KR101320489B1 - 인간 세포주에서 재조합 인간 단백질의 무혈청의 안정한형질감염 및 생산 - Google Patents

인간 세포주에서 재조합 인간 단백질의 무혈청의 안정한형질감염 및 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 단백질(protein of interest)을 코딩하는 유전자를 운반하는 특정한 벡터에 의해 무혈청 조건에서 안정적으로 형질감염(transfect)된 불멸화된(immortalized) 인간 세포주의 개선된 무혈청 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 세포주의 생산, 상기 생산 세포주를 이용한 상기 목적 단백질의 생산 방법, 및 목적 유전자를 운반하는 특정한 벡터에 관한 것이다.
불멸화된 세포주, 무혈청 형질감염, 무혈청 생산방법

Description

인간 세포주에서 재조합 인간 단백질의 무혈청의 안정한 형질감염 및 생산{Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines}
본 발명은 목적 단백질(protein of interest)을 코딩하는 유전자를 운반하는 특정한 벡터에 의해 무혈청(serum-free) 조건에서 안정적으로 형질감염(transfect)된 불멸화된(immortalized) 인간 세포주의 무혈청 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 세포주의 생산, 상기 생산 세포주를 이용한 상기 목적 단백질의 생산 방법, 및 목적 유전자를 운반하는 특정한 벡터에 관한 것이다.
인간 단백질의 재조합 생산은 일반적으로 안정적으로 형질감염된 진핵 세포주 및 바람직하게는 포유동물 세포주의 배양 및 배양액으로부터의 단백질의 분리에 의해 수행된다. 재조합 단백질이 약학적 응용을 위해 의도되는 경우, 인간 세포에 의해 유지되고 발현될 수 있는 감염체(infectious agent)를 동시에 정제할 위험을 배제하기 위해 비-인간(non-human) 세포주를 사용하는 것이 오랜 관행이었다.
인간 혈액 응집 인자 VIII와 같은 일부 인간 단백질의 생산에서, 비-인간 세포주의 사용은 일부 단점, 예를 들면, 발현된 단백질의 배지로의 불만족스러운 분 비 수준을 수반하는 것으로 확인되었다. 이는 단백질 번역 및 변형을 위한 세포내 경로에 있어서, 상이한 종류의 포유동물 세포들 내에서의 미세한 차이 때문일 수 있는 것으로 사료되며, 이는 또한, 발현된 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대해 영향을 미칠 수 있다. 이 외에, 비-인간 발현 시스템으로부터 정제된 치료용 단백질이 환자에서 항원성 반응을 일으킬 수 있는 세포 성분들에 의해 오염된다는 우려가 있었다. 또한, 비-인간 발현 시스템에서 재조합 방법에 의해 생산된 인간 단백질 상에서 발견되는 비-인간 글리코실화 양상에 대한 우려가 있었다. 이는 환자에서 항원성 반응의 가능성을 증가시키는 것으로 사료된다. 또한, 응고 인자와 같은 혈액 단백질의 생물학적 안정성 및 효능은 실질적으로 그들의 N-글리코실화(N-glycosylation) 양상에 의해 영향을 받는다. 특히 주변(peripheral) 단당류 및 말단 단당류가 중요하며, 이는 주변 단당류 및 말단 단당류가 그들의 분해를 담당하는 세포로부터의 특정한 수용체에 의해 검출되기 때문이다. 응고 인자는 예를 들면, 말단 단당류로서 시알산 잔기를 갖는다. 당단백질(glycoprotein)의 안테나에서 시알산의 조성의 변형은 이질적인 글리코실화 양상을 초래할 수 있다. 따라서, 변형이 일어나는 경우, 생물학적 안정성 및 효능이 결정적으로 영향을 받는다. 따라서, 재조합 응고 인자의 생산에서 인간 세포주 대비 비-인간 생산 세포주로부터의 글리코실화의 영향을 평가하는 것은 중요한 고려 사항이다. .
반면에, 바이러스 전사 활성자(viral transcription activator) 단백질을 발현하는 불멸화된(immortalized), 안정적으로 형질감염된 포유동물 세포주를 포함하는 원하는 유전자의 고 수준 단백질 발현을 위한 일반적인 방법이 개시되었다(예 를 들면, 미국특허 제5,712,119호). 이 세포주들은 적합한 바이러스 전사 프로모터가 목적 유전자를 코딩하는 DNA 서열과 작동적으로 연결된 것인 벡터 작제물(construct)에 의해 형질전환될 수 있고, 상기 세포주에 의해 제공된 전사 활성자 단백질은 상기 바이러스 전사 프로모터를 활성화시키고 따라서 상기 목적 유전자의 발현을 개시한다.
재조합 유전자를 불멸화된 생산 세포주로 도입시키기 위해 이용되는 벡터도 세포주만큼 중요하다. 다양한 벡터들이 포유동물 단백질의 번역을 위해 이용되었다(예를 들면, Witsch-Baumgartner, M et al. Am. J. Genet (2000). 66, 402-412는 DHCR7 cDNA를 pCI-neo 포유동물 발현 벡터로 클로닝시키고 HEK 293 세포에서 발현시켰고; McGarvey, T. W. et. al. Oncogene (2001) 20, 1041-1051는 TERE1 유전자를 pTARGET 포유동물 발현 벡터로 클로닝시키고 인간 방광 이행 세포 암종(human bladder transitional cell carcinoma)에서 발현시켰으며; Lin Lin et. al. J Biol Chem (2002) 277 (44) 41872-8은 AchR 유전자를 포유동물 세포 발현 벡터 pEF6/myc-His 벡터로 클로닝시키고 이를 293 세포에서 발현시켰다). 재조합 단백질의 과다-발현을 수행할 수 있는 것으로 입증된 최근에 개발된 매우 강력한 벡터는 소위 Invitrogen의 pcDNATM3.1 벡터이다. Li J. et al., Life Sci. 2004 Apr 16; 74(22):2693-705은 HEK 293 세포에서 pcDNA 3.1을 이용하여 히스톤 디아세틸라아제를 성공적으로 과다발현시켰다. 상기 세포들은 혈청의 존재 하에 안정적으로 형질감염되고 배양되었다. Yuan-Gen Fu. et al., World J Gastroenterol 2003는 pcDNA 3.1(+)에 기반한 진핵세포 벡터로 일시적으로 형질감염되고 혈청의 존재 하에 배양된 위암 세포주 SGC7901 상에서 pcDNA 3.1(+)에 기반한 진핵세포 벡터를 이용하여 돌연변이 카스파아제-3을 발현시켰다. Ma H. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec;41(13):4232-9은 COS-7를 세포주로 이용하여 pcDNA3.1 벡터로 서브클로닝된 Lp82 및 Lp-82 관련 단백질을 발현시켜서 안정적인 단백질의 부족 및 효소 활성의 상실을 조사하였다. 세포들은 배지에서 혈청의 존재 하에 일시적으로 형질감염되고 배양되었다. 티오레독신 과다발현은 폐 내피 세포에서 NO 신타아제 활성의 NO-유도 감소를 방지한다. Zhang J. et al., Am J Physiol. 1998 Aug; 275(2 Pt 1): L288-93은 pcDNA 3.1 벡터에 의한 돼지 폐 동맥 내피 세포의 일시적인 형질감염에 의해, 배양된 상기 세포에서 티오레독신 유전자의 과다발현을 개시한다. 형질감염된 세포들은 혈청으로 보충된 배지에서 배양되었다. Shinki T. et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 1997 Nov 25; 94(24):12920-5는 랫트 신장 미토콘드리아 시토크롬 P450 혼합 기능(mixed function) 옥시다아제, 25-히드록시비타민 D3-1알파-히드록실라아제에 대한 전장(full length) cDNA를 비타민 D 결핍 랫트 신장 cDNA와 비교하고 이를 포유동물 발현 벡터 pcDNA 3.1 (+)로 서브클로닝하고 상기 벡터를 COS-7 형질전환된 원숭이 신장 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 상기 형질감염된 세포들을 혈청으로 보충된 배지에서 배양하였다. Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004, 36(10): 707-712은 인간화된 520C9 단일 사슬 Fv 항체/인간 인터루킨-2 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 pcDNA에 의한 인간 태아 신장 293 세포의 형질감염을 개시한다. 상기 세포들을 무 혈청 SFM II 배지에서 3일 동안 배양한 후 상층액을 채취하였다. 결과물인 융합 단백질은 p185(유방암에서 항체 요법에 대한 유망한 표적)에 대한 결합 특이성을 가졌고 IL-2의 중요한 면역-자극 활성을 유지했다. Chen, J.Z. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2004 Aug; 36(8):1554-61은 pcDNA-Bim 알파3으로 형질감염된 HEK 293 세포를 사용하여, 아폽토시스를 위한 필수적인 인자인 Bim 단백질을 과다발현시켰다.
약학적 응용을 위해 재조합 단백질의 안전성을 증가시키기 위한 또 다른 방법은 혈청의 사용은 안전성 위험 및 원치않은 오염원을 의미하므로, 배양 과정에서 무혈청 배지의 사용이다. 그와 같은 무혈청 배양은 제조방법의 수율이 일반적으로 크게 감소된다는 단점을 갖는다. 또 다른 안전성 우려는 실시에서 통상적인 방법으로서 숙주 세포를 형질감염시키는 경우 혈청의 사용이며, 이는 형질감염 절차에서 혈청의 사용은 나중에 생산 공정에서 세포에 의해 발현되는 산물을 오염시키게 되는, 원치않는 생물학적 물질이 세포 내로 통합되게 할 수 있다. 재조합 단백질의 생산을 위한 이용가능한 방법들(전술된 방법 포함) 중 일부는 무혈청 배양을 가능하게 하나, 인간 세포의 무혈청 안정적인 형질감염은 알려져 있지 않다. 2005년 6월 5일에서 8일까지 열린 제19회 ESACT 회의에서, CHO 세포의 무혈청 형질감염이 Kuchenbecker 등에 의해 제안되었다. 따라서, 인간 재조합 단백질을 생산하는 효과적이고 안전한 방법을 개발하는 것이 바람직하다.
놀랍게도, 오염되지 않은 인간 단백질(즉, 원치않는 단백질 부산물을 포함하지 않는 단백질 제제(protein preparation))이 목적 단백질을 코딩하는 유전자로, 무혈청 조건 하에서 안정적으로 형질감염된 불멸화된 인간 세포주로부터 양호한 수율로 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 보다 상세하게는, 본 발명은:
(1) 인간 표적 단백질 또는 그의 유도체 또는 돌연변이체를 코딩하는 유전자, 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함하고, 상기 프로모터 및 폴리A 신호는 각각 상기 인간 표적 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단에 연결된 것인 핵산 서열로 안정적으로 형질감염된 불멸화된(immortalized) 인간 세포주를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 무혈청 조건 하에서 상기 핵산 서열 및 복제 원점(origin of replication)을 포함하는 형질감염 벡터로 무한성장의 인간 숙주 세포주를 형질감염시키는 단계를 포함하는 것인 방법;
(2) 상기 (1)의 방법에 있어서, 형질감염 벡터는 서열번호 4 또는 5의 서열을 갖는 pcDNA 3.1 벡터로부터 유래된 것인 방법;
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 방법에 있어서, 상기 인간 세포주는 293 세포(ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), 프리스타일(FreeStyle) 293 세포(이하에서 "293F" 세포라 함; Invitrogen R79007) 및 293T 세포(ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494)로부터 선택된 인간 태아 신장 세포인 것인 방법;
(4) 상기 (1) 내지 (3)의 방법에 있어서, 상기 인간 단백질은 혈액 응고 인자 IX(예를 들면, 서열번호 1의 939에서 2324까지의 염기에 의해 코딩되는 혈액 응고 인자 IX), 알파-1-안티트립신(이하에서, "A1AT"라 함; 예를 들면, 서열번호 2의 913에서 2259까지의 염기에 의해 코팅되는 인간 A1AT), 혈액 응고 인자 VIII(서열번호 8로 표시된 야생형(wt) 인자 VIII, 또는 서열번호 3의 783에서 5162까지의 염기에 의해 코팅되는 B-도메인 결실형 인간 인자 VIII 포함), 인자 VII/FVIIa(서열번호 13 및 14에 의해 코딩된 그의 a형 및 b형 포함), G-CSF(서열번호 15, 16 및 17로 표시된 G-CSF a형, b형 및 c형), 또는 폰 빌레브란드(von Willebrand) 인자(vWF)인 것인 방법;
(5) 복제 원점(origin of replication) 및 상기 (1) 및 (2)에 정의된 바와 같은 인간 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질감염 벡터(transfection vector)로서, 바람직하게는 상기 형질감염 벡터는 상기 (4)에 정의된 바와 같은 인간 단백질에 대한 유전자를 포함하는 pcDNA3.1 벡터인 것인 형질감염 벡터;
(6) 상기 (1) 내지 (5)에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능하고, 바람직하게는 상기 (3) 또는 (4)에 정의된 바와 같은 것인 불멸화된 인간 세포주; 및
(7) 상기 (6)에 정의된 바와 같은 불멸화된 인간 세포주를, 바람직하게는 무혈청 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 표적 단백질 또는 그의 유도체 또는 돌연변이체의 재조합 생산방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 혈청 및 단백질을 전혀 포함하지 않는 조건 하에서 인간 불멸화된 세포주에서 인간 재조합 단백질을 형질감염시키고 생산하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 단백질의 무혈청 형질감염 및 생산을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 바이러스 불활성화 절차를 포함한 하나 이상의 정제 단계들을 포함할 수 있고, 이는 인간 병원체에 의한 재조합 단백질의 오염 위험을 감소시킨다. 인간 세포주에서 생산된 인간 재조합 단백질은 인간의 글리코실화 패턴을 가지므로, 그들은 천연 글리코실화 패턴을 갖지 않는 인간 단백질에 비해 분해에 대해 덜 민감하다. 요약하면, 본 발명의 방법은 선행 기술에 비해 다양한 장점을 제공한다.
특히, 본 발명의 구체예(7)의 방법은 안전하고 높은 활성을 갖는 인간 재조합 혈액 응고 인자, 예를 들면, 인간의 B형 간염 및 A형 간염에 대한 치료적 적용을 위한 인자 IX 및 FVIII을 생산하는 효과적인 시스템을 제공한다. 상기 방법은 야생형 단백질의 발현에 적합하나, 또한 단백질 분해효소에 의한 불활성화(proteolytic inactivation)에 대해 예외적으로 안정하고 따라서 강한 바이러스 불활성화 프로토콜을 견딜 수 있는 그와 같은 단백질의 돌연변이체, 예를 들면, 인자 VIII의 돌연변이체를 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 구체예 (7)의 방법의 바람직한 모드는 상기 인간 혈액 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결된 프로모터를 갖는 벡터를 가진 불멸화된 세포주를 무혈청 배양하는 단계를 포함한다. 상기 인간 혈액 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 3' 말단은 소 성장 호르몬 폴리A 신호에 작동적으로 연결된다. 본 발명에 따르면, 불멸화된 인간 세포주는 벡터에 의해 안정적으로 형질감염된다. 안정적인 형질감염을 검출하기 위해, 벡터는 인간 혈액 단백질에 대한 유전자 외에, 프로모터에 작동적으로 연결된 선택 마커 시스템에 대한 유전자를 하나 이상 더 포함할 수 있다.
