체 분자"는 전장 항체 및 항체 단편(예를 들어, scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어 항체 분자는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 복수의 것들 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지고, 복수의 것들 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체 분자는 일반적으로 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 특성화된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하류 복제-촉진 서열"(dRFS)은 유전 요소 서열의 하류에 위치할 때(예를 들어, 유전 요소가 dRFS에 비해 5'에 있음) dRFS의 부재 하에 다른 유사한 유전 요소 서열과 비교하여 유전 요소 서열의 복제를 증가시키는 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 서열의 단편을 지칭한다. 일반적으로, 생성된 복제된 가닥은 단백질성 외부에 봉입되어 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 형성할 수 있는 기능적 유전 요소이다. 일부 구현예에서, dRFS는 Rep 단백질(예를 들어, CAV Rep 단백질)에 대한 변위 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, dRFS는 CAV 3' UTR 서열 또는 이의 단편, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, dRFS는 5' UTR(예를 들어, 헤어핀 루프를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, dRFS는 복제 원점을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상류 복제-촉진 서열"(uRFS)은 유전 요소 서열의 상류에 위치할 때(예를 들어, 유전 요소가 uRFS에 비해 3'에 있음) uRFS의 부재 하에 다른 유사한 유전 요소 서열과 비교하여 유전 요소 서열의 복제를 증가시키는 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 서열의 단편을 지칭한다. 일반적으로, 생성된 복제된 가닥은 단백질성 외부에 봉입되어 CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 형성할 수 있는 기능적 유전 요소이다. 일부 구현예에서, uRFS는 Rep 단백질(예를 들어, CAV Rep 단백질)에 대한 결합 및/또는 인식 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, uRFS는 CAV 5' UTR 서열 또는 이의 단편, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, uRFS는 5' UTR(예를 들어, 헤어핀 루프를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, uRFS는 복제 원점을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인코딩"하는 핵산은 아미노산 서열 또는 기능적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 비-코딩 RNA, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "외인성" 작용제(예를 들어, 이펙터, 핵산(예를 들어, RNA), 유전자, 페이로드, 단백질)는 상응하는 야생형 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV에 의해 포함되지 않거나, 이에 의해 인코딩되지 않는 작용제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제, 예컨대 천연 발생 단백질 또는 핵산에 비하여 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환에 의해) 변경된 서열을 갖는 단백질 또는 핵산은 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지만, 바이러스에 대하여 외인성이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지만, 요망되는 수준으로 또는 요망되는 시간에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표적 세포에서 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표적 세포에서 자연적으로 존재하지만, 바이러스에 대하여 외인성이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표적 세포에서 자연적으로 존재하지만, 요망되는 수준으로 또는 요망되는 시간에 존재하지 않는다. 구현예에서, 외인성 작용제의 표적 세포로의 도입은 표적 세포에서 작용제의 비자연적 수준(예를 들어, 세포에서 작용제의 내인성 수준보다 높은 수준)을 초래한다.
또 다른 작용제 또는 요소(예를 들어, 이펙터, 핵산 서열, 아미노산 서열)에 관하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "이종" 작용제 또는 요소(예를 들어, 이펙터, 핵산 서열, 아미노산 서열)는 천연적으로, 예를 들어 야생형 바이러스, 예를 들어 CAV에서 함께 발견되지 않는 작용제 또는 요소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이종 핵산 서열은 천연 발생 핵산 서열(예를 들어, CAV에서 천연적으로 발생하는 서열)과 동일한 핵산에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 작용제 또는 요소는 CA벡터의 다른(예를 들어, 나머지) 요소가 기반으로 하는 CAV에 비하여 외인성이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 요소"는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 형성하기 위해, 단백질성 외부이거나 단백질성 외부 내에 봉입될 수 있는(예를 들어, 단백질성 외부에 의해 DNAse I로부터 보호될 수 있는) 핵산 분자를 지칭한다. 유전 요소가 네이키드(naked) DNA로서 생성되고, 선택적으로 추가로 단백질성 외부로 조립될 수 있는 것이 이해된다. 또한, CA벡터는 이의 유전 요소를 세포 내로 삽입하여, 유전 요소가 세포 내에 존재하게 하고, 단백질성 외부가 반드시 세포에 유입되는 것은 아니라는 점이 이해된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 단일-가닥이다. 일부 구현예에서 유전 요소는 환형이다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 하나 이상의 서열, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV 유래의 패키징 신호를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전 요소 작제물"은 적어도 하나(예를 들어, 2개)의 유전 요소 서열(들), 또는 이의 단편을 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드, 박미드, 코스미드, 또는 미니서클)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 탠덤 작제물은 나란히 배열된, 2개 이상의 유전 요소 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 유전 요소 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)이다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 적어도 하나의 전장 유전 요소 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 전장 유전 요소 서열 및 부분 유전 요소 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 2개 이상의 부분 유전 요소 서열(예를 들어, 5'에서 3' 순서로, 3'-절단된 유전 요소 서열과 나란히 배열된 5'-절단된 유전 요소 서열)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 요소 영역"은 유전 요소의 서열을 포함하는 작제물의 영역을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역은 야생형 CAV 서열, 또는 이의 단편에 대해 충분한 동일성을 갖는 서열을 포함하여 단백질성 외부에 의해 봉입됨으로써 CA벡터(예를 들어, 야생형 CAV 서열 또는 이의 단편에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열)를 형성한다. 구현예에서, 유전 요소 영역은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 단백질 결합 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 5' UTR, 3' UTR 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역은 회전환 복제를 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역은 uRFS를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역은 dRFS를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 Rep 단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 Rep 단백질 변위 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역을 포함하는 작제물은 단백질성 외부로 봉입되지 않지만, 작제물로부터 생성된 유전 요소는 단백질성 외부로 봉입될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역을 포함하는 작제물은 제2 uRFS 또는 제2 dRFS를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 영역을 포함하는 작제물은 벡터 백본을 추가로 포함한다.
VP1-, VP2-, 또는 아폽틴-코딩 유전자, 또는 이의 단편과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비기능적"은 단백질을 생성하지 않거나, 야생형 대응물과 비교하여 적어도 하나의 활성(예를 들어, 모든 활성)이 결여된 단백질을 생성하는 유전자 또는 이의 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 비기능적 유전자는 미성숙 정지 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 비기능적 유전자는 프레임시프트 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비기능적 유전자는 시작 코돈이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 활성은 결합 활성 또는 효소 활성이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 전장 단백질 또는 폴리펩티드의 "기능적 단편"은 전장 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 활성(예를 들어, 모든 활성)을 갖고, 전장 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 적어도 하나의 아미노산(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 아미노산)이 결여된 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성은 결합 활성 또는 효소 활성이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단백질에 결합하는 전장 핵산 서열의 "기능적 단편"은 전장 핵산 서열에 의해 결합되는 적어도 하나의 단백질에 결합하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 전장 핵산 서열은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 5' UTR 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터 요소"는 프로모터의 기능을 갖는 서열을 포함하는 조절 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 프로모터 요소는 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터 요소는, 예를 들어 RNA 중합효소가 프로모터 요소의 하류에 있는 핵산 서열로부터 RNA 분자를 전사할 수 있도록, RNA 중합효소 분자에 결합하고/하거나 이를 동원한다. 일부 구현예에서, 프로모터 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 구성적 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 유도성 프로모터를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "VP1 분자"는 CAV VP1 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 단백질, 또는 이의 기능적 단편)의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. VP1 분자는 일부 예에서 포함하는 제1 영역 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, VP1 분자는 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3, 및 제4 영역을 포함한다. VP1 분자는 일부 예에서 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. VP1 분자는 일부 예에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 단백질 유래의 이종 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 CAV 게놈(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV 게놈)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 CAV VP1 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 VP1 유전자)에 의해 인코딩된 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 스플라이스 변이체이거나 번역 후 변형을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "VP2 분자"는 CAV VP2 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP2 단백질, 또는 이의 기능적 단편)의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, VP2 분자는 CAV 게놈(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV 게놈)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VP2 분자는 CAV VP2 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 VP2 유전자)에 의해 인코딩된 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, VP2 분자는 스플라이스 변이체이거나 번역 후 변형을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아폽틴 분자"는 CAV 아폽틴 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV 아폽틴 단백질, 또는 이의 기능적 단편)의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아폽틴 분자는 CAV 게놈(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV 게놈)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 아폽틴 분자는 CAV 아폽틴 핵산(예를 들어, 아폽틴 유전자)에 의해 인코딩된 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 아폽틴 분자는 스플라이스 변이체이거나 번역 후 변형을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CAV 캡시드 폴리펩티드"는 야생형 CAV의 캡시드에 존재하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, CAV 캡시드 폴리펩티드는 VP1 분자이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "VP1 핵산"은 VP1 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 역상보체를 지칭한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, VP1 핵산은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP1 유전자를 포함한다. "VP1 유전자"는 일반적으로 야생형 VP1 분자를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 지칭한다. 일부 구현예에서, VP1 유전자는 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 유전자는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 유전자는 이중-가닥이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "VP2 핵산"은 VP2 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 역상보체를 지칭한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, VP2 핵산은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP2 유전자를 포함한다. "VP2 유전자"는 일반적으로 야생형 VP2 분자를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 지칭한다. 일부 구현예에서, VP2 유전자는 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, VP2 유전자는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, VP2 유전자는 이중-가닥이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아폽틴 핵산"은 아폽틴 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 역상보체를 지칭한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 아폽틴 핵산은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV 아폽틴 유전자를 포함한다. "아폽틴 유전자"는 일반적으로 야생형 아폽틴 분자를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아폽틴 유전자는 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 아폽틴 유전자는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 아폽틴 유전자는 이중-가닥이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CAV 게놈 서열"은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV 유래의 전장 게놈 서열, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, CAV 게놈은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV 게놈 서열(예를 들어, 표 1A 및 1B 또는 표 17 중 임의의 것에 열거된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV 게놈 서열)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CAV UTR"은 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 표 1A, 1B, 또는 17에 열거된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 CAV) 유래의 비번역 영역(UTR) 서열을 포함하는 핵산 서열(예를 들어, 5' UTR 또는 3' UTR의 서열), 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질성 외부"는 주로(예를 들어, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과) 단백질인 외부 구성성분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 핵산 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 유전 요소를 봉입한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 바이러스 입자의 캡시드, 또는 이의 일부를 형성한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질 결합 서열"은 단백질, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 단백질성 외부의 구성성분에 결합(예를 들어, 이에 특이적으로 결합)할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부 내에 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소의 봉입을 촉진시키기에 충분한 친화도로 단백질성 외부의 구성성분에 결합한다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부 단백질에 직접 결합한다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부 단백질에 간접적으로 결합한다(예를 들어, 단백질 결합 서열은 단백질, 핵산 분자, 또는 단백질성 외부 단백질과 회합된 다른 모이어티에 결합한다).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 핵산"은 발현 생성물을 인코딩하는 DNA 서열의 발현, 예를 들어 전사 및/또는 번역을 변형시키는 핵산 서열을 지칭한다. 구현예에서, 발현 생성물은 RNA 또는 단백질을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 서열"은 표적 유전자 생성물의 전사를 변형시키는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Rep" 또는 "복제 단백질"은 바이러스 게놈 복제를 촉진시키는 단백질, 예를 들어 바이러스 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 복제 단백질은 CAV Rep 단백질이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Rep 결합 부위"는 Rep 단백질(예를 들어, CAV Rep 단백질)에 의해 인식되고 결합되는 핵산 분자 내의 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, Rep 결합 부위는 5' UTR(예를 들어, 헤어핀 루프를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, Rep 결합 부위는 복제 원점(ORI)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Rep 변위 부위"는 핵산 분자와 회합된(예를 들어, 이에 결합된) Rep 단백질(예를 들어, CAV Rep 단백질)을 야기하여 Rep 변위 부위에 도달하면 핵산 분자를 방출할 수 있는 핵산 분자 내의 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, Rep 변위 부위는 5' UTR(예를 들어, 헤어핀 루프를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, Rep 변위 부위는 복제 원점(ORI)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"는 비특이적 대조군 분자(예를 들어, 단백질 결합 서열이 결여된 핵산)보다 더 강하게 제2 분자(예를 들어, 단백질 결합 서열, 예를 들어 패키징 신호를 포함하는 핵산)에 결합하는 제1 분자(예를 들어, 캡시드 단백질, 예를 들어 VP1 단백질)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 제1 분자는 비특이적 대조군 분자에 대한 결합의 검출 가능한 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제2 분자에 대한 제1 분자의 KD는 비특이적 대조군 분자에 대한 제1 분자의 KD보다 5, 10, 20, 50, 또는 100배 더 낮다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-병원성인" 유기체, 입자 또는 구성성분은, 예를 들어 숙주 유기체, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간에서 허용 불가능한 질환 또는 병원성 병태를 야기하거나 유도하지 않는 유기체, 입자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 바이러스 또는 CA벡터) 또는 이의 구성성분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체에 대한 CA벡터의 투여는 치료 기준의 일부로서 허용 가능한 부차 반응 또는 부작용을 초래할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비-병원성"은 숙주 유기체, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간에서 허용 불가능한 질환 또는 병원성 병태를 야기하거나 유도하지 않는 유기체 또는 이의 구성성분을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-통합성인" 유전 요소는 숙주 세포(예를 들어, 진핵 세포) 또는 유기체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간) 내로 유입되는 유전 요소 중 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% 또는 1% 미만이 게놈 내로 통합되는 유전 요소, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 바이러스 또는 CA벡터 내의 유전 요소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는, 예를 들어 숙주 세포의 게놈 내로 검출 가능하게 통합되지 않는다. 일부 구현예에서, 게놈 내로의 유전 요소의 통합은 본 명세서에 기재된 바와 같은 기법, 예를 들어 핵산 서열결정, PCR 검출 및/또는 핵산 혼성화를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 통합 빈도는, 예를 들어 문헌[Wang et al., 2004, Gene Therapy 11: 711-721](본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 자유 벡터에서 분리된 게놈 DNA의 정량적 겔 정제 분석에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "하위서열"은 각각 더 큰 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 포함되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 하위서열은 더 큰 서열의 도메인 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하위서열은 더 큰 서열로부터 단리되는 경우, 더 큰 서열의 나머지와 함께 존재할 때 하위서열에 의해 형성되는 2차 및/또는 3차 구조와 유사한 2차 및/또는 3차 구조를 형성할 수 있는 더 큰 서열의 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하위서열은 또 다른 서열(예를 들어, 외인성 서열 또는 더 큰 서열의 나머지에 대하여 이종인 서열을 포함하는 하위서열, 예를 들어 상이한 CAV 유래의 상응하는 하위서열)에 의해 대체될 수 있다.
본 발명은 일반적으로 CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 CA벡터, CA벡터를 포함하는 조성물, 및 CA벡터의 제조 또는 사용 방법을 제공한다. CA벡터는 일반적으로, 예를 들어 치료제를 진핵 세포로 운반하기 위한 운반 비히클로서 유용하다. 일반적으로, CA벡터는 단백질성 외부 내에 봉입된 (예를 들어, 이펙터, 예를 들어 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터를 인코딩하는) 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함할 것이다. CA벡터는 CAV 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에 비한 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 영역 또는 도메인)의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. CA벡터는, 예를 들어 세포를 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위하여, 유전 요소 또는 그 내에 인코딩된 이펙터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 폴리펩티드 또는 핵산 이펙터)를 진핵 세포 내로 운반하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다.
목차
I. CA벡터를 제조하기 위한 조성물 및 방법
A. CA벡터의 구성성분 및 조립
i. CA벡터의 조립을 위한 VP1 분자
ii. CA벡터의 조립을 위한 VP2 분자
B. 유전 요소 작제물
i. 플라스미드
ii. 환형 유전 요소 작제물
iii. 시험관 내 환화
iv. 시스/트랜스 작제물
v. 발현 카세트
vi. 유전 요소 작제물의 설계 및 생성
C. 이펙터
D. 숙주 세포
i. 숙주 세포 내로의 유전 요소의 도입
ii. 시스 또는 트랜스로 CAV 단백질(들)을 제공하는 방법
iii. 헬퍼
iv. 예시적인 세포 유형
E. 배양 조건
F. 수확 및 정제
II. CA벡터
A. CAV
B. VP1 분자
C. VP2 분자
D. 유전 요소
E. 단백질 결합 서열
F. 5' UTR 영역
G. GC-풍부 영역
H. 이펙터
I. 조절 서열
J. 복제 단백질
K. 기타 서열
L. 단백질성 외부
III. 유전 요소 작제물
IV. 조성물
V. 숙주 세포
VI. 사용 방법
VII. 투여/운반
I. CA벡터를 제조하기 위한 조성물 및 방법
본 개시내용은, 일부 양태에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터를 생성하는 데 사용될 수 있는 유전 요소 작제물을 제공한다.
CA벡터의 구성성분 및 조립
본 명세서의 조성물 및 방법은 CA벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CA벡터는 일반적으로 단백질성 외부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함함) 내에 봉입된 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 5' UTR 영역을 포함하는, 예를 들어 단일-가닥, 환형 DNA 분자)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 CAV ORF(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴 중 하나 이상)를 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, CAV ORF 또는 ORF 분자(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)는, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상응하는 CAV ORF 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 구현예에서, 유전 요소는 CAV VP1, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 CAV VP1 핵산(예를 들어, CAV VP1 분자 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 단백질성 외부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 내에 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 봉입함으로써 조립된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 숙주 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에서 단백질성 외부 내에 봉입된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 단백질성 외부에 포함된 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 예를 들어 VP1 분자)를 발현한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CAV VP1 분자, 예를 들어 CAV VP1 폴리펩티드의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 야생형 CAV VP1 단백질 또는 야생형 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, CAV VP1 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에 포함된 유전 요소 작제물(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스, 미니서클, 박미드, 또는 인공 염색체)에 포함된다. 구현예에서, CAV VP1 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포의 게놈에 통합된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 유전 요소 및/또는 유전 요소의 서열을 포함하는 유전 요소 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 플라스미드, 바이러스 핵산, 미니서클, 박미드, 또는 인공 염색체로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 유전 요소 작제물로부터 절제되고, 선택적으로, 이중-가닥 형태에서 단일-가닥 형태로 (예를 들어, 변성에 의해) 전환된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 유전 요소 작제물의 주형 서열에 기반한 중합효소에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 중합효소는 유전 요소 서열의 단일-가닥 카피를 생성하며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소를 형성하기 위해 선택적으로 환화될 수 있다. 다른 구현예에서, 유전 요소 작제물은 시험관 내에서 유전 요소의 핵산 서열의 환화에 의해 생성된 이중-가닥 미니서클이다. 구현예에서, 시험관 내-환화(IVC) 미니서클은 숙주 세포 내로 도입되고, 여기서 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질성 외부에 봉입하기에 적합한 단일-가닥 유전 요소로 전환된다.
VP1 분자로서, 예를 들어, CA벡터의 조립을 위한 VP1 분자
CA벡터는, 예를 들어 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입함으로써 제조될 수 있다. CA벡터의 단백질성 외부는 일반적으로 CAV VP1 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 분자 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 구현예에서, 단백질성 외부는 CAV VP1 아르기닌-풍부 영역 및/또는 젤리-롤 영역 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 CAV VP1 젤리-롤 영역(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 CAV VP1 아르기닌-풍부 영역(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 VP1 분자 및/또는 VP1 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, VP1 분자는 CAV VP1 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 단백질)의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 CAV VP1 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 단백질)에 비해 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 CAV VP1 단백질의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 또는 700개 아미노산만큼 절단된다. 일부 구현예에서, VP1 분자는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP1 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. VP1 분자는 일반적으로, 예를 들어 내부 단백질 결합 서열에서, 핵산 분자, 예컨대 DNA(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 유전 요소)에 결합할 수 있다.
이론에 구속되고자 하지 않지만, VP1 분자는 다른 VP1 분자에 결합하여, 예를 들어 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은) 단백질성 외부를 형성할 수 있다. 이러한 VP1 분자는 캡시드를 형성하는 능력을 갖는 것으로서 설명될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 탠덤 작제물을 사용하여 생성된, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 봉입할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 VP1 분자는, 예를 들어 단백질성 외부를 생성하기 위해, 다량체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체는 동종다량체일 수 있다. 다른 구현예에서, 다량체는 이종다량체일 수 있다.
그 외 CAV 폴리펩티드로서, 예를 들어, CA벡터의 조립을 위한 그 외 CAV 폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 방법을 사용하여 CA벡터를 생성하는 것은 CAV VP2 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 VP2 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편, 및/또는 VP2 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 VP2 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편, 및/또는 VP2 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CA벡터를 생성하는 것은 VP2 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 포함하지만, VP2 분자는 CA벡터에 포함되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 방법을 사용하여 CA벡터를 생성하는 것은 CAV 아폽틴 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 아폽틴 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편, 및/또는 아폽틴 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 아폽틴 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편, 및/또는 아폽틴 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CA벡터를 생성하는 것은 아폽틴 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 포함하지만, 아폽틴 분자는 CA벡터에 포함되지 않는다.
유전 요소 작제물로서, 예를 들어, CA벡터의 조립을 위한 유전 요소 작제물
본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터의 유전 요소는 유전 요소 영역 및 선택적으로 벡터 백본과 같은 다른 서열을 포함하는 유전 요소 작제물로부터 생성될 수 있다. 일반적으로, 유전 요소 작제물은 CAV 5' UTR(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 유전 요소 작제물은 유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입될 수 있는 숙주 세포 내로 유전 요소의 서열을 운반하기에 적합한 임의의 유전 요소 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 선형 핵산 분자이다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 환형 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 플라스미드, 박미드, 또는 미니서클)이다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 (예를 들어, 유전 요소 작제물을 포함하는 곤충 세포가 유전 요소 작제물의 유전 요소 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 바큘로바이러스(baculovirus)를 생성할 수 있도록) 바큘로바이러스 서열을 포함한다. 유전 요소 작제물은 일부 구현예에서 이중-가닥일 수 있다. 다른 구현예에서, 유전 요소는 단일-가닥이다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 유전 요소 서열의 하나의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 유전 요소 서열의 복수의 카피(예를 들어, 유전 요소 서열의 2개의 카피)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전은 유전 요소 서열의 하나의 전장 카피 및 적어도 하나의 부분 유전 요소 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 서열의 2개의 카피(예를 들어, 전장 및/또는 부분 유전 요소 서열)는 유전 요소 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 내에 나란히 위치한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 (예를 들어, 세포 배양 시스템에서) 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터의 복제 및 증식을 위한 방법을 제공하며, 이는 하기의 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 유전 요소(예를 들어, 선형화됨)를 CA벡터 감염에 민감한 세포주 내로 도입하는(예를 들어, 형질감염시키는) 단계; (b) 세포를 수확하고, 선택적으로 유전 요소의 존재를 나타내는 세포를 단리하는 단계; (c) 단계 (b)에서 수득되는 세포를 실험 조건 및 유전자 발현에 따라, (예를 들어, 적어도 3일, 예컨대 적어도 1주 이상 동안) 배양하는 단계; 및 (d) 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 단계 (c)의 세포를 수확하는 단계.
플라스미드
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 플라스미드이다. 플라스미드는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소의 서열뿐만 아니라 숙주 세포에서의 복제에 적합한 복제 원점(예를 들어, 박테리아 세포에서의 복제를 위한 박테리아 복제 원점) 및 선택 가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 유전 요소의 서열은 플라스미드로부터 절제될 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 박테리아 세포에서 복제할 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 복제할 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 길이가 적어도 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000 bp이다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 길이가 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 bp 미만이다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 4000, 또는 4000 내지 5000 bp의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는, 예를 들어 (예를 들어, 시험관 내 환화에 의해) 플라스미드로부터 절제되어, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 미니서클을 형성할 수 있다. 구현예에서, 유전 요소의 절제는 유전 요소 서열을 플라스미드 백본으로부터 분리한다(예를 들어, 유전 요소를 박테리아 백본으로부터 분리함).
환형 유전 요소 작제물
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은, 예를 들어 백본이 결여된(예를 들어, 박테리아 복제 원점 및/또는 선택 가능한 마커가 결여된) 환형 유전 요소 작제물이다. 구현예에서, 유전 요소는 이중-가닥 환형 유전 요소 작제물이다. 구현예에서, 이중-가닥 환형 유전 요소 작제물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 시험관 내 환화(IVC)에 의해 생성된다. 구현예에서, 이중-가닥 환형 유전 요소 작제물은 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 여기서, 상기 유전 요소 작제물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 단일-가닥 환형 유전 요소를 생성하기 위한 주형으로 전환되거나 주형으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 환형 유전 요소 작제물은 플라스미드 백본 또는 이의 기능적 단편을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 환형 유전 요소 작제물은 길이가 적어도 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 또는 4500 bp이다. 일부 구현예에서, 환형 유전 요소 작제물은 길이가 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5500, 또는 6000 bp 미만이다. 일부 구현예에서, 환형 유전 요소 작제물은 길이가 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 2300 내지 2400, 2400 내지 2500, 2500 내지 2600, 2600 내지 2700, 2700 내지 2800, 2800 내지 2900, 2900 내지 3000, 3000 내지 3100, 3100 내지 3200, 3200 내지 3300, 3300 내지 3400, 3400 내지 3500, 3500 내지 3600, 3600 내지 3700, 3700 내지 3800, 3800 내지 3900, 3900 내지 4000, 4000 내지 4100, 4100 내지 4200, 4200 내지 4300, 4300 내지 4400, 또는 4400 내지 4500 bp이다. 일부 구현예에서, 환형 유전 요소 작제물은 미니서클이다.
시험관 내 환화
일부 예에서, 단백질성 외부에 패키징되는 유전 요소는 단일 가닥 환형 DNA이다. 유전 요소는 일부 예에서, 단일 가닥 환형 DNA 이외의 형태를 갖는 유전 요소 작제물을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 유전 요소 작제물은 이중-가닥 환형 DNA일 수 있다. 그 다음 이중-가닥 환형 DNA는 숙주 세포(예를 들어, 회전환 복제에 적합한 효소, 예를 들어 CAV Rep 단백질을 포함하는 숙주 세포)에서 단일-가닥 환형 DNA로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 환형 DNA는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 시험관 내 환화(IVC)에 의해 생성된다.
일반적으로, 시험관 내 환화된 DNA 작제물은 유전 요소 서열이 선형 DNA 분자로서 절제되도록, 패키징될 유전 요소의 서열을 포함하는 플라스미드를 분해함으로써 생성될 수 있다. 그 다음, 생성된 선형 DNA는, 예를 들어 DNA 리가제를 사용하여 결찰되어, 이중-가닥 환형 DNA를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 시험관 내 환화에 의해 생성되는 이중-가닥 환형 DNA는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 회전환 복제를 겪을 수 있다. 이론에 구속되고자 하지 않지만, 시험관 내 환화가 추가의 변형 없이 회전환 복제를 겪을 수 있는 이중-가닥 DNA 작제물을 생성함으로써, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터에 패키징되기에 적합한 크기의 단일-가닥 환형 DNA를 생성할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 DNA 작제물은 플라스미드(예를 들어, 박테리아 플라스미드)보다 더 작다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 DNA 작제물은 플라스미드(예를 들어, 박테리아 플라스미드)로부터 절제된 다음, 예를 들어 시험관 내 환화에 의해 환화된다.
시스/트랜스 작제물
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물은 하나 이상의 CAV ORF, 예를 들어 단백질성 외부 구성성분(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴 핵산 중 하나 이상에 의해 인코딩된 폴리펩티드)을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전 요소 작제물은 CAV VP1 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 유전 요소 작제물은 유전 요소 및 CAV ORF(들)를 시스로 숙주 세포 내로 도입하는 데 적합할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물은 하나 이상의 CAV ORF, 예를 들어 단백질성 외부 구성성분(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드)을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 유전 요소 작제물은 CAV VP1 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않을 수 있다. 이러한 유전 요소 작제물은 (예를 들어, 하나 이상의 CAV ORF를 인코딩하는 제2 유전 요소 작제물의 도입을 통해, 또는 숙주 세포의 게놈에 통합된 CAV ORF 카세트를 통해) 트랜스로 제공되는 하나 이상의 CAV ORF와 함께, 유전 요소를 숙주 세포 내로 도입하는 데 적합할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 CAV VP1 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 유전 요소의 서열을 포함하지 않는 유전 요소의 부분은 (예를 들어, 프로모터 및 CAV VP1 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 카세트에) CAV VP1 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 유전 요소의 서열을 포함하는 작제물의 일부는 CAV VP1 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 단백질성 외부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에 이러한 유전 요소의 봉입은 복제-구성성분 CA벡터(예를 들어, 세포 감염 시, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAV ORF를 인코딩하는, 추가 유전 요소 작제물을 세포 내로 도입하지 않고 세포가 CA벡터의 추가 카피를 생성할 수 있게 하는 CA벡터)를 생성한다.
다른 구현예에서, 유전 요소는 CAV VP1 분자, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 단백질성 외부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에 이러한 유전 요소의 봉입은 복제-부적격 CA벡터(예를 들어, 세포 감염 시, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAV ORF를 인코딩하는, 예를 들어 하나 이상의 추가 작제물의 부재 시, 감염된 세포가 추가 CA벡터를 생성할 수 없게 하는 CA벡터)를 생성한다.
발현 카세트
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 폴리펩티드 또는 비-코딩 RNA(예를 들어, miRNA 또는 siRNA)의 발현을 위한 하나 이상의 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 이펙터(예를 들어, 외인성 또는 내인성 이펙터), 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 비-코딩 RNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 CAV 단백질(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴, 또는 이의 기능적 단편)의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 일부 구현예에서 유전 요소 서열 내에 위치할 수 있다. 구현예에서, 이펙터에 대한 발현 카세트는 유전 요소 서열 내에 위치한다. 구현예에서, CAV 단백질에 대한 발현 카세트는 유전 요소 서열 내에 위치한다. 다른 구현예에서, 발현 카세트는 유전 요소의 서열 외부에 있는 유전 요소 작제물 내의 위치(예를 들어, 백본 내)에 위치한다. 구현예에서, CAV 단백질에 대한 발현 카세트는 유전 요소의 서열 외부에 있는 유전 요소 작제물 내의 위치(예를 들어, 백본)에 위치한다.
