CN104046593A - 一种低免疫原性的人细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明中提供了一种低免疫原性的人细胞及其制备方法。具体而言，本发明涉及一种修饰的人细胞，与相应的野生型细胞相比，其细胞表面人类白细胞抗原HLA蛋白或多肽缺失或表达下调，从而使得所述修饰的人细胞具有降低的免疫原性。本发明还涉及制备上述修饰的人细胞的方法，包括使人细胞中HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因(例如β2-微球蛋白基因)缺失或表达下降。本发明的修饰的人细胞(系)具有低免疫原性，有望成为一种新型的、能够降低甚至避免免疫排斥反应的移植供体，这将为器官移植提供一种崭新的材料和方法。

Description

一种低免疫原性的人细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程和医学领域，具体涉及一种具有低免疫原性的人细胞及其制备方法。

背景技术

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)是当受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团(inner cell mass)的细胞在体外培养而成、能够无限增殖、自我更新且具有发育全能性的一种细胞。

人类胚胎干细胞的研究意义十分重大，并且具有广阔的应用前景。首先，它带来了人类细胞移植治疗的一次重大革命。由于人类胚胎干细胞能分化出成体的所有组织和器官(包括生殖细胞)，因而有望成为实施器官再生医学和现代生物细胞疗法的重要细胞来源，也将为目前大量疑难病症，如神经退行性疾病、癌症、器官移植和损伤再生等的发病机理和治疗学提供研究途径。例如，用分化得到的神经细胞治疗神经性疾病(帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、阿兹海默症等)；用分化得到的造血干细胞重建造血功能；用分化得到的胰岛细胞治疗糖尿病；用分化得到的心肌细胞修复已坏死的心肌；用分化得到的肝细胞治疗肝病，等等。

近年来，我国也非常重视并鼓励干细胞研究，尤其是人胚胎干细胞研究。例如，2006年，国务院公布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中就已经指出：我国要“重点研究治疗性克隆技术，干细胞体外建系和定向诱导技术，人体结构组织体外构建与规模化生产技术，人体多细胞复杂结构组织构建与缺损修复技术和生物制造技术”，并进一步指出我国要“重点研究干细胞增殖、分化和调控，生殖细胞发生、成熟与受精，胚胎发育的调控机制，体细胞去分化和动物克隆机理，人体生殖功能的衰退与退行性病变的机制，辅助生殖与干细胞技术的安全和伦理等”。

然而，由于细胞或者器官异体移植的供受体之间，极易发生免疫排斥反应，因此使得干细胞的临床应用受限。为了解决免疫排斥的问题，可根据现有技术水平建立非常庞大的干细胞库，但是建立这些干细胞库的难度相当大，代价也相当高；并且，即使可以建立庞大的干细胞库，也不一定能满足所有患者的配型。

20世纪时，有科学家发现，在不同种属或同种不同系别的个体间进行组织移植时，会出现排斥反应，其本质是细胞表面的同种异型抗原诱导的一种免疫应答。这种代表个体特异性的同种异型抗原被称为“移植抗原”或“组织相容性抗原”，其中能引起强而迅速排斥反应的抗原被称为“主要组织相容性抗原”，在人体中称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。

主要组织相容性抗原是一个复杂的抗原系统，编码这一系统的基因位于同一染色体片段上，是一组紧密连锁的基因群，称为“主要组织相容性复合体”(major histocompatibility complex，MHC)。同种异体组织移植时，若供受体移植抗原不同，尤其是MHC不匹配，将会诱发受体产生明显的移植排斥反应。MHC分为I类和II类分子，其中MHC I类分子分布于所有有核细胞，MHC II类分子主要表达于B细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞等。在人体中，MHC I类基因编码的主要组织相容性抗原指的是HLA I类分子。若供受体的I类分子不同，会诱发CD8⁺的T细胞增殖和分化成熟，导致移植物的破坏，I类抗原的错配是导致免疫效应阶段供体移植物成为被攻击的靶标的主要原因。在人类器官移植中，I类抗原主要影响供体移植物的长期存活效率。

由于II类分子主要只表达于部分免疫细胞，而I类分子则分布于所有有核细胞，因此，如果能够得到HLA I类分子敲除或沉默的人多能干细胞，将其分化为非免疫细胞的细胞类型(如胰腺或肝脏细胞等)，作为移植的供体来源，将极大降低异体移植的免疫排斥反应。这将为供体移植物的来源提供一种崭新的途径，并且能够在很大程度上改善移植物的长期存活率。

HLA生物合成或转运途径中可涉及很多种基因，例如β2-微球蛋白(β2-microglobulin，B2M)基因和TAP1、TAP2、TAPBP、NLRC5等基因。B2M是HLA I类分子的一个组成部分，其与I类分子在细胞表面的表达以及分子的稳定性相关。因此，敲除β2-微球蛋白可能会导致HLA I类分子在免疫系统中功能的丧失。TAP1在装配HLA I类分子过程中发挥重要作用。当TAP1缺失时，HLA I类分子不能正确装配进而影响HLA I类分子在细胞表面的表达。因此，敲除TAP1可能会导致HLA I类分子在免疫系统中功能的丧失。

然而，由于不同生物种类的多样性和机体的复杂性等因素，至今仍没有在人细胞中对这些HLA相关基因(如β2-微球蛋白基因或TAP1)进行成功打靶和后续研究的报道。

综上所述，人干细胞具有分化的多潜能性，是实施器官再生医学和现代生物细胞疗法、药物筛选等的重要细胞来源。但由于细胞或者器官异体移植的供受体之间极易发生免疫排斥反应，由此使得人成体细胞或人干细胞的临床应用受限。因此，本领域中迫切需要开发出一种具有低免疫原性的人细胞或人干细胞系，该细胞系可作为新型的、能够降低或者避免免疫排斥反应的移植供体，从而为移植治疗提供一种崭新的材料和方法，且可用于候选药物的评估和筛选。

发明内容

本发明通过对人细胞进行基因工程学操作，使得人细胞表面的HLA表达下调或者缺失，这种方法得到的人细胞具有低免疫原性。

由此，本发明的首要目的在于，提供一种HLA缺失或减少的、具有低免疫原性的修饰的人细胞及其制备方法，优选所述细胞为人干细胞。本发明的第二个目的在于，提供由本发明的修饰的人干细胞进一步制得的、具有降低的移植排斥性的移植用细胞及其制备方法。本发明的第三个目的在于，提供本发明修饰的人干细胞以及移植用细胞在疾病治疗中的应用(例如通过具有降低的免疫原性的移植等)。

在本发明的第一方面中，提供了一种修饰的人细胞，与相应的野生型细胞相比，所述修饰的人细胞的细胞表面人类白细胞抗原HLA蛋白或多肽缺失或表达下调，从而使得所述修饰的人细胞具有降低的免疫原性。

在一个优选例中，所述HLA蛋白或多肽为HLA I类蛋白或多肽。在另一个优选例中，所述HLA蛋白或多肽为选自下组中的至少一种：HLA A型多肽、HLA B型多肽和HLA C型多肽。在另一个优选例中，所述人细胞选自下组：造血细胞、神经细胞、血液细胞、脂肪细胞、间充质细胞、肌肉细胞、心脏细胞、肝脏细胞、胰腺细胞、皮肤细胞等。

在一些实施方式中，所述人细胞是人干细胞，优选人多能干细胞。在一个优选例中，所述修饰的人干细胞基于选自下组的干细胞：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

在另一个优选例中，所述修饰的人干细胞通过对选自下组的干细胞系进行基因工程化操作获得：胚胎来源的胚胎干细胞，例如已建立的胚胎干细胞系；诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)；生殖细胞起源的干细胞；通过体细胞核移植(SCNT)所获得的干细胞。优选已建立的干细胞系(例如胚胎干细胞，如X1细胞系)、诱导多能干细胞。

在另一个优选例中，所述修饰的人干细胞基于选自下组的干细胞：造血干细胞、神经干细胞、周边血干细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、心脏干细胞等。

在另一个优选例中，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞的HLA I类多肽在细胞表面表达下调至少30%，优选下调至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%，更优选不表达HLA I类多肽。

在另一个优选例中，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的人干细胞的免疫原性降低，优选与移植相关的免疫原性降低。在另一个优选例中，所述免疫原性的降低在统计学上具有显著差异(P<0.05)，更优选具有极显著差异(P<0.001)。

在本发明的一些实施方式中，所述修饰的人干细胞不具有发育成人类个体的能力。

在另一个优选例中，相对于相应的野生型干细胞，所述修饰的干细胞具有降低的免疫原性。相对于相应的野生型干细胞，所述降低可选自下组：(i)用所述修饰的干细胞诱导的炎性应答水平降低；(ii)用所述修饰的干细胞诱导的细胞因子水平降低；和/或(iii)用所述修饰的干细胞诱导的外周血细胞增殖水平降低。

在另一个优选例中，(i)、(ii)和/或(iii)中的所述水平基本上低于相应野生型干细胞所致的水平，是相应野生型干细胞所致的水平的10%～95%，更优选10%～50%。在另一个优选例中，(i)、(ii)和/或(iii)中的所述水平比相应野生型干细胞所致的水平降低0.05～10倍，更优选1～10倍。

在另一个优选例中，所述(i)中的炎性应答水平是在开始注入所述修饰的干细胞后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天测定的。所述降低的炎性应答水平包括炎性细胞数量的减少。采用炎性细胞侵润分析法来定量所述炎性应答水平。

在另一个优选例中，所述(ii)中的细胞因子水平是在外周血与所述修饰的干细胞共孵育后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天测定的。所述细胞因子水平的降低包括降低干扰素的量。采用酶联免疫吸附斑点分析法相对于相应的野生型干细胞定量所述细胞因子水平。

在另一个优选例中，所述(iii)中的外周血细胞增殖水平是在开始孵育所述修饰的干细胞和外周血细胞后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天计算的。所述外周血细胞增殖水平包括采用免疫表型分析法定量的外周血单核细胞(PMBC)增殖水平。

