CN1244772A - 靶向性细胞毒性细胞 - Google Patents

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Abstract

本文公开了表达和分泌免疫毒素的哺乳动物细胞,所说的免疫毒素针对肿瘤、HIV抗原和其他患病的细胞。优选的细胞包括淋巴细胞和神经元。

Description

靶向性细胞毒性细胞
                         发明背景
1.发明领域
本发明总的来说涉及微生物学和免疫治疗学领域。更具体地说涉及抗原-特异性的细胞毒性细胞，这些细胞提供抗体指导的和细胞-介导的免疫。
2.相关技术简述
抗体-和细胞-介导的免疫利用不同的机制抑制肿瘤生长以使宿主免受病毒感染从而保卫宿主。抗体免疫在通过依赖抗体的杀灭细胞从而使病原体失效上特别起作用(Stires等，1994)。T-细胞介导的免疫利用两类T-细胞的子类的作用：辅助T细胞(其通过分泌淋巴因子而介导其效应以激活其它效应细胞)，及细胞毒性T细胞(其通过触发受体-介导的编程性细胞死亡杀灭靶细胞(Berke，1994；Young和Liu，1988)。
已确定肿瘤细胞细胞表面优选表达的增加数量的抗原，如致癌蛋白，及细胞分裂抗原，并且这些在癌治疗中可提供选择性破坏靶细胞的潜在标记(Urban和Schreiber，1992；Pastan和FitzGerald，1991；Boon等，1994)。已研究探讨了肿瘤免疫治疗的两种基本方法：对肿瘤细胞的毒素和溶细胞活性的抗体-指导的导向作用(vitetta等，1987；Waldmann，1991；Dohlsten等，1994)，以及增强与肿瘤的细胞免疫反应(Perez等，1985；Gross等，1989；Goverman等，1990；Rosenberg，1991；Eshhar等，1993；Hwu等，1993)。虽然已显示抗体-指导的免疫治疗在体外及体内均有效地破坏肿瘤，但其在癌治疗中成功利用的主要障碍是抗体或抗体缀合物接近肿瘤块受到限制(Jain，1989；Shockley等，1992；Reithmuller和Johnson，1992)。在这些情况下，由于接近癌细胞受到限制，抗体-指导的-免疫治疗不能完全摧毁所导向的肿瘤。为了使这种免疫治疗获得成功，必须发现一种成功地将抗体或抗体-缀合物传送到肿瘤内部的方法。
已花费大量的精力来刺激或修饰T-淋巴细胞(其通过转导细胞因子基因)或抗体/T-细胞受体以增加细胞抗-肿瘤的活性(Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994)。但是使用这种类型的过继细胞免疫治疗的主要局限性是难以获得特异性细胞毒性淋巴细胞(Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994)。除非可获得特异性细胞毒性淋巴细胞，否则会出现非特异性的细胞毒性并对受治疗者产生不可接受的副作用。
当前利用天然毒素来治疗癌和病毒感染十分有限。植物和细菌产生防御性毒素，它们是能够杀灭哺乳动物细胞的最有力毒素的一部分；即，一个或几个分子足以杀死哺乳动物细胞(Yamaizumi等，1978；Chen等，1995)。例如，植物产生蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，gelonin和皂草素。细菌毒素包括假单胞菌属外毒素A(PEA)与白喉毒素。毒素分子，如PEA，其在胞质溶胶中通过灭活延伸因子-2(EF-2)而阻断蛋白质合成从而杀死细胞(Pastan和FitzGerald，1992)。遗憾的是，由于该毒素的细胞毒性影响不限于特定类型的细胞(如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)，因而非特定的细胞与组织的死亡对受治疗者产生不可接受的副作用或风险，所以这些和其它植物或细菌的毒素在治疗应用上十分有限。此外，目前必须全身注射这些毒素，并且其在血液与体内被迅速清除掉。对于许多治疗用法，例如在转移性肿瘤细胞的治疗中，毒素最好能在系统中仍然保持一段时间，这样它们可″清除″其它治疗方法没有除去的或杀死的靶细胞。
所进行的抗癌和抗病毒疾病的大量研究表明，很明显需要治疗这些致命疾病的新方法。尤其是，能提高对靶细胞的毒性特异性的方法将带来很多优点，所说的细胞尤其是接近受到限制的细胞(如实体肿瘤内部的细胞)，并且该方法允许毒素存在于系统中作为″清除剂″并减少毒副作用和风险。
                     发明概要
本发明旨在通过在免疫毒素治疗领域中提供惊人的提高作用来克服这些局限性，其中可利用受治疗者自己的细胞或其它哺乳动物的细胞来产生和分泌免疫毒素，然后将那些细胞再注入到受治疗者体内以作为靶疾病治疗中的治疗或预防剂。本发明提供了几种与常规免疫毒素疗法相比的改进的方法，其中合成制备免疫毒素，然后注射给受治疗者。与常规制备免疫毒素的方法(如毒素与抗体分子的化学交联)相比，例如，在本发明的实践中通过细胞培养可产生免疫毒素，且可从培养基中通过过滤，离心及层析便利地进行纯化。常规免疫毒素的另一个困难是它们在受治疗者的循环系统中迅速被清除掉，而需要多次施用，这使得很难在血液中保持治疗水平而不产生明显的副作用。相反，在本发明的实践中，只要一次施用产生免疫毒素的细胞，其即可在受治疗者体内存活并在一段时间内产生免疫毒素(几个星期至几个月)。
在许多方面，本发明可被描述为哺乳动物细胞，如细胞毒性-T-淋巴细胞，神经元或其它表达和分泌免疫毒素的哺乳动物细胞。免疫毒素优选地由载体(其包含编码前导序列的核酸序列)编码，它的表达在表达的毒素损害亲本或宿主细胞之前，可指导免疫毒素以分泌泡的形式分泌到细胞外。一旦分泌了免疫毒素，细胞毒性作用主要限于那些表达免疫毒素抗体组分所识别的抗原的细胞，并且亲本细胞(其通常不表达高水平的抗原)仍然能生存并继续表达免疫毒素。
在本领域中，已知细胞毒性-T-淋巴细胞(杀伤细胞)是细胞免疫反应所涉及的免疫系统的细胞，这种反应具有识别外源抗原并杀死具有该抗原的细胞的能力。例如，在本领域中已知免疫毒素是抗体组分和毒素组分的融合物或缀合物，这样抗体组分或结构域能够识别并特异性地结合在靶细胞上的抗原上，这样指导毒素至特定的细胞类型。如本文所使用的，“表达和分泌”指本发明的细胞毒性-T-细胞或其它哺乳动物细胞含有编码免疫毒素的遗传物质片段，并且通过宿主细胞的翻译机制(即核糖体)将这些遗传物质翻译成多肽免疫毒素产物，并且将免疫毒素运输至宿主细胞外并分泌到胞外基质中。在本发明的实践中，编码免疫毒素的遗传物质可包括DNA载体或RNA载体，或者该物质可掺入到宿主细胞的遗传物质中。
本发明免疫毒素被理解为包含抗体组分和毒素组分，本文例证说明其从单一启动子共表达。然而，本发明的免疫毒素也可以表达为从不同的启动子表达的两个或多个mRNA信使，然后其翻译产物在细胞中或分泌过程期间或之后装配。在某些实施方案中，免疫毒素的抗体结构域可包含抗-肿瘤抗体的结构域，或者在另一些实施方案中它包含抗-病毒抗体的结构域，或者在本发明的其它实施方案中它包含T-辅助细胞的特异性子类的抗-T-辅细胞抗体的结构域。例如，免疫毒素可以与HER2抗原，Lym-1抗原，生长因子或激素受体，或已知在肿瘤细胞中被超量表达的任何其它抗原发生免疫反应。抗-病毒免疫毒素可与HIV抗原进行免疫反应，诸如gpl20抗原或流感病毒，疱疹病毒，Epstein-Barr病毒或任何已知的病毒抗原。在另一实施方案中，抗-T辅助细胞免疫毒素可与T-辅细胞(其牵涉自身免疫疾病)的特异性子类发生免疫反应。用于本发明实践的优选毒素包括(但不限于)假单胞菌属外毒素，如假单胞菌属外毒素A，蓖麻毒蛋白A，白喉毒素，或其具有细胞毒性和转运活性的部分，相思豆毒蛋白，gelonin，皂草素或可获得编码基因的任何其它毒素。
在许多方面，本发明可以包括哺乳动物细胞，如表达和分泌免疫毒素的细胞毒性-T-淋巴细胞或神经元，其中这些细胞分散于药学上可接受载液中。该溶液适于肌肉内或静脉内注射，或者适于吸入或本领域已知的其它施用方法。″药学上可接受″是指当施用至动物或人时，组合物不产生过敏性或类似的副反应，并且其包括(但不限于)任何和所有溶剂，介质，等渗剂及类似物。本领域熟知将这些基质和药剂用于药学活性物质。除了任何常规介质或药剂与活化组分不可兼容外，预期它们可用于治疗组合物中。也可将辅助活性组分掺入到组合物中。
在另一方面，本发明可被描述为被载体转染的动物细胞，淋巴细胞，细胞毒性淋巴细胞，及神经元，这样该载体包含有效连接在启动子上的核酸序列，编码一个或多个核糖体结合位点及融合蛋白(其包含前导序列和免疫毒素)的核酸序列，以及所有真核基因表达所必需的基因信号(如聚腺苷酸化位点)。在本发明的该实施方案中，前导序列指导载体表达的免疫毒素转移至淋巴细胞的内质网中。因此人们认为前导序列在免疫毒素的毒素组分表达之前即被表达，优选由启动子在第一编码区表达。载体可以是本领域已知的任何合适的表达载体(其被插入了前导序列与免疫毒素基因)，也可以是质粒，病毒载体如腺病毒，逆转录病毒，或腺病毒相关载体，粘粒或本领域已知的其它类型的载体。此外，所述载体可包含与脂质体或脂质复合物相缔合的裸露DNA或RNA分子，或者可以通过本领域已知的受体介导基因转移法，电穿孔法或其它机械，电气或化学方法将所述载体引入至细胞内。上述载体表达的免疫毒素可与肿瘤相关抗原(如HER2或Lym-l抗原)或病毒相关抗原(如HIV抗原或HIVgp120抗原)或T-辅细胞的子类相关抗原发生免疫反应。在某些实施方案中，当细胞分散在例如上述药学上可接受的载体中时，宿主动物细胞或淋巴细胞可包含药理组合物。
本发明在许多方面可被描述为杀灭肿瘤细胞的方法，该方法包括使肿瘤细胞与动物细胞(如细胞毒性-T-细胞及神经元)所分泌的免疫毒素相接触，其中免疫毒素的抗体部分识别肿瘤细胞的抗原。优选地，肿瘤细胞超量表达HER-2或Lym-1相关抗原，或其它肿瘤相关抗原，并且肿瘤细胞是B细胞淋巴瘤，乳房瘤，卵巢瘤，胃瘤或脑肿瘤的细胞，或其它已知的与正常细胞相比超量表达表面抗原的肿瘤细胞。在某些优选的实施方案中，肿瘤细胞在动物受治疗者中，优选为人受治疗者，或干脆是人癌患者，将这些动物细胞以药物组合物的形式施用给受治疗者。本发明在许多方面也可被描述为抑制受治疗者体内肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞生长的方法，其包括将表达抗-肿瘤细胞免疫毒素的细胞毒性-T-细胞施用至受治疗者体内。
神经元或其它脑细胞表达并分泌本文所描述的免疫毒素。该实施方案的融合蛋白包含肽信号序列，抗体结构域，及细胞毒素组分，其中抗体结构域可与脑肿瘤细胞相关抗原发生免疫反应，并且脑细胞产生与分泌免疫毒素没有对上述宿主脑细胞产生不利影响。由于能将表达自体固有的免疫毒素的神经元在外科手术除去肿瘤后植入到脑内(例如为了长期表达免疫毒素以消除剩余的肿瘤细胞或转移肿瘤细胞)，因此认为该实施方案特别有效。
在许多方面，本发明也可被描述为杀灭病毒感染的细胞的方法，其包括使该细胞与细胞毒性-T-细胞或其它哺乳动物细胞表达的免疫毒素相接触，其中免疫毒素的抗体部分识别病毒感染的细胞表达的抗原。在该实施方案的实践中，将细胞毒性-T-细胞以药物溶液施用给被病毒感染的动物受治疗者或人受治疗者。在一些方面，本发明可被描述为抑制受治疗者HIV感染的方法，其包括施用药物溶液至受治疗者体内，其中所说的溶液包含表达和分泌抗-HIV免疫毒素的细胞毒性-T-细胞。
在许多方面，本发明也可被描述为杀灭在自身免疫疾病中所牵涉的T-辅细胞的特定物种的方法，并且免疫毒素的抗体部分识别特定类型T-辅细胞表达的抗原。例如，T-辅细胞的特定子类在这些病情下(如风温性关节炎或全身狼疮红斑症)得到超活化。本发明由于只将病症所涉及的细胞作为靶位而无伤于其余的免疫系统，因此它比抑制整个免疫系统的疗法更具优越性。例如，在风湿性关节炎的情况下的另一优点是免疫毒素产生细胞可直接注射到病理位点，如关节内。在该实施方案的实践中，可将细胞毒性淋巴细胞或产生免疫毒素的细胞以药物组合物形式施用至动物受治疗者体内，最优选为人受治疗者(其患有涉及T-辅细胞特定子类的自身免疫疾病)。
本发明也在许多方面被描述为制备重组免疫毒素的方法，其中该方法包含获得经表达载体(其编码前导序列和免疫毒素)转染的哺乳动物细胞的步骤。通过将表达载体导入到哺乳动物细胞内，或用表达载体转染这些细胞，可使细胞表达免疫毒素，并将其分泌至培养基中。在该方法的实践中，免疫毒素前导序列的构建体可由本领域已知的各种启动子来表达，包括CMV启动子或诱导型启动子(若需求)。若细胞在表达免疫毒素有效的条件下培养时，前导序列可指导表达的免疫毒素进入细胞的内质网中或分泌泡内。产生免疫毒素的方法还包括从培养基中分离免疫毒素的步骤。这种方法比化学合成免疫毒素法或细菌细胞(如大肠杆菌)表达免疫毒素法更具各种优点。例如，在连续细胞培养中可获得大量的免疫毒素并且可通过本领域已知的各种方法从培养基中容易地分离出免疫毒素。此外，在细菌中表达哺乳动物的基因经常导致不能溶解的包涵体，其中的蛋白质不能正确折叠并可能是失活的。本发明的优点在于通过标准技术可从培养基中容易地分离出活化的免疫毒素。可包装这些分离的免疫毒素进行商业出售，并且可用于体外应用，或研究，或输入疗法(其中所有细胞均非所需)。
                          附图简述
下列附图构成了本发明叙述的一部分，并进一步说明本发明的特定方面。参考一或多个这些附图并结合本文具体实施方案的详细描述将会更好地理解本发明。