폴리펩티드 발현 카세트는 일반적으로 프로모터 및 폴리펩티드, 예를 들어 이펙터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 외인성 또는 내인성 이펙터) 또는 CAV 단백질을 인코딩하는 코딩 서열(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴, 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 서열)을 포함한다. (예를 들어, 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위해) 폴리펩티드 발현 카세트에 포함될 수 있는 예시적인 프로모터는 제한 없이, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 구성적 프로모터(예를 들어, CMV, RSV, PGK, EF1a, 또는 SV40), 세포 또는 조직-특이적 프로모터(예를 들어, 골격 α-액틴 프로모터, 미오신 경쇄 2A 프로모터, 디스트로핀 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 간 알부민 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 오스테오칼신 프로모터, 골 시알로단백질 프로모터, CD2 프로모터, 면역글로불린 중쇄 프로모터, T 세포 수용체 a 쇄 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 또는 신경필라멘트 경쇄 프로모터), 및 유도성 프로모터(예를 들어, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템, 테트라사이클린-억제성 시스템, 테트라사이클린-유도성 시스템, RU486-유도성 시스템, 라파마이신-유도성 시스템)를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 인핸서를 추가로 포함한다.
유전 요소 작제물의 설계 및 생성
유전 요소 작제물을 합성하기 위해 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 유전 요소 작제물 서열은 합성하기에 더 쉬운 더 작은 중첩하는 조각(예를 들어, 약 100 bp 내지 약 10 kb 범위의 세그먼트 또는 개별 ORF)으로 나뉠 수 있다. 이들 DNA 세그먼트는 중첩하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 세트로부터 합성된다. 그 다음 생성되는 중첩 신톤(synthon)은 더 큰 조각의 DNA, 예를 들어, 유전 요소 작제물로 조립된다. 세그먼트 또는 ORF는, 예를 들어 시험관 내 재조합에 의해 또는 5' 및 3' 말단의 특유한 제한 부위에 의해 유전 요소 작제물로 조립되어, 결찰을 가능하게 할 수 있다.
유전 요소 작제물은 작제물 서열을 올리고-길이 단편으로 분석하는 설계 알고리즘으로 합성하여, 서열 공간의 복잡성을 고려하는 합성을 위한 적합한 설계 조건을 생성할 수 있다. 그 다음 올리고는 반도체-기반의 고밀도 칩 상에서 화학적으로 합성되며, 칩마다 200,000개 초과의 개별 올리고가 합성된다. 올리고를 조립 기법, 예컨대 BioFab®으로 조립하여, 더 작은 올리고로부터 더 긴 DNA 세그먼트를 구축한다. 이는 병렬 방식으로 행해지며, 따라서 수백 내지 수천개의 합성 DNA 세그먼트가 한번에 구축된다.
각각의 유전 요소 작제물 또는 유전 요소 작제물의 세그먼트는 검증된 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 또는 DNA의 고-처리량 서열결정은 AnyDot.chips(Genovoxx, 독일)를 사용하여 일어날 수 있으며, 이는 생물학적 과정(예를 들어, miRNA 발현 또는 대립형질 가변성(SNP 검출))의 모니터링을 가능하게 한다. 다른 고-처리량 서열결정 시스템은 문헌[Venter, J., et al. Science 16 Feb. 2001]; 문헌[Adams, M. et al, Science 24 Mar. 2000]; 및 문헌[M. J, Levene, et al. Science 299:682-686, January 2003]; 및 미국 공개 출원 20030044781 및 2006/0078937에 개시된 것을 포함한다. 전체적으로 이러한 시스템은 핵산 분자에서 측정되는 중합 반응을 통해 염기를 일시적으로 첨가함으로써 복수의 염기를 갖는 표적 핵산 분자를 서열결정하는 것을 수반하며, 즉 서열결정될 주형 핵산 분자 상의 핵산 중합 효소의 활성이 실시간으로 추적된다. 일부 구현예에서, 샷건(shotgun) 서열결정이 수행된다.
유전 요소 작제물은 복제 또는 패키징을 위한 인자가 유전 요소에 비하여 시스 또는 트랜스로 공급될 수 있도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 시스로 공급되는 경우, 유전 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 및/또는 패키징 신호는, 예를 들어 증폭 및/또는 캡슐화를 유도하기 위하여 유전 요소 내로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터는 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이러스 ORF는 이펙터로 대체된다.
또 다른 예에서, 복제 또는 패키징 인자가 트랜스로 공급되는 경우, 유전 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자가 결여될 수 있으며; 이 단백질 또는 단백질들은, 예를 들어 또 다른 핵산에 의해 공급될 수 있다. 일부 구현예에서, 최소 시스 신호(예를 들어, 5' UTR, 3' UTR 및/또는 GC-풍부 영역)가 유전 요소 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 복제 또는 패키징 인자(예를 들어, 복제효소 및/또는 캡시드 단백질)를 인코딩하지 않는다. 이러한 인자는 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산(예를 들어, 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 바이러스 핵산, 플라스미드 또는 핵산)에 의해 공급될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 증폭 및/또는 패키징을 유도하기에 충분한 단백질 및/또는 RNA를 발현하지만, 이들 자체의 패키징 신호가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 및 제2 핵산은 (예를 들어, 동시에 또는 개별적으로) 숙주 세포 내로 도입되어, 유전 요소의 증폭 및/또는 패키징을 초래하지만, 제2 핵산의 증폭 및/또는 패키징을 초래하지 않는다.
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 컴퓨터-지원 설계 도구를 사용하여 설계될 수 있다.
핵산 분자, 예컨대 유전 요소 작제물을 제조하는 일반적인 방법은, 예를 들어 문헌[Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)]; 문헌[Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (First Edition), Academic Press (2013)]; 및 문헌[Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (First Edition), Wiley-VCH (2012)]에 기재되어 있다.
회전환 증폭
이론에 구속되고자 하지 않지만, 회전환 증폭은 유전 요소 영역에 대해 5'에(또는 유전 요소 영역의 5' 영역 내에) 위치한 Rep 결합 부위(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 헤어핀 루프 및/또는 복제 원점을 포함하는, 예를 들어 5' UTR을 포함함)에 대한 Rep 단백질 결합을 통해 발생할 수 있다. 그 다음 Rep 단백질은 유전 요소 영역을 통해 진행되어, 유전 요소의 합성을 초래할 수 있다. 그 다음 방출된 유전 요소는 환화된 다음, 단백질성 외부 내에 봉입되어 CA벡터를 형성할 수 있다.
탠덤 작제물
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 탠덤 작제물이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 탠덤 작제물은 일반적으로 제1 유전 요소 영역을 포함하며, 이는 유전 요소 작제물의 나머지 부분에 연결되지 않고/않거나 환형의 단일-가닥 DNA 분자로 전환될 때, 단백질성 외부 내에 봉입되어 CA벡터를 생성할 수 있다. 탠덤 작제물은 제2 유전 요소 영역, 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 탠덤 작제물은, 예를 들어 회전환 증폭에 의해, 단백질성 외부(예를 들어, VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함함)에 봉입하기에 적합한 유전 요소를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부에 봉입하기에 적합한 유전 요소는 제1 유전 요소 영역의 회전환 증폭을 통해 생성된다.
일부 구현예에서, 탠덤 작제물은 유전 요소 서열(예를 들어, 유전 요소 영역)의 제1 카피 및 유전 요소 서열(예를 들어, uRFS 또는 dRFS를 포함함)의 제2 카피의 적어도 일부를 포함하는 유전 요소 작제물이다. 일부 구현예에서, 제2 카피는 유전 요소의 전체 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 카피는 유전 요소의 부분 서열(예를 들어, 유전 요소 서열의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터, 예를 들어 유전 요소 서열의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 카피의 유전 요소 서열 및 제2 카피의 유전 요소 서열은 동일한 유전 요소 서열(예를 들어, 동일한 CAV 서열)이거나, 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 카피의 유전 요소 서열 및 제2 카피의 유전 요소 서열은 상이한 유전 요소 서열(예를 들어, 상이한 CAV 유래의 서열)이거나, 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 서열의 제1 카피 및 유전 요소 서열의 제2 카피는 유전 요소 작제물 상에서 서로 인접하게 위치한다. 다른 구현예에서, 유전 요소 서열의 제1 카피 및 유전 요소 서열의 제2 카피는, 예를 들어 스페이서 영역에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피 또는 이의 일부(예를 들어, uRFS를 포함함)는 유전 요소 서열의 제1 카피에 대해 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 서열의 제2 카피 또는 이의 일부(예를 들어, dRFS를 포함함)는 유전 요소 서열의 제1 카피에 대해 3'에 위치한다.
이펙터
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 서열을 포함하는 CA벡터의 유전 요소를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이펙터는 일부 예에서, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터일 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터는 치료용 이펙터이다. 일부 구현예에서, 이펙터는 폴리펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 치료용 폴리펩티드 또는 펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터는 비-코딩 RNA(예를 들어, miRNA, siRNA, shRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, 또는 gRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 조절 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 이펙터-인코딩 서열은, TATA 박스 상류의 5' 비-코딩 영역, 5' UTR, 폴리-A 신호의 하류, 또는 GC-풍부 영역 상류의 3' 비-코딩 영역에서, 예를 들어 비-코딩 영역, 예를 들어 오픈-리딩 프레임의 3' 및 유전 요소의 GC-풍부 영역의 5'에 배치된 비-코딩 영역에서, 유전 요소에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터-인코딩 서열은, 예를 들어 코딩 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴을 인코딩하는 서열)에서, 유전 요소에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터-인코딩 서열은 오픈 리딩 프레임의 전부 또는 일부를 대체한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 이펙터-인코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서)을 포함한다.
일부 구현예에서, 이펙터를 포함하는 유전 요소는, 예를 들어 상부에 배치된 유전 요소 서열의 회전환 복제에 의해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물(예를 들어, 탠덤 작제물)로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 이펙터-코딩 서열의 정확히 하나의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 이펙터-인코딩 서열의 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상)의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 이펙터-인코딩 서열의 하나의 전장 카피 및 이펙터-인코딩 서열의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 그 이상)의 부분 카피(예를 들어, 이펙터-인코딩 서열의 5' 절단 또는 3' 절단을 포함하는 부분 카피)를 포함한다.
숙주 세포
본 명세서에 기재된 CA벡터는, 예를 들어 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 일반적으로, CA벡터 유전 요소 및 CA벡터 단백질성 외부(예를 들어, CAV VP1 핵산 또는 CAV VP1 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드)의 구성성분을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 그 다음 숙주 세포는 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 배양 조건) 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CA벡터를 숙주 세포로부터, 예를 들어 주변 상청액으로 방출하기에 적합한 조건 하에서 추가로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 세포 용해물로부터 CA벡터의 수확을 위해 용해된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 높은 세포 밀도로 성장한 숙주 세포주에 도입될 수 있다.
숙주 세포 내로의 유전 요소의 도입
유전 요소, 또는 유전 요소 작제물은 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소 자체가 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 서열을 포함하는 유전 요소 작제물이 숙주 세포 내로 도입된다. 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은, 예를 들어 당업계에 알려진 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 형질감염(예를 들어, 안정한 형질감염 또는 일시적 형질감염)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 lipofectamine 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 칼슘 포스페이트 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 전기천공에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 유전자 총을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 뉴클레오펙션에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 PEI 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 숙주 세포를 유전 요소 또는 유전 요소 작제물을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 숙주 세포를 유전 요소를 포함하는 CA벡터와 접촉시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다.
구현예에서, 유전 요소 작제물은 일단 숙주 세포 내로 도입되면 복제할 수 있다. 구현예에서, 유전 요소는 일단 숙주 세포 내로 도입되면 유전 요소 작제물로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소는, 예를 들어 주형으로서 유전 요소 작제물을 사용하여, 중합효소에 의해 숙주 세포에서 생성된다.
일부 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 벡터는 CA벡터의 발현을 달성하기 위해 바이러스 중합효소 단백질을 발현하는 세포주 내로 도입(예를 들어, 형질감염)된다. 이를 위해, CA벡터 중합효소 단백질을 발현하는 세포주가 적절한 숙주 세포로 이용될 수 있다. 숙주 세포는 다른 바이러스 기능 또는 추가 기능을 제공하도록 유사하게 엔지니어링될 수 있다.
본 명세서에 개시된 CA벡터를 제조하기 위해, 유전 요소 작제물이 복제 및 생성에 필요한 CA벡터 단백질 및 기능을 제공하는 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 본 명세서에 개시된 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 벡터에 의한 형질감염 전, 도중 또는 후에 CA벡터 단백질 및 기능을 제공하는 제2 작제물(예를 들어, 바이러스)로 형질감염될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 작제물은 불완전한 바이러스 입자의 생성을 보완하는 데 유용할 수 있다. 제2 작제물(예를 들어, 바이러스)은 숙주 범위 제한 또는 온도 민감성과 같은 조건부 성장 결함을 가질 수 있으며, 이는 예를 들어 형질감염 바이러스의 후속 선택을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 제2 작제물은 CA벡터의 발현을 달성하기 위해 숙주 세포에 의해 이용되는 하나 이상의 복제 단백질을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 복제 단백질과 같은 바이러스 단백질을 인코딩하는 벡터로 형질감염될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 작제물은 항바이러스 민감성을 포함한다.
본 명세서에 개시된 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 벡터는 일부 예에서 당업계에 알려진 기법을 사용하여 CA벡터로 복제 및 생성될 수 있다. 예를 들어, 다양한 바이러스 배양 방법이, 예를 들어 미국 특허 4,650,764; 미국 특허 5,166,057; 미국 특허 5,854,037; 유럽 특허 공개 EP 0702085A1; 미국 특허 출원 일련번호 09/152,845; 국제 특허 공개 PCT WO97/12032; WO96/34625; 유럽 특허 공개 EP-A780475; WO 99/02657; WO 98/53078; WO 98/02530; WO 99/15672; WO 98/13501; WO 97/06270; 및 EPO 780 47SA1에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
시스 또는 트랜스로 CAV 단백질(들)을 제공하는 방법
일부 구현예(예를 들어, 본 명세서에 기재된 시스 구현예)에서, 유전 요소 작제물은 CAV ORF(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴, 또는 이의 기능적 단편)에 대한 코딩 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함한다. 구현예에서, 유전 요소 작제물은 CAV VP1, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 이펙터뿐만 아니라 하나 이상의 CAV ORF에 대한 발현 카세트를 포함하는 이러한 유전 요소 작제물은, 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 유전 요소 작제물을 포함하는 숙주 세포는, 일부 예에서, 추가의 유전 요소 작제물 또는 발현 카세트의 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 요구하지 않으면서, 단백질성 외부에 대한, 그리고 단백질성 외부 내의 유전 요소의 봉입을 위한 유전 요소 및 구성성분을 생성할 수 있다. 다시 말하면, 이러한 유전 요소 작제물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 숙주 세포에서 시스 CA벡터 생성 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예(예를 들어, 본 명세서에 기재된 트랜스 구현예)에서, 유전 요소는 하나 이상의 CAV ORF(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴, 또는 이의 기능적 단편)에 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않는다. 구현예에서, 유전 요소 작제물은 CAV VP1, 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하지 않는다. 이펙터에 대한 발현 카세트를 포함하지만 하나 이상의 CAV ORF(예를 들어, CAV VP1 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편)에 대한 발현 카세트가 결여된 이러한 유전 요소 작제물은 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 유전 요소 작제물을 포함하는 숙주 세포는, 일부 예에서, CA벡터의 하나 이상의 구성성분(예를 들어, 단백질성 외부 단백질)의 생성을 위해 추가의 유전 요소 작제물 또는 발현 카세트의 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 유전 요소 작제물을 포함하는 숙주 세포는 CAV VP1 분자를 인코딩하는 추가의 핵 작제물의 부재시 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입할 수 없다. 다시 말하면, 이러한 유전 요소 작제물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 숙주 세포에서 트랜스 CA벡터 생성 방법에 사용될 수 있다.
헬퍼
일부 구현예에서, 헬퍼 작제물은 숙주 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물 또는 유전 요소를 포함하는 숙주 세포) 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 작제물은 유전 요소 작제물의 도입 이전에 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 작제물은 유전 요소 작제물의 도입과 동시에 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 작제물은 유전 요소 작제물의 도입 후에 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 작제물은 헬퍼 작제물을 포함하는 헬퍼 바이러스를 통해 숙주 세포 내로 도입된다.
예시적인 세포 유형
CA벡터의 생성에 적합한 예시적인 숙주 세포는 제한 없이, 진핵 세포(예를 들어, 조류 세포, 포유동물 세포, 및 곤충 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 인간 세포 또는 세포주이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 조류 세포 또는 세포주(예를 들어, 닭 세포 또는 세포주, 예를 들어 MDCC-MSB1 세포; 또는 오리 세포 또는 세포주, 예를 들어 EB66 세포 또는 AGE.CR 세포)이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포 또는 세포주, 예를 들어 T 세포 또는 세포주, 암 세포주, 간 세포 또는 세포주, 뉴런, 신경아교세포, 피부 세포, 상피 세포, 중간엽 세포, 혈액 세포, 내피 세포, 눈 세포, 위장 세포, 전구 세포, 전구체 세포, 줄기 세포, 폐 세포, 심장 세포, 또는 근육 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 동물 세포(예를 들어, 마우스 세포, 래트 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 또는 곤충 세포)이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 림프계 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포 또는 무한증식 T 세포이다. 구현예에서, 숙주 세포는 Jurkat 세포이다. 구현예에서, 숙주 세포는 MOLT-4 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 B 세포 또는 무한증식 B 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Raji 세포이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 유전 요소 작제물, 예를 들어 탠덤 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함한다.
구현예에서, 숙주 세포는 Raji 세포, EKVX 세포, MRC5 세포, 또는 MCF7 세포이다. 구현예에서, 숙주 세포는 HEK293T 세포, HEK293F 세포, A549 세포, Jurkat 세포, Chang 세포, HeLa 세포 Phoenix 세포, MRC-5 세포, NCI-H292 세포 또는 Wi38 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 비-인간 영장류 세포(예를 들어, Vero 세포, CV-1 세포, 또는 LLCMK2 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 뮤린 세포(예를 들어, McCoy 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 햄스터 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 BHK 21 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 MARC-145, MDBK, RK-13, 또는 EEL 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 상피 세포(예를 들어, 상피 계통의 세포주)이다.
일부 구현예에서, CA벡터는 연속 동물 세포주(예를 들어, 연속 증식될 수 있는 무한증식 세포주)에서 배양된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 세포주는 돼지 세포주를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 고려되는 세포주는 돼지 신장 상피 세포주 PK-15 및 SK, 단골수성 세포주 3D4/31 및 고환 세포주 ST와 같은 무한증식 돼지 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
배양 조건
단백질성 외부의 유전 요소 및 구성성분을 포함하는 숙주 세포는 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션되어, CA벡터를 생성할 수 있다. 적합한 배양 조건은 기재된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 액체 배지(예를 들어, RPMI(예를 들어, FBS, 예를 들어 10% FBS로 보충됨), EX-CELL EBx GRO-I 무혈청 배지(예를 들어, l-글루타민으로 보충됨), HyClone CDM4Avian 배지(예를 들어, l-글루타민으로 보충됨), Optipro SFM, Grace's Supplemented(TNM-FH), IPL-41, TC-100, Schneider's Drosophila, SF-900 II SFM, 또는 EXPRESS-FIVE™ SFM)에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 부착 배양에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 현탁 배양에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 튜브, 병, 마이크로캐리어 또는 플라스크에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 접시 또는 웰(예를 들어, 플레이트 상의 웰)에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 증식에 적합한 조건 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 숙주 세포가 그 내에서 생성된 CA벡터를 주변 상청액으로 방출하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션된다.
본 발명에 따른 CA벡터-함유 세포 배양물의 생성은 상이한 규모(예를 들어, 플라스크, 롤러 보틀(roller bottle) 또는 생물반응기)에서 수행될 수 있다. 감염될 세포의 배양을 위해 사용되는 배지는 세포 생존에 필요한 표준 영양물질을 포함하지만, 또한 세포 유형에 따라 추가의 영양물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 배지는 단백질-무함유 및/또는 혈청-무함유일 수 있다. 세포 유형에 따라, 세포는 현탁액 중에서 또는 기질 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 성장을 위하여, 그리고 CA벡터의 생성을 위하여 상이한 배지가 사용된다.
수확 및 정제
숙주 세포에 의해 생성된 CA벡터는, 예를 들어 당업계에 알려진 방법에 따라 수확될 수 있다. 예를 들어, 배양 중인 숙주 세포에 의해 주변 상청액으로 방출된 CA벡터는 상청액으로부터 수확될 수 있다. 일부 구현예에서, 상청액은 CA벡터를 얻기 위해 숙주 세포로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 수확 전 또는 수확 동안 용해된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 숙주 세포 용해물로부터 수확된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 숙주 세포 용해물 및 상청액 둘 다로부터 수확된다. 일부 구현예에서, CA벡터의 정제 및 단리는, 예를 들어 문헌[Rinaldi, et al., DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 3rd ed. 2014, Humana Press](본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 바이러스 생성에서 알려진 방법에 따라 수행된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 생물물리학적 특성, 예를 들어 크기, 밀도, 전하에 기반한 용질의 분리에 의해 수확되고/되거나 정제될 수 있다. 일 구현예에서, CA벡터는 밀도 구배 원심분리 및/또는 초원심분리, 예를 들어 수크로스 밀도 구배 원심분리 또는 염화세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 세포 또는 세포 배양물로부터 정제된다. 예를 들어, CA벡터 제제는 (a) 선택적으로 숙주 세포 배양물로부터 숙주 세포를 용해시키고, (b) 선택적으로 숙주 세포 배양물로부터 세포 파편을 제거하여 세포 배양물의 가용성 분획을 생성하고, (c) 가용성 분획에 대해 밀도 구배 원심분리 및/또는 초원심분리를 수행하고, (d) 밀도 구배로부터 농축된 CA벡터 제제를 수집함으로써 농축 또는 정제된다. 다른 단계, 예컨대 수크로스 쿠션 원심분리/초원심분리, 이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 접선 유동 여과가 약제학적 부형제와 함께 제형화하기 전에 수행될 수 있다.
수확된 CA벡터는, 예를 들어 CA벡터 제제를 생성하기 위해, 정제되고/되거나 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 수확된 CA벡터는, 예를 들어 바이러스 입자를 정제하기 위해 당업계에 알려진 방법(예를 들어, 침강, 크로마토그래피 및/또는 한외여과에 의한 정제)을 사용하여, 수확 용액에 존재하는 다른 구성요소 또는 오염물로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 제제로부터 혈청, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 유전 요소가 결여된 입자, 및/또는 페놀 레드 중 하나 이상을 제거하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 수확된 CA벡터는, 예를 들어 바이러스 입자를 농축시키기 위해 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 수확 용액에 존재하는 다른 구성요소 또는 오염물에 비해 농축된다.
일부 구현예에서, 생성된 제제 또는 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 허용 가능한 기간 및 온도에 걸쳐 안정할 것이고/이거나, 요망되는 투여 경로 및/또는 투여 경로가 필요로 할 임의의 디바이스, 예를 들어 니들 또는 주사기와 병용 가능할 것이다.
II. CA벡터
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 발명은 CA벡터, CA벡터 제제, 및 치료용 조성물을 사용하고 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물을 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV), 또는 이의 단편 또는 부분, 또는 다른 실질적으로 비-병원성인 바이러스, 예를 들어 상리공생 바이러스(symbiotic virus), 편리공생 바이러스(commensal virus), 고유 바이러스에 기반한 서열, 구조 및/또는 기능을 포함하는 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, CAV-기반 CA벡터는 해당 CAV에 대하여 외인성인 적어도 하나의 요소, 예를 들어 외인성 이펙터 또는 CA벡터의 유전 요소 내에 배치된 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAV-기반 CA벡터는 해당 CAV 유래의 또 다른 요소에 대하여 이종인 적어도 하나의 요소, 예를 들어 프로모터 요소와 같은 또 다른 연결된 핵산 서열에 대하여 이종인 이펙터-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소의 나머지 및/또는 단백질성 외부에 비하여 이종인 적어도 하나의 요소(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 이펙터를 인코딩하는 외인성 요소)를 포함하는 유전 요소(예를 들어, 환형 DNA, 예를 들어 단일 가닥 DNA)를 포함한다. CA벡터는 숙주, 예를 들어, 인간 내로의 페이로드를 위한 운반 비히클(예를 들어, 실질적으로 비-병원성 운반 비히클)일 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포에서 복제할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서 실질적으로 비-병원성 및/또는 실질적으로 비-통합성이다. 일부 구현예에서, CA벡터는 복제-결핍이다. 일부 구현예에서, CA벡터는 복제-적격이다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어 페이로드)를 인코딩하는 서열, 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 단일-가닥 DNA이며, 하기의 특성 중 하나 또는 둘 다를 갖는 유전 요소: 환형이고/이거나 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 진핵 세포의 게놈 내로 통합됨; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 CA벡터를 포함하며; 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되고; CA벡터는 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 서열은, 예를 들어 유전 요소를 CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부에 패키징하는 것을 허용하기에 적합한 패키징 신호를 포함한다. 구현예에서, 단백질 결합 서열(예를 들어, 패키징 서열)은 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 역상보체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 CA벡터의 일부 구현예에서, 유전 요소는 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 복수의 CA벡터로부터 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 미만의 유전 요소는 대상체 내의 하나 이상의 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터의 집단의 유전 요소는 비슷한 AAV 바이러스의 집단의 것보다 더 낮은 빈도로, 예를 들어 비슷한 AAV 바이러스의 집단보다 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상 더 낮은 빈도로 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어 페이로드)를 인코딩하는 서열, 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 야생형 CAV 서열, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 야생형 CAV 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 유전 요소; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 CA벡터를 포함하며; 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되고; CA벡터는 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은
a) (i) 외부 단백질(예를 들어, 비-병원성 외부 단백질)을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및
b) 유전 요소와 회합된, 예를 들어 이를 둘러싸거나, 캡시드화되거나, 봉입하는 단백질성 외부를 포함하는 CA벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 비-외피, 환형, 단일-가닥 DNA 바이러스로부터의(또는 이와 70% 초과, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%의 상동성을 갖는) 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 동물 환형 단일-가닥 DNA 바이러스는 일반적으로 진핵 비-식물 숙주를 감염시키고, 환형 게놈을 갖는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스의 하위군을 지칭한다. 따라서, 동물 환형 ssDNA 바이러스는 원핵생물을 감염시키는 ssDNA 바이러스(즉, 마이크로바이러스과(Microviridae) 및 이노바이러스과(Inoviridae)) 및 식물을 감염시키는 ssDNA 바이러스(즉, 제미니바이러스과(Geminiviridae) 및 나노바이러스과(Nanoviridae))와 구별 가능하다. 동물 환형 ssDNA 바이러스는 또한 비-식물 진핵생물을 감염시키는 선형 ssDNA 바이러스(즉, 파보바이러스과(Parvoviridiae))와 구별 가능하다.
일부 구현예에서, CA벡터는 숙주 세포 기능을, 예를 들어 일시적으로 또는 장기간 조절한다. 특정 구현예에서, 세포 기능은 안정하게 변경되며, 예컨대 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 더 긴 시간 동안 또는 이들 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 특정 구현예에서, 세포 기능은 일시적으로 변경되며, 예를 들어, 예컨대 조절은 약 30분 이하 내지 약 7일 또는 약 1시간 이하, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 프로모터 요소를 포함한다. 구현예에서, 프로모터 요소는 RNA 중합효소 II-의존성 프로모터, RNA 중합효소 III-의존성 프로모터, PGK 프로모터, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, SV40 프로모터, CAGG 프로모터, 또는 UBC 프로모터, TTV 바이러스 프로모터, 조직 특이적, U6(pollIII), 활성화 단백질(TetR-VP16, Gal4-VP16, dCas9-VP16 등)에 대한 상류 DNA 결합 부위가 있는 최소 CMV 프로모터로부터 선택된다. 구현예에서, 프로모터 요소는 TATA 박스를 포함한다. 구현예에서, 프로모터 요소는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 야생형 CAV에 대하여 내인성이다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 하기의 특성 중 하나 이상을 포함한다: 단일-가닥, 환형, 음성 가닥, 및/또는 DNA. 구현예에서, 유전 요소는 에피솜을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터를 배제한 유전 요소의 일부는 약 1 내지 5 kb(예를 들어, 약 2.8 내지 4kb, 약 2.8 내지 3.2kb, 약 3.6 내지 3.9kb, 또는 약 2.8 내지 2.9kb), 약 5kb 미만(예를 들어, 약 2.9 kb, 3.2 kb, 3.6 kb, 3.9 kb 또는 4 kb 미만), 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 1 kb)의 조합된 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 이펙터를 배제한 유전 요소의 일부는 약 0.5 내지 1 kb, 1 내지 1.5 kb, 1.5 내지 2 kb, 2 내지 2.5 kb, 2.5 내지 3 kb, 또는 3 내지 3.5 kb의 조합된 크기를 갖는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터, CA벡터를 포함하는 조성물, 이러한 CA벡터의 사용 방법 등은 일부 예에서 부분적으로, 상이한 이펙터, 예를 들어 (예를 들어, IFN 또는 miR-625에 대한) miRNA, shRNA 등 및 단백질 결합 서열, 예를 들어 캡시드 단백질, 예컨대 Q99153에 결합하는 DNA 서열을 단백질성 외부, 예를 들어 문헌[Arch Virol (2007) 152: 1961-1975]에 개시된 캡시드와 조합하여, 이어서 이펙터를 세포(예를 들어, 동물 세포, 예를 들어 인간 세포 또는 비-인간 동물 세포, 예컨대 돼지 또는 마우스 세포)로 운반하는 데 사용될 수 있는 CA벡터를 생성하는 방법을 예시하는 실시예에 기초한다. 구현예에서, 이펙터는 인터페론과 같은 인자의 발현을 침묵화시킬 수 있다. 실시예에는 이펙터를, 예를 들어 CAV로부터 유래된 서열 내로 삽입함으로써 CA벡터가 제조될 수 있는 방법이 추가로 기재된다. 이들 실시예에 기초하여 이하의 설명은 실시예에서 고려되는 특정 발견 및 조합의 다양한 변형을 고려한다. 예를 들어, 당업자는 특정 miRNA가 단지 이펙터의 예로서 사용되며, 다른 이펙터가, 예를 들어 다른 조절 핵산 또는 치료용 펩티드일 수 있음을 실시예로부터 이해할 것이다. 유사하게, 실시예에 사용되는 특정 캡시드는 하기 기재되는 실질적으로 비-병원성인 단백질에 의해 대체될 수 있다. 실시예에 기재된 특정 CAV 서열은 또한 하기 기재되는 CAV 서열에 의해 대체될 수 있다. 이들 고려사항은 단백질 결합 서열, 조절 서열, 예컨대 프로모터 등에 유사하게 적용된다. 이와 독립적으로, 당업자는 특히 실시예와 밀접하게 관련이 있는 구현예를 고려할 것이다.