在另一些实施方式中，所述修饰的人细胞中HLA I类分子生物合成或转运途径中的一种或多种基因表达下降。在一个优选例中，所述HLA I类分子生物合成或转运途径中的一种或多种基因发生全部或部分缺失。在另一个优选例中，所述修饰的人细胞的内源性HLA基因被破坏，优选通过基因定点修饰将所述破坏引入所述修饰的人细胞的基因组，更优选所述破坏包括同源性破坏HLA基因。

在另一些实施方式中，所述基因选自：B2M基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因，优选B2M基因。

在另一个优选例中，所述B2M基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因全部或部分缺失。

在一个优选例中，通过TAP1^－/－双拷贝敲除或TAP1^＋/－单拷贝敲除实现所述TAP1的缺失或表达下降。在另一个优选例中，所述TAP1^＋/－(单拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类蛋白或者多肽在细胞表面表达下调。在另一个优选例中，所述TAP1^－/－(双拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类分子或者多肽在细胞表面表达下调，更优选不表达HLA I类蛋白或者多肽。

在另一些实施方式中，所述B2M基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因全部或部分缺失。通过B2M^－/－双拷贝敲除或B2M^＋/－单拷贝敲除实现所述β2-微球蛋白的缺失或表达下降。在另一个优选例中，所述B2M^＋/－(单拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类蛋白或者多肽在细胞表面表达下调至少30%。在另一个优选例中，所述B2M^－/－(双拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类分子蛋白或者多肽在细胞表面表达下调至少90%，更优选不表达HLA I类分子蛋白或者多肽。

在本发明的第二方面中，提供了一种制备本发明所述的修饰的人细胞的方法，所述方法包括：A)提供原料人细胞；B)对所述原料人细胞进行修饰改造，以使其HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因表达下降；C)收集所述修饰的人细胞。

在一个优选例中，步骤A)中的原料人细胞选自下组：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。在另一个优选例中，所述人干细胞原料选自下组：已建立并可公开获得的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)；人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)；生殖细胞起源的干细胞；通过体细胞核移植(SCNT)所获得的干细胞。优选已建立的干细胞系(例如胚胎干细胞，如X1细胞系)、诱导多能干细胞。

在另一个优选例中，所述原料人干细胞选自下组：成体干细胞例如造血干细胞、神经干细胞、血液干细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、心脏干细胞等。

在另一个优选例中，所述原料人细胞选自下组：造血细胞、神经细胞、血液细胞、脂肪细胞、间充质细胞、肌肉细胞、心脏细胞、肝脏细胞、胰腺细胞、皮肤细胞等体细胞。

在一个优选例中，步骤B)使得原料人细胞中HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因发生全部或部分基因缺失。在另一个优选例中，所述基因选自：β2-微球蛋白基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因，优选B2M基因。

在另一些实施方式中，所述步骤B)是使得所述原料人细胞中的HLA I类分子组分蛋白的B2M基因缺失或使得该基因的表达下调。

在一个优选例中，所述步骤B)使得所述原料干细胞中B2M基因发生全部或部分基因缺失。在另一个优选例中，通过B2M^－/－双拷贝敲除或B2M^+/－单拷贝敲除实现所述β2-微球蛋白的缺失或表达下降。在另一个优选例中，所述B2M^＋/－(单拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类蛋白或者多肽在细胞表面表达下调至少30%。在另一个优选例中，所述B2M^－/－(双拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类分子蛋白或者多肽在细胞表面表达下调至少90%，更优选不表达HLA I类分子蛋白或者多肽。

在另一个优选例中，通过TAP1^－/－双拷贝敲除或TAP1^＋/－单拷贝敲除实现所述TAP1的缺失或表达下降。在另一个优选例中，TAP1^＋/－(单拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类蛋白或者多肽在细胞表面表达下调。在另一个优选例中，所述TAP1^－/－(双拷贝敲除)使得所述修饰的干细胞的HLA I类分子蛋白或者多肽在细胞表面表达下调，更优选不表达HAL I类蛋白或者多肽。

在另一个优选例中，通过如下步骤进行所述B)：

B1)构建打靶载体，所打靶的目标为HLA I类分子组分蛋白的B2M基因；

B2)用所述打靶载体转染所述人细胞，得到因B2M基因被敲除而使得细胞表面HLA I类分子表达缺失或下调的人细胞。

在另一个优选例中，所述步骤B)是通过基因定点修饰技术实现的。在另一个优选例中，所述步骤B)是通过TALEN实现的。在另一个优选例中，所述步骤B)是通过TALEN法单拷贝或双拷贝敲除所述人细胞中的HLA I类分子组分蛋白的B2M基因。

在另一些实施方式中，所述步骤C)包括：从步骤B)中所得细胞中选择细胞表面HLA I类分子表达缺失或下调的人细胞，从而获得细胞表面的HLA I类分子缺失或表达下调的修饰的人细胞。

在另一些实施方式中，所述方法还任选包括：D)检验步骤C)中所得修饰的人细胞的免疫原性，以确定所述修饰的人细胞与野生型细胞相比具有降低的免疫原性。

在一个优选例中，所述方法包括：收集包含靶多核苷酸的人细胞，所述靶核酸与HLA I类分子生物合成或转运途径的一种和多种基因相关；将转录激活子样(TAL)效应子核酸酶导入所述人细胞以产生所述修饰的干细胞；和分离所述修饰的干细胞，其中多种TAL效应子重复序列与靶多核苷酸结合。

在本发明的第三方面中，提供了一种具有降低的免疫原性的移植用细胞，所述移植用细胞是由本发明所述修饰的人细胞获得或诱导分化来的，或是由采用本发明所述方法制得的修饰的人细胞获得、诱导分化、或者转分化来的。

在一个优选例中，与相应的野生型细胞相比，所述移植用细胞与移植相关的免疫原性降低。在另一个优选例中，所述免疫原性的降低在统计学上具有显著差异(P<0.05)，更优选具有极显著差异(P<0.001)。

在另一个优选例中，所述分化的诱导是通过选自下组的方法进行的：拟胚体形成、生长因子诱导的分化、小分子化合物诱导的分化、转录因子诱导的分化、或其他方法诱导的分化以及转分化。

在本发明的第四方面中，提供了一种制备本发明所述移植用细胞的方法，所述方法包括：诱导本发明所述修饰的人细胞分化为所需的移植用细胞；或用采用本发明所述方法制得的修饰的人细胞，并诱导所得的修饰的人细胞分化为所需的移植用细胞，其中所述修饰的人细胞是修饰的人干细胞，优选修饰的人多能干细胞。

在本发明的第五方面中，提供了本发明所述修饰的人细胞、通过本发明方法制得的修饰的人细胞、本发明的移植用细胞或通过本发明方法制得的移植用细胞在制备用于疾病治疗的移植物或药物组合物中的用途。

在一个优选例中，所述修饰的人干细胞为未分化或分化状态。在另一个优选例中，所述移植物或药物组合物具有减弱的免疫排斥反应。

在另一个优选例中，所述移植物或药物组合物用于治疗选自下组的疾病：帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症、阿兹海默症、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症等神经退行性疾病，以及脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、肝病、糖尿病、造血功能缺陷、癌症等的器官移植(如胰腺移植、肝细胞移植、肾脏移植等)及损伤再生。

在本发明的其它方面中，还提供了本发明的修饰的人细胞在器官再生、修复、疾病治疗等方面(例如治疗细胞功能障碍或组织破坏)、对干细胞全能性的机理研究、器官移植、药物筛选、基因治疗中的应用。

在一个实施方式中，本发明提供了一种对患者进行干细胞治疗的方法，所述方法包括：(a)分离和收集人干细胞；(b)对所述人干细胞进行修饰改造，以使其HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因表达下降；(c)收集所述修饰的人干细胞；(d)将所述修饰的人干细胞移植入需要所述治疗的患者，或诱导所述修饰的人干细胞分化为所需的细胞类型后移植入需要所述治疗的患者。

在一个优选例中，所述干细胞可为获自患者本身或他人的干细胞。在另一优选例中，所述基因选自β2-微球蛋白基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因，优选B2M基因。

在另一个实施方式中，提供了一种筛选候选药物或评估候选化合物生理功能或毒性的方法，所述方法包括步骤：用所述候选药物或候选化合物处理本发明的修饰的人细胞或由本发明的修饰的干细胞分化而得的所需细胞类型。

从另一角度而言，在本发明中涉及一种修饰的细胞、产生用于移植的修饰的细胞的方法、采用本发明细胞的治疗方法。以下以修饰的干细胞为例，但应理解所述修饰的细胞可为其它类型的细胞，例如上文所例举的各种细胞类型，优选为人细胞。

在本发明中涉及一种修饰的干细胞，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞包含的HLA多肽的量减少，且其中与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞具有降低的免疫原性。

在本发明的一些实施方式中，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞中HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因表达下降。在本发明的另一些实施方式中，所述一种或多种基因包括全部或部分基因缺失。

在本发明中进一步涉及一种产生用于移植的修饰的干细胞的方法，所述方法包括：在培养基中培养修饰的干细胞，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞的HLA多肽减少，其中与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞具有降低的免疫原性。

在本发明的一些实施方式中，所述的方法进一步包括：收集包含靶多核苷酸的干细胞，所述靶核酸与HLA生物合成或转运途径的一种和多种基因相关；将转录激活子样(TAL)效应因子核酸酶导入所述干细胞以产生所述修饰的干细胞；和分离所述修饰的干细胞，其中多种TAL效应因子重复序列与靶多核苷酸结合。

在本发明的另一些实施方式中，与相应的野生型干细胞相比，采用本发明方法制得的所述修饰的干细胞中HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因的表达降低。在本发明的另一些实施方式中，所述一种或多种基因包含全部或部分基因缺失。

在本发明进一步涉及一种治疗方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的修饰的干细胞，其中与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞包含的HLA多肽的量减少，且其中与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞具有降低的免疫原性。

在本发明的一些实施方式中，所述疾病是选自下组中的至少一种：帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症、阿兹海默症、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症等神经退行性疾病，以及脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、肝病、糖尿病、造血功能缺陷癌症等的器官移植及损伤再生。在本发明的另一些实施方式中，所述对象是人。