图1.抗-HER2/毒素表达载体的构建示意图。表达载体(pCMV-sFv23e-PE40)含有具有前导信号序列并融合了PEA(ATCC)的PE40序列(结构域II和III)的抗-HER2 sFv23e基因(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)，它们都在CMV启动子的控制之下。在重组体逆转录病毒穿梭载体(LNCX-sFve23/PE40)中，sFve23/PE40基因由内部的CMV启动子驱动，新霉素抗性(neo)基因由LTR驱动。
图2.所分泌的sFv23e-PE40融合毒素的ADP-核糖基化活性。如以前所述(Collier和Kandel，1971；Chen等，1995)，收获MOLT-sFv23e-PE40和MOLT-对照的培养基并进行ADP-核糖基化试验。如以前所述(Collier和Kandel，1971)，用尿素使纯化的PEA蛋白质变性，然后进行ADP-核糖基化试验。在减去背景水平后，用重复测定进行所示样品的平均闪烁计数。阴影柱表明所示浓度下的PEA活性。空白柱表明：Molt-4对照培养基；MOLT-sFv23e-PE40(sFv23e-PE40-1)的培养基；MOLT-sFv23e-PE40的培养基(sFv23e-PE40-2)(其通过Amicon滤器得以浓缩)。
图3A.将超量表达HER2的肿瘤细胞(SKOV-3，N-87)及低表达HER2(或没达到检测水平)的对照细胞系(MCF-7和NIH3T3)接种在96孔的平板(1×105/ml)上。培养24小时后，添加0.3ml Molt-sFv23e-PE40(1和2个克隆)或Molt-对照细胞(5×105/ml)至平板的每孔中，并继续共培养62小时。然后通过台盼蓝染色(Chen等，1995)除去共培养中的死细胞，通过肿瘤细胞减去Molt-对照细胞在共培养中死亡细胞的百分比(3％)，然后再显示所选的细胞的杀灭百分比。
图3B.添加指定浓度的亲本23e抗体至Molt-sFv23e-PE40和SKOV3肿瘤细胞的共培养物中(1个克隆)，所呈现的细胞毒性抑制作用的百分比。
图4A.将肿瘤细胞(N87)(5×106)皮下注射进无胸腺/Nu小鼠的侧部，并让其生长16天。计数细胞数量后，用PBS洗涤Molt-sFv23e-PE40或Molt-对照细胞并再次悬浮在培养基中。将具有肿瘤异常移植物的小鼠随机分成两组：第1天对处理组(7只小鼠)施用Molt-sFv23e-PE40(0.2ml1×107)，对照组(5只小鼠)施用Molt-对照细胞(0.2ml 1×107)，然后每周注射一次直到第六周。每隔三至五天卡钳测量肿瘤直径，并由下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(宽度)2×长度/2(Osborne等，1985)。已显示了处理组(实线连接，方形)，及对照组(点线连接，实心菱形)的平均肿瘤体积。如Manova检验所评估的，处理和对照组的生长曲线的区别为统计学上显著(P＝0.009)。
图4B.显示如图4A所述的处理组(实心菱形)和对照组(实心方形))的存活率。
图5.抗-gp120/毒素表达载体的示意图。为了产生HIV-1-特异杀伤细胞，利用中和人类单克隆的抗体(105)(其可识别被HIV-1感染的细胞表面上表达的HIV-1 gp120的CD4-结合位点)。将编码PEA的结构域II(用于穿过膜双分子层的转运)和结构域III(用于EF-2的腺苷二磷酸(ADP)-核糖基化)的基因(PE40)融合到F105的k链基因上。所产生的双顺反子载体(pCMV-Fab105-PE40)含有在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的Fd链(VH+CHI)，及内部核糖体进入位点(IRES)以及K-PE40嵌合基因(其之前为前导信号序列)。在LNCX-Fab105-PE40重组逆转录病毒穿梭载体中，Fab105/PE40嵌合基因由内部CMV启动子表达，Neo基因由LTR表达。该构建体是通过限制酶消化而鉴定的，并通过DNA序列分析得以确认。
图6A.所分泌的Fab105-PE40融合蛋白的抗原结合活性(由ELISA检测)。在Jurkat-Fab105-PE40的基质中检测到HIV-1 gp120的阳性结合活性，而在Jurkat-对照基质中没有检测到任何明显结合活性。实心柱是：Jurkat-Fab105-PE40(Fab105-PE40)的培养基；Jurkat-对照(Jurkat)培养基。空心柱：标明浓度的纯化F105抗体(O.8-0.1μg/ml)与HIV-1 gp120的阳性结合活性。
图6 B.所分泌的Fab105-PE40的ADP-核糖基化活性(DPM)。将Jurkat-Fab105和Jurkat-对照细胞的培养基进行ADP-核糖基化试验。实心柱是：Jurkat-Fab105-PE40(Fab 105-PE40-1)的培养基；Jurkat-Fab105-PE40(Fab105-PE40-2)培养基(通过Amlcon过滤使其浓缩)；Jurkat-对照(Jurkat)的培养基。空心柱：所分泌的Fab105-PE40的ADP-核糖基化活性(通过表明浓度的纯化PEA(每反应5-40ng)所测量的值)。
图7A.在体外通过转导淋巴细胞对HIV-1感染细胞的选择性细胞毒性。用实验室毒株HIV-1病毒(IIIB)和两种主要受治疗者分离物(INME和TPO)感染亲本Jurkat细胞，每隔三至四天测量反转录酶(RT)活性，直到RT活性达到平台。然后将HIV-1-感染的Jurkat细胞放置在12孔Costar-Transwell滤器组织培养平板的顶部腔室中，并将Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-对照细胞以比率1∶1(HIV-感染的细胞：Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-对照细胞)(空心柱)和比率1∶10(实心柱)放置在底部腔室中。顶端腔室中的HIV-1-感染细胞经过72小时的共培养，然后计算存活的细胞数量，通过比较与Jurkat-对照共培养的感染细胞的存活细胞数量，来阐述与Jurkat-Fab105-PE40共培养的感染细胞的杀灭细胞百分比以表明其存活细胞数量情况。
图7B.转导的LAK细胞的选择性细胞杀灭。通过在培养基(其补充了riL-2和PHA)培育外周血液淋巴细胞可产生人LAK细胞。通过将LAK细胞与转染的包装细胞系(PA317)共培养24小时，可将Fab105-PE40基因转导到LAK细胞中，接着扩大培养几天。将所转导的LAK细胞与来自实验室毒株HIV-1(IIIB)的HIV-感染细胞，以及两个主要病系株(INME和TPO)共培养72小时，如上述表示细胞杀灭百分比。空心柱：比率1∶1(HIV-感染细胞：转导或拟转导的LAK细胞)。实心柱：比率1∶10(HIV-感染细胞：转导或拟转导的LAK细胞)。
图7C.抑制HIV-1感染的动力学。将被主要HIV-1分离物(WEAU)感染的亲本Jurkat细胞与Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-对照细胞以1∶1，1∶5和1∶10的比率进行共培养。培养后每三至四天监测共培养物中的RT活性。
                说明性实施方案的描述
本发明提供了一种新型细胞毒性细胞，其集合了抗体的特异性，毒素的强毒性，及淋巴细胞效应细胞特性，如归巢和组织穿入作用，这样均给抗体-指导的和细胞-介导的免疫治疗提供了优点。细胞毒性淋巴细胞不仅识别靶，而且可产生有效的分子以主要的不依赖组织相容性(MHC)的方式杀死靶细胞。此外，所描述的细胞不因产生免疫毒素而具有副作用。惊人地是，细胞毒性淋巴细胞不仅能存活而且似乎不以任何方式被削弱。
本发明也被描述为能表达和分泌免疫毒素的细胞毒性细胞，其中所说的免疫毒素包含前导序列信号序列和免疫学活性抗体结构域和细胞毒素，其中所说的结构域可识别靶细胞特异的抗原。本发明的细胞所产生的免疫毒素对靶细胞与组织具有高特异性，这样没有发现非靶细胞或组织的任何非特异性的毒性相互作用。细胞能产生免疫毒素分子至一段较长的时间，多达三个月或更长。
本发明的分泌免疫毒素的细胞的另一方面是为了患者的安全，该细胞可用阴性选择标记来标记。通过将标记基因掺入到用来转导细胞的重组载体中，如两个串联拷贝的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)(其提供在鸟嘌磷存在下的阴性选择(Ishibashi等，1993)))，可选择地消灭所转导细胞(如果必要)。这使得万一有不利副作用，临床医师也可选择性地消灭分泌免疫毒素的细胞。
这种新型细胞毒性的细胞(其能产生和分泌新靶毒素蛋白)是根据毒素的蛋白质运输和细胞杀灭机理来设计的。毒素分子(如假单胞菌属外毒素(PEA))可阻止细胞蛋白质合成，并通过在胞质溶胶中使延伸因子-2(EF-2)失活从而杀死细胞(Vitetta等，1987；Waldmann，1991；Dohlsten等，1994；Yamaizuni等，1978；Hwang等，1987；Siegall等，1989；Pastan等，1992)，这表明毒素分子定位于了胞质溶胶以便杀死细胞。本发明利用该性质，通过遗传修饰细胞以利用前导信号序列产生和分泌靶毒素(Walter和Lingappa，1986)。然后，新合成的靶毒素转运至内质网(ER)腔中然后分泌到细胞外。由于在胞质溶胶中ER与分泌泡的膜脂双层阻止了所合成的融合毒素与EF-2相互作用，因此表达毒素的细胞应该仍然能存活。分泌的靶毒素在进入并释放到胞质溶胶后选择地结合和消灭靶细胞(Vitetta等，1987；Waldmann，1991；Dohlsten等，1994；Yamaizumi等，1978；Hwang等，1987；Siegall等，1989；Pastan等，1992)。然而，分泌的毒素不能杀死表达毒素的细胞，由于该细胞缺乏细胞表面上的靶抗原。遗传修饰的细胞对靶细胞具有有力的和选择性的细胞毒性，表明该方法能广泛应用于病毒感染，癌和自身免疫疾病的治疗。
本发明的方法可用于治疗病毒感染的治疗应用，尤其是HIV-1感染，其中转导的淋巴细胞可在淋巴组织和器官以及HIV-1感染的主要库中归巢并分泌抗-HIV/毒素(Pantaleo等，1993；Embretson等，1993)。这样，局部所产生的较高水平的靶毒素与全身施用抗体/毒素蛋白质(Chaudhary等，1988)相比能更有效地中和无细胞的毒粒，并消灭HIV-感染的细胞。因为抗体确定了在肿瘤细胞表面上选择地表达的抗原数量增多(Pastan和FitzGerald，1992；Walter和Lingappa，1986；Waldmann，1991)，所以本发明的方法也可以用来选择性地摧毁其它靶，如肿瘤。例如，转导的细胞毒性细胞所分泌的靶毒素可识别和消灭乳房癌细胞。
本发明的某些实施方案可用于自身免疫疾病和反应的治疗，如风湿性关节炎。这种类型的疾病经常因T-辅细胞的特定子类的超活化而恶化。本发明提供了通过指导免疫毒素只对那些细胞起作用的特异性抑制有毒T-细胞的方法。因为靶免疫毒素将不影响受治疗者其它的免疫应答机制部分(包括其它不与该抗体发生交叉-反应T辅助细胞的子类)，所以该方法比治疗自身免疫疾病的抑制整个免疫系统的疗法具有优势。在该实施方案的实践中，可从受治疗者体内分离T-辅细胞的毒性物种，并且利用本领域已知的制备抗体的标准技术使其产生识别T-辅细胞子类的特异抗原的抗体。然后如本文所述利用该抗体产生免疫毒素载体，并用该载体来转导淋巴细胞(如分泌对T辅助细胞的免疫毒素)。为了更好地定靶于疾病位点，所转导细胞可直接输注在炎症位置，如关节。总之，这类新型抗原特异性细胞毒性的细胞和融合蛋白(其具有抗体指导的和细胞-介导的免疫治疗特性)可广泛应用于治疗病毒感染，癌和自身免疫疾病和反应。
如本文所示，发现所转导的细胞毒性细胞在体外和体内均对靶癌细胞具有有力的和选择性的细胞毒性。除了集合了抗体的特异性及毒素分子的毒性和淋巴细胞的效应-细胞-性质之外，这些细胞还显示在体内具特异性抗-肿瘤的活性而没有明显非特异毒性。由于TILs再注入后可在体外迅速增生并扩散再循环然后定位在肿瘤位点上(Perez等，1985；Gross等，1990；Goverman等，1990；Rosenberg，1991；Eshhar等，1993；Hwu等，1993；Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994；Bolhuis等，1991；Topalian等，1989；Barth等，1990)，本发明的一个方面是肿瘤渗透淋巴细胞(TILs)或其它淋巴细胞的利用。所转导的TILs的归巢肿瘤特点使得它们不仅可充当向肿瘤组织传送抗体/毒素的载体，还可在肿瘤组织内充当靶毒素生产者。尤其适合于那种几乎不可能检测到但可被这些靶的毒性细胞选择性消灭(当再输入到受治疗者体内，以作免疫监视时)的肿瘤微转移块。免疫毒素
免疫毒素技术是相当先进的技术，其为抗体研究领域的技术人员所熟知。免疫毒素是具有与另一药剂相连接的抗体组分的试剂，尤其是与细胞毒性或以其它方式抗细胞的药剂(其能杀死或抑制细胞的生长或细胞分裂)相连接。典型的抗细胞剂包括化疗剂和放射性同位素及细胞毒素。化疗剂的例子是激素如类固醇；代谢拮抗物如胞嘧啶戊糖苷，氟尿嘧啶，氨甲蝶呤或氨基蝶呤；anthracycline；丝裂霉素C；长春花生物碱；脱乙酰甲基秋水仙硷；依托泊苷；光神霉素；或抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。
