CN103031277B

CN103031277B - 力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用

Info

Publication number: CN103031277B
Application number: CN201110292302.7A
Authority: CN
Inventors: 张兵兵; 鲜成玉; 王远亮; 徐洪记; 赵源
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2011-09-29
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2031-09-29
Also published as: CN103031277A

Abstract

本发明属于细胞工程和基因工程重组技术领域，涉及力生长因子（Mechano growth factor, MGF）在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用，通过将MGF编码基因转入哺乳动物细胞，可以构建出能自主表达MGF的工程细胞，该工程细胞通过表达MGF能显著提高对无血清培养的耐受力，可降低对发酵条件的要求，减少培养成本，特别适用于生物制品的工业化大规模生产，具有广阔的应用前景。

Description

力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程重组技术领域，涉及一种新型生长因子在改良工程细胞方面的应用，特别涉及力生长因子（Mechano growth factor, MGF）在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用。

背景技术

在生物技术领域，基因工程重组技术无疑是最具革命性的技术，该技术使人类可以对物种进行改造，通过基因重组构建工程菌、哺乳动物工程细胞、转基因动植物等，从而获得所需的生物制品或更具经济价值的生物品种。长期以来，重组蛋白的生产多采用大肠杆菌表达系统，但有许多重要蛋白在大肠杆菌中无法进行有活性的表达，对大肠杆菌进一步的遗传改造也收效甚微。与大肠杆菌相比，用哺乳动物细胞表达重组蛋白具有独特的优势：哺乳动物细胞能够正确有效地识别蛋白的合成、加工和分泌信号，能够准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键以及蛋白水解等翻译后加工过程，所表达的蛋白具有天然蛋白一样的生物活性。但与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的工程化培养面临诸多困难，主要原因在于：哺乳动物细胞对培养基的要求高，对大规模发酵环境下的应激环境非常敏感，容易发生细胞死亡或凋亡。虽然通过优化培养基配方和培养条件获得了一些有利成果，但一些问题仍然无法从根本上得到解决。近年来，随着对细胞代谢途径和调控机理的深入研究，越来越多的研究者将研究方向转向对细胞本身进行改造，通过基因工程重组技术使细胞对体外培养的适应能力更强，从而满足产业化大规模培养的要求。

在哺乳动物细胞发酵工程中，为了下游纯化方便和提高生物安全性，也为了降低生产成本，通常需要进行无血清培养，但血清中所含的各种生长因子、细胞因子、激素、粘附蛋白等成份往往是细胞存活和增殖所必须的。因此，提高哺乳动物工程细胞对无血清培养的耐受力，是哺乳动物细胞发酵工程的关键。

MGF是胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的一种变体，由Igf-1基因剪接变异产生。与IGF-1相比，人MGF多出长40个氨基酸的羧基端短肽序列（啮齿类动物为41个氨基酸，两种MGF的功能相同），该短肽可以作用于独立的受体；并由于来自外显子5的49bp（啮齿类动物为52bp）的插入序列，导致外显子6的翻译发生移码突变，产生特异的长24个氨基酸的羧基端E肽序列（啮齿类动物为25个氨基酸），该序列可以作为MGF的活性片段单独发挥MGF的生物学功能。MGF最初是在机械损伤的骨骼肌中被发现的，目前发现心肌、成骨细胞、子宫内膜细胞、肌腱成纤维细胞等在损伤状态下都有MGF的表达。既往研究显示，MGF具有保护损伤细胞、促进损伤修复的功能，预示了该因子在医学上的应用前景。但MGF能否应用于细胞工程领域以提高哺乳动物工程细胞对大规模发酵环境下无血清培养的耐受力，目前尚未见国内外文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于研究MGF能否应用于细胞工程领域以提高哺乳动物工程细胞对大规模发酵环境下无血清培养的耐受力，进而获得一种更适合生物制品工业化大规模生产的哺乳动物工程细胞。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