在本发明的另一些实施方式中，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞中HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因的表达降低。在本发明的另一些实施方式中，所述一种或多种基因包含全部或部分基因缺失。

如本发明前述的修饰的干细胞或方法，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞中累积的HLA多肽的量减少。在本发明的另一些实施方式中，与相应的野生型干细胞相比，所述修饰的干细胞上包含的HLA多肽的量减少。

在本发明的另一些实施方式中，所述修饰的细胞的内源性HLA基因被破坏。在本发明的另一些实施方式中，所述破坏是通过基因定点修饰导入所述修饰的细胞的基因组，或者所述破坏包括同源性破坏HLA基因。在本发明的另一些实施方式中，所述破坏阻碍了功能性HLA RNA在所述修饰的细胞中的表达。在本发明的另一些实施方式中，所述破坏使得HLA基因的至少部分缺失。在本发明的另一些实施方式中，所述HLA多肽包含HLA I型多肽。在本发明的另一些实施方式中，，优选所述HLA多肽包括HLA A型多肽、HLA B型多肽、HLA C型多肽中的至少一种，更优选所述HLA多肽包括β2免疫球蛋白多肽。

在本发明的另一些实施方式中，所述修饰的细胞的内源性TAP1基因被破坏。在本发明的另一些实施方式中，所述破坏是通过基因定点修饰导入所述修饰的细胞的基因组，或者所述破坏包括同源性破坏TAP1基因。在本发明的另一些实施方式中，所述破坏阻碍了功能性TAP1RNA在所述修饰的细胞中的表达。在本发明的另一些实施方式中，所述破坏使得TAP1基因的至少部分或全部缺失。

在本发明的另一些实施方式中，本发明所述的修饰的干细胞或方法中所述修饰的干细胞包括全能干细胞和/或多能干细胞，优选包括胚胎干细胞、诱导的多能干细胞，更优选所述修饰的干细胞包括人胚胎干细胞。

在本发明的另一些实施方式中，本发明所述的修饰的干细胞或方法中的免疫原性降低包括：与用相应的野生型干细胞诱导的炎性应答水平相比，用所述修饰的干细胞诱导炎性应答水平的降低，优选用所述修饰的干细胞诱导的炎性应答水平是用相应的野生型干细胞诱导的炎性应答水平的至少约20%、至少约50%、或基本上少于用相应的野生型干细胞诱导的炎性应答水平，优选与用相应的野生型干细胞诱导的炎性应答水平相比，用所述修饰的干细胞诱导的炎性应答水平至少降低0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20倍。在本发明的另一些实施方式中，在开始注入所述修饰的干细胞后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天测定用所述修饰的干细胞诱导的炎性应答水平。在本发明的另一些实施方式中，所述降低的炎性应答水平包括炎性细胞数量的减少。在本发明的另一些实施方式中，采用炎性细胞浸润分析法来定量所述炎性应答水平。

在本发明的另一些实施方式中，所述降低的免疫原性包括：与相应的野生型干细胞相比，用所述修饰的干细胞诱导细胞因子水平的降低，优选用所述修饰的干细胞诱导的细胞因子水平是用相应的野生型干细胞诱导的细胞因子水平的至少约20%、至少约50%、或者用所述修饰的干细胞诱导的细胞因子水平基本上低于用相应的野生型干细胞诱导的细胞因子水平。在本发明的另一些实施方式中，与用相应的野生型干细胞诱导的细胞因子水平相比，用所述修饰的干细胞诱导的细胞因子水平至少降低0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20倍。在本发明的另一些实施方式中，在开始注入所述修饰的干细胞后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天测定用所述修饰的干细胞诱导的细胞因子水平。在本发明的另一些实施方式中，所述细胞因子水平的降低包括降低干扰素的量。在本发明的另一些实施方式中，采用酶联免疫吸附斑点分析法相对于相应的野生型干细胞定量所述细胞因子水平。

在本发明的另一些实施方式中，所述降低的免疫原性包括：相对于相应的野生型干细胞，用所述修饰的干细胞诱导的外周血细胞增殖水平降低，优选用所述修饰的干细胞诱导的外周血细胞增殖水平是用相应的野生型干细胞诱导的外周血细胞增殖水平的至少约10%、至少约20%、至少约30%，更优选用所述修饰的干细胞诱导的外周血细胞增殖水平基本上低于用相应的野生型干细胞诱导的外周血细胞增殖水平。在本发明的另一些实施方式中，与用相应的野生型干细胞诱导的外周血细胞增殖水平相比，用所述修饰的干细胞诱导的外周血细胞增殖水平至少降低1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20倍。在本发明的另一些实施方式中，在开始孵育所述修饰的干细胞和外周血细胞后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天计算所述水平。在本发明的另一些实施方式中，所述外周血细胞增殖水平包括采用免疫表型分析法定量的外周血单核细胞(PMBC)增殖水平。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。并且，本领域普通技术人员可对本文中所述的各种特征和方面进行有效的组合，这些组合仍然在本申请所要求保护的范围之内。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1：人工设计的人B2M基因的TALEN识别的DNA序列及位点示意图(以SEQ ID NO:4和7中所示的靶序列为例)。

其中，NI对应于A；HD对应于C；NN对应于G；NG对应于T。

图2A：B2M打靶载体TALEN-L86和TALEN-R102的结构图示意图。

图2B：TAP1打靶载体TALEN-1L1和TALEN-1R1的结构图示意图。

图3：用人工设计的人B2M基因的TALEN在293T细胞中的打靶效率。

图4：用人工设计的人B2M基因的TALEN建立的B2M敲除的人多能干细胞系测序比对。

图5：用人工设计的人B2M基因的TALEN(L86&R102)在人多能干细胞中的打靶效率。

图6：用蛋白质印迹法(Western blot)检测B2M蛋白和HLA I类蛋白表达水平。

图7A：用FACS检测正常人多能干细胞及敲除B2M的人多能干细胞的B2M和HLA I类蛋白表达水平。

图7B：用FACS检测正常人多能干细胞及敲除TAP1的人多能干细胞的HLA I类蛋白表达水平。

图8：将正常人多能干细胞及敲除B2M的人多能干细胞注射入Balb/c小鼠胫骨前肌2天后进行苏木精-伊红染色。

图9：正常人多能干细胞及敲除B2M的人多能干细胞刺激人外周血细胞的酶联免疫斑点分析(ELISPOT assay)实验。

图10：正常人多能干细胞及敲除B2M的人多能干细胞刺激人外周血细胞增殖实验。

具体实施方式

本发明的发明人通过长期而深入的研究，利用特定的基因打靶技术克服了人细胞(尤其是干细胞)上基因打靶效率低的问题，对人细胞上的HLA I类分子蛋白相关基因进行了修饰改造(例如敲除人多能干细胞中编码β2-微球蛋白的基因，包括单拷贝敲除和双拷贝敲除)，使所得人细胞表面的HLA I类分子表达下调或者不表达，这种方法得到的人细胞具有低免疫原性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

相关定义

除非另行定义，文中所使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所知晓的意义相同。虽然任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明的实施或测试中，优选的方法和材料如本文所描述。为了本发明的目的，下述术语定义如下。

文中所用的术语“一”是指“一”或“多于一”(即“至少一”)个/种本文的语法对象。例如，“一个/种元素”指一个/种元素或多于一个/种元素。

术语“大约/约”是指总数、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度与参照总数、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度相比变化达30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。

术语“大体上”或“基本上”是指几乎全部或完全，例如，95%、96%、97%、98%、99%或大于某给定的量。

“相当于”是指(a)具有与参照核苷酸序列的全部或者部分大体上相同或互补的核苷酸序列的多核苷酸；或者编码与多肽或者蛋白质中氨基酸序列完全相同的氨基酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参照多肽或者蛋白质大体相同的氨基酸序列的肽或多肽。

“下降”或者“减少”或者“少于”的量通常是“统计意义上显著”或生理意义上显著的量，可包括本文所描述的量或水平下降约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.61.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或50，或更多倍(如100、500、1000倍)(包括这些数值之间的所有的整数和小数点，且大于1，如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

在某些情况下，“下降”或者“减少”包括修饰干细胞引发免疫原性应答的能力。在特定的实施方式中，所述免疫原性应答与非修饰或不同修饰的干细胞相比降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%或至少1000%。在某些实施方式中，所述免疫原性应答降低约50%～200%。

术语“β2微球蛋白”或“β2微球多肽”是指MHC I类基因的表达产物，例如天然人β2微球蛋白(可参见例如Gene ID为567的序列)、与前述表达产物具有至少65%(优选75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)氨基酸序列相同性且具有天然β2微球蛋白功能活性的蛋白质或多肽。蛋白质的“功能活性”是与该蛋白质的生理功能相关的任何活性。例如，天然β2微球蛋白的功能活性包括：与其它MHC I类分子(例如α链)和MHC I类分子(例如聚类分化群1(CD1))相关的活性，与同种异体免疫相关的活性，且包括MHC I类分子的转运。

术语“结合”是指一种分子识别或附着样品或组织中的特定第二种分子，但基本上不能识别或附着该样品中其它非结构相关分子。

术语“编码序列”是指可用于编码某基因的多肽产物的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不用于编码某基因的多肽产物的任何核酸序列。

术语“互补性”及“互补”是指通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。“互补”可以是“部分的”互补，其中只有部分核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，可以是“完全”或“全部”核酸互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率及强度有着显著影响。

靶基因的“缺失”可通过靶向基因的DNA实现，如采用领域内已知的多种基因定点修饰技术(如同源重组或者ZFN技术等)。这使得修饰的细胞产生或聚积比未修饰或者不同修饰的细胞更少的特定蛋白质产物(例如β2微球蛋白)。

术语“核酸内切酶”是指能催化水解(切割)DNA或RNA分子(优选DNA分子)中核酸之间的键的任何野生型或变体酶。核酸内切酶的例子包括但不限于：II型限制性内切酶，如FokI、HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI和AlwI。本文中的核酸内切酶可为转录激活子样(TAL)效应因子核酸内切酶(TALEN)。

