CN1217956C

CN1217956C - 可溶性单链t细胞受体蛋白

Info

Publication number: CN1217956C
Application number: CN98811223XA
Authority: CN
Inventors: J·A·魏旦茨; K·F·卡德; H·C·王
Original assignee: Sunol Molecular Corp
Current assignee: Sunol Molecular Corp
Priority date: 1997-10-02
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2018-09-28
Also published as: ATE533784T1; KR100712256B1; CA2305630A1; CA2305630C; AU742650B2; JP2001519143A; EP1019439A1; EP1019439A4; KR20010030846A; AU9586998A; CN1279690A; EP1019439B1; WO1999018129A1

Abstract

本发明描述了完全可溶并有功能的单链T细胞受体蛋白。一方面，本发明涉及含有共价连接于单链T细胞受体上的免疫球蛋白轻链恒定区或其片段的可溶性融合蛋白，其中该单链T细胞受体包含由肽连接序列共价连接的V-α链和V-β链。该单链T细胞受体蛋白具有多种用途，包括可用于筛选能表达目的MHC-肽复合体的细胞。

Description

可溶性单链T细胞受体蛋白

1.发明领域

本发明涉及可溶性单链T细胞受体蛋白，以及制备和应用这些蛋白的方法。这些蛋白用途很多，包括体外筛选能表达所需肽-MHC复合体的细胞。

2.背景

T细胞应答受抗原与T细胞受体(TCR)结合的调节。TCR类型之一为膜结合的异二聚体，由类似免疫球蛋白可变区(V)和恒定区(C)的α链和β链组成。TCRα链包括共价连接的V-α链和C-α链，而β链包括与C-β链共价连接的V-β链。V-α链和V-β链组成一个能结合超抗原或属于主要组织相容性复合体(MHC)(人类为HLA复合体)范畴之抗原的口袋或裂隙。总见Davis，免疫学年鉴3：537(1985)；基础免疫学，第三版，W.Paul编，Rsen出版公司，纽约(1993)。

据信TCR在免疫系统的发育和功能中起重要作用。例如，据报道TCR介导细胞杀伤、增强B细胞增殖、影响各种疾病包括癌症、过敏、病毒感染及自身免疫病的进程和严重性。因此，对获得商用、研究用和医用TCR之方法的开发引起人们极大的兴趣。

一般来说，TCR难以大量分离。其中一个主要的障碍是不含TCR跨膜区的可溶性TCR的产生。更具体地说，据报道如果TCRα链和β链没有参与包括γ、δ、ε和ζ链的CD3复合体的装配，则该蛋白通常被降解。参见如Shin等(1993)科学259：1901。

常常在细菌中尝试生产无跨膜区的可溶性TCR。但细菌性TCR表达常导致形成包涵体如不溶和不正确折叠的分子。很多情况下，由这些方法经困难地蛋白溶解和重新折叠步骤后可获得TCR。这些步骤大大减少了TCR产量并对TCR的稳定性和功能产生负影响。

获得可溶性TCR的进一步尝试集中于设计可溶性更好的TCR分子。例如，将TCR与各种蛋白和多肽序列如磷脂酰肌醇连接序列和CD3链融合。目的常常是在特殊细胞区室中表达TCR以辅助蛋白折叠。表达在细胞表面的TCR融合蛋白常用常规方法切割以获得可溶性TCR。但通常只产生少量能完全可溶并有功能的TCR。参见如Matsui，K等(1991)科学254，1788(1991)；Engel，I.等(1992)科学256，1318；Lin，A.Y.等(1990)科学249，677。

产生可溶性TCR的其它尝试包括合成包含与免疫球蛋白恒定区共价连接的TCR V链在内的TCR异二聚体分子。例如，Gregoire，C.等(1991)PNAS 88，8087报道了包括与κ型轻链C区(Cκ)连接的Cα、Vα序列的TCRαβ链异二聚体的分泌。该文献还公开了VβCβCκ序列。亦参见Weber，S等(1992)自然，356：793。

