CN114026225A - 安全的免疫隐形细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及安全且免疫隐形的可植入细胞，及其预防、治疗或治愈疾病的用途。

Description

安全的免疫隐形细胞
本发明涉及哺乳动物细胞的领域，并且涉及此类细胞作为供体细胞用于植入的用途。
序列表的援引并入
序列表
本申请与电子形式的序列表一同提交。该序列表的全部内容通过引用并入本文。
背景
目前正在研究通用可移植的组织和/或细胞，以期获得显著益处，如降低移植排斥风险，例如，在不匹配的供体/受体免疫学特征或自身免疫疾病如1型糖尿病(T1D)的情况下的移植排斥风险。
为了限制移植排斥的风险，自体移植是一种选择，即从患者提取干细胞、扩充、分化并移植回同一患者体内。然而，这个过程在技术上是非常困难且昂贵的。
组织错配排斥由I类HLA(人类白细胞抗原)肽复合物和随后的基于T细胞的组织破坏所介导。耗尽I类HLA肽复合物能免除大多数细胞对组织匹配的要求。
存在6种I类HLA肽复合物：高多态性的I类HLA肽复合物HLA-A、HLA-B和HLA-C，以及较低多态性的I类HLA肽复合物HLA-E、HLA-F和HLA-G。
可通过以下两种途径之一耗尽I类HLA肽复合物：
1)通过直接去除所有六种高多态性的I类HLA等位基因，或
2)通过消除β2微球蛋白(B2M)蛋白。B2M是所有HLA-I复合物易位至细胞表面所必需的。B2M蛋白的缺失导致细胞表面缺少所有I类HLA肽复合物。
虽然泛I类HLA缺陷型细胞免受错配排斥，但由于缺乏I类HLA-E复合物，这些细胞容易受到自然杀伤细胞排斥(NK细胞)的影响。当存在于细胞表面时，I类HLA-E复合物向NK细胞传递抑制信号。在不存在HLA-E复合物的情况下，这种抑制信号的丧失会导致HLA缺陷型细胞被NK细胞裂解。
解决NK裂解这一问题的尝试依赖于与HLA-E蛋白融合的B2M蛋白的工程化变体的表达(WO19032675)。一种方法(Gornalusse等人,Nature Biotechnology 2017)是以信号肽/B2M/HLA-E三聚体的形式在融合蛋白中预先构建信号肽(HLA I类前导肽序列)，以增加复合物的稳定性和膜表达。大多数重大的开发计划采用融合构建体，其包含融合(或“预结合”)的HLA-G衍生信号肽作为HLA I类前导肽。
在产生HLA缺陷型细胞(也称为“通用供体”细胞)中的一个公认问题是它们对于针对病毒感染或致瘤性转化的免疫监视变得沉默。仍然存在相关风险，即在病毒感染或恶性去分化后，细胞不再受到常规免疫监视，这引发了安全性问题。
仍然需要改进的安全通用供体细胞。
Gornalusse G.等人(Nature Biotechnology 2017)公开了表达HLA-E的多能干细胞。
WO2012145384公开了B2M缺陷型细胞。
US8586358B2公开了HLA单元型纯合的HLA纯合细胞。
US20040225112A1公开了编码单链HLA-E蛋白以防止NK细胞介导的细胞毒性的基因。
Deuse等人(Nature Biotechnology,2019)公开了敲除B2M和CIITA以及添加CD47。
WO19032675公开了分离的经遗传修饰的T细胞，其包含编码包含B2M蛋白和HLA-E和/或HLA-G蛋白的融合蛋白的序列。
WO18005556据称公开了包含MHC-E分子的细胞。
Young等人,Cancer Gen.Therapy(2000),7:240-246公开了使用单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)基因的更昔洛韦介导的细胞杀伤。
发明内容
在一方面，本发明提供了包含B2M/HLA-E基因如B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞在不同的已知位置处具有至少4个HSV-TK基因的敲入。
在另一方面，本发明提供了哺乳动物细胞，其具有B2M/HLA-E基因的敲入，如B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因两者均敲入另外的B2M和HLA-II缺陷型细胞，例如CIITA缺陷型细胞中。
在另一方面，本发明提供了包含B2M/HLA-E基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因，是CIITA缺陷型的，并且在不同的已知位置处具有4个HSV-TK基因的敲入。
在另一方面，本发明提供了包含B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因，是CIITA缺陷型的，并且在不同的已知位置处具有4个HSV-TK基因的敲入。
在一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
在一方面，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
在进一步的方面，所述哺乳动物细胞是干细胞。
在一方面，所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞。在另一方面，所述哺乳动物细胞是多能干细胞。在又一方面，所述哺乳动物细胞处于分化阶段。
在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在不同的已知位置处敲入至少4个HSV-TK基因的步骤。
在又一方面，本发明提供了根据本发明的哺乳动物细胞用于预防、治疗或治愈慢性疾病的用途。
在一个实施方案中，该慢性疾病选自糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、干性黄斑变性、色素性视网膜炎、神经系统疾病、帕金森病、心脏病、慢性心力衰竭和慢性肾病。
本发明提供了改进的通用供体细胞。本发明的细胞对患者而言更加通用和安全。
定义
等位基因：
如本文所用的术语“等位基因”是指给定基因的变体。例如，HLA-E 01:01和HLA-E01:03是HLA-E基因的变体，也称为等位基因或同种型。
B2M：
如本文所用的术语“B2M”是指beta2-微球蛋白，即β2微球蛋白。术语“B2M基因”指代编码B2M蛋白的基因。B2M蛋白是所有I类HLA蛋白的亚单位。B2M蛋白是I类HLA蛋白易位至细胞表面所必需的。在人类中，B2M基因位于第15号染色体上。
B2M缺陷型细胞：
所用的术语“B2M缺陷型细胞”是指没有功能性B2M基因的细胞。因此，该细胞可完全缺乏B2M基因，或者该基因可能是功能缺陷的，例如，灭活或受损的，使得其不表达或不编码功能性B2M蛋白。
B2M/HLA-E基因或蛋白质：
如本文所用的术语“B2M/HLA-E基因”等同于“B2M/HLA-E融合基因”，并且是指编码包含B2M部分和HLA-E部分的蛋白质的基因融合构建体，该蛋白质等同于“B2M/HLA-E融合蛋白”。如本文所用的，除非另外说明，否则术语“B2M/HLA-E基因”和“B2M/HLA-E融合蛋白”指其任意功能形式，其中该基因具有表达相应融合蛋白的能力，并且其中所表达的B2M/HLA-E融合蛋白具有易位至细胞表面的能力。
B2M/HLA-E*0101蛋白：
如本文所用的术语“B2M/HLA-E*0101蛋白”是指包含“B2M”部分和“HLA-E”部分的融合蛋白，其中HLA-E部分属于01:01同种型，也称为01:01等位基因，该融合蛋白即包含B2M功能肽和HLA-E 01:01功能肽的融合体。
B2M/HLA-E*0101基因：
如本文所用的术语“B2M/HLA-E*0101基因”是指编码B2M/HLA-E*0101蛋白的基因融合构建体。
HLA/MHC:
术语“HLA”表示人类白细胞抗原。如本文所用的，HLA是指负责调控哺乳动物免疫系统的公知的HLA系统。“HLA基因”编码也称为“MHC蛋白”的“HLA蛋白”。“MHC”表示“主要组织相容性复合物”。
功能性“HLA蛋白”(或“MHC蛋白”)易位至细胞表面并且诱导所需的免疫应答。在人类中，HLA基因位于第6号染色体上。
I类HLA蛋白是异二聚体，并且包括高多态性的HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白，以及较低多态性的HLA-E、HLA-F和HLA-G蛋白。I类HLA蛋白常见于人类所有有核细胞的表面。
I类HLA蛋白的作用是将在本文中称为“内源肽”的小肽从细胞内呈递到细胞外表面上。在细胞感染的情况下，I类HLA肽向细胞外表面呈递来自入侵病原体(例如，病毒)的小肽，该小肽将会被识别为“非自身的”(或“外来物”或“抗原”)，并且通过由免疫细胞破坏该细胞来诱导免疫应答。在不存在细胞感染时，I类HLA肽向细胞外表面呈递例如来自HLA-E的内源小肽(HLA-E片段)，该内源小肽将会被识别为“自身的”(或“自身抗原”)并且不会诱导免疫应答。
II类HLA蛋白是异二聚体，并且包括HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。II类HLA蛋白常见于专职抗原呈递细胞上。
II类HLA蛋白的作用是将主要衍生自外部来源的抗原呈递至细胞表面，并引发抗原特异性免疫应答(经由CD4(+)T淋巴细胞)。
细胞基因型：
“基因A-/-细胞”是指这样的细胞，其中基因A的两个拷贝都是非功能性的，例如缺失的或以其他方式被破坏的。“基因A+/-细胞”是指这样的细胞，其中基因A的一个拷贝是功能性的，而第二个拷贝是非功能性的，例如是缺失或以其他方式被破坏的。“基因A+细胞”是指细胞仅包含一个基因A拷贝，并且所述一个基因A拷贝是功能性的。
细胞表面表型：
如本文所用的，表述“HLA-A/B/C-/-细胞的细胞表面表型”指没有HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白的细胞表面。
如本文所用的，表述“HLA-E*0101+HLA-E*0103+细胞的细胞表面表型”是指包含从每种HLA-E等位基因的一个拷贝表达的HLA-E*0101蛋白和HLA-E*0103蛋白的细胞表面。
CIITA/CIITA缺陷型：