적합한 프로모터는 바이러스 프로모터, 상시발현(housekeeping) 프로모터, 조직 특이적 프로모터 등을 포함한다. 프로모터가 바이러스 프로모터인 경우, 세포주는 상기 프로모터에 대해 매칭되는 바이러스 전사 활성자 단백질(matching viral transcription activator protein)을 포함하지 않는다. 그러나, 세포는 인간 혈액 단백질을 코딩하는 유전자에 작동적으로 연결되지 않은 또 다른 바이러스 프로모터를 보충하는 T 항원과 같은 바이러스 전사 활성자 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF-1알파 프로모터, HSV TK 프로모터 등이고, 가장 바람직하게는 프로모터는 CMV 프로모터, 즉, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 구성적이고(constitutive), 주요한 중간 조기 프로모터(major intermediate early promoter)이다.
"형질감염(transfection)" 또는 "형질감염된(transfected)"이라는 표현은 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 핵산의 세포로의 도입을 의미한다. 일반적으로, 핵산은 DNA 서열, 특히, 적합한 프로모터 하에 그 발현이 상기 프로모터에 의해 조절되는 것인 목적 유전자를 운반하는 벡터, 또는 플라스미드이다. 그러나, 용어 형질감염은 또한 RNA 형질감염을 포함한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 DOTAP(Roche), DOSPER(Roche), Fugene(Roche), Transfectam®(Promega), TransFastTM(Promega) 및 TfxTM(Promega), Lipofectamine(Invitrogene) 및 293fectinTM(Invitrogene)과 같은 양이온성 지질, 또는 인산칼슘 및 DEAE 덱스트란과 같은 담체(carrier) 분자를 이용한 방법과 같은 다양한 형질감염 방법을 잘 알고 있다. 당업자는 또한 무작위 대입식 형질감염(brute force transfection) 기법을 잘 알고 있다. 이들은 전기천공(electroporation), 핵산 코팅된 담체 입자에 의한 충격(bombardment with nucleic-acid coated carrier particle)(유전자 총), 및 미세주입(microinjection)을 포함한다. 마지막으로, 당업자는 또한 바이러스 벡터를 이용한 핵산 형질감염을 잘 알고 있다.
"일시적으로 형질감염된(transiently transfected)" 또는 "일시적 형질감염(transient transfection)"은 도입된 핵산의 에피좀 속성(episomal nature) 때문에, 목적 유전자의 일시적인, 즉, 비-영구적인 발현을 의미한다. 그의 속성 자체에 의해, RNA 형질감염 또는 세포용해성(cytolytic) 바이러스는 일시적인 발현을 위해서 사용될 수 있을 뿐이다. DNA(플라스미드 또는 벡터)를 포함한 에피좀 핵산은 세포에 의해 2 내지 4일 후에 분해되고, 따라서, 목적 유전자의 발현이 그때 중단된다.
"안정적으로 형질감염된(stably transfected)" 또는 "안정적인 형질감염(stable transfection)"은 형질감염된 DNA의 세포의 게놈내로의 삽입에 따른 목적 유전자의 영구적인 발현을 의미한다. 모두는 아니나, 대부분의 세포들은 매우 낮은 비율이긴 하나, 에피좀 DNA를 그들의 게놈 내로 통합시키는 능력을 갖는다. 그러나, 형질감염된 DNA를 통합한 세포들을 확장시키기 위해 정교한 선택 전략이 사용된다. 그 때문에, 벡터는 예를 들면, 히그로마이신과 같은 선택 마커에 대한 유전자를 하나 이상 포함해야 한다.
본 명세서에서, 용어 "안정적인 형질감염" 또는 "안정적으로 형질감염된"은 자율적으로 복제하고 따라서 외래 유전자의 장기적인 발현을 위해 이용될 수 있는 플라스미드를 갖는 세포를 의미한다. "안정적으로 형질감염시키는" 세포에 적용가능한 하나의 특정한 유전자 전달 시스템은 재조합 레트로바이러스에 기반한다. 프로바이러스 DNA(proviral DNA)의 통합은 레트로바이러스 복제 사이클 동안 필수적인 단계이기 때문에, 재조합 레트로바이러스에 의한 세포의 감염은 매우 높은 비율의 목적 유전자를 통합하고, 따라서, 안정적으로 형질감염된 세포를 생성할 것이다.
용어 "배양하는(culturing)"은 세포의 증식 및 유전자 발현을 지지하는 배지를 포함하는 용기에서의 세포/세포주의 인 비트로 유지를 의미한다. 따라서, 배양은 배양 배지에 발현된 분비성 단백질의 축적을 유발한다. 배지는 일반적으로 아미노산, 지질, 미량 원소, 비타민 및 기타 성장 촉진 성분들 외에, pH를 안정화시키는 보조제를 포함한다.
"무혈청(serum-free)", "무혈청 형질감염(serum-free transfection)" 또는 "무혈청 배양(serum-free cultivation)"은 혈청을 제외한 적합한 보충제를 포함하는 배지에서의 세포의 형질감염 및 배양을 의미한다. 보충제는 아미노산, 지질, 미량 원소 및 기타 성장 촉진 성분으로부터 선택된다. 종종 "무혈청" 배양 조건은 훨씬 더 엄격하고, 외래 단백질이 첨가되지 않거나 또는 이미 배지 내에 포함되지 않은 경우, 그 배지는 "단백질-불포함(protein-free)"이라 지칭된다.
용어 "불멸화된 인간 세포주(immortalized human cell line)"는 개체로부터 직접 채취된 일차 세포(primary cell)가 아닌 인간 세포를 의미한다. 특히, 이는 적합한 신선한 배지 및 공간이 주어지는 경우 무한정 증식하고, 따라서, 해이플릭(Hayflick) 한계를 벗어난 영구적으로 수립된 세포주를 의미한다.
용어 "농축(concentration)"은 배양 배지로부터 생성된 재조합 단백질의 농축을 의미한다. 내재적으로, 이는 또한 단백질의 농축을 초래한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 한외 여과(ultra filtration)를 포함한 여과, 원심분리, 침전 등과 같은 농축 기법을 잘 알고 있다. 농축은 반드시 순수한 단백질을 생성하는 것은 아니고, 분리된 단백질은 비-단백질(non-protein) 오염물 및 단백질 오염물을 여전히 포함할 수 있다. 종종 추가적인 정제 단계들이 요구된다.
용어 "정제(purification)"는 실질적으로 순수한(60% 이상 순수한, 바람직하게는 75% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 90% 이상 순수하고, 가장 바람직하게는 99.9% 이상 순수한) 인간 재조합 단백질을 수득하기 위해 분리된 단백질에 적용되는 단계들을 의미한다. 적합한 방법에 의해 순도(purity)가 측정될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 면역-친화도 크로마토그래피(immuno-affinity chromatography), 친화도 크로마토그래피, 단백질 침전, 완충액 교환(buffer exchange), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피, 전기영동과 같은 재조합 단백질의 정제를 위해 적용가능한 기법들을 잘 알고 있다. 또한, 정제는 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 화학 물질의 존재하에 또는 부재하에 건조 또는 액체 상태로 열 처리 및/또는 용매 디터전트(SD) 처리와 같은 바이러스 불활성화 단계를 포함할 수 있다. 또한, 정제는 단백질 침전, 여과, 크로마토그래피 단계, 특히, 친화도 크로마토그래피 단계(예를 들면, "Partitioning of TSE infectivity during ethanol fractionation of human plasma", Gregori, L. et al., Biologicals 32 1-10; 2 (2004); and "Removal of TSE agents from blood products" Foster, P.R., Vax Sanguinis 87 (Suppl. 2), S7-S10 (2004) 참조)와 같은 프리온 제거를 위한 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 바이러스 불활성화 후에, 전술된 것들 중 하나로부터 선택된 추가적인 정제 단계가 바이러스 불활성화를 위해 사용된 화학 물질의 제거를 위해 필요할 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 적합한 제어 요소들과 함께 결합된 경우 복제할 수 있고, DNA 단편들이 삽입되거나 클로닝될 수 있는, 플라스미드, 파아지(phage), 코스미드(cosmid) 등과 같은 유전적 작제물(genetic construct)를 의미한다. 벡터는 고유한 제한효소 인식부위(restriction site)를 포함하고 숙주 세포에서 자율적인 복제가 가능할 수 있다. 상기 용어는 클로닝 비히클 및 발현 비히클을 포함한다. "벡터"는 하나 이상의 조절 요소를 더 가질 수 있고, 상기 조절 요소는 바람직하게는 스플라이싱 부위(splice site), 재조합 부위, 폴리 A 부위, 인핸서, 다중클로닝 부위(multicloning site) 및 원핵세포 플라스미드 서열로부터 선택될 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된(functionally linked)"은 프로모터가 목적 단백질, 특히, 인간 혈액 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 전사를 촉진할 수 있는 방식으로 벡터 내에 위치하는 것인 벡터의 구성(configuration)을 의미한다.
용어 "성숙한(mature)"은 주어진 단백질의 가공된 단백질, 즉, N-말단 유출 신호(N-terminal export signal)가 제거된 단백질의 분자 구조를 의미한다.
용어 "프로모터(promoter)"는 전사의 개시 동안 RNA 폴리머라아제 및 전사 인자에 의해 결합되는 조절성 DNA 서열의 영역을 의미한다.
용어 "인핸서(enhancer)"는 진핵세포 프로모터의 이용을 증가시키는 시스-작용 서열(cis-acting sequence)을 의미하고, 프로모터에 대한 임의의 배향 및 임의의 위치(상향 또는 하향)에서 기능할 수 있다.
용어 "폴리아데닐화(polyadenylation)(polyA) 신호"는 특화된 종료 서열(specialized termination signal)을 의미한다. 폴리아데닐화 신호는 mRNA의 세포질로의 유출을 가능하게 하는 mRNA 말단으로의 아데닌 "테일(tail)"의 첨가를 신호한다. 세포질에 도달한 후, mRNA의 폴리A 테일은 단백질 번역 동안 유지되고 단백질 발현 동안 mRNA를 안정화시킨다.
용어 "코딩하다(encodes)" 또는 "코딩하는(encoding)"은 적합한 조절성 서열의 제어 하에 배치되는 경우 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 폴리펩티드(단백질)로 전사(DNA의 경우) 또는 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 서열의 특성을 의미한다.
본 출원의 목적을 위해, 용어 "발현하다(express)", "발현하는(expressing)", 또는 "발현(expression)"은 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 및 번역을 의미한다.
본 발명의 "인간 단백질(human protein)"은 인간 단백질, 폴리펩티드, 그의 돌연변이체 및 그의 변형물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 인간 단백질은 재조합 혈장 단백질, 예를 들면, 혈액 응고 인자(예를 들면, 인자 VIII, 인자 VII/VIIa, 인자 V, 인자 IX, 인자 XI, 폰 빌레브란드 인자, 등), 성장 인자(예를 들면, 에리트로포이에틴, 등), 콜로니-촉진 인자(CSF)(예를 들면, 과립구 촉진 인자(G-CSF), 대식구 CSF(M-CSF), 과립구-대식구 CSF(GM-CSF), 시토킨(예를 들면, 인터루킨-3을 포함한 인터루킨, 등), 단백질 분해효소 억제제(예를 들면, 알파-1-안티트립신(A1AT), 키모트립신, 등), 수송 단백질(예를 들면, 호르몬 등), 억제성 또는 조절성 작용 단백질(inhibitory or regulatory acting protein), 및 그 등가물을 포함한다. 또한, 이 단백질 또는 폴리펩티드의 돌연변이 및 변형이 포함되며, 구체적으로, 돌연변이 또는 변형은 재조합 단백질의 보다 우수한 안정성, 연장된 반감기, 또는 보다 우수한 회수를 제공하고, 각각 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이 및 작용기의 화학적 돌연변이를 포함한다. 본 출원 발명의 방법에 의해 제조될 수 있는 특히 바람직한 단백질은 인간 인자 VIII(B-도메인 결실형 또는 야생형), 인간 인자 IX, 인간 G-CSF, 인간 A1AT, 인간 인자 VII/VIIa 및 폰 빌레브란드 인자이다.
인자 VIII 및 IX의 재조합 생산은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다(EP-A-160457; WO-A-86/01961, 미국특허 제4,770,999호, 제5,521,070호 및 제5,521,070호). 인자 VIII의 경우, 응집 활성을 보이는 복합체의 생산을 위한 서브유닛의 재조합 발현이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, 미국특허 제5,045,455호 및 제5,789,203호). 또한, 고도로 글리코실화된 B-도메인을 코딩하는 서열이 부분적으로 또는 전체적으로 결여된 절단된(truncated) cDNA-버전의 발현이 개시되었다(예를 들면, WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, 미국특허 제4,868,112호 및 제4,980,456호, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 및 WO-91/09122). Arg740과 Glu1649 사이의 B-도메인이 3개 이상의 Arg 잔기를 가지며, 10개 내지 25개의 아미노산 잔기를 포함하는 Arg-풍부 링커 펩티드(Arg-rich linker peptide)에 의해 치환된 것인 특정한 인자 VIII 돌연변이체(상기 인자 VIII의 번호체계(numbering)는 서열번호 9로 표시된 성숙한 야생형 인자를 기준으로 함)가 그 전체가 본 명세서에 포함된 WO 01/70968에 개시된다. 특히, Arg-풍부 링커 펩티드는 14개 내지 20개의 아미노산 잔기를 가지며, 하기를 포함하는 링커가 특히 바람직하다:
아미노산 서열 SFSQNSRH (서열번호 10), 및/또는
아미노산 서열 QAYRYRRG (서열번호 11), 및/또는
아미노산 서열 SFSQNSRHQAYRYRRG (서열번호 12).
그와 같은 B-도메인 인자 VIII 돌연변이체는 서열번호 3의 783번 뉴클레오티드부터 5162번 뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
G-CSF는 호중구(neutrophil)로 알려진, 골수로부터 유래된 종류의 백혈구의 생산을 촉진하는 인간 혈액의 계통-특이적(lineage-specific), 소형 분자이다. 호중구는 신체의 면역계에서 중심적인 역할을 수행하며 감염을 방어한다. G-CSF(특히, 그의 a형, b형 및 c형의 cDNA 서열은 각각 서열번호 15, 16 및 17에 표시되고; G-CSF b형(이하에서, "G-CSFb" 단백질로 칭함)은 서열번호 27로 표시됨)는 천연적으로 단핵구, 섬유아세포, 및 내피세포에 의해 생산된다. 일반적으로, 혈액에서 그 농도는 건강한 사람의 경우, 약 40 pg/ml이다. 환자의 혈장에서, G-CSF의 수준은 10배 이상 저하될 수 있다. G-CSF는 또한, 약 70 ng/ml를 분비하는 5637 세포와 같은 암 세포주에서 생산된다. 치료법을 위해, 재조합 인간 G-CSF는 Amgen Inc.에 의해 페길화(PEGylated) 생성물로도 이용가능한(Pegfilgrastim/Neulasta®), N-말단 메틸화, 비-글리코실화된 형(Filgrastim/Neupogen®)으로 대장균에서 생산된다. 또 다른 의약은 Chugai Pharmaceuticals Co에 의해 CHO 세포에서 생산되며, 글리코실화된 생성물(Lenograstim/Granocyte®)을 가져온다. G-CSF는 유전형이거나 또는 화학요법(암)에 의해 유발된 호중구 감소증(neutropenia), AIDS, 또는 골수 이식을 치료하기 위한 약물로 사용된다. 이를 위해, 통상적인 투여량은 1일당 5 ㎍/kg이다.