일부 구현예에서, CA벡터, 또는 CA벡터에 포함되는 유전 요소는 세포(예를 들어, 인간 세포) 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 일단 CA벡터 또는 유전 요소가 세포 내로 도입되면, 예를 들어 CA벡터의 유전 요소에 의해 인코딩된 이펙터(예를 들어, RNA, 예를 들어 miRNA)는 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 발현된다. 구현예에서, 세포 내로의 CA벡터 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은, 예를 들어 세포에 의한 표적 분자의 발현 수준을 변경시킴으로써 세포에서 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산, 예를 들어 RNA 또는 표적 폴리펩티드)의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 구현예에서, CA벡터, 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포에 의해 생성되는 인터페론의 수준을 감소시킨다. 구현예에서, 세포 내로의 CA벡터, 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포의 기능을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 구현예에서, 세포 내로의 CA벡터, 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포의 생존력을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 구현예에서, 세포 내로의 CA벡터, 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포(예를 들어, 암 세포)의 생존력을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터(예를 들어, 합성 CA벡터)는 70% 미만의 항체 출현율(예를 들어, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 항체 출현율)을 유도한다. 구현예에서, 항체 출현율은 당업계에 알려진 방법에 따라 결정된다. 구현예에서, 항체 출현율은, 예를 들어 문헌[Tsuda et al., 1999; J. Virol. Methods 77: 199-206](본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV 항체 검출 방법 및/또는 문헌[Kakkola et al., 2008; Virology 382: 182-189](본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV IgG 혈청학적 출현율의 결정 방법에 따라 생물학적 샘플에서 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 또는 그에 기반한 CA벡터에 대한 항체를 검출함으로써 결정된다. CAV 또는 그에 기반한 CA벡터에 대한 항체는 또한 항-바이러스 항체를 검출하기 위한 당업계의 방법, 예를 들어 문헌[Calcedo et al., 2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7](본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은, 예를 들어 항-AAV 항체의 검출 방법에 의해 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 복제 결핍, 복제 결함, 또는 복제 비적격 유전 요소는 유전 요소의 복제에 필요한 필수 기구 또는 구성성분의 전부를 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 복제 결함 유전 요소는 복제 인자를 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 복제 결함 유전 요소는 하나 이상의 ORF(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)를 인코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전 요소에 의해 인코딩되지 않는 기구 또는 구성성분은 (예를 들어, 바이러스 또는 플라스미드를 사용하여, 또는 숙주 세포 및/또는 주변 배지에 의해 또한 포함되는, 예를 들어 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 핵산에 인코딩되어) 트랜스로 제공되어, 예를 들어 복제 결핍, 복제 결함, 또는 복제 부적격 유전 요소가, 트랜스로 제공되는 기구 또는 구성성분의 존재 하에 복제를 겪을 수 있게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 결핍, 패키징 결함, 또는 패키징 부적격 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 또는 이의 일부를 포함함)에 패키징될 수 없다. 일부 구현예에서, 패키징 결핍 유전 요소는 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)와 비교하여 10% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만)의 효율로 단백질성 외부에 패키징된다. 일부 구현예에서, 패키징 결함 유전 요소는 심지어 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)의 존재 하에서도 단백질성 외부에 패키징될 수 없다. 일부 구현예에서, 패키징 결핍 유전 요소는 심지어 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)의 존재 하에서도, 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)와 비교하여 10% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만)의 효율로 단백질성 외부에 패키징된다.
일부 구현예에서, 패키징 적격 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 또는 이의 일부를 포함함)에 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 적격 유전 요소는 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)와 비교하여 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상)의 효율로 단백질성 외부에 패키징된다. 일부 구현예에서, 패키징 적격 유전 요소는 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)의 존재 하에서 단백질성 외부에 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 적격 유전 요소는 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)의 존재 하에서, 야생형 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)와 비교하여 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 그 이상)의 효율로 단백질성 외부에 패키징된다.
닭 빈혈 바이러스(CAV)
일부 구현예에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터는 야생형 닭 빈혈 바이러스(CAV)로부터 유래되거나 이와 유사한 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 야생형 CAV에 비해 외인성인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 야생형 CAV에 비해 내인성인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 CA벡터에서 하나 이상의 기타 서열 또는 발현 생성물에 비해 이종인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. CAV는 일반적으로 음의 극성을 갖는 단일-가닥 환형 DNA 게놈을 갖는다. CAV는 일반적으로 임의의 인간 질환과 연관된 바 없으며, 인간 세포를 감염시키는 것으로 생각되지 않는다(예를 들어, 문헌[Shulman and Davidson 2017, Ann. Rev. Virol. 4: 159-180]; 및 [Fatoba and Adeleke 2019, Acta Virologica 63: 19-25] 참조; 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로 포함됨).
일부 구현예에서, 유전 요소는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나, 예를 들어 CAV 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV 핵산 서열, 또는 이의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV의 5' UTR, 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2 유전자, 아폽틴 유전자, VP1, 3' UTR, GC-풍부 영역, 폴리A 신호 서열 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 CAV 중 임의의 것의 캡시드 단백질, 예를 들어 VP1, VP2, 및/또는 아폽틴 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 CAV VP1 단백질(또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편) 또는 CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 반복 영역 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 CAAT 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 TATA 박스 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 GC-풍부 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A의 폴리A 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 6에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 995 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 7 내지 994, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 2의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 206에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1195 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 207 내지 1194, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 3의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 406에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1395 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 407 내지 1394, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 4의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 606에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1595 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 607 내지 1594, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 5의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 806에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1795 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 807 내지 1794, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 6의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 1006에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1995 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1007 내지 1994, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 7의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 1206에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 2195 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1207 내지 2194, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 8의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 1271에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1272 내지 2319, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 987개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 nLuc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 9의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 546에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 2133 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 547 내지 2134, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 950 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 또는 1500 내지 1587개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 iCRE 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 10의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 606에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1798 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 607 내지 1797, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 950 내지 1000, 1000 내지 1100, 또는 1100 내지 1190개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 GFP 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 11의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 606에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 2015 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 607 내지 2014, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 950 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 또는 1500 내지 1587개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 Gluc 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 12의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 전체 핵산 서열, 또는 거기의 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1100, 1100 내지 1200, 1200 내지 1300, 1300 내지 1400, 1400 내지 1500, 1500 내지 1600, 1600 내지 1700, 1700 내지 1800, 1800 내지 1900, 1900 내지 2000, 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 또는 2300 내지 2319개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1 내지 606에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 1790 내지 2319에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B의 전체 핵산 서열 중 뉴클레오티드 607 내지 1789, 또는 거기의 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 950, 950 내지 1000, 1000 내지 1100, 또는 1100 내지 1190개 뉴클레오티드의 인접 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 mCherry 삽입 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 VP2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 VP1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 VP2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 아폽틴 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 VP1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 표 13의 3' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 서열에 열거되거나 상기 서열에 의해 인코딩된 바와 같은, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나, 예를 들어 CAV 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV 서열, 또는 이의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 서열, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 서열, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터는, 본 명세서에 기재된 CAV 중 임의의 것의 5' UTR, 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2 유전자, 아폽틴 유전자, VP1, 3' UTR, GC-풍부 영역, 폴리A 신호 서열 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 CAV 중 임의의 것의 캡시드 단백질(예를 들어, VP1 분자), VP2 분자, 및/또는 아폽틴 분자를 인코딩하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산 분자는 CAV VP1 분자(예를 들어, 표 1 내지 17 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 VP1 아미노산 서열, 또는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 핵산 서열에 의해 인코딩된 VP1 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP2 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 아폽틴 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP2 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 아폽틴 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전 요소를 포함한다.
[표 1A] 예시적인 닭 빈혈 바이러스(CAV) 핵산 서열
[표 1B] 대안의 예시적 닭 빈혈 바이러스(CAV) 핵산 서열
[표 2] CAV-nLuc1 핵산 서열
[표 3] CAV-nLuc2 핵산 서열
[표 4] CAV-nLuc3 핵산 서열
[표 5] CAV-nLuc4 핵산 서열
[표 6] CAV-nLuc5 핵산 서열
[표 7] CAV-nLuc6 핵산 서열
[표 8] CAV-nLuc7 핵산 서열
[표 9] CAV-nLuc8 핵산 서열
[표 10] CRE-CA벡터 핵산 서열
[표 11] GFP-CA벡터 핵산 서열
[표 12] Gluc-CA벡터 핵산 서열
[표 13] mCherry-CA벡터 핵산 서열
구현예에서, 키메라 CA벡터는 복수의 상이한 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 서열을 포함하는 복수의 폴리펩티드(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)를 포함한다. 예를 들어, 키메라 CA벡터는 하나의 CAV 유래의 VP1 분자(예를 들어, VP1 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VP1 분자) 및 상이한 CAV 유래이거나 이와 유사성을 갖는 VP2 분자를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 키메라 CA벡터는 하나의 CAV 유래이거나 이와 유사한 제1 VP1 분자 및 상이한 CAV 유래이거나 이와 유사한 제2 VP1 분자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CA벡터는, 예를 들어 하나의 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 적어도 하나의 부분 및 상이한 CAV 유래의 적어도 하나의 부분(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함하는, 키메라 폴리펩티드(예를 들어, CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)를 포함한다. 구현예에서, CA벡터는 하나의 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 VP1, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VP1 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 VP1 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VP1 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 VP1 분자를 포함한다. 구현예에서, 키메라 VP1 분자는 하나의 CAV 유래의 VP1 젤리-롤 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 CAV 유래의 VP1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 키메라 VP1 분자는 하나의 CAV 유래의 VP1 아르기닌-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 CAV 유래의 VP1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, CA벡터는 하나의 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 VP2, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VP2 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 VP2 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VP2 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 VP2 분자를 포함한다. 구현예에서, CA벡터는 하나의 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 아폽틴, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아폽틴 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 CAV(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 유래의 아폽틴 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아폽틴 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 아폽틴 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 탠덤 작제물을 사용하여 생성될 수 있다. CAV 탠덤 작제물 서열의 비-제한적인 예는 하기 표 14 내지 16에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유전 요소 작제물(예를 들어, 탠덤 작제물)은 표 14 내지 16 중 임의의 것에 열거된 CAV 유전 요소 서열 유래의 5' UTR, 반복 영역, CAAR 신호, TATA 박스, VP2-인코딩 서열, 아폽틴-인코딩 서열, VP1-인코딩 서열, 3' UTR, GC-풍부 영역, 또는 폴리A 신호 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유전 요소 작제물(예를 들어, 탠덤 작제물)은 표 14 내지 16 중 임의의 것에 열거된 CAV 유전 요소 서열 유래의 VP1 단편(예를 들어, 시작이 없는 VP1 단편), VP2 단편(예를 들어, 시작이 없는 VP2 단편), 및/또는 아폽틴 단편(예를 들어, 시작이 없는 아폽틴 단편) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유전 요소 작제물(예를 들어, 탠덤 작제물)은 표 14 내지 16 중 임의의 것에 열거된 탠덤 작제물 서열 유래의 프로모터(예를 들어, SV40 프로모터), SV40 폴리A 서열, 헤어핀 영역, 복제 원점(예를 들어, pUC 원점), 또는 내성 유전자(예를 들어, AmpR 유전자) 중 하나 이상을 포함한다.
[표 14] 예시적인 CAV 탠덤 플라스미드 pCAV-nLuc6_CAV
[표 15] 예시적인 CAV 탠덤 플라스미드 pCAV-nLuc6_CAVΔ3NCR
[표 16] 예시적인 CAV 탠덤 플라스미드 pCAV-nLuc6_CAVΔPromΔORFΔ3NCR
본 명세서에 포함된 서열 또는 하위서열이 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 CA벡터를 생성하기 위한 유전 요소 작제물의 일부로서, 또는 탠덤 작제물의 유전 요소 서열로서, CA벡터의 유전 요소를 형성하기 위해) 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 이용될 수 있는 추가의 예시적인 CAV 게놈 서열은 하기 표 17에 열거되어 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열 유래의 5' UTR, 반복 영역, CAAT 신호, TATA 박스, VP2-인코딩 서열, 아폽틴-인코딩 서열, VP1-인코딩 서열, 3' UTR, GC-풍부 영역, 또는 폴리A 신호 서열 중 하나 이상(예를 들어, 이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개), 또는 이에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP2 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 아폽틴 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 VP2 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 표 17에 열거된 CAV 게놈 서열에 의해 인코딩된 아폽틴 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전 요소를 포함한다.
[표 17] 예시적인 야생형 CAV 단리물의 목록
VP1 분자
일부 구현예에서, CA벡터는 CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부를 포함한다. 일반적으로, VP1 분자는 CAV VP1 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 단백질)의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 CAV VP1 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 단백질)에 비해 절단을 포함한다. VP1 분자는 다른 VP1 분자에 결합하여, 예를 들어 단백질성 외부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), 예를 들어 캡시드를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 핵산 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 봉입할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 VP1 분자는, 예를 들어 단백질성 외부를 형성하기 위해, 다량체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체는 동종다량체일 수 있다. 다른 구현예에서, 다량체는 이종다량체일 수 있다.
VP1 분자는 일부 구현예에서, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 아르기닌-풍부 영역, 예를 들어 적어도 60%의 염기성 잔기(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 염기성 잔기; 예를 들어, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90% 또는 70 내지 80%의 염기성 잔기)를 갖는 영역, 및 젤리-롤 도메인.
아르기닌-풍부 영역
아르기닌 풍부 영역은 본 명세서에 기재된 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖거나, 적어도 60%, 70% 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 이의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개 아미노산의 서열을 갖는다.
젤리 롤 도메인
젤리-롤 도메인 또는 영역은 하기의 특성 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 더 큰 폴리펩티드에 포함된 도메인 또는 영역)를 포함한다(예를 들어, 이로 이루어진다):
(i) 젤리-롤 도메인의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 그 이상)의 아미노산이 하나 이상의 β-시트의 부분임;
(ii) 젤리-롤 도메인의 2차 구조는 적어도 4개(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함함; 및/또는
(iii) 젤리-롤 도메인의 3차 구조는 적어도 2개(예를 들어, 적어도 2, 3 또는 4개)의 β-시트를 포함함; 및/또는
(iv) 젤리-롤 도메인은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함함.
특정 구현예에서, 젤리-롤 도메인은 2개의 β-시트를 포함한다.
특정 구현예에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 β-시트는 약 8개(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 β-시트는 8개의 β-가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 β-시트는 7개의 β-가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 β-시트는 6개의 β-가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 β-시트는 5개의 β-가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 β-시트는 4개의 β-가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, 젤리-롤 도메인은 제2 β-시트에 대한 역평행 배향의 제1 β-시트를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 β-시트는 약 4개(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)의 β-가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 β-시트는 약 4개(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)의 β-가닥을 포함한다. 구현예에서, 제1 및 제2 β-시트는 총 약 8개(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함한다.
특정 구현예에서, 젤리-롤 도메인은 캡시드 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 VP1 분자)의 구성성분이다. 특정 구현예에서, 젤리-롤 도메인은 자가-조립 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 젤리-롤 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 젤리-롤 도메인을 포함하는 또 다른 카피의 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 젤리-롤 도메인은 제2 카피의 폴리펩티드의 젤리-롤 도메인에 결합한다.
예시적인 VP1 서열
예시적인 CAV VP1 아미노산 서열, 및 예시적인 VP1 도메인의 서열은 제한 없이 표 1 내지 17에 열거된 VP1 핵산 서열에 의해 인코딩된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, VP1 분자)는, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAV VP1 분자, 또는 이의 기능적 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터는, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAV VP1 분자의 아르기닌-풍부 영역에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VP1 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터는, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAV VP1 분자의 젤리 롤 도메인에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VP1 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터는, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAV VP1 분자, 또는 이의 기능적 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VP1 분자를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 유전 요소)를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 CAV VP1 하위서열은 아르기닌(Arg)-풍부 도메인 및/또는 젤리-롤 도메인(예를 들어, 표 1 내지 17 중 임의의 것에 열거된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 분자는 상이한 CAV 유래의 복수의 하위서열(예를 들어, 본 명세서의 임의의 표에 열거된 CAV 하위서열로부터 선택되는, VP1 하위서열의 임의의 조합, 예컨대 아르기닌-풍부 영역 서열 및/또는 젤리 롤 도메인 서열)을 포함한다.
일부 구현예에서, VP1 분자는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 1A, 1B, 또는 17에 열거된 바와 같은), 야생형 VP1 단백질에 비해 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형, 또는 후생적 변경)를 포함한다.
유전 요소
일부 구현예에서, CA벡터는 유전 요소(예를 들어, CAV 캡시드 단백질, 예를 들어 VP1 분자를 포함하는, 예를 들어 단백질성 외부에 봉입된 유전 요소)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는다: 숙주 세포의 게놈과 실질적으로 비-통합성임, 에피솜 핵산임, 단일 가닥 DNA임, 환형임, 약 1 내지 10 kb임, 세포의 핵 내에 존재함, 내인성 단백질에 의해 결합될 수 있음, 이펙터, 예컨대 숙주 또는 표적 세포의 유전자, 활성 또는 기능을 표적화하는 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, RNA, iRNA, 마이크로RNA)를 생성하고/하거나 인코딩함. 일 구현예에서, 유전 요소는 실질적으로 비-통합성 DNA이다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 패키징 신호, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 결합 서열, 예를 들어 캡시드 단백질에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징 신호는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징 또는 캡시드-결합 서열의 외측에서, 유전 요소는 야생형 CAV 핵산 서열에 대하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 서열 동일성을 가지며, 예를 들어 본 명세서, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은, CAV 핵산 서열에 대하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 패키징 또는 캡시드-결합 서열의 외측에서, 유전 요소는 CAV 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100개 미만의 인접 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 구현예에서, 유전 요소는 프로모터 서열, 치료용 이펙터 및 캡시드 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 환형, 단일 가닥 DNA이다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 20 kb 미만(예를 들어, 약 19 kb, 18 kb, 17 kb, 16 kb, 15 kb, 14 kb, 13 kb, 12 kb, 11 kb, 10 kb, 9 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb 또는 그 미만)의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 독립적으로 또는 부가적으로 1000 b 초과(예를 들어, 적어도 약 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4 kb, 4.1 kb, 4.2 kb, 4.3 kb, 4.4 kb, 4.5 kb, 4.6 kb, 4.7 kb, 4.8 kb, 4.9 kb, 5 kb 또는 그 초과)의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2.5 내지 4.6, 2.8 내지 4.0, 3.0 내지 3.8 또는 3.2 내지 3.7 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 1.5 내지 2.0, 1.5 내지 2.5, 1.5 내지 3.0, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 3.8, 1.5 내지 3.9, 1.5 내지 4.0, 1.5 내지 4.5, 또는 1.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2.0 내지 2.5, 2.0 내지 3.0, 2.0 내지 3.5, 2.0 내지 3.8, 2.0 내지 3.9, 2.0 내지 4.0, 2.0 내지 4.5, 또는 2.0 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2.5 내지 3.0, 2.5 내지 3.5, 2.5 내지 3.8, 2.5 내지 3.9, 2.5 내지 4.0, 2.5 내지 4.5, 또는 2.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 3.0 내지 5.0, 3.5 내지 5.0, 4.0 내지 5.0, 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.1 내지 3.6, 3.2 내지 3.7, 3.3 내지 3.8, 3.4 내지 3.9, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5, 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 3.6 내지 3.9 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2.8 내지 2.9 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 약 2.0 내지 3.2 kb의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 본 명세서에 기재된 특징, 예를 들어 실질적으로 비-병원성인 단백질을 인코딩하는 서열, 단백질 결합 서열, 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 서열, 하나 이상의 조절 서열, 복제 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 서열, 및 기타 서열 중 하나 이상을 포함한다.
구현예에서, 유전 요소를 (예를 들어, 시험관 내 환화에 의해 생성되는) 이중-가닥 환형 DNA로부터 생성하였다. 일부 구현예에서, 유전 요소를 이중-가닥 환형 DNA로부터 회전환 복제에 의해 생성하였다. 구현예에서, 회전환 복제는 세포(예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어 조류 세포(예를 들어, MDCC 세포) 또는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포, 예를 들어 HEK293T 세포, A549 세포 또는 Jurkat 세포)에서 발생한다. 구현예에서, 유전 요소는 세포에서 회전환 복제에 의해 지수적으로 증폭될 수 있다. 구현예에서, 유전 요소는 세포에서 회전환 복제에 의해 선형적으로 증폭될 수 있다. 구현예에서, 이중-가닥 환형 DNA 또는 유전 요소는 세포에서 회전환 복제에 의해 원래의 양의 적어도 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 518, 1024배 이상을 제공할 수 있다. 구현예에서, 이중-가닥 환형 DNA를, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포 내로 도입하였다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 환형 DNA 및/또는 유전 요소는 하나 이상의 박테리아 플라스미드 요소(예를 들어, 박테리아 복제 원점 또는 선택 가능한 마커, 예를 들어 박테리아 내성 유전자, 예를 들어 암피실린 내성 유전자)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 환형 DNA 및/또는 유전 요소는 박테리아 플라스미드 백본을 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 (i) 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질, (ii) 유전 요소를 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 조절 핵산을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 이러한 구현예에서, 유전 요소는 고유 바이러스 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 고유 CAV 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
단백질 결합 서열
많은 바이러스에 의해 사용되는 전략은 바이러스 캡시드 단백질이 이의 게놈 내의 특정 단백질 결합 서열을 인식하는 것이다. 예를 들어, 비세그먼트화된 게놈을 갖는 바이러스, 예컨대 효모의 L-A 바이러스에서, 게놈의 5' 말단에 이차 구조(스템-루프) 및 특정 서열이 존재하며, 이는 둘 다 바이러스 캡시드 단백질에 결합하는 데 사용된다. 그러나, 세그먼트화된 게놈을 갖는 바이러스, 예컨대 레오바이러스과(Reoviridae), 오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)(인플루엔자), 부니아바이러스(Bunyaviruse) 및 아레나바이러스(Arenaviruse)는 게놈 세그먼트의 각각을 패키징할 필요가 있다. 일부 바이러스는 세그먼트의 상보성 영역을 이용하여, 바이러스가 각각의 게놈 분자 중 하나를 포함시키는 것을 보조한다. 다른 바이러스는 상이한 세그먼트의 각각에 대하여 특이적인 결합 부위를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Curr Opin Struct Biol. 2010 Feb; 20(1): 114-120]; 및 문헌[Journal of Virology (2003), 77(24), 13036-13041]을 참조한다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 단백질성 외부에 포함된 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질, 예를 들어 CAV VP1 분자)에 결합하는 단백질 결합 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부로의 유전 요소의 패키징을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부에 포함된 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 핵산 서열 AGCCCTGAAAAGGGGGGGGGGCTAAAGCCCCCCCCCCTTAAACCCCCCCCTGGGGGGGATTCCCCCCCAGACCCCCCCTTTATATAGCACTCAATAAACGCAGAAAATAGATTTATCGCACTATC(서열번호 17), 또는 이의 역상보체를 갖는 단백질 결합 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는, 예를 들어 본 명세서에, 예를 들어 표 1 내지 17 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 CAV 서열의 5' UTR, 3' UTR, 또는 GC-풍부 도메인에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질 결합 서열을 포함한다.
5' UTR 영역
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자(예를 들어, 유전 요소, 유전 요소 작제물, 또는 유전 요소 영역)는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 5' UTR 서열(예를 들어, 표 1 내지 16 중 임의의 것의 5' UTR 서열, 또는 표 17에 열거된 CAV 게놈의 5' UTR), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' UTR 서열은 표 1A에 열거된 5' UTR의 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표 1A에 열거된 5' UTR에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' UTR 서열은 표 1B에 열거된 5' UTR의 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표 1B에 열거된 5' UTR에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' UTR 서열은 표 17에 열거된 CAV 게놈의 5' UTR의 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표 17에 열거된 CAV 게놈의 5' UTR에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
GC-풍부 영역
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 GC 함량을 갖는 핵산 서열(예를 들어, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 또는 150 내지 200개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 인접 서열)을 포함한다. 구현예에서, 유전 요소 또는 유전 요소 작제물은 본 명세서에 기재된(예를 들어, 표 1A 또는 1B에 기재된, 또는 표 17에 열거된 바와 같은) CAV 게놈의 GC-풍부 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 또는 150 내지 200개 뉴클레오티드를 갖는 인접 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, GC-풍부 영역은 헤어핀을 형성한다.
이펙터
일부 구현예에서, 유전 요소는 이펙터, 예를 들어 기능적 이펙터, 예를 들어 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어 치료용 이펙터를 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터는 폴리펩티드 또는 핵산이다. 일부 구현예에서, 이펙터는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (i) 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화됨, (ii) 인간 폴리펩티드 또는 핵산임, (iii) 인간 폴리펩티드 또는 핵산에 결합함, 또는 (iv) 인간 세포에서 활성을 가짐(예를 들어 인간 세포에서 인간 유전자의 활성 및/또는 수준을 조절함(예를 들어, 증가시키거나 감소시킴)).
이펙터는 생물학적 활성을 조절할 수 있으며, 예를 들어 효소 활성, 유전자 발현, 세포 신호전달, 및 세포 또는 기관 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 이펙터 활성은 또한 조절 단백질에 결합하여, 조절제의 활성, 예컨대 전사 또는 번역을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 이펙터 활성은 또한, 활성화제 또는 저해제 기능을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터는 효소 활성을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터는 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 이펙터는 감염원(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아) 유래의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터는 세포독성 또는 세포용해 RNA 또는 단백질이다. 일부 구현예에서, 기능적 핵산은 비-코딩 RNA이다. 일부 구현예에서, 기능적 핵산은 코딩 RNA이다. 일부 구현예에서, 이펙터는 효소에서 증가된 기질 친화성을 촉발시키며, 예를 들어 프룩토스 2,6-비스포스페이트는 포스포프룩토키나제 1을 활성화시키고, 인슐린에 반응하여 당분해 속도를 증가시킨다. 또 다른 예에서, 이펙터는 수용체로의 기질 결합을 저해하고, 이의 활성화를 저해할 수 있으며, 예를 들어 날트렉손(naltrexone) 및 날록손(naloxone)은 오피오이드 수용체를 활성화시키지 않고 결합하며, 수용체가 오피오이드에 결합하지 못하게 한다. 이펙터 활성은 또한, 단백질 안정성/분해 및/또는 전사물 안정성/분해를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 분해를 위해 폴리펩티드 보조-인자인 유비퀴틴에 의해 단백질 상에 표적화되어, 분해에 대해 표시된다. 또 다른 예에서, 이펙터는 효소의 활성 부위를 차단함으로써 효소 활성을 저해하며, 예를 들어 메토트렉세이트는 천연 기질보다 1000배 더 단단하게 디하이드로폴레이트 환원효소에 결합하고, 뉴클레오티드 염기 합성을 저해하는, 효소 디하이드로폴레이트 환원효소에 대한 보조효소인 테트라하이드로폴레이트의 구조적 유사체이다.
일부 구현예에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 유전 요소의 부분이며, 예를 들어 상기 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 삽입 부위에서 삽입될 수 있다. 구현예에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 비코딩 영역, 예를 들어 오픈-리딩 프레임의 3'에, 그리고 유전 요소의 GC-풍부 영역의 5'에 배치된 비코딩 영역에서, TATA 박스의 상류의 5' 비코딩 영역에서, 5' UTR에서, 폴리-A 신호의 하류 또는 GC-풍부 영역의 상류의 3' 비코딩 영역에서 유전 요소 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 오픈 리딩 프레임의 일부 또는 전부(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ORF, 예를 들어 CAV VP1, VP2, 및/또는 아폽틴)를 대체한다.
일부 구현예에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 100 내지 2000, 100 내지 1000, 100 내지 500, 100 내지 200, 200 내지 2000, 200 내지 1000, 200 내지 500, 500 내지 1000, 500 내지 2000, 또는 1000 내지 2000개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 핵산 또는 단백질 페이로드이다.
조절 핵산
일부 구현예에서, 이펙터는 조절 핵산이다. 조절 핵산은 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 변경시킨다. 일 구현예에서, 조절 핵산은 숙주 유전자를 표적화한다. 조절 핵산은 내인성 유전자(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA)에 혼성화되는 핵산, 외인성 핵산, 예컨대 바이러스 DNA 또는 RNA에 혼성화하는 핵산, RNA에 혼성화하는 핵산, 유전자 전사를 간섭하는 핵산, RNA 번역을 간섭하는 핵산, RNA를 안정화시키거나, 예컨대 분해에 대한 표적화를 통하여 RNA를 불안정화시키는 핵산, 및 DNA 또는 RNA 결합 인자를 조절하는 핵산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 조절 핵산은 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 조절 핵산은 야생형 CAV에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, 조절 핵산은 야생형 CAV에 대해 외인성이다.
일부 구현예에서, 조절 핵산은 통상적으로 5 내지 500개의 염기쌍(특정 RNA 구조에 따라, 예를 들어 miRNA 5 내지 30 bp, lncRNA 200 내지 500 bp)을 함유하는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함하며, 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열 또는 세포 내의 발현된 표적 유전자를 인코딩하는 서열과 동일하거나(또는 상보성이거나) 거의 동일한(또는 실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 핵산은 핵산 서열, 예를 들어 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 표적화 모이어티는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티에 대한 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성될 수 있다. 실제로, 가이드 RNA 서열은 일반적으로 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖고 표적화된 핵산 서열에 대하여 상보성이 되도록 설계된다. 효과적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위한 맞춤형 gRNA 생성기 및 알고리즘이 상업적으로 구매 가능하다. 유전자 편집은 또한, 천연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제에 결합하기 위함) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집을 위해 표적화된 서열로 가이드함) 둘 다를 함유하는 엔지니어링된(합성) 단일 RNA 분자인, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 달성되었다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 또한 게놈 편집에서 효과적인 것으로 입증되었으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
조절 핵산은 특정 DNA 서열(예를 들어, 유전자의 프로모터, 인핸서, 침묵자 또는 억제자에 인접하거나 그 내의 서열)을 인식하는 gRNA를 포함한다.