关于多核苷酸，术语“外源性的”指的是非天然存在于野生型细胞或生物体内，而通常是通过分子生物学技术导入所述细胞或生物体内的多核苷酸序列。外源多核苷酸的实例包括载体、质粒和/或编码所需蛋白质的人工核酸构建体。

关于多核苷酸，术语“内源性”或“天然”是指可在指定的野生型细胞或者生物体中发现的、天然存在的多核苷酸序列。此外，从第一生物体中分离并通过分子生物学技术转移到第二生物体中的特定多核苷酸序列，相对于所述第二生物体通常被认为是“外源性”多核苷酸。在具体的实施方案中，可通过分子生物学技术将多核苷酸序列“导入”已含有此多核苷酸序列的微生物体中，例如以创建一个或者多个此天然存在的多核苷酸序列的额外拷贝，从而促进所编码蛋白质或多肽的过表达。

如本文所用，术语“功能”和“功能性的”以及相似的用词指生物的、酶的或治疗性的功能。

术语“基因”表示在染色体上占据特定基因座的遗传单位，它包含转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子，5'和3'的非翻译序列)，或由选自上述的元件组成。

“同源性”是指相同氨基酸或者组成型保守取代的百分比。同源性也可通过序列比对程序(如GAP)来确定(可参见例如Deveraux等.,1984,Nucleic AcidsResearch12,387-395，纳入本文作为参考)。通过这种方法，与本文所述的序列具有类似的或基本上不同长度的序列可以通过缺口的插入进行比对，这样的缺口可以通过例如GAP中所用比对算法来确定。

术语“宿主细胞”包括可作为或者已作为本发明任何重组载体或者分离得到的多核苷酸的受体的单个细胞或者细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，这些后代由于自然、随机或者有意的突变和/或变化，可能并不与原始亲本细胞完全相同(形态或者总DNA互补方面)。宿主细胞包括用本发明的重组载体或者多聚核苷酸体内或者体外转染或者感染的细胞。包含了本发明重组载体的宿主细胞被称为重组宿主细胞。

术语“免疫原性”是指引起体内或体外免疫原性应答的能力。免疫原性应答可由免疫原(例如免疫原性多肽和/或细胞，如干细胞)引起。可通过各种测定法来检测和/或定量特定免疫原的免疫原性。所述测定法的例子包括酶联免疫测定法(ELISA)、基于表面等离子共振技术(SPR)的测定法、PBMC免疫表型分析、以及炎性细胞浸润分析。术语“干细胞的免疫原性”是指干细胞引起体内或体外免疫应答的能力。

术语“野生型”是指一种基因或基因产物，其具有该基因或基因产物从其天然存在的来源中分离出来时的特征。野生型基因或基因产物(如多肽)在群体中被观察到的频率最高，并由此被命名为“正常”或“野生型”的基因形式。

术语“分离出的”是指大体上或者从本质上不包含其天然状况中通常伴随的组分。例如，“分离的多核苷酸”，如本文所用，是指从其天然存在状态中侧接的序列中纯化出的多核苷酸，例如，已从DNA片段通常邻接的序列中移除的DNA片段。或者，“分离的肽”或“分离的多肽”和类似的，如本文所用，是指体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，这些分子从其天然的细胞环境中，及从与细胞其它组分的关联中分离和/或纯化出来。“分离的细胞”，如本文所用，是指将细胞从其原始存在的环境(例如生物体、组织、器官、体液、血液等)移出。

关于探针或抗体，术语“标记的”是指通过偶联(即物理连接)可检测物质和所述探针或抗体来直接标记所述探针或抗体。

术语“基因座”是染色体上DNA序列(例如基因)的特定物理定位。

本文所用的“多核苷酸”或者“核酸”代表mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度至少为10个碱基的核苷酸多聚形式，包括核糖核苷酸或者脱氧核苷酸或者这两类核苷酸中任一类的修饰形式。该术语也包含DNA和RNA的单链或者双链形式。

术语“多核苷酸变体”和“变体”和类似术语是指显示与参照多核苷酸序列实质性序列相同性的多核苷酸，或在下文中被定义的严格条件下，与参照序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括与参照多核苷酸具有至少一个核苷酸插入、缺失或取代的区别的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中已有一个或多个核苷酸的添加或缺失或被不同的核苷酸所替换的多核苷酸。在这方面，本领域中很容易理解：可对参照多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物功能或活性，或与参照多核苷酸相比具有提高的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括，例如，与本文所述的参照多核苷酸序列具有至少50%(至少51%～至少99%，以及其间的所有整数百分比，例如，90%、95%或98%)序列相同性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括编码这些酶的天然存在等位变体和直向同源物。

术语“严格条件”指某序列(如探针、变体)能与其靶序列杂交，而不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖的，在不同环境中不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。在确定的离子强度和pH条件下，严格条件一般选择比特定序列的解链温度(Tm)低约15℃。此Tm是(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)与靶序列互补的探针有50%与该靶序列杂交达到平衡时的温度。(由于在Tm时靶序列通常过量存在，平衡时只有50%的探针被占据)。通常严格条件是盐浓度低于约1.0M钠离子，典型的是约0.01～1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0～8.3，短探针(10～15个核苷酸)的温度至少约30℃，长探针(50全核苷酸以上)的温度至少约60℃。也可通过加入去稳定试剂如甲酰胺来实现严格条件。对于选择性和特异性杂交，阳性信号通常应是背景的至少二倍，优选背景杂交的10倍。示范性严格条件如下：50%甲酰胺、5×SSC和1%SDS，42℃培育，或5×SSC、1%SDS，65℃培育，65℃用0.2×SSC和0.1%SDS洗涤。对于PCR，通常在温度约36℃作低严格性扩增，虽然退火温度要根据引物长度在约32～48℃之间变化。对于高严格PCR扩增，通常温度为约62℃，虽然高严格退火温度范围为约50℃至约65℃，这取决于引物长度和特异性。高和低严格性扩增的典型循环条件包括：90～95℃变性30～120秒，退火持续30～120秒，约72℃延伸1～2分钟。低和高严谨性扩增反应和方法和指南可参见例如：Innis等，(1990)PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)，学术出版社(Academic Press)，纽约。

术语“核酸酶”包括核酸外切酶和核酸内切酶。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在此可以互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是人工合成的非天然存在的氨基酸(如相应的天然存在氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物。

术语多肽“变体”指的是通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代而不同于参照多肽序列的多肽。在某些实施方式中，多肽变体通过一个或多个保守或非保守取代区别于参照多肽。在某些实施方式中，多肽变体包含保守取代，就该点而言，本领域中很容易理解可将一些氨基酸改变为具有大致类似特性的另一些氨基酸而不改变多肽的天然活性。多肽变体也包括一个或多个氨基酸被添加或缺失，或被不同的氨基酸残基替代的多肽。

术语“参照序列”通常指的是用于与另一个序列比较的核酸编码序列或者氨基酸序列。参照序列包括本文描述的所有的多肽和多核苷酸序列，包括用名称描述的序列(如，β2微球蛋白)以及序列表中描述的序列。

在此所用的术语“序列相同性”或者例如包括“与……具有50%序列相同性”，指得是通过窗口比对，序列在逐个核苷酸基础或逐个氨基酸基础上是相同的。因此，“序列相同性百分比”可通过用比较窗口比较两条最佳匹配序列来计算，从而确定在两条序列中存在相同核酸碱基(如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(如丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸)的位置的数目，以得到匹配位置的数目。将匹配位置的数目除以在比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，将结果乘以100，得到序列相同性百分数。包括与文本所述任何参照序列(参见例如序列表)具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列相同性的核苷酸和多肽通常多肽变体保持参照多肽的至少一种生物活性。

用于描述两个或两个以上的多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列相同性”、“序列相同性的百分比”和“实质性相同”。“参照序列”包含的核苷酸和氨基酸残基的长度至少为12个，但往往是15至18个，并且通常至少25个单体单元。由于两种多核苷酸均可以包括：(1)这两种多核苷酸之间相似的序列(即只是全长多核苷酸序列的一部分)，和(2)这两种多核苷酸之间有区别的序列，两种(或更多种)多核苷酸之间序列的比较通常是通过在“比较窗口”内比较这两种多核苷酸的序列来进行，从而识别和比较局部区域的序列相似性。“比较窗口”是指至少6个连续的位置的概念性片段，通常约50至约100个，更通常约100至约150个连续的位置，在这些位置中，当序列和参照序列最佳匹配之后，该序列与具有相同数目连续位置的参照序列进行比较。比较窗口与参照序列(其中不包括添加或缺失)相比，可包括约20%或更少的添加或缺失(即，缺口)，作为两条序列的最佳序列比对。最佳序列比对可以由计算机执行算法(威斯康星遗传软件包7.0版(Wisconsin Genetics Software Package Release7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，575科学驱动麦迪逊，WI，美国(Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA))实现，或通过检测和任何这些选择的方法产生的最佳比对(即在比较窗口得到最高同源百分比)来确定。也可以参考BLAST程序族，例如Altschul等人，1997年，Nucl.Acids Res.25:3389公开的程序。在Altschul等人的“分子生物学现行操作步骤”(“CurrentProtocols in Molecular Biology”),John Wiley & Sons Inc,1994-1998,第15章的19.3单元中，对序列分析有详细的讨论。

术语“载体”是指其中可插入或克隆入多核苷酸的多核苷酸分子，优选为DNA分子，所述分子从例如质粒、噬菌体、酵母或病毒中衍生的。载体优选地包含一个或多个独特的限制性内切酶位点，并且可以在限定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织)中自主复制，或者整合至宿主基因组使得克隆序列可再生。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，这种复制独立于染色体复制，例如，线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可以包含任何装置用于确保自我复制。或者当导入宿主细胞时，该载体可以整合到基因组并随所整合的染色体一起复制。这种载体可含有特定的序列，允许重组发生在宿主染色体中的特定的、所期望的部位。载体系统可以包括单个载体或质粒，两个或更多的载体或质粒，它们共同包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA，或转座子。通常，载体的选择将取决于载体与将引入该载体的宿主细胞之间的相容性。在本情况下，优选地，载体优选在干细胞中能够行使功能，如质粒。该载体可以包括报告基因，如绿色荧光蛋白(GFP)，其既可以在融合到一个或多个编码多肽架构中，也可以独立表达。该载体还可以包括选择标记物，如抗生素抗性基因，其可用于选择合适的转化体。