본 출원 발명에 적합한 특정한 A1AT cDNA 서열은 서열번호 2의 973번 뉴클레오티드로부터 2259번 뉴클레오티드의 서열로 주어진다. 특정한 인자 VII/VIIa cDNA는 그의 a형 및 b형에 해당하는 서열번호 13 및 14로 주어진다. 특정한 vWF cDNA는 서열번호 18로 주어진다.
선택 마커 시스템은 히그로마이신 저항성, 푸로마이신 저항성, 네오마이신 저항성, 아데노신 디아미나아제(ADA) 저항성, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제(neo, G418, APH) 저항성, 블레오마이신(phleo, bleo, zeocin) 저항성, 시토신 디아미나아제(CDA, CD) 저항성, 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 저항성, 히스티디놀 디히드로게나아제(hisD) 저항성, 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라아제(HPH) 저항성, 푸로마이신-N-아세틸 트랜스퍼라아제(PAC, puro) 저항성, 티미딘 키나아제(TK) 저항성, 및 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(XGPRT, gpt) 저항성을 포함한다. 특히 바람직한 것은 히그로마이신 저항성 유전자이다. 또한, 선택 마커에 대한 유전자는 소 성장 호르몬(BGH)으로부터 유래된 폴리 A 신호 또는 SV40 폴리아데닐화 신호로부터 유래된 것과 같은 폴리A 신호와 작동적으로 연결될 수 있다.
형질감염된 세포는 선택 단계 동안 그들의 배양 배지에서 히그로마이신과 같은 선택 마커 시스템의 단백질에 지속적으로 노출되어, 벡터를 가진 세포들만의 생존을 초래한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 적용되어야 하는 선별된 선택제의 농축 및 안정적으로 형질감염된 세포의 수립에 적합한 대안적인 선택 마커를 잘 알고 있다.
본 발명의 특히 바람직한 벡터는 CMV 프로모터, 히그로마이신 유전자, 폴리A 서열 및 목적 유전자를 가지며, 바람직하게는 서열번호 4의 서열을 갖는 Invitorgen의 pcDNA3.1 벡터이며, 상기 벡터의 재 서열결정으로 실제로 상기 벡터는 서열번호 5의 서열을 갖는것으로 확인되었다.
본 발명의 방법에 적합한 불멸화된 세포주는 신장, 방광, 간, 폐, 심장근육, 연근육, 난소 또는 위장관 세포의 군으로부터 선택된다. 이 세포들은 그들의 게놈에 아데노바이러스 DNA 서열, 특히, Ad5 서열의 최초 4355개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 바람직한 것은 293 세포(ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), 293T 세포(DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229), 및 프리스타일(FreeStyle) 293 세포(293F cells; Invitrogen R79007)로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 태아 신장 세포(HEK)이다. 가장 바람직한 것은 293F 세포이다. 상기 벡터를 갖는 그와 같은 불멸화된 세포주는 재조합 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다. 본질적으로, 그들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 표준 배양 조건이나, 인간 인자 IX에 대한 유전자를 갖는 세포의 경우, 비타민 K가 배지에 포함되어야 한다.
본 발명의 특정한 구체예는 안정적으로 불멸화되고(immortalized), 또한 무혈청 조건에서 형질감염된 세포의 무혈청 배양에서의 재조합 단백질의 무혈청 생산이다. 전술된 불멸화된 인간 세포주의 경우, 바람직하게는, 293F 세포주는 무혈청 조건 하에서 형질감염되고 배양된다. 세포들은 혈청의 부재 하에 현탁 배양에서 안정적으로 형질감염되고 단일 세포 클론의 선택을 위해 부착성 세포 성장(adherent cell growth)에 적응된다. 일단 개별적인 클론이 수득되면, 그들은 부착적으로 확대된다. 가장 우수한 생산용 클론의 선택 후에, 세포들은 현탁 배양으로 이전된다. 전체의 안정적인 세포주 절차 동안 및 생산을 위한 추가적인 규모 확장(up-scaling)에서, 세포들은 무혈청 배지에서 배양되고 혈청 또는 인간 또는 동물 단백질과 접촉되지 않는다. 혈액 응고 인자 또는 A1AT와 같은 단백질 분해효소 억제제 또는 성장인자(예를 들면, G-CSF 및 GM-CSF)와 같은 재조합 혈액 단백질은 배양액으로부터 분리되고, 표준 정제 단계가 뒤따른다. 보다 상세하게는, 재조합 인간 혈액 단백질, 특히, 인간 인자 VIII 또는 인자 IX 또는 A1AT 또는 G-CSFb의 무혈청 생산의 특정한 구체예는 하기 단계들을 포함한다:
(1) 무혈청 현탁 배양에서 인간 불멸화된 세포, 바람직하게는 293F 세포의 형질감염. 세포들은 1회용의 멸균된 폴리카르보네이트 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 배양된다. 세포들은 형질감염 작용제(transfection agent), 바람직하게는 양이온성 형질감염 작용제, 보다 바람직하게는 리포펙타민 2000 CD 시약(Invitrogen) 또는 인산칼슘 형질감염 방법을 위한 시약에 의해, 예를 들면, ml 당 1 x 106 개의 생존가능한 세포의 농도로 형질감염되고; 인간 혈액 단백질을 코딩하는 벡터로 형질감염되며, 바람직하게는 상기 벡터는 pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-FVIII, pcDNA3.1-A1AT 또는 pcDNA3.1-GCSFb이다;
(2) 형질감염 후 24시간 내지 120시간, 바람직하게는 36-96시간, 보다 바람직하게는 48시간 경과 시, 적합한 수의 세포(103 내지 1010; 바람직하게는 105 내지 108, 가장 바람직하게는 106 개의 세포)가 부착성 성장(adherent growth)를 수립하기 위해 침전용의 편평한 배양 디쉬로 이전시킨다. 바람직하게는 배양 디쉬는 10-cm 디쉬이고, 세포들은 혈청 및 단백질 불포함 배지에서, 바람직하게는 프리스타일(FreeStyle) 293 발현 배지(12338-018, Invitrogen) 또는 무혈청 자체 배지(in-house medium)(Octapharma Stockholm)에서 배양된다.
(3) 선택 압력(selection pressure)은 편평한 배양 디쉬로의 이전 후 2 내지 50시간, 바람직하게는 48시간 경과시 개시된다. 배지는 선택 마커, 예를 들면, 히그로마이신, 네오마이신, G418 및 제오신(Zeocin)으로 구성된 군으로부터 선택된 적합한 선택 작용제로 보충된다. 바람직한 선택 작용제는 10 내지 300 ㎍/ml, 바람직하게는 50 내지 200 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 50 ㎍/ml의 농도의 히그로마이신이다. 상기 압력은 10 내지 20일 이상, 바람직하게는 14일 동안 유지되고, 이 때 히그로마이신이 보충된 배지는 격일로 교체된다. 안정적으로 형질감염된 세포들만이 이 선택 조건 하에서 생존하고 개별적으로 채취될 수 있는 부착성 세포 클론을 형성한다. 추가적으로, 세포들을 디쉬 상에 부착시키고 세포가 하나의 클론으로부터 다른 세포 클론으로 부양되는 것을 방지하기 위해 부착 인자(attachment factor)가 이용될 수 있다. 이 부착 인자는 폴리-D-라이신, 인간 또는 동물 단백질을 포함하지 않는 합성 배지 보충제 또는 다른 물질일 수 있다. 대안적으로, 클로닝 링(cloning ring)이 클론의 채취를 위해 이용될 수 있다.
(4) 세포들의 무혈청 확대(serum-free expansion)(확장(scaling up))를 위해 선택 압력은 생략된 채, 개별적인 세포 클론이 채취되어 별개의 배양 용기로 옮겨지진다. 임의의 배양 용기의 경우, 적합하게 그러나 바람직하게는 개별적인 클론이 먼저 충분한 양의 배지를 갖는 96-웰 플레이트로 옮겨지고, 그 후 48-, 24-, 12- 및 6-웰 플레이트로 옮겨지고, 그 후, 스핀튜브(spintube)로 옮겨진다. 스핀튜브 단계에서, 세포들은 현탁 성장으로 회귀하지 않도록 부드럽게 진탕하면서 무혈청 배지에서 배양된다. 일단 세포들이 6-세포 웰 플레이트 또는 스핀튜브 단계에 도달하면, 일부 선택 기준, 즉, 보다 빠르게 성장하는 세포가 바람직한 것인 세포의 성장 속도 및 그들이 생산하는 재조합 단백질의 양에 따라 가장 우수한 세포 클론을 선택할 수 있다. 그러나, 상기 선택은 보다 이후의 단계에서 수행될 수도 있다.
(5) 스핀튜브 배양으로부터 수득된 세포들을 충분한 양의 무혈청 배지를 담은 엘렌마이어 배양 용기에 접종한다. 확장된, 현탁 성장된 혈청- 및 단백질-불포함 세포 클론에 대한 추가적인 선택 기준은 다음과 같다: 생존력(viability), 세포 형태, 응집(aggregation)의 부재, 원심분리에 대한 강건성(robustness) 및 세포 잔해 (cell debris)의 부재.
본 발명의 방법은 벡터가 pcDNA3.1-hygro(+)-zz인 경우 특히 잘 작용한다. 인간 단백질, 특히, 인간 FIX, FVIII, A1AT 또는 G-CSFb를 코딩하는 유전자가 각각 도 2, 3, 7 및 11에 도시된 바와 같이 CMV 프로모터의 제어 하에 놓이도록 삽입되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 유전자의 야생형 서열이, 재조합에 의해 발현된 단백질은 돌연변이를 포함하지 않으며 혈액 혈장으로부터 분리된 야생형 단백질과 구조적으로 동일하도록 삽입된다. 야생형 인간 인자 IX의 약식도(schematic drawing)가 도 1에 도시된다. 서열번호 1, 2, 3 및 22는 각각 pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII 및 pcDNA3.1-GCSFb의 핵산 서열을 제공한다. 개별적인 단백질은 각각 939 내지 2224, 913 내지 2259, 679 내지 5055 및 970 내지 1584번 위치의 뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 발명은 따라서, 불멸화된 인간 세포, 바람직하게는 293 세포(ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), FreeStyle 293 세포(293F 세포; Invitrogen R79007) 또는 293T 세포 (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229) 와 같은 인간 태아 신장 세포의 게놈으로 삽입되는, pcDNA3.1TM으로 클로닝되어 각각 pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII 및 pcDNA3.1-GCSFb를 생성하는, 인간 인자 IX, A1AT, factor VIII 및 G-CSFb의 재조합 생산 방법을 제공한다.
pcDNA3.1-FIX 또는 pcDNA3.1-A1AT 또는 pcDNA 3.1-FVIII 또는 pcDNA 3.1-GCSFb을 운반하는 세포들은 유전자 발현을 가능하게 하는 표준 조건 하에서 배지에서 배양되거나 또는 대안적으로 그들은 인간 병원체에 의한 오염의 위험을 최소화하기 위해 무혈청 조건 하에서 배양된다. 하나 이상의 프리온 제거 단계, 예를 들면, 단백질 침전, 여과, 크로마토그래피 단계, 특히, 친화도 크로마토그래피 단계가 포함될 수 있다. 대안적으로/추가적으로, 프리온 넉-아웃 세포주가 발현 세포로 이용될 수 있다. 이는 완전한 게놈 넉-아웃 또는 안티센스 기법에 의해 수득될 수 있다. 인간 인자 IX의 생산의 경우, 세포들은 바람직하게는 비타민 K의 존재 하에 배양된다. 인간 혈액 단백질은 배양 상층액으로부터 분리되고 순수하고 안정적이며 높은 활성을 갖는 생성물의 수율을 최대화하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되고 면역 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등 및 이들의 조합으로부터 선택되는 뒤이은 정제 단계들을 거친다. 그들은 재조합 인자 IX, G-CSFb 또는 A1AT를 분리하기 위해 필요한 특정한 요건에 맞도록 용이하게 개조될 수 있다. 정제 절차 동안 및 그 후에 정제된 단백질의 양 및 활성이 ELISA 및/또는 일-단계 응집 시간 분석(one-stage coagulation time assay: aPTT)에 의해 모니터링될 수 있다.
정제된 단백질 시료 또는 목적하는 분비된 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양 상층액으로부터 직접 수득된 생성물에서 가능한 감염성 오염의 문제를 극복하기 위해, 배양 상층액은 열 처리 및/또는 SD-처리(건조 또는 액체 상태, 단백질 분해효소 억제제를 포함한 화학 물질의 첨가와 함께 또는 첨가 없이)를 포함한 바이러스 불활성화를 위한 절차로 처리될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 정제 절차를 잘 알고 있다. 예를 들면, 혈액 혈장으로부터 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 고 순도의 바이러스-불활성화된 인자 VIII의 분리 및 정제 및 회수가 개시되었다(WO93/15105). 또한, 혈액 혈장 또는 다른 생물학적 출처로부터 고-순도, 비-감염성 응집 인자를 생산하는 여러 방법들이 보고되었다. 지질 코팅된 바이러스는 이-상 시스템(two-phase system)을 형성하고, 뒤이어 수불용성 부분이 제거되는 소수성 상으로 잠재적인 감염성 물질을 처리하는 것에 의해 효과적으로 불활성화된다. 비-이온성 생체적합성(biocompatible) 디터전트 및 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트에 의한 처리로 동시에 또는 순차적으로 소수성 상 처리를 보완하는 추가적인 장점이 입증되었다(WO 96/36369, EP 0131740, US 6, 007,979). 비-지질 코팅된 바이러스는 비-이온성 디터전트에 의한 처리 및 뒤이은 수시간 동안의 가열 단계(60-65 ℃)로 구성되는 불활성화 프로토콜을 필요로 한다(WO 94/17834). 바이러스 불활성화 후에, 화학 물질을 제거하는 추가적인 정제 단계가 필요할 수 있다. 요약하면, 본 발명은 허가된 단백질 정제와 연계된 인간 세포주에 기반하고, 잠재적으로 위험한 감염성 작용제의 불활성화를 위한 효과적인 단백질 생산 방법을 제공한다. 재조합 단백질, 예를 들면, 혈액 응고 인자 IX 또는 VIII, A1AT 및 G-CSFb의 안전하고 사용하기 용이한 생산 시스템이 수립되었다. 재조합에 의해 생산된 단백질의 활성은 표준 테스트로 조사될 수 있다. 인간 인자 IX의 경우, 예를 들면, 수동적인 응고 장치에 의한 Dapptin TC(Kaolin/Sulfatid-Phospholipid Cat. No. 5035090, Technoclone GmbH) 활성화를 이용한 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 분석(activated partial thromboplastin time assay)에 의해 조사될 수 있다. 마지막으로, 전술된 혈액 단백질과 같은, 본 발명의 방법에 의해 수득된 재조합 단백질은 약학적 조성물에서 이용될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에서 더 설명된다. 그러나, 실시예들은 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1: 야생형 인간 응고 인자 IX (FIX) 단백질. 5' UTR(5' untranslated) 영역 및 3' UTR 영역을 갖는 FIX 유전자의 약식도. 가공되지 않은 461개의 아미노산으로 구성된 단백질의 8개의 도메인이 표시된다; S: 시그날(signal) 펩티드 P: 프로펩티드(propeptide); Gla 도메인: γ-카르복시글루타밀 도메인; H 도메인: 소수성(hydrophobic) 서열; EGF 도메인: 상피 성장 인자 유사 도메인(epidermal growth factor-like domain); L: 링킹(linking) 서열; AP: 활성화 펩티드(activation peptide); 촉매 도메인( catalytic domain ). FIX 성숙 단백질은 415개의 아미노산으로 구성된 길이 및 55 kDa의 근사 분자량(approximate molecular weight)을 갖는다.