특정 조절 핵산은 RNA 간섭(RNAi)의 생물학적 과정을 통하여 유전자 발현을 저해할 수 있다. RNAi 분자는 통상적으로 15 내지 50개의 염기쌍(예컨대, 약 18 내지 25개의 염기쌍)을 함유하고, 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일하거나(상보성이거나) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 갖는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함한다. RNAi 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex), 및 다이서(dicer) 기질(미국 특허 8,084,599, 8,349,809 및 8,513,207)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
긴 비-코딩 RNA(lncRNA)는 100개 초과의 뉴클레오티드의 비-단백질 코딩 전사물로서 정의된다. 이러한 다소 임의의 제한은 lncRNA를 소형 조절 RNA, 예컨대 마이크로RNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 및 다른 짧은 RNA로부터 구별한다. 일반적으로, 대다수(약 78%)의 lncRNA는 조직-특이적인 것으로 특성화된다. 근처의 단백질-코딩 유전자에 대하여 반대 방향으로 전사되는(포유동물 게놈 내에 총 lncRNA의 유의미한 비율 약 20%를 포함하는) 분지 lncRNA는 아마도 근처의 유전자의 전사를 조절할 수 있다.
유전 요소는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부 또는 이의 단편에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 갖는 조절 핵산을 인코딩할 수 있다. 조절 핵산은 인트론과 엑손 사이의 경계에서의 서열에 상보성이어서, 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 전사를 위해 mRNA로 성숙되는 것을 방지할 수 있다. 특정 유전자에 상보성인 조절 핵산은 유전자에 대한 mRNA와 혼성화하고, 이의 번역을 방지할 수 있다. 안티센스 조절 핵산은 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 혼성물일 수 있다.
관심 전사물에 혼성화하는 조절 핵산의 길이는 5 내지 30개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드, 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사물에 대한 조절 핵산의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%여야 한다.
유전 요소는 조절 핵산, 예를 들어 표적 유전자의 약 5 내지 약 25개의 인접 뉴클레오티드와 동일한 마이크로 RNA(miRNA) 분자를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA 서열은 mRNA를 표적화하며, 디뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30 내지 70%(약 30 내지 60%, 약 40 내지 60% 또는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하며, 예를 들어 표준 BLAST 검색에 의해 결정시, 그것이 도입될 포유동물의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열에 대하여 높은 동일성 백분율을 갖지 않는다.
siRNA 및 shRNA는 내인성 마이크로RNA(miRNA) 유전자의 가공 경로 내의 중간체와 유사하다(문헌[Bartel, Cell 116:281-297, 2004]). 일부 구현예에서, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있으며, 그 역도 그러하다(문헌[Zeng et al., Mol Cell 9:1327-1333, 2002]; 문헌[Doench et al., Genes Dev 17:438-442, 2003]). siRNA와 같이 마이크로RNA는 RISC를 사용하여, 표적 유전자를 하향조절하지만, siRNA와 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신에, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 배출물을 감소시킨다(문헌[Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-4039, 2006]). 알려진 miRNA 결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 존재하며; miRNA는 miRNA의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 2 내지 8에 대하여 거의 완벽하게 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 보인다(문헌[Rajewsky, Nat Genet 38 Suppl:S8-13, 2006]; 문헌[Lim et al., Nature 433:769-773, 2005]). 이러한 영역은 시드 영역으로 공지되어 있다. siRNA 및 miRNA가 상호 교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA에 대하여 시드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다(문헌[Birmingham et al., Nat Methods 3:199-204, 2006]). 3' UTR 내의 다수의 표적 부위는 더 강한 하향조절을 제공한다(문헌[Doench et al., Genes Dev 17:438-442, 2003]).
알려진 miRNA 서열의 목록은 특히 Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 또한, 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동족(cognate) 결합 부위는 관련 문헌에서 잘 나타나 있다. RNAi 분자는 당업계에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 찾는 기회를 증가시키는 컴퓨터 기반 도구가 존재한다(문헌[Lagana et al., Methods Mol. Bio., 2015, 1269:393-412]).
조절 핵산은 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, 일부 구현예에서, 조절 핵산은 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 부류를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 핵산은 상이한 유전자 표적 간에 공유되는 또는 특정 유전자 표적에 특유한 서열에 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 핵산은 몇몇의 유전자 간에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적화하여, 그에 의해, 유전자 패밀리 내의 몇몇의 유전자(예를 들어, 상이한 유전자 아이소폼, 슬라이스 변이체, 돌연변이 유전자 등)를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 핵산은 단일 유전자의 특정 RNA 서열에 특유한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분으로서 사용된다. 유전자 편집의 목적을 위하여, CA벡터는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다수의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Ran et al. (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308]을 참조한다. 적어도 약 16 또는 17개 뉴클레오티드의 gRNA 서열은 일반적으로 Cas9-매개된 DNA 절단이 발생하게 하며; Cpf1에 있어서, 적어도 약 16개 뉴클레오티드의 gRNA 서열이 검출 가능한 DNA 절단을 달성하는 데 필요하다.
치료용 이펙터(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드)
일부 구현예에서, 유전 요소는 치료용 발현 서열, 예를 들어 치료용 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 단백질, 예를 들어 치료용 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 치료용 단백질의 일부 예는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체(예를 들어, 적어도 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 하나 또는 복수의 폴리펩티드), 전사 인자, 수용체(예를 들어, 막 수용체), 리간드, 막 수송체, 분비 단백질, 펩티드, 담체 단백질, 구조 단백질, 뉴클레아제, 또는 이의 구성성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 펩티드, 예를 들어 치료용 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 펩티드는 약 5 내지 약 500개의 아미노산, 약 15 내지 약 400개의 아미노산, 약 20 내지 약 325개의 아미노산, 약 25 내지 약 250개의 아미노산, 약 50 내지 약 200개의 아미노산, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 길이를 갖는다. 펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연적인 생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 본 발명에 유용한 펩티드는 또한, 항원-결합 펩티드, 예를 들어 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디를 포함한다(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조). 이러한 항원 결합 펩티드는 시토졸 항원, 핵 항원, 또는 소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 작은 펩티드, 펩티드모방체(예를 들어, 펩토이드(peptoid)), 아미노산, 및 아미노산 유사체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 치료제는 일반적으로 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 형태를 갖는다. 이러한 치료제는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자, 및 이의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 CA벡터는 특정 위치, 조직, 또는 세포를 표적화할 수 있는 리간드에 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 발현 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 상기 중 임의의 것의 기능적 변이체 또는 이의 단편, 예를 들어 UniProt ID를 참조하여 본 명세서의 표에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 발현 서열은 상기 중 임의의 것에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 UniProt ID를 참조하여 본 명세서의 표에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질에 대한 항체를 인코딩할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 요망되는 항원-결합 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. "항체 단편"은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄를 포함하고 항원에 결합하는 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 세포내 폴리펩티드 이펙터
일부 구현예에서, 이펙터는 세포질 폴리펩티드 또는 세포질 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터는 DPP-4 저해제, GLP-1 신호전달의 활성화제, 또는 호중구 엘라스타제의 저해제인 세포질 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터는 성장 인자 또는 이의 수용체(예를 들어, FGF 수용체, 예를 들어 FGFR3)의 수준 또는 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 이펙터는 n-myc 상호작용 단백질 활성의 저해제(예를 들어, n-myc 상호작용 단백질 저해제); EGFR 활성의 저해제(예를 들어, EGFR 저해제); IDH1 및/또는 IDH2 활성의 저해제(예를 들어, IDH1 저해제 및/또는 IDH2 저해제); LRP5 및/또는 DKK2 활성의 저해제(예를 들어, LRP5 및/또는 DKK2 저해제); KRAS 활성의 저해제; HTT 활성의 활성화제; 또는 DPP-4 활성의 저해제(예를 들어, DPP-4 저해제)를 포함한다.
일부 구현예에서, 이펙터는 조절 세포내 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조절 세포내 폴리펩티드는 표적 세포에 대해 내인성인 하나 이상의 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산)에 결합한다. 일부 구현예에서, 조절 세포내 폴리펩티드는 표적 세포에 대해 내인성인 하나 이상의 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산)의 수준 또는 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 조절 세포내 폴리펩티드는 표적 세포에 대해 내인성인 하나 이상의 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산)의 수준 또는 활성을 감소시킨다.
예시적인 분비 폴리펩티드 이펙터
예시적인 분비 치료제는 본 명세서에, 예를 들어 하기 표에 기재되어 있다.
[표 18A] 예시적인 사이토카인 및 사이토카인 수용체
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18A의 사이토카인, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어 이의 상동체(예를 들어, 오솔로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 UniProt ID를 참조하여 표 50에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 동일한 조건 하에서 동일한 수용체에 대하여 상응하는 야생형 사이토카인의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하로 더 높거나 더 낮은 Kd로 상응하는 사이토카인 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 이펙터는 제1 영역(예를 들어, 표 18A의 사이토카인 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편) 및 제2의 이종 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 표 18A의 제1 사이토카인 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 제2 영역은 표 18A의 제2 사이토카인 폴리펩티드이며, 여기서 제1 및 제2 사이토카인 폴리펩티드는 야생형 세포에서 서로 사이토카인 이종이량체를 형성한다. 일부 구현예에서, 표 18A의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어 이펙터에 대해 내인성인 신호 서열, 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 18A의 사이토카인, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18A의 사이토카인에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18A의 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 신호 서열을 포함한다.
예시적인 사이토카인 및 사이토카인 수용체는, 예를 들어 문헌[Akdis et al., "Interleukins (from IL-1 to IL-38), interferons, transforming growth factor βand TNF-α: Receptors, functions, and roles in diseases" October 2016 Volume 138, Issue 4, Pages 984-1010]에 기재되어 있으며, 이는 상기 문헌의 표 I을 포함하여 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
[표 18B] 예시적인 폴리펩티드 호르몬 및 수용체
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18B의 호르몬, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 이의 상동체(예를 들어, 오솔로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 UniProt ID를 참조하여 표 51에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 동일한 조건 하에서 동일한 수용체에 대하여 상응하는 야생형 호르몬의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하로 더 높은 Kd로 상응하는 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 표 18B의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어 이펙터에 대해 내인성인 신호 서열, 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 18B의 호르몬, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18B의 호르몬에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18B의 호르몬 수용체에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 신호 서열을 포함한다.
[표 18C] 예시적인 성장 인자
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18C의 성장 인자, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 이의 상동체(예를 들어, 오솔로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 UniProt ID를 참조하여 표 52에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 동일한 조건 하에서 동일한 수용체에 대하여 상응하는 야생형 성장 인자의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하로 더 높은 Kd로 상응하는 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 표 18C의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어 이펙터에 대해 내인성인 신호 서열, 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 18C의 성장 인자, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18C의 성장 인자에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18C의 성장 인자 수용체에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 신호 서열을 포함한다.
예시적인 성장 인자 및 성장 인자 수용체는, 예를 들어 문헌[Bafico et al., "Classification of Growth Factors and Their Receptors" Holland-Frei Cancer Medicine. 6th edition]에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
[표 18D] 응고-연관 인자
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 18D의 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 이의 상동체(예를 들어, 오솔로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 UniProt ID를 참조하여 표 53에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는, 예를 들어 야생형 단백질보다 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이상 더 낮은 속도로, 상응하는 야생형 단백질과 동일한 반응을 촉매한다. 일부 구현예에서, 표 18D의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어 이펙터에 대해 내인성인 신호 서열, 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 18D의 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 표 18D의 질환 또는 장애의 치료에 사용된다.
예시적인 단백질 대체 치료제
예시적인 단백질 대체 치료제는 본 명세서에, 예를 들어 하기 표에 기재되어 있다.
[표 19A] 예시적인 효소 이펙터 및 상응하는 적응증
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 19A의 효소, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 이의 상동체(예를 들어, 오솔로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 UniProt ID를 참조하여 표 54에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는, 예를 들어 야생형 단백질보다 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이상 더 낮은 속도로, 상응하는 야생형 단백질과 동일한 반응을 촉매한다. 일부 구현예에서, 표 19A의 효소, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 표 19A의 질환 또는 장애의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 우리딘 디포스페이트 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 또는 이의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어 간 세포로 운반하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 OCA1 또는 이의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어 망막 세포로 운반하는 데 사용된다.
[표 19B] 예시적인 비-효소 이펙터 및 상응하는 적응증
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 에리트로포이에틴(EPO), 예를 들어 인간 에리트로포이에틴(hEPO), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 에리트로포이에틴, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 적혈구형성을 자극하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 에리트로포이에틴, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 질환 또는 장애, 예를 들어 빈혈의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 EPO 또는 이의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어 적혈구로 운반하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 표 19B의 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 이의 상동체(예를 들어, 오솔로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 UniProt ID를 참조하여 표 55에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 19B의 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 CA벡터는 표 19B의 질환 또는 장애의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 SMN 또는 이의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어 척수 및/또는 운동 뉴런의 세포로 운반하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 마이크로-디스트로핀을 표적 세포, 예를 들어 근세포로 운반하는 데 사용된다.
예시적인 마이크로-디스트로핀은 문헌[Duan, "Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy." Mol Ther. 2018 Oct 3;26(10):2337-2356. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.07.011. Epub 2018 Jul 17]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 응고 인자, 예를 들어 본 명세서의 임의의 표(예를 들어, 표 19A 또는 표 19B)에 열거된 응고 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 돌연변이되는 경우 리소좀 축적 장애를 야기하는 단백질, 예를 들어 본 명세서의 임의의 표(예를 들어, 표 19A 또는 표 19B)에 열거된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터는 수송체 단백질, 예를 들어 본 명세서의 임의의 표(예를 들어, 표 19A 또는 표 19B)에 열거된 수송체 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 야생형 단백질의 기능적 변이체는 야생형 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 단백질을 포함하며, 예를 들어 기능적 변이체는, 예를 들어 야생형 단백질보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 더 낮은 속도로, 상응하는 야생형 단백질과 동일한 반응을 촉매한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 야생형 단백질에 의해 결합되는 동일한 결합 파트너에, 예를 들어 동일한 조건 하의 동일한 결합 파트너에 대한 상응하는 야생형 단백질의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이하로 더 큰 Kd로 결합한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 야생형 폴리펩티드의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 단백질의 상동체(예를 들어, 오솔로그(오솔로그) 또는 파라로그(paralog))를 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 융합물은 상응하는 야생형 단백질에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 제1 영역 및 제2 이종 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 단백질의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진다.
재생, 복구, 섬유증 인자
본 명세서에 기재된 치료용 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 표 56에 개시된 바와 같은 성장 인자, 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어 UniProt ID를 참조하여 표 56에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 또한 재생 및 복구를 촉진시키는 이러한 성장 인자, 또는 miRNA에 대한 항체 또는 이의 단편이 포함된다.
[표 56] 예시적인 재생, 복구, 및 섬유증 인자
형질전환 인자
본 명세서에 기재된 치료용 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 섬유아세포를 분화 세포로 형질전환시키는 단백질 인자, 예를 들어 표 57에 개시된 인자 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어 UniProt ID를 참조하여 표 57에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질을 포함한다.
[표 57] 예시적인 형질전환 인자
세포 재생을 자극하는 단백질
본 명세서에 기재된 치료용 폴리펩티드는 또한 세포 재생을 자극하는 단백질, 예를 들어 표 58에 개시된 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어 UniProt ID를 참조하여 표 58에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질을 포함한다.
[표 58] 세포 재생을 자극하는 예시적인 단백질
STING 조절제 이펙터
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 분비 이펙터는 STING/cGAS 신호전달을 조절한다. 일부 구현예에서, STING 조절제는 폴리펩티드, 예를 들어 바이러스 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체이다. 예를 들어, 이펙터는 문헌[Maringer et al. "Message in a bottle: lessons learned from antagonism of STING signalling during RNA virus infection" Cytokine & Growth Factor Reviews Volume 25, Issue 6, December 2014, Pages 669-679]에 기재된 STING 조절제(예를 들어, 저해제)를 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 추가의 STING 조절제(예를 들어, 활성화제)는, 예를 들어 문헌[Wang et al. "STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptide vaccines in melanoma-bearing mice." Cancer Immunol Immunother. 2015 Aug;64(8):1057-66. doi: 10.1007/s00262-015-1713-5. Epub 2015 May 19]; 문헌[Bose "cGAS/STING Pathway in Cancer: Jekyll and Hyde Story of Cancer Immune Response" Int J Mol Sci. 2017 Nov; 18(11): 2456]; 및 문헌[Fu et al. "STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to PD-1 blockade" Sci Transl Med. 2015 Apr 15; 7(283): 283ra52]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연적인 생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 본 발명에 유용한 펩티드는 또한, 항원-결합 펩티드, 예를 들어 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디를 포함한다(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조). 이러한 항원 결합 펩티드는 시토졸 항원, 핵 항원, 또는 소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 작은 펩티드, 펩티드모방체(예를 들어, 펩토이드(peptoid)), 아미노산, 및 아미노산 유사체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 치료제는 일반적으로 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 형태를 갖는다. 이러한 치료제는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자, 및 이의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 CA벡터는 특정 위치, 조직, 또는 세포를 표적화할 수 있는 리간드에 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
유전자 편집 구성성분
CA벡터의 유전 요소는 유전자 편집 시스템의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 유전자 라이터(Gene Writer), 역전사효소, 후성적 변형제, 재조합효소, 및 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제(TALEN)를 포함한다. ZFN, TALEN, 및 CRISPR-기반 방법은, 예를 들어 문헌[Gaj et al. Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405]에 기재되어 있으며; 유전자 편집의 CRISPR 방법은, 예를 들어 문헌[Guan et al., Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016 Oct;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004]; 문헌[Zheng et al., Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, Vol. 57, No. 3, September 2014, pp. 115-124]에 기재되어 있다. 유전자 편집 및 유전자 라이팅(gene writing) 시스템의 비-제한적인 예는, 예를 들어 PCT 공개 WO 2020/047124(예를 들어, 거기에 개시된 임의의 서열) 및 문헌[Anzalone et al. 2019, Nature 576: 149-157](이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소는, 예를 들어 비-긴 말단 반복부(LTR) 레트로트랜스포존(예를 들어, 퓨린 제거(apurinic)/피리미딘 제거(apyrimidinic) 엔도뉴클레아제(APE)-유형 또는 제한 효소-유사 엔도뉴클레아제(RLE)-유형) 유래의 하나 이상의 요소를 포함하는, 유전자 라이터를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 라이터는 레트로트랜스포사제를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 라이터는 DNA 결합 도메인, 역전사 도메인, 및/또는 엔도뉴클레아제 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전 요소에 의해 인코딩될 수 있는 유전자 라이터, 역전사효소, 및 재조합효소는, 예를 들어 PCT 공개 WO 2020/047124(본 명세서에 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
CRISPR 시스템은 원래 박테리아 및 고세균에서 발견된 적응 방어 시스템이다. CRISPR 시스템은 CRISPR-회합 또는 "Cas" 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 명명되는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하여, 외래 DNA를 절단한다. 통상적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 엔도뉴클레아제는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 서열을 표적화하는 서열-특이적, 비-코딩 "가이드 RNA"에 의해 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열-편집될 게놈 내의 부위)에 지향된다. CRISPR 시스템의 3가지 부류(I 내지 III)가 확인된 바 있다. 부류 II CRISPR 시스템은 (다수의 Cas 단백질이 아닌) 단일의 Cas 엔도뉴클레아제를 사용한다. 하나의 부류 II CRISPR 시스템은 II형 Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9, CRISPR RNA("crRNA"), 및 트랜스-활성화 crRNA("tracrRNA")를 포함한다. crRNA는 통상적으로 표적 DNA 서열에 상응하는 약 20개 뉴클레오티드 RNA 서열인 "가이드 RNA"를 포함한다. crRNA는 또한, tracrRNA에 결합하여, RNase III에 의해 절단되는 부분 이중-가닥 구조를 형성하여, crRNA/tracrRNA 혼성물을 초래하는 영역을 포함한다. 그 다음, crRNA/tracrRNA 혼성물은 Cas9 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 인식하고 절단하게 한다. 표적 DNA 서열은 일반적으로 주어진 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 "프로토스페이서 인접 모티프"("PAM")에 인접해야 하지만; PAM 서열은 주어진 게놈의 전체에 걸쳐 나타난다.
일부 구현예에서, CA벡터는 CRISPR 엔도뉴클레아제에 대한 유전자를 포함한다. 예를 들어, 다양한 원핵생물 종으로부터 확인되는 일부 CRISPR 엔도뉴클레아제는 독특한 PAM 서열 요건을 가지며; PAM 서열의 예는 5'-NGG(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), 5'-NNAGAA(스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR3), 및 5'-NNNGATT(네이세리아 메닌지디티스(Neisseria meningiditis))를 포함한다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-NGG와 회합되며, PAM 부위(이로부터 5')로부터 3개 뉴클레오티드 상류의 위치에서 표적 DNA의 평활-말단(blunt-end) 절단을 수행한다. 또 다른 부류 II CRISPR 시스템은 Cas9보다 더 작은 V형 엔도뉴클레아제 Cpf1을 포함하며; 예는 AsCpf1(아시드아미노코커스(Acidaminococcus) 종 유래) 및 LbCpf1(라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 종 유래)을 포함한다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-TTN과 회합된다. 또한, Cpf1은 5'-CTA PAM 모티프를 인식할 수 있다. Cpf1은 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행(overhang)을 갖는 오프셋 또는 스태거형 이중-가닥 파단부를 도입함으로써, 예를 들어 코딩 가닥 상의 PAM 부위(이로부터 3')로부터 18개 뉴클레오티드 하류, 및 상보성 가닥 상의 PAM 부위로부터 23개 뉴클레오티드 하류에 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 스태거형 절단으로 표적 DNA를 절단함으로써 표적 DNA를 절단하며; 이러한 오프셋 절단으로부터 초래되는 5-뉴클레오티드 오버행은 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 평활-말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다 더 정밀한 게놈 편집을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759 - 771]을 참조한다.
다양한 CRISPR 회합(Cas) 유전자가 CA벡터 내에 포함될 수 있다. 유전자의 구체적인 예는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cpf1, C2C1, 또는 C2C3을 포함하는 부류 II 시스템으로부터의 Cas 단백질을 인코딩하는 것이다. 일부 구현예에서, CA벡터는, 다양한 원핵생물 종 중 임의의 것의 유래일 수 있는 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 특정 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열을 인식하도록 선택되는 특정 Cas 단백질, 예를 들어 특정 Cas9 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 세포, 접합체, 배아 또는 동물 내로 도입되어, 예를 들어 동일한, 유사한 또는 상이한 PAM 모티프를 포함하는 부위의 인식 및 변형을 가능하게 할 수 있는 2가지 이상의 상이한 Cas 단백질 또는 2가지 이상의 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 비활성화된 뉴클레아제를 갖는 변형된 Cas 단백질, 예를 들어 뉴클레아제-결핍 Cas9를 인코딩하는 유전자를 포함한다.
야생형 Cas9 단백질이 gRNA에 의해 표적화된 특정 DNA 서열에서 이중-가닥 파단부(DSB)를 생성하는 한편, 변형된 기능을 갖는 수많은 CRISPR 엔도뉴클레아제가 알려져 있으며, 예를 들어 "닉카제" 버전의 Cas엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 오직 단일-가닥 파단만을 생성하며; 촉매적으로 비활성인 Cas 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9("dCas9")는 표적 DNA를 절단하지 않는다. dCas9를 인코딩하는 유전자를 이펙터 도메인을 인코딩하는 유전자와 융합시켜, 표적 유전자의 발현을 억제(CRISPRi)하거나 활성화(CRISPRa)시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자는 전사 침묵화제(예를 들어, KRAB 도메인) 또는 전사 활성화제(예를 들어, dCas9-VP64 융합물)를 갖는 Cas9 융합물을 인코딩할 수 있다. 2개의 gRNA에 상동성인 표적 서열에 DSB를 생성하기 위하여, FokI 뉴클레아제에 융합된 촉매적 비활성 Cas9(dCas9)("dCas9-FokI")를 인코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 애드진 레포지터리(Addgene repository)(Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)에 개시되고, 이로부터 공개적으로 이용 가능한 수많은 CRISPR/Cas9 플라스미드를 참조한다. 각각 개별 가이드 RNA에 의해 유도되는, 2개의 별개 이중-가닥 파단을 도입하는 "이중 닉카제" Cas9는 더 정확한 게놈 편집을 달성하는 것으로 문헌[Ran et al. (2013) Cell, 154:1380 - 1389]에 기재되어 있다.
진핵생물의 유전자를 편집하기 위한 CRISPR 기술은 미국 특허 출원 공개 2016/0138008A1 및 US2015/0344912A1, 및 미국 특허 8,697,359, 8,771,945, 8,945,839, 8,999,641, 8,993,233, 8,895,308, 8,865,406, 8,889,418, 8,871,445, 8,889,356, 8,932,814, 8,795,965, 및 8,906,616에 개시되어 있다. Cpf1 엔도뉴클레아제 및 상응하는 가이드 RNA 및 PAM 부위는 미국 특허 출원 공개 2016/0208243 A1에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, CA벡터는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 예를 들어 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9, 예를 들어 야생형 Cas9, 닉카제 Cas9(예를 들어, Cas9 D10A), 데드(dead) Cas9(dCas9), eSpCas9, Cpf1, C2C1 또는 C2C3, 및 gRNA를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 뉴클레아제 및 gRNA(들)를 인코딩하는 유전자의 선택은 표적화된 돌연변이가 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지, 예를 들어 표적화된 서열에 대한 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지에 의해 결정된다. (하나 이상의) 이펙터 도메인(예를 들어, VP64)의 전부 또는 일부(예를 들어, 이의 생물학적 활성 부분)와 테더링된 촉매적 비활성 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데드 Cas9(dCas9, 예를 들어 D10A; H840A)를 인코딩하는 유전자는 하나 이상의 표적 핵산 서열의 활성 및/또는 발현을 조절할 수 있는 키메라 단백질을 생성한다.
일부 구현예에서, CA벡터는 dCas9와 하나 이상의 이펙터 도메인의 전부 또는 일부(예를 들어, 전장 야생형 이펙터 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체, 예를 들어 이의 생물학적 활성 부분)의 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함하여 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 키메라 단백질을 생성한다. 따라서, 일부 구현예에서, CA벡터는 dCas9-메틸라제 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 다른 일부 구현예에서, CA벡터는 내인성 유전자를 표적화하기 위해 부위-특이적 gRNA와 함께 dCas9-효소 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 양태에서, CA벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 dCas9와 융합된 이펙터 도메인(전체 또는 생물학적 활성 부분)을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
조절 서열
일부 구현예에서, 유전 요소는 이펙터를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 발현 생성물을 인코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 포함한다. 프로모터는 인접 DNA 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 통상적으로 프로모터가 존재하지 않는 경우 발현되는 생성물의 양과 비교하여 DNA 서열로부터 발현되는 생성물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터의 프로모터를 이용하여 또 다른 유기체로부터 기원한 DNA 서열로부터의 생성물 발현을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 척추동물 프로모터는 척추동물에서 해파리 GFP의 발현을 위해 사용될 수 있다. 또한, 하나의 프로모터 요소는 나란히 부착된 다수의 DNA 서열에 대해 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 프로모터 요소는 하나 이상의 생성물의 발현을 향상시킬 수 있다. 다수의 프로모터 요소는 당업자에게 널리 알려져 있다.
일 구현예에서, 높은 수준의 구성적 발현이 요망된다. 이러한 프로모터의 예는 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터/인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 조기 프로모터/인핸서(예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 유도성 프로모터가 요망될 수 있다. 유도성 프로모터는 제한 없이, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제성 시스템(문헌[Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]); 테트라사이클린-유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)]; 또한, 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조); RU486-유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 문헌[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]); 및 라파마이신-유도성 시스템(문헌[Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]; 문헌[Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)])을 포함하여, 예를 들어 시스로 또는 트랜스로 제공되는, 외인적으로 공급되는 화합물에 의해 조절되는 것들이다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성 단계에 의해 또는 오직 복제하는 세포에서만 조절되는 것들이다.
일부 구현예에서, 관심 유전자 또는 핵산 서열에 대한 고유 프로모터가 사용된다. 유전자 또는 핵산 서열의 발현이 고유 발현을 모방하는 것이 요망되는 경우에 고유 프로모터가 사용될 수 있다. 유전자 또는 다른 핵산 서열의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에, 고유 프로모터가 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, 다른 고유 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작(Kozak) 컨센서스 서열도 또한 고유 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함한다. 예를 들어, 골격근에서의 발현이 요망되는 경우, 근육에서 활성인 프로모터가 사용될 수 있다. 이들은 골격 α-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 인코딩하는 유전자로부터의 프로모터 및 자연-발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 포함한다. 문헌[Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)]을 참조한다. 특히 간 알부민, 문헌[Miyatake et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 문헌[Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)]; 알파-태아단백질(AFP), 문헌[Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], 골(오스테오칼신(osteocalcin), 문헌[Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]; 골 시알로단백질(sialoprotein), 문헌[Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996)]), 림프구(CD2, 문헌[Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)]; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 a 쇄), 뉴런(뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 문헌[Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]; 신경필라멘트 경쇄 유전자, 문헌[Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]; 뉴런-특이적 vgf 유전자, 문헌[Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]을 위한 조직-특이적인 프로모터의 예가 알려져 있다.