术语CIITA表示“II类，主要组织相容性复合物，反式激活蛋白”。如本文所用的术语CIITA指代“CIITA基因”或“CIITA蛋白”，即由CIITA基因编码的蛋白质。CIITA蛋白是参与所有II类HLA肽的转录的转录因子。在人类基因组中，CIITA蛋白位于第16号染色体上。
如本文所用的术语“CIITA缺陷型”是指“没有功能性CIITA基因”。“CIITA缺陷型细胞”是指不表达功能性CIITA蛋白的细胞，例如细胞的CIITA基因已被敲除或以其他方式灭活，或表达非功能性蛋白质。在CIITA缺陷型细胞中，所有HLA II类蛋白都被消融。
不同的已知位置：
如本文所用的，表述“在已知位置”是指“在靶向基因座中”。该表述是指基因组上特定靶向基因座(位置)中的基因修饰，如插入、缺失或破坏，这与基因组中的随机位置上的随机基因修饰不同。特别是，就敲入而言，表述“在不同的已知位置”是指目的基因未插入到基因组中的随机位置，而是插入到已预先确定并专门靶向的基因座中。这样的优势在于确保所插入基因的表达水平一致，并且例如靶向安全港基因座。
如本文所用的表述“在不同位置”是指“在基因组上的不同基因座处”。该表述是指例如超过一个核酸序列插入，其中所述2个或更多个核酸序列未插入到基因组的同一基因座上，即基因组的一个相同位置上。相反，所述2个或更多个核酸序列插入到基因组上的不同基因座处。例如，如果插入到同一染色体上，则所述2个或更多个序列在插入后彼此相隔多个核苷酸。表述“不同位置”可包括位于一对染色体的两条染色体上的相同基因座。
EF1a mini、EF1a、UbC、PGK、CMV和CAG启动子：
EF1a启动子表示人类延伸因子1α启动子，UbC启动子表示人类泛素C启动子，PGK启动子表示小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子，CMV启动子表示巨细胞病毒立即早期启动子，CAG(或CAGG)启动子表示与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子。这些启动子是组成型启动子，可用于驱动异位基因表达。
UCO和UCOE：
UCOE表示普遍存在的染色质开放元件。UCO元件防止启动子的沉默。UCO元件可以放置在启动子的上游。
HLA-E杂合的：
包含HLA-E基因的至少两个不同等位基因，例如包含HLA-E*0101基因和HLA*0103基因的细胞是HLA-E杂合的。
HSV-TK基因：
如本文所用的术语“HSV-TK”表示单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)，并指代自杀开关系统。HSV-TK基因编码TK酶。为了触发HSV-TK+细胞的自杀，将更昔洛韦提供给HSV-TK+细胞或具有此类细胞的生物体时，TK酶将更昔洛韦磷酸化为有毒化合物，该化合物抑制DNA聚合酶并触发HSV-TK+细胞的死亡。
敲入和敲除：
如本文所用的术语“敲入”是指将基因插入基因组中。使用敲入技术，基因插入是靶向的，这意味着基因被插入到特定基因座中，插入基因组上已预先定义并专门靶向的位置，这与使用其他基因工程化方法的随机基因插入不同。
如本文所用的术语“敲除”是指通过破坏基因组中的基因而导致的缺失或灭活。为了实现给定目的基因的缺失或破坏，敲除技术通常需要在基因组上的特定靶向位置进行遗传修饰。
在本领域中存在几种敲入和敲除技术，并且其被详细定义。
哺乳动物细胞：
如本文所用的术语“哺乳动物细胞”是指源自哺乳动物活生物体的细胞，如哺乳动物细胞或人类细胞。哺乳动物细胞可以处于未分化阶段，例如处于多能(pluripotent)或专能(multipotent)阶段，或处于分化阶段，例如完全成熟阶段，或处于分化的中间阶段。
匹配HLA类型：
如本文所用的术语“匹配HLA”或“匹配HLA类型”是指供体细胞与宿主生物体之间足够相似，从而不会诱导免疫系统对供体细胞的排斥的HLA同种型。在哺乳动物中，HLA蛋白是个体独特的。宿主生物体的免疫系统会将供体细胞(例如移植的细胞或移植器官中的细胞)外细胞表面上的“非匹配”HLA蛋白识别为“非自身的”(或“入侵者”)，并诱导免疫应答和对供体细胞的排斥。如果供体细胞的HLA蛋白与宿主生物体的HLA蛋白具有相同或足够相似的同种型，即HLA类型与宿主生物体相匹配，则免疫系统会将供体细胞识别为“自身的”，并且不会诱导对供体细胞的排斥。
多态性的：
如本文所用的术语“多态性的”是指给定细胞内存在给定基因的不同同种型。HLA系统中的多态性允许更有效和适应性的免疫应答。
蛋白质、肽：
除非另有说明，否则术语“蛋白质”和“肽”是指其功能形式。
安全港：
如本文所用的术语“安全港位点”或“安全港基因座”或“基因组安全港位点”是指基因组上不断表达的位置，其不会因例如表观遗传沉默或转录活性下调而沉默。AAVS1和hROSA16是人类基因组中的安全港位点的示例。“AAVS1”表示腺相关病毒整合位点1，位于人类第19号染色体上。“hROSA26”表示“Gt(ROSA)26S的人类形式”或“ROSA26的人类形式”，位于人类第3号染色体上。CLYBL和CCR5是其他可能的安全港位点，“CLYBL”表示“柠檬酸裂解β样”，位于人类第13号染色体上，“CCR5”表示“5型C-C趋化因子受体”，位于人类第5号染色体上。
通用可植入细胞、可移植细胞、可植入细胞或通用供体细胞：
如本文所用的术语“通用可移植/可植入细胞”或“通用细胞”或“通用供体细胞”或“可移植细胞”或“免疫安全细胞”或“隐形(stealth)细胞”或“免疫隐形细胞”或“可植入细胞”全部指代可以移植到宿主生物体中而不被识别为非自身的，因此不会被宿主生物体的免疫系统排斥的细胞。该细胞通常源自与宿主生物体不同的供体生物体。本发明的一个目的是提供可以安全地植入众多类型的患者体内而不会被排斥的细胞。
可植入的哺乳动物细胞与哺乳动物细胞：
在本发明的方法、方法权利要求和方法实施方案的上下文中，术语“哺乳动物细胞”是指在完成本发明的遗传修饰之前的细胞，术语“可植入的哺乳动物细胞”是指包含本发明的遗传修饰的细胞。
附图
图1是根据本发明的B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103基因构建体及其在人类第15号染色体上的B2M基因座中的敲入的实施方案的图示。示出的基因构建体包含启动子、编码信号肽的核酸序列、编码B2M的核酸序列、编码(G4S)4接头的核酸序列，和用于基因构建体之一的编码HLA-E*0101的核酸序列或用于另一个基因构建体的编码HLA-E*0103的核酸序列。箭头
Figure BDA0003432094000000101
示出了驱动基因构建体表达的启动子。
图2是根据本发明在安全港基因座中敲入2个HSV-TK基因的实施方案的图示，该安全港基因座例如是第19号染色体上的港基因座AAVS1(PPP1R12C)、第3号染色体上的hROSA26、第5号染色体上的CCR5或第13号染色体上的CLYBL。示出的基因构建体包含启动子和编码HSV-TK蛋白的核酸序列。箭头
Figure BDA0003432094000000102
示出驱动基因构建体表达的启动子。
图3显示了暴露于不同浓度的更昔洛韦(GCV)后细胞培养物的图片。
具体实施方式
在一方面，本发明提供了包含至少一种B2M/HLA-E基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。
在另一方面，本发明提供了包含B2M/HLA-E基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因，并且在不同的已知位置处具有至少4个HSV-TK基因的敲入。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞包含B2M/HLA-E基因。在一个实施方案中，所述细胞包含一种类型的B2M/HLA-E等位基因，即在B2M/HLA-E融合体中的一个HLA-E变体。在一个实施方案中，B2M/HLA-E融合体中的HLA-E变体是HLA-E*01:01等位基因或是HLA-E*01:03等位基因。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞包含两种不同的B2M/HLA-E等位基因，即所述细胞是B2M/HLA-E基因杂合的。在一个实施方案中，B2M/HLA-E融合体中的HLA-E变体是HLA-E*01:01等位基因和HLA-E*01:03等位基因。
在一方面，本发明提供了包含B2M/HLA-E*0101融合基因或B2M/HLA-E*0103融合基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。在一方面，本发明提供了包含B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。
在本发明中，B2M/HLA-E*0101基因编码B2M/HLA-E*0101蛋白。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101蛋白包含B2M蛋白、HLA-E*0101蛋白和在B2M蛋白与HLA-E*0101蛋白之间的接头。在一个实施方案中，B2M部分位于B2M/HLA-E*0101融合蛋白的N末端，并且HLA-E部分位于C末端。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101蛋白还包含信号肽。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101蛋白包含信号肽、B2M蛋白、HLA-E*0101蛋白和在B2M蛋白与HLA-E*0101蛋白之间的接头。在一个实施方案中，信号肽位于B2M/HLA-E*0101融合蛋白的N末端，其后是B2M蛋白和接头，并且HLA-E蛋白位于C末端。
在一个实施方案中，在B2M蛋白与HLA-E*0101蛋白之间的接头是(G4S)4接头。