MGF在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用。

所述MGF可以来源于啮齿类动物鼠，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因序列如SEQ ID No.4所示。鉴于除鼠外的其它啮齿类动物来源的MGF、人源MGF与鼠源MGF都具有高度类似的序列和相同的功能，并都能在不同种属的细胞中得到表达，因此，所述MGF也可以来源于除鼠外的其它啮齿类动物，如兔，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因序列如SEQ ID No.5所示；还可以来源于人，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码基因序列如SEQ ID No.6所示。

所述哺乳动物工程细胞的宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）、幼仓鼠肾细胞（BHK）和人胚肾293细胞等。

本发明的有益效果在于：本发明提供了MGF在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用，通过将MGF编码基因转入哺乳动物细胞，可以构建出能稳定、自主表达MGF的工程细胞，该工程细胞通过表达MGF能显著提高对无血清培养的耐受能力，可降低对发酵条件的要求，减少培养成本，特别适用于生物制品的工业化大规模生产，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为携带MGF编码基因的重组慢病毒质粒构建示意图。

图2为PCR鉴定阳性克隆细胞中基因组MGF基因的整合，其中M为DNA分子量标准（Maker），1为携带MGF编码基因的阳性克隆细胞，2为未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞。

图3为PCR鉴定阳性克隆细胞中MGF mRNA的表达，其中M为Marker，1为携带MGF编码基因的阳性克隆细胞，2为未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞，3为未经病毒感染的细胞，4为携带MGF编码基因的重组慢病毒质粒。

图4为Western blot鉴定阳性克隆细胞中MGF的表达，其中1为携带MGF编码基因的阳性克隆细胞，2为未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞，3为未经病毒感染的细胞。

图5为MTT法检测阳性克隆细胞在无血清培养下的增殖能力，其中空白对照为未经病毒感染的细胞，空病毒为未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞，MGF整合为携带MGF编码基因的阳性克隆细胞。

图6为Annexin V-FITC/PI法流式细胞仪检测阳性克隆细胞在无血清培养下的凋亡状况，其中a为未经病毒感染的细胞，b为未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞，c为携带MGF编码基因的阳性克隆细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、稳定表达鼠 MGF 的哺乳动物工程细胞的构建和鉴定

合成核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的鼠MGF编码基因。按照ViraPower^TMLentiviral Directional TOPO^® Expression Kit（Invitrogen公司）说明书的要求合成如下引物：上游引物F：5’-caccatgggaccggagacgc-3’；下游引物R：5’-gatgaacacaagaagtttac-3’。以合成的鼠MGF编码基因为模板，采用上述引物，PCR扩增带有CACC粘性末端的鼠MGF编码基因。

将带有CACC粘性末端的鼠MGF编码基因与慢病毒质粒pLenti6/V5-D-TOPO连接，获得携带鼠MGF编码基因的重组慢病毒质粒pLenti6/V5-D-TOPO-MGF（图1）。采用常规CaCl₂法制备大肠杆菌Stb13的感受态细胞，并热激转化pLenti6⁄V5 D-TOPO-MGF质粒。经转化的Stb13细胞用含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml稻瘟菌素（blasticidin）的LB平板培养，筛选出转化了pLenti6⁄V5 D-TOPO-MGF的阳性克隆细胞。将阳性克隆细胞扩增后提取质粒，用BstXⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，获得大小符合鼠MGF编码基因长度的酶切片段，说明重组慢病毒质粒pLenti6/V5-D-TOPO-MGF构建成功。

复苏293FT细胞，待细胞生长融合达到60-80%时，按照ViraPower^TMLentiviral Directional TOPO^® Expression Kit说明书介绍的方法，将重组慢病毒质粒pLenti6/V5-D-TOPO-MGF用Lipofectamine转化细胞。转化后的细胞继续培养72小时，收集含病毒的培养上清液，离心去除细胞碎片，获得鼠MGF重组慢病毒悬液。