도 2: 벡터 pcDNA3.1-FIX. 상기 원형 DNA 벡터는 6,960개의 염기쌍을 포함하고, 그의 정확한 서열은 서열번호 1로 주어진다. 약식도에서, CMV 프로모터(CMV), 인간 FIX 유전자(hFIX), f1 원점(f1), SV40 프로모터(SV40)의 제어 하의 히그로마이신(Hyg) 유전자, SV40 폴리 A 영역(SV40 폴리 A), pUC 원점 및 암피실린(Amp) 저항성 유전자 및 다수의 제한효소 인식부위가 표시된다. 이 벡터는 서열이 재결정된(resequenced) pcDNA 3.1 벡터, 서열번호 5의 pcDNA3.1Hygro(+)-zz로부터 유래되었다.
도 3: 벡터 pcDNA3.1-A1AT. 상기 원형 DNA 벡터는 6,914개의 염기쌍을 포함하고, 그의 정확한 서열은 서열번호 2로 주어진다. 약식도에서, CMV 인핸서 프로모터, A1AT cDNA, 강화된 mRNA 안정성에 대한 전사 종료 서열을 포함하는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(폴리A) 신호, f1 원점(f1), SV40 프로모터(SV40)의 제어 하의 히그로마이신(Hyg) 유전자, SV40 폴리 A 영역(SV40 폴리 A), pUC 원점 및 암피실린(Amp) 저항성 유전자 및 다수의 제한효소 인식부위가 표시된다. 이 벡터는 서열번호 5의 벡터 pcDNA3.1Hygro(+)-zz로부터 유래된다.
도 4: 알파-1-안티트립신을 코딩하는 벡터에 의한 상이한 인간 태아 신장 세포의 일시적인 형질감염(transient transfection). 일시적인 형질감염 연구에서 세포주의 비교가 도시된다. 293, 293T 및 293F 세포에 대해 106 개의 세포당 발현된 알파-1-안티트립신(A1AT)의 양(%)이 도시된다. pcDNA3.1-A1AT에 의해 일시적으로 형질감염된 293F 세포에서 발현된 A1AT 양이 100%로 설정되었다.
도 5: 알파-1-안티트립신을 코딩하는 상이한 벡터에 의한 293F 세포주의 일시적인 형질감염. 일시적으로 형질감염된 프리스타일 293F 세포주를 이용하여 상 이한 벡터로부터 발현된 A1AT 농도의 비교가 도시된다. A1AT pcDNA3.1-A1AT의 발현 수준이 100%로 설정되었다. A1AT 유전자를 운반하는 다양한 상이한 벡터도 테스트되었다: 자체 제작된(in-house) 벡터 pTG1-A1AT(도 10에 도시된 인간 재조합 A1AT를 생성하는 자체 벡터), pCMV Script® A1AT (Stratagene) 및 pcI neo-A1AT (Promega)를 pcDNA3.1-A1AT (pcDNA3.1)에 대비해 비교하였다. 어느 벡터도 pcDNA3.1-A1AT에서 관찰된 높은 발현 수준에 근접하지 않았다.
도 6: 세포 배양 상층액의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western blot). pcDNA3.1-A1AT(래인 1-3 및 6-8) 또는 GFP-발현 제어 플라스미드(래인 4 및 8)에 의해 일시적으로 형질감염된 프리스타일 293F 세포의 상층액의 분량을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 래인 1은 크기 마커를 포함하고, 래인 5는 빈 래인이었다. A1AT에 대한 밴드는 화살표로 표시한다. 또한, 래인 4 및 8에서 GFP에 해당하는 27 kDa 밴드를 볼 수 있다.
도 7은 벡터 pcDNA 3.1-F.VIII를 도시한다. 상기 벡터는 9,975개의 염기쌍을 포함하고, 그의 정확한 서열은 서열번호 3으로 표시된다. 783번 내지 5162번 염기쌍에 의해 코딩되는 인자 VIII 단백질은 WO 01/70968에 개시된 B-도메인 결실형 인자 VIII 돌연변이이다. 이 벡터는 서열번호 5의 벡터 pcDNA 3.1 Hygro(+)-zz로부터 유래된다.
도 8: pcDNA3.1-FVIII 및 그 정확한 서열이 서열번호 7에 의해 주어진 자체 벡터 pTGF8-2hyg-s로 293 및 293F 세포를 형질감염시켜서 가장 안정적으로 형질감염된 3개의 클론에 의해 생성된 인자 VIII의 평균 양을 비교한다.
도 9는 벡터 pTG1-A1AT를 도시한다. 상기 벡터는 5,610개의 염기쌍을 포함하고, 그 정확한 서열은 서열번호 6으로 주어진다.
도 10은 벡터 pCR2.1d2-GCSFb를 도시한다. 상기 벡터는 4,542개의 염기쌍을 포함하고, 그 정확한 서열은 서열번호 21로 주어진다.
도 11은 벡터 pDNA3.1-GCSFb를 도시한다. 상기 벡터는 6,237개의 염기쌍을 포함하고, 그 정확한 서열은 서열번호 22로 주어진다.
도 12는 벡터 pCINeo-GCSFb를 도시한다. 상기 벡터는 6,101개의 염기쌍을 포함하고, 그 정확한 서열은 서열번호 23으로 주어진다.
도 13은 벡터 pCMVScript-GCSFb를 도시한다. 상기 벡터는 4,920개의 염기쌍을 포함하고, 그 정확한 서열은 서열번호 24로 주어진다.
도 14는 벡터 pTG2-GCSFb-hyg-as를 도시한다. 상기 벡터는 6,917개의 염기쌍을 포함하고, 그 정확한 서열은 서열번호 25로 주어진다.
도 15는 실시예 9에 따른 상이한 발현 작제물에 의해 생성된 rhG-CSF의 양을 비교한다.
도 16은 실시예 9에 따라 생성된 rhG-CSF의 웨스턴 블롯을 도시한다.
재료 및 방법
단백질 발현용 인간 세포주: 바람직한 세포주는 SV40 온도-민감성 T 항원을 안정적으로 발현하는 형질전환된 인간 태아 신장세포주인 293T (tsA201, ECACC Ref. 96121229), 프리스타일(FreeStyle) 293(293F; Invitrogen R79007) 및 HEK293(ECACC Ref. 85120602)이다. 이 상피-유사 세포주는 다양한 기능성 발현 분석법(functional expression assay)에서 이용되었고 고 수준의 재조합 단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 바람직하게는, 293 세포주로부터 유래된, 293F 세포주(Invitrogen)가 하기의 실시예에서 사용되었다. 모세포주(parental cell line) 293은 절단된(sheared) 인간 아데노바이러스 타입 5 DNA로 형질전환된 일차 인간 태아 신장 세포로부터 수립된 영구 세포주(permanent line)이다(Graham et al., 1977; Harrison et al., 1977). 293F 세포주는 FreeStyleTM 293 (293F) Expression Medium(12338-018, Invitrogen)에서의 현탁 성장에 적응된 293 세포주의 변이주이다. 293F 세포주는 Pharmacopeia의 Robert Horlick으로부터 수득하였다. 293F 세포주는 본래 한정적인 희석(limiting dilution)에 의해 재-클로닝된 모 293F 세포로부터 유래된 낮은 계대(low passage) 마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank) 배양으로부터 제조되었다. 세포들은 본 발명의 개발 동안 1년 이상 동안 무혈청 FreeStyle 293 Expression 배지 또는 무혈청 배지 (Octapharma Stockholm)에서 우수한 생존력 및 양호한 형태로 지속적으로 배양되었다.
인간 인자 IX의 효율적인 생산을 위해, 배지는 비타민 K의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 이 세포주들은 적합한 보충제를 포함하는 무혈청 및/또는 단백질-불포함 배지에서 배양될 수 있다.
표적 단백질의 결정 및 측정
ELISA에 의한 인간 인자 IX 농도의 결정: 상층액에서 인간 재조합 인자 IX의 수준을 표준 절차에 따라 포획 항체(capture antibody)로서 염소 항인간 FIX(GAFIX-AP, Affinity Biologicals)를 이용한 ELISA에 의해 결정하였다. 모든 인큐베이션은 실온(RT)의 습기있는 챔버(humid chamber)에서 수행하였다. 두 개의 표준(reference), Octanyne(플라스미드-유래 FIX, Octapharma) 및 BeneFIX(재조합 FIX, Genetics Institute)를 사용하였다. 검출 항체는 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-인간(peroxidase conjugated goat anti-human) FIX(GAFIX-APHRP, Affinity Biologicals)였다. 각 웰에 ABTS(Cat.No. 1682008, Roche Diagnostics)를 기질로 첨가하고, 405 nm에서 15분 동안 비색 반응(colorimetric reaction)을 검출하였다. 결과는 표준 농도 대 표준 흡광도의 선형 회귀에 의해 계산하였다.
인간 응고 인자 IX 활성의 검출: 상층액에서 인간 재조합 인자 IX의 응고 활성을 하기와 같이 결정하였다: 수동식 응고 장치(Amelung KC 4A micro, Amelung GmbH)로 Dapptin TC(Kaolin/Sulfatid-Phospholipid, Cat.No. 5035090, Technoclone GmbH)를 이용한 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 분석법(activated partial thromboplastin time assay)에 근거하여 응고 활성을 분석하였다. 본 연구를 위해, 형질감염된 세포로부터 유래된 50 ㎕의 상층액, 50 ㎕의 FIX-결핍 혈장(Progen) 및 50 ㎕의 Dapptin TC를 37℃에서 2분간 인큐베이션시켰다. 응집은 50 ㎕ CaCl2 (Cat.No. 84687-22F, Instumentation Laboratory)의 첨가에 의해 개시시켰다. 시료 응집 시간을 Octanyne 또는/및 BeneFIX에 비교하였다.
COAMATIC : FVIII 분석법( Chromogenix )에 의한 BDDrhFVIII 의 결정: 상업적인 발색 분석법(chromogenic assay) 키트 COAMATIC:FVIII(Chromogenix, cat. No. 82 25 85)는 FIX, FX 및 FXa 절단에 의해 황색 수용성 염료로 변하는 색소원을 포함한다. FVIII 함유 시료가 이 시스템을 완성한다: FVIII는 복합체를 형성하여(complexing) FIX를 활성화시키고, 이 복합체는 단백질 분해효소에 의한 절단에 의해 FX를 FXa로 활성화시킨다. FXa는 뒤이어 색소원을 염료로 변형시키고, 뒤이어 405 nm에서 광도계에 의해 결정된다. 이 테스트는 환자 혈장으로부터 FVIII의 결정을 위해 설계되었다. 하기의 절차는 이 테스트가 희석된 배양 배지에서 인자 VIII 측정을 위해 적용될 수 있도록 하기 위하여 수립되었다. 대조 표준(control standard)으로서, 전장(full length) 재조합 인간 응고 인자 VIII(NIBSC, order no. 57814F) 및 정상 대조 혈장(normal control plasma)(Instrumentation Laboratory Company)을 사용하였다.
시료 준비: 시료를 COAMATIC 시약과 함께 제공된 희석 완충액으로 2 내지 20 IU/ml의 예상되는 최종 FVIII 활성까지 희석하고 WHO No. 6 표준 곡선에 비교하였다.
방법: 보온블럭(thermobloc) 상에 배치된 96-웰 어레이 상에서, 표준 및 시료를 모두 삼배수로(in triple) 측정하였다.
작동 체계(웰 당):
시약 용량 인큐베이션((37℃)
희석된 표준 및 시료 50㎕ 4분
인자 시약(factor reagent)(37℃) 50㎕ 96-웰 광도측정 장치에 배치하고, 37℃ 인큐베이터에서 2분간 인큐베이션함
S-2765 + I-2581 (37℃) 50㎕ 96-웰 광도측정 장치에 배치하고, 37℃ 인큐베이터에서 2분간 인큐베이션함
20% 아세트산 50㎕ 96-웰 광도측정 장치에 배치하고, 96-웰 광도계에서 15초간 진탕함
즉시 405 nm에서 흡광도를 측정함
엘라스타아제( elastase ) 활성 테스트에 의한 A1AT 활성의 결정: A1AT cDNA의 형질감염 후에, A1AT를 발현시키고 세포 배양 배지로 분비시켰다. 원심분리(5분, 1000 rpm)에 의한 세포의 제거 후에, 배양 상층액에서 A1AT 활성을 측정하였다. 이 활성 테스트에서, A1AT 활성을 엘라스타아제에 대한 억제 효과에 의해 결정하였다. 엘라스타아제는 기질인 N-숙시닐-(Ala)3-pNA로부터 pNA를 절단한다. pNA 방출은 405 nm에서 광도계에 의해 측정하였다. 정의된 A1AT 활성을 갖는 표준 시료와의 비교에 의해, 개별적인 시료의 활성을 결정하였다. 다른 실험에서 입증된 바와 같이, 본 테스트는 무혈청 프리스타일(FreeStyle) 배지에서 유효하다. 프라스타일 배지가 본 테스트에 대해 영향을 미치지 않는다는 사실을 확인하기 위해, 두 개의 표준 곡선을 준비하였다: 표준 인간 혈장을 T+ 완충액 또는 프리스타일 배지로 희석시켰다.
시료의 희석: 모든 시료를 희석하지 않는 상태 및 프리스타일 배지로 1:10 및 1:50으로 희석된 상태로 테스트하고, 인간 혈장의 표준 희석과 비교하였다.