优选的免疫毒素通常包括来源于植物，霉菌或细菌的毒素，如链毒素，核糖体失活蛋白质，α-次黄嘌呤，曲霉素，局限曲霉素，核糖核酸酶诸如胎盘的核糖核酸酶，血管生成素，白喉毒素或假单胞菌属外毒素，皂草素，gelonin，或相思豆毒蛋白(所论及的仅仅是一些例子)。细胞毒素与抗体在淋巴细胞或其它哺乳动物细胞中遗传上共表达是本发明的一个重要部分。因此，优选利用的毒素是那些已知编码基因，并可通过分子生物学的标准技术将其插入到表达载体中的毒素。本文实践中所述的任何这种毒素包括在所要求的发明的精神和范围内。
例如，现在已克隆并表达了一种生物活性蓖麻毒蛋白A链(o′Hare等，1987；Lamb等，1985；Halling等，1985)，因此可将蓖麻毒蛋白A，或更小的或其它方式的变体肽(其仍具有适当的毒素活性)用于本发明的实践中。此外，现在已克隆蓖麻毒蛋白A链的事实使得可应用定点诱变，通过这些诱变易于制备，并筛选A链的衍生肽，并且获得与本发明有关的另外的有用组分。单克隆抗体的制备
在本领域大家熟知制备和鉴定抗体的方法(参见，例如，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988；本文一并参考)。
通常按照制备多克隆抗体的相同线路开始产生单克隆抗体(MAb)。简言之，依据本发明，多克隆抗体是通过用免疫原性组合物(如特异性T-辅细胞的物种)免疫动物(根据所使用的抗原组合物和方案，或进行预先免疫耐受化或不进行)，并从该免疫动物中收集抗血清。各式各样的动物物种均可用于产生抗血清。用于产生抗血清的典型动物是兔，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠或小羊。由于兔的血液量比较大，因此优选兔来制备多克隆抗体。
如本领域所熟知的，给定的组合物的免疫原性可以变化。因此经常需要促进宿主的免疫系统，其可通过使载体偶连肽或多肽免疫原来达到目的。典型和优选的载体是锁眼帽贝血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它清蛋白如卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白可用作为载体。本领域熟知用以使载体蛋白质连结多肽的方法，其包括戊二醛，m-马来酰苯甲酰基-N-羟基琥珀酸胺酯，碳二亚胺和二-重氮化联苯胺。
如本领域所熟知的，特定免疫原组合物的免疫原性可利用免疫应答的非特异刺激物(称为佐剂)得以提高。典型和优选的佐剂包括完全费氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌的免疫应答的非特异刺激质)，不完全费氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于制备多克隆抗体的免疫原组合物的量取决于免疫原的性质及用于免疫的动物。各种途径可用来施用免疫原(皮下，肌内，真皮内，静脉内和腹膜内)。通过免疫后在不同时间取免疫动物的血液可监控多克隆抗体的产生。也可再进行一次助推器注射。重复促进和滴度检验的过程直到达到合适的滴度。当达到所需的免疫原性水平时，可使免疫动物流血，分离血清并存储和/或将动物用来产生MAb。
利用大家熟知的技术易于制备MAb，如美国专利4,196,265(本文一并参考)，所述技术。典型地，该技术涉及用所选择的免疫原组合物对合适的动物种进行免疫处理，例如，纯化的或部分纯化的T-辅细胞表面蛋白质，多肽或肽或任何其它所需的抗原组合物。以刺激产生抗体细胞的有效方式施用组合物免疫。啮齿动物如小鼠和大鼠是优选动物，然而，也可利用兔子或绵羊细胞。利用大鼠具有一定的优点(Goding，1986，pp.60-61)，但是优选小鼠，BALB/c小鼠更优选，这是常规利用的并且通常给出高百分比的稳定融合蛋白。
免疫后，可选择具有产生抗体能力的体细胞(尤其是B淋巴细胞(B细胞))用于MAb生产方案。这些细胞可从活组织脾，扁桃体或淋巴结以及外周血液样品中获得。优选脾细胞和外周血液细胞，因为前者是产生抗体的细胞(其在分裂成浆细胞阶段)的丰富来源，而后者因为外周血液容易获得。通常，将一组动物进行免疫处理，移走具有最高抗体滴度的动物脾，并通过用注射器使脾匀化获得淋巴细胞。典型地，一只免疫小鼠的脾含有大约5×107-2×108个淋巴细胞。
然后使来自免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与无限增殖的骨髓细胞(其通常是与所说免疫动物相同物种的一种)相融合。适宜用于产生杂交瘤融合方法(优选为非-抗体-产生性的)的骨髓瘤细胞系具有高融合效率及酶缺陷性，这种酶缺陷性使得它不能在一定选择性基质(其只支持所需融合细胞(杂交瘤)的生长)中生长。
如本领域技术人员所熟知的，可利用许多骨髓瘤细胞中的任何一种(Goding，pp.65-66，1986；Campbell，pp.75-83，1984)。引用)。例如，其中免疫动物是小鼠时，可利用P3-X63/Ag8，X63/Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可利用R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210；U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6均可用于与人细胞融合的有关事项中。
优选的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称P3-NS-1-Ag4-1)，其可通过细胞系保藏号GM3573从NIGMS人基因突变体细胞保藏处获得。另一个可利用的小鼠骨髓瘤细胞系是抗8-氮鸟嘌呤的小鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。
通常用于制备产生抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂种的方法包括在一种或多种药剂(化学剂或电方法)(其能促进细胞膜的融合)的存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例相混合，但比例可在约20∶1至约1∶1的范围内变化。利用仙台病毒的融合方法见Kohier和Milstein的描述(1975，1976)，利用聚乙烯乙二醇(PEG)(如37％(v/v)PEG)的方法见Gefter等的描述(1977)。也适于利用电刺激引起融合(Goding pp.71-74，1986)。
融合方法通常以低频产生的存活杂种，约1×10-6至1×10-8。然而，通过在选择培养基中培养将存活的融合杂种与亲本未融合的细胞(尤其是继续无限分裂的未融合的骨髓瘤细胞)区分开，因此这不成问题。选择培养基通常含有阻止组织培养基中从头合成核苷酸的药剂。典型和优选的药剂是氨基蝶呤，氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤均阻止嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅仅阻止嘌呤合成。若利用氨基蝶呤或氨甲蝶呤，则给基质补充次黄嘌呤和胸苷以作为核苷酸来源(HAT基质)。若利用重氮丝氨酸，则给基质补充次黄嘌呤。
优选的选择培养基是HAT。仅仅能启动核苷酸补救途径的细胞才能在HAT基质中生存。骨髓瘤细胞缺损补救途径的关键酶，例如，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，因此它们不能生存。B细胞可以启动该途径，但它们在培养中生活范围有限，通常大约两周之内死去。因此，在选择培养基中唯一存活的细胞是那些由骨髓瘤和B细胞所形成的杂种。
该培养提供一群杂交瘤，从中可选择特定的杂交瘤。典型地，通过在微量滴定板用单克隆稀释液培养细胞，接着检验每个克隆上清液的所需反应性(大约两至三周后)来选择杂交瘤。这种检验分析应该灵敏，简单和迅速，如放射免疫测定，酶免疫测定，细胞毒性试验，噬斑试验，点免疫结合试验，等。
然后连续稀释所选择的杂交瘤并克隆到产生抗体的细胞系的个体中，这些克隆可无限繁殖并提供MAb。以两种基本方法可使该细胞系用于产生MAb。可将杂交瘤的样品注射到(经常为腹腔内注射)常用来提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞的一类组织兼容性动物体内。所注射的动物产生分泌特异单克隆抗体(其由融合的杂交细胞而产生)的肿瘤。穿刺放液处理动物的体液(如血清或流动的腹水)则可提供高浓度的MAb。也可体外培养单个细胞系，这时Mab自然分泌到培养基(从中易于获得高浓度的Mab)中。利用过滤，离心和各种层析方法如HPLC或亲和性层析，可对任何方法所产生的Mab进行进一步纯化(如果需要)。免疫测定
用于本发明实践的免疫测定包括(但不限于)美国专利4,367,110(双单克隆抗体夹心化验)美国专利4,452,901(Wester印迹)所描述的。其它测定法包括在体内和体外的配体标记免疫沉淀法和免疫细胞化学法。
免疫测定，最简单和直接地说就是结合分析。优选的免疫测定是各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)，以及其它本领域已知的固体支持物的免疫测定。最优选的见Doellgast等(1993，1994)和美国专利4,668,621所描述的。利用组织段和放射免疫测定(RIA)的免疫组织化学测定法也特别有用。然而，更好的是这些检测不限于这些技术，也可利用Western印迹，斑点印迹，FAGS分析，等。
在一个典型的ELISA中，本发明的抗体(即将用于免疫毒素的产生的那些抗体)固定化在挑选的具有蛋白质亲和性的表面上，如聚苯乙烯微滴定板的小孔。然后，往孔中添加可能含有靶抗原的生物样品(其可以自身连接可检测的标记)。在结合后，进行洗涤以除去非特异结合的免疫复合物，并检测结合抗原的量。
此外，借助于二级结合配体(其对初级抗体具有结合亲和性)可检测第一次添加的组分(其成为初级免疫复合物内的结合物)。在这些情况下，二级结合配体可与检测标记相连接。二级结合配体经常本身就是抗体，可称为″次级″抗体。在有效的条件下，将初级免疫复合物与标记的次级结合配体或抗体相接触至一段足以形成次级免疫复合物的时间。然后通常进行洗涤以除去非特异结合的标记的次级抗体或配体，然后检测在次级免疫复合物中所余下的标记。这种类型的ELISA是简单的″夹心ELISA″。
其它方法包括用两步操作来检测初级免疫复合物。二级结合配体如抗体(其对初级抗体具有结合亲和性)可用来形成次级免疫复合物，如上述。在洗涤后，再一次在有效的条件下将次级免疫复合物与三级结合配体或抗体(其对二级抗体具有结合亲和性)相接触至一段足以形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时间。三级配体或抗体可与检测标记相连接，这使得可检测所形成的三级免疫复合物。如果需要，该系统可使信号扩增。
在另一个典型的ELISA中，怀疑包含靶抗原的样品固定化在小孔表面上，然后与本发明的抗体或免疫毒素相接触。结合后，进行洗涤除去非特异结合的免疫复合物，并检测结合抗原。若初始抗体与可检测标记相连接，则可直接检测免疫复合物。再一次利用二级抗体(其对一级免疫毒素抗体具有结合亲和性)检测免疫复合物，并且该二级抗体与可检测标记相连接。
另一种ELISA(其中蛋白质或肽被固定化)包括利用检测中的抗体竞争。在这种ELISA中，将标记的抗体添加至小孔中，使其结合，并且借助它们的标记来进行检测。在用涂布壁的孔中进行温育之前或期间使样品与标记抗体相混合，从而检测未知样品中的靶抗原的量。样品中靶抗原的存在使得减少了免疫毒素抗体与孔结合的量，这样减少了最终的信号。
不管使用何种形式，ELISA具有一定的共同特性，如涂布，温育或结合，洗涤以除去非特异性结合的物种，以及检测结合免疫复合物。这些见下述：
在抗原或抗体涂布平板时，人们通常以抗原或抗体的溶液温育(或过夜或规定的几小时)平板的小孔。然后洗涤平板的小孔以除去未完全吸附的材料。然后利用非特异性蛋白质(其对于所检验的抗血清是抗原中性的)涂布任何小孔的余下的有效表面。这些蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白以及奶粉溶液。涂布可阻断固定化表面的非特异吸附位点，并且这样减少由抗血清非特异结合在表面上所造成的背景影响。
在ELISA中，通常利用次级或三级检测方法而非直接的方法。这样，在蛋白质或抗体结合到小孔(其涂上一层非反应性物质以减少背景影响)上后，进行洗涤以除去未结合的材料，并在利于形成免疫复合物(抗原/抗体)方式的条件下，使固定化表面与被检验的对照抗原和/或生物样品相接触。然后免疫复合物的检测需要标记的次级结合配体或抗体，或与标记的三级抗体或三级结合配体协力作用的次级结合配体或抗体。
“在利于形成免疫复合物(抗原/抗体)方式的条件下”包括用溶液如BSA，牛微克球蛋白(BGG)和磷酸缓冲盐水(PBS)/Tween稀释抗原与抗体。这些添加剂有助于减少非特异的背景影响。″合适的″条件是指在使得可以有效结合的温度下温育至足以充分结合的时间。典型的温育步骤约1-2-4小时，温度优选为25℃-27℃的顺序，或在约4℃下过夜。