培养CHO-K1细胞至60-80%融合，加入鼠MGF重组慢病毒悬液进行转染，用4μg/ml稻瘟菌素筛选阳性克隆细胞，共培养12天。取所得阳性克隆细胞，进行基因组PCR、mRNA PCR及western blot鉴定。基因组PCR鉴定结果如图2所示，提取细胞DNA，采用前述上游引物F和下游引物R进行PCR扩增，从阳性克隆细胞基因组中可以扩增出MGF编码基因，说明MGF编码基因已整合入细胞基因组中，而从未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞基因组中不能扩增出相应条带。mRNA PCR鉴定结果如图3所示，提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，采用前述上游引物F和下游引物R进行PCR扩增，阳性克隆细胞可以扩增出MGF编码基因，说明细胞中有MGF mRNA表达，而未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞和未经病毒感染的细胞均不能扩增出相应条带。Western blot鉴定结果如图4所示，提取细胞总蛋白，采用兔抗MGF抗体进行分析，可见阳性克隆细胞中有MGF表达，而未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞和未经病毒感染的细胞都没有特异性条带产生。上述携带MGF编码基因并有相应蛋白表达的阳性克隆细胞即为成功构建的稳定表达鼠MGF的CHO-K1工程细胞。

二、稳定表达鼠 MGF 的哺乳动物工程细胞的无血清培养耐受能力测试

以未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞和未经病毒感染的细胞为对照，取所构建的稳定表达鼠MGF的CHO-K1工程细胞进行无血清培养耐受实验：（1）将细胞用IMDM/HT无血清培养基培养24小时，用MTT法检测细胞增殖能力；（2）将细胞用IMDM/HT无血清培养基培养72小时，用Annexin V-FITC/PI法流式细胞仪检测细胞凋亡状况。MTT法检测结果如图5所示，与未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞和未经病毒感染的细胞相比，稳定表达鼠MGF的CHO-K1工程细胞数显著增加，说明鼠MGF可以提高CHO-K1细胞在无血清培养条件下的增殖能力。流式细胞仪检测结果如图6所示，未经病毒感染的细胞和未携带MGF编码基因的空病毒感染细胞在无血清培养条件下培养72小时的细胞凋亡率分别为65.6%和68.3%，而稳定表达鼠MGF的CHO-K1工程细胞在无血清培养条件下的细胞凋亡率仅为20.5%，说明鼠MGF可以提高CHO-K1细胞对无血清培养的耐受能力。

鉴于除鼠外的其它啮齿类动物来源的MGF、人源MGF与鼠源MGF具有高度类似的序列和相同的功能，并都能在不同种属的细胞中得到表达，本领域技术人员可以预测除鼠外的其它啮齿类动物来源的MGF和人源MGF也可以提高CHO-K1细胞对无血清培养的耐受能力。参照上述实施例，本发明分别以兔MGF编码基因（SEQ ID No.5）和人MGF编码基因（SEQ ID No.6）取代鼠MGF编码基因构建MGF重组慢病毒，再转化CHO-K1细胞获得稳定表达兔MGF或人MGF的CHO-K1工程细胞，同样进行无血清培养耐受实验，获得了与鼠MGF相近的结果，证实了啮齿类动物来源的MGF和人源MGF都可以提高CHO-K1细胞对无血清培养的耐受能力。

参照上述实施例，本发明还将所构建的鼠/兔/人MGF重组慢病毒分别转染BHK细胞和人胚肾293细胞，获得稳定表达鼠/兔/人MGF的工程细胞，同样进行无血清培养耐受实验，也获得了与CHO-K1细胞相近的结果，证实了MGF也能够提高除CHO-K1细胞以外的其它哺乳动物细胞对无血清培养的耐受能力。