방법: 각각, 표준 희석액 및 시료 희석액 50 ㎕를 96-웰 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 피펫을 이용하여 첨가하였다. 각 웰에 150 ㎕의 엘라스타아제 용 액(elastase working solution)을 첨가하고, 상기 96-웰 플레이트를 ELISA 판독기 상에서 1분간 진탕하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 100 ㎕의 기질 용액(substrate working solution)을 멀티펫트(multipette)로 각 웰에 첨가하였다. 기질 용액의 첨가 직후 및 37 ℃의 암기에서 7분간 인큐베이션 후 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 제1값은 엘라스타아제-촉매 반응이 일어나지 않은 기본 흡광도를 나타내며 기질로부터 엘라스타아제가 pNA를 절단한 후의 흡광도를 나타내는 제2값으로부터 차감되었다. 차감 후의 결과를 이용하여, 시료의 A1AT 활성을 표준 곡선에 따라 계산하였다.
ELISA에 의한 G- CSF 활성의 결정: 세포 배양 상층액의 인간 재조합 G-CSF 수준을 표준 절차에 따라 포획 항체로서 마우스 항-인간 G-CSF 항체(MAB-214, R&D System)를 이용한 ELISA에 의해 결정하였다. 모든 인큐베이션은 실온의 습기있는 챔버에서 수행하였다. G-CSF 표준(recombinant hG-CSF, E. coli , 214-CS-025, R&D Systems)을 사용하였다. 검출 항체는 비오티닐화된(biotinylated) 염소 항-인간 G-CSF(BAF-214, R&D Systems)였다. 스트렙타비딘을 검출 항체에 연결된 호스래디쉬-퍼옥시다아제(horseradish-peroxidase)(DY998, R&D Systems)에 접합시켰다. QuantaBluTM Fluorogenic Peroxidase Substrate (15169, Pierce)을 기질로 각 웰에 첨가하고, 형광 형성(fluometic) 반응을 60분 내에 감광(extinction) 320 nm/ 발광(emission) 420 nm에서 측정하였다. 결과는 표준 농도 대 표준 상대 형광 단위(relative fluorescence unit:RFU)의 선형 회귀에 의해 계산하였다.
실시예 1: 표적 단백질의 클로닝 .
A. 인간 인자 IX의 클로닝 : WO01/70968에 개시된 벡터 pTG36로부터, 인간 응고 인자 IX의 개방 해독 프레임(open reading frame)을 포함하는 1.4 kb 단편을 Hind III 및 NotI에 의한 이중-제한효소 처리(double digestion)에 의해 절단하였다. 이 단편을 Hind III 및 NotI로 처리된 벡터 pcDNA3.1Hygro(+)-zz(V870-20으로부터 유래, Invitrogen)의 5.6 kb 단편에 연결시켜, 도 2에 도시된 바와 같은 벡터 pcDNA3.1-FIX를 제조하였다. pcDNA3.1-FIX의 DNA 서열은 서열번호 1로 표시된다. Invitrogen에 의해 발표된 서열(서열번호 4로 표시됨)에 대비해 pcDNA3.1Hygro(+)-zz 벡터(서열번호 5 참조)에서 벡터 백본 상의 3개의 추가적인 뉴클레오티드 삽입을 발견하였다. 벡터 pcDNA3.1-FIX는 안정적으로 형질감염된 세포 클론에 대한 선택 방법을 수행할 수 있게 하는 카세트 히그로마이신-저항성 유전자를 포함한다(도 2, 도 3 및 도 7 참조). 상기 벡터는 인산칼슘 형질감염 또는 기타 방법에 의해 안정적으로 발현하는 세포주의 수립, 및 히그로마이신 저항성에 대한 뒤이은 선택을 가능하게 한다.
B. 인간 인자 VIII 의 클로닝 : B-도메인 결실형 인간 응고 인자 VIII의 개방 해독 프레임을 포함하는 4380 bp의 FVIIIcDNA를 벡터 pTGF8-2hyg-s(서열번호 7; 그 제작이 WO 01/70968에 개시됨)로부터 NotI + XhoI 처리에 의해 분리하고 pcDNA3.1Hygro(+)-zz에 라이게이션시키고, 이를 XhoI+PspOMI으로 처리하여 선형화(linerize)하여 도 7에 도시된 벡터 pcDNA3.1-FVIII를 수득하였다.
C. 인간 A1AT의 클로닝 : mRNA Miniprep Kit(Sigma, Cat# MRN-10)를 이용하여 A1AT mRNA를 HepG-2 세포(DSMZ# ACC 180)로부터 직접 분리하였다. 후속 단계에서, mRNA를 올리고 (dT) 비드 상에 포획하였다. 그 후, mRNA는 RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction)에 뒤이어 조류 미엘로블라스토시스 바이러스 역전사 효소(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase)(AMV RT, Promega, Cat# M5101)로 이중가닥 cDNA로 전사된다. A1AT cDNA를 PCR 반응으로 증폭시켰다. 상기 PCR 산물을 아가로오스 겔 상에 적재하였다. 적합한 DNA-밴드를 분리하고 그 후, Qiaquik Gel Extraction Kit(Qiagen, Cat# 28704)로 정제하였다. 그 후, A1AT 단편을 상업용 벡터(TOPO® Invitrogen, Cat# K4650-01)에 서브클로닝하였다. pCMV-Script의 클로닝을 위해: PCR II TOPO-A1AT를 EcoRI으로 처리하고, A1AT 1370 bp 단편을 EcoRI으로 선형화된 pCMV-Script에 라이게이션시켰다.
pCI-neo-A1AT의 클로닝을 위해, PCR II TOPO-A1AT를 EcoRI으로 처리하고, A1AT 1370 bp 단편을 EcoRI으로 선형화된 pCI-neo에 라이게이션시켰다.
pcDNA3.1-FVIII의 클로닝을 위해, 1370 bp A1AT를 XhoI+HindIII로 처리된 PCR II TOPO-A1AT로 분리하고 XhoI+HindIII에 의해 선형화된 pcDNA3.1에 라이게이션시켰다. 결과물인 벡터가 도 3에 도시된다.
pTG1-A1AT의 클로닝을 위해, PCR II TOPO-A1AT를 HindIII 및 NotI으로 처리하였다. A1AT 1370 bp 단편을 pTG1 (no PRE)에 라이게이션시키고, HindIII 및 NotI으로 선형화시켰다. 결과물인 벡터가 도 9에 도시된다.
D. 인간 G- CSF cDNA 의 클로닝 : RNeasy mini kit (QIAGEN, cat. No. 74104)를 이용하여 천연 5637 인간 방광 암 세포로부터 직접 전체 RNA를 분리하였다. 그 후, 분리된 전체 RNA를 DNase I과 인큐베이션하여 5637 세포의 게놈 DNA의 절단된 혼합물(digested possibly mixed genomic DNA)을 수득하였다. DNase-불포함 전체 RNA를 수득하기 위해, 상기 반응 혼합물을 RNeasy clean-up kit(QIAGEN, cat.No. 74204)로 처리하였다. RNase 억제제 (Roche, Cat. No. 799-017)의 존재 하에, 올리고(dT)12-18 프라이머(Invitrogen, Cat. No. 18418-012) 및 SuperscriptTM II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cat. No. 18064-022)로 전체 RNA를 주형으로 하는 RT-PCR을 수행하여 5637 세포로부터 유래된 ds cDNA 풀을 합성하였다. 그 후, G-CSF cDNA를 PCR 반응으로 증폭시켰다. G-CSF cDNA를 QIA quick Gel Extraction kit (QIAGEN, Cat. No. 28704)로 아가로오스 겔로부터 분리하고 하기의 G-CSF PCR 프라이머를 이용하여 서열을 결정하였다:
- G-CSF 정방향(forward): 5'ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC-3'(서열번호 19)
- G-CSF 역방향(reverse): 5'TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG-3'(서열번호 20)
5637 세포로부터 합성된 DNA의 서열은 서열 분석에 의해 GCSF-b 형(서열번호 26으로 표시된 서열을 가짐)으로 확인되었다.
전술된 바와 같이 분리된 GCSF-b형의 cDNA를 직접 상업용 벡터 pCR2.1 (Invitrogen)에 라이게이션시켰다. 결과물인 플라스미드는 pCR2.1d2-GCSFb로 표시 되며 도 10에 도시된다.
PCR2.1d2-GCSFb를 HindIII 및 NotI으로 처리하고, 705 bp GCSFb cDNA 단편을 분리하고 이를 HindIII 및 NotI으로 선형화시킨 벡터 pcDNA3.1Hygro(+)-zz에 라이게이션시켰다. 결과물인 pDNA3.1-GCSFb 벡터가 도 11에 도시된다.
PCR2.1d2-GCSFb를 EcoRI으로 처리하여, 629 bp GCSFb cDNA 단편을 분리하고, 이를 EcoRI으로 선형화시킨 pCINeo 벡터에 라이게이션시켰다. 결과물인 pCINeo-GCSFb 벡터가 도 12에 도시된다.
PCR2.1d2-GCSFb를 BamHI 및 XhoI로 처리하여, 693 bp GCSFb cDNA 단편을 분리하고 이를 BamHI 및 XhoI으로 선형화시킨 pCMV Script 벡터에 라이게이션시켰다. 결과물인 pCMVScript-GCSFb 벡터가 도 13에 도시된다.
PCR2.1d2-GCSFb를 HindIII 및 NotI으로 처리하여, 705 bp GCSFb cDNA 단편을 분리하고 이를 HindIII 및 NotI으로 선형화시킨 pTG2-hyg-as 벡터에 라이게이션시켰다. 결과물인 pTG2-GCSFb-hyg-as 벡터가 도 14에 도시된다.
실시예 2: 상이한 세포주 및 상이한 벡터에서 표적 단백질의 발현: 재조합 단백질 생산을 위한 본 발명의 방법을 최적화하기 위해, 알파-1-안티트립신(A1AT)에 대한 재조합 유전자를 포함하는 벡터를 갖는 상이한 세포주의 고 수준 발현 능역을 테스트하였다. CHO, BHK 및 다른 세포주들은 293T 세포주에 비해 일시적인 형질감염 분석법에서 보다 적은 양의 재조합 단백질을 생산하는 것으로 확인되었다. 그러므로, 다른 인간 태아 신장 세포주 유래 파생물(derivate)을 조사하였다. 결과가 도 4 내지 6에 도시된다.
실시예 3: 무혈청 조건 하에서 형질감염되고 배양된, 293F 세포 대비, 혈청 함유 배지에서 293T 및 293 세포의 일시적인 형질감염: 0.1-0.2 x 106 개의 293T 또는 293 세포의 생존가능한 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 세포들을 인산칼슘 방법(Biotechniques 6:7 632-638 (1988))을 이용하여 형질감염시켰다: 4 ㎍의 플라스미드 DNA를 0.1 x TE 완충액으로 희석하고(약 200 ㎕의 형질감염 믹스), 가볍게 혼합하고, 20 ㎕의 2.5 M CaCl2 및 100 ㎕의 2x HBS를 상기 형질감염 시료에 첨가하였다. 상기 형질감염 시료를 실온에서 20분간 인큐베이션시켰다. 6시간 후에, 인큐베이션 배지를 교체하고 세포들을 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
실시예 4: 무혈청 배지에서 293F 세포에 의한 표적 단백질의 무혈청 형질감염 및 발현: 106 개의 생존가능한 293F 세포 농도를 갖는 28 ml의 현탁 배양액을 준비하였다(형질감염 실험과 동일한 일자에). 지질-DNA 복합체를 Opti-MEM®I (Invitrogen)의 30 ㎍의 플라스미드 DNA를 1 ml의 총 용량까지 희석하여 준비하고, 40 ㎕의 293fectin®을 Opti-MEM?I (Invitrogen)으로 1 ml의 총 용량까지 희석하였다. 실온에서 5분 인큐베이션 후에, 희석된 DNA를 293fectin®에 첨가하여 2 ml의 총 용량을 수득하였다. 형질감염된 시료를 실온의 암기에서 20분간 인큐베이션시켰다. 2 ml의 형질감염 믹스를 28 ml의 293F 현탁 배양액에 첨가하였다(최종 세포 농도는 1x106 개의 세포/ml 였음). 형질감염된 293F 세포들을 125 rpm으로 회전하 는 오르비탈 진탕기(orbital shaker) 상에서 37℃/공기 중 8% CO2의 습윤화된 대기(humidified atmosphere)에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
A: A1AT의 형질감염 및 발현: 293F 세포를 293 및 293T 세포들과 비교하는 실험의 결과가 도 4에 도시된다. 모든 실험에서, 정해진 양의 세포(106 개의 세포)를 pcDNA3.1-A1AT로 형질감염시켰다. 이와 같은 상이한 세포주들에서 발현된 A1AT의 양을 비교하였다. 293F 세포에서의 A1AT의 발현량을 100%로 설정하였다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 293 및 293T 세포들은 293F 세포 대비 A1AT의 12-13% 만을 생산하였다.
또한, 상이한 벡터 백본이 293F 세포에서 생산되는 재조합 단백질의 양에 영향을 미치는지 여부를 테스트하였다. 인간 알파-1-안티트립신(A1SAT)에 대한 코딩 서열을 pTG (자체 벡터), pCMV Script® (Stratagene), pcl neo (Promega) 및 pcDNA3.1TM 벡터에 삽입시켰다.
pcDNA3.1-A1AT로부터 A1AT의 발현 수준을 100%로 설정하였다. 어느 벡터도 pcDNATM3.1-A1AT로 관찰된 높은 발현에 근접하지 않았다. pcDNA 3.1- A1AT가 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 가장 많은 양의 A1AT를 생산하는 것으로 확인하였다(도 5 참조). 자체 벡터는 pcDNA 3.1로부터 발현된 A1AT의 양에 대비해 20%를 발현했고, 나머지 상업용 벡터들은 pcDNA 3.1로부터 발현된 A1AT의 양의 15-30%의 범위를 발현했다. 따라서, pcDNA 3.1을 모든 추가 실험을 위한 벡터로 선택하였다.
요약하면, 상이한 세포주들을 A1AT 유전자를 운반하는 pcDNA3.1TM로 형질감염시켰다. 무혈청 293F 세포주는 293T 및 293 세포들보다 106 개의 세포당 7배 많은 A1AT를 발현하는 것으로 확인되었다. 따라서, 프리스타일 293F 세포주를 안정적인 형질감염 실험을 위해 선택하였다.
일시적인 형질감염 실험의 결과가 도 6에 도시된다. 상부 패널(A)은 상이한 형질감염 벡터를 이용한 6개의 상이한 형질감염 시험(trial)의 상층액의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 분석 도면으로부터, 분석된 세포 배양 상층액에 존재하는 α1-안티트립신은 항원에 대한 활성의 비 1(데이터는 도시되지 않음)로부터 유추될 수 있는 바와 같이, 우수한 품질인 것으로 결론지을 수 있다. 테스트 결과의 유효성은 음성 대조구는 α1-안티트립신 활성이나 항원을 보이지 않는다는 사실로부터 추론될 수 있다.
SDS-PAGE에 의해 분석된 분자량 분포는 3개의 α1-안티트립신 함유 시료에 대한 비교가능한 그림을 보여준다. 음성 대조구에서, α1-안티트립신을 나타내는 밴드가 없을 뿐 아니라, 예상된 바와 같이, 27 kD의 분자량에서 추가적인 밴드가 관찰된다.