尽管据报道TCR异二聚体的合成有时可增加可溶性表达，但这些方法有重大缺陷。例如，合成常要求将DNA共转染入特定细胞，这些细胞必须正确装配多蛋白链。这些方法常大大降低功能性异二聚体TCRαβ的产量。

值得注意的是，据报道Cκ链对TCR异二聚体的表达有负影响。例如有人提出，替换Cκ链有时可增加TCR异二聚体的化合价。而且，已公开的包含Cκ区的Vβ嵌合链加工、分泌和/或折叠都十分困难。参见Gregoire等，文献同上；Mariuzza，R.A.和Winter，G.(1989)264：7310；Gascoigne，N.R.J.等，PNAS(USA)(1987)，84：2936。

还有人尝试构建含TCR V区的单链蛋白(即sc-TCR)，以产生完全可溶并有功能的TCR。简而言之，sc-TCR包括融合的V-α和V-β链。参见Novotny，J等，PNAS(USA)88，8646(1991)；Soo Hoo，W.F.等，PNAS(USA)89，4759(1992)；Wulfing，C.和Pluckthun，A.，分子生物学杂志242，655(1994)；Kurucz，I.等，PNAS(USA)90 3830(1993)；PCT WO96/13593；Ward，E.S.等，分子生物学杂志224，885，(1992)；和Schlueter，C.J.等，分子生物学杂志256，859(1996)。

但以上产生sc-TCR的方法常产生不溶性、非正确折叠的分子。例如，已公开的PCT申请WO 96/18105公开了表达sc-TCR的方法，它一般需要有不很方便的蛋白重折叠和溶解步骤。这些方法产生的sc-TCR量常低得出乎人的意料。亦参见Ward，E.S.等，文献同上，及Schlueter，C.J.，文献同上。

关于改进sc-TCR生产已提出了好几个方案。这些方案包括指导蛋白在细胞表面表达及有溶解作用的载体蛋白的应用。参见如，已公开的PCT申请WO 96/18105和WO 96/13593。然而，这些方法产生的sc-TCR常需要耗时的操作以获得哪怕是普通量的蛋白。

有关免疫系统分子的体外和体内相互作用一直吸引人们的极大兴趣。因而十分需要可简便地大量生产可溶并完全有功能的TCR分子。例如，有人提出TCR V区为可有效调节TCR功能的小分子(如TCR拮抗物或激动剂)提供了具有吸引力的靶。因此获得可生产大量可溶并完全有功能的sc-TCR融合蛋白的便利方法比较合乎需要。

发明简述

本发明涉及可溶性单链T细胞受体蛋白，如包括单链T细胞受体与免疫球蛋白轻链恒定区共价连接的融合蛋白。已发现免疫球蛋白轻链恒定区与单链T细胞受体的融合意外地能促进可溶性表达。无需进行困难的溶解、切割或重折叠步骤。即可分离出大量单链T细胞受体蛋白。

本发明的单链T细胞受体(即sc-TCR)蛋白完全有功能并可溶。一方面，sc-TCR蛋白包括共价连接的TCR Vα和Vβ链与免疫球蛋白轻链恒定区(即Ig-C_L)或合适的Ig-C_L片段的融合。另一方面，所提供的sc-TCR不含融合的Ig-C_L链或片段。本发明之sc-TCR融合蛋白有时在本文中称为“sc-TCR融合蛋白”、“可溶性融合蛋白”或类似称呼。可溶性sc-TCR蛋白的表达减少了宿主细胞中不溶颗粒的形成，从而显著提高该蛋白的稳定性和产量，并使纯化更为简易。

sc-TCR融合蛋白通常包括与单链V链共价连接的Ig-C_L链或合适片段。V链包括Vα，β序列，其中V-α链一般与V-β链通过肽连接序列融合。融合产物进一步通过V-α链或V-β链共价连接至Ig-C_L链或合适的Ig-C_L片段上。Ig-C_L链或其片段可与单链V序列有间隔，如被本文所提供的肽连接序列隔开。