根据上述记载，本领域技术人员可以预测，除MGF以外，具有MGF活性的MGF截短片段如羧基端E肽序列，以及维持MGF活性不变或活性提高的MGF变体和MGF衍生物等都可以实现本发明目的；除天然的MGF编码基因序列以外，根据宿主细胞对密码子的偏好性人工设计的MGF编码基因序列，也同样可以实现本发明目的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 重庆大学

<120> 力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用

<160> 8

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<220>

<223> 力生长因子

<400> 1

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln

1 5 10 15

Phe Val Cys Gly pro Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr val

20 25 30

Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp

35 40 45

Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr

50 55 60

Cys Val Arg Cys Lys Pro Thr Lys Ser Ala Arg Ser Ile Arg Ala

65 70 75

Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Ser Gln Pro Leu

80 85 90

Ser Thr His Lys Lys Arg Lys Leu Gln Arg Arg Arg Lys Gly Ser

95 100 105

Thr Leu Glu Glu His Lys

110

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 兔（Oryctolagus cuniculus）

<220>

<223> 力生长因子

<400> 2

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln

1 5 10 15

Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly

20 25 30

Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp

35 40 45

Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr

50 55 60

Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ala Ala Arg Ser Val Arg Ala

65 70 75

Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro

80 85 90

Ser Thr Asn Lys Lys Met Lys Ser Gln Arg Arg Arg Lys Gly Ser

95 100 105

Thr Phe Glu Glu His Lys

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<220>

<223> 力生长因子

<400> 3

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln

1 5 10 15

Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly

20 25 30

Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp

35 40 45

Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr

50 55 60

Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala

65 70 75

Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro

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Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr

95 100 105

Phe Glu Glu His Lys

110

<210> 4

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<212> DNA

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<220>

<223> 力生长因子编码基因

<400> 4

atgggaccag agaccctttg cggggctgag ctggtggacg ctcttcagtt cgtgtgtgga 60

ccaaggggct tttacttcaa caagcccaca gtctatggct ccagcattcg gagggcacca 120

cagacgggca ttgtggatga gtgttgcttc cggagctgtg atctgaggag gctggagatg 180

tactgtgtcc gctgcaagcc tacaaagtca gctcgttcca tccgggccca gcgccacact 240

gacatgccca agactcagaa gtcccagccc ctatcgacac acaagaaaag gaagctgcaa 300

aggagaagga aaggaagtac acttgaagaa cacaagtag 339

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 兔（Oryctolagus cuniculus）

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<223> 力生长因子编码基因

<400> 5

atgggaccgg agacgctctg cggtgctgag ctggtggatg ctcttcagtt cgtgtgtgga 60

gacaggggct tttatttcaa caagcccaca ggatacggct ccagcagtcg gagggcacct 120

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aggagaagga aaggaagtac atttgaagaa cacaagtag 339

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人（homo sapiens）

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<223> 力生长因子编码基因

<400> 6

atgggaccgg agacgctctg cggggctgag ctggtggatg ctcttcagtt cgtgtgtgga 60

gacaggggct tttatttcaa caagcccaca gggtatggct ccagcagtcg gagggcgcct 120

cagacaggca tcgtggatga gtgctgcttc cggagctgtg atctaaggag gctggagatg 180

tattgcgcac ccctcaagcc tgccaagtca gctcgctctg tccgtgccca gcgccacacc 240

gacatgccca agacccagaa gtatcagccc ccatctacca acaagaacac gaagtctcag 300

agaaggaaag gaagtacatt tgaagaacac aagtag 336

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 上游引物F

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caccatggga ccggagacgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 下游引物R

<400> 8

gatgaacaca agaagtttac 20

Claims

1.力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用，所述哺乳动物工程细胞为自主、稳定表达力生长因子的中国仓鼠卵巢细胞。

2.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于：所述力生长因子来源于啮齿类动物鼠，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于：所述力生长因子的编码基因序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于：所述力生长因子来源于啮齿类动物兔，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求4中所述的应用，其特征在于：所述力生长因子的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述力生长因子来源于人，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于：所述力生长因子的编码基因序列如SEQ ID No.6所示。