(항 인간 α1-안티트립신 일차 항체를 이용한) 웨스턴 블롯팅을 이용한 분석에서 단백질은 환원성 조건(reducing condition) 하에서 예상되는 분자량 영역에서 확인될 수 있다. 분열된 생성물(split product)은 관찰되지 않는다.
흑색 화살표는 52 kDa 재조합 단백질 알파-1-안티트립신에 해당하는 주요한 밴드를 표시한다. 또한, 래인 4 및 8에서 프리스타일 293 F 세포주에서 대조구로 일시적으로 발현된, 27kDa GFP 단백질에 해당하는 밴드가 관찰가능하다. 래인 1, 2, 3 및 5, 6 및 7에서 추가적인 밴드는 숙주 세포 단백질(프리스타일 293 F 세포 유래)이다. 하부의 패널(B)은 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 그 결과는 분석법의 보다 높은 엄격성(stringency) 때문에, 결과가 보다 선명하게 나타나고, A1AT에 해당하는 밴드만 관찰가능하다는 것을 제외하고는 동일하다.
B: FVIII 의 형질감염 및 발현: 도 8에, 3개의 가장 안정적으로 형질감염된 클론의 인자 VIII의 평균 양이 도시된다. 상기 pcDNA-FVIII로 발현된 가장 우수한 3개의 클론의 인자 VIII의 평균 양을 100% 생산성으로 설정하였다. 자체 벡터 pTGF8-2hyg-s와의 비교는 293F 세포에서 pcDNA3.1-FVIII 벡터에 의한 인자 VIII 의 약 3배 높은 생산성을 보여주었다.
C: FIX 의 형질감염 및 발현: 인자 IX를 발현하는 pcDNA3.1-FIX 및 pUC 19/X 기반 벡터 pTGF36 (WO 01/70968 참조)를 이용하여 안정적으로 형질감염된 293F 세포에서, 하기의 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 293F 세포에서 pcDNA3.1 벡터의 사용으로 약 3배 높은 생산성이 확인될 수 있었다.
표 1: pcDNA3.1 및 pTG2 벡터에 의한 안정적인 형질감염 후 293 및 293F 세포에서 FIX의 생산성
FIX 생산성 %
[mIU/106개의 세포, 일]
기반(substrate) 세포주/벡터 pcDNA3.1-FIX pTG2-FIX
293 (+ 혈청) 100% -
293F (- 혈청) 100% 60%
실시예 5: G- CSFb 의 생산
A. 무혈청 배지에서 293F 세포의 형질감염, 일시적 형질감염: 형질감염 실험과 동일한 날에 ml 당 1.1x 106 개의 생존가능한 293F 세포의 세포 농도를 갖는 293F 세포의 현탁배양 28 ml를 준비하였다. 지질-DNA 복합체를 Opti-MEM?I (Invitrogen)에서 30 ㎍의 플라스미드 DNA(pcDNA3.1-G-CSFb)를 1 ml의 총 용량까지 희석하여 준비하고, 30 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 CD를 Opti-MEM?I (Invitrogen)에서 1 ml의 총 용량까지 희석하였다. 실온에서 5분 인큐베이션 후에, 희석된 DNA를 리포펙타민 2000 CD에 첨가하여 2 ml의 총 용량을 수득하였다. 형질감염 시료를 실온의 암기에서 20분간 인큐베이션시켰다. 2 ml의 형질감염 믹스를 28 ml의 293F 현탁 배양에 첨가하였다(최종 세포 농도는 1x106 개의 세포/ml였음). 형질감염된 293F 세포들을 125 rpm으로 회전하는 오르비탈 진탕기 상에서 37℃/공기 중 8% CO2의 습윤화된 대기에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
B. 안정적인 형질감염: 상기 A에 개시된 바와 같은 일시적인 형질감염 후 72시간 경과시에, 적합한 수의 세포(105 내지 106개의 세포)를 부착성 성장(adherent growth)을 수립하기 위해 침전용 편평한 디쉬로 옮겼다. 선택 압력은 편평한 디쉬로의 이전 후 2 내지 50시간, 바람직하게는 48시간 경과시에 개시하였다. 바람직한 선택 작용제는 75㎍/ml 농도의 히그로마이신이었다. 선택 압력은 2 내지 3일 간격으로 히그로마이신 보충 배지를 교체하여, 10 내지 20일 이상, 바람직하게는 14일 동안 유지시켰다.
C. 분석 및 채취 로보트 ClonePixFL ( Genetix )를 이용한 최상의 G- CSF 생산자의 선택: 상기 B에 기술된 바와 같이 안정적으로 형질감염된 프리스타일 293F 세포를 약 2일 후에 클론의 선택을 위한 적합한 항생제 및 형광을 통해 최고 생산량의 클론의 검출을 위한 표지된 항체를 포함하는 반-고형 메틸-셀룰로오스 기반 배지에 접종하였다. G-CSF를 가장 많이 생산하는 수백개의 클론을 채취하기 위해 세포 수 및 G-CSF 분비에 대해 다수(수천개)의 클론을 ClonePixFL (Genetix)를 이용하여 분석하였다. 생산하지 않는 클론과 혼합된 클론이 무작위로 채취되는 공지된 다른 방법과 대조적으로, ClonePixFL의 이용은 단일 세포로부터 유래된, 높은 생산량을 갖는 신속하게 성장하는 클론만의 채취를 가능하게 한다. 채취된 세포들을 완전한 절차를 위한 무혈청 조건 하에서 마이크로타이터 플레이트 및 뒤이어 스핀 튜브, 세포 배양 플라스크 및 발효기(fermenter)에서 확장시켰다.
또한, 완전한 안정적인 형질감염 절차도 무혈청 조건 하에서 생성되었다. 추가적으로, 전체의 후속 확장 및 세포 배양 절차 동안, 세포는 혈청 또는 동물 유래 단백질과의 접촉을 갖지 않았다.
확장 동안, 강건성(robustness), 높은 성장속도, 생존력 및 ELISA 포맷에 의 해 측정된 활성 G-CSF의 측면에서 가장 우수한 클론을 선택하였다. 이 선택 단계 후에, 채취된 클론을 항생제 보충 없이 무혈청 조건 하에서 배양하였다. 293F 세포들을 전체 절차 동안 완전히 무혈청 조건으로 배양하고, 배지는 격일로 교체하였다. 세포의 규모 확장(up-scaling)은 Kuhner Shaker의 엘렌마이어 플라스크로부터 웨이브 반응기(wave reactor)(Wave Biotech Europe)에서 보다 큰 용량으로 완전한 무혈청 조건 하에 수행하였다. 이 선택 동안, 클론의 수는 다시 수개의 가장 우수한 생산 클론으로 감소되었다. 올바른 cDNA 서열, mRNA 함량 및 발효 시 거동(behavior)이 서브클로닝을 위한 가장 우수한 클론을 확인하는 기준이다. 이를 위해, 전술된 바와 같이 선택된 클론의 세포들을 플레이팅하고, 분석하고, ClonePixFL로 채취하고, 그 후, 확장시키고 선택하였다. 서브클로닝은 클론의 프레이팅된 서브집단에서 가능한 유전적 변형을 제거하여 보다 우수한 생산자 클론을 다시 선택하기 위해 필수적인 단계이다. 서브클로닝 후에, 선택된 클론을 다시 무혈청 조건 하에 보관하였다. 발현된 재조합 인간 G-CSF 단백질을 생화학적으로 보다 상세하게 파악하였다.
D. ELISA 에 의한 인간 G- CSF 농도의 결정: 상기와 같이 수득된 프리스타일 293 F 세포주에 의해 발현된 rhG-CSF의 양을 ELISA에 의해 결정하고, 상이한 벡터에 의해 형질감염된 세포들로부터 수득된 단백질의 수율을 비교하였다(도 15). 실시예 2 및 3에서 기재된 FIX 및 A1AT에 의한 발현 실험으로부터 예상된 바와 같이, 여기에서 다시 벡터 pcDNA 3.1-GCSFb와 293F 세포의 조합이 가장 높은 생산성을 보였고 따라서, 재조합 인간 G-CSFb의 생산을 위해 사용하였다.
E. 환원성 SDS PAGE 에서 rhG - CSF 의 웨스턴 블롯 : HEK293 및 HEK293F 세포로부터의 상층액에서 생산된 G-CSF 10 ㎕를 15% SDS PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. G-CSF의 검출은 BAF214-bio/SA-HRP/DAB을 통해 수행하였다(도 16 참조). 화살표는 올바른 분자량의 rhG-CSF의 단량체 밴드를 표시한다.
서열 목록, Free text
서열번호 1: pcDNA3.1-FIX,
분자: 6960 bps DNA, 원형
유형 개시 종료 명칭/설명
영역 209 863 CMV 프로모터
영역 895 911 MCS"
유전자 939 2324 hFIX
유전자 2328 2339 SV40'/SV40 폴리a + 인트론
영역 2340 2370 'MCS
영역 2381 2595 BGH pA
영역 2658 3071 f1 원점
영역 3136 3460 SV40 프로모터
유전자 3478 4501 HygR
영역 4514 4886 SV40 pA
영역 5819 5146 C PUC 원점
유전자 6824 5964 C AmpR(상보적 가닥)
서열번호 2: pcDNA3.1-A1AT
분자: 6914 bps DNA, 원형
유형 개시 종료 명칭/설명
영역 209 863 CMV 프로모터
유전자 913 2259 A1AT
유전자 2328 2339 SV40'/SV40 폴리a + 인트론
영역 2335 2549 BGH pA
영역 2612 3025 f1 원점
영역 3090 3414 SV40 프로모터
유전자 3432 4455 HygR
영역 4468 4840 SV40 pA
영역 5773 5100 C PUC 원점
유전자 6778 5918 C AmpR(상보적 가닥)
서열번호 3: pcDNA3.1-FVIII
분자: 9975 bps DNA, 원형
유형 개시 종료 명칭/설명
영역 1 655 CMV 프로모터
유전자 783 3082 인간 FVIII 도메인 A1 및 A2
유전자 3083 3104 B-도메인의 나머지 부분 및 추가적인 뉴클레오티드
유전자 3105 5162 인간 인자 FVIII 도메인 A3, C1, C2
영역 5188 5402 BGH pA
영역 5465 5878 f1 원점
영역 5943 6267 SV40 프로모터
유전자 6285 7308 HygR
영역 7321 7693 SV40 pA
영역 8626 7953 C PUC 원점
유전자 9631 8771 C AmpR(상보적 가닥)
서열번호 4: Invitrongen에 의해 공개된 pcDNA 3.1 서열
분자: 5597 bps DNA, 원형
유형 개시 종료 명칭/설명
영역 209 863 CMV 프로모터
영역 895 1010 MCS
영역 1021 1235 BGH pA
영역 1298 1711 f1 원점
영역 1776 2100 SV40 프로모터
유전자 2118 3141 HygR
영역 3154 3526 SV40 pA
영역 4456 3786 C PUC 원점
유전자 5461 4601 C AmpR(상보적 가닥)
서열번호 5: pcDNA3.1Hygro(+)-zz, 서열번호 4 대비 4380번 위치에 3개의 추가적인 뉴클레오티드 "GGT"를 가짐
분자: 5600 bps DNA, 원형
유형 개시 종료 명칭/설명
영역 209 863 CMV 프로모터
영역 895 1010 MCS
영역 1021 1235 BGH pA
영역 1298 1711 f1 원점
영역 1776 2100 SV40 프로모터
유전자 2118 3141 HygR
영역 3154 3526 SV40 pA
영역 4459 3786 C PUC 원점
유전자 5464 4604 C AmpR(상보적 가닥)
서열번호 6: 벡터 pTG1-A1AT
서열번호 7: 벡터 pFGF8-hyg-s
분자: 10705 bps DNA, 원형
Type 개시 종료 명칭/설명
영역 1 586 CMV 프로모터
유전자 676 2975 hFVIII 도메인 A1 및 A2
유전자 2976 2997 B-도메인의 잔류 힌지 및 추가적인 뉴클레오티드
유전자 2998 5055 hFVIII 도메인 A3, C1, C2
영역 5067 5916 SV40로부터의 폴리A 인트론 및 폴리A 부위
유전자 5928 7910 히그로마이신 저항성
영역 8346 8423 프로게스테론 반응성 요소
유전자 8681 9469 암피실린 저항성
서열번호 8: 인간 야생형 인자 VIII cDNA
서열번호 9: 인간 야생형 인자 VIII
서열번호 10-12: 링커(linker) 펩티드
서열번호 13: hFVII a-형의 cDNA
서열번호 14: hFVII b-형의 cDNA
서열번호 15: 인간 GCSF a-형의 cDNA, CDS: 41-661
서열번호 16: 인간 GCSF b-형의 cDNA, CDS: 41-652
서열번호 17: 인간 GCSF c-형의 cDNA, CDS: 229-828
서열번호 18: hvWF의 cDNA
서열번호 19 및 20: G-CSF 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머
서열번호 21: 벡터 PCR2.1d2-GCSFb
분자: 4542 bps DNA; 원형
개시 종료 특징/명칭
293 907 GCSFb
1159 1596 f1 원점
1930 2724 KanR
2742 3602 AmpR
3747 4420 pUC 원점
서열번호 22: 벡터 pcDNA3.1-hyg(+)-GCSFb
분자: 6237 bps DNA, 원형
개시 종료 특징/명칭
209 863 CMV 프로모터
970 1584 GCSFb
1658 1872 BGH pA
1935 2348 f1 원점
2413 2737 SV40 프로모터
2755 3778 HygR
3791 4163 SV40 pA
5096 4423C PUC 원점
6101 5241 C AmpR
서열번호 23: 벡터 pCINeo-GCSFb
분자: 6101 bps DNA, 원형
개시 종료 특징/명칭
1 1022 CMV 프로모터/인트론
1106 1720 GCSFb
1796 2017 SV40 폴리A
2112 2567 fi 원점
2629 3047 SV40 인핸서/프로모터
3092 3886 NeoR
3950 3998 폴리A
4409 5269 AmpR
서열번호 24: 벡터 pCMVScript_GCSFb,
분자: 4920 bps DNA, 원형
개시 종료 특징/명칭
1 602 CMV 프로모터
728 1342 GCSFb
1453 1836 SV40 폴리A
1974 2280 f1 원점
2449 2787 SV40 프로모터
2822 3613 NeoR
3614 4063 HSV-TK 폴리A
서열번호 25: pTG2-GCSFb-hyg-as
분자: 6917 bps DNA, 원형
개시 종료 특징/명칭
5 591 CMV 프로모터
722 1336 GCSFb
1383 2228 SV40 인트론+pA
2767 2255 C HSV TK 폴리A
3782 2745 C HygR
4044 3796 C HSV TK 프로모터
4916 5704 AmpR
서열번호 26: 인간 GCSF b-형의 cDNA
서열번호 27: 인간 GCSF b-형 단백질
SEQUENCE LISTING <110> Octapharma AG <120> Serum-Free Stabile Transfrection and Production of Recombinant Human Proteins in Human Cell Lines <130> 060523wo/JH <150> EP05105965.7 <151> 2005-06-30 <160> 27 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector pcDNA3.1-FIX <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 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gaaaaccaga 1440 agtcctgtga accagcagtg ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta 1500 agctcacccg tgctgagact gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg 1560 aaaccatttt ggataacatc actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgggttg 1620 ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag 1680 ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact 1740 gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag 1800 aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag 1860 ctattaataa gtacaaccat gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa 1920 acagctacgt tacacctatt tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat 1980 ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag 2040 ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt 2100 tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc 2160 aaggagatag tgggggaccc catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa 2220 ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat 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gca cac aga aca cct atg cct aaa ata caa aat 2352 Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn 770 775 780 gtc tcc tct agt gat ttg ttg atg ctc ttg cga cag agt cct act cca 2400 Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800 cat ggg cta tcc tta tct gat ctc caa gaa gcc aaa tat gag act ttt 2448 His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 810 815 tct gat gat cca tca cct gga gca ata gac agt aat aac agc ctg tct 2496 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830 gaa atg aca cac ttc agg cca cag ctc cat cac agt ggg gac atg gta 2544 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val 835 840 845 ttt acc cct gag tca ggc ctc caa tta aga tta aat gag aaa ctg ggg 2592 Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860 aca act gca gca aca gag ttg aag aaa ctt gat ttc aaa gtt tct agt 2640 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser 865 870 875 880 aca tca aat aat ctg att tca aca att cca tca gac aat ttg gca gca 2688 Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895 ggt act gat aat aca agt tcc tta gga ccc cca agt atg cca gtt cat 2736 Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 900 905 910 tat gat agt caa tta gat acc act cta ttt ggc aaa aag tca tct ccc 2784 Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925 ctt act gag tct ggt gga cct ctg agc ttg agt gaa gaa aat aat gat 2832 Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940 tca aag ttg tta gaa tca ggt tta atg aat agc caa gaa agt tca tgg 2880 Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 gga aaa aat gta tcg tca aca gag agt ggt agg tta ttt aaa ggg aaa 2928 Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 aga gct cat gga cct gct ttg ttg act aaa gat aat gcc tta ttc aaa 2976 Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990 gtt agc atc tct ttg tta aag aca aac aaa act tcc aat aat tca gca 3024 Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005 act aat aga aag act cac att gat ggc cca tca tta tta att gag aat 3072 Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn 1010 1015 1020 agt cca tca gtc tgg caa aat ata tta gaa agt gac act gag ttt aaa 3120 Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys 1025 1030 1035 1040 aaa gtg aca cct ttg att cat gac aga atg ctt atg gac aaa aat gct 3168 Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala 1045 1050 1055 aca gct ttg agg cta aat cat atg tca aat aaa act act tca tca aaa 3216 Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys 1060 1065 1070 aac atg gaa atg gtc caa cag aaa aaa gag ggc ccc att cca cca gat 3264 Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp 1075 1080 1085 gca caa aat cca gat atg tcg ttc ttt aag atg cta ttc ttg cca gaa 3312 Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1090 1095 1100 tca gca agg tgg ata caa agg act cat gga aag aac tct ctg aac tct 3360 Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser 1105 1110 1115 1120 ggg caa ggc ccc agt cca aag caa tta gta tcc tta gga cca gaa aaa 3408 Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys 1125 1130 1135 tct gtg gaa ggt cag aat ttc ttg tct gag aaa aac aaa gtg gta gta 3456 Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val 1140 1145 1150 gga aag ggt gaa ttt aca aag gac gta gga ctc aaa gag atg gtt ttt 3504 Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe 1155 1160 1165 cca agc agc aga aac cta ttt ctt act aac ttg gat aat tta cat gaa 3552 Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu 1170 1175 1180 aat aat aca cac aat caa gaa aaa aaa att cag gaa gaa ata gaa aag 3600 Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys 1185 1190 1195 1200 aag gaa aca tta atc caa gag aat gta gtt ttg cct cag ata cat aca 3648 Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr 1205 1210 1215 gtg act ggc act aag aat ttc atg aag aac ctt ttc tta ctg agc act 3696 Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr 1220 1225 1230 agg caa aat gta gaa ggt tca tat gag ggg gca tat gct cca gta ctt 3744 Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1235 1240 1245 caa gat ttt agg tca tta aat gat tca aca aat aga aca aag aaa cac 3792 Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His 1250 1255 1260 aca gct cat ttc tca aaa aaa ggg gag gaa gaa aac ttg gaa ggc ttg 3840 Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu 1265 1270 1275 1280 gga aat caa acc aag caa att gta gag aaa tat gca tgc acc aca agg 3888 Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg 1285 1290 1295 ata tct cct aat aca agc cag cag aat ttt gtc acg caa cgt agt aag 3936 Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys 1300 1305 1310 aga gct ttg aaa caa ttc aga ctc cca cta gaa gaa aca gaa ctt gaa 3984 Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu 1315 1320 1325 aaa agg ata att gtg gat gac acc tca acc cag tgg tcc aaa aac atg 4032 Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met 1330 1335 1340 aaa cat ttg acc ccg agc acc ctc aca cag ata gac tac aat gag aag 4080 Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys 1345 1350 1355 1360 gag aaa ggg gcc att act cag tct ccc tta tca gat tgc ctt acg agg 4128 Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg 1365 1370 1375 agt cat agc atc cct caa gca aat aga tct cca tta ccc att gca aag 4176 Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1385 1390 gta tca tca ttt cca tct att aga cct ata tat ctg acc agg gtc cta 4224 Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu 1395 1400 1405 ttc caa gac aac tct tct cat ctt cca gca gca tct tat aga aag aaa 4272 Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys 1410 1415 1420 gat tct ggg gtc caa gaa agc agt cat ttc tta caa gga gcc aaa aaa 4320 Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys 1425 1430 1435 1440 aat aac ctt tct tta gcc att cta acc ttg gag atg act ggt gat caa 4368 Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln 1445 1450 1455 aga gag gtt ggc tcc ctg ggg aca agt gcc aca aat tca gtc aca tac 4416 Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr 1460 1465 1470 aag aaa gtt gag aac act gtt ctc ccg aaa cca gac ttg ccc aaa aca 4464 Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 tct ggc aaa gtt gaa ttg ctt cca aaa gtt cac att tat cag aag gac 4512 Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys Asp 1490 1495 1500 cta ttc cct acg gaa act agc aat ggg tct cct ggc cat ctg gat ctc 4560 Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu 1505 1510 1515 1520 gtg gaa ggg agc ctt ctt cag gga aca gag gga gcg att aag tgg 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caa aac cca cca gtc ttg aaa cgc cat caa cgg 4944 Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1635 1640 1645 gaa ata act cgt act act ctt cag tca gat caa gag gaa att gac tat 4992 Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr 1650 1655 1660 gat gat acc ata tca gtt gaa atg aag aag gaa gat ttt gac att tat 5040 Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr 1665 1670 1675 1680 gat gag gat gaa aat cag agc ccc cgc agc ttt caa aag aaa aca cga 5088 Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg 1685 1690 1695 cac tat ttt att gct gca gtg gag agg ctc tgg gat tat ggg atg agt 5136 His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser 1700 1705 1710 agc tcc cca cat gtt cta aga aac agg gct cag agt ggc agt gtc cct 5184 Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 cag ttc aag aaa gtt gtt ttc cag gaa ttt act gat ggc tcc ttt act 5232 Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr 1730 1735 1740 cag ccc tta tac cgt gga gaa cta aat gaa cat ttg gga ctc ctg ggg 5280 Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly 1745 1750 1755 1760 cca tat ata aga gca gaa gtt gaa gat aat atc atg gta act ttc aga 5328 Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg 1765 1770 1775 aat cag gcc tct cgt ccc tat tcc ttc tat tct agc ctt att tct tat 5376 Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr 1780 1785 1790 gag gaa gat cag agg caa gga gca gaa cct aga aaa aac ttt gtc aag 5424 Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys 1795 1800 1805 cct aat gaa acc aaa act tac ttt tgg aaa gtg caa cat cat atg gca 5472 Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala 1810 1815 1820 ccc act aaa gat gag ttt gac tgc aaa gcc tgg gct tat ttc tct gat 5520 Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp 1825 1830 1835 1840 gtt gac ctg gaa aaa gat gtg cac tca ggc ctg att gga ccc ctt ctg 5568 Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu 1845 1850 1855 gtc tgc cac act aac aca ctg aac cct gct cat ggg aga caa gtg aca 5616 Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr 1860 1865 1870 gta cag gaa ttt gct ctg ttt ttc acc atc ttt gat gag acc aaa agc 5664 Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser 1875 1880 1885 tgg tac ttc act gaa aat atg gaa aga aac tgc agg gct ccc tgc aat 5712 Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1890 1895 1900 atc cag atg gaa gat ccc act ttt aaa gag aat tat cgc ttc cat gca 5760 Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala 1905 1910 1915 1920 atc aat ggc tac ata atg gat aca cta cct ggc tta gta atg gct cag 5808 Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln 1925 1930 1935 gat caa agg att cga tgg tat ctg ctc agc atg ggc agc aat gaa aac 5856 Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn 1940 1945 1950 atc cat tct att cat ttc agt gga cat gtg ttc act gta cga aaa aaa 5904 Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1955 1960 1965 gag gag tat aaa atg gca ctg tac aat ctc tat cca ggt gtt ttt gag 5952 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu 1970 1975 1980 aca gtg gaa atg tta cca tcc aaa gct gga att tgg cgg gtg gaa tgc 6000 Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys 1985 1990 1995 2000 ctt att ggc gag cat cta cat gct ggg atg agc aca ctt ttt ctg gtg 6048 Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val 2005 2010 2015 tac agc aat aag tgt cag act ccc ctg gga atg gct tct gga cac att 6096 Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile 2020 2025 2030 aga gat ttt cag att aca gct tca gga caa tat gga cag tgg gcc cca 6144 Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 2035 2040 2045 aag ctg gcc aga ctt cat tat tcc gga tca atc aat gcc tgg agc acc 6192 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr 2050 2055 2060 aag gag ccc ttt tct tgg atc aag gtg gat ctg ttg gca cca atg att 6240 Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile 2065 2070 2075 2080 att cac ggc atc aag acc cag ggt gcc cgt cag aag ttc tcc agc ctc 6288 Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu 2085 2090 2095 tac atc tct cag ttt atc atc atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg 6336 Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 2100 2105 2110 cag act tat cga gga aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc 6384 Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly 2115 2120 2125 aat gtg gat tca tct ggg ata aaa cac aat att ttt aac cct cca att 6432 Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile 2130 2135 2140 att gct cga tac atc cgt ttg cac cca act cat tat agc att cgc agc 6480 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 2145 2150 2155 2160 act ctt cgc atg gag ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc agc atg 6528 Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met 2165 2170 2175 cca ttg gga atg gag agt aaa gca ata tca gat gca cag att act gct 6576 Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala 2180 2185 2190 tca tcc tac ttt acc aat atg ttt gcc acc tgg tct cct tca aaa gct 6624 Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 cga ctt cac ctc caa ggg agg agt aat gcc tgg aga cct cag gtg aat 6672 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn 2210 2215 2220 aat cca aaa gag tgg ctg caa gtg gac ttc cag aag aca atg aaa gtc 6720 Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val 2225 2230 2235 2240 aca gga gta act act cag gga gta aaa tct ctg ctt acc agc atg tat 6768 Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr 2245 2250 2255 gtg aag gag ttc ctc atc tcc agc agt caa gat ggc cat cag tgg act 6816 Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr 2260 2265 2270 ctc ttt ttt cag aat ggc aaa gta aag gtt ttt cag gga aat caa gac 6864 Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 2275 2280 2285 tcc ttc aca cct gtg gtg aac tct cta gac cca ccg tta ctg act cgc 6912 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg 2290 2295 2300 tac ctt cga att cac ccc cag agt tgg gtg cac cag att gcc ctg agg 6960 Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg 2305 2310 2315 2320 atg gag gtt ctg ggc tgc gag gca cag gac ctc tac 6996 Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 2325 2330 <210> 9 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 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atgcacacac cgatgtgcgc acacacagat atgcacacac atggatgagc acacacacac 2100 caagtgcgca cacacaccga tgtacacaca cagatgcaca cacagatgca cacacaccga 2160 tgctgactcc atgtgtgctg tcctctgaag gcggttgttt agctctcact tttctggttc 2220 ttatccatta tcatcttcac ttcagacaat tcagaagcat caccatgcat ggtggcgaat 2280 gcccccaaac tctcccccaa atgtatttct cccttcgctg ggtgccgggc tgcacagact 2340 attccccacc tgcttcccag cttcacaata aacggctgcg tctcctccgc acacctgtgg 2400 tgcctgccac cc 2412 <210> 15 <211> 1518 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aaaacagccc ggagcctgca gcccagcccc acccagaccc atggctggac ctgccaccca 60 gagccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg cacagtgcac tctggacagt 120 gcaggaagcc acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg 180 cttagagcaa gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggtgag 240 tgagtgtgcc acctacaagc tgtgccaccc cgaggagctg gtgctgctcg gacactctct 300 gggcatcccc tgggctcccc tgagcagctg ccccagccag gccctgcagc tggcaggctg 360 cttgagccaa ctccatagcg gccttttcct ctaccagggg ctcctgcagg ccctggaagg 420 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<220> <223> primer <400> 20 tcagggctgg gcaaggtggc gtag 24 <210> 21 <211> 4542 <212> DNA <213> artificial <220> <223> vector PCR2.1d2-GCSFb <400> 21 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg ctatggctgg 300 acctgccacc cagagcccca tgaagctgat ggccctgcag ctgctgctgt ggcacagtgc 360 actctggaca gtgcaggaag ccacccccct gggccctgcc agctccctgc cccagagctt 420 cctgctcaag tgcttagagc aagtgaggaa gatccagggc gatggcgcag cgctccagga 480 gaagctgtgt gccacctaca agctgtgcca ccccgaggag ctggtgctgc tcggacactc 540 tctgggcatc ccctgggctc ccctgagcag ctgccccagc caggccctgc agctggcagg 600 ctgcttgagc caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga 660 agggatctcc cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt 720 tgccaccacc 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gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 3300 cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 3360 actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 3420 ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 3480 tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 3540 ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 3600 aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 3660 ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 3720 agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 3780 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 3840 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 3900 cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 3960 ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 4020 gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 4080 ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 4140 aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 4200 cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 4260 ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 4320 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 4380 ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 4440 ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 4500 gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga ag 4542 <210> 22 <211> 6237 <212> DNA <213> artificial <220> <223> vector pcDNA3.1-hyg(+)-GCSFb <400> 22 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg 960 aattcggcta tggctggacc tgccacccag agccccatga agctgatggc cctgcagctg 1020 ctgctgtggc acagtgcact ctggacagtg caggaagcca cccccctggg ccctgccagc 1080 tccctgcccc agagcttcct gctcaagtgc ttagagcaag tgaggaagat ccagggcgat 1140 ggcgcagcgc tccaggagaa gctgtgtgcc acctacaagc tgtgccaccc cgaggagctg 1200 gtgctgctcg gacactctct gggcatcccc tgggctcccc tgagcagctg ccccagccag 1260 gccctgcagc tggcaggctg cttgagccaa ctccatagcg gccttttcct ctaccagggg 1320 ctcctgcagg ccctggaagg gatctccccc gagttgggtc ccaccttgga cacactgcag 1380 ctggacgtcg ccgactttgc caccaccatc tggcagcaga tggaagaact gggaatggcc 1440 cctgccctgc agcccaccca gggtgccatg ccggccttcg cctctgcttt ccagcgccgg 1500 gcaggagggg tcctggttgc ctcccatctg cagagcttcc tggaggtgtc gtaccgcgtt 1560 ctacgccacc ttgcccagcc ctgaagccga attctgcaga tatccatcac actggcggcc 1620 gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1680 ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 1740 cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 1800 tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 1860 gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc 1920 tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 1980 gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 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agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 4560 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 4620 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 4680 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 4740 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 4800 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 4860 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 4920 agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 4980 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 5040 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 5100 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 5160 atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 5220 gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 5280 tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 5340 gagggcttac catctggccc cagtgctgca 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ctg gga atg gcc cct gcc ctg 480 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc tct gct ttc cag cgc 528 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 cgg gca gga ggg gtc ctg gtt gcc tcc cat ctg cag agc ttc ctg gag 576 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcc cag ccc tga 615 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 <210> 27 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 85 90 95 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 1