通常，Ig-C_L是序列已知的κ-或λ-型免疫球蛋白轻链恒定区。κ-型免疫球蛋白轻链恒定区本文常称为“Cκ链”，而λ-型免疫球蛋白轻链恒定区本文常称为“Cλ链”。例如，Ig-C_L链可为如下所述Cκ链或其合适片段。本发明提供完全可溶并有功能的融合蛋白及获得大量sc-TCR融合蛋白或相同来源并有多种应用的sc-TCR的方法。

部分实例中，sc-TCR无需与Ig-C_L链或其片段融合便完全有功能并可溶。尤其是，我们意外地发现很多sc-TCR分子无需与Ig-C_L链或其片段融合便能表达。本发明因此提供不含融合的Ig-C_L链或其片段的sc-TCR分子以及产生sc-TCR分子的方法。

本发明之sc-TCR蛋白具有很多重要的优点。例如，此前的实践常需要在获得大量蛋白之前对TCR相关蛋白(如TCR受体、TCR异二聚体、sc-TCR)进行大量操作。对比之下，本发明之sc-TCR可大量得到。其中sc-TCR融合蛋白包括对其可溶性、产量和功能具有正影响的融合的Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段。因此对TCR和sc-TCR与诸如小分子(如合成肽、药物等)和抗原呈递细胞(APC)之相互作用的分析可通过应用本发明提供的可溶性融合蛋白而得到促进。而且，有各种各样的sc-TCR融合蛋白可用来与超抗原或APC相互作用，下文将就此作更全面描述。

此外，Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段与sc-TCR的融合为经常规免疫学方法如下文所公开方法检测和纯化融合蛋白提供了一种方便的方法。

还有一些好处是由下文所示编码sc-TCR蛋白的DNA构建体提供的。例如，所提供的一些DNA构建体包含以可开关的盒式编码sc-TCR的DNA区段，另一区段编码所需sc-TCR。DNA构建体可编码与很多TCR Vαβ序列完全相容的融合的Ig-C_L链或Ig-C_L片段，并可在宿主细胞中表达以提供大量的蛋白。本发明因此提供生产研究用、医用或商用充足量的完全可溶并有功能的sc-TCR蛋白的方法。

本发明的sc-TCR蛋白有多种体外和体内用途。

例如，sc-TCR蛋白可体外用于检测和分析配体如肽以及TCR配体的MHC/HLA分子组成。sc-TCR蛋白还可用于诊断如检测有致病性的T细胞。sc-TCR还可用于功能分析、细胞和分子分析、结构分析，包括X射线晶体学、核磁共振成像、计算技术如计算机图象显示。特别兴趣在于那些可很容易适用于鉴定对TCR和MHC复合体之间相互作用有调节能力的小分子的已知技术。相关技术可用于筛选可能阻断TCR和TCR特异性抗体之间相互作用的小分子。特别引起关注的是设计用于体外检测TCR拮抗物的筛选技术。

sc-TCR蛋白还具有重要的体内应用。例如，这些蛋白可用于与致病性T细胞如涉及免疫相关失调或疾病的T细胞竞争；或用于免疫哺乳动物如人类，以抵抗T细胞结构如出现在T细胞表面、造成或辅助其它分子致病或引发其它有害功能的TCR胞外区。尤其是，sc-TCR蛋白可用于按如下述已知免疫学方法产生抗体。这些方法产生的抗体可用于以体内调节免疫应答为目的的治疗方案，如通过抑制或减少识别所指抗原之特异性T细胞数而进行调节。尤其是，可选择特异性结合TCR表位的单克隆抗体，从而可以靶向参与致病的特定T细胞亚组或群，并将其清除或在数量上大大减少。如下文将详述，sc-TCR蛋白或其结合抗体可不经修饰，或若有必要，有时可通过一段肽连接序列与所需分子如药物、毒素、酶或放射性物质共价连接。