유전 요소는 인핸서, 예를 들어 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 통상적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하거나, 코딩 DNA 서열(예를 들어, 생성물 또는 생성물들로 전사 또는 번역되는 DNA 서열)의 하류에 또는 그 내에 위치할 수 있다. 그러므로, 인핸서 요소는 생성물을 인코딩하는 DNA 서열의 100개 염기쌍, 200개 염기쌍 또는 300개 이상의 염기쌍 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 DNA 서열로부터 발현되는 재조합 생성물의 양을 프로모터 요소에 의해 제공되는 증가된 발현을 초과하여 증가시킬 수 있다. 다수의 인핸서 요소는 당업자에게 용이하게 이용 가능하다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 본 명세서에 기재된 발현 생성물을 인코딩하는 서열을 측접하는 하나 이상의 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 본 명세서에 기재된 발현 생성물을 인코딩하는 서열을 측접하는 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR)를 포함한다. 사용될 수 있는 프로모터 서열의 예는 시미안 바이러스 40(SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스테인-바 바이러스 즉시 조기 프로모터, 및 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
복제 단백질
일부 구현예에서, CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터의 유전 요소는 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터는 회전환 복제 방법에 의해 복제할 수 있으며, 예를 들어 선도 가닥 및 지연 가닥의 합성은 분리된다. 이러한 구현예에서, CA벡터는 3가지의 추가의 요소를 포함한다: i) 개시 단백질을 인코딩하는 유전자, ii) 이중 가닥 원점, 및 iii) 단일 가닥 원점. 복제 단백질을 포함하는 회전환 복제(RCR) 단백질 복합체는 선도 가닥에 결합하며, 복제 원점을 불안정화시킨다. RCR 복합체는 게놈을 절단하여, 유리 3'OH 말단을 생성한다. 세포 DNA 중합효소는 유리 3'OH 말단으로부터 바이러스 DNA 복제를 개시한다. 게놈이 복제된 후에, RCR 복합체는 루프를 공유적으로 폐쇄시킨다. 이는 양성 환형 단일-가닥 모 DNA 분자 및 음성 모체 가닥 및 새로 합성된 양성 가닥으로 구성된 환형 이중-가닥 DNA 분자의 방출을 야기한다. 단일-가닥 DNA 분자는 캡시드화되거나 제2차의 복제에 수반될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Virology Journal 2009, 6:60 doi:10.1186/1743-422X-6-60]을 참조한다.
유전 요소는 중합효소, 예를 들어 RNA 중합효소 또는 DNA 중합효소를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
기타 서열
일부 구현예에서, 유전 요소는 생성물(예를 들어, 리보자임, 단백질을 인코딩하는 치료용 mRNA, 외인성 유전자)을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 CA벡터의 종 및/또는 조직 및/또는 세포 향성(예를 들어, 캡시드 단백질 서열), 감염성(예를 들어, 캡시드 단백질 서열), 면역억제/활성화(예를 들어, 조절 핵산), 바이러스 게놈 결합 및/또는 패키징, 면역 회피(비-면역원성 및/또는 관용), 약동학, 엔도시토시스 및/또는 세포 부착, 핵 유입, 세포내 조절 및 국재화, 엑소시토시스 조절, 증식 및 숙주 또는 숙주 세포에서의 CA벡터의 핵산 보호에 영향을 미치는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 DNA, RNA 또는 인공 핵산을 포함하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 다른 서열은 게놈 DNA, cDNA, 또는 tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 다른 RNAi 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 유전 요소는 조절 핵산과 동일한 유전자 발현 생성물의 상이한 유전자좌를 표적화하기 위하여 siRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 유전 요소는 조절 핵산과 상이한 유전자 발현 생성물을 표적화하기 위하여 siRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 하기의 서열 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 서열(siRNA, lncRNA, shRNA)을 인코딩하는 서열, 및 치료용 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
다른 서열은 약 2 내지 약 5000개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 250개의 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 350개의 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 1000 내지 약 2000개의 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개의 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개의 뉴클레오티드, 약 4000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
인코딩된 유전자
예를 들어, 유전 요소는 신호전달 생화학 경로와 연관된 유전자, 예를 들어 신호전달 생화학 경로-연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예에는 질환 연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "질환-연관" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 비 질환 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여, 질환-이환된 조직으로부터 유래된 세포에서 전사 또는 번역 생성물을 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 제공하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며; 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며, 여기서, 변경된 발현은 질환의 발생 및/또는 진행과 상호연관된다. 질환-연관 유전자는 또한, 질환의 병인의 직접적인 원인이 되거나, 질환의 병인을 담당하는 유전자(들)와 연관 불균형인 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 지니는 유전자를 지칭한다.
또한, 유전 요소는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 표적화 모이어티를 인코딩할 수 있다. 이는, 예를 들어 당, 당지질 또는 단백질, 예컨대 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 표적화 모이어티의 추가의 생성 방법을 안다.
바이러스 서열
일부 구현예에서, 유전 요소는 적어도 하나의 바이러스 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 단일 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어 CAV, 아넬로바이러스(Anellovirus), 비드나바이러스(Bidnavirus), 써코바이러스(Circovirus), 제미니바이러스(Geminivirus), 게노모바이러스(Genomovirus), 이노바이러스(Inovirus), 마이크로바이러스(Microvirus), 나노바이러스(Nanovirus), 파보바이러스(Parvovirus) 및 스피라바이러스(Spiravirus)로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열은 이중 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스(Adenovirus), 암풀라바이러스(Ampullavirus), 아스코바이러스(Ascovirus), 아스파바이러스(Asfarvirus), 바큘로바이러스, 푸셀로바이러스(Fusellovirus), 글로불로바이러스(Globulovirus), 구타바이러스(Guttavirus), 하이트로사바이러스(Hytrosavirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 이리도바이러스(Iridovirus), 리포트릭스바이러스(Lipothrixvirus), 니마바이러스(Nimavirus) 및 폭스바이러스(Poxvirus)로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열은 RNA 바이러스, 예를 들어 알파바이러스(Alphavirus), 푸로바이러스(Furovirus), 간염 바이러스(Hepatitis virus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 트리코르나바이러스(Tricornavirus), 루비바이러스(Rubivirus), 비르나바이러스(Birnavirus), 시스토바이러스(Cystovirus), 파르티티바이러스(Partitivirus) 및 레오바이러스(Reovirus)로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 비-병원성인 바이러스, 예를 들어 상리공생 바이러스, 예를 들어 편리공생 바이러스, 고유 바이러스, 예를 들어 CAV 유래의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 CAV의 Cuxhaven 1 단리물(예를 들어, 표 1A 또는 1B에 열거된 바와 같음)에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-병원성 바이러스는 환형의 음성-센스 게놈을 갖는 비-외피, 단일-가닥 DNA 바이러스, 예를 들어 CAV이다. 일부 구현예에서, 유전 요소는 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 비-병원성 바이러스 유래의 하나 이상의 서열 또는 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 레트로바이러스가 결함이 있기 때문에, 감염성 입자를 생성하도록 지원이 제공될 수 있다. 이러한 지원은, 예를 들어 LTR 내의 조절 서열의 제어 하에 레트로바이러스의 구조적 유전자의 전부를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 세포주를 사용함으로써 제공될 수 있다. 본 명세서에 기재된 CA벡터를 복제하는 데 적합한 세포주는 당업계에 알려진 세포주, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 A549 세포를 포함한다. 상기 유전 요소는 선택 가능한 마커를 인코딩하는 유전자를 추가로 함유하여, 요망되는 유전 요소가 확인되게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소는 서열이 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하게 유지되거나, 또는 다르게 본 발명을 실시하는 데 유용하다면, 인코딩된 폴리펩티드에 아미노산 차이를 초래하는 비-침묵 돌연변이, 예를 들어 염기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 이와 관련하여, 일반적으로 전체 단백질 기능을 비활성화시키지 않는 것으로 인식되는 특정 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다: 예컨대 양으로 하전된 아미노산(및 이의 역)에 관하여, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 음으로 하전된 아미노산(및 이의 역)에 관하여, 아스파르트산 및 글루탐산; 및 특정 군의 중성으로 하전된 아미노산(및 모든 경우에, 또한 이의 역)에 관하여, (1) 알라닌 및 세린, (2) 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘, (3) 시스테인 및 세린, (4) 글리신 및 프롤린, (5) 이소류신, 류신 및 발린, (6) 메티오닌, 류신 및 이소류신, (7) 페닐알라닌, 메티오닌, 류신 및 티로신, (8) 세린 및 트레오닌, (9) 트립토판 및 티로신, (10) 및 예를 들어, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌. 아미노산은 물리적 특성 및 이차 및 삼차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로의 치환으로서 당업계에 인식된다.
일부 구현예에서, 동일한 또는 특정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성(예를 들어, 비교 윈도우 또는 표기된 영역에 걸쳐 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬되는 경우, 특정 영역에 걸쳐 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)은 하기 기재된 디폴트 파라미터와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동의 정렬 및 육안의 검사(예를 들어, NCBI 웹 사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)에 의해 측정될 수 있다. 동일성은 또한 시험 서열의 상보물을 지칭할 수 있거나 이에 적용될 수 있다. 동일성은 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열, 및 치환을 갖는 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 알고리즘은 갭 등을 설명한다. 동일성은 적어도 약 10개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 15개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 20개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 30개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 35개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 40개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 45개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 50개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이 이상인 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 유전 암호가 축퇴성이기 때문에, 상동성 뉴클레오티드 서열은 임의의 수의 침묵 염기 변경, 즉 그럼에도 불구하고 동일한 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
단백질성 외부
일부 구현예에서, CA벡터, 예를 들어 합성 CA벡터는 유전 요소를 봉입하는 단백질성 외부를 포함한다. 단백질성 외부는 캡시드 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 분자)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 캡시드 단백질이고, 예를 들어 본 명세서에 기재된 캡시드 단백질, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CAV VP1 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 인코딩된 단백질에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질의 단백질 또는 기능적 단편은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP1 핵산에 대하여 적어도 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, CA벡터는 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAV VP1 분자에 대하여 적어도 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. CA벡터의 단백질성 외부는, 일부 구현예에서, 자가-조립되어, 예를 들어 단백질성 외부를 형성할 수 있는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은, 예를 들어 단백질성 외부를 구성하는 정20면체 형성으로 자가-조립될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질성 외부 단백질은 CA벡터의 유전 요소의 서열에 의해 인코딩된다(예를 들어, 유전 요소와 시스로 존재함). 다른 구현예에서, 단백질성 외부 단백질은 CA벡터의 유전 요소와 별개인 핵산에 의해 인코딩된다(예를 들어, 유전 요소와 트랜스로 존재함).
일부 구현예에서, 더 낮은 서열 동일성을 갖는 아미노산의 범위는 본 명세서에 기재된 특성 중 하나 이상 및 세포/조직/종 특이성(예를 들어, 향성)의 차이를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, CA벡터는 단백질성 외부 내에 지질이 결여된다. 일부 구현예에서, CA벡터에는 지질 이중층, 예를 들어 바이러스 외피가 결여된다. 일부 구현예에서, CA벡터의 내부는 단백질성 외부에 의해 완전히 덮인다(예를 들어, 100% 커버리지). 일부 구현예에서, CA벡터의 내부는 단백질성 외부에 의해 100% 미만, 예를 들어 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 이하의 커버리지로 덮인다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 유전 요소가 CA벡터에 보유되는 한, 예를 들어 물, 이온, 펩티드 또는 소분자에 대한 투과 가능성을 허용하는 갭 또는 불연속부를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질성 외부는 숙주 세포 내로의 유전 요소의 유입을 매개하기 위하여 숙주 세포를 특이적으로 인식하고/인식하거나 이에 결합하는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 상보성 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질성 외부는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 VP1 분자의 아르기닌-풍부 영역, 및/또는 젤리-롤 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질성 외부는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 글리코실화된 단백질, 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열, 및 하나 이상의 이황화 가교. 예를 들어, 단백질성 외부는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV VP1 핵산에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질성 외부는 하기의 특성 중 하나 이상을 포함한다: 정20면체 대칭, 하나 이상의 숙주 세포 분자와 상호작용하는 분자를 인식하고/하거나 이에 결합하여, 숙주 세포로의 유입을 매개함, 지질 분자가 결여됨, 탄수화물이 결여됨, pH 및 온도 안정성임, 세제 저항성임, 및 숙주에서 실질적으로 비-병원성임.
일부 구현예에서, 단백질, 예를 들어 실질적으로 비-병원성인 단백질 및/또는 단백질성 외부 단백질은 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 글리코실화된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질, 실질적으로 비-병원성인 단백질 및/또는 단백질성 외부 단백질은 적어도 하나의 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열, 및 하나 이상의 이황화 가교를 포함한다.
III. 유전 요소 작제물
본 명세서에 기재된 유전 요소는 유전 요소 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 탠덤 작제물)에 포함될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 비-병원성 외부 단백질(예를 들어, CAV VP1 분자 또는 이의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편)을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터를 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 유전 요소 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 유전 요소의 제2 카피, 또는 이의 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 uRFS 또는 dRFS를 포함함)을 추가로 포함하는 탠덤 작제물이다.
유전 요소 또는 유전 요소 내의 임의의 서열은 임의의 적합한 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 다양한 재조합 방법, 예를 들어 바이러스 서열을 보유하는 세포로부터 라이브러리의 스크리닝, 이를 포함하는 것으로 알려져 있는 유전 요소 작제물로부터 서열의 유도, 또는 표준 기법을 사용한 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터의 직접적인 단리가 당업계에 알려져 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 유전 요소의 일부 또는 전부는 클로닝보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 조절 요소, 표적 유전자에 상동성인 핵산 서열, 및 생존 가능한 세포 내에서 및/또는 세포내 분자가 표적 세포 내에 존재하는 경우 리포터 분자의 발현을 야기하기 위한 다양한 리포터 작제물을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하거나 이에 의해 발현되지 않고, 발현이 다소 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 리포터 유전자의 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측접 영역을 갖는 작제물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 실질적으로 비-병원성이고/이거나 숙주 세포 내에 실질적으로 비-통합된다.
일부 구현예에서, 유전 요소 작제물은 표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 다른 바이러스와의 경쟁, 질환 상태 등 중 하나 이상을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상 조절하기에 충분한 양으로 존재한다.
IV. 조성물
본 명세서에 기재된 CA벡터는 또한, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 1015개의 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 105 내지 1015, 105 내지 1010, 또는 1010 내지 1015개의 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 108개(예를 들어, 약 105, 106, 107, 108, 109, 또는 1010개) 게놈 당량/㎖의 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바이러스 역가를 측정하는 방법에 따라 결정시, 105 내지 1010, 106 내지 1010, 107 내지 1010, 108 내지 1010, 109 내지 1010, 105 내지 106, 105 내지 107, 105 내지 108, 105 내지 109, 105 내지 1011, 105 내지 1012, 105 내지 1013, 105 내지 1014, 105 내지 1015, 또는 1010 내지 1015개 게놈 당량/㎖의 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 세포당 CA벡터에 포함되는 적어도 1, 2, 5 또는 10, 100, 500, 1000, 2000, 5000, 8,000, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107개 이상의 카피의 유전 요소를 진핵 세포의 집단에 운반하기에 충분한 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 세포당 CA벡터에 포함되는 적어도 약 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 또는 107, 또는 약 1 x 104 내지 1 x 105, 1 x 104 내지 1 x 106, 1 x 104 내지 1 x 107, 1 x 105 내지 1 x 106, 1 x 105 내지 1 x 107, 또는 1 x 106 내지 1 x 107개 카피의 유전 요소를 진핵 세포의 집단에 운반하기에 충분한 CA벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는다: 약제학적 조성물이 약제학적 또는 우수 제조 기준(GMP) 표준을 충족하거나; 약제학적 조성물을 우수 제조 기준(GMP)에 따라 제조하거나; 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 병원체 수준을 갖거나, 예를 들어 실질적으로 병원체가 없거나; 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 갖거나, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실질적으로 오염물질이 없음.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 임계값 미만의 양의 하나 이상의 오염물질을 포함한다. 약제학적 조성물에서 바람직하게는 배제되거나 최소화되는 예시적인 오염물질은 제한 없이, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 숙주 세포 단백질, 동물-유래 구성성분(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 바이러스, 비-감염성 입자, 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래성 물질 및 응집물을 포함한다. 구현예에서, 오염물질은 숙주 세포 DNA이다. 구현예에서, 조성물은 용량당 약 10 ng 미만의 숙주 세포 DNA를 포함한다. 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 수준은 여과 및/또는 숙주 세포 DNA의 효소적 분해에 의해 감소된다. 구현예에서, 약제학적 조성물은 중량 기준 10% 미만(예를 들어, 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만)의 오염물질로 이루어진다. 따라서 본 개시내용은 하기 중 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 전부)에 대해 CA벡터 제제를 평가하는 단계를 포함하는 본 명세서에 개시된 CA벡터를 제조하는 방법을 포함한다: 외래성 물질, 발열성 물질, 내독소, 마이코플라스마, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 비-감염성 입자 또는 빈 캡시드.
본 개시내용은 일부 예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터 및 약제학적 부형제를 포함하는 멸균 약제학적 조성물을 포함하며, 조성물은 21 C.F.R. §§610.12 및 610.13의 요건을 충족한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 일부 구현예에서, 하기 특성 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 8개 전부를 가질 수 있다:
(i)
실질적으로 외래성 물질이 결여됨,
(ii)
실질적으로 발열성 물질이 결여됨,
(iii)
대조군 참조 또는 규격, 예를 들어 내독소 오염에 대한 미국 약전(USP) 또는 FDA 참조 표준물보다 같거나 그보다 더 적은 내독소를 함유함,
(iv)
대조군 참조 또는 규격, 예를 들어 마이코플라스마 오염에 대한 미국 약전(USP) 또는 FDA 참조 표준물보다 같거나 그보다 더 적은 마이코플라스마를 함유함,
(v)
대조군 참조 표준물보다 더 적은 숙주 세포 DNA, 예를 들어 용량당 10 ng 미만의 숙주 세포 DNA, 용량당 5 ng 미만의 숙주 세포 DNA를 함유함,
(vi)
대조군 참조 표준물보다 더 적은 숙주 세포 단백질(HCP), 예를 들어 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 및/또는 10 ng/용량 미만, 5 ng/용량 미만을 함유함,
(vii)
임계량 미만의 비-감염성 입자를 함유함, 예를 들어 감염성 입자에 비하여 비-감염성 입자에 대해 사전결정된 방출 규격, 예를 들어 입자 대 감염성 유닛이 2000:1 미만, 1000:1 미만, 500:1 미만, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만인 것을 충족함, 및/또는
(viii)
임계량 미만의 빈 캡시드(게놈이 결여됨)를 함유함, 예를 들어 빈 캡시드에 대해 사전결정된 방출 규격을 충족함.
일 양태에서, 본 명세서에 기재된 본 발명은 하기를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다:
a) (i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및 유전 요소와 회합된, 예를 들어 이를 봉입하거나 둘러싸는 단백질성 외부를 포함하는 유전 요소를 포함하는 CA벡터; 및
b) 약제학적 부형제.
소낭
일부 구현예에서, 조성물은 운반체 구성성분, 예를 들어 마이크로입자, 리포좀, 소낭 또는 엑소좀을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일- 또는 다중라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외부 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구형의 소낭 구조를 포함한다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 일반적으로 생체적합성이고, 비독성이며, 친수성 및 친유성 약물 분자 둘 다를 운반하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 이들의 카고(cargo)를 보호하고, 생물학적 막을 가로질러 이들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소낭은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 흔히 사용된다. 소낭은 제한 없이, DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB를 단독으로 또는 콜레스테롤과 함께 포함하여, DOTMA와 콜레스테롤, DOTAP와 콜레스테롤, DOTIM과 콜레스테롤, 및 DDAB와 콜레스테롤을 제공할 수 있다. 다중라멜라 소낭 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 다중라멜라 소낭 지질 제제에 관한 교시가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 6,693,086 참조). 지질 필름이 수용액과 혼합되는 경우 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 이는 또한 균질화기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태로 힘을 가함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 압출된 지질 제제에 관한 교시가 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이 감소하는 크기의 필터를 통해 압출시킴으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 첨가제를 소낭에 첨가하여, 이들의 구조 및/또는 특성을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 콜레스테롤 또는 스핑고미엘린을 혼합물에 첨가하여, 구조의 안정화 및 내부 카고의 누출의 방지를 도울 수 있다. 추가로, 소낭은 수소화된 난(egg) 포스파티딜콜린 또는 난 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 디세틸 포스페이트로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 또한, 소낭은 합성 동안 또는 그 후에 수용자 세포 상의 반응성 기에 상보성인 반응성 기를 포함하도록 표면 변형될 수 있다. 이러한 반응성 기는 제한 없이, 말레이미드 기를 포함한다. 일 예로서, 소낭은 말레이미드 컨쥬게이트된 인지질, 예컨대 제한 없이 DSPE-MaL-PEG2000을 포함하도록 합성될 수 있다.
소낭 형성은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 난 포스파티딜콜린 및 모노시알로강글리오시드로 구성될 수 있다. 인지질만으로 제조된 제형은 혈장에서 덜 안정하다. 그러나, 콜레스테롤을 이용한 지질 막의 조작은 캡슐화된 카고의 신속한 방출을 감소시키거나, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
구현예에서, 지질은 지질 마이크로입자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 지질은 DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 공지질 디스테로일포스파티딜 콜린을 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 콜레스테롤 및 PEG-DMG는 자발적 소낭 형성 절차를 사용하여 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3] 참조). 성분 몰비는 약 50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA 또는 C12-200/디스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG)일 수 있다. 테크미라(Tekmira)는 모두가 본 발명에 사용될 수 있고/있거나 조정될 수 있는 지질 마이크로입자 및 지질 마이크로입자 제형의 다양한 양태에 관한, 미국 및 해외에서의 대략 95개의 특허 패밀리의 포트폴리오를 갖는다(예를 들어, 미국 특허 7,982,027; 7,799,565; 8,058,069; 8,283,333; 7,901,708; 7,745,651; 7,803,397; 8,101,741; 8,188,263; 7,915,399; 8,236,943 및 7,838,658 및 유럽 특허 1766035; 1519714; 1781593 및 1664316 참조).
일부 구현예에서, 마이크로입자는 무작위 방식으로 배열된 하나 이상의 고형화된 폴리머(들)를 포함한다. 마이크로입자는 생분해성일 수 있다. 생분해성 마이크로입자는, 예를 들어 제한 없이, 용매 증발, 핫 멜트 마이크로캡슐화, 용매 제거, 및 분무 건조를 포함하는 당업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 마이크로입자를 합성하기 위한 예시적인 방법은 문헌[Bershteyn et al., Soft Matter 4:1787-1787, 2008] 및 US 2008/0014144 A1에 기재되어 있으며, 마이크로입자 합성에 관한 이의 구체적인 교시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
생분해성 마이크로입자를 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 합성 폴리머는 제한 없이, 지방족 폴리에스테르, 폴리 (락트산)(PLA), 폴리 (글리콜산)(PGA), 락트산 및 글리콜산의 코폴리머(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 다가무수물(polyanhydride), 폴리(오르토)에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 및 폴리(락티드-코-카프로락톤) 및 천연 폴리머, 예컨대 알부민, 알긴산염 및 덱스트란 및 셀룰로스를 포함하는 기타 다당류, 콜라겐, 예컨대, 예를 들어 알킬, 알킬렌과 같은 화학 기의 치환, 부가, 하이드록실화, 산화 및 당업자에 의해 일상적으로 이루어지는 기타 변형을 포함하는 이의 화학적 유도체, 알부민 및 기타 친수성 단백질, 제인 및 기타 프롤라민 및 소수성 단백질, 이의 코폴리머 및 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 이들 물질은 효소적 가수분해 또는 물에의 노출에 의해, 표면 또는 벌크 침식에 의해 분해된다.
마이크로입자의 직경은 0.1 내지 1000 마이크로미터(㎛) 범위이다. 일부 구현예에서, 이들의 직경은 크기가 1 내지 750 ㎛, 또는 50 내지 500 ㎛, 또는 100 내지 250 ㎛의 범위이다. 일부 구현예에서, 이들의 직경은 크기가 50 내지 1000 ㎛, 50 내지 750 ㎛, 50 내지 500 ㎛, 또는 50 내지 250 ㎛의 범위이다. 일부 구현예에서, 이들의 직경은 크기가 .05 내지 1000 ㎛, 10 내지 1000 ㎛, 100 내지 1000 ㎛, 또는 500 내지 1000 ㎛의 범위이다. 일부 구현예에서, 이들의 직경은 약 0.5 ㎛, 약 10 ㎛, 약 50 ㎛, 약 100 ㎛, 약 200 ㎛, 약 300 ㎛, 약 350 ㎛, 약 400 ㎛, 약 450 ㎛, 약 500 ㎛, 약 550 ㎛, 약 600 ㎛, 약 650 ㎛, 약 700 ㎛, 약 750 ㎛, 약 800 ㎛, 약 850 ㎛, 약 900 ㎛, 약 950 ㎛ 또는 약 1000 ㎛이다. 마이크로입자 직경의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 언급된 절대값의 +/-5%를 의미한다.
일부 구현예에서, 리간드는 입자의 표면 상에 존재하고, 부착될 리간드 상에 존재하는 작용성 화학 기(카복실산, 알데히드, 아민, 술프하이드릴 및 하이드록실)를 통해 마이크로입자의 표면에 컨쥬게이트된다. 기능성은, 예를 들어 마이크로입자의 에멀젼 제조 동안 작용성 화학 기를 갖는 안정화제의 혼입에 의해 마이크로입자 내로 도입될 수 있다.
작용성 기를 마이크로입자에 도입하는 또 다른 예는 입자 제조 후 동안, 입자 및 리간드를 동종- 또는 이종 이작용성 가교결합제와 직접 가교결합시킴으로써 이루어진다. 이러한 절차는 적합한 화학물질 및 소정의 부류의 가교결합제(하기에 더 상세히 논의된 바와 같은 CDI, EDAC, 글루타르알데히드 등) 또는 제조 후에 입자 표면의 화학적 변형을 통해 리간드를 입자 표면에 커플링시키는 임의의 다른 가교결합제를 사용할 수 있다. 이는 또한 양친매성 분자, 예컨대 지방산, 지질 또는 기능적 안정화제가 입자 표면에 수동으로 흡수되고 부착되어, 이에 의해 리간드로의 테더링을 위한 작용성 말단 기를 도입할 수 있는 과정을 포함한다.
일부 구현예에서, 마이크로입자는 이들의 외부 표면 상에 하나 이상의 표적화 기를 포함하도록 합성되어, 특정 세포 또는 조직 유형(예를 들어, 심근세포)을 표적화할 수 있다. 이들 표적화 기는 제한 없이, 수용체, 리간드, 항체 등을 포함한다. 이들 표적화 기는 세포의 표면 상의 이들의 파트너와 결합한다. 일부 구현예에서, 마이크로입자는 세포 표면을 포함하는 지질 이중층 내로 통합될 것이며, 미토콘드리아는 세포로 운반된다.
마이크로입자는 또한, 그들의 최외각 표면 상에 지질 이중층을 포함할 수 있다. 이러한 이중층은 동일하거나 상이한 유형의 하나 이상의 지질로 구성될 수 있다. 예는 제한 없이, 인지질, 예컨대 포스포콜린 및 포스포이노시톨을 포함한다. 구체적인 예는 제한 없이, DMPC, DOPC, DSPC 및 다양한 다른 지질, 예컨대 리포좀에 대하여 본 명세서에 기재된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 담체는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 나노입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 소낭 또는 마이크로입자는 진단제로 기능화된다. 진단제의 예는 양전자 방사 단층촬영(PET), 컴퓨터 보조 단층촬영(CAT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영, x-선, 형광투시법 및 자기 공명 영상화(MRI)에 사용되는 구매할 수 있는 영상화제; 및 조영제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. MRI에서 조영제로서 사용하기에 적합한 물질의 예는 가돌리늄 킬레이트, 및 철, 마그네슘, 망간, 구리 및 크롬을 포함한다.
담체
본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 담체를 포함하고/하거나, 이와 함께 제형화되고/되거나, 이 내에서 운반될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CA벡터, CAV, 또는 유전 요소)을 포함하는(예를 들어, 캡슐화하는) 담체(예를 들어, 소낭, 리포좀, 지질 나노입자, 엑소좀, 적혈구, 엑소좀(예를 들어, 포유동물 또는 식물 엑소좀), 푸소좀)를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 시스템은 리포좀 또는 다른 유사한 소낭 내에 제형화될 수 있다. 일반적으로, 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일- 또는 다중라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외부 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구형의 소낭 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 일반적으로 하기의 특성 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 갖는다: 생체적합성, 비독성, 친수성 및 친유성 약물 분자 둘 다를 운반할 수 있음, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고를 보호할 수 있음, 및 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 이들의 로드를 수송할 수 있음(예를 들어, 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679]; 및 문헌[Zylberberg & Matosevic. 2016. Drug Delivery, 23:9, 3319-3329, doi: 10.1080/10717544.2016.1177136] 참조).
소낭은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 흔히 사용된다. 다중라멜라 소낭 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 다중라멜라 소낭 지질 제제에 관한 교시가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 6,693,086 참조). 지질 필름이 수용액과 혼합되는 경우 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 이는 또한 균질화기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태로 힘을 가함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은, 예를 들어 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이 감소하는 크기의 필터를 통해 압출시킴으로써 제조될 수 있다.
지질 나노입자(LNP)는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 위한 생체적합성 및 생분해성 운반 시스템을 제공하는 담체의 또 다른 예이다. 예를 들어, 문헌[Gordillo-Galeano et al. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. Volume 133, December 2018, Pages 285-308]을 참조한다. 나노구조화된 지질 담체(NLC)는 고체 지질 나노입자(SLN)의 특성을 보유하고, 약물 안정성 및 로딩 능력을 개선시키고, 약물 누출을 방지하는 변형된 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 폴리머 나노입자(PNP)는 약물 운반의 중요한 구성성분이다. 이들 나노입자는 특정 표적으로의 약물 운반을 효율적으로 유도하고, 약물 안정성 및 제어된 약물 방출을 개선시킬 수 있다. 리포좀과 폴리머를 조합한 새로운 유형의 담체인, 지질-폴리머 나노입자(PLN)도 또한 이용될 수 있다. 이들 나노입자는 PNP와 리포좀의 보완적인 이점을 보유한다. PLN는 코어(core)-쉘(shell) 구조로 구성되고; 폴리머 코어는 안정한 구조를 제공하며, 인지질 쉘은 우수한 생체적합성을 제공한다. 이와 같이, 2가지 구성성분은 약물 캡슐화 효율을 증가시키고, 표면 변형을 용이하게 하고, 수용성 약물의 누출을 방지한다. 검토를 위하여, 예를 들어 문헌[Li et al. 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122]을 참조한다.
엑소좀도 또한, 본 명세서에 기재된 조성물 및 시스템을 위한 약물 운반 비히클로서 사용될 수 있다. 검토를 위하여, 문헌[Ha et al. July 2016. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 6, Issue 4, Pages 287-296; doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001]을 참조한다.
생체 외 분화된 적혈구도 또한, 본 명세서에 기재된 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2015073587; WO2017123646; WO2017123644; WO2018102740; WO2016183482; WO2015153102; WO2018151829; WO2018009838; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]; 미국 특허 9,644,180; 문헌[Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423]; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]을 참조한다.