在本发明中，B2M/HLA-E*0103基因编码B2M/HLA-E*0103蛋白。如本文所用的术语“B2M/HLA-E*0103”旨在表示β2微球蛋白(B2M)与HLA-E*0103之间的融合体。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0103蛋白包含B2M蛋白、HLA-E*0103肽和在B2M蛋白与HLA-E*0103肽之间的接头。在一个实施方案中，B2M部分位于B2M/HLA-E*0103融合蛋白的N末端，并且HLA-E部分位于C末端。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0103蛋白还包含信号肽。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0103蛋白包含信号肽、B2M蛋白、HLA-E*0103蛋白和在B2M蛋白与HLA-E*0103蛋白之间的接头。在一个实施方案中，信号肽位于B2M/HLA-E*0103融合蛋白的N末端，其后是B2M蛋白和接头，并且HLA-E蛋白位于C末端。
在一个实施方案中，在B2M蛋白与HLA-E*0103之间的接头是(G4S)4接头。
在优选实施方案中，B2M/HLA-E*0101融合蛋白和/或B2M/HLA-E*0103融合蛋白保留在易位至细胞表面之前进一步结合内源肽的能力。这由于不存在作为所述融合蛋白的一部分的预结合的HLA I类前导肽序列(如VMAPRTLIL)而成为可能。在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101融合蛋白和/或B2M/HLA-E*0103融合蛋白不包含预结合的HLA I类前导肽序列。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101融合蛋白的HLA-E*0101部分包含氨基酸序列[SEQ ID NO:01]：
GSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101融合蛋白或B2M/HLA-E*0103融合蛋白的B2M部分包含氨基酸序列[SEQ ID NO:02]：
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0103融合蛋白的HLA-E*0103部分包含氨基酸序列[SEQ ID NO:03]：GSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
在一个实施方案中，包含(G4S)4接头和信号肽的B2M/HLA-E*0101融合蛋白包含氨基酸序列[SEQ ID NO:04]：MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
在一个实施方案中，包含(G4S)4接头和信号肽的B2M/HLA-E*0103融合蛋白包含氨基酸序列[SEQ ID NO:05]：MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
在一个实施方案中，编码具有(G4S)4接头和信号肽的B2M/HLA-E*0101融合蛋白的B2M/HLA-E*0101基因包含核酸序列SEQ ID NO:06：ATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCCGGTTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACAGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAGTTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTGAGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCACAAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGACACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGGCCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGGCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGATCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCAGGTGGGAAAGGAGGGAGCTACTCTAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGGGTCTGAGTCTCACAGCTTG。
在一个实施方案中，编码具有(G4S)4接头和信号肽的B2M/HLA-E*0103融合蛋白的B2M/HLA-E*0103基因包含核酸序列SEQ ID NO:07：ATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCCGGTTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAGTTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTGAGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCACAAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGACACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGGCCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGGCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGATCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCAGGTGGGAAAGGAGGGAGCTACTCTAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGGGTCTGAGTCTCACAGCTTG。
在另一方面，本发明提供了哺乳动物细胞，其中B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因两者均敲入另外的B2M缺陷型细胞中。
在一个实施方案中，B2M/HLA-E基因插入到原有B2M基因的基因座处，在人类细胞的情况下，该基因座在第5号染色体上。在一个实施方案中，B2M/HLA-E*0101基因的拷贝和B2M/HLA-E*0103基因的拷贝插入到细胞的原有B2M基因的两个拷贝中每一个的基因座上，由此灭活原有B2M基因。一个示例如图1所示。
在一个实施方案中，B2M/HLA基因不包含编码预结合的HLA I类前导肽的序列，并且B2M/HLA蛋白不包含预结合的HLA I类前导肽。
令人惊讶地发现，将不包含编码预结合的HLA I类前导肽的序列的B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103基因融合构建体两者用于B2M缺陷型细胞中产生了HLA-A/B/C-/-HLA-E*0101+HLA-E*0103+细胞的细胞表面表型，其具有高且稳定的HLA-E密度、最大的内源肽结合多样性、针对NK细胞介导的非感染靶细胞裂解的最佳保护，以及NK细胞对感染病毒或其他病原体的哺乳动物靶细胞的增强识别和最佳消除。
本发明有利地允许A)组成性地增加供体细胞表面上HLA-E蛋白的密度，以抑制NK细胞介导的B2M缺陷型细胞排斥，B)经由原有内源肽结合保留HLA-E的正常免疫监视功能(导致致耐受性能力轻微降低)，C)通过包含多个HLA-E同种型，使与HLA蛋白结合的潜在内源肽的多样性最大化，以及D)降低病毒感染或恶性去分化后细胞不再受到常规免疫监视的风险。
为了通过非原有启动子提供增加的HLA-E密度并实现优势A)，将B2M/HLA-E基因的两个而不是一个等位基因插入细胞中。为了实现优势B)，发明人使用了编码B2M/HLA-E融合蛋白的B2M/HLA-E基因，该融合蛋白没有预先工程化，即，为预结合的HLA I类前导肽，进而利用原有内源肽加工和加载机制。为了实现优势C)，采用了两个主要的HLA-E等位基因——HLA-E*0101和HLA-E*0103。这两个编码的HLA-E*0101和HLA-E*0103蛋白负载并呈递不同的内源肽子集，从而增加了HLA蛋白在正常情况下将会充分负载致耐受性内源肽并在病毒感染期间充分负载激活性内源肽的可能性。为了实现优势D)，发明人引入了4个拷贝的HSV-TK基因作为稳定的开关，如果需要，其可以迅速杀死细胞。几种修饰的组合具有在感染条件下显著改善细胞保留和免疫监视的潜力。
有利地，正常内源肽负载(通过不使用预结合的肽)与多种HLA-E同种型的组合允许扩大细胞对病毒和/或细菌感染的免疫监视，同时保持最大致耐受性表型。在感染期间，来自病毒或细菌病原体的几种肽可以从HLA-E取代正常内源肽。当HLA-E呈递病原体衍生的肽时，它会刺激受感染细胞的NK裂解；与之相反，带有预结合的肽的HLA-E将向NK细胞指示“健康状态”，不会刺激NK裂解，从而提供耐受功能。这是本发明实现的重要安全性特征。
在一个实施方案中，本发明的哺乳动物细胞是HLA-II缺陷型的。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是CIITA缺陷型的。
任何可用的和相关的基因编辑技术(CRISPR、TALEN、ZFN、归巢核酸内切酶、腺病毒重组等)均可用于修饰细胞，从而敲除原有B2M的两个等位基因，而敲入B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因中每一个的一个或多个拷贝。
B2M/HLA-E基因如B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的敲入可以直接在原有B2M基因座上、在其他基因座如安全港基因座(如AAVS1安全港基因座)或其任何组合上完成。任何可用的启动子均可用于这些敲入基因，例如选自EF1a mini、EF1a、UbC、PGK、CMV和CAG的启动子。根据本发明，通过由组成型活性启动子控制的双等位基因HLA-E敲入来获得HLA-E密度的期望增加。在原生细胞中，内源性HLA-E启动子由启动子INFγ应答元件控制。