术语“统计学显著的”指的是结果并不是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域任何已知的方法来确定。通常用p值来衡量显著性，它表示零假设为真时，所观察事件可能发生的频率或概率。如果所得p值小于显著性水平，则推翻零假设。在单事件中，显著性水平定义为p值小于或等于0.05。

术语“TALEN”是指包含转录激活子样(TAL)效应因子结合区域和核酸内切酶区域的蛋白质，这两个区域的融合形成“单体TALEN”。某些单体TALEN本身具有功能，而其它则需要与另一单体TALEN二聚化。当两个单体TALEN相同时，二聚化可产生同二聚化TALEN，而当两个单体TALEN不同时，二聚化可产生异二聚化TALEN。例如当两个单体TALEN的RVD数不同和/或当至少一种RVD的内容(即氨基酸序列)不同时，这两个单体TALEN不同。术语“TAL效应因子-DNA修饰酶”是指包含转录激活子样效应因子结合区域和DNA修饰酶区域的蛋白质。

术语“样品”用于本文时具有其最广义的含义。包含多核苷酸、肽、抗体等等的样品可包括体液、细胞制备物或细胞生长的培养基的可溶性部分、基因组DNA、RNA或cDNA、细胞、组织、皮肤、毛发等等。样品的例子包括唾液、血清、活检样品、血液、尿液和血浆。

术语“患者”、“对象”和“个体”可互换使用，均是指待处理和/或由其获得生物样品的哺乳动物(例如人)对象。

术语“治疗有效量”是指可有效获得所需治疗反应的本文所述组合物的量，例如足以降低移植物免疫排斥或延长术后存活时间的量。特定的安全有效量或治疗有效量可因以下因素而改变：待治疗的具体病状、患者的身体状况、待治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗的持续时间、同步治疗的性质(如有)、以及所用的特定剂型和化合物及其衍生物的结构。

术语“治疗”是指将治疗剂应用于或给予患者、或将治疗剂应用于或给予分离自患者的组织或细胞系，所述患者患有疾病、具有疾病症状或具有易患病的体质，从而达到治愈、复原、缓和、缓解、改变、矫正、改善、改进或影响所述疾病、疾病症状或易患病的体质。在本发明中，所用的术语“治疗”包括预防性治疗。例如，对未鉴别出疾病或紊乱症状或临床相关表现的患者的“治疗”是预防性治疗，而对鉴别出疾病或紊乱症状或临床相关表现的患者的临床、治愈性或姑息“治疗”通常不构成预防性治疗。

术语“分化诱导”是指用特定的方法诱导干细胞分化。常用的方法包括拟胚体形成法、生长因子诱导法、小分子化合物诱导的分化、转录因子诱导的分化、或其他方法诱导的分化。转录因子表达调控诱导法等。例如用Activin A，Wnt3a等生长因子诱导人胚胎干细胞向胰腺细胞分化(D'Amour,K.A.,(2006).NatBiotechnol24,1392-1401.)等。

干细胞和多能干细胞

术语“干细胞”(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stemcell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)。

如本文所用，术语“多能干细胞”(包括pluripotent stem cell，PSC)和Multipotent Stem Cell，MSC)是指具有分化出多种细胞组织的潜能的干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPS细胞)；也包括发育潜能受到一定的限制，失去了发育成完整个体的能力的一类干细胞，例如造血干细胞。

多能干细胞，具有在适当条件下产生不同类型后代细胞的能力特征，按照本领域所接受的标准试验，如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或在组织培养中形成所有三种胚层的能力可鉴定此细胞。

可利用自愿捐献的生殖细胞、体外受精(例如体外受精时多余的配子或囊胚)、体细胞核移植(例如通过体细胞核移植技术所获得的囊胚和单性分裂囊胚)或细胞重编程获得多能干细胞。或者，可从成体骨髓和各种组织器官获得多能干细胞。

可用于制备本发明低免疫原性多能干细胞的多能干细胞原料可包括但不限于：已建立的胚胎干细胞、生殖细胞起源的干细胞、通过体细胞核移植(SCNT)所获得的干细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)，优选已建立的胚胎干细胞(如X1细胞系等)、诱导多能干细胞。

本文所用的“胚胎干细胞”(ESC)，是当受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团(inner cell mass)的细胞在体外培养而成、能够无限增殖、自我更新且具有发育全能性的一种细胞。所述细胞不具备发育成完整个体的潜能，只能分化成人体其它成体细胞类型，从该角度而言，其本质上与其它类型的成体干细胞无异，仅仅是比其它成体干细胞具有更多的潜能而已。

除非另有明确要求，该术语包括原代组织和建立的具有ES细胞表型特征的细胞系和此类细胞系的后代，该后代仍能产生具有3个胚层各自表型性状的后代细胞。优选人ES细胞(hESC)。Thomson等.(Science282:1145,1998;美国专利6,200,806)描述了原型“人胚胎干细胞”(hES细胞)，包括其中所述建立的细胞系。也可采用Thomson等(美国专利5,483,780，Science282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133，1998)和Reubinoff等(Nature Biotech.18:399，2000)所述的技术从人胚泡制备人胚胎干(hES)细胞。

关于组织培养和胚胎干细胞，可参考例如：“畸胎瘤和胚胎干细胞：实施方法(Teratocarcinomas and embryonic stem cells:A practicalapproach)”(E.J.Robertson编,LPL Press Ltd，1987)；“小鼠开发技术指南(Guide toTechniques in Mouse Development)”(P.M.Wasserman等编，Academic Press，1993)；“胚胎干细胞的体外分化(Embryonic Stem Cell Differentiation inVitro)”(M.V.Wiles，Meth.Engymol.225:900，1993)；“胚胎干细胞的特性和应用：在人类生物和基因治疗中的应用前景(Properties and uses of Embryonic StemCells:Prospects for Application to Humcn.Biology and Gene Therapy)”(P.D.Rathjen等，Repord.Fortil.Dev.10:31，1998)。

本发明的修饰的细胞及其制备

如本文所用，术语“修饰”或“修饰的”是指通过遗传工程操作，使得原料细胞细胞表面的HLA I类分子蛋白或多肽缺失或表达下调，从而降低所得细胞的免疫原性/排斥性。所述修饰可使得人细胞中HLA I类分子生物合成或转运途径中的一种或多种基因(例如B2M基因)表达缺失或下降，例如使所述基因发生全部或部分基因缺失。

如本文所用，术语“本发明的人细胞”、“修饰的人细胞”、“具有低免疫原性的人细胞”、“HLA减少的人细胞”等可互换使用，均是指通过本发明的基因工程方法操作使得人细胞中的HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因表达下降(例如使得B2M基因缺失或表达下调，如利用TALEN方法双拷贝或单拷贝敲除B2M)，从而产生的免疫原性低于正常人细胞的一类新型细胞。

在某些方面，可通过如下方式使得靶基因称为“非功能性”：通过在核苷酸水平的改变或突变改变所编码多肽的氨基酸序列以表达修饰的多肽，所述修饰多肽就其活性而言功能降低或活性降低(例如引入HLA I类分子的转运)，无论是通过修饰多肽的活性位点、其细胞内定位、其稳定性，或对于本领域技术人员显而易见的其它功能特性。对此涉及HLA表达的多肽编码序列的的这类修饰可以通过本领域中已知的技术实现，如对给定细胞进行基因组水平的定向诱变和/或天然选择(即定向进化)。

制备本发明的修饰的人细胞的方法，可包括如下主要步骤：

A)提供原料人细胞，优选人干细胞，更优选人多能干细胞；

B)对所述原料人细胞进行修饰，以使其HLA I类分子生物合成或转运途径中的一种或多种基因表达下降；

C)收集所述修饰的人细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：

A')提供人细胞，优选人干细胞，更优选人多能干细胞，更优选人胚胎干细胞；

B')敲除所述人多能干细胞中的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)蛋白或多肽的组份蛋白的B2M基因或使得该基因的表达下调；

C')从步骤B')经基因工程化操作的细胞中选择细胞表面HLA I类分子表达缺失或下调的多能干细胞系，从而获得所述人多能干细胞。

在本发明的一些实施方式中，可采用包含如下主要步骤的方法：

A'')提供原料人细胞，优选人干细胞，更优选人多能干细胞；

B'')构建打靶载体，所打靶的目标为HLA I类分子组份蛋白的B2M基因；

C'')用所述打靶载体转染所述人多能干细胞，通过对单细胞起始的克隆进行传代培养，得到因B2M基因被敲除而使得细胞表面HLA I类分子表达缺失或下调的人多能干细胞系；

D'')任选地，检验步骤C'')中所得多能干细胞的免疫原性，以确定所述多能干细胞与正常多能干细胞相比具有降低的免疫原性。

根据本发明所述的方法，所述步骤B'')中的打靶载体可为TALEN打靶载体。可根据如下原则初步选择TALEN识别序列：(1)第0位碱基为T(识别序列第一位之前的碱基为第0位)；(2)最后一位碱基为T；(3)识别序列长度在13-19之间；(4)二个识别序列之间的间隔序列(Spacer)长度控制在13-21之间(12也可，但效率可能较低)。可用于本发明的TALEN靶序列包括但不限于：SEQ ID NOs:4-17中所示的序列。可将构建的TALEN的靶点识别模块克隆入表达载体，优选真核表达载体，例如但不限于：pCDNA3.0。

近年发展很快的序列特异性核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般的序列特异性核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。其作用原理是：首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域；然后由非特异性核酸内切酶切断双链DNA，从而造成DNA双链断裂(double-strand break，DSB)；由此引入的DSB可激活DNA自我修复，从而可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。

转录激活子样效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like EffectorNucleases，TALEN)是近期发展很快的一种序列特异性核酸酶，其作用原理是：由特异性识别DNA的串联“蛋白模块”识别靶DNA序列，并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fok1的两个单聚体定位到一起；DNA切割蛋白形成双聚体时，可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB。