예를 들어, WO2018208728에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물도 또한 본 명세서에 기재된 조성물을 운반하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
조합
일 양태에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터 또는 CA벡터를 포함하는 조성물은 또한, 하나 이상의 이종성 모이어티를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터 또는 CA벡터를 포함하는 조성물은 또한, 융합물 내에 하나 이상의 이종성 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 유전 요소와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 CA벡터의 일부로서 단백질성 외부에 봉입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 CA벡터와 함께 투여될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 CA벡터 및 이종성 모이어티 중 어느 하나를 포함하는 세포 또는 조직을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 CA벡터 및 이종성 모이어티를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 바이러스(예를 들어, 이펙터(예를 들어, 약물, 소분자)), 표적화제(예를 들어, DNA 표적화제, 항체, 수용체 리간드), 태그(예를 들어, 형광단, 감광성 작용제, 예컨대 킬러레드(KillerRed)), 또는 본 명세서에 기재된 편집 또는 표적화 모이어티일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 막 전위 폴리펩티드는 하나 이상의 이종성 모이어티에 연결된다. 일 구현예에서, 이종성 모이어티는 소분자(예를 들어, 펩티드 모방체 또는 2000 달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 유기 분자), 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 나노입자, 압타머 또는 약리학적 작용제(pharmacoagent)이다.
표적화 모이어티
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 CA벡터는 표적화 모이어티, 예를 들어 표적 세포 상에 존재하는 관심 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 관심 분자 또는 세포의 특정 기능을 조절하거나, 특정 분자(예를 들어, 효소, 단백질 또는 핵산), 예를 들어 경로 내의 관심 분자의 하류의 특정 분자를 조절하거나, 표적에 특이적으로 결합하여, CA벡터 또는 유전 요소를 국재화시킬 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 특정 관심 분자와 상호작용하여 이의 기능을 증가시키거나, 감소시키거나, 또는 다르게 조절하는 치료제를 포함할 수 있다.
태그화 또는 모니터링 모이어티
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 CA벡터는 태그를 추가로 포함하여, 본 명세서에 기재된 CA벡터 또는 유전 요소를 표지하거나 모니터링할 수 있다. 태그화 또는 모니터링 모이어티는 화학적 작용제 또는 효소적 절단, 예컨대 단백질 분해 또는 인테인 스플라이싱에 의해 제거할 수 있다. 친화성 태그는 친화성 기법을 사용하여 태그화된 폴리펩티드를 정제하는 데 유용할 수 있다. 일부 예에는 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 폴리(His) 태그가 포함된다. 가용화 태그는 샤페론-결함 종, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되는 재조합 단백질이 단백질에서 적절하게 폴딩되는 것을 지원하는 것을 돕고, 이들이 침전하지 못하게 하는 데 유용할 수 있다. 일부 예는 티오레독신(TRX) 및 폴리(NANP)를 포함한다. 태그화 또는 모니터링 모이어티는 감광성 태그, 예를 들어 형광을 포함할 수 있다. 형광 태그는 시각화에 유용하다. GFP 및 이의 변이체는 형광 태그로서 흔히 사용되는 몇몇의 예이다. 단백질 태그는 특정 효소적 변형(예컨대, 비오틴 리가제에 의한 비오티닐화) 또는 화학적 변형(예컨대, 형광 영상화를 위한 FlAsH-EDT2와의 반응)이 일어나게 할 수 있다. 종종 태그화 또는 모니터링 모이어티를 조합하여, 단백질을 다수의 다른 구성성분과 연결시킨다. 태그화 또는 모니터링 모이어티는 또한 특정 단백질분해 또는 효소적 절단에 의해(예를 들어, TEV 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 또는 엔테로펩티다제에 의해) 제거될 수 있다.
나노입자
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 CA벡터는 나노입자를 추가로 포함할 수 있다. 나노입자는 약 1 내지 약 1000 나노미터, 약 1 내지 약 500 나노미터 크기, 약 1 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 75 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 및 그 사이의 임의의 범위의 크기를 갖는 무기 물질을 포함한다. 나노입자는 일반적으로, 나노규모 치수들의 복합 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 나노입자는 통상적으로 구형이지만, 나노입자 조성에 따라 상이한 형태가 가능하다. 나노입자의 외부 환경과 접촉하는 나노입자의 일부분은 일반적으로 나노입자의 표면으로서 확인된다. 본 명세서에 기재된 나노입자에서, 크기 제한은 2차원으로 제한될 수 있으며, 이에 따라, 나노입자는 약 1 내지 약 1000 nm의 직경을 갖는 복합 구조를 포함하게 되며, 여기서 특정 직경은 나노입자 조성물 및 실험 설계에 따라 의도된 나노입자의 용도에 좌우된다. 예를 들어, 치료적 응용에 사용되는 나노입자는 통상적으로 약 200 nm 이하의 크기를 갖는다.
나노입자의 바람직한 추가의 특성, 예컨대 표면 전하 및 입체적 안정화는 또한, 특정 관심 응용을 고려하여 달라질 수 있다. 임상적 응용, 예컨대 암 치료에 바람직할 수 있는 예시적인 특성은 이의 전문이 각각 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Davis et al, Nature 2008 vol. 7, pages 771-782]; 문헌[Duncan, Nature 2006 vol. 6, pages 688-701]; 및 문헌[Allen, Nature 2002 vol. 2 pages 750-763]에 기재되어 있다. 추가의 특성은 본 개시내용의 판독 시에 당업자에 의해 확인 가능하다. 나노입자 치수 및 특성은 해당 분야에 알려진 기법에 의해 검출될 수 있다. 입자 치수를 검출하기 위한 예시적인 기법은 동적 광 산란(DLS) 및 다양한 현미경관찰, 예컨대 투과 전자 현미경관찰(TEM) 및 원자력 현미경관찰(AFM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 입자 형태를 검출하기 위한 예시적인 기법은 TEM 및 AFM을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 나노입자의 표면 전하를 검출하기 위한 예시적인 기법은 제타 전위 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 화학적 특성을 검출하는 데 적합한 추가의 기법은 1H, 11B, 및 13C 및 19F NMR, UV/Vis 및 적외선/라만 분광학 및 형광 분광학(나노입자가 형광 표지와 조합하여 사용되는 경우) 및 당업자에 의해 확인 가능한 추가의 기법을 포함한다.
V. 숙주 세포
본 발명은 추가로, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터, CAV, 유전 요소, 또는 유전 요소 작제물을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 또는 숙주 세포는 식물, 곤충, 박테리아, 진균, 척추동물, 조류(예를 들어, 닭), 포유동물(예를 들어, 인간), 또는 기타 유기체 또는 세포이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 확인된 바와 같이, 제공된 CA벡터는 다양한 상이한 숙주 세포를 감염시킨다. 표적 숙주 세포는 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 기원의 세포를 포함한다. 표적 숙주 세포는, 예를 들어 상피 세포, 근육 세포, 백혈구(예를 들어, 림프구), 신장 조직 세포, 폐 조직 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 또는 숙주 세포는 CA벡터와 접촉된다(예를 들어, 이로 감염됨). 일부 구현예에서, 숙주는 포유동물, 예컨대 인간이다. 숙주 내의 CA벡터의 양은 투여 후 임의의 시간에 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양물 중 CA벡터 성장의 시간 경과가 결정된다.
일부 구현예에서, CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터는 유전 가능하다. 일부 구현예에서, CA벡터는 유체 및/또는 세포 중에서, 모체에서 아이에게 연속적으로 전달된다. 일부 구현예에서, 원래의 숙주 세포로부터의 딸 세포는 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 모체는 CA벡터를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 효율로 아이에게, 또는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 전달 효율로 숙주 세포로부터 딸 세포로 전달한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 내의 CA벡터는 감수분열 동안 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 전달 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 내의 CA벡터는 유사분열 동안 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 전달 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포 내의 CA벡터는 약 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99%, 또는 그 사이의 임의의 백분율의 전달 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, CA벡터는 숙주 세포 내에서 복제한다. 일 구현예에서, CA벡터는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포에서 복제할 수 있다. 다른 구현예에서, CA벡터는 복제 결핍 또는 복제 비적격이다.
일부 구현예에서, CA벡터가 숙주 세포에서 복제되지만, CA벡터는 숙주의 게놈 내로, 예를 들어 숙주의 염색체와 통합되지 않는다. 일부 구현예에서, CA벡터와, 예를 들어 숙주의 염색체와의 재조합 빈도는 무시할 수 있는 정도이다. 일부 구현예에서, CA벡터는, 예를 들어 숙주의 염색체와, 예를 들어 약 1.0 cM/Mb, 0.9 cM/Mb, 0.8 cM/Mb, 0.7 cM/Mb, 0.6 cM/Mb, 0.5 cM/Mb, 0.4 cM/Mb, 0.3 cM/Mb, 0.2 cM/Mb, 0.1 cM/Mb 미만의 재조합 빈도를 갖는다.
VI. 사용 방법
본 명세서에 기재된 CA벡터 및 CA벡터를 포함하는 조성물은, 예를 들어 질환, 장애 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예를 들어 인간 대상체)에서의 질환, 장애 또는 병태의 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 투여는, 예를 들어 비경구(정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 강내 및 피하를 포함함) 투여로 이루어질 수 있다. CA벡터는 단독으로 투여되거나 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
CA벡터는 단위-용량 조성물, 예컨대 단위 용량 비경구 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 혼합에 의해 제조되며, 비경구 투여를 위하여 적합하게 조정될 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어 주사 및 주입 용액 또는 현탁액 또는 좌제 또는 에어로졸의 형태로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CA벡터 또는 이를 포함하는 조성물의 투여는 CA벡터에 의해 포함되는 유전 요소가, 예를 들어 대상체 내의 표적 세포로 운반되게 할 수 있다.
예를 들어, 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 포함하는 본 명세서에 기재된 CA벡터 또는 이의 조성물을 사용하여 이펙터를 세포, 조직 또는 대상체에 운반할 수 있다. 일부 구현예에서, CA벡터 또는 이의 조성물을 사용하여, 이펙터를 골수, 혈액, 심장, GI 또는 피부에 운반한다. 본 명세서에 기재된 CA벡터 조성물의 투여에 의한 이펙터의 운반은 세포, 조직, 또는 대상체에서 비코딩 RNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 조절할 수 있다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킬 수 있다). 이러한 방식으로의 발현 수준의 조절은 이펙터가 운반되는 세포에서 기능적 활성의 변경을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절된 기능적 활성은 효소적, 구조적 또는 조절적 성질을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, CA벡터 또는 이의 카피는 세포로의 운반 후 24시간(예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 30일 또는 1개월)에 세포에서 검출 가능하다. 구현예에서, CA벡터 또는 이의 조성물은 표적 세포 상에서 효과를 매개하며, 효과는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 2, 3 또는 4주 또는 1, 2, 3, 6 또는 12개월 동안 지속된다. (예를 들어, CA벡터 또는 이의 조성물이 외인성 단백질을 인코딩하는 유전 요소를 포함하는) 일부 구현예에서, 효과는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 2, 3 또는 4주 또는 1, 2, 3, 6 또는 12개월 미만 동안 지속된다.
본 명세서에 기재된 CA벡터, 또는 CA벡터를 포함하는 조성물로 치료될 수 있는 질환, 장애, 및 병태의 예는 제한 없이, 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질환, 염증성 장애, 자가면역 병태, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암, 비-소세포 폐암, 예를 들어, mIR-625, 예를 들어 카스파제-3에 반응성인 유전자를 발현하는 종양), 및 위장 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는 CA벡터가 접촉되는 세포 내에서 활성 또는 기능을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 일부 구현예에서, CA벡터는 CA벡터가 접촉되는 세포에서 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 수준 또는 활성을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 일부 구현예에서, CA벡터는 CA벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어 암 세포의 생존력을, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 구현예에서, CA벡터는 CA벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어 암 세포의 생존력을, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 감소시키는 이펙터, 예를 들어 miRNA, 예를 들어 miR-625를 포함한다. 일부 구현예에서, CA벡터는, 예를 들어 카스파제-3 활성을 증가시킴으로써, CA벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어 암 세포의 아폽토시스를, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, CA벡터는, 예를 들어 카스파제-3 활성을 증가시킴으로써, CA벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어 암 세포의 아폽토시스를, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 증가시키는 이펙터, 예를 들어 miRNA, 예를 들어 miR-625를 포함한다.
VII. 투여/운반
조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 포함하는 약제학적 조성물)은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 및/또는 발열원-무함유일 수 있다. 약제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본 명세서에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 제공되는 약제학적 조성물의 설명이 주로 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물로의, 예를 들어 비-인간 동물, 예를 들어 비-인간 포유동물로의 투여에 적합하다는 것을 당업자라면 이해할 것이다. 조성물이 다양한 동물로의 투여에 적합하게 만들기 위해 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물을 변형하는 것이 충분히 이해되며, 숙련된 수의학 약리학자는 존재한다면, 단지 일상적인 실험을 사용하여 이러한 변형을 설계하고/설계하거나 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 기타 영장류; 포유동물, 예컨대 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 래트; 및/또는 조류, 예컨대 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나, 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분이 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되게 한 다음, 필요하면 그리고/또는 바람직하면, 생성물을 나누고/나누거나, 성형하고/하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체로 CA벡터를 운반하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 CA벡터는 대상체에서 복제한다(예를 들어, 대상체의 바이러스체의 일부가 됨).
약제학적 조성물은 야생형 또는 고유 바이러스 요소 및/또는 변형된 바이러스 요소를 포함할 수 있다. CA벡터는 하나 이상의 CAV 서열(예를 들어, 핵산 서열 또는 이의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 이에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 CAV 서열을 포함할 수 있다. CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 CAV 서열(예를 들어, CAV VP1 핵산 서열)에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV 아미노산 서열(예를 들어, CAV VP1 분자의 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. CA벡터는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, CAV 아미노산 서열(예를 들어, CAV VP1 분자의 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CA벡터는 내인성 유전자 및 단백질 발현을 기준, 예를 들어 건강한 대조군과 비교하여, 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상 증가(자극)시키기에 충분하다. 특정 구현예에서, CA벡터는 내인성 유전자 및 단백질 발현을 기준, 예를 들어 건강한 대조군과 비교하여, 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상 감소(저해)시키기에 충분하다.
일부 구현예에서, CA벡터는 숙주 또는 숙주 세포에서 하나 이상의 바이러스 특성, 예를 들어 향성, 감염성, 면역억제/활성화를 기준, 예를 들어 건강한 대조군과 비교하여, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상 저해/향상시킨다.
일부 구현예에서, 바이러스 유전 정보에서 표현되지 않는 하나 이상의 바이러스 주를 추가로 포함하는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 CA벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 바이러스 감염을 조절하기에 충분한 용량 및 시간으로 투여된다. 바이러스 감염의 일부 비-제한적인 예는 아데노-연관 바이러스, 아이치(Aichi) 바이러스, 호주 박쥐 리사 바이러스(lyssavirus), BK 폴리오마바이러스(polyomavirus), 반나 바이러스(Banna virus), 바르마 포레스트(Barmah forest) 바이러스, 부니아무에라(Bunyamwera) 바이러스, 부니아바이러스 라 크로세(Bunyavirus La Crosse), 부니아바이러스 스노우슈 하레(Bunyavirus snowshoe hare), 세르코피테신 헤르페스바이러스(Cercopithecine herpesvirus), 찬디푸라 바이러스(Chandipura virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 코사바이러스(Cosavirus) A, 우두 바이러스, 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 크리민-콩고 출혈성 열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 뎅기(Dengue) 바이러스, 도리(Dhori) 바이러스, 더그비(Dugbe) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 에볼라바이러스, 에코바이러스(Echovirus), 뇌심근염(Encephalomyocarditis) 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스, GB 바이러스 C/G형 간염 바이러스, 한탄(Hantaan) 바이러스, 헨드라(Hendra) 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 간염 델타 바이러스, 마두 바이러스, 인간 아데노바이러스, 인간 아스트로바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 엔테로바이러스 68, 인간 엔테로바이러스 70, 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 2, 인간 헤르페스바이러스 6, 인간 헤르페스바이러스 7, 인간 헤르페스바이러스 8, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 파필로마바이러스 1, 인간 파필로마바이러스 2, 인간 파필로마바이러스 16, 인간 파필로마바이러스 18, 인간 파라인플루엔자, 인간 파보바이러스 B19, 인간 호흡기 융합 바이러스, 인간 리노바이러스, 인간 SARS 코로나바이러스, 인간 스푸마레트로바이러스(spumaretrovirus), 인간 T-림포트로픽 바이러스, 인간 토로바이러스(torovirus), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 이스파한(Isfahan) 바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 주닌 아레나바이러스(Junin arenavirus), KI 폴리오마바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 라고스(Lagos) 박쥐 바이러스, 레이크 빅토리아 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 란가트(Langat) 바이러스, 라사(Lassa) 바이러스, 로즈데일(Lordsdale) 바이러스, 라우핑 일(Louping ill) 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 마이아로(Mayaro) 바이러스, MERS 코로나바이러스, 홍역 바이러스, 멘고(Mengo) 뇌심근염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스(Merkel cell polyomavirus), 모콜라(Mokola) 바이러스, 전염성 연속종 바이러스, 원두 바이러스, 볼거리 바이러스, 무레이 밸리(Murray valley) 뇌염 바이러스, 뉴욕 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 오뇽-뇽(O'nyong-nyong) 바이러스, 올프(Orf) 바이러스, 오로퓨스(Oropouche) 바이러스, 피친데(Pichinde) 바이러스, 폴리오바이러스, 푼타 토로 플레보바이러스(Punta toro phlebovirus), 푸말라(Puumala) 바이러스, 광견병 바이러스, 리프트계곡열 바이러스, 로사바이러스(Rosavirus) A, 로스 강(Ross river) 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B, 로타바이러스 C, 풍진 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 살리바이러스(Salivirus) A, 모래파리 열 시실리안(Sandfly fever sicilian) 바이러스, 삿포로(Sapporo) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스, 서울(Seoul) 바이러스, 유인원 포미(Simian foamy) 바이러스, 유인원 바이러스 5, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 사우샘프턴(Southampton) 바이러스, 세인트 루이스 뇌염(St. louis encephalitis) 바이러스, 틱-본 포와산(Tick-borne powassan) 바이러스, 토르크 테노 바이러스, 토스카나(Toscana) 바이러스, 우우쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스, 백시니아 바이러스, 바리셀라-조스터(Varicella-zoster) 바이러스, 바리올라(Variola) 바이러스, 베네주엘란(Venezuelan) 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 야바(Yaba) 원숭이 종양 바이러스, 야바-유사 질병 바이러스, 황열 바이러스 및 지카 바이러스를 포함한다. 특정 구현예에서, CA벡터는 대상체에 이미 존재하는 바이러스를, 예를 들어 기준과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상 능가하고/능가하거나 대체하기에 충분하다. 특정 구현예에서, CA벡터는 만성 또는 급성 바이러스 감염과 경쟁하기에 충분하다. 특정 구현예에서, CA벡터는 바이러스 감염으로부터 보호하기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 바이러스전(provirotic)). 일부 구현예에서, CA벡터는 (예를 들어, 표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 다른 바이러스와의 경쟁, 질환 상태 등을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상) 조절하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, "치료", "치료하는" 및 이의 동족어는 (예를 들어, CA벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 CA벡터를 투여함으로써), 예를 들어 질환, 병리학적 병태, 또는 장애를 개선하거나, 호전시키거나, 안정화시키거나, 예방하거나 치유하기 위한 의도를 갖는 대상체의 의학적 관리를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 적극 치료(질환, 병리학적 병태, 또는 장애를 개선하고자 하는 치료), 원인 치료(연관 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 원인을 대상으로 하는 치료), 완화 치료(증상의 경감을 위해 설계된 치료), 예방적 치료(연관 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 예방, 최소화, 또는 이의 발생을 부분적으로 또는 완전히 억제하고자 하는 치료), 및/또는 지지 치료(또 다른 치료법을 보충하기 위해 이용되는 치료)를 포함한다.
재투약
본 명세서에 기재된 CA벡터는 일부 예에서 다수 용량(예를 들어, 개별적으로 투여되는 용량)으로 투여될 수 있는 운반 비히클로 사용될 수 있다. 이론에 구속되고자 하지 않지만, 일부 구현예에서, CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)는 상대적으로 낮은 면역 반응(예를 들어, 실시예 12에서 관찰된 바와 같은, 예를 들어 50% GMT 값으로서 측정됨)을 유도하여, 예를 들어 하나 이상의 CA벡터(예를 들어, 동일한 CA벡터 또는 상이한 CA벡터의 다수 용량)로 대상체에게 반복 투약하는 것을 가능하게 한다. 일 양태에서, 본 발명은 대상체에게 제1 복수의 CA벡터 및 그 다음 제2 복수의 CA벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 이펙터를 운반하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제2 복수의 CA벡터는 제1 복수의 CA벡터와 동일한 단백질성 외부를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 이펙터를 받을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 선택하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 포함하는 제1 복수의 CA벡터를 이전에 받았거나 받은 것으로 확인되었고, 방법은 이펙터(예를 들어, 제1 복수의 CA벡터의 유전 요소에 의해 인코딩된 것과 동일한 이펙터, 또는 제1 복수의 CA벡터의 유전 요소에 의해 인코딩된 것과 상이한 이펙터)를 인코딩하는 유전 요소를 포함하는 제2 복수의 CA벡터를 받을 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 제2 복수의 CA벡터를 받기에 적합한 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 확인하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체가 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 포함하는 제1 복수의 CA벡터를 이전에 받은 것으로 확인하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 복수의 CA벡터를 받은 것으로 확인된 대상체는 대상체가 제2 복수의 CA벡터를 받기에 적합한지를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제2 복수의 CA벡터는 제1 복수의 CA벡터의 CA벡터와 공통인 적어도 하나의 표면 에피토프를 갖는 단백질성 외부를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 복수의 CA벡터 및 제2 복수의 CA벡터는 동일한 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 복수의 CA벡터 및 제2 복수의 CA벡터는 상이한 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 보유한다.
일부 구현예에서, 제2 복수는 (예를 들어, 투여 시점에 대상체의 체질량에 대하여 정규화될 때) 제1 복수와 거의 동일한 양 및/또는 농도의 CA벡터를 포함하고, 예를 들어 제2 복수는 투여 시점에 대상체의 체질량에 대하여 정규화될 때 제1 복수의 CA벡터의 수의 90 내지 110%, 예를 들어 95 내지 105%를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 복수는 제2 복수보다 더 많은 투약량의 CA벡터를 포함하며, 예를 들어 제1 복수는 제2 복수에 비해 더 많은 양 및/또는 농도의 CA벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 복수는 제2 복수보다 더 적은 투약량의 CA벡터를 포함하며, 예를 들어 제1 복수는 제2 복수에 비해 더 적은 양 및/또는 농도의 CA벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 제1 및 제2 복수의 CA벡터의 투여 사이에, 예를 들어 제1 복수, 또는 이의 자손으로부터의 CA벡터의 존재(예를 들어, 지속성)에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 제1 복수, 또는 이의 자손으로부터의 CA벡터의 존재가 검출되지 않는 경우에 제2 복수의 CA벡터가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 제2 복수는 대상체에게 제1 복수의 투여 후 적어도 1, 2, 3, 또는 4주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 또는 20년 후에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 복수는 대상체에게 제1 복수의 투여 후 1 내지 2주, 2 내지 3주, 3 내지 4주, 1 내지 2개월, 3 내지 4개월, 4 내지 5개월, 5 내지 6개월, 6 내지 7개월, 7 내지 8개월, 8 내지 9개월, 9 내지 10개월, 10 내지 11개월, 11 내지 12개월, 1 내지 2년, 2 내지 3년, 3 내지 4년, 4 내지 5년, 5 내지 10년, 또는 10 내지 20년 후에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년의 과정에 걸쳐 아넬로벡터의 반복 용량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제1 복수의 투여 후 및 제2 복수의 투여 전에 하기 중 하나 이상을 평가하는 단계를 추가로 포함한다:
a) (예를 들어, ELISA에 의해, 예를 들어 단백질 이펙터의 검출에 의한; 예를 들어, RT-PCR에 의해, 핵산 이펙터의 검출에 의한, 또는 이펙터의 하류 효과, 예를 들어 이펙터에 의해 영향을 받는 내인성 유전자의 수준의 검출에 의한) 대상체 내 이펙터의 수준 또는 활성;
b) (예를 들어, CA벡터의 VP1의 수준의 검출에 의한) 대상체 내 제1 복수의 CA벡터의 수준 또는 활성;
c) 아넬로벡터가 치료를 위해 투여된 대상체 내에서의 질환의 존재, 중증도, 진행, 또는 징후 또는 증상; 및/또는
d) CAV 또는 CA벡터에 대한 면역 반응, 예를 들어 중화 항체의 존재 또는 수준.
일부 구현예에서, 방법은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 제3, 제4, 제5, 및/또는 추가의 복수의 CA벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 복수 및 제2 복수는 동일한 투여 경로를 통해, 예를 들어 정맥내 투여를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 복수 및 제2 복수는 상이한 투여 경로를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 복수 및 제2 복수는 동일한 실체(예를 들어, 동일한 건강 관리 제공자)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 복수 및 제2 복수는 상이한 실체(예를 들어, 상이한 건강 관리 제공자)에 의해 투여된다.
본 명세서에 언급된 모든 참고문헌 및 간행물은 본 명세서에 참조로 포함된다.
하기의 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않으며; 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법, 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 실시예의 예시적인 성질에 의해 이해될 것이다.
실시예
목차
실시예 1: 재조합 합성 CAV의 구제 및 조류 세포에서의 계대
실시예 2: 탠덤 CAV 작제물
실시예 3: 조류 및 인간 세포에 결합하는 CAV
실시예 4: 예시적인 CA벡터 유전 요소의 설계 및 구축
실시예 5: 야생형 CAV를 사용한 CA벡터의 구제
실시예 6: 상청액으로부터 CA벡터의 정제
실시예 7: CA벡터는 인간 세포를 형질도입한다
실시예 8: 중화 항체에 대한 CA벡터의 내성
실시예 9: CAV 야생형 CAV 없이 CA벡터의 생성
실시예 10: 마우스에 주입하기 위한 nLuc CA벡터의 생성
실시예 11: 다수 기관에서 페이로드 DNA의 운반을 초래하는, 마우스에 대한 생체내 CA벡터의 투여
실시예 12: CA벡터 대 AAV2를 받은 마우스에서 면역원성
실시예 13: CAV-유사 입자(VLP)는 정제된 캡시드 단백질로부터 시험관 내에서 조립된다
실시예 14: CA벡터는 후기 엔도솜 경로를 통해 MDCC-MSB1 세포에 유입된다
실시예 15: 열 처리 후 및 4℃에서 보관 후 CA벡터 생존력
실시예 16: 탠덤 플라스미드를 사용한 CA벡터의 회수
실시예 1: 재조합 합성 CAV의 구제 및 조류 세포에서의 계대
본 실시예에서, 재조합 합성 닭 빈혈 바이러스(CAV)를 합성 게놈으로부터 합성하였다. 합성 게놈으로부터 생존 가능한 CAV를 구제하기 위해, CAV 플라스미드 DNA를 시험관 내 환화(IVC)하여 벡터 백본을 제거하고, 닭 세포에 형질감염시킨 다음, 생성된 감염됨 세포를 신선한 세포로 반복적으로 계대하였다. 간략하게, MDCC-MSB1 세포를 p637(음성), pCAV, 또는 pCAV-IVC 작제물로 전기천공하였다. 세포를 감염되지 않은 MDCC-MSB1 세포가 있는 신선한 배지로 분할하고, 이어서 48시간마다 세포를 분할하였다. 반복된 분할 단계로 계대 0(P0), 계대 1(P1), 계대 2(P2), 및 그 이상을 생성하였다. 환형 이중-가닥 CAV 게놈 DNA가 세포에 제공될 때에만 바이러스 회수가 검출됨을 나타내기 위하여 대조군 DNA(하기 기재됨)를 유사하게 처리하였다(도 1 및 4). 정량적 PCR(qPCR), 감염된 세포의 현미경 검사, 농축된 바이러스 현탁액의 전자 현미경관찰, 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 CAV가 세포에서 복제되고 있음을 나타내었다.
이중-가닥 게놈의 준비
야생형 CAV 균주 Cuxhaven 1의 게놈을 2,319 bp EcoRI 단편으로 시험관 내에서 합성한 다음, 플라스미드 pUC57에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드(pRTx-708)를 이. 콜라이에서 증식시키고 표준 방법에 따라 정제하였다. 플라스미드(75 μg)를 EcoRI 및 PvuI로 분해하고 2.3 kb 밴드를 아가로스 겔에서 절제하였다. 겔 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 CAV 게놈 dsDNA를 추출하고 T4 DNA 리가제(NEB)를 사용한 결찰 반응을 5 mL의 부피로 수행하여 CAV 이중-가닥 게놈을 환화시켰다. 16℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 표준 방법에 따라 DNA를 에탄올 침전시키고 100 μL의 물에 재현탁시켰다. DNA 용액을 초순수에 대하여 1시간 동안 투석하였다(Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units 10,000 MWCO, 10 내지 100 μl 카탈로그 번호 69576).
2개의 음성 대조군 DNA 샘플을 또한 준비하였다. 하나의 음성 대조군은 CAV 게놈 플라스미드 pRTx-708이었고, 이는 이. 콜라이로부터 정제 후 상기 기재된 바와 같이 박테리아 백본을 제거하기 위해 처리하지 않았다. 또 다른 음성 대조군은 캡시드 단백질 VP1을 코딩하는 유전자가 결실된 플라스미드 pRTx-637이었다.
CAV 게놈의 형질감염
각각의 조건에 대해, 2.5 ug의 DNA를 106개의 살아있는 MDCC-MSB1 세포(ATCC)에, 또는 약 2.5 pg/세포로 첨가하고, 제조업체의 지침에 따라 큰 큐벳(106개 세포/큐벳) 및 프로그램 DS-137을 이용하는 4D-Nucleofector System(Lonza)을 사용한 전기천공에 의해 운반하였다. 각각의 조건에 대해, 형질감염된 세포를 권장된 바와 같이 회수하고, T25 플라스크에 10% FBS를 포함하는 5 mL RPMI의 최종 배양 부피로 옮겼다. 형질감염된 세포를 가습된 40℃/5% CO2 인큐베이터에서 2 내지 3일 동안 성장시켰다. 이 단계의 생성물을 본 명세서에서 계대 0(P0)으로 지칭한다.