类似地，HSV-TK基因可以在期望的位置，即在靶向基因座处敲入。可以使用任何可用的和相关的基因编辑技术。
本发明的细胞在不同的已知位置包含至少4个HSV-TK基因。
在本发明中，HSV-TK基因充当可诱导的“自杀开关”系统，以控制工程化哺乳动物细胞例如在宿主生物体中的存活。自杀开关的概念需要向基因组引入使细胞对可在需要时施用的外源性分子敏感的基因。HSV-TK基因编码胸苷激酶，胸苷激酶在表达HSV-TK的细胞内将常见的小分子抗病毒药物更昔洛韦转化为有毒物质。此类自杀基因的问题是，理论上它们可以通过自发的基因组缺失或启动子沉默而被灭活或消除，从而导致“自杀开关”失去预期的控制。
在本发明的一个实施方案中，HSV-TK自杀基因被置于基因组中的安全港基因座中。在本发明的一个实施方案中，HSV-TK的表达由带有上游UCO元件的启动子驱动。在本发明的一个实施方案中，HSV-TK自杀基因的表达由带有上游UCO元件的UbC启动子驱动。
在本发明的一个实施方案中，将HSV-TK自杀基因的四个拷贝插入到细胞的基因组中。
在本发明的一个实施方案中，4个HSV-TK基因，即HSV-TK基因的4个拷贝在不同的位置处敲入，即在基因组上具有一定间隔的位置处敲入，例如以提供不易因基因重排或缺失而破坏的安全系统。在一个实施方案中，4个HSV-TK基因被敲入同一染色体上，并且彼此相隔至少10Kbp，如至少100Kbp、至少1Mbp或至少20Mbp。在另一个实施方案中，4个HSV-TK基因在4条不同染色体上的位置处敲入。在另一个实施方案中，4个HSV-TK基因在3条不同染色体上的位置处敲入。在另一个实施方案中，4个HSV-TK基因在2条不同染色体上的位置处敲入，例如两个HSV-TK拷贝在二倍体细胞中两条3号染色体上各自的相同位置上，两个HSV-TK拷贝在两条19号染色体上的相同位置上。在本发明的另一个实施方案中，2个HSV-TK基因在基因组安全港位点处敲入。在另一个实施方案中，敲入一个HSV-TK基因以破坏和消除B2M等位基因。在另一个实施方案中，敲入一个HSV-TK基因以消除CIITA等位基因。
患者安全性是细胞疗法中非常重要的参数。
插入4个拷贝的TK自杀基因还有利地提高了对患者的安全性。令人惊讶地发现，具有4个拷贝的TK自杀基因的细胞对更昔洛韦治疗的敏感性显著高于具有2个拷贝的细胞，从而用较少量的更昔洛韦实现细胞死亡。
与随机整合到细胞基因组中相比，将TK自杀基因放置在已知的、预先定义的位置有利地提高了对患者的安全性。与随机整合相比，靶向整合降低了重要基因或重要基因表达调节被破坏的风险。它还降低了自杀基因随机整合到表达活性欠佳的区域的风险，从而确保最佳的TK表达水平。
将TK自杀基因放置在不同位置通过限制所有TK自杀基因拷贝在其插入基因座暴露于基因沉默或转录下调的情况下被一次性沉默或下调的风险，进一步提高了患者的安全性。
将TK自杀基因放置在安全港基因座处有利地增加了对患者的安全性。安全港基因座是基因组中恒定表达的区域。这种方法降低了自杀基因被意外沉默或下调的风险，从而增加了自杀TK蛋白始终保持在最佳表达水平并且随后在施用更昔洛韦时按需要控制细胞死亡的几率。
结果是，根据本发明，将4个TK自杀基因拷贝放置在已知的不同位置如安全港基因座处向接受细胞疗法的患者提供了显著提高的安全性。
在一个实施方案中，将至少2个HSV-TK基因敲入安全港位点，如AAVS1基因座或hROSA26基因座或CLYBL基因座中。在一个实施方案中，将2个HSV-TK基因敲入安全港位点，如AAVS1基因座或hROSA26基因座或CLYBL基因座中，并将2个HSV-TK基因敲入CIITA基因座中。
在另一个实施方案中，将2个HSV-TK基因敲入安全港位点中，将2个HSV-TK基因敲入另一个安全港位点中，并且敲除CIITA基因座。在更具体的实施方案中，将2个HSV-TK基因敲入AAVS1基因座中，将2个HSV-TK基因敲入CLYBL基因座中，并且敲除CIITA基因。
在一个实施方案中，将B2M/HLA-E基因敲入B2M基因的基因座中，由此灭活细胞原有的B2M基因。在一个实施方案中，将B2M/HLA-E*01:01基因或B2M/HLA-E*01:03基因敲入B2M基因的基因座中，由此灭活细胞原有的B2M基因。在一个实施方案中，将B2M/HLA-E*0101基因敲入B2M基因的一个拷贝的基因座中，将B2M/HLA-E*0103基因敲入B2M基因的另一个拷贝的基因座中，由此灭活细胞原有的B2M基因。在一个实施方案中，将2个HSV-TK基因敲入AAVS1基因的基因座中并将2个HSV-TK基因敲入CIITA基因的基因座中，由此灭活细胞原有的CIITA基因。细胞原有的CIITA基因的灭活导致HLA-II蛋白的耗尽。
在一个实施方案中，将B2M/HLA-E*0101基因敲入B2M基因的一个拷贝的基因座中，将B2M/HLA-E*0103基因敲入B2M基因的另一个拷贝的基因座中，将HSV-TK基因的两个拷贝敲入安全港基因座如AAVS1基因中，并将2个HSV-TK基因敲入CIITA基因的基因座中。
在一个实施方案中，将B2M/HLA-E*0101基因敲入B2M基因的一个拷贝的基因座中，将B2M/HLA-E*0103基因敲入B2M基因的另一个拷贝的基因座中，将HSV-TK基因的两个拷贝敲入AAVS1基因座中，将2个HSV-TK基因敲入CLYBL基因座中，并敲除CIITA基因，即敲除CIITA基因的两个拷贝。
所述4个HSV-TK基因的表达优选地达到当暴露于更昔洛韦时其中每一个均会单独杀死所述哺乳动物细胞的程度。
在一个实施方案中，HSV-TK蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:08：MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN。
在一个实施方案中，编码HSV-TK蛋白的HSV-TK基因包含核酸序列SEQ ID NO:09：
ATGGCTTCTTACCCTGGACACCAGCATGCTTCTGCCTTTGACCAGGCTGCCAGATCCAGGGGCCACTCCAACAGGAGAACTGCCCTAAGACCCAGAAGACAGCAGGAAGCCACTGAGGTGAGGCCTGAGCAGAAGATGCCAACCCTGCTGAGGGTGTACATTGATGGACCTCATGGCATGGGCAAGACCACCACCACTCAACTGCTGGTGGCACTGGGCTCCAGGGATGACATTGTGTATGTGCCTGAGCCAATGACCTACTGGAGAGTGCTAGGAGCCTCTGAGACCATTGCCAACATCTACACCACCCAGCACAGGCTGGACCAGGGAGAAATCTCTGCTGGAGATGCTGCTGTGGTGATGACCTCTGCCCAGATCACAATGGGAATGCCCTATGCTGTGACTGATGCTGTTCTGGCTCCTCACATTGGAGGAGAGGCTGGCTCTTCTCATGCCCCTCCACCTGCCCTGACCCTGATCTTTGACAGACACCCCATTGCAGCCCTGCTGTGCTACCCAGCAGCAAGGTACCTCATGGGCTCCATGACCCCACAGGCTGTGCTGGCTTTTGTGGCCCTGATCCCTCCAACCCTCCCTGGCACCAACATTGTTCTGGGAGCACTGCCTGAAGACAGACACATTGACAGGCTGGCAAAGAGGCAGAGACCTGGAGAGAGACTGGACCTGGCCATGCTGGCTGCAATCAGAAGGGTGTATGGACTGCTGGCAAACACTGTGAGATACCTCCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGACTGGGGACAGCTCTCTGGAACAGCAGTGCCCCCTCAAGGAGCTGAGCCCCAGTCCAATGCTGGTCCAAGACCCCACATTGGGGACACCCTGTTCACCCTGTTCAGAGCCCCTGAGCTGCTGGCTCCCAATGGAGACCTGTACAATGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTTCTAGCCAAGAGGCTGAGGTCCATGCATGTGTTCATCCTGGACTATGACCAGTCCCCTGCTGGATGCAGAGATGCTCTGCTGCAACTAACCTCTGGCATGGTGCAGACCCATGTGACCACCCCTGGCAGCATCCCCACCATCTGTGACCTAGCCAGAACCTTTGCCAGGGAGATGGGAGAGGCCAAC。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·任选地使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
这些步骤的顺序在合理的情况下可能有所不同。例如，遗传修饰步骤和细胞分化步骤可以以不同的顺序进行，B2M/HLA-E基因的敲入可以在B2M基因灭活之前进行，分化步骤可以在B2M/HLA-E基因和/或B2M基因灭活之前进行。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·在所述哺乳动物细胞的不同的已知位置处敲入至少4个HSV-TK基因，
·任选地使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·在不同的已知位置处敲入至少4个HSV-TK基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有HLA-II基因或原有CIITA基因灭活，
·任选地使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供B2M和CIITA缺陷型哺乳动物细胞，