Rudolf Jaenisch小组验证了TALEN在人胚胎干细胞和人iPS细胞中的打靶效果(Rudolf Jaenisch等，Genetic Engineering of Human Pluripotent Cells Using TALENucleases(“采用TALE核酸酶对人多能干细胞进行的基因工程化操作”)；NatureBiotechnology，第29卷，第8期：731-734，2011年8月)。他们通过比较在五个位点利用TALEN的打靶效果和之前在相同位置利用锌指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)的打靶效果，得出五组TALEN在打靶效率和精确度上都与从Sangamo BioSciences公司购买的ZFN相似，进一步验证了TALEN是非常好的基因组编辑工具。

然而，尽管TALEN技术是很好的基因修饰工具，并且在不断改进和成熟中，但并非根据原理设计的每一对TALENs都有基因修饰活性，也需要通过尝试众多不同的TALENs组合，才能找到有活性的TALENs。在本发明中，发明人从众多Talens中筛选出了具有活性的TALENs，并优选其中效率最高的TALENs进行了后续实验。

根据本发明所述的方法，所述步骤C')的传代培养是将多能干细胞克隆按1:1～20，优选1:4～10，更优选1:6～8的比例传代至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。

根据本发明所述的方法，所述步骤C'')中细胞表面HLA I类分子表达缺失或下调可采用选自下组的一种或多种方法和/或指标检测，当然本领域普通技术人员也可采用本领域中已知的其它方法或结合选自下组的方法对此进行检测：

1)测序检验β2-微球蛋白基因缺失；

2)用蛋白质印迹法检测β2-微球蛋白蛋白在多能干细胞内表达缺失；和

3)采用流式细胞技术检测β2-微球蛋白、HLA I类分子蛋白在人多能干细胞表面表达缺失。

根据本发明所述的方法，检验所得干细胞的免疫原性可采用本领域普通技术人员已知的方法进行，例如对上述细胞及普通干细胞引起的小鼠体内炎症反应强度进行检测。小鼠体内炎症反应强度检测可包括以下步骤：

1)将本发明的多能干细胞和普通人干细胞分别注射入Balb/c小鼠肌肉内；

2)一段时间后取出注射过细胞的小鼠肌肉进行切片；

3)对上述切片进行HE染色，统计炎症细胞数量。

由此，本发明中提供了一种主要组织相容性抗原缺失或下调的人干细胞及其制备方法，它具有低免疫原性。

移植用细胞及其制备

在获得了本发明的修饰的干细胞及其制备方法的基础上，本发明中还进一步提供了免疫原性降低的移植用细胞及其制备方法。

所述移植用细胞可直接为本发明的修饰的人细胞或可通过诱导本发明的修饰的干细胞分化获得，例如所述分化的诱导可为定向分化诱导。分化诱导的方法是本领域中熟知的，例如可参考拟胚体形成、生长因子诱导的分化、小分子化合物诱导的分化、转录因子诱导的分化、或其他方法诱导的分化。

本发明的移植用细胞可包括：胰腺细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、心肌细胞、皮肤细胞等细胞；可用于例如：胰腺移植、肝细胞移植、肾脏细胞移植、心肌细胞移植、皮肤细胞移植等细胞移植。

与相应的野生型细胞相比，所述移植用细胞与移植相关的免疫原性降低，优选所述免疫原性的降低在统计学上具有显著差异(P<0.05)，更优选具有极显著差异(P<0.001)。

本发明修饰的人细胞以及移植用细胞的应用

如前所述，本发明的修饰的人细胞以及移植用细胞具有低免疫原性。因此，其可成为一种新型的、具有低免疫排斥反应的移植供体的来源，将为移植治疗提供一种崭新的材料和方法。本发明的修饰的细胞可用于组织器官再生、修复、和疾病治疗等方面(例如治疗细胞功能障碍或组织破坏)，对干细胞全能性的机理研究以及器官移植、药物筛选、基因治疗等临床应用研究具有重要价值。

本发明的细胞可用于如下用途，包括但不限于：帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症、阿兹海默症、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症等神经退行性疾病，以及脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、肝病、糖尿病、造血功能缺陷癌症等的器官移植及损伤再生。

本发明细胞使用的通用原则可参见例如“细胞治疗：干细胞移植、基因治疗和细胞免疫疗法(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation，Gene Therapy andCellular Immunotherapy)”G.Morstyn & W.Sheridan编，Cambridge UniversityPress，1996和“造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)”E.D.Ball，JLister & P.Law，Churchill Livingstone，2000等。

可提供包含本发明干细胞或移植用细胞的试剂盒或组合物以用于进一步的研究和应用。例如，本发明的组合物中可包含：(a)本发明的修饰的人细胞或移植用细胞；(b)药学上或生理学上可接受的载体或培养基。本发明的试剂盒中可包含：(a')本发明的修饰的人细胞或移植用细胞；(b')药学上或生理学上可接受的载体或培养基；(c')任选的一个或多个容器；(d')任选的一个或多个适于给予本发明细胞的装置；(e')任选的使用说明书，等等。

本发明的主要优点

本发明获得了如下的主要技术进步：

1.克服了本领域中的技术难点，首次成功敲除了人细胞中的β2-微球蛋白基因；

2.通过遗传工程学修饰改造获得了细胞表面HLA表达下调或甚至不表达的人细胞，该细胞具有低免疫原性，有望成为新型的可降低或避免免疫排斥反应的移植供体，为器官移植提供了新材料和方法。

由于本文的公开内容且基于本领域中的常识，本领域的技术人员也可了解到本发明的其它优点。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染等分子生物学技术以及细胞培养、检测技术、免疫学方法等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术(例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；《蛋白质方法》(Protein Methods)(Bollag等，John Wiley&Sons1996)；《免疫方法手册》(Immunology Methods Manual)(I.Lefkovits编，Academic Press，1997)和《细胞和组织培养：生物技术中的试验方法》(Cell and Tissue Cluture:LaboratoryProcedures in Biotechnology)(Doyle & Griffiths，John Wiley & Sons1998))或按照供应商所建议的条件)；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.实施例中所用的细胞及其来源

1.人多能干细胞

本实验的起始原料为“已建立的未分化人胚胎干(hES)细胞系”X1(参见Wu Z等，Derivation and characterization of human embryonic stem cell lines from theChinese population(“中国人群来源的人胚胎干细胞系的衍生和表征”)，J GenetGenomics.2011年1月，38(1):13-20)。

本申请人已于2013年3月12日，将该人胚胎干(hES)细胞系提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)保藏，其保藏号为CGMCC7353。

并且，本申请人承诺从申请日起20年内向公众发放该生物材料，前提为①签订生物材料转移协议；②仅限于合法的、非商业目的使用。

2.小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞

MEF细胞可从众多商业公司购买，例如本发明中的MEF细胞购自Millipore公司。

II.实施例中所用的培养基和细胞培养产品

1.用于人多能干细胞的培养基

具体组成为：79%的D-MEM/F12培养液(购自Invitrogen，10330)；20%的Knockout SR(购自Invitrogen，10828)；1mM L-谷氨酸(购自Invitrogen，25030)；1%的非必需氨基酸(购自Invitrogen，11140050)；0.1mM的β-巯基乙醇(购自Sigma，M7522)；10μg的bFGF(购自Invitrogen，13256-029)。

2.用于小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的培养基

具体组成为：89%的D-MEM培养液(购自Invitrogen，11965)；10%的胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03)；1mM的L-谷氨酸(购自Invitrogen，25030)；1%的非必需氨基酸(购自Invitrogen，11140050)。

3.实施例中所用细胞培养产品

以下实施例中，通用的细胞培养产品均购自Invitrogen公司。

III.实施例中所用的抗体

HLA-ABC、β2m：购自BD(用于细胞流式检测实验)；

HLA-ABC、β2m：购自Santa Cruz(用于western检测实验)

实施例1.TALEN靶序列的设计

1.从NCBI上下载人β2-微球蛋白基因组序列(Gene ID:567)及TAP1基因组序列(Gene ID:100507463)。

2.设计引物，PCR扩增基因组上打靶位点片段并测序，其中，PCR引物及测序引物见表1-1和表1-2：

表1-1

表1-2

3.设计TALEN识别序列(靶序列)：

根据测序得到的序列，并依照以下原则确定TALEN识别序列：

(1)第0位碱基为T(识别序列第一位之前的碱基为第0位)；

(2)最后一位碱基为T；

(3)识别序列长度在13-19之间；

(4)二个识别序列之间的间隔序列(Spacer)长度控制在13-21之间(12也可，但效率可能较低)；

设计得到的B2M靶序列位置如图1所示，B2M及TAP1基因靶序列的具体序列分别见表2-1和表2-2。

表2-1

TALEN名称	SEQ ID NO.	靶序列
			Human-B2M-TAL-L86	4	CCAAAGATTCAGGT
Human-B2M-TAL-L87	5	CCAAAGATTCAGGTT
			Human-B2M-TAL-L88	6	CCAAAGATTCAGGTTT
Human-B2M-TAL-R102	7	GACTTTCCATTCTCTGCT
			Human-B2M-TAL-R105	8	GACTTTCCATTCTCT
Human-B2M-TAL-L164	9	TCATCCATCCGACAT
			Hunan-B2M-TAL-L165	10	TTCATCCATCCGACATT
Human-B2M-TAL-R181	11	TCTCTCTCCATTCTT
			Human-B2M-TAL-R182	12	CAATTCTCTCTCCATTCT
Human-B2M-TAL-L243	13	CAGCAAGGACTGGTCT
			Human-B2M-TAL-L244	14	CAGCAAGGACTGGTCTT
Human-B2M-TAL-L245	15	CAGCAAGGACTGGTCTTT
			Human-B2M-TAL-R260	16	GGGGGTGAATTCAGTGT
Human-B2M-TAL-R262	17	GGGGGTGAATTCAGT

表2-2

TALEN名称	SEQ ID NO.	靶序列
			Human-TAP1-TAL-1L1	20	AAATGGCTGAGCT
Human-TAP1-TAL-1L2	21	AAATGGCTGAGCTT
			Human-TAP1-TAL-1L3	22	AAATGGCTGAGCTTCT
Human-TAP1-TAL-1R1	23	CCCAGGAACAGGCTGAT
			Human-TAP1-TAL-1R2	24	CCCAGGAACAGGCT