형질감염/감염된 세포의 수확 및 계대
qPCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포 현탁액의 2개 분취액을 취하여 P0 세포 현탁액(약 5 mL)을 수확한 다음, 1.5 mL의 세포 현탁액을 새로운 플라스크로 옮기고 7 mL의 최종 부피의 신선한 세포를 사용하여 세포 수를 2x105개 세포/mL로 만든 다음, 40℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이 과정을 4 계대 동안 반복하였다.
바이러스 역가의 측정
샘플 튜브에 200 μL의 용해 완충액 및 25 μL의 프로테이나제 K를 직접 첨가함으로써 PureLink 바이러스 DNA/RNA 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 세포 현탁액 샘플(200 μL)을 정제하였다. 제조업체의 권장사항에 따라 Thermo Fisher TaqMan 시약 및 QuantStudio 실시간 qPCR 기기를 사용하여 수행된 TaqMan qPCR에 의해 카피/ml를 평가하였다.
사용된 프라이머 및 프로브:
CAV 정방향: 5'-TTGGAAACCCCTCACTGCAGAG-3'
CAV 역방향: 5'-CTGAATTGTCCGCAGTTGCAG-3'
CAV VP1 프로브: 5'-6FAM-CTGGAATTACAATCACTCTAT-MGBNFQ-3'
계대 0, 1, 2, 및 4로부터의 샘플에 대하여 분석을 수행하였다(P1 내지 4; 도 1). 원래 IVC CAV DNA로 형질감염된 세포 유래의 샘플만 계대 수 경과에 따라 CAV 카피수의 증가를 나타내었다. 이는 CAV DNA의 복제 및 신선한 세포로의 전달이 발생하였음을 나타내었다.
웨스턴 블롯에 의한 바이러스 단백질의 검출
CAV 단백질 발현을 분석하기 위해, SDS 샘플 완충액을 사용하고 10분 동안 끓여서 각각의 샘플의 30 ul를 환원시키고 변성시켰다. 그 다음 샘플을 BOLT 4 내지 12% Bis-Tris 겔(Thermo Fisher)에 로딩하고 공급업체가 권장한 바와 같이 40분 동안 전기영동하였다. 겔을 물에서 5분 동안 세척하고 iBlot2 시스템을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 TBS-T로 5분 동안 세척하고 Li-Cor TBS 차단 완충액을 이용하여 1시간 동안 차단하였다. TBS 차단 완충액에 1:100으로 희석된 토끼 항-아폽틴(VP3; Abcam, Ab193612) 및 항-VP2 혈청(Cusabio Technology, CSB-PA302471LA01CID)의 혼합물과 함께 차단된 막을 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션함으로써 검출을 수행하였다. 세척 후, 염소 항-토끼 IRDye 680 2차 항체 (LI-COR Biotechnology)를 막에 적용하고, 세척한 다음, Li-Cor Odyssey 기기를 사용하여 영상화하였다. 도 1은 IVC CAV-형질감염 세포(P0)로부터 유래된 P1 및 P2 세포가 2가지 CAV 단백질에 대해 양성이었으나, 다른 형질감염으로부터 유래된 샘플은 그렇지 않음을 나타낸다.
감염된 세포의 특성화
P4로부터의 세포 샘플을 위상차 현미경으로 관찰하여 세포 형태를 조사하였다. IVC CAV 샘플의 세포는 정상적인 외관을 가진 대조군 샘플의 세포와 대조적으로, 확대되고 여러 개의 세포질 내포물을 갖는 것으로 자주 발견되었다.
구제된 CAV의 단리
별도의 실험에서, MDCC-MSB1 세포를 형질감염시키고 상기 기재된 바와 같이 P2로 2회 계대하였다. 전기천공에 의해 CAV IVC 또는 p637을 MDCC-MSB1 세포로 형질감염시킨 후, 형질감염된 세포를 2회 계대하고(P0에서 P2로; 감염되지 않은 MDCC-MSB1 세포가 있는 새로운 배지로의 분할을 48시간마다 수행함) P2에서 생성된 계대된 세포를 동결-해동에 의해 용해시켜 용해물을 생성하고 이를 신선한 MDCC-MSB1 세포를 감염시키는 데 사용하였다. 이들 세포로부터의 바이러스 수확물은 P3에 해당한다. CAV IVC 또는 음성 대조군 세포로부터의 세포 현탁액을 동결-해동하여 용해시키고 이를 신선한 세포에 적용한 다음 40℃ 및 5%CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 위상차 현미경으로 검사하였으며 CAV IVC-유래 용해물로 감염된 세포에서만 명확한 세포 변성 효과가 나타났다. 구체적으로, p637로부터 유래된 P2에 노출된 세포는 정상적인 형태를 나타낸 반면, IVC CAV DNA로부터 유래된 P2에 노출된 세포는 감염된 세포의 통상적인 형태를 나타내었다. P2 및 P3 분취액의 qPCR 분석에 기반하여, CAV 게놈 카피 수는 CAV IVC-유래 용해물을 받은 세포에서만 P2(도 2에 "투입"으로 표지됨)에서 P3("배출")으로 증가하였다. 이러한 관찰은 감염성 CAV를 야기하는 CAV IVC DNA와 일치하였다.
CAV-감염 P3 세포 현탁액을 0.5% Triton X-100으로 용해시키고, 벤조나제로 처리한 다음, 20% 수크로스 쿠션을 통한 침강 초원심분리에 의해 펠렛화하였다. 그 다음 재현탁된 펠렛을 등밀도 초원심분리를 위한 선형 CsCl 구배에 적용하고 구배로부터의 분획을 qPCR(도 3) 및 감염성(도 4)에 의한 특성화를 위해 수확하였다. 약 1.32 g/mL의 밀도 구배의 피크로 CAV 게놈 카피를 검출하였다(도 3).
피크 분획을 인접하는 2개의 분획과 함께 풀링하고, 투석하여 CsCl을 제거한 다음, 생성된 정제된 바이러스 현탁액을 5000배 또는 50,000배 희석 후 신선한 세포에 첨가하였다. 동일한 방식으로 희석된 음성 대조군 용해물을 사용하여 허위 정제 및 감염을 동시에 수행하였다. 6일에 걸쳐 매일 취한 세포 배양 샘플의 qPCR에 의해 측정될 때, 음성 대조군의 희석물은 감염 징후를 나타내지 않았다(도 4). 그러나, 5000배 CAV 희석물로 감염된 배양 샘플은 2일 후에 시작하여 명백히 양성이었다. 이는 감염성 CAV가 합성 IVC DNA-형질감염 MDCC-MSB1 세포로부터 유래되었음을 확인시켜주었다.
전자 현미경관찰
MDCC-MSB1 세포를 CAV로 감염시키고, 인큐베이션시킨 다음 본질적으로 문헌[Todd et al. 1990]에 의해 기재된 바와 같이 처리하였다. 바이러스 현탁액을 음성 균주 전자 현미경으로 영상화하여, 다수의 바이러스 입자를 밝혔다(도 5).
실시예 2: 탠덤 CAV 작제물
일련의 예시적인 CAV 탠덤 작제물을 생성하였다(도 6a). 간략하게, 탠덤 작제물은 플라스미드 백본, 및 CAV 게놈의 2개 전체 카피 또는 1개의 전체 카피 및 1개의 부분 카피 중 하나를 포함하였다. 각각의 CAV 탠덤 작제물을 뉴클레오펙션에 의해 MDCC-MSB1 세포 내로 도입하였다. 이는 P0 배양이었다. 200 μl의 세포 현탁액을 하류 qPCR을 위해 뉴클레오펙션 후 제2일 및 제3일에 수집하였다. 제3일에, 세포 현탁액을 신선한 MDCC-MSB1 세포에 1:10의 비로 계대하여 P1 배양을 시작하였다. P1 배양의 제2일에, 200 μl의 현탁액을 qPCR을 위해 수집하고, 나머지 세포를 DNA 추출 및 서던 블롯팅을 위해 펠렛화하였다. CAV 프로브를 사용하여 P0 및 P1 배양 샘플에 대해 qPCR을 수행하였다. pRTX-1114 내지 1116에 대한 계대 시 복제의 증가가 관찰되었다. pRTX1113, 1118, 및 1119에 대해서는 더 작은 증가가 관찰되었다(도 6b). P1 샘플로부터의 세포 펠렛을 서던 블롯팅에 의해 분석하였다. 백본 절단 또는 DpnI 분해 DNA를 겔에서 실시하고, 막으로 옮긴 다음, CAV 및 래더에 대한 무작위 헥사머로 제조된 비오틴-표지 프로브로 조사하였다. 스트렙타비딘-IRDye-800을 첨가하고, 결과는 LiCor Odyssey에서 영상화하였다. 이 실험의 결과는 qPCR 데이터와 일치하였다. pRTX-1117 및 pRTX-1121을 포함하는 것을 제외한 모든 레인에서 dsDNA 원이 관찰되었다(도 6c). 밴드는 DpnI 내성이었으며, 이는 게놈의 복제를 나타내었다. 야생형 CAV 바이러스도 또한 회수하였다.
이 결과는 CAV 게놈의 전체 또는 부분 카피를 백본 및 전체 CAV 게놈을 포함하는 플라스미드에 첨가하면 바이러스 역가를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 조류 및 인간 세포에 결합하는 CAV
인간 세포주의 패널에 결합하는 CAV의 능력을 스크리닝하였다. MCF-7(인간 유방암), MRC5(폐 섬유아세포), EKVX(폐 선암종), Raji(B 림프모구), Jurkat(T 림프모구), 및 MDCC(닭 림프모구, 양성 대조군) 세포를 이중으로 테스트하였다. 각각의 세포 유형에 대해, 2 x 105개 세포를 CAV(MOI = 세포당 1.5개 CAV 입자)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 트립신 대조군을 수행하였으며, 여기서 각각의 조건을 트립신으로 처리하여 결합된 비리온을 제거하고 배경을 확립하였다. DNA를 추출하고, qPCR을 수행하여 각각의 세포 유형에 결합된 바이러스 게놈의 수를 결정하였다. 트립신 배경을 차감하고, MDCC 대조군에 대해 정규화된 결합 백분율로 값을 플롯팅하였다(도 7). 결과는 CAV가 Raji 세포 및 EKVX 세포에 결합하였음을 나타내었다. 이러한 데이터는 CAV가 인간 세포에 특이적으로 결합할 수 있으며, CAV가 인간 세포에 유입될 수 있다는 것과 일치함을 나타낸다.
실시예 4: 예시적인 CA벡터 유전 요소의 설계 및 구축
추정 벡터를 생성하기 위해, 스캐닝 접근법을 바이러스 복제 및 패키징에 필요한 영역을 발견하기 위해 CAV 게놈을 분석하는 데 사용하였다. 간략하게, 988 bp 리포터 카세트를 스태거형 200 bp 간격의 CAV 게놈에 삽입하였다(도 8a 내지 8b). SV40 프로모터, 나노-루시퍼라제(nLuc) ORF, 및 SV40 종결자를 포함하는 리포터는 CAV 게놈의 상응하는 영역을 대체하여, 야생형 CAV 게놈 길이를 유지하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이 총 8개의 nLuc 삽입 작제물을 설계하였다. 각각의 nLuc 작제물의 서열이 상기 표 2 내지 9에 나타나 있다. 작제물을 화학적으로 합성하고, pUC57-미니 플라스미드로 클로닝한 다음, 플라스미드 백본으로부터 제한 분해하고, 시험관 내 환화(IVC)하였다. 그 다음 이들 플라스미드는 단백질성 외부로 패키징될 수 있는 능력에 대해 테스트될 엔지니어링된 CAV-기반 유전 요소를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이에 의해 엔지니어링된 CAV 벡터(본 명세서에 CA벡터로 지칭함)를 형성할 수 있다.
실시예 5: 야생형 CAV를 사용한 CA벡터의 구제
본 실시예는 외인성 유전자를 포함하는 CA벡터에 CAV 단백질을 트랜스로 제공하는 것을 입증한다. 생성된 CA벡터는 외인성 유전자를 표적 세포로 운반할 수 있었다.
실시예 4에 기재된 바와 같이 설계된 CA벡터 게놈을 시험관 내 환화(IVC)에 의해 생성한 다음 탠덤 CAV 게놈을 인코딩하는 플라스미드(pRTX-966) 또는 VP1 코딩 영역은 결실되었지만 VP2 및 VP3은 유지된 부분 CAV 게놈을 인코딩하는 플라스미드(pRTX-637)를 이용하여 1:1의 비로 MDCC-MSB1 세포에 동시-형질감염시켰다. 대조군으로서, pRTX-966 또는 pRTX-637을 이용하여 WT CAV IVC를 또한 동시-형질감염시켰다. 조건당 뉴클레오펙션을 통해 5x106개의 총 세포를 형질감염시키고 10% FBS가 포함된 25 mL RPMI에서 인큐베이션하였다. 3일 후, nLuc의 생성을 확인하고, 세포 상청액을 수확한 다음, 상청액을 원심분리에 의해 정화하였다. 그 다음 정화된 상청액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.
벡터 구제가 발생했는지 여부를 테스트하기 위해, 여과된 상청액을 48-웰 플레이트에서 30분 동안 1x105개의 MDCC-MSB1 세포와 함께 인큐베이션한 후, 3회 세척하였다. 그 다음 형질도입이 발생하였는지(제0일)를 결정하기 위해서뿐만 아니라, 그 후 24시간 증분으로(제1일 및 제2일) 발광을 측정하였다(도 9a). 제0일 판독은 nLuc 배경 측정값을 제공하는 한편, 제1일 및 제2일은 형질도입으로부터 생성된 nLuc를 측정한다. 발광을 측정하기 전에, 형질도입된 세포를 PBS로 3회 세척하여 샘플에서 배경 nLuc를 감소시켰다. 발광 측정을 용해된 세포에 대해 수행하여 nLuc 신호를 강화하였다. 대조군 샘플(pRTX-637)에서는, 제0일부터 제2일까지 발광 증가가 없었으며, 이는 VP1의 부재 하에 벡터가 형성되지 않았음을 나타낸다(도 9b). 탠덤 CAV로 동시-형질감염된 샘플에서, CAV-nLuc4, 5, 및 7의 경우 제0일부터 제2일까지 발광 증가가 관찰되었고, CAV-nLuc6의 경우 제0일부터 제1일까지 증가가 관찰되었다(도 9c). 이는 이러한 IVC CA벡터 게놈이 탠덤 게놈 유래의 WT CAV의 존재 하에 복제 및 패키징을 겪을 수 있음을 나타내었다. 또한, CAV-nLuc1, 2, 3, 또는 8에 대한 발광 증가가 없다는 것은 이들 작제물에서 CA벡터 삽입에 의해 파괴된 영역이 복제 및/또는 패키징에 필요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
실시예 6: 상청액으로부터 CA벡터의 정제
상청액 CA벡터 입자를 농축시키고 계속 남은 nluc를 추가로 감소시키기 위해, 10 ml의 CA벡터 상청액으로 20% 수크로스 쿠션 상에 층을 형성하고 31,000 rpm에서 3시간 동안 원심분리하여 바이러스 및 벡터 입자를 펠렛화하였다. 상청액 및 수크로스를 제거하고, 펠렛을 PBS에서 밤새 재현탁시켰다. CAV 및 CA벡터용 프로브를 사용하여 재현탁된 펠렛에 대해 DNase 보호 분석을 수행하였다. 이것으로 약 1x108개 벡터/ml의 농도에서 CA벡터 입자의 성공적인 정제를 확인하였다(도 10a). 가이드로서 CA벡터 DNase 보호 분석을 사용하여, MDCC-MSB1 세포를 세포당 3개 CA벡터 게놈의 표준화된 양을 사용하여 형질도입하였다. 3x105개 CA벡터 게놈을 1x105개 MDCC-MSB1 세포와 함께 48-웰 플레이트에서 30분 또는 48시간 동안 인큐베이션하고 형질도입이 발생하였는지를 결정하기 위해 3회 PBS 세척 단계 후 발광을 측정하였다. 제0일의 결과는 배경 nLuc 신호가 감소되었음을 나타내었다(도 10b). 또한, 제2일의 결과로 CAV-nLuc4 내지 7이 MDCC-MSB1 세포를 형질도입하는 벡터를 산출하였음을 확인하였다. 제2일의 발광 값은 CAV-nluc4 내지 7 간에 유사하였으며, 이는 이들 벡터가 유사한 효율로 세포를 형질도입하였음을 나타낸다. 이 결과는 또한 nluc4의 나노루시퍼라제 카세트의 5'-최말단과 작제물 nluc7의 카세트의 3'-최말단에 걸쳐 있는 창(window)을 정의하며, 여기서 이식유전자는 CAV 게놈에 삽입되어 형질도입-적격 벡터를 성공적으로 회수할 수 있다.
실시예 7: CA벡터는 인간 세포를 형질도입한다
본 실시예에서, CA벡터가 Raji 또는 Jurkat 세포를 형질도입할 수 있는지 여부를 평가하였다. CAV-nluc4 및 CAV-nluc6을 테스트 대상으로 사용하였고, CAV-nluc1, CAV WT, 및 p637 + nluc 6을 예상 음성 대조군으로 사용하였다. 허위-형질도입 세포를 또한 추가 음성 대조군으로 사용하였다. 3x105개 CA벡터 게놈을 1x105개 Raji 또는 Jurkat 세포와 함께 48-웰 플레이트에서 30분 또는 48시간 동안 인큐베이션하고 형질도입이 발생하였는지를 결정하기 위해 3회 PBS 세척 단계 후 발광을 측정하였다. Raji 세포에서, CAV-nluc4 및 CAV-nluc6으로 형질도입된 세포에서 제0일부터 제2일까지 발광 증가가 있었지만, 음성 대조군에서는 그렇지 않았다(도 11b). CAV n-Luc4 및 CAV-nLuc6으로 형질도입된 Jurkat 세포는 또한 제0일부터 제2일까지 발광 증가를 나타내었다(도 11a). 이들 데이터는 CA벡터가 인간 세포를 형질도입할 수 있음을 나타내었다.
두 번째 실시예에서, 낮은(10 미만) 감염 다중도(MOI)에서 CAVector-nLuc를 사용하고 차선의 프로모터를 사용하여 다수의 세포주에서 형질도입 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝은, MOI가 3인 이들 조건 하에서, MOLT-4 세포(제0일부터 제2일까지 약 2.5X의 발광 증가), Jurkat 세포(제0일부터 제2일까지 약 0 내지 2.5X의 발광 증가), 및 Raji 세포(제0일부터 제2일까지 약 4 내지 13X의 발광 증가)를 비롯한 림프계 세포에서 형질도입이 검출되었음을 나타내었다.
실시예 8: 중화 항체에 대한 CA벡터의 내성
닭 혈청에서 인간 IVIG에 대한 CA벡터의 내성 및 VP1-특이적 항체에 의한 CA벡터의 중화
본 발명자들은 CA벡터가 항-VP1 항체에 의해 중화되었는지 여부를 평가하였다. 2개의 독립적인 공급원으로부터의 닭 혈청은 CAV의 VP1 캡시드 단백질에 대한 중화 항체를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. CAV를 닭 혈청 또는 VP1 펩티드에 대해 생성된 항-VP1 항체와 함께 인큐베이션하였다. 많은 닭이 CAV에 대해 백신접종을 받았으므로, 닭 혈청은 CAV를 중화할 것이라는 가설을 세웠다. 또한, 항-VP1 펩티드 항체는 형태적으로 관련이 없는 펩티드를 기반으로 하므로, CAV를 중화하지 않을 것으로 예상되었다. 인큐베이션 후, 세포를 접종하고 총 바이러스 게놈을 7일 후에 측정하였다. 닭 혈청은 CAV를 중화시킨 반면, 항-VP1 펩티드 항체는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다(도 13a). 중화가 닭 혈청에서 중화 VP1 항체로 인한 것임을 증명하기 위해, 항체 공급원으로서 닭 혈청을 사용하여 정제된 CAV 입자에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 항-VP1 항체에 의해 검출된 것과 일치하는 밴드가 관찰되었으며, 이는 중화가 VP1-특이적 항체로 인한 것임을 나타낸다(도 13b). CA벡터가 VP1에 의해 캡시드화되었음을 나타내기 위해, 본 발명자들은 닭 혈청의 중화 항체가 CA벡터 형질도입을 차단할 수 있는지 여부를 테스트하였다. CA벡터를 닭 혈청, 비-중화 VP1 항체, 또는 인간 정맥 면역글로불린(IVIG)과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음 형질도입 분석을 수행하였다. 닭 혈청은 CA벡터 형질도입을 중화시켰지만, 항-VP1 항체 및 IVIG는 그렇지 않았다(도 13c). 이는 CA벡터 형질도입이 VP1을 통해 매개되고 CA벡터가 캡시드화 바이러스 벡터임을 나타낸다.
중화 인간 항체에 대한 CA벡터의 내성
염화세슘(CsCl)에서 등밀도 원심분리에 의해 입자를 정제함으로써 추가 특성화를 수행하였다(도 19a). DNase-보호 벡터 카피(나노루시퍼라제 앰플리콘)의 피크는 qPCR에 의해 결정된 야생형 CAV 입자의 피크와 일치하였으며, 이는 약 1.29 g/mL의 밀도에 해당한다. 분획을 투석한 결과 세포를 형질도입하여 관찰된 qPCR 역가에 비례하는 나노루시퍼라제 발광 신호를 산출하는 것이 밝혀졌다(도 19b).
인간 항체에 의한 중화에 대한 CA벡터의 감수성을 추가로 조사하기 위해, 양성 및 음성 대조군과 함께 10개의 인간 혈청 샘플을 분석하였다. 초기 IVIG 관찰과 일관되게, 10개의 샘플 중 단지 1개만이 1:10 초과의 희석에서 중화에 대한 임의의 징후를 나타내었다(도 19c). 이에 비해, 동일한 나노루시퍼라제 카세트를 인코딩하는 아데노-연관 바이러스 2(AAV2) 벡터를 동일한 혈청 및 대조군 샘플과 함께 분석한 결과 이전에 공개된 데이터에 기반한 예상에 따라 중화되는 것으로 나타났다(도 19d). 10개의 공여자 혈청 중 3개가 1:10 초과의 희석에서 AAV2 벡터를 중화하였고, IVIG의 1:1250 희석은 또한 벡터를 강력하게 중화하였다.
실시예 9: 야생형 CAV 없이 CA벡터의 생성
본 실시예는 외인성 유전자를 포함하는 CA벡터에 CAV 단백질을 트랜스로 제공하여, 야생형 CAV를 검출 가능하게 포함하지 않는 CA벡터 제제를 생성하는 것을 입증한다. 생성된 CA벡터는 외인성 유전자를 표적 세포로 운반할 수 있었다.
상기 실시예에 기재된 바와 같이, 탠덤 CAV 게놈을 인코딩하는 플라스미드를 이용하여 나노루시퍼라제 리포터를 발현하는 시험관 내 환화(IVC) CA벡터 DNA를 동시-형질감염시킴으로써 CAV에 기반하여 바이러스 벡터를 생성하였다(CA벡터). 세포 상청액 및 용해물로부터, 진짜 CA벡터를 회수하였지만, 생성된 제제는 CAV 탠덤 게놈으로 인해 WT CAV 입자를 포함할 수 있었다. 이에 따라, WT CAV가 없는 순수한 CA벡터를 생성하기 위해 노력을 기울였다. 탠덤 CAV 플라스미드 대신에, CAV 단백질을 발현하지만 패키징된 입자를 만들 수 없는 전체 CAV 게놈을 인코딩하는 플라스미드(pCAV)를 대신 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 고유 프로모터로부터의 CAV 단백질의 발현이 동시-형질감염된 CA벡터 DNA를 복제하고 패키징하기에 충분할 것이라는 가설을 세웠다. 음성 대조군으로서, VP1 코딩 영역이 결실된 플라스미드 CAV(pΔVP1)를 이용하여 CA벡터 IVC를 동시-형질감염시켰다. 따라서, 음성 대조군은 패키징된 CA벡터를 생성하지 않았다.
MDCC-MSB1 세포 내로 pCAV 및 CA벡터 nLuc6 IVC의 형질감염 후 3일째에, 세포 펠렛을 수확하고 용해시킨 다음 20% 수크로스 쿠션 상에서 초원심분리에 의해 부분 정제를 수행하였다. 원심분리 후 펠렛을 PBS에 재현탁시키고, MDCC-MSB1 세포에 대해 형질도입 분석을 수행하였다. 관찰되었을 수 있는 임의의 형질도입 신호가 VP1-캡시드화 벡터로 인한 것임을 확인하기 위해, 2가지 조건 모두 닭 혈청 유래의 VP1-중화 항체(NAb)로 처리하였다. 샘플을 VP1-중화 항체와 함께 또는 없이 사전-인큐베이션한 후 형질도입을 수행하였다. 형질도입 후 30분 또는 2일째에 샘플을 수집하여 형질도입에 대한 판독값으로서 발광 변화를 측정하였다.
음성 대조군인 pΔVP1은 CA벡터를 구제하지 않았다(도 14). pCAV+nLuc6 샘플에서 제0일부터 제2일가지 발광의 25배 증가가 관찰되었고, 이 신호는 중화 항체에 의해 차단되었으며, 이는 pCAV가 CA벡터를 성공적으로 구제하였음을 나타낸다. 적어도 3가지의 증거에 기반하여, 이 샘플에는 어떠한 복제 CAV도 존재하지 않아야 한다. 첫째, pCAV 형질감염은 일관되게 야생형 CAV 회수의 결여를 나타내었다. 둘째, 과량의 DNase-보호 CAV 게놈은 qPCR 분석에서 검출되지 않았다. 셋째, 야생형 CAV가 CA벡터 샘플에 첨가될 때 관찰된 발광 신호가 증가되었다.
실시예 10: 마우스에 주입하기 위한 nLuc CA벡터의 생성
본 실시예에서, nLuc 이식유전자를 보유하는 CA벡터를 생성하고 마우스에 주입하였다. 간략하게, Luc6 CA벡터 작제물(본 명세서, 예를 들어 표 7에 기재된 바와 같음) 또는 CAV(음성 대조군)를 이용하여 3e8개 MDCC-MSB1 세포를 형질감염시켰다. 양성 대조군으로서 AAV2 작제물을 이용하여 Expi293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 3리터의 배지에서 3일 동안 성장시켰다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 0.5% SDS에서 용해시킨 다음 벤조나제로 처리하여 보호되지 않은 핵산을 분해하였다. 그 다음 용해된 펠렛을 0.45 μm 필터를 통해 이동시켰다. 여과된 용해물을 20% 수크로스 쿠션을 통해 31,000 rpm에서 3시간 동안 초원심분리하고, 밤새 재현탁시킨 다음, CsCl 선형 구배를 통해 이동시켰다. 그 다음 샘플을 분별하고 분획을 투석한 후, 생성된 농축물의 정량화를 수행하였다. 품질 확인을 수행하였다. 생성된 제제의 역가 및 내독소 수준이 도 12에 나타나 있다.
실시예 11: 다수 기관에서 페이로드 DNA의 운반을 초래하는, 마우스에 대한 생체내 CA벡터의 투여
본 실시예에서, 나노-루시퍼라제(nLuc) 페이로드를 보유하는 CA벡터를 생체 내에서 마우스 조직으로 운반하였다. 간략하게, 마우스는 (i) 야생형 CAV(WT) 및 나노-루시퍼라제(Nluc) 페이로드를 인코딩하는 유전 요소를 보유하는 CA벡터의 혼합물, 또는 (ii) 야생형 CAV 단독, 또는 (iii) 또한 nLuc 페이로드를 인코딩하는 AAV2 중 어느 하나의 비슷한 용량을 받았다. 망막하(SR), IV, IP, 및 IM을 비롯한 다양한 운반 경로를 테스트하였다(하기 표 23에 나타낸 바와 같음).
CAV 및/또는 CA벡터의 조직 분포를 평가하기 위해, 주입 3주 후 동물을 희생시키고, 다양한 조직(혈액, 간, 비장, 폐, 심장, 난소, 근육, 뇌, 신장, 및 망막)을 수집하였다. 조직으로부터 총 DNA를 추출하고, qPCR에 의해 CA벡터 게놈(nLuc 프로브를 사용함) 또는 CAV WT 바이러스 게놈에 대해 평가하였다. 본 발명자들은 AAV2 IM 그룹에 비해 IV 및 IP 경로를 통해 CA벡터를 받은 마우스의 비장 및 간에서 상승된 수준의 CA벡터(nLuc 카피/DNA(μg))를 검출하였다(도 16a 및 16c). 또한, 본 발명자들은 IV 및 IP를 통한 것을 포함하여, CAV WT 또는 CA벡터를 투여받은 마우스의 간 및 비장에서 야생형 CAV 게놈을 검출하였다(도 16b 및 16d). 본 발명자들은 또한 근육, 망막, 심장, 및 난소에서 유사한 신호를 관찰하였지만, 뇌에서는 그렇지 않았다. 벡터는 투여 경로와 일치하는 패턴으로 조직에서 검출되었다(도 20). 이들 데이터는 마우스에서 CA벡터 DNA의 성공적인 생체 내 운반을 나타낸다.
[표 23] 마우스에서 CA벡터 및 대조군의 투여 용량 및 경로
실시예 12: CA벡터 대 AAV2를 받은 마우스에서 면역원성
본 실시예에서, 실시예 11에 기재된 바와 같이, 근육내(IM) 투여를 통해 야생형 CAV, CA벡터, 또는 AAV2를 받은 마우스를 CAV 또는 AAV2에 대한 항체 반응에 대하여 평가하였다. 인코딩된 nLuc 이식유전자로부터의 발광 신호의 검출에 의존하는 시험관 내 중화 분석을 사용하여 CAV 또는 AAV2에 대한 항체 반응을 측정하였다. 투여된 벡터(즉, CAV 또는 AAV2)에 대한 중화 항체가 샘플에 존재할 때, 벡터에 의해 생성된 발광이 감소된다. 간략하게, 희생시 마우스로부터 취한 혈청 샘플을 열-불활성화시키고 연속적으로 희석하였다. CAV 및 AAV2의 상대적인 면역원성을 비교하기 위해, IM 경로로 CAV 또는 AAV2를 받은 마우스에 대해 중화 측정값을 플롯팅하였다(역 y-축 상에 발광을 표시)(도 17a).