·向所述B2M和CIITA缺陷型哺乳动物细胞中敲入B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·在不同的已知位置处敲入4个HSV-TK基因，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述细胞的B2M基因中敲入B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞，该细胞是B2M缺陷型的，并且表达B2M/HLA-E*0101蛋白和/或B2M/HLA-E*0103蛋白。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞的B2M基因中敲入B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·在所述哺乳动物细胞的基因组中的不同的已知位置处敲入4个HSV-TK基因，
·任选地使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞，该细胞是B2M缺陷型的，并且表达B2M/HLA-E*0101蛋白和/或B2M/HLA-E*0103蛋白以及HSV-TK蛋白。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供B2M缺陷型哺乳动物细胞，
b)向所述B2M缺陷型哺乳动物细胞中敲入B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103两者，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供了制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供B2M和CIITA缺陷型哺乳动物细胞，
b)向所述B2M和CIITA缺陷型哺乳动物细胞中敲入B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103两者，
c)在不同的已知位置处敲入4个HSV-TK基因，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
设想到根据本发明的方法进行遗传修饰的哺乳动物细胞可以处于分化的不同阶段，并且可以根据需要进行进一步分化。例如，在干细胞、多能细胞或处于早期分化阶段的细胞的情况下，该细胞可在植入前分化为更后期的分化阶段、更成熟的细胞类型。本发明的方法还可适用于在植入前不需要进一步分化的功能细胞类型。
在又一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的哺乳动物细胞用于预防、治疗或治愈疾病如慢性疾病的用途。设想到本发明的哺乳动物细胞和方法可用于治疗众多慢性疾病。还设想到它们可用于预防慢性疾病以及其他疾病。
在一个实施方案中，所述疾病选自糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、干性黄斑变性、色素性视网膜炎、神经系统疾病、帕金森病、心脏病、慢性心力衰竭和慢性肾病。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是动物细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是未分化的细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是干细胞，如人类干细胞、多能细胞，如人类多能细胞，或iPS细胞(诱导多能干细胞)，如人类iPS细胞。
在一个实施方案中，本发明的哺乳动物细胞是未分化的细胞，如干细胞、多能细胞或iPS细胞，其进一步分化成功能细胞类型。
在另一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是分化的细胞。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是衍生自本发明的干细胞、多能细胞或iPS细胞的人类分化细胞。
在本发明的特定实施方案中，所述哺乳动物细胞是选自以下列表的分化细胞。
可以根据以下列表中提及的出版物中所描述的分化方法之一，从本发明的干细胞、多能细胞或iPS细胞衍生出所述分化细胞：
·β细胞，例如INS+和NKX6.1+双阳性细胞或C-肽+/NKX6.1+双阳性细胞、产生胰岛素的细胞、体外衍生的β样细胞、胰腺内分泌细胞或内分泌细胞，如通过WO2017/144695中描述的方法可获得的；
·内分泌祖细胞或NGN3+/NKX2.2+双阳性细胞，如通过专利申请WO2015028614中描述的方法可获得的；
·神经细胞，如神经元、中间神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、多巴胺能细胞，如通过Nolbrant S.等人,Nat.Protoc.2017年9月,12(9):1962-1979；Kirkeby A.等人,Cell Rep.2012年6月28日,1(6):703-14；Aktinson-Dell R.等人,Adv Exp MedBiol.2019,1175:383-405；Ni P.等人,Mol Ther Methods Clin Dev.2019年4月8日,13:414-430中描述的方法可获得的；
·外泌体细胞，如ESC(胚胎干细胞)或NSC(神经元干细胞)，或衍生自ESC或NSC的外泌体细胞，如通过Chen B.Stem Cell Res Ther.2019年5月21日,10(1):142；Sun X.等人,Front Cell Neurosci.2019年9月3日,13:394；Dougherty J.A.等人,FrontPhysiol.2018年12月14日,9:1794；Candelario K.M.等人,J Comp Neurol.2019年11月19日；Yang R.等人,Front Immunol.2019年10月16日,10:2346中描述的方法可获得的；
·免疫细胞，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞，如通过Ackermann M.等人,Nat Commun.2018年11月30日；9(1):5088；Good ML.等人J Vis Exp.2019年10月24日(152)；Zhu H.等人Methods Mol Biol.2019,2048:107-119；Kitadani J.等人,SciRep.2018年3月15日；8(1):4569中描述的方法可获得的；
·肝细胞，如通过Li Z.等人Cell Death Dis.2019年10月10日,10(10):763中描述的方法可获得的；
·星状细胞，如通过Coll M.Cell Stem Cell.2018年7月5日,23(1):101-113中描述的方法可获得的；
·成纤维细胞、角质形成细胞或毛细胞，如通过Miyake T.Int J Radiat OncolBiol Phys.2019年9月1日,105(1):193-205中描述的方法可获得的；
·内耳细胞，如通过Jeong M.等人,Cell Death Dis.2018年9月11日；9(9):922中描述的方法可获得的；
·肠细胞或类器官细胞，如通过Negoro R.等人Stem Cell Reports,2018年12月11日,11(6):1539-1550；Lees EA等人J Vis Exp.2019年5月12日,(147)中描述的方法可获得的；
·类肾细胞或另一种肾相关细胞，如通过Vanslambrouck JM等人J Am SocNephrol.2019年10月,30(10):1811-1823中描述的方法可获得的；
·心肌细胞，如通过Huang CY等人J Mol Cell Cardiol.2019年10月23日,138:1-11中描述的方法可获得的；
·视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞，如通过Ben M’Barek K等人Biomaterials.2019年11月6日:119603中描述的方法可获得的；
·间充质干细胞，如通过Chen KH等人Am J Transl Res.2019年9月15日；11(9):6232-6248中描述的方法可获得的。
在本发明方法的一个实施方案中，当采用分化步骤时，哺乳动物细胞是未分化的细胞，如干细胞、多能细胞或iPS细胞，并且分化成选自以上列表的细胞。
在本发明方法的一个实施方案中，可植入的哺乳动物细胞是选自以上列表的分化细胞。
本发明的非限制性实施方案包括：
1.包含至少B2M/HLA-E基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。
2.根据实施方案1的哺乳动物细胞，其包含B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。
3.根据实施方案1的哺乳动物细胞，其包含B2M/HLA-E*0101基因或B2M/HLA-E*0103基因。
4.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述细胞在不同的已知位置处具有4个或至少4个HSV-TK基因的敲入。
5.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因已被敲入所述哺乳动物细胞的原有B2M序列中。
6.包含B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因。
7.哺乳动物细胞，其中B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103两者均敲入另外的β2微球蛋白(B2M)缺陷型细胞中。
8.根据实施方案6-7中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E*0101和B2M/HLA-E*0103已被直接敲入用于制备所述B2M缺陷型细胞的细胞的原有B2M序列中。