将上表中的TALEN靶序列的识别序列构建到载体上成为质粒，用于后续实验。图2A和2B中示例性地显示了本发明中所构建的B2M载体TALEN-L86和TALEN-R102的结构图、以及TAP1载体TALEN-1L1和TALEN-1R1的结构图，其余载体可基于本领域常规方法和表1中所示序列相应构建。

实施例2.用TALENs质粒转染293T细胞验证打靶效率

1.将培养293T细胞的T25瓶中的培养基吸出，用PBS洗一遍，加入1ml0.25%的胰蛋白酶，来回晃动，使其均匀覆盖瓶底，置于37℃、5%CO₂培养箱中5min。

2.消化完成后，使用2ml含10%FBS的DMEM培养液终止反应，将细胞吹打成单细胞后转移至离心管中，计数。

3.取30万个细胞置于24孔板的一个孔中，每孔加入0.5ml新鲜的培养基。

4.24h后进行转染。

5.将构建好的B2M的TALEN质粒按表3两两配对组合转染细胞，共16种组合。

表3

L86&R102	L87&R105	L165&R181	L244&R260
				L87&R102	L88&R105	L165&R182	L244&R262
L88&R102	L164&R181	L243&R260	L245&R260
				L86&R105	L164&R182	L243&R262	L245&R262

根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液：

体系中各成分的比例：

TALEN-L：TALEN-R：Lv-EF1a-EGFP-IRES-PURO=5:5:2

总DNA：opti MEM=2μg：100μl

总DNA：Fugene=2μg：5μl

6.转染后第二天，将培养液换成含1μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养液，置于5%CO₂培养箱中37℃培养三天，每天换同样的培养液。

7.用0.25%的胰蛋白酶消化上述药杀结束后的293T细胞，并将细胞悬液吸入15ml离心管中，13200rpm/min离心5min，弃去上清液。

8.用直接PCR Kit(thermo货号：F-140)抽提基因组，并PCR扩增打靶区域DNA片段。引物为表1中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。PCR体系如下(50μl)：

PCR程序：95℃2min；95℃5s，60℃5s，72℃20s，35个循环；72℃延长10min。

9.将上述基因组的PCR片段加A后连入PMD18-T载体(购自TAKARA公司)中，将其连接产物转化至感受态细菌(DH5a)中，挑出单克隆并送测序。根据测序结果计算出每对TALENs的打靶效率。

加A体系为：

结果显示，16对B2M的TALENs中有9对测出效率，其余几对未检测到打靶成功的克隆(如图3所示)。该结果表明需要经过筛选验证才能得到有活性且高效率的TALENs。

实施例3.TANLENs质粒转染人多能干细胞

1.在6孔板每个孔中加入100μl基质胶，来回晃动，使之铺满整个孔的底部，铺好后置于37℃、5%CO₂培养箱中30min。

2.将培养人多能干细胞细胞的T25瓶中的培养基吸出，PBS洗一遍，加入4ml IV型胶原酶，来回晃动，使其均匀覆盖瓶底，置于37℃、5%CO₂培养箱中30min。

3.消化完成后使用人多能干细胞培养液终止反应，吹打成小块后转移至离心管中，1200rpm离心5min。

4.去除上清后，使用该培养基重悬细胞，取50万个细胞置于已铺好基质胶的6孔板中，加入2ml新鲜的培养基。

5.24h后进行转染。

6.将测好效率的几对B2M的TALENs质粒按表4两两配对组合转染细胞(结果如图3所示)，共9种组合。将构建好的TAP1的质粒按表5两两配对组合转染细胞。

表4

L86&R102	L164&R182	L164&R181
			L87&R102	L165&R181	L244&R262
L88&R102	L165&R182	L243&R260

表5

1L1&1R1	1L1&1R2	1L2&1R1
			1L2&1R2	1L3&1R1	1L3&1R2

根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液：

体系中各成分的比例如下：

TALEN-L：TALEN-R：Lv-EF1a-EGFP-IRES-PURO=5:5:2

总DNA：opti MEM=2μg：100μl

总DNA：Fugene=2μg：5μl

7.转染后第二天，即可在荧光显微镜下观察EGFP荧光亮度以及转染效率。若转染成功，则将6孔中的培养基吸除，加入含1μg/ml嘌呤霉素的2ml新鲜培养基。

8.置于5%CO₂培养箱中37℃培养三天，每天换2ml1μg/ml嘌呤霉素的新鲜的培养基。

9.第四天开始将培养液换为不含嘌呤霉素的培养基，置于5%CO₂培养箱中37℃培养至细胞量足够传代培养之用。

实施例4.细胞打靶鉴定

1.提前2～3天铺好CF-1滋养层细胞于6孔板中。

2.向实例3中药杀后的人多能干细胞中加入2ml中性蛋白酶，来回晃匀。37℃放置30min，用枪吹打使所有细胞都被消化下来。将上述悬液吸入15ml离心管中，计数。

3.将CF-1滋养层细胞中的培养基换成人多能干细胞培养基，按照5000个细胞/孔的密度，将步骤2中消化并完成计数的人多能干细胞，种入CF-1滋养层细胞之上。

4.置于5%CO₂培养箱中37℃培养14天左右，挑出单个细胞克隆于孔板中单独培养。

5.单细胞克隆培养约7天左右，消化细胞，用直接PCR试剂盒(thermo货号：F-140)抽提基因组，并PCR扩增打靶区域DNA片段。引物为表1中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。PCR体系如下所示(50μl)：

PCR程序：95℃2min；95℃5s，60℃5s，72℃20s，35个循环；72℃延长10min

6.鉴定打靶细胞的基因型。将上述扩增后的打靶区域PCR片段加碱基A后，连入PMD18-T载体中，单克隆化DNA片段，送测序后得到B2M基因打靶位点的基因型(如图4)，并计算打靶效率(如图5)。

加A体系为：

然后混匀，置于72℃20min。

结果显示已得到了几株B2M双拷贝敲除(^－/－)和B2M单拷贝敲除(^＋/－)的人多能干细胞系。该结果表明用TANLENs技术对人的B2M基因进行基因敲除是可行的，且有着较高的效率。

实施例5.B2M表达鉴定

1.用蛋白质印迹法检测蛋白水平表达

1)用冰冷的PBS洗涤细胞3次，加细胞裂解液，在冰上孵育20min。

2)将细胞刮下，4℃，12000rpm/min离心10min后吸出上清液体。

3)取40μg细胞总蛋白与加样缓冲液混匀，100℃，5min热变性。

4)于15%SDS-PAGE胶中上样并电泳，转移至PVDF膜上。

5)封闭液室温封闭1h。

6)将小鼠抗人B2M的单克隆抗体以1:1000稀释于抗体稀释液中，并与PVDF膜共孵育，4℃过夜。

7)TBST洗膜，用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(1:2000稀释)，室温1h。

8)洗膜后，ECL发光自显影，洗片显带。

9)同一张膜洗脱后，用小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1:800稀释)和辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗(1:2000稀释)重新孵育，发光自显影，洗片显带作为内参。

结果如图6所示。

2.流式细胞分析蛋白在细胞表面表达水平

1)将细胞接种于基质胶孵育过的6孔板，每孔5×10⁵个细胞。

2)细胞贴壁后，对照组正常换液培养，实验组加500U/ml的IFN-γ处理24h。

3)胰酶消化细胞，1200rpm/min离心5min，收集细胞置于1.5ml离心管中。用4℃预冷的PBS洗两次。

4)用50μl PBS重新悬浮细胞，加10μl抗人B2M-PE流式抗体，37℃孵育20min。

5)1200rpm/min离心5min，去上清，并将细胞过细胞筛。最后将细胞转移至流式管中，用PBS将细胞悬液体积定至500μL，进行流式细胞仪分析，结果如图7A所示。

所示结果显示：在细胞内，与野生型人多能干细胞相比，B2M^＋/－的人多能干细胞β2m蛋白的表达水平明显下降，B2M^－/－的人多能干细胞检测不到β2m蛋白的表达；在细胞表面，与野生型人多能干细胞相比，B2M^＋/－的人多能干细胞表达β2m蛋白的水平有所下降，B2M^－/－的人多能干细胞几乎不表达β2m蛋白。该结果表明，我们正确地得到了B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞系，并且这些细胞表达B2M基因产物的水平下降或者不表达B2M基因产物。

实施例6.HLA I类蛋白表达水平鉴定

1.用蛋白质印迹法检测蛋白表达水平

1)用冰冷的PBS洗涤细胞3次，加细胞裂解液，在冰上孵育20min。

2)将细胞刮下，4℃，12000rpm/min离心10min后吸出上清液体。

3)取40μg细胞总蛋白与加样缓冲液混匀，100℃，5min热变性。

4)于15%SDS-PAGE胶中上样并电泳，转移至PVDF膜上。

5)封闭液室温封闭1h。

6)将小鼠抗人HLA I类分子的单克隆抗体以1:1000稀释于抗体稀释液中，并与PVDF膜共孵育，4℃过夜。

7)TBST洗膜，用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(1:2000稀释)，室温1h。

8)洗膜后，ECL发光自显影，洗片显带。

9)同一张膜洗脱后，用小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1:800稀释)和辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗(1:2000稀释)重新孵育，发光自显影，洗片显带作为内参。

结果如图6所示。

2.采用流式细胞法分析蛋白质在细胞表面的表达水平

1)将细胞接种于基质胶孵育过的6孔板，每孔5×10⁵个细胞。

2)细胞贴壁后，对照组正常换液培养，实验组加500U/ml的IFN-γ处理24h。

3)胰酶消化细胞，1200rpm/min离心5min，收集细胞置于1.5ml离心管中。4℃预冷的PBS洗两次。

4)用50μl PBS重新悬浮细胞，加5μul抗人HLA-A,B,C-PE-CY7流式抗体，37℃孵育20min。

5)1200rpm/min离心5min，去上清，并将细胞过细胞筛。最后将细胞转移至流式管中，用PBS将细胞悬液体积定至500μl，进行流式细胞仪分析，结果如图7A所示。