Claims (17)

  1. 인간 단백질을 코딩하는 유전자, 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함하고, 상기 프로모터 및 폴리A 신호는 각각 상기 인간 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단에 연결된 것인 핵산 서열로 형질감염된 불멸화된(immortalized) 인간 세포주를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 무혈청 조건 하에서 상기 핵산 서열 및 복제 원점(origin of replication)을 포함하는 형질감염 벡터로 불멸화된 인간 숙주 세포주를 형질감염시켜 상기 핵산 서열 및 복제 원점을 상기 불멸화된 인간 숙주 세포주의 게놈 내에 통합시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 단백질은 혈액 응고 인자, 성장 인자, 콜로니 자극 인자(CSF), 시토킨, 단백질 분해효소(protease) 억제제, 및 수송 단백질(transport protein)로부터 선택된 인간 혈장 단백질인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형질감염 벡터는 하기로부터 선택된 하나 이상을 특징으로 하는 것인 방법:
    (i) 상기 프로모터는 바이러스 프로모터, 상시발현 유전자(housekeeping gene) 프로모터 및 조직 특이적 프로모터로부터 선택되고, 및
    (ii) 상기 복제 원점은 세균에서 플라스미드의 복제 및 증식을 가능하게 하고, 및
    (iii) 상기 벡터는 히그로마이신 저항성, 네오마이신 저항성, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제, 블레오마이신 저항성 및 잔틴(Xanthine)-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제로부터 선택된 선택 마커에 대한 유전자를 하나 이상 더 가지며, 및
    (iv) 상기 벡터는 하나 이상의 추가적인 조절 요소를 더 가지며, 상기 조절 요소는 스플라이싱 부위(splice site), 재조합 부위, 폴리A 부위, 인핸서, 및 다중클로닝 부위로부터 선택된다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 형질감염 벡터는 CMV 프로모터, 히그로마이신 저항성 유전자, 폴리A 서열 및 인간 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 pcDNA3.1 벡터인 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 불멸화된 인간 세포주는 하기로부터 선택된 하나 이상을 특징으로 하는 것인 방법:
    (i) 상기 세포주는 무혈청 조건하에서 형질감염되고 배양될 수 있고, 및
    (ii) 상기 세포주는 그의 게놈 내로 삽입된 아데노바이러스 서열을 가지며, 및
    (iii) 상기 세포주는 신장, 방광, 간, 폐, 심장근육, 연근육, 난소 및 위장관 세포로 구성된 군으로부터 선택되고, 및
    (iv) 상기 세포주는 인간 프리온(prion) 단백질을 발현할 수 없다.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포주는 신장 세포이고, 상기 신장 세포는 293 세포(ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), 293T 세포(DSM ACC 2494), 및 프리스타일(FreeStyle) 293 세포(293F 세포; Invitrogen R79007)로부터 선택된 인간 태아 신장 세포인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신장 세포는 293F 세포이고 상기 형질감염 벡터는 서열번호 1의 939에서 2324번까지의 염기쌍에 의해 표시된 혈액 응고 인자 IX, 서열번호 2의 973에서 2259번까지의 염기쌍에 의해 코딩되는 인간 A1AT, 서열번호 9로 표시된 야생형(wt) 인간 인자 VIII, 또는 서열번호 3으로 표시된 B-도메인 결실형 인간 인자 VIII, FVII/FVIIa, 서열번호 27로 표시된 G-CSFb를 포함한 G-CSF, 또는 폰 빌레브란드 인자를 코딩하는 pcDNA3.1인 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 무혈청 조건에서의 형질감염은 양이온성 형질감염제(transfection agent) 또는 인산칼슘을 포함하는 무혈청 현탁 배양물에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 형질감염된 세포를 생성된 상기 인간 단백질의 생산성, 활성 및 생성물 품질(product qaulity)의 비교에 의해 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 수득가능한 형질감염된 불멸화된 인간 세포주.
  11. 제10항에 있어서, 상기 불멸화된 인간 세포주는 293F 세포이고, 형질감염 벡터는 CMV 프로모터, 히그로마이신 저항성 유전자, 폴리A 서열, 및 인간 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 pcDNA3.1 벡터인 것인 세포주.
  12. 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 수득가능한 불멸화된 인간 세포주를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 단백질의 재조합 생산(recombinant production) 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인간 단백질은 서열번호 1의 939에서 2324번까지의 염기쌍에 의해 표시된 인간 혈액 응고 인자 IX, 서열번호 2의 973에서 2259번까지의 염기쌍에 의해 코딩되는 인간 A1AT, 서열번호 9로 표시된 야생형(wt) 인자 VIII, 또는 서열번호 3으로 표시되는 B-도메인 결실형 인간 인자 VIII, FVII/FVIIa, 서열번호 27로 표시된 G-CSFb를 포함한 G-CSF, 또는 폰 빌레브란드 인자인 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 배양액으로부터 상기 인간 단백질을 농축하는 단계, 및 상기 인간 단백질을 정제하는 단계, 및 프리온을 제거하는 단계 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 인간 단백질의 생산은 무혈청 조건에서 수행되는 것인 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008153366A2 (en) 2007-06-15 2008-12-18 Mogam Biotechnology Research Institute Method for manufacturing active recombinant blood coagulation factor ix
WO2009156430A1 (en) 2008-06-24 2009-12-30 Octapharma Ag A process of purifying coagulation factor viii
KR101921698B1 (ko) 2008-08-21 2018-11-26 옥타파마 아게 재조합에 의해 제조된 인간 인자 ⅷ 및 ⅸ
JP5592080B2 (ja) * 2009-05-08 2014-09-17 株式会社日立製作所 細胞培養方法、細胞培養システム
CN101906438B (zh) * 2009-06-05 2013-04-24 苏州泽璟生物制药有限公司 一种重组人凝血因子ⅶ在动物细胞内的表达和生产方法
KR101808751B1 (ko) 2009-11-13 2017-12-13 그리폴스 테라퓨틱스 인코포레이티드 폰 빌레브란트 인자(ｖＷＦ)-함유 제제, 및 그와 관련된 방법, 키트 및 용도
DK2553095T3 (en) 2010-03-30 2017-01-23 Octapharma Ag PROCEDURE FOR CLEANING VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS SUCH AS COAGULATION FACTOR IX
US9453045B2 (en) 2010-03-30 2016-09-27 Octapharma Ag Process for the purification of a growth factor protein
WO2011131720A1 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Octapharma Ag New stabilizing agent for pharmaceutical proteins
EP2707387B1 (en) 2011-05-13 2019-12-25 Octapharma AG A method of increasing the productivity of eucaryotic cells in the production of recombinant fviii
CN102277379B (zh) * 2011-08-18 2013-07-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 表达凝血因子viii的表达载体及其应用
CN103031277B (zh) * 2011-09-29 2015-07-15 重庆大学 力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用
CN103305540B (zh) * 2012-03-14 2015-03-25 齐鲁制药有限公司 一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法
WO2013166339A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Life Technologies Corporation High yield transient expression in mammalian cells using unique pairing of high density growth and transfection medium and expression enhancers
RU2731717C2 (ru) * 2013-05-03 2020-09-08 ФУДЖИФИЛМ ДИОСИНТ БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ЮКей ЛИМИТЕД Способ экспрессии
JP6735672B2 (ja) 2013-09-12 2020-08-05 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルス第ｖｉｉｉ因子ベクター
CA2934705C (en) 2014-01-20 2020-03-31 Octapharma Ag A process for manufacturing factor viii having an improved ratio of fviii:c/fviii:ag
CA2966527C (en) * 2014-11-02 2024-02-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger una molecules and uses thereof
WO2018210771A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Octapharma Ag Method for the production of a recombinant target protein
US20210124000A1 (en) 2018-05-04 2021-04-29 Fraunhofer-Gesellschaft zur Foerderung der angewandten Forschung eingetragener Verein Arterial spin labeling with evaluation of inversion state of magnetization
WO2020115318A1 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Basf Se Aqueous suspension comprising a zeolitic material and a zirconium chelate complex
CN110438066B (zh) * 2019-08-19 2021-01-12 杭州百凌生物科技有限公司 一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 c18p及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004095027A1 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Baxter International Inc. Diagnostic assay for anti-von willebrand factor cleaving protease (adamts13) antibodies
EP1533380A2 (en) * 1999-04-15 2005-05-25 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell comprising at least one E1 protein of adenovirus

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
US4540573A (en) 1983-07-14 1985-09-10 New York Blood Center, Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
EP0150735B2 (en) 1984-01-12 2004-01-07 Chiron Corporation Protein composition exhibiting coagulation activity and method for the preparation thereof
IL74909A (en) 1984-04-20 1992-01-15 Genentech Inc Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein
JPS6171774A (ja) 1984-09-14 1986-04-12 Sony Corp テレビジヨンカメラ装置のビ−ム電流制御装置
AU5772886A (en) 1985-04-12 1986-11-05 Genetics Institute Inc. Novel procoagulant proteins
JPS63500636A (ja) * 1985-08-23 1988-03-10 麒麟麦酒株式会社 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
WO1987004187A1 (en) 1986-01-03 1987-07-16 Genetics Institute, Inc. METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS
FI98829C (fi) 1986-01-27 1997-08-25 Chiron Corp Menetelmä rekombinoidun proteiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on humaanitekijä VIII:C-aktiivisuutta
US5451521A (en) 1986-05-29 1995-09-19 Genetics Institute, Inc. Procoagulant proteins
EP0251843A1 (fr) 1986-06-06 1988-01-07 Transgene S.A. Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères
DK155388C (da) 1986-07-08 1989-10-23 Palle Pedersen Laas
ATE63335T1 (de) 1986-07-11 1991-05-15 Miles Inc Herstellung von rekombinantem protein.
NO872932L (no) 1986-07-18 1988-01-19 Gist Brocades Nv Fremgangsmaate for fremstilling av proteiner med faktorviiiaktivitet ved hjelp av mikrobielle vertsceller, eksprimeringsvektorer, vertsceller, antibiotika.
IL84168A0 (en) 1986-10-15 1988-03-31 Rorer Int Overseas Human factor viii-c analogs,process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same
EP0690126B1 (en) 1987-06-12 2001-11-28 Baxter Aktiengesellschaft Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
JPH084495B2 (ja) * 1988-08-19 1996-01-24 帝人株式会社 接着性動物細胞の培養方法
ZA909167B (en) 1989-11-17 1993-10-15 Chiron Corp Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
DE4204694C3 (de) 1992-02-01 1995-10-12 Octapharma Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie
JPH08506498A (ja) 1993-02-09 1996-07-16 オクタファルマ・アクチエンゲセルシャフト 非脂質被覆ウイルスの失活方法
US5585237A (en) 1993-10-25 1996-12-17 Creative Biomolecules, Inc. Methods and compositions for high protein production from recombinant DNA
DK128093D0 (da) 1993-11-12 1993-11-12 Novo Nordisk As Hidtil ukendte forbindelser
US6136865A (en) 1995-05-20 2000-10-24 Octapharma Ag Method for reduction of the infectiousness of potentially infectious material
WO1999029848A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Immune Response Corporation Novel vectors and genes exhibiting increased expression
ES2226383T3 (es) * 1998-04-17 2005-03-16 Societe Des Produits Nestle S.A. Linea de celulas inmortalizadas derivadas de tejidos cutaneos humanos normales.
US6210924B1 (en) * 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
CA2252972C (en) * 1998-11-26 2012-09-18 National Research Council Of Canada Serum-free production of recombinant proteins and adenoviral vectors
EP1010762A1 (en) 1998-12-02 2000-06-21 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung DNA constructs of blood clotting factors and P-Selectin
IL146128A0 (en) * 1999-04-29 2002-07-25 Leukotech As Expression of heparin-binding protein in recombinant mammalian cells
AU784506B2 (en) * 1999-08-25 2006-04-13 Immunex Corporation Compositions and methods for improved cell culture
IL151857A0 (en) 2000-03-22 2003-04-10 Octagene Gmbh Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines
CN1443170A (zh) * 2000-07-20 2003-09-17 神经原公司 辣椒素受体配体
KR20040032105A (ko) * 2001-06-04 2004-04-14 엠엘 래보러토리즈 피엘씨 재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준대규모 생산방법
US20040180438A1 (en) * 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
KR101149777B1 (ko) 2002-11-29 2012-06-11 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게 신규한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고생산성 재조합 세포의 선별 방법
US7217566B2 (en) 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
CN104059147A (zh) * 2003-06-27 2014-09-24 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
JP2005073509A (ja) * 2003-08-28 2005-03-24 Nihon Pharmaceutical Co Ltd ヒトアンチトロンビンの生産方法
CA2540135C (en) * 2003-10-03 2012-12-04 Keiichi Fukuda Method of inducing the differentiation of stem cells into cardiomyocytes
EA200600918A1 (ru) * 2003-11-06 2006-10-27 Игзонхит Терапьютикс Са Васе455, вариант альтернативного сплайсинга бета-секретазы человека
WO2005045007A1 (ja) * 2003-11-06 2005-05-19 Kyoto University 幹細胞の凍結保存法およびシステム
WO2009101560A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Koninklijke Philips Electronics N.V. Apparatus for segmenting an object comprising sub-objects

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1533380A2 (en) * 1999-04-15 2005-05-25 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell comprising at least one E1 protein of adenovirus
WO2004095027A1 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Baxter International Inc. Diagnostic assay for anti-von willebrand factor cleaving protease (adamts13) antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Yisrael Sidis 등. Endocrinology. Vol. 146, No. 1, 페이지 130-136 (2005) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105755041A (zh) 2016-07-13
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