9.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E+细胞表面表型，如HLA-A/B/C-/-HLA-E*0103+和/或HLA-A/B/C-/-HLA-E*0101+细胞表面表型。
10.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E+细胞表面表型，并且在不同的已知位置处包含4个HSV-TK基因的敲入。
11.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E*0101+和HLA-E*0103+细胞表面表型。
12.包含B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因，是CIITA缺陷型的，并且在不同的已知位置处具有4个HSV-TK基因的敲入。
13.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是通用的可移植细胞。
14.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是干细胞或多能细胞。
15.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞选自神经元、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞和β细胞。
16.根据实施方案15的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是β细胞或其前体。
17.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞选自间充质干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞。
18.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，均包含启动子，或者被敲入在处于功能性启动子控制下的基因座中或紧挨启动子处。
19.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E基因的敲入是在原有B2M基因座上，利用了原有B2M启动子(即，在该启动子控制下)。
20.根据实施方案1-19中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因的敲入是在原有B2M基因座上，并且利用非原有B2M启动子(即，在该启动子控制下)。
21.根据实施方案1-19中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因被敲入除原有B2M基因座之外的基因座中，并且利用替代的启动子。
22.根据实施方案1-21中任一项的哺乳动物细胞，其中期望的HLA-E密度经由双等位基因HLA-E敲入来产生。
23.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中未使用HLA-G信号序列肽的优先加载。
24.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E基因不包含预结合的HLA-I前导肽。
25.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E*0101基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的B2M/HLA-E*0101蛋白，或其具有总共1-10个置换、缺失或添加的变体。
26.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述B2M/HLA-E*0103基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:5的B2M/HLA-E*0103蛋白，或其具有总共1-10个置换、缺失或添加的变体。
27.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是HLA-II缺陷型的，如CIITA缺陷型的。
28.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其在不同的已知位置处包含4个或至少4个HSV-TK基因的敲入。
29.根据实施方案28的哺乳动物细胞，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在相隔至少10Kbp，如至少100Kbp、至少1Mbp或至少20Mbp的位置处。
30.根据实施方案28-29中任一项的哺乳动物细胞，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在4个不同染色体上的位置处。
31.根据实施方案28-29中任一项的哺乳动物细胞，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在3个不同染色体上的位置处。
32.根据实施方案28-29中任一项的哺乳动物细胞，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在2个不同染色体上的位置处。
33.根据实施方案28的哺乳动物细胞，其中所述4个HSV-TK基因的表达达到当暴露于更昔洛韦时其中每一个均会单独杀死所述哺乳动物细胞的程度。
34.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中2个或至少2个HSV-TK基因在基因组安全港位点处敲入。
35.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中敲入1个HSV-TK基因以消除B2M等位基因。
36.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，其中敲入1个HSV-TK基因以消除CIITA等位基因。
37.根据实施方案4-36中任一项的哺乳动物细胞，其中所述4个HSV-TK基因在安全港位点，如AAVs1、hROSA、AAVS1、CLYBL或其任意组合处敲入。
38.根据前述实施方案中任一项的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞不是自然杀伤(NK)细胞。
39.制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·任选地使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
40.制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E融合基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
41.制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供哺乳动物细胞，
b)向所述哺乳动物细胞的B2M基因座中敲入B2M/HLA-E基因，由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
42.制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供B2M缺陷型的未分化哺乳动物细胞，
b)向所述B2M缺陷型的未分化哺乳动物细胞中敲入B2M/HLA-E基因，以及
c)使所述未分化细胞分化成功能性分化细胞，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
43.制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供B2M缺陷型哺乳动物细胞，
b)向所述B2M缺陷型哺乳动物细胞中敲入B2M/HLA-E基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
44.根据实施方案39-43中任一项的方法，其进一步包括在不同的已知位置处敲入至少4个HSV-TK基因的步骤。
45.根据实施方案39-44中任一项的方法，其中至少2个HSV-TK基因在安全港基因座处敲入。
46.根据实施方案39-45中任一项的方法，其中4个HSV-TK基因在安全港基因座处敲入。
47.根据实施方案39-46中任一项的方法，其进一步包括灭活所述哺乳动物细胞的原有HLA-II基因或原有CIITA基因的步骤。
48.根据实施方案39-47中任一项的方法，其中所述B2M/HLA-E基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因已被直接敲入用于制备所述B2M缺陷型细胞的细胞的原有B2M序列上。
49.根据实施方案39-48中任一项的方法，其中所述B2M/HLA-E基因包含B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因。
50.根据实施方案39-49中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E*0101+HLA-E*0103+细胞的细胞表面表型。
51.根据实施方案39-50中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
52.根据实施方案39-51中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞或所述可移植的哺乳动物细胞选自神经元、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞和β细胞。
53.根据实施方案39-52中任一项的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物干细胞或多能细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·在不同的已知位置处敲入至少4个HSV-TK基因，