닭 혈청은 테스트한 모든 희석에서 CA벡터의 완전한 중화를 유도한 반면, CAV에 대한 항체를 유도할 것으로 예상되지 않은 AAV2-nluc IM 음성 대조군은 그렇지 않았다(도 19a). 놀랍게도, CA벡터 및 CAV WT IM을 받은 마우스 유래의 혈청은 CA벡터를 중화하지 않았다. 대조적으로, AAV2 IM을 받은 동물은 인간 IVIG에 존재하는 역가와 동등하게 AAV2에 대하여 높은 수준의 중화 항체를 생성하였다(도 17b 및 17c). AAV2-nLuc 저용량 및 고용량 동물로부터의 50% 기하 평균 중화 역가의 역수(50% GMT)는 각각 320 및 640이었고, 이는 인간 IVIG의 경우 1,280인 것과 비교된다. 다른 경로에 의해 제공된 CA벡터 및 CAV WT는 더 낮은 수준의 중화 항체를 유도하였다. 관찰된 가장 높은 역가는 IV로 투여된 CAV에 대해 160이었다. 이러한 데이터는 근육내로 투여될 때 CA벡터가 AAV2 벡터보다 면역원성이 더 낮다는 것을 시사한다.
실시예 13: CAV-유사 입자(VLP)는 정제된 캡시드 단백질로부터 시험관 내에서 조립된다
본 실시예에서, CAV 캡시드 단백질인 VP1에 의한 시험관 내 입자 형성을 도 18 상단의 작업 흐름에 나타낸 바와 같이 평가하였다. 간략하게, 재조합 VP1(rVp1)을 CAV VP2와 함께 포유동물 세포에서 공동-발현시키고 N-말단 친화성 태그(도 18, 패널 2)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였다. VP1을 야생형 CAV 바이러스의 보유 부피에 상응하는 보유 부피로 SEC로부터 용출하였다(도 18, 패널 3). CAV와 유사한 입자가 VP1 SEC 분획에서 전자 현미경으로 관찰되었다(도 18, 패널 4). 추정 VP1 VLP는 야생형 CAV 입자와 거의 동일한 크기이었으며 야생형 CAV 바이러스에 존재하는 동일한 트럼펫-형상의 스파이크 특징을 나타내었다(도 18, 패널 5). 이러한 결과는 CAV VP1 단백질이 시험관 내에서 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있음을 입증한다.
실시예 14: CA벡터는 후기 엔도솜 경로를 통해 MDCC-MSB1 세포에 유입된다
본 실시예에서, 세포 내로의 CAV 바이러스 유입의 메커니즘을 평가하였다. 발광 분석에 의한 CA벡터 형질도입의 검출은 바이러스 유입에 대한 상이한 경로를 저해하는 것으로 알려진 4가지 화합물의 효과를 평가할 수 있게 하였다. 세포흡수작용(macropinocytosis) 저해제인 아밀로라이드 하이드로클로라이드(amiloride hydrochloride)(EIPA) 및 라트룬큘린 B(LatB), 디나소어(엔도시토시스의 초기 사건을 저해함), 및 바필로마이신 A1(BafA1)(엔도솜 산성화의 저해제)(도 21a)을 포함하는 테스트된 화합물의 형질도입 저해 능력에 대해 평가하였다. CA벡터와 함께 20시간 형질도입 인큐베이션 15분 전 및 동안에 MDCC-MSB1 세포에 화합물들, 또는 디메틸설폭시드(DMSO) 희석제 대조군을 첨가하였다. Expi293 세포에서 AAV2-nLuc 벡터를 사용한 대조군 실험을 또한 수행하였다.
발광을 측정하여 CA벡터 형질도입을 정량화하였으며, 이는 디나소어 및 BafA1이 DMSO 희석제 대조군에 비해 신호의 천배 초과의 감소를 야기한 반면, 다른 2가지 화합물은 최소한의 영향을 미쳤음을 나타낸다(도 21b). 비교하면, AAV2-nluc는 디나소어 및 BafA1에 의해 유사한 정도로 저해되었고, LatB에 의해 약 3배 저해되었다(도 21c). 임의의 바이러스 벡터뿐만 아니라 DMSO의 부재 하에 세포를 각각의 유입 저해제로 처리하였고, 유의한 세포 사멸은 관찰되지 않았다.
실시예 15: 열 처리 후 및 4℃에서 보관 후 CA벡터 생존력
CA벡터의 안정성을 평가하기 위해, 열안정성 및 보관 안정성을 확인하였다. 20% 수크로스 쿠션을 통한 세포 용해물의 침강, 등밀도 CsCl 원심분리, 및 2가 양이온 및 0.001% 폴록사머 188을 함유하는 인산염-완충 식염수(PBS)로의 투석에 의해 벡터를 정제하였다.
첫 번째 실시예에서, 벡터의 15분 열 처리를 40℃ 내지 95℃ 범위의 온도에서 수행하였다(도 22a). 형질도입 신호는 55℃ 처리 후에 변화가 없었고, 65℃에서 15분 후 10배 감소하였으며, 75℃에서 인큐베이션 후 제거되었다. 임의의 거짓 발광 신호를 배제하기 위해 중화 대조군(NAb)을 포함하였다.
두 번째 실시예에서, 샘플이 고갈되기 전 6개월에 동안 정제된 CA벡터 샘플을 4℃에서 보관하였다. 이 기간 동안, 물질에 대해 형질도입 효력에 대한 3가지 비슷한 테스트를 수행하였다. 결과는 도 22b에 나타나 있다. 형질도입 신호는 이 기간 동안 변화되지 않은 상태로 있었다.
실시예 16: 탠덤 플라스미드를 사용한 CA벡터의 회수
본 실시예는 2개의 CA벡터 게놈 카피를 포함하는 탠덤 플라스미드 작제물(pRTx-1580)을 사용하여 나노-루시퍼라제(nLuc) 유전자를 인코딩하는 예시적인 CA벡터의 회수를 기재한다. 탠덤 작제물의 개략도는 도 23a에 나타나 있다. 첫 번째 게놈 카피는 부분적인 ORF 대신에 나노루시퍼라제 이식유전자를 인코딩하지만 바이러스 시스 요소 및 ORF의 나머지를 유지한다. 두 번째 게놈 카피는 3'NCR의 결실을 제외하고 완전한 CA벡터 게놈이다.
이 작제물이 벡터를 산출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, MDCC-MSB1 세포를 탠덤 벡터 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 형질감염 3일 후에 수확하고 20 mM Tris(pH 8.0)를 함유하는 0.5% SDS 용해 완충액을 사용하여 37℃에서 30분 동안 용해시켰다. 그 다음 용해물을 100 U/ml의 벤조나제로 37도에서 20분 동안 처리한 후, 10,000xg에서 30분 동안 정화하여 세포 파편을 펠렛화하였다. 정화된 용해물에 대하여 수크로스 쿠션 정제를 수행하였다. 캡시드화되지 않은 잔류 DNA를 제거하기 위해 DNase 처리 후 qPCR로 수크로스 쿠션 정제 물질에서 벡터 및 야생형 게놈을 정량화하였다.
도 23b에 나타낸 바와 같이, DNAse-보호 CA벡터 게놈 카피를 회수하였으며, 이는 pRTx-1580 탠덤 벡터 작제물이 MDCC-MSB1 형질감염에서 벡터 DNA 복제 및 패키징에 대한 능력을 유지함을 나타낸다. 이러한 DNAse 보호 벡터 게놈이 형질도입할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 수크로스 쿠션 정제 물질을 MDCC-MSB1 또는 ConA-B1-VICK 세포에 첨가하였다. MDCC-MSB1 및 ConA-B1-VICK 형질도입 둘 다에서 배경에 대한 발광 신호의 명확한 증가가 관찰되었으며(도 23c), 이는 pRTx-1580 작제물이 형질도입이 가능한 벡터 입자를 생성하였음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC.
<120> CHICKEN ANEMIA VIRUS (CAV)-BASED VECTORS
<130> V2057-7014WO
<140> PCT/US2021/057292
<141> 2021-10-29
<150> 63/147,087
<151> 2021-02-08
<150> 63/107,149
<151> 2020-10-29
<160> 114
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2313
<212> DNA
<213> Chicken anemia virus
<400> 1
cgagtggtta ctattccatc accattctag cctgtacaca gaaagtcaag atggacgaat 60
cgctcgactt cgctcgcgat tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc 120
ctccaacgag tggagcacgt acaggggggt acgtcatccg tacagggggg tacgtcatcc 180
gtacaggggg gtacgtcaca aagaggcgtt cccgtacagg ggggtacgtc acgcgtacag 240
gggggtacgt cacagccaat caaaagctgc cacgttgcga aagtgacgtt tcgaaaatgg 300
gcggcgcaag cctctctata tattgagcgc acataccggt cggcagtagg tatacgcaag 360
gcggtccggg tggatgcacg ggaacggcgg acaaccggcc gctgggggca gtgaatcggc 420
gcttagccga gaggggcaac ctgggcccag cggagccgcg caggggcaag taatttcaaa 480
tgaacgctct ccaagaagat actccacccg gaccatcaac ggtgttcagg ccaccaacaa 540
gttcacggcc gttggaaacc cctcactgca gagagatccg gattggtatc gctggaatta 600
caatcactct atcgctgtgt ggctgcgcga atgctcgcgc tcccacgcta agatctgcaa 660
ctgcggacaa ttcagaaagc actggtttca agaatgtgcc ggacttgagg accgatcaac 720
ccaagcctcc ctcgaagaag cgatcctgcg acccctccga gtacagggta agcgagctaa 780
aagaaagctt gattaccact actcccagcc gaccccgaac cgcaaaaagg cgtataagac 840
tgtaagatgg caagacgagc tcgcagaccg agaggccgat tttactcctt cagaagagga 900
cggtggcacc acctcaagcg acttcgacga agatataaat ttcgacatcg gaggagacag 960
cggtatcgta gacgagcttt taggaaggcc tttcacaacc cccgccccgg tacgtatagt 1020
gtgaggctgc cgaaccccca atctactatg actatccgct tccaaggggt catctttctc 1080
acggaaggac tcattctgcc taaaaacagc acagcggggg gctatgcaga ccacatgtac 1140
ggggcgagag tcgccaagat ctctgtgaac ctgaaagagt tcctgctagc ctcaatgaac 1200
ctgacatacg tgagcaaaat cggaggcccc atcgccggtg agttgattgc ggacgggtct 1260
aaatcacaag ccgcggacaa ttggcctaat tgctggctgc cgctagataa taacgtgccc 1320
tccgctacac catcggcatg gtggagatgg gccttaatga tgatgcagcc cacggactct 1380
tgccggttct ttaatcaccc aaagcagatg accctgcaag acatgggtcg catgtttggg 1440
ggctggcacc tgttccgaca cattgaaacc cgctttcagc tccttgccac taagaatgag 1500
ggatccttca gccccgtggc gagtcttctc tcccagggag agtacctcac gcgtcgggac 1560
gatgttaagt acagcagcga tcaccagaac cggtggcaaa aaggcggaca accgatgacg 1620
gggggcattg cttatgcgac cgggaaaatg agacccgacg agcaacagta ccctgctatg 1680
cccccagacc ccccgatcat caccgctact acagcgcaag gcacgcaagt ccgctgcatg 1740
aatagcacgc aagcttggtg gtcatgggac acatatatga gctttgcaac actcacagca 1800
ctcggtgcac aatggtcttt tcctccaggg caacgttcag tttctagacg gtccttcaac 1860
caccacaagg cgagaggagc cggggacccc aagggccaga gatggcacac gctggtgccg 1920
ctcggcacgg agaccatcac cgacagctac atgtcagcac ccgcatcaga gctggacact 1980
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gtccagtcgg tctggcagct gggtaacagg cagaggccat acccatggga cgtcaactgg 2160
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cccccttaaa cccccccctg ggggggattc ccccccagac ccccccttta tatagcactc 2280
aataaacgca gaaaatagat ttatcgcact atc 2313
<210> 2
<211> 2319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 2
gaattcctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 60
agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 120
tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 180
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ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc 300
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aagtccttga acagggaggt gtgtccagtt tgtttcagaa tctcggggtg tccgtaactc 480
cgatccaaag gattgtcctg agcggtgaaa atgggctgaa gatcgacatc catgtcatca 540
tcccgtatga aggtctgagc ggcgaccaaa tgggccagat cgaaaaaatt tttaaggtgg 600
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agcgcctgat caaccccgac ggctccctgc tgttccgagt aaccatcaac ggagtgaccg 840
gctggcggct gtgcgaacgc attctggcgt aataagatac attgatgagt ttggacaaac 900
cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 960
atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttcctttc acaacccccg ccccggtacg 1020
tatagtgtga ggctgccgaa cccccaatct actatgacta tccgcttcca aggggtcatc 1080
tttctcacgg aaggactcat tctgcctaaa aacagcacag cggggggcta tgcagaccac 1140
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gtgccctccg ctacaccatc ggcatggtgg agatgggcct taatgatgat gcagcccacg 1380
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cgggacgatg ttaagtacag cagcgatcac cagaaccggt ggcaaaaagg cggacaaccg 1620
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gtgccgctcg gcacggagac catcaccgac agctacatgt cagcacccgc atcagagctg 1980
gacactaatt tctttacgct ttacgtagcg caaggcacaa ataagtcgca acagtacaag 2040
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gccccccccc cttaaacccc cccctggggg ggattccccc ccagaccccc cctttatata 2280
gcactcaata aacgcagaaa atagatttat cgcactatc 2319
<210> 3
<211> 2319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
gaattccgag tggttactat tccatcacca ttctagcctg tacacagaaa gtcaagatgg 60
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 15
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agcgatcacc agaaccggtg gcaaaaaggc ggacaaccga tgacgggggg cattgcttat 3960
gcgaccggga aaatgagacc cgacgagcaa cagtaccctg ctatgccccc agaccccccg 4020
atcatcaccg ctactacagc gcaaggcacg caagtccgct gcatgaatag cacgcaagct 4080
tggtggtcat gggacacata tatgagcttt gcaacactca cagcactcgg tgcacaatgg 4140
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gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 4620
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ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 5220
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 5280
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 5340
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 5400
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 5460
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 5520
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 5580
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 5640
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 5700
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 5760
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ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 6300
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<210> 16
<211> 4793
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 16
gaattccgag tggttactat tccatcacca ttctagcctg tacacagaaa gtcaagatgg 60
acgaatcgct cgacttcgct cgcgattcgt cgaaggcggg gggccggagg ccccccggtg 120
gcccccctcc aacgagtgga gcacgtacag gggggtacgt catccgtaca ggggggtacg 180
tcatccgtac aggggggtac gtcacaaaga ggcgttcccg tacagggggg tacgtcacgc 240
gtacaggggg gtacgtcaca gccaatcaaa agctgccacg ttgcgaaagt gacgtttcga 300
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cgcaaggcgg tccgggtggt tgcacgggaa cggcggacaa ccggccgctg ggggcagtga 420
atcggcgctt agccgagagg ggcaacctgg gcccagcgga gccgcgcagg ggcaagtaat 480
ttcaattgaa cgctctccaa gaagatactc cacccggacc atcaacggtg ttcaggccac 540
caacaagttc acggccgttg gaaacccctc actgcagaga gatccggatt ggtatcgctg 600
gaattacaat cactctatcg ctgtgtggct gcgcgaatgc tcgcgctccc acgctaagat 660
ctgcaactgc ggacaattca gaaagcactg gtttcaagaa tgtgccggac ttgaggaccg 720
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agctaaaaga aagcttgatt accactactc ccagccgacc ccgaaccgca aaaaggcgta 840
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agacagcggt atcgtagacg agcttttagg aaggcctttc acaaccctgt ggaatgtgtg 1020
tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1080
tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 1140
gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 1200
gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 1260
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ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct gccaccatgg tcttcacact cgaagatttc 1380
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ccatcaccat tctagcctgt acacagaaag tcaagatgga cgaatcgctc gacttcgctc 2400
gcgattcgtc gaaggcgggg ggccggaggc cccccggtgg cccccctcca acgagtggag 2460
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ctgaatgaga cgcacgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 2700
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ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 3420
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 3480
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 3540
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ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 3660
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 3720
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 3780
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 3840
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 3900
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 3960
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 4020
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 4080
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 4140
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 4200
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 4260
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 4320
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 4380
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 4440
tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 4500
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 4560
tttccccgaa aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag atctcccgat cccctatggt 4620
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt 4680
gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct 4740
tgaccgacaa ttctctggct aactagagaa cccactgctt actaggcgtc tca 4793
<210> 17
<211> 125
<212> DNA
<213> Chicken anemia virus
<400> 17
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000
<210> 73
<400> 73
000
<210> 74
<400> 74
000
<210> 75
<400> 75
000
<210> 76
<400> 76
000
<210> 77
<400> 77
000
<210> 78
<400> 78
000
<210> 79
<400> 79
000
<210> 80
<400> 80
000
<210> 81
<400> 81
000
<210> 82
<400> 82
000
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<400> 83
000
<210> 84
<400> 84
000
<210> 85
<400> 85
000
<210> 86
<400> 86
000
<210> 87
<400> 87
000
<210> 88
<400> 88
000
<210> 89
<400> 89
000
<210> 90
<400> 90
000
<210> 91
<400> 91
000
<210> 92
<400> 92
000
<210> 93
<400> 93
000
<210> 94
<400> 94
000
<210> 95
<400> 95
000
<210> 96
<400> 96
000
<210> 97
<400> 97
000
<210> 98
<400> 98
000
<210> 99
<400> 99
000
<210> 100
<211> 2319
<212> DNA
<213> Chicken anemia virus
<400> 100
gaattccgag tggttactat tccatcacca ttctagcctg tacacagaaa gtcaagatgg 60
acgaatcgct cgacttcgct cgcgattcgt cgaaggcggg gggccggagg ccccccggtg 120
gcccccctcc aacgagtgga gcacgtacag gggggtacgt catccgtaca ggggggtacg 180
tcatccgtac aggggggtac gtcacaaaga ggcgttcccg tacagggggg tacgtcacgc 240
gtacaggggg gtacgtcaca gccaatcaaa agctgccacg ttgcgaaagt gacgtttcga 300
aaatgggcgg cgcaagcctc tctatatatt gagcgcacat accggtcggc agtaggtata 360
cgcaaggcgg tccgggtgga tgcacgggaa cggcggacaa ccggccgctg ggggcagtga 420
atcggcgctt agccgagagg ggcaacctgg gcccagcgga gccgcgcagg ggcaagtaat 480
ttcaaatgaa cgctctccaa gaagatactc cacccggacc atcaacggtg ttcaggccac 540
caacaagttc acggccgttg gaaacccctc actgcagaga gatccggatt ggtatcgctg 600
gaattacaat cactctatcg ctgtgtggct gcgcgaatgc tcgcgctccc acgctaagat 660
ctgcaactgc ggacaattca gaaagcactg gtttcaagaa tgtgccggac ttgaggaccg 720
atcaacccaa gcctccctcg aagaagcgat cctgcgaccc ctccgagtac agggtaagcg 780
agctaaaaga aagcttgatt accactactc ccagccgacc ccgaaccgca aaaaggcgta 840
taagactgta agatggcaag acgagctcgc agaccgagag gccgatttta ctccttcaga 900
agaggacggt ggcaccacct caagcgactt cgacgaagat ataaatttcg acatcggagg 960
agacagcggt atcgtagacg agcttttagg aaggcctttc acaacccccg ccccggtacg 1020
tatagtgtga ggctgccgaa cccccaatct actatgacta tccgcttcca aggggtcatc 1080
tttctcacgg aaggactcat tctgcctaaa aacagcacag cggggggcta tgcagaccac 1140
atgtacgggg cgagagtcgc caagatctct gtgaacctga aagagttcct gctagcctca 1200
atgaacctga catacgtgag caaaatcgga ggccccatcg ccggtgagtt gattgcggac 1260
gggtctaaat cacaagccgc ggacaattgg cctaattgct ggctgccgct agataataac 1320
gtgccctccg ctacaccatc ggcatggtgg agatgggcct taatgatgat gcagcccacg 1380
gactcttgcc ggttctttaa tcacccaaag cagatgaccc tgcaagacat gggtcgcatg 1440
tttgggggct ggcacctgtt ccgacacatt gaaacccgct ttcagctcct tgccactaag 1500
aatgagggat ccttcagccc cgtggcgagt cttctctccc agggagagta cctcacgcgt 1560
cgggacgatg ttaagtacag cagcgatcac cagaaccggt ggcaaaaagg cggacaaccg 1620
atgacggggg gcattgctta tgcgaccggg aaaatgagac ccgacgagca acagtaccct 1680
gctatgcccc cagacccccc gatcatcacc gctactacag cgcaaggcac gcaagtccgc 1740
tgcatgaata gcacgcaagc ttggtggtca tgggacacat atatgagctt tgcaacactc 1800
acagcactcg gtgcacaatg gtcttttcct ccagggcaac gttcagtttc tagacggtcc 1860
ttcaaccacc acaaggcgag aggagccggg gaccccaagg gccagagatg gcacacgctg 1920
gtgccgctcg gcacggagac catcaccgac agctacatgt cagcacccgc atcagagctg 1980
gacactaatt tctttacgct ttacgtagcg caaggcacaa ataagtcgca acagtacaag 2040
ttcggcacag ctacatacgc gctaaaggag ccggtaatga agagcgatgc atgggcagtg 2100
gtacgcgtcc agtcggtctg gcagctgggt aacaggcaga ggccataccc atgggacgtc 2160
aactgggcga acagcaccat gtactggggg acgcagccct gaaaaggggg gggggctaaa 2220
gccccccccc cttaaacccc cccctggggg ggattccccc ccagaccccc cctttatata 2280
gcactcaata aacgcagaaa atagatttat cgcactatc 2319
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization signal sequence
<400> 101
Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg Arg Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 102
<211> 24
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization signal sequence
<400> 102
Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Lys Phe Arg His Arg Arg Arg Gln Arg
1 5 10 15
Tyr Arg Arg Arg Ala Phe Arg Lys
20
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear export signal sequence
<400> 103
Ile Phe Leu Thr Glu Gly Leu Ile Leu
1 5
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear export signal sequence
<400> 104
Leu Lys Glu Phe Leu Leu Ala Ser Met Asn Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear export signal sequence
<400> 105
Glu Leu Asp Thr Asn Phe Phe Thr Leu Tyr Val Ala Gln
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CAV VP2 sequence
<400> 106
Ile Cys Asn Cys Gly Gln Phe Arg Lys His
1 5 10
<210> 107
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CAV VP2 sequence
<400> 107
Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn Cys Gly
1 5 10 15
Gln Phe Arg Lys His
20
<210> 108
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CAV VP1 sequence
<400> 108
Arg Arg Arg Tyr Lys Phe Arg His Arg Arg Gln Arg Tyr Arg Arg Arg
1 5 10 15
Ala Phe Arg Lys His
20
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CAV VP1 sequence
<400> 109
Ser Arg Arg Ser Phe Asn His His Lys Ala Arg Gly Ala Gly Asp Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 110
<211> 20
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization signal sequence
<400> 110
Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg Arg Gly
1 5 10 15
Arg Trp His His
20
<210> 111
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CAV VP2 sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(8)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(12)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(20)
<223> Any amino acid
<400> 111
Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa His
20
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 112
ttggaaaccc ctcactgcag ag 22
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 113
ctgaattgtc cgcagttgca g 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 114
ctggaattac aatcactcta t 21
Claims (26)
- 프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
예를 들어 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드(예를 들어, CAV VP1 분자)에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하는 유전 요소. - 프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
단백질 결합 서열
을 포함하며, CAV VP1 분자에 의해 패키징(예를 들어, 특이적으로 패키징)될 수 있는, 유전 요소. - 프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
CAV 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하는 유전 요소로서, 외인성 이펙터가 하기와 같은, 유전 요소:
(a) 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화됨,
(b) 인간 폴리펩티드 또는 핵산,
(c) 인간 폴리펩티드 또는 핵산에 결합함, 또는
(d) 인간 세포에서 활성을 가짐(예를 들어 인간 세포에서 인간 유전자의 활성 및/또는 수준을 조절함(예를 들어, 증가시키거나 감소시킴)). - 프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
서열번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 374에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및/또는 서열번호 100의 뉴클레오티드 2195 내지 2319에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열
을 포함하는 유전 요소. - 프로모터 요소;
외인성 이펙터(예를 들어, 치료용 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및
e의 인접 부분에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 또는 3,000개 뉴클레오티드
를 포함하는 유전 요소. - 예를 들어 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 예를 들어 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하며, 하기 중 하나 이상을 포함하지 않는, 유전 요소:
(i) 전장 CAV VP1 유전자(예를 들어, 유전 요소는 CAV VP1 유전자, 예를 들어 약 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만 뉴클레오티드의 CAV VP1 유전자 서열의 하나 이상의 단편을 포함함);
(ii) 전장 CAV VP2 유전자(예를 들어, 유전 요소는 CAV VP2 유전자, 예를 들어 약 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만 뉴클레오티드의 CAV VP2 유전자 서열의 하나 이상의 단편을 포함함); 또는
(ii) 전장 CAV 아폽틴 유전자(예를 들어, 유전 요소는 CAV 아폽틴 유전자, 예를 들어 약 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만 뉴클레오티드의 CAV 아폽틴 유전자 서열의 하나 이상의 단편을 포함함). - 예를 들어 약 10 μM 미만(예를 들어, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μM 미만, 예를 들어 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10 nM 미만)의 친화도/특이성으로, CAV 캡시드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열
을 포함하며, 하기 중 하나 이상을 포함하는, 유전 요소:
(i) 예를 들어, CAV VP1 코딩 서열의 5' 말단에서, 예를 들어 CAV VP1 코딩 서열의 서열 내에 있는 정지 코돈을 포함하는, 비기능적 CAV VP1 유전자 또는 이의 단편(예를 들어, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 bp 또는 그 이상의 인접 단편);
(ii) 예를 들어, CAV VP2 코딩 서열의 5' 말단에서, 예를 들어 CAV VP2 코딩 서열의 서열 내에 있는 정지 코돈을 포함하는, 비기능적 CAV VP2 유전자 또는 이의 단편(예를 들어, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 bp 또는 그 이상의 인접 단편); 또는
(ii) 예를 들어, CAV 아폽틴 코딩 서열의 5' 말단에서, 예를 들어 CAV 아폽틴 코딩 서열의 서열 내에 있는 정지 코돈을 포함하는, 비기능적 CAV 아폽틴 유전자 또는 이의 단편(예를 들어, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 bp 또는 그 이상의 인접 단편). - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
- (a) CAV VP1 유전자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
(b) CAV VP2 유전자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및/또는
(c) CAV 아폽틴 유전자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열
중 1, 2개, 또는 3개 전부를 포함하며, CAV 패키징 신호를 포함하지 않고/않거나 CAV VP1 분자에 의해 패키징될 수 없는, 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드). - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전 요소, 또는 제8항 또는 제9항의 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 (i) 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포; 또는 (ii) 조류 세포, 예를 들어 닭 세포).
- a) CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
b) (i) 프로모터 요소, (ii) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) CAV VP1 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소
를 포함하는 CA벡터. - a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전 요소, 및
b) 단백질성 외부, 예를 들어 CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하는 CA벡터. - a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전 요소, 및
b) 캡시드, 예를 들어 CAV VP1 분자를 포함하는 캡시드
를 포함하는 CA벡터. - 유전 요소에 결합된 CAV VP1 분자
를 포함하는 복합체로서, 유전 요소는 (i) 프로모터 요소, (ii) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) 단백질 결합 서열을 포함하는, 복합체. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 CA벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 외인성 이펙터를 표적 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)로 운반하는 방법.
- (a) CAV에 대한 원치 않는 면역 반응, 예를 들어 항-CAV 항체, 예를 들어 CAV 중화 항체의 존재에 대하여, 표적 세포, 또는 표적 세포를 포함하는 대상체를 평가하는 단계; 및
(b) 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 CA벡터를 세포 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 외인성 이펙터를 표적 세포(예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포)로 운반하는 방법. - CAV에 대한 원치 않는 면역 반응, 예를 들어 항-CAV 항체, 예를 들어 CAV 중화 항체의 존재에 대하여 대상체를 평가하는 단계를 포함하는, CA벡터를 받기 위한 대상체를 선택하는 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 CA벡터를 대상체 내로 도입하는 단계를 포함하되, 예를 들어 질환 또는 장애는 암인, 생물학적 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 생물학적 활성을 조절하는 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 CA벡터를 대상체 내로 도입하는 단계를 포함하되, 예를 들어 질환 또는 장애는 암인, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- (a) CAV에 대한 원치 않는 면역 반응, 예를 들어 항-CAV 항체, 예를 들어 CAV 중화 항체의 존재에 대하여, 대상체를 평가하는 단계; 및
(b) 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 CA벡터를 대상체 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 CA벡터를 대상체 내로 도입하는 단계를 포함하되, 외인성 이펙터는 감염원(infectious agent)(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아) 유래의 항원을 포함하는, 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 백신접종을 하는 방법.
- a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전 요소를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및
b) 숙주 세포를 단백질성 외부(예를 들어, CAV VP1 분자를 포함하는 단백질성 외부)의 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 CA벡터를 제조하는, CA벡터를 제조하는 방법. - CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물을 1 내지 5℃, 5 내지 10℃, 10 내지 15℃, 15 내지 20℃, 또는 20 내지 25℃의 온도에서 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 2년의 기간, 또는 약 1 내지 2주, 2 내지 3주, 3 내지 4주, 1 내지 2개월, 2 내지 3개월, 3 내지 4개월, 4 내지 5개월, 5 내지 6개월, 6 내지 7개월, 7 내지 8개월, 8 내지 9개월, 9 내지 10개월, 10 내지 11개월, 11 내지 12개월, 12 내지 18개월, 18 내지 24개월, 또는 2 내지 3년의 기간 동안 유지하는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 보관하는 방법.
- CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물의 온도를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10℃까지, 또는 1 내지 5℃(예를 들어, 약 4℃)까지 낮추는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 냉각시키는 방법.
- CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물의 온도를 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃까지, 또는 20 내지 25℃ 또는 25 내지 30℃(예를 들어, 약 25℃)까지 상승시키는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 가열하는 방법.
- CA벡터(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CA벡터)를 포함하는 조성물의 온도를 약 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40℃까지, 또는 30 내지 35℃ 또는 35 내지 40℃(예를 들어, 약 37℃)까지 상승시키는 것을 포함하는, CA벡터를 포함하는 조성물을 가열하는 방법.
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