在所有ELISA的温育步骤之后，洗涤该接触表面以除去非复合的物质。优选的洗涤方法包括用溶液如PBS/Tween，或硼酸盐缓冲液进行洗涤。检验样品与原来的结合物质所形成的特异性免疫复合物后，接着进行洗涤，甚至能检测微量免疫复合物的存在。
为了提供检测方法，二级或三级抗体将与检测标记相连接。优选酶，其通过用适当的显色底物进行温育可产生颜色。这样，例如，需要在利于形成进一步的免疫复合物的条件下，使一级或二级免疫复合物与缀合了脲酶，葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶或氢过氧化物酶的抗体相接触并温育至一段时间(如室温下在含PBS的溶液如PBS-Tween中温育2小时)。
在用标记抗体温育之后，随后进行洗涤以除去未结合的物质，定量分析标记的量，如在过氧化物酶作为酶标记的情况下通过用显色底物如尿素和溴甲酚紫或2，2′-吖嗪-二-(3-乙基-苯二氢噻唑-6-硫酸[ABTS]和H2O2。然后通过测量颜色产生的程度进行定量分析，例如，利用可视频谱分光光度计。启动子和增强子
在哺乳动物细胞中，控制编码蛋白质的基因的转录的启动子与增强子由若干的遗传元件组成。细胞机制能够收集并整合每个元件所传达的调节信息，这使得不同基因进化不同的且经常为复合物模式的转录调节。
本文所说的术语启动子是指一组转录控制模块，它们聚集在RNA聚合酶II的起始位点周围。许多关于启动子如何组织的思想都来自对几个病毒启动子的分析，其包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位。这些研究(最近工作更加验证了)表明启动子由不连续的功能模块组成，每个大约由7-20bp DNA组成，并包含一个或多个转录激活蛋白质的识别位点。每个启动子中至少一个组件具有RNA合成的起始位点位置的作用。最好的已知例子是TATA盒，但是一些启动子缺乏TATA盒，如哺乳动物末端脱氧核苷酸基转移酶基因的启动子以及SV40晚期基因的启动子，重叠在细胞起始位点的不连续元件利于固定起始处。
另外的启动子元件调节转录起始频率。典型地，这些位于起始位点的上游区30-110bp，虽然近来表明一些启动子也含有起始位点下游区的功能元件。元件之间的间距是可变的，这样若元件倒转或相互之间相对移动，启动子功能仍得以维持。在tk启动子中，元件之间的间距最多可增至50bp远而活性未降低。取决于启动子，每个元件可协同作用或独立作用以激活转录。
最初发现增强子是增强位于同一DNA分子的远距离位置的启动子的转录遗传元件。原核转录调节的经典研究几乎没有这种远距离作用的先例。后来的工作表明具有增强子活性的DNA区可组织得象启动子一样。即，它们由许多单个元件组成，每个元件结合了一个或多个转录蛋白。增强子和启动子之间的基本区别是操作上的差异。作为一个整体的增强子区必须能在远距离刺激转录；而这对启动子区或其组分是不必要的。另一方面，启动子必须有一个或多个元件，其能在特殊位点以一定的方向指导RNA合成的起始，而增强子缺乏这些特性。除了这些操作差异，增强子和启动子是十分类似的实体。它们具有在细胞中激活转录的相同的一般性功能。它们经常重叠并邻接，而且似乎具有十分类似模结构。综合来说，这些事项暗示增强子和启动子是同源的实体，并且结合至这些序列上的转录激活物蛋白可以以基本相同的方式与细胞转录机制相互作用。
下列是可用来与免疫毒素构建体相组合的病毒启动子，细胞启动子/增强子以及诱导型启动子/增强子。此外，在基因治疗方案中也可利用任何启动子/增强子组合(AS PER真核启动子数据库EPDB)来驱动免疫毒素融合基因的表达。
                                   表1
  增强子 参考文献
  免疫球蛋白重链 Hanerji等，1983；Gilles等，1983；Grosschedl和Baltimore，1985；Atchinson和Ferry，1986，1987；Imler等，1987；Weinberger等，1988；Kiledjian等，1988；Porton等，1990
  免疫球蛋白轻链 Queen和Baltimore，1983；Picard和Schaffner，1984
  T-细胞受体 Luria等，1987，Winoto和Baltimore，1989；Redondo等，1990
  HLA DQa和DQβ Sullivan和Peterlin，1987
  β-干扰素 Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn和Maniatis，1985
  白细胞介素-2 Greene等，1989
  白细胞介素-2受体 Greene等，1989；Lin等，1990
  MHC类型II5 Koch等，1989
  MHC类型II HIA-DRa Sherman等，1989
  β-肌动蛋白 Kawamoto等，1988；Ng等，1989
  肌肉肌酸激酶 Jaynes等，1988；Horlick和Benfieid，1989；Johnson等，1989a
  前白蛋白(甲状腺运载蛋白) Costa等，1988
  弹性硬蛋白酶I Omitz等，1987
  金属硫蛋白 Karin等，1987；Culotta和Hamer，1989
  胶原酶 Pinkert等，1987；Angel等，1987
  清蛋白基因 Pinkert等，1987，Tronche等，1989，1990
  a-胎儿蛋白 Godbout等，1988；Campere和Tiighman，1989
  t-珠蛋白 Bodine和Ley，1987；Perez-Stable和Constantini，1990
  β-珠蛋白 Trudel和Constantini，1987
  e-fos Cohenetal.，1987
  c-HA-ras Triesman，1986；Descharnps等，1985
  胰岛素 Edlund等，1985
  神经元粘着分子(NCAM) Hirsch等，1990
  a1-抗胰蛋白酶   Latimer等，1990
  H2B(TH2B)组蛋白   Hwang等，1990
  小鼠或I类胶原   Ripe等，1989
  葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)   Chang等，1989
  大鼠生长激素   Larsen等，1986
  人血清淀粉A(SAA)   Edbrooke等，1989
  肌钙蛋白I(TNI)   Yutzey等，1989
  来源于血小板的生长因子   Peeh等，1989
  杜兴氏肌损伤   Klamut等，1990
  SV40   Banerji等，1981；Moreau等，1981；Sleigh和Lockett，1985；Firak和Subramanian，1986；Herr和Clarke，1986；Imbra和Karin，1986；Kadesch和Berg，1986；Wang和Calame，1986；Ondek等，1987；Kuhl等，1987 Schaffner等，1988
  多形瘤   Swartzendruber和Lehman，1975；Vasseur等，1980；Katinka等，1980，1981；Tyndell等，1981；Dandolo等，1983；deVilliers等，1984；Hen等，1986；Satake等，1988；Campbell和Villarreal，1988
  逆转录病毒   Kriegler和Botchan，1982，1983；Levinson等，1982；Kriegier等，1983，1984a，b，1988；Bosze等，1986；Miksicek等，1986；Celander和Haseltine，1987；Thiesen等，1988；Celander等，1988；Chol等，1988；Reisman和Rotter，1989
  乳瘤病毒   Campo等，1983；Lusky等，1983；Spandidos和Wilkie，1983；Spalholz等，1985；Lusky和Botchan，1986；Gripe等，1987；Gloss等，1987；Hiroehika等，1987，Stephens和Hentschel，1987；Glue等，1988
  乙型肝炎病毒   Bulla和Siddiqui，1986；Jameel和Siddiqui，1986；Shaul和Ben-Levy，1987；Spandau和Lee，1988；Vannice和Levinson，1988
  人免疫缺损病毒   Muesing等，1987；Hauber和Cullan，1988；Jakobovits等，1988；Feng和Holland，1988；Takebe等，1988；Rowen等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp和Marciniak，1989；Braddock等，1989
  巨细胞病毒   Weber等，1984；Boshart等，1985；Foecking和Hofstetter，1986
  长臂猿白血病病毒   Holbrook等，1987；Quinn等，1989
                    表2
  元件   诱导物   参考文献
  MT II 佛波醇酯(TFA)重金属 Palmiter等，1982；Haslinger和Karin，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等，1987；Karin，1987；Angel等，1987b；McNeall等，1989
  MMTV(小鼠乳房肿瘤病毒) 糖皮质激素 Huang等，1981；Lee等，1981；Majors和Varmus，1983；Chandler等，1983；Lee等1984；Fonta等，1985；Sakai等，1986
  β-干扰素 poly(rI)Xpoly(rc) Tavernier等，1983
  腺病毒5 E2 Ela Imperiale和Nevins，1984
  胶原酶 佛波醇酯(TPA) Angle等，1987a
  基质溶素 佛波醇酯(TPA) Angle等，1987b
  SV40 佛波醇酯(TFA) Angle等，1987b
 鼠MX基因 干扰素，新城疫病毒
  GRP78基因 A23187 Resendez等，1988
  a-2-巨球蛋白 IL-6 Kunz等，1989
  波形蛋白 血清 Rittling等，1989
  MHC I型基因H-2kb 干扰素 Blanar等，1989
  HSP70 Ela，SV40大T抗原 Taylor等，1989；Taylor和Kingston，1990a，b
  增殖蛋白 佛波醇酯-TPA Mordacq和Linter，1989
  肿瘤坏死因子 FMA Hensel等，1989
  甲状腺刺激激素基因 甲状腺激素 Chatterjee等，1989
启动子和增强子的利用
在本领域中人们认为，要使编码序列置于启动子的控制下，则需将蛋白质的转录阅读框的转录起始位点，端放置在所选择启动子的″下游″约1至约50个核苷酸处。此外，若进行真核表达，其通常需要结合成包含协同转运蛋白蛋白质和适当的聚腺苷酸化位点(如5′-AATAAA-3′)的转录单位(如果这些不包含在原来的克隆节段内的话)。典型地，聚A附加位点位于转录终止位置之前的蛋白质终止位点″下游″约30至2000核苷酸处。重组载体
对于在哺乳动物细胞中的应用，表达载体的控制功能经常由病毒物质提供。例如，一般利用的启动子来自巨细胞病毒(CMV)，多形肿瘤，腺病毒2，以及最常见的猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为易从病毒中获得其含有SV40病毒复制起点的片段(Fiers等，1978)。如果其包含从HindIII位点至BglI位点(其位于病毒的复制起点处)约250bp的序列，也可利用较小或较大的SV40片段。此外，可以(也是经常需要的)利用通常与所需基因序列相联合的启动子或控制序列，只要这些控制序列与宿主细胞系统可兼容。
复制起点可通过载体构建来提供，以便包含外源起点(如来自CMV，SV40或其它病毒(例如多形肿瘤，腺，VSV，BPV)来源的)，或由宿主细胞染色体复制机制来提供。如果载体整合在宿主细胞染色体上，后者经常足够。表达载体的构建
使编码PEA 253-613(ATCC)氨基酸的DNA片段在阅读框中与抗-HIV-1gp120人单克隆抗体F105的K基因相融合。先构建包含Fd-IRES-K-F105的双顺反子表达载体(Chen等，1994)，并用来构建表达载体pCMV-Fab105-PE40(图.5)。所形成的双顺反子表达载体(pCMV-Fab105-PE40)含有CMV启动子控制下的FdF105基因/内部核糖体进入位点(IRES)序列/k105-PE40融合基因。用限制酶消化来鉴定该表达载体，并由DNA序列分析进行确认。
在该表达载体中，在CMV启动子控制下转录单条mRNA，从单条mRNA分别翻译出两种基因产物。第一个Fd105基因的翻译以帽依赖性方式的，第二个K-PE40融合基因以非帽依赖帽性方式在IRES的控制下进行翻译。载体构建的详情如下。利用IRES构建Fab105的双顺反子表达载体