·使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
54.根据实施方案39-53中任一项的方法，其中在分化步骤中，所述哺乳动物细胞分化成β细胞、INS+和NKX6.1+双阳性细胞或C-肽+/NKX6.1+双阳性细胞、产生胰岛素的细胞、体外衍生的β样细胞、胰腺内分泌细胞或内分泌细胞、内分泌祖细胞或NGN3+/NKX2.2+双阳性细胞、神经细胞(如神经元、中间神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、多巴胺能细胞)、外泌体细胞(如ESC或NSC，或衍生自ESC或NSC的外泌体细胞)、免疫细胞(如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞)、肝细胞、星状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或毛细胞、内耳细胞、肠细胞或类器官细胞、类肾细胞或另一种肾脏相关细胞、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞。
55.根据实施方案39-54中任一项的方法，其中所述可植入的哺乳动物细胞选自β细胞、INS+和NKX6.1+双阳性细胞或C-肽+/NKX6.1+双阳性细胞、产生胰岛素的细胞、体外衍生的β样细胞、胰腺内分泌细胞或内分泌细胞、内分泌祖细胞或NGN3+/NKX2.2+双阳性细胞、神经细胞(如神经元、中间神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、多巴胺能细胞)、外泌体细胞(如ESC或NSC，或衍生自ESC或NSC的外泌体细胞)、免疫细胞(如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞)、肝细胞、星状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或毛细胞、内耳细胞、肠细胞或类器官细胞、类肾细胞或另一种肾脏相关细胞、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞。
56.根据实施方案39-55中任一项的方法，其中敲入的B2M/HLA-E基因，如B2M/HLA-E*0101基因和/或B2M/HLA-E*0103基因，均包含启动子，或者其中所述B2M/HLA-E基因被敲入在紧挨启动子处或在处于功能性启动子控制下的基因座中。
57.根据实施方案39-56中任一项的方法，其中所述B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的敲入是在原有B2M基因座上，利用了原有B2M启动子。
58.根据实施方案39-57中任一项的方法，其中所述B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因的敲入是在原有B2M基因座上，利用了替代的非原有B2M启动子。
59.根据实施方案39-58中任一项的方法，其中B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因两者的敲入是除原有B2M基因座之外的基因座中，并且利用替代的启动子或在替代的启动子的控制下。
60.根据实施方案39-59中任一项的方法，其中所述B2M/HLA-E*0101基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的B2M/HLA-E*0101蛋白，或其具有总共1-10个置换、缺失或添加的变体。
61.根据实施方案39-60中任一项的方法，其中所述B2M/HLA-E*0103基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:5的B2M/HLA-E*0103蛋白，或其具有总共1-10个置换、缺失或添加的变体。
62.根据实施方案39-61中任一项的方法，其中期望的HLA-E密度经由双等位基因敲入来产生。
63.根据实施方案39-62中任一项的方法，其中未使用HLA-G信号序列肽的优先加载。
64.根据实施方案39-63中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是CIITA缺陷型。
65.根据实施方案39-64中任一项的方法，其包括灭活功能性HLA-II蛋白的表达的步骤。
66.根据实施方案65的方法，其包括灭活CIITA的步骤。
67.根据实施方案41-66中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：c)在不同的已知位置处敲入4个HSV-TK基因。
68.根据实施方案44-67中任一项的方法，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在相隔至少10Kbp，如至少100Kbp、至少1Mbp或至少20Mbp的位置处。
69.根据实施方案44-68中任一项的方法，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在4个不同染色体上的位置处。
70.根据实施方案44-69中任一项的方法，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在2个不同染色体上的位置处。
71.根据实施方案44-70中任一项的方法，其中仅由所述4个HSV-TK基因之一表达的HSV-TK蛋白足以在暴露于更昔洛韦时杀死所述哺乳动物细胞。
72.根据实施方案44-71中任一项的方法，其中2个或至少2个HSV-TK基因在基因座安全港位点处敲入。
73.根据实施方案44-72中任一项的方法，其中敲入1个HSV-TK基因以消除B2M等位基因。
74.根据实施方案44-73中任一项的方法，其中敲入1个HSV-TK基因以消除CIITA等位基因。
75.根据实施方案39-74中任一项的方法，其中所述敲入和/或基因灭活是使用选自锌指核酸酶(ZFN)、CRISPR、TALEN或腺病毒重组的基因编辑技术进行的。
76.根据实施方案39-75中任一项的方法，其中所述B2M缺陷型哺乳动物细胞是通过敲除原有B2M的两个等位基因而修饰的干细胞。
77.根据实施方案1-38中任一项的哺乳动物细胞用于预防、治疗或治愈慢性疾病的用途。
78.根据实施方案77的用途，其中所述慢性疾病选自糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、干性黄斑变性、色素性视网膜炎、神经系统疾病、帕金森病、心脏病、慢性心力衰竭和慢性肾病。
79.根据实施方案1-38中任一项的哺乳动物细胞，其中一个HSV-TK基因被敲入以消除B2M等位基因，并且另一个HSV-TK基因被敲入以消除CIITA等位基因。
80.制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供B2M缺陷型且CIITA缺陷型的哺乳动物细胞，
·向所述B2M和CIITA缺陷型哺乳动物细胞中敲入B2M/HLA-E基因，如B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因中的一种或两种，
·在不同的已知位置处敲入4个HSV-TK基因，由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
81.实施方案80的方法，其中所述可植入的哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E细胞表面表型。
82.实施方案80-81的方法，其中所述可植入的哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E*0101+HLA-E*0103+细胞的细胞表面表型。
83.根据实施方案80-82中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞、多能细胞或iPS细胞。
84.根据实施方案80-83中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞选自神经元、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞和β细胞。
85.根据实施方案80-84中任一项的方法，其包括使所述哺乳动物细胞分化的步骤。
86.根据实施方案85的方法，其中在分化步骤中，所述哺乳动物细胞分化成β细胞、INS+和NKX6.1+双阳性细胞或C-肽+/NKX6.1+双阳性细胞、产生胰岛素的细胞、体外衍生的β样细胞、胰腺内分泌细胞或内分泌细胞、内分泌祖细胞或NGN3+/NKX2.2+双阳性细胞、神经细胞(如神经元、中间神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、多巴胺能细胞)、外泌体细胞、免疫细胞(如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞)、肝细胞、星状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或毛细胞、内耳细胞、肠细胞或类器官细胞、类肾细胞或另一种肾脏相关细胞、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞。
87.根据实施方案80-84中任一项的方法，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在4个不同染色体上的位置处。
88.根据实施方案80-85中任一项的方法，其中2个HSV-TK基因在基因组安全港位点处敲入。
实施例
实施例1-更昔洛韦试验
描述