所示结果显示，在细胞内，与野生型人多能干细胞相比，MHC I类分子HLAI类分子在细胞内部的表达不受B2M基因敲除的影响；在细胞表面，与野生型人多能干细胞相比，B2M^＋/－的人多能干细胞表达MHC I类分子HLA I类分子蛋白的水平有所下降，B2M^-/－的人多能干细胞几乎不表达MHC I类分子HLA I类分子蛋白。该结果表明，通过对B2M基因的敲除，我们得到了细胞表面MHC I类蛋白表达量下调(B2M^＋/－)的人多能干细胞系和表达缺失(B2M^－/－)的人多能干细胞系。

TAP1敲除的人多能干细胞的HLA I类分子的表达也有降低(如图7B)。

实施例7.细胞在体液免疫反应中的检测

1.实验动物

SPF级雄性Balb/c小鼠，5～6周龄，购自斯莱克公司。

2.细胞体内注射

给予Balb/c小鼠一周的适应时间后，将其分为3组，进行胫骨前肌肌肉注射。

每组分别注射：1)正常人多能干细胞，体积50μl，细胞量3×10⁶个；2)B2M^＋/－人多能干细胞，体积50μl，细胞量3×10⁶个；3)B2M^－/－人多能干细胞，体积50μl，细胞量3×10⁶个。

3.冰冻切片及苏木精-伊红(HE)染色

1)注射2天后，取实验小鼠的胫骨前肌，用PBS洗两遍，4%多聚甲醛在4℃固定过夜。

2)用20%蔗糖处理2天。

3)包埋剂包埋，-80℃，30min。制作20μm冷冻切片。

4)HE染色步骤：

将冰冻切片用蒸馏水洗2min，苏木精染色10min后，流水冲去切片上残余染液，自来水冲洗10min左右。用蒸馏水洗数秒，95%酒精洗30s，伊红染液染2min。再用95%乙醇洗两遍，每次2min。最后用二甲苯洗2次，每次5min后封片。

4.炎症细胞数量统计结果如图8所示。

所示结果显示，与野生型的人多能干细胞相比，B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞作为移植物所引起的受体小鼠炎症细胞侵润的反应显著减弱(P<0.001)。该结果表明，我们得到的B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞具有低的免疫原性。

实施例8.酶联免疫斑点分析(Elispot assay)

1.PBMC的准备

1)用EDTA-2K抗凝真空采血管取自愿献血者外周血5ml，用人外周血淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞(PBMC)。

2)用1640基础培养基离心(1500rpm，10min)洗涤两次。

3)将洗涤好的PBMC用血细胞计数平板计数，用含10%FBS的1640培养基将PBMC的浓度调至5×10⁶个细胞/ml。

2.抗原细胞的准备

1)用浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理人多能干细胞及敲除β2m的人多能干细胞，37℃放置2h。

2)用PBS洗去残留的丝裂霉素C。

3)用trypLE消化人多能干细胞及敲除β2m的人多能干细胞，37℃放置10min，轻轻用枪头吹散成单细胞，离心去除trypLE。

4)用含10%FBS的1640培养基离心(1200rpm，4min)洗涤一遍。

5)用血细胞计数平板进行细胞计数，用含10%FBS的1640培养基将PBMC的浓度调至5×10⁶个细胞/毫升。

3.Elispot板的准备

1)用无菌PBS稀释包被抗体人IFN-γ(mabtech kit货号：3420-2H)浓度至15ug/ml。

2)用15μl35%乙醇处理PVDF板(Millipore货号：MSIPS4510)不超过1min。

3)用无菌水洗涤5次，200μl/孔/次。

4)加100μl/孔稀释后的包被抗体溶液，4℃过夜。

4.在Elispot板中共孵育PBMC和抗原细胞

1)去除Elispot板中的包被抗体溶液，用无菌PBS洗涤5次，200μl/孔/次。

2)加10%FBS的1640培养基200μl/孔，室温孵育至少30min。

3)去除10%FBS的1640培养基，在阴性对照孔中加入100μl步骤1中准备好的PBMC和100μl10%FBS的1640培养基；阳性对照孔中加入100μl步骤1中准备好的PBMC、100μl10%FBS的1640培养基和终浓度为10μg/ml植物凝集素(PHA)；实验组中加入100μl步骤1中准备好的PBMC和100μl步骤2中准备好的对应的人多能干细胞或者敲除β2m的人多能干细胞。

4)用锡箔纸将加好样品的Elispot板，放置在37℃含5%CO₂的细胞培养箱中静止共孵育24h(共孵育过程中禁止移动Elispot板)。

5.检测斑点

1)去除板中的细胞，用PBS洗涤5次，200μl/孔/次。

2)用含0.5%FBS的PBS稀释检测抗体(-生物素)至1μg/ml，每孔加100μl，室温孵育2h。

3)去除板中的检测抗体溶液，用PBS洗涤5次，200μl/孔/次。

4)用含0.5%FBS的PBS按1:300比例稀释链酶亲和素-HRP，每孔加100μl，室温孵育1h。

5)去除板中的链酶亲和素-HRP溶液，用PBS洗涤5次，200μl/孔/次。

6)加100μl/孔TMB底物溶液，避光室温孵育至清晰斑点出现(通常情况下20～60min)。

7)通过用大量的ddH₂O反复洗涤来终止显色反应，并吸干多余的水。

8)晾干Elispot板，用Elispot酶标仪读板、计数。

9)室温避光保存Elispot板。

Elispot分析结果如图9所示。

所示结果显示，与野生型的人多能干细胞相比，B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞刺激人外周血细胞的免疫反应程度减弱或显著减弱(P<0.05和P<0.01)，该结果表明我们得到的B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞具有较低的免疫原性。

实施例9.刺激人外周血单核细胞(PBMC)增殖实验

1.PBMC的准备

1)用EDTA-2K抗凝真空采血管取自愿献血者外周血5ml，用人外周血淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞(PBMC)。

2)用1640基础培养基离心(1500rpm，10min)洗涤两次。

3)将洗涤好的PBMC用血细胞计数平板计数，用含10%FBS的1640培养基将PBMC的浓度调至5×10⁶个细胞/毫升。

2.抗原细胞的准备

1)用浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理人多能干细胞及敲除β2m的人多能干细胞，37℃放置2h。

2)用PBS洗去残留的丝裂霉素C。

3)用trypLE消化人多能干细胞及敲除β2m的人多能干细胞，37℃放置10min，轻轻用枪头吹散成单细胞，离心去除trypLE。

4)用含10%FBS的1640培养基离心(1200rpm，4min)洗涤一遍。

5)用血细胞计数平板计数，用含10%FBS的1640培养基将PBMC的浓度调至5×10⁶个细胞/毫升。

3.抗原细胞与PBMC共孵育

1)加入100μl步骤1中准备好的PBMC和100μl步骤2中准备好的对应的人多能干细胞或者敲除β2m的人多能干细胞到96孔板中，共孵育3～4天。

2)用血细胞计数平板计数，PBMC相对人多能干细胞较小、较圆、较光滑，容易区分，只计PBMC形态的细胞数目。

刺激PBMC增殖实验的结果如图10。

所示结果显示，与野生型的人多能干细胞相比，B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞刺激人外周血细胞增殖的速度显著减弱(P<0.05)。该结果表明，我们得到的B2M^＋/－和B2M^－/－的人多能干细胞具有低免疫原性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种修饰的人细胞，其特征在于，与相应的野生型细胞相比，所述修饰的人细胞的细胞表面人类白细胞抗原HLA蛋白或多肽缺失或表达下调，从而使得所述修饰的人细胞具有降低的免疫原性。

2.如权利要求1所述的修饰的人细胞，其特征在于，所述人细胞是人干细胞，优选人多能干细胞。

3.如权利要求1所述的修饰的人细胞，其特征在于，所述修饰的人细胞中HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因缺失或表达下降。

4.如权利要求3所述的修饰的人细胞，其特征在于，所述基因选自：β2-微球蛋白基因B2M、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因，优选β2-微球蛋白基因B2M。

5.如权利要求4所述的修饰的人细胞，其特征在于，通过B2M^－/－双拷贝敲除或B2M^＋/－单拷贝敲除实现所述β2-微球蛋白的缺失或表达下降。

6.一种制备权利要求1～5中任一项所述的修饰的人细胞的方法，所述方法包括：

A)提供原料人细胞；

B)对所述原料人细胞进行修饰改造，以使其HLA生物合成或转运途径中的一种或多种基因缺失或表达下降；

C)收集所述修饰的人细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤B)是使得所述原料人细胞中的HLA I类分子组分蛋白的B2M基因缺失或使得该基因的表达下调。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤C)包括：从步骤B)中所得细胞中选择细胞表面HLA I类分子表达缺失或下调的人细胞，从而获得细胞表面的HLA I类分子缺失或表达下调的修饰的人细胞。

9.如权利要求6～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还任选包括：

D)检验步骤C)中所得修饰的人细胞的免疫原性，以确定所述修饰的人细胞与野生型细胞相比具有降低的免疫原性。

10.一种具有降低的免疫原性的移植用细胞，所述移植用细胞是由权利要求1～5中任一项所述修饰的人细胞获得、诱导分化或转分化来的，或是由采用权利要求6～9中任一项所述方法制得的修饰的人细胞获得、诱导分化或转分化来的。

11.一种制备权利要求10所述的移植用细胞的方法，所述方法包括：诱导权利要求1～5中任一项所述修饰的人细胞分化为所需的移植用细胞；或采用权利要求6～9中任一项所述方法制得的修饰的人细胞，并诱导所得的修饰的人细胞分化为所需的移植用细胞，其中所述修饰的人细胞是修饰的人干细胞，优选修饰的人多能干细胞。

12.权利要求1～5中任一项所述修饰的人细胞、通过权利要求6～9中任一项所述的方法制得的修饰的人细胞、权利要求10所述的移植用细胞或通过权利要求11所述的方法制得的移植用细胞在制备用于疾病治疗的移植物或药物组合物中的用途。