利用两个独立CMV启动子，可在Fab105表达载体中共表达Fab105片段的重链和轻链(Chen等，1994)。进一步修饰具有两个独立CMV启动子序列的Fab105表达盒的共表达载体，以使其包括一个内部核糖体进入位点(IRES)序列。在逆转录病毒和其它载体中已利用来源于EMCV的IRES使两个或多个基因得到有效的共表达。在这种类型的表达载体中，单一mRNA在上游启动子的控制下进行转录，从单条mRNA分别翻译出两种基因产物。第一个基因的翻译以帽依赖性方式，第二个基因以非帽依赖性方式在IRES的控制进行翻译。
如下由利用两个相同CMV启动子的表达载体来构建利用内部核糖体进入位点(IRES)序列的双顺反子Fab105表达载体：利用引物(具有附加NheI克隆位点的5′-TTTGCTAGCGGTATTATCATCGTG-3′引物(SEQ ID NO：1)；具有附加NotI位点的5′-TTTGCGGCCGCGAATTAAT TCCGGTTA-3′引物(SEQ IDNO：2))，由pCITE-2a质粒(Novogen，Madison，WI)PCRTM扩增来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。用琼脂糖胶纯化IRES DNA片段，约515bp，然后用NheI/NotI切割。
为了将单个NheI克隆位点引入到具有IRES的双顺反子表达载体中，由来自杂交瘤的cDNA PCRTM扩增人单克隆中和抗体2.1H(其抗HIV-1 gp120的CD4-结合位点)的轻入链片段，并测序(Bagley等，分子免疫学，31：1149-1160，1994)。然后用NheI/Xbal切割2.1H的轻链片段并进行凝胶纯化。通过连接三个片段，将NheI/Xbal切割的2.1H轻链和NotI/NheI切割的IRES DNA片段克隆到NotI/Xbal切割的pCMV-Fab105内。通过DNA测序鉴定并确认所产生的构建体pCMV-FI105-IRES-2.1H，其含有F105的Fd，IRES，以及巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的2.1H轻链序列。然后用NheI和Xbal消化pCMV-Fd105-IRES-2.1H质粒，并从琼脂糖胶中回收载体DNA片段。利用引物5′-GGTTGCTAGCATGGAAACCCCAGCGCAG-3′(SEQ ID NO：3)5’-AAAATCTAGATTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3′(SEQ ID NO：4)，由pCMV-Fab105进行PCRTM扩增F105的k链DNA片段。用NheI和Xbal消化所扩增的k链片段，约760bp，并进行琼脂糖胶纯化。然后将NheI/Xbal切割的pCMV-Fd105-IRES-2.1H与-K DNA片段连接在一起，并转导到宿主大肠杆菌中。用酶消化鉴定所产生的双顺反子表达载体pCMV-Fab105-I(其含有CMV启动子控制下的Fd/IRES/K基因)，并用于进一步的研究。Fab105-PE40融合蛋白的双顺反子表达载体的构建
从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的PEA基因含有三个功能性结构域：结构域I，细胞-识别域；结构域II，转移结构域(氨基酸(aa)残基253-404)；以及结构域III，催化结构域(405-613的aa)(Pastan和FitzGerald，科学254：1173-1177，1942)。从质粒pJH8(ATCC)上切割下包含编码PEA的253-613氨基酸的序列的BglII-EcoRI片段，并克隆到pSP72载体(Stratagene)(pSP-PE40)。为了将NotI位点整合到该片段上，利用对应PEA氨基酸253-258的具有附加NotI位点的引物5′-TTGCGGCCGCGAAAGGCGG CAGCCTGGCCGCG-3′(SEQ ID NO：5)以及对应氨基酸330-324的反向引物5′-GCGGATCGCTTCGCCCAGGT-3′(SEQ ID NO：6)来扩增氨基酸253-330，然后用NotI/SalI切割所扩增的DNA。从pSP-PE40载体上切割下包含PEA氨基酸308-613序列的Sal I/XbaI-DNA片段，并纯化。然后通过三片段连接，将氨基酸253/308的NotI/SalI片段和编码氨基酸308/613的SalI/Xbal DNA片段克隆到pCMV-sFv23e-S的NotI/Xbal位点上。从pCMV-sFv23e/PE40切割下包含PE40(结构域II和III)序列的NotI/Xbal DNA片段，由pCMV-Fab105-I载体PCRTM扩增k链基因以掺入NheI/NotI位点。通过NheI/NotI-切割的k链/NotI/Xbal切割的PE40/NheI/Xbal切割的pCMV-Fab105-I的三片段连接，构建所形成的Fab105-PE40双顺反子表达载体。通过限制酶消化鉴定载体，并由DNA测序进行确认。放射标记和免疫沉淀
为了瞬时表达，利用脂质转染试剂(Chen和Compans，1991)用20μg质粒DNA pCMV-Fab105-PE40或载体pRc/CMV转染COS细胞，并在转染60-72小时后用200μCi 35S-半胱氨酸放射性标记一段时间。用200μCi 35S-半胱氨酸放射性标记所转导的Jurkat细胞(5×106)一段时间。将培养基和细胞溶胞产物与抗PEA和人类IgG的混合物进行免疫沉淀反应。在还原条件下，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以分析样品(Chen和Compans，1991)，并利用磷光造影(Phosphorimager)(Molecular Dynamic)进行观察。细胞转导和PCRTM扩增
通过电穿孔法用pCMV-Fab105-PE40转染Jurkat细胞(CD4+人T-淋巴细胞)，并且在包含G418(800μg/ml)的培养基中选择两至三周(Chen等，1994)。如所述(Maniatis等，1986)，从细胞中提取基因组DNA。下列低核苷酸用于PCRTM反应：A对：5′-TTATTGCTAGC GTCGACCTTCGCGATGTACGGGCCAG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-GGTACCGAATTCTCTAGAACAAGATTTGGGCTC-3′(SEQ ID NO：8)B对：5′-GGTAGGCCTCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3′(SEQ ID NO：9)和5′-TTTGCTAGCGGTATTATCATCGTG-3′(SEQ ID NO：10)C对：5′-TTTGCGGCCGCGAATTAATTCCGGTTA-3′(SEQ ID NO：)和5′-TTTAAGATCTCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3′(SEQ ID NO：12)D对：5′-TTGAATTCGGAGGTGGCCGGAAGTCACCCTGGCGCGGAGTTC(SEQ ID NO：13)和5′-TTTATCGATTCTAGATTACGGCGGTTTGCCGGGCTG-3′(SEQ ID NO：14)。在琼脂糖凝胶上分析PCRTM产品。酶联免疫吸附测定和ADP-核糖基化测定
如其它地方所描述(Chen等，1994，本文一并参考)在HIV-1 gp120-涂布的平板中完成ELISA。简言之，HIV-1 gp120涂布的平板用来自Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-对照的培养基进行温育，其后进行抗人IgG(西格玛)反应。
如图7A所示，所分泌的Fab105-PE40具有特异性结合HIV-1 gp120的活性。为了进一步确定结合活性，利用其它抗体进行ELISA。用10μg重组HIV-1 gp120涂布Elisa微量滴定板(美国生物技术公司)。用含1％BSA的TBST缓冲液封闭平板。添加Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-对照的培养基至平板上。然后将溶于TBST中的山羊抗人免疫球蛋白(西格玛)或抗PEA(GIBCO BRL)的稀释液(1∶1,000)添加至小孔中，接着加入抗山羊IgG-过氧化物酶缀合物(西格玛)的TBST-1％BSA溶液(稀释度为1∶1,000)。利用抗人IgG或抗PEA检测到在Jurkat-Fab105-PE40培养基中的阳性结合活性；而在Jurkat对照培养基中未检测到任何明显的结合活性。细胞培养和HIV-1感染
为了检查细胞毒性细胞的杀细胞活性，在12孔平板中放置直径12mm、孔径0.40μM的Costar-Transwell滤膜(其可分离细胞，但不分离大分子)(Costar公司，剑桥，MA)，并用于共培养测定。用实验室毒株HIV-1病毒(IIIB)或两种主要的患者的分离物(INME和IPO)(其能感染Jurkat细胞，可从UAB(伯明翰，AL)的Drs.F.Gao和G.Shaw处获得)感染亲本Jurkat细胞。每三至四天测量反转录酶直到RT达到其平台。然后以不同的比率将HIV-1-感染的Jurkat细胞放置在顶腔室中，将Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat对照细胞放置在底腔室中。每日计数在顶端腔室中的HTV-1-感染细胞的存活细胞数量。通过比较与Jurkat对照共培养的存活感染细胞的量，用与Jurkat-Fab105-PE40共培养的存活感染细胞的百分比来表示杀灭活性。为了检查转导细胞对HIV-1 RT产生的效应，利用主要HIV-1分离物(WEAU)感染亲本Jurkat细胞。感染6天后，在受感染的Jurkat细胞培养的培养基中发现高水平的RT活性。然后用PBS洗涤这些感染的细胞，并以5×105/ml的细胞密度悬浮在RPMI-1640基质/10％牛血清中。然后将受感染的Jurkat细胞以几种不同的比率与Jurkat-Fab105-PE40及Jurkat对照相混合。如以前所述(Poiesz等，1980)进行RT试验。构建靶特异性细胞毒性细胞
通过将抗-HER2/毒素表达载体转导到人淋巴细胞内可产生肿瘤特异性细胞毒性细胞。由于在胞质溶胶中ER与分泌泡的膜脂双层结构阻止了EF-2与新近合成的融合毒素的相互作用，因此该基因修饰的细胞仍然能存活并表达和分泌靶抗体/毒素。然后在内化并且释放至靶肿瘤细胞的胞质溶胶中后，所分泌的抗体-毒素融合蛋白即能识别并消灭靶细胞。然而，靶毒素蛋白不杀死在细胞表面上缺乏靶抗原的所转导的表达毒素的细胞。这样，这一新类型的具有抗体指导的和细胞介导的细胞毒性特性的细胞毒性细胞将广泛应用于癌和其它疾病治疗上。
通过将抗-HIVgp120/毒素表达载体转导到人淋巴细胞内可产生HIV-特异性的细胞毒性细胞。该遗传修饰的细胞表达并分泌靶抗体/毒素，其能识别并特异性地杀死靶HIV-1-感染的细胞。该抗原特异性细胞毒性细胞具有靶毒素生产者及载体的作用，这样就结合了抗体指导的和细胞介导的免疫治疗的各优点。靶特异性淋巴细胞的蛋白质合成速率
为了确定在表达抗体/毒素蛋白质的细胞中其细胞蛋白质的合成是否受到阻碍，分别检查Jurkat-Fab105-PE40，Jurkat对照细胞，MOLT-SFv23e-PE40，以及MOLT对照的3H-亮氨酸的掺入速率。用RPMI 1640培养基洗涤Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat对照(0.5×106)，然后悬浮在含有10％FBS的1ml RPMI 1640基质中。添加3H-亮氨酸(ICN药物，公司，1mCi/ml)至培养基中，使其终浓度为4μCi/ml，并在37℃下温育1小时，接着用PBS洗涤三次以除去未掺入的3H-亮氨酸。沉淀后用三氯乙酸(TCA)洗涤，将小球再悬浮在4ml闪烁液体中(ScintiVerse ED，Fisher)，并用闪烁计数器进行计数(LS Beekman)。发现Jurkat-Fab105-PE40和Jurkat-对照细胞的3H-亮氨酸的掺入速率为可比较的水平。靶特异性淋巴细胞的胸苷掺入速率
通过测量胸苷掺入情况检测DNA合成速率。用RPMI-1640洗涤Jurkat-F105-PE40，Jurkat对照细胞，MOLT-F105-PE40或MOLT对照细胞，并以0.5×106ml的密度再悬浮在RPMI-1640/10％FBS中。然后在有或没有PHA(载体实验室)下添加细胞(终浓度为0.8μg/ml)1小时。然后分别添加10μCi的(甲基-3H)-胸苷(ICN药物，公司，1mCi/ml)至每个细胞培养物中，并在37℃下温育12小时。用100μl 0.5％SDS洗涤细胞三次，并将其溶解。然后将所溶解的细胞溶胞产物添加至4ml闪烁液体中，并用闪烁计数器进行计数。Jurkat-F105-PE40或Jurkat对照的3H-胸苷掺入速率没有任何显著性差异。此外，通过台盼蓝排除法检测到两个细胞系均为超过95％的存活率。还发现Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat对照细胞有一条类似的增殖曲线。Jurkat-Fab105-PE40细胞在四个多月观察期内仍然保持存活并正常增殖。