将未分化的亲代hESC(人胚胎干细胞)细胞系(WT)、具有2个拷贝的HSV-TK基因的hESC细胞系(2xHSV-TK)和具有4个拷贝的HSV-TK基因的hESC细胞系(4xHSV-TK)涂布到hFN(人纤连蛋白涂层)上。将细胞以60,000个细胞/孔接种到24孔格式的培养皿中，并在DEF-CS培养基中培养过夜。然后将细胞在含有以下5种不同浓度的更昔洛韦(GCV)的DEF-CS培养基中培养7天：0、1、12.5、25、50或100μM。每天更换含有更昔洛韦的DEF-CS培养基。当细胞达到90％汇合时，将细胞在含有更昔洛韦的DEF-CS中按1:2传代。培养7天后，将细胞用DAPI染色并捕获图像。结果图像在图3中示出。
结论
与在基因组中不同位点处只有两个拷贝的HSV-TK的细胞相比，在基因组中不同位点处具有四个拷贝的HSV-TK的细胞对更昔洛韦更敏感。
实施例2-免疫安全细胞生成方案
用总共500ng针对AAVS1的
Figure BDA0003432094000000381
mRNA对(
Figure BDA0003432094000000382
正向靶序列：CTGTCCCCTCCACCCCAC，反向靶序列：TTCTGTCACCAATCCTGT)和500ng供体质粒对人胚胎干细胞(SA121)进行电穿孔，该供体质粒含有在AAVS1中的
Figure BDA0003432094000000383
切割位点侧翼的300bp同源臂、HSV-TK盒和随后的mCherry选择盒。将细胞培养一周，然后使用FACS细胞分选仪对mCherry阳性细胞进行批量分选。将细胞再培养一周，然后用总共500ng针对CLYBL的
Figure BDA0003432094000000384
mRNA对(
Figure BDA0003432094000000385
正向靶序列：CTCAAGTAGGTCTCTTTC，反向靶序列：GAAAGTCTTCTCCTCCAA)和500ng供体质粒对其进行电穿孔，该供体质粒含有在CLYBL中的
Figure BDA0003432094000000386
切割位点侧翼的300bp同源臂、HSV-TK盒和随后的eGFP选择盒。将细胞培养一周，然后使用FACS细胞分选仪对mCherry/eGFP双阳性细胞进行批量分选。将细胞再培养一周，然后用100ng Cre重组酶mRNA对其进行电穿孔，以切下选择盒。mCherry/eGFP双阴性细胞是使用FACS细胞分选仪分选到96孔板中的单细胞，并在其中培养两到四周。使用PCR针对靶向双等位基因整合筛选细胞克隆。
用总共200ng针对B2M的
Figure BDA0003432094000000387
mRNA对(
Figure BDA0003432094000000388
正向靶序列：TCTCGCTCCGTGGCCTT，反向靶序列：AGCCTCCAGGCCAGAAAG)和200ng含有在B2M中的
Figure BDA0003432094000000389
切割位点侧翼的300bp同源臂、B2M-HLAIE01:01融合盒和随后的mCherry选择盒的供体质粒以及200ng含有在B2M中的
Figure BDA00034320940000003810
切割位点侧翼的300bp同源臂、B2M-HLAIE01:03融合盒和随后的eGFP选择盒的供体质粒，对来自上述方案的含有四个HSV-TK拷贝的克隆进行电穿孔。将细胞培养一周，然后使用FACS细胞分选仪对mCherry/eGFP双阳性细胞进行批量分选。将细胞再培养一周，然后用100ng Cre重组酶mRNA进行电穿孔，以切下选择盒。mCherry/eGFP双阴性细胞是使用FACS细胞分选仪分选到96孔板中的单细胞，并在其中培养两到四周。使用PCR针对靶向单等位基因整合筛选细胞克隆。所有电穿孔均使用10uL Neon转染试剂盒按照制造商的说明(
Figure BDA0003432094000000391
#MPK1025，脉冲电压为1100V，脉冲宽度为20，脉冲数为2，4e5个细胞)完成。
在DEF-CS中按照制造商的说明(
Figure BDA0003432094000000392
#Y30017)培养细胞。
Figure IDA0003432095060000011
Figure IDA0003432095060000021
Figure IDA0003432095060000031
Figure IDA0003432095060000041
Figure IDA0003432095060000051
Figure IDA0003432095060000061
Figure IDA0003432095060000071
Figure IDA0003432095060000081
Figure IDA0003432095060000091
Figure IDA0003432095060000101
Figure IDA0003432095060000111
Figure IDA0003432095060000121
Figure IDA0003432095060000131
Figure IDA0003432095060000141
Figure IDA0003432095060000151
Figure IDA0003432095060000161

Claims (15)

1.包含B2M/HLA-E基因的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞不包含其他可表达的B2M基因，并且在不同的已知位置处具有至少4个HSV-TK基因的敲入。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞包含B2M/HLA-E*0101基因和B2M/HLA-E*0103基因。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞选自神经细胞、神经元、中间神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、多巴胺能细胞、外泌体细胞、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞、β细胞、INS+和NKX6.1+双阳性细胞、C-肽+和NKX6.1+双阳性细胞、产生胰岛素的细胞、体外衍生的β样细胞、胰腺内分泌细胞、内分泌细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、肝细胞、星状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、毛细胞、内耳细胞、肠细胞或类器官细胞、类肾细胞和肾相关细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是HLA-II缺陷型的，例如CIITA缺陷型的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的哺乳动物细胞，其中至少2个HSV-TK基因在基因组安全港位点处敲入。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的哺乳动物细胞，其中一个HSV-TK基因在安全港位点处敲入，并且将另一个HSV-TK基因敲入以消除CIITA等位基因。
8.用于制备可植入的哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
·提供哺乳动物细胞，
·向所述哺乳动物细胞中敲入至少B2M/HLA-E基因，
·将所述哺乳动物细胞的原有B2M基因灭活，
·在不同的已知位置处敲入至少4个HSV-TK基因，
·任选地使所述哺乳动物细胞分化，
由此获得所述可植入的哺乳动物细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可植入的哺乳动物细胞具有HLA-A/B/C-/-HLA-E*0101+HLA-E*0103+细胞的细胞表面表型。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自干细胞、多能细胞或iPS细胞、内分泌祖细胞和NGN3+/NKX2.2+双阳性细胞。
11.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述可植入的哺乳动物细胞选自神经细胞、神经元、中间神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、多巴胺能细胞、外泌体细胞、心肌细胞、视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞、β细胞、INS+和NKX6.1+双阳性细胞、C-肽+和NKX6.1+双阳性细胞、产生胰岛素的细胞、体外衍生的β样细胞、胰腺内分泌细胞、内分泌细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、肝细胞、星状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、毛细胞、内耳细胞、肠细胞或类器官细胞、类肾细胞和肾相关细胞。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中4个HSV-TK基因的所述敲入是在2个不同染色体上的位置处。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中至少2个HSV-TK基因在基因组安全港位点处敲入。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的哺乳动物细胞用于预防、治疗或治愈慢性疾病的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述疾病选自糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、干性黄斑变性、色素性视网膜炎、神经系统疾病、帕金森病、心脏病、慢性心力衰竭和慢性肾病。
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Application publication date: 20220208