下列实施例旨在说明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员将看到下述实施例所揭示的技术代表了本发明发明人所发明的技术在本发明的实践中很好地起作用，这样可认为它们构成了其实践的优选方式。然而，本领域的技术人员应该(按照本文)能认识到在所述具体实施方案中可作许多改变且仍然得到同样或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
                        实施例1
                  抗肿瘤细胞毒性细胞
下列实施例说明了特异于HER-2的细胞毒性细胞的构建和利用，其中所说的HER-2是表皮生长因子家族的跨膜蛋白质，其在各种人类肿瘤中得以超量表达，如乳房，卵巢，胃以及其它癌(King等，1985；Slamon等，1989；Wen等，1992；Hynes，1993；Muss等，1994)。发现抗HER2单链抗体(sFv)(其包含连接在来自单克隆抗体23e的轻链可变区上的重链可变区)对HER-2的胞外结构域具有高亲合性结合活性，并在结合后能有效地进入其内部(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)。在本研究中，将具有前导信号序列的sFv23e基因在阅读框中与切断的基因(PE40)相融合，该切断的基因在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下编码PEA的结构域II(转移)和III(催化)(氨基酸253-613)(Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994；Gray等，1984；Allured等，1986)。该载体(pCMV-sFv23e-PE40)在哺乳动物细胞中表达并分泌抗-HER2sFv-PE40融合毒素。
合成具有附加信号前导序列(包括HindIII克隆位点)的用于扩增sFv23e基因的正向引物：5′-TTAAGCTTATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCGACGTCCAGCTGACC-3′(F-1)(SEQ ID NO：15)，并利用具有附加NotI克隆位点的反向引物5′-TTTGCGGCCGCGGAGACGGTGACCGTGGT-3′(SEQ ID NO：16)来扩增具有附加前导信号序列的sFv23e基因。然后将具有前导序列片段的sFv23e基因克隆进质粒pRc/CMV(Invitrogen)的HindIII/NotI位点内，则所产生的载体为pCMV-sFv23e-S。从质粒pJH8(ATCC)中切割下含有编码PEA氨基酸(aa)253-613序列的BglII-EcoRI片段，并克隆到pSP72载体中(Stratagene)(pSP-PE40)。为了将NotI位点结合在片段上，利用对应253-263氨基酸并具附加NotI位点的引物(5′-CCCGCGGCCGCGCCGTCGCCGAGGAACTC-3′(F-2)(SEQ IDNO：17)和对应氨基酸330-322的反向引物(5′-GCGGATCGCTTCGCCCAGGT-3′(SEQ ID NO：18)来扩增编码氨基酸253-322的DNA片段，然后用NotI/SalI切割所扩增的DNA。从pSP-PE40载体切割下编码氨基酸322-613的Sal/XbaDNA片段并进行纯化。然后通过三片段连接，将氨基酸253/322的NotI/SalI片段和氨基酸322/613的SalI/Xbal片段克隆到pCMV-sFv23e-S的NotI/XbaI位点内。通过限制酶消化确定所产生的构建体，并由DNA序列分析进行确认。
为了检验哺乳动物细胞是否能产生抗体/毒素融合蛋白，用pCMV-sFv23e-PE40 DNA转染COS细胞，并通过免疫荧光染色进行分析。当该细胞与抗-sFv23e(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)抗体或抗-PEA(Gibco-BRL)抗体一起温育，在转染细胞的胞质中(尤其是核周高尔基区)发现强阳性染色现象时，表明转染的哺乳动物COS细胞高水平地表达抗-HERSsFv/PE40融合蛋白。该染色模式类似于一种典型的分泌蛋白模式(Chen等，1994)。荧光阳性细胞显示了正常形态学，并且转染的细胞超过98％均能存活(这类似于对照细胞)。在仅被载体转染并用抗-sFv23e抗体和-PEA抗体的混合物染色的对照细胞中没有观察到任何明显的染色。
用放射性标记和免疫沉淀分析进一步检查融合蛋白的表达情况。用pCMV-sFv23e-PE40 DNA或对照载体转染COS细胞，60小时后，用35S-光氨酸放射性标记转染细胞4小时(Chen和Compans，1991)。从被抗-sFv23e抗体或抗-PEA抗体转导的细胞的培养基中免疫沉淀出抗体-毒素融合蛋白，约70kd，随后进行SDS-PAGE分析。对照细胞没有发现任何对应的蛋白质带。这些结果确认了哺乳动物细胞能够产生抗体/毒素融合蛋白。
将pCMV-sFv23e-PE40转导到人T-淋巴细胞(Molt-4细胞)内可产生特异于HER-2的细胞毒性细胞，然后进行G418选择(Chen等，1994)。人淋巴细胞表达低水平(几乎不可检测)的HER-2蛋白质(Potter等，1989；Press等，1990)。挑选抗G418的细胞，并亚克隆，进一步分析它们的生物特性与蛋白质表达情况。脉冲追踪放射性标记研究显示转导的细胞产生并分泌了融合蛋白。
用基因组PCRTM分析来检测是否掺入了表达载体基因。从MOLT-sFv23e-PE40和MOLT对照细胞中分离出基因组DNA(Maniatis等，1986)，并进行PCRTM扩增。由转导的MOLT-sFv23e-PE40细胞(而非对照细胞)的基因组DNA特异扩增PEA DNA片段的sFv23e DNA片段(约770bp)，结构域II(约450bp)或结构域III(约610bp)。此外，在MOLT-sFv23e-PE40的培养基中检测到明显的ADP-核糖基化活性，但是在对照细胞的基质中仅检测到背景水平的ADP-核糖基化活性，这表明分泌的融合蛋白具有毒素酶促活性。当与纯化的PEA(Gibco-BRL)的活性相比较时，MOLT-sFv23e-PE40(24小时/1×106细胞/ml)产生了超过0.5μg的PEA蛋白质。
检查MOLT-sFv23e-PE40的几种生物特性。首先，检查MOLT-sFv23e-PE40和MOLT对照细胞的增殖速率和存活力，并没有任何明显的区别。其次，通过3H-胸苷掺入法(有或没有PHA(0.8μg/ml)的刺激)测量，发现MOLT-sFv23e-PE40和MOLT对照细胞的DNA合成速率相似。第三，通过3H-亮氨酸掺入法测量，发现MOLT-sFv23e-PE40和MOLT对照细胞的蛋白质合成速率几乎相同。这样，所转导的MOLT-sFv23e-PE40细胞保持了它们的基本生物学功能。
为了确定转导细胞是否对靶肿瘤细胞具有选择性细胞毒性，进行了共培养研究。将表达不同水平的HER2细胞系与MOLT-sFv23e-PE40和MOLT对照淋巴细胞共培养62小时。在与MOLT-sFv23e-PE40共培养的超量表达HER-2的肿瘤细胞(SKOV-3和N-87)中观察到明显的细胞杀灭力(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993；Kraus等，1987)，而与MOLT-sFv23e-PE40共培养的低水平表达HER-2的肿瘤细胞(MCF-7和NIW3T3)中仅有少量的细胞被杀死(Di Fiore等，1987)(图.3A)。MOLT对照细胞对高水平或低水平表达HER-2的肿瘤细胞均没有任何明显作用。因此，选择性地抑制与MOLT-sFv23e-PE40共培养的超量表达HER2的肿瘤细胞的蛋白质合成。亲本23e抗体也显示其以一定浓度(其大小取决于方法)抑制细胞毒性(图.3B)。总之，这些结果表明所转导的淋巴细胞对靶癌细胞具有选择性的细胞毒性。
通过质粒DNA的转染，可产生转导的淋巴细胞，MOLT-sFv23e-PE40和对照淋巴细胞，随后进行G418选择(Chen等，1994)。如所描述的(Maniatis，1986)，从该细胞系中提取基因组DNA。以下列出了用于PCRTM反应的低核苷酸：
A对：F-1和5′-TTTAAGATCTACAGGAGACGGTGACCGTGG-3′(SEQ ID NO：19)
B对：F-2和5′-TTGCGGCCGCGAAAGGCGGCAGCCTGGCCGCG-3’(SEQ ID NO：5)
C对：5′-GGTACCGAATTCTCTAGAGGCGACGTCAGCTTCAGC-3′(SEQ ID NO：20)和
     5′-TTAATTGCGGCCGCTTACTTCAGGTCCTCGCG-3′(SEQ ID NO：21).
在琼脂糖凝胶上分析PCRTM扩增的DNA片段。
                        实施例2
              抗肿瘤细胞毒性细胞的体外活性
进一步在裸鼠模型中检测实施例1所描述的转导细胞的抗肿瘤活性。利用人胃癌细胞系N87，这种细胞超量表达HER-2蛋白质，并且在裸鼠中作为皮下肿瘤得以充分生长(Batra等，1992；Kaspryzk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)。检查采用的转导细胞对肿瘤组织的浸润能力。通过尾部注射给具有异体移植N87癌的昏迷裸鼠施用MOLT-sFv23e-PE40细胞。48小时后，处死小鼠，制备肿瘤组织的冷冻切片并用抗PEA抗体染色，接着用抗山羊IgG缀合物(西格玛)进行染色。在注射了MOLT-sFv23e-PE40的小鼠的肿瘤组织外周血管区观察到明显的荧光染色现象，而在Molt对照细胞所注射的动物中无此现象。显微镜下没有检测到对正常组织(肝，肺，肾和心脏)明显的细胞毒性。然后检测对肿瘤生长与动物存活的作用。每周对具有异体移植N87肿瘤的小鼠静脉注射Molt-sFv23e-PE40或Molt对照细胞(0.5至1.0×107)，共六周。转导细胞的施用严重地阻碍了异体移植肿瘤的生长(图.4A)。Molt对照细胞所注射的小鼠在70天内全部死去，但是以Molt-sFv23e-PE40注射的小鼠在观察期内均存活(图.4B)。这样，施用转染细胞能很好地阻止肿瘤生长，并延长动物存活时间。
                        实施例3
            重组抗-HIV-1毒素融合蛋白的表达
为了产生HIV-1-特异性的细胞毒性细胞，可利用抗HIV-1 gp120(其在HIV-1-感染细胞的表面上得以表达)(Sodroski等，1986；Lifson等，1986)的CD4-结合位点的人类中和单克隆抗体(F105)(Marasco等，1993；Thali等，1991；Chen等，1994)。将PEA的编码结构域II(用于跨双层膜转运)和结构域III(用于EF-2的腺苷二磷酸(ADP)-核糖基化)的基因(PE40)(Gray等，1984；Allured等，1986；Siegall等，1989)与F105的k链基因相融合(Chen等，1994)。随后，构建一种双顺反子表达载体(pCMV-Fab105-PE40)，其含有Fd链(VH+CH1)，内部核糖体进入位点序列(IRES)，及k-PE40嵌合基因(图.5)。
通过将抗体/毒素表达载体转导进CD4+Jurkat人T-淋巴细胞内产生特异于HIV-1-感染细胞的细胞毒性细胞，接着进行G418选择。选择抗G418的细胞，并亚克隆，利用基因组聚合酶链式反应(PCRTM)来检测Fab105-PE40基因是否掺入到细胞内。如图6A所示，由从转导的Jurkat细胞中分离出的基因组DNA特异性扩增CMV启动子-Fd，Fd-IRES，IRES-k链，以及毒素结构域III DNA片段。用抗人IgG抗体或抗PEA抗体从Jurkat-Fab105-PE40的培养基中免疫沉淀Fd和k-PE40蛋白质，这表明Fd和k-PE40链的两片段共同组合在Fab片段上。这样，存活的所转导的淋巴细胞能产生并分泌抗体-PE40分子至培养基中。
用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检查所分泌的Fab105-PE40的抗原结合活性。在Jurkat-Fab105-PE40的培养基中发现gp120的阳性结合活性，而在Jurkat对照中没有发现任何明显的结合活性。与连续稀释的纯化亲本F105抗体的结合活性相比较(Chen等，1994)，Jurkat-Fab105-PE40(24小时/1×106细胞/ml)产生了约0.6-0.7μg/ml的Fab105-PE40分子。利用ADP-核糖基化分析法检查Fab105-PE40的毒素酶促活性。在Jurkat-Fab105-PE40的培养基中检测到明显的ADP-核糖基化活性，而在对照细胞的基质中仅检测到背景水平的ADP-核糖基化活性。当与纯化的PEA的ADP-核糖基化活性相比较时，Jurkat-Fab105-PE40(24小时/1×106细胞/ml)产生约0.8μg/ml的PEA蛋白质。
检查Jurkat-Fab105-PE40的几种生物学特性。当检查Jurkat-Fab105-PE40和Jurkat对照细胞的增殖速率和存活力时，其区别几乎可忽略。此外，通过3H-胸苷掺入法(有或没有PHA(0.8μg/ml)的刺激)测量，发现Jurkat-Fab105-PE40与Jurkat对照的DNA合成速率相类似。当用3H-亮氨酸掺入法测量时发现Jurkat-Fab105-PE40与Jurkat对照细胞的DNA合成速率几乎相同。这样，所转导的Jurkat-Fab105-PE40细胞保持了它们的基本生物学功能。对HIV-1-感染细胞的选择性细胞毒性
通过利用共培养分析检查对HIV-1-感染细胞的细胞杀灭活性及对病毒逆转录酶(RT)的作用，来评估所转导的Jurkat-Fab 105-PE40细胞对HIV-1-感染细胞的选择性毒性。为了检查细胞毒性细胞的细胞杀灭活性，用HIV-1实验室毒株(IIIB)或分别用两种主要HIV-1分离物(INME和TPO)感染亲本Jurkat T-淋巴细胞，然后将其以几个不同的比率与Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat对照细胞在12孔Costar-Transwell滤膜培养平板中进行共培养。计数顶部腔室中存活的HIV-1-感染的细胞量，图7A显示了非存活细胞的百分比。在被菌株IIIB或主要HIV-1分离物感染的细胞与Jurkat-Fab105-PE40的共培养物中观察到明显的细胞杀灭现象，但Jurkat对照中没有。没有观察到任何对未受感染的亲本Jurkat细胞的副作用。
为了在共培养中进一步观察病毒感染，用HIV-1患者主要分离物(WEAU)感染亲本的Jurkat细胞6天，并用PBS洗涤三次，然后以几种不同的比率与Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-对照细胞进行共培养。每三至四天通过测量病毒的RT活性监控共培养物中的HIV-1感染情况。如图7B所示，整个时期在与Jurkat-Fab105-PE40的共培养物中仅观察到低水平的RT，而在与Jurkat对照的共培养物中检测到明显高水平的RT。当利用增加的Jurkat-Fab105-PE40与靶HIV-1-感染细胞的比例时，观察到对HIV-1感染的更强的抑制作用。没有检测到Jurkat-Fab105-PE40对共培养的未受到HIV-1感染的Jurkat和其它淋巴细胞系有任何作用。这样，Jurkat-Fab105-PE40很有可能通过Fab 105-PE40融合蛋白的选择性细胞毒性与中和活性有效地抑制HIV-感染。
                          实施例4
            特异于B细胞谱系的杀伤细胞的产生
前不久，产生了一种独特的鼠单克隆抗体，Lym-1，其能识别正常和恶性B-细胞的细胞表面上存在的HLA-Dr抗原的多形变体(Epstein等，1987；Hu等，1995)。该抗体Lym-1与正常的B淋巴细胞相比较时，对淋巴瘤细胞具有明显增加的亲合力，尤其对B-细胞具有非凡的特异性。123I-标记的Lym-1放射造影研究例证了淋巴瘤位点的选择性定位以及检测肿瘤位点的能力(Epstein等，1985；1987；DeNardo等，1987；1988a；1988b；Hu等，1989)。组织切片的免疫化学检测及放射造影表明，目前还没有任何Lym-1抗体结合T-细胞或其它正常细胞和组织的迹象(Epstein等，1987)。总之，显示了抗体Lym-1对恶性B-细胞的特异性，并且其可用于B-谱系恶性肿瘤的靶治疗。
为了利用Lym-1抗体特异性的优点，通过转导嵌合基因可产生特异于B-谱系的白血病/淋巴瘤的杀伤细胞。所转导的细胞识别和杀死B-谱系的白血病/淋巴瘤细胞。具体地说，克隆Lym-1抗体的抗体可变区的基因，并装配到单链抗体(sFv)基因上。将sFv-Lym基因在阅读框内融合到PEA的结构域II-III序列内，并克隆到哺乳动物表达载体内。
将具有前导信号肽的sFv-lym/毒素基因转导进人T-淋巴细胞内，可产生特异的细胞毒性T-淋巴细胞，其能产生并分泌sFv-lym/毒素融合蛋白。由ADP-核糖基化分析和流动细胞计数分析可证明所分泌抗体/毒素分子的B-细胞结合活性和毒素催化活性。在体外观察到所转导的细胞毒性细胞对B-细胞白血病/淋巴瘤细胞具有选择性的细胞毒性。该结果显示这种新型的具有一定特异性的细胞毒性细胞可广泛应用于B-谱系恶性肿瘤和其它癌的治疗。抗体/毒素融合蛋白的构建和表达
从美国加利弗尼亚San Diego A.Epstein.教授处获得单克隆抗体Lym-1的cDNA基因(Epstein等，1987)。分别PCRTM扩增VH与VL cDNA基因，然后进行凝胶纯化。然后进行延伸PCRTM以将VH与VL装配到sFv中。所产生的sFv-Lym蛋白质由连接了前导信号多肽序列的抗体Lym-1的轻链及重链可变区组成。来源于ATCC的PEA的基因含有三个功能性结构域：结构域I，细胞识别区；结构域II，转运结构域(氨基酸(aa)残基253-404)；以及结构域III，催化结构域(氨基酸405-613)(Pastan，1992)。
具体地说，用抗体Lym-1的可变区基因作为PCRTM反应的模板，如上述(Chen等，1994)。利用具有附加信号肽前导序列和Hind III克隆位点的VH-Lym正向引物(5′-TTAAGCTTCATATGGAACA TCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3′SEQ ID NO：22(F-1))，及具有附加链间接头序列的反向引物5′-GCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACGTGACCCAGAGT-3′，SEQ ID NO：23，来扩增具有前导信号肽序列的VH基因。利用具有附加链间接头序列的VL-Lym正向引物5′-GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGG6AGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTFCGTGAATGACCCAGTCTCCA-3′SEQ ID NO：24，及具有附加NotI克隆位点的反向引物5′-AAAGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGT-3′SEQ ID NO：25，(F-2)来扩增具有前导信号肽序列的VL基因。然后利用引物F-1与F-2通过延伸PCRTM使PCRTM所扩增的VH和VL DNA片段装配到sFv-Lym中。然后将具有前导序列片段的sFv-Lym克隆进入质粒pRc/CMV(Invivrogen)的HindIII/NotI位点内，所产生的载体命名为pCMV-sFv-Lym。特异于B-谱系白血病/淋巴瘤的细胞毒性细胞的产生
通过转导所融合的抗体/毒素表达载体，产生特异于B-谱系细胞的细胞毒性细胞。基因转移和选择方法如上述(Chen等，1994)。简言之，通过电穿孔法使抗体/毒素表达DNA转染人T-淋巴细胞(如Molt，或SupT)，并在含G418的培养基中进行筛选。两至三周后筛选出抗G418的细胞，并将其亚克隆。为了检测重组蛋白质表达情况，如上述，对所转导细胞进行放射标记并进行免疫沉淀。然后由SDS-PAGE分析样品，并通过磷光造影使其可视。
对所转导的淋巴细胞的基因组DNA进行PCRTM分析以确定抗体/毒素基因是否掺入到所转导的淋巴细胞的基因组内。按照标准方法(Maniatias等，1986)，从所转导的淋巴细胞中提取基因组脱氧核糖核酸。以下列出了用于PCRTM反应的对应sFv-Lym和PEA毒素基因的低核苷酸：A对：引物F-1和5′-TTTAAGATCTACAGGAGAC GGTGACCGTGG-3′(SEQ ID NO：26)；B对：F-2和5′-TTGCGGCCGCGAAAGGCGGCAGCCTGGCCGCG-3’(SEQ ID NO：27)；C对：5′-GGTACCGAATTCTCTAGAGGCGACGTCAGCTTCAGC-3′(SEQ TD NO：28)和
 5′-TTAATTGCGGCCGCTTACTTCAGGTCCTCGCG-3’(SEQ ID NO：29)。琼脂糖胶电泳分析PCRTM产物。已掺入了编码sFv-lym/毒素DNA的淋巴细胞基因组将产生具有PCRTM引物对的三个特异带：约770bp的sFv-Lym DNA片段，约450bp的PEA结构域II以及约610bp的PEA结构域III。
为了检查哺乳动物细胞中抗体/毒素表达情况，进行瞬时表达分析。在盖玻片上培育COS-1细胞，并利用脂质转染试剂将5μg抗体/毒素表达质粒DNA转染到细胞内(Chen和Compans，1992)。温育48小时后，用抗毒素抗体(Gibco-BRL)固定细胞并染色，接着用荧光缀合物处理。在转染细胞中观察到强阳性的荧光染色，而在对照细胞中没有检测到任何明显染色。荧光染色定位在整个胞质与核周高尔基区，这表明是典型的分泌蛋白质染色模式。还证明了表达抗体/毒素蛋白质的转染细胞保持了它们正常的形态学，这表明哺乳动物细胞能够产生抗体/毒素分子，并能存活。所分泌的重组抗体/毒素融合蛋白的结合B-细胞活性和毒素催化活性
为了确定所分泌的抗体/毒素融合蛋白是否保持抗原结合活性。对恶性B-细胞系(如Raji)进行流动细胞计数分析。将Raji细胞(1×106)(ATCC)与不同的连续稀释的抗体/毒素融合蛋白在4℃下温育30分钟，然后在利于进一步形成免疫复合物的条件下(如室温下在含PBS的溶液(如PBS-Tween)中温育2小时)与抗鼠IgG抗体缀合物或抗-PEA抗体接着与标记的抗体缀合物(西格玛)温育一段时间。T-细胞系(如Molt-4，SupT)作为阴性对照。阳性结果表明由淋巴细胞产生的抗体/毒素融合蛋白能结合B-细胞。
                          实施例5
                    由脑细胞产生靶毒素
通过脂质体胶囊化将表达TGF-PE40融合毒素的质粒DNA转染到正常的神经元内，该神经元产生并分泌TGF-PE40融合毒素。在肿瘤异种移植裸鼠模型中，转染一个月后检测到转染的神经元表达了TGF-PE40融合蛋白。
将TGF-PE40质粒DNA转染到组织培养基中和肿瘤异种移植裸鼠模型中的脑肿瘤细胞内。人们发现转染的肿瘤细胞表达TGF-PE40，这导致扩展的细胞毒性使周围的肿瘤细胞死亡，即所转染细胞能够杀死许多周围的肿瘤细胞。这样，可局部利用靶毒素来产生并增强选择性细胞杀灭能力，这对癌和自身免疫疾病的治疗具有广泛意义，尤其是脑癌的治疗。例如，从脑除去肿瘤后，对受治疗者施用该质粒/脂质体至脑内。然后所产生的免疫毒素能寻找并消灭外科手术后残余的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞在它们生长成另一个肿瘤之前不能被其它方式检测到。因此，本发明为脑治疗提供了一种非常有效的治疗法。
                          实施例6
与自身免疫疾病或反应相联系的物种特异性杀伤细胞T-辅细胞的产生
为了转导T淋巴细胞(这样它们可产生能识别与T-辅细胞子类特异性相关的抗原的免疫毒素，其中所说的T-辅细胞与自身免疫疾病或反应(如风湿性关节炎)有相关联，从患者分离出血液样品，大约200cc/每样品。从血液样品中分离出淋巴细胞，并在适当的条件下按照Janda等，临床微生物学手册(第5版，美国微生物学学会，华盛顿，DC，19章，P137)中所述的标准方案(本文一并参考)进行培养；以这种方法，约两周之后从培养物中分离到约1011个淋巴细胞。
如上述转导所分离并培养的淋巴细胞，这样它们将产生并分泌对所需物种的T辅助细胞具有免疫活性的细胞毒素。然后将这些淋巴细胞以药学上可接受的载体再输入，或注射到宿主受治疗者体内，这样输送了约109个淋巴细胞。间隔2周至6个月(或需要)再次施用该剂量。可变化施用所选择的位点以适合治疗情况。例如，在关节炎症风温性关节炎的情况下，优选对关节施用药剂。皮下，肌内，真皮内或其它位点都可以作为施用位点。
                  *          *         *
按照本发明的教导，不须过度地进行实验就可以制造并实施本文所公开的和所要求的所有组合物和方法。虽然以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物与方法，但本领域的技术人员清楚：本文所述的组合物和/或方法均可变化并且方法的步骤或步骤中的顺序均可改变，而不背离本发明的概念、精神及范围。更具体地说，很明显化学和生理学两者上相关联的某些试剂可替代本文所述的试剂，并得到相同或类似的结果。所有本领域技术人员明显知道的类似的替代和修改都被认为在附加权利要求书所限定的本发明的精神，范围以及概念之内。
                        参考文献
下列参考文献以提供例证性的方法和补充说明本文提出的方法的其他细节的程度特别地由本文一并参考。
Allured，Collier，Carroll和Mckay，″在3.0埃图形分辨率下铜绿假单胞菌外毒素A的结构″美国国家科学院院报，83：1320-1324，1986.
Barth，Bock，Mule和Rosenberg，免疫学杂志，144：1531，1990.
Batra，Kasprzyk，Bird，Fasten和King，美国国家科学院院报，89：5867，1992.
Berke，″靶细胞被细胞毒性淋巴细胞的结合和溶解：分子和细胞方面″免疫学年度回顾，12：735-773，1994.
Bird等，科学，242：423，1988.
Bolhuis，Strum和Braakman，癌症免疫和免疫治疗，34：1，1991.
Boon等，免疫学年度回顾，12：337，1994.
Campbell，生物化学和分子生物学技术，单克隆抗体技术，Vol.13，Burden和Von Knippenberg编.pp.75-83，Amsterdam，Elseview，1984.
Chaudhary等，″重组人CD4-假单胞菌属外毒素杂种蛋白质选择性杀伤HIV-感染的细胞″自然，335：369-372，1988.
Chen和Compans，″punta toro病毒糖蛋白的寡聚、传送和golgi保留″病毒学杂志，65：5902-5909，1991.
Chen，Khouri，Bagley和Marasco，″用抗gp120抗体抗人免疫缺陷病毒1型感染的组合胞内和胞外免疫″美国国家科学院院报，91：5932-5936，1994.
Chen，Zani，Khouri和Marasco，″消除毒素免疫原性的遗传免疫毒素的设计″基因治疗，2：116-123，1995.
Collier和Kandel，″白喉毒素的结构和活性″生物化学杂志，246：1496-1503，1971.
DeNardo，DeNardo，O’Grady，Macey，Mills，Epstein，Peng，McGahan，″用I-131 Lym-1单克隆抗体治疗患有B-细胞淋巴瘤的患者″国际生物学杂志。Markers，2：49，1987.
DeNardo，DeNardo，O″Grady，Hu，Systma，Mills，Levy，Macey，Miller，Epstein，″用131I Lym-1单克隆抗体治疗B-细胞恶性肿瘤″国际癌杂志，3：96，1988a.
DeNardo，DeNardo，O’Grady，Levy，Mills，Macey，McGahan，Miller，Epstein，″使用I-131 Lym-1单克隆抗体的放射免疫治疗的引导性研究″抗体免疫结合，放射药物，1：17，1988b.
Di Fiore等，科学，237：178，1987.
Dohlsten等，美国国家科学院院报，91：8945，1994.
Embretson等，″在AIDS潜伏期间辅助T淋巴细胞和巨噬细胞由HIV的大量转换感染，″自然，362：359-362，1993.
Epstein，Zimmer，Spies，Mills，DeNardo，DeNardo，″用放射标记的肿瘤特异性单克隆抗体(Lym-1)放射免疫检测人B-细胞淋巴。恶性淋巴瘤和何杰金氏病″。实验和治疗进展，Cavalli F，Bonadonna G，Rozencweig M，编，Boston：Martin Nijhoff出版社，1985.
Epstein，Marder，Winter，Stathopoulos，Chen，Parker，Taylor，″具有免疫诊断和免疫治疗潜能，与人B-淋巴细胞和衍生性肿瘤具有反应性的两种新的单克隆抗体，Lym-1和Lym-2，″肿瘤研究，47：830，1987.
Eshhar，Waks，Gross和Schindler，″通过由抗体结合结构域和免疫球蛋白的γ和ι亚单位和T-细胞受体组成的嵌合单链特异性激活和导向细胞毒性淋巴细胞，″美国国家科学院院报，90：720-724，1993.
Goding，1986，单克隆抗体：原理和实践，第二版，Orlando，Fla，Academic出版社，1986，pp.60-61，65-66，71-74.
Goverman等，″嵌合免疫球蛋白-T细胞受体蛋白质形成功能性受体：暗示T-细胞受体复合物形成和活化，″细胞，60：929-939，1990.
Gray等，″克隆，铜绿假单胞菌外毒素A结构基因的核苷酸序列和在大肠杆菌中的表达，″美国国家科学院院报，81：2645-2649，1984.
Gross，Waks和Eshhar，″免疫球蛋白-T-细胞受体嵌合分子作为具有抗体类特异性的功能性受体的表达，″美国国家科学院院报，86：10024-10028，1989.
Halling等(1985)核酸研究，13，8019.
Hu等，1989.
Hu等，1995.
Hwang，Fitzgerald，Adhya，Pastan，细胞，48：129，1987.
Hwu等，免疫学杂志，150：4104，1993.
Hynes，癌生物学，4：19，1993.
Ishibashi等，″低密度脂蛋白受体Knockout小鼠中血胆甾醇过多和由腺病毒-介导的基因递送引起的其逆转″临床研究杂志，92：883-893，1993.
Jain，J.Natl.癌症研究，81：570，1989.
Kasprzyk，Song，DiFiore和King，肿瘤研究，52：2771，1992.
Kawakami等，美国国家科学院院报，91：3515，1994.
King，Kraus和Aaronson，科学，229：974，1985.
Kraus等，EMBO J：，6：605，1987.
Lamb等(1985)欧洲生物化学杂志，148，265.
Lifson等，″HTLV-III/LAV包膜糖蛋白诱导CD4-依赖性细胞融合，″自然，323：725-728，1986.
Maniatis，T.，Frirsch，E.F.，Sambrook，J.(编者)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY，1986.
Marasco，Haseltine和Chen，″人抗人免疫缺陷病毒1型gp120单链抗体的设计，胞内表达和活性，″美国国家科学院院报，90：7889-7893，1993.
Muss等，新英格兰医学杂志，330，1260，1994.
O’Hare等(1987)FEES Lett.，210，731.
Osborne，Hobbs和Clark，肿瘤研究，45：584，1985.
Pantaleo等，″在疾病临床晚期，HIV感染是活动性的和进行性的，″自然，362：355-358，1993.
Pastan和FitzGerald，″用于癌症肿瘤的重组毒素，″科学，254：1173-1177，1992.
Pastan，Chaudhary和Fitzgerald，生物化学年评，61：331，1992.
Perez等，″由连接到抗靶细胞抗体上的抗T3特异性导向细胞毒性T细胞，″自然，316：354-356，1985.
Poiesz等，″从鱼和培养的患有皮肤T-细胞淋巴瘤的患者的淋巴细胞检测和分离C型逆转录病毒颗粒，″美国国家科学院院报，77：7415-7419，1980.
Potter等，病理组织学，15：351，1989；出版社，Cordon-Cardo和Slaman，致癌基因，5：953，1990.
Riethmuller和Johnson，Curr.Opin.Immunol.，4：647，1992.
Rosenberg等，新英格兰医学杂志，319：1676，1988.
Rosenberg等，新英格兰医学杂志，323：570，1990.
Rosenberg，肿瘤研究，51(增刊)：5074s，1991.
Shockley等，肿瘤研究，52：357，1992.
Siegall，Chaudhary，FitzGerald和Pastan，″假单胞菌属外毒素的结构域II，Ib和III的功能分析″生物化学杂志，264：14256-14261，1989.
Slamon等，科学，244：707，1989.
Sodroski等，″HTLV-III/LAV包膜在合胞体形成和细胞病理中的作用，″自然，322：470-474，1986.
Stites，D.P.，Terr，A.I.和Parslow，T.G.(编)，免疫学，Appleton&Lange，Nonvalk，Connecticut，8th.pp40-49，(1994).
Thali等，″由广泛反应性中和人单克隆抗体所识别的不连续人免疫缺陷病毒1型包膜的特征，″病毒学杂志，65：6188-6193，1991.
Topalian，Solomon和Rosenberg，免疫学杂志，142：3714，1989.
Urban和Schreiber，免疫学年评.10：617，1992.
Vitetta，Fulton，May，Till和Uhr，″重新设计天然毒素产生抗肿瘤剂，″科学，238：1098-1104，1987.
Waidmann，″诊断和治疗中的单克隆抗体，″科学，252：1657-1662，1991.
Waiter和Lingappa，″蛋白质跨越内质网膜的易位机制，″细胞生物学年评，2：499-516，1986.
Wen等，细胞，69：559，1992.
Yamaizumi，Mekada，Uchida和Okada，″引入到细胞的一种白喉毒素片段A的分子可以杀死细胞，″细胞，15：245-250，1978.
Young和Liu，″淋巴细胞介导的杀伤的多种机制，″当今免疫学，9：140-145，1988.
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  (A)名称：Wake Forest大学
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Claims (41)

1.一种哺乳动物的细胞，其表达和分泌免疫毒素。
2.权利要求1的哺乳动物细胞，其还被限定为细胞毒性淋巴细胞。
3.权利要求1的哺乳动物细胞，其还被限定为神经元。
4.权利要求1的哺乳动物细胞，其中所说的免疫毒素包括抗-肿瘤抗体结构域。
5.权利要求3的哺乳动物细胞，其中所说的抗-肿瘤抗体结构域是与HER2抗原免疫反应性的。
6.权利要求3的哺乳动物细胞，其中所说的抗体结构域是与Lym-1抗原免疫反应性的。
7.权利要求1的哺乳动物细胞，其中所说免疫毒素的抗体结构域是与病毒抗原免疫反应性的。
8.权利要求7的哺乳动物细胞，其中所说的病毒抗原是HIV抗原。
9.一种权利要求2的细胞毒性-T-淋巴细胞，其中所说免疫毒素的抗体结构域是与T-辅细胞免疫反应性的。
10.权利要求1的哺乳动物细胞，其中所说的免疫毒素的毒素是下列物质的一个或多个结构域：假单胞菌属外毒素，白喉毒素，蓖麻毒蛋白A，相思豆毒蛋白，gelonin或皂草素毒素。
11.权利要求1的哺乳动物的细胞，其中所说的免疫毒素包含假单胞菌属外毒素结构域。
12.权利要求1的哺乳动物细胞，其分散于药学上可接受的载液中。
13.一种由表达载体转染了的哺乳动物细胞，其中所说的载体表达包含前导序列和免疫毒素的融合蛋白，而且所说的前导序列指导所说的免疫毒素进入所说细胞的内质网中。
14.权利要求13的细胞，其中所说的载体是质粒。
15.权利要求13的细胞，其中所说的载体是病毒载体。
16.权利要求13的细胞，其中所说的免疫毒素与肿瘤相关抗原发生免疫反应。
17.权利要求13的细胞，其中所说的免疫毒素与病毒相关抗原发生免疫反应。
18.权利要求13的细胞，其中所说的免疫毒素与T-辅细胞相关抗原发生免疫反应。
19.权利要求17的细胞，其中所说的病毒相关抗原是HIV相关抗原。
20.权利要求19的细胞，其中所说的HIV相关抗原是gp120抗原。
21.权利要求16的细胞，其中所说的肿瘤相关抗原是HER2抗原。
22.权利要求16的细胞，其中所说的相关肿瘤抗原是Lym-1抗原。
23.权利要求13的细胞，其还被限定为细胞毒性淋巴细胞。
24.权利要求13的细胞，其还被限定为神经元。
25.一种药理学组合物，其包含分散于药学上可接受的载体中的权利要求13的细胞。
26.一种杀灭癌细胞的方法，该方法包括使所说的癌细胞与哺乳动物分泌的免疫毒素相接触，其中所说免疫毒素的抗体部分识别所说癌细胞的抗原。
27.权利要求26的方法，其中所说的哺乳动物细胞是细胞毒性淋巴细胞。
28.权利要求26的方法，其中所说的癌细胞超量表达HER-2。
29.权利要求26的方法，其中所说的哺乳动物细胞是神经元。
30.权利要求26的方法，其中所说的癌细胞超量表达Lym-1。
31.权利要求28的方法，其中所说的癌细胞是乳房，卵巢或胃癌细胞。
32.权利要求26的方法，其中所说的癌细胞是脑癌细胞。
33.权利要求26的方法，其中所说的癌细胞在动物受治疗者中，而且所说的哺乳动物细胞以药物组合物的形式施用到所说的受治疗者体内。
34.权利要求33的方法，其中所说的受治疗者是人类癌患者。
35.一种杀灭病毒感染的细胞的方法，该方法包括使所说的细胞与细胞毒性-T-细胞表达的免疫毒素相接触，其中所说免疫毒素的抗体部分识别所说的病毒感染的细胞表达的抗原。
36.权利要求35的方法，其中所说的细胞毒性-T-细胞以药物溶液形式施用到具有病毒感染的细胞的动物受治疗者体内。
37.权利要求36的方法，其中所说的受治疗者是人。
38.一种抑制受治疗者HIV感染的方法，该方法包括将药物溶液施用至所说的受治疗者体内，其中所说的溶液包含细胞毒性-T-细胞(其表达并分泌抗-HIV免疫毒素。
39.一种抑制受治疗者肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将表达抗-肿瘤细胞免疫毒素的细胞毒性-T-细胞施用至受治疗者体内。
40.一种制备重组免疫毒素的方法，该方法包括下述步骤：
获得被表达载体转染的哺乳动物细胞，其中所说的载体表达包含前导序列和免疫毒素的融合蛋白，而且其中所说的前导序列指导该免疫毒素进入所说细胞的内质网中；和
在有效表达所说的免疫毒素的条件下培养所说的细胞。
41.权利要求40的方法，该方法还包括分离所说的免疫毒素的步骤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU641392B2 (en) * 1989-04-21 1993-09-23 Protein Design Laboratories, Inc. Recombinant antibody-toxin fusion protein
EP0745134A1 (en) * 1994-02-22 1996-12-04 Danafarber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114026225A (zh) * 2019-06-27 2022-02-08 诺和诺德股份有限公司 安全的免疫隐形细胞

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