本发明之sc-TCR蛋白还可用于体外筛选表达所需肽-MHC复合体的APC。更具体地说，它已用于获得并扩展所选的含所需肽-MHC复合体之APC的好几种方案中。

编码sc-TCR融合蛋白的DNA构建体还可用于按1997年3月7日提交的未决美国专利申请流水号08/813,781(已引入本文作为参考)所述方法制备噬菌体展示库。

sc-TCR蛋白还可用于体外筛选肽文库以检测肽结合序列如潜在的超抗原。

本发明还涉及含有编码目的sc-TCR蛋白之序列的核酸区段(RNA，mRNA，cDNA或基因组DNA)。其中该核酸区段可编码与Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段共价连接的所需sc-TCR。sc-TCR编码核酸可由各种来源获得，包括对可公开获得的TCR和Ig-C_L链DNA序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。核酸区段可以以能在适当的真核或原核细胞表达系统中表达sc-TCR蛋白的DNA载体形式提供。该区段可以包括可操作连接的转录因子如启动子、前导序列、转录起始序列和最适增强子序列，以驱动可溶性sc-TCR蛋白在所需细胞表达系统中表达。或者，DNA载体自身可提供部分或所有控制元件。

编码sc-TCR的核酸区段常经过构建除去了天然TCR控制元件。但有时可能需要用本领域内已知的免疫球蛋白启动子和/或增强子驱动sc-TCR蛋白表达。当可溶性融合蛋白在能进行RNA剪接的某类细胞(通常为哺乳动物细胞)中表达时，由本发明之核酸区段编码的Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段常包含内含子和外显子序列。当需要将sc-TCR融合蛋白表达在原核细胞中时，可去除或大大减小内含子以得到最大表达。如下文详述，各种Ig-C_L链或其合适片段可按所需与sc-TCR分子融合，只要表达的sc-TCR融合蛋白经以下试验测定为完全可溶并具有功能即可。

本发明特别提供编码不含Ig-C_L链或其合适片段之sc-TCR分子的核酸区段和含有该DNA区段的载体。

本发明进一步提供分离本文所公开的可溶性sc-TCR蛋白的方法。这些方法一般包括将目的核酸区段或含有其的载体导入能表达融合蛋白的细胞。含有该区段或载体的宿主细胞均在能支持细胞增殖的培养基中培养。宿主细胞可以是能表达可溶形式的可溶性融合蛋白的真核细胞，优选哺乳动物细胞。但有时可能需要在细菌中表达可溶性融合蛋白。如下文将详述，表达可溶性sc-TCR蛋白的细菌细胞可在慢诱导条件下培养。慢诱导条件一般指培养基中一种必需营养物经几小时被耗竭，从而诱导sc-TCR蛋白可溶性大量表达的细胞培养条件。故在这类实例中需要设计细菌表达载体以便在慢诱导条件下产生最大表达。若有必要，表达在真核或原核细胞中的可溶性sc-TCR蛋白可纯化为相当纯的sc-TCR融合蛋白。

本发明特别提供分离不含融合Ig-C_L链或片段之sc-TCR分子的方法。这些方法一般包括向哺乳动物细胞中导入编码sc-TCR的DNA区段或含有该核酸区段的载体、在适当培养基中在允许sc-TCR表达的条件下培养哺乳动物细胞、从哺乳动物细胞或培养基中纯化sc-TCR以分离sc-TCR受体。

本发明还包括对含有本发明之可溶性sc-TCR蛋白的编码序列的载体或核酸区段进行分离的方法。一般而言，该方法包括将载体或核酸区段导入宿主细胞，优选哺乳动物细胞，培养细胞，自宿主细胞中纯化融合蛋白以获得相当纯的融合蛋白。该载体或核酸区段随后按常规方法分离成很纯的形式。通常，该载体或区段为DNA。

某些实例中，可溶性sc-TCR包括一个或多个融合的效应物或标记(通常一或两个)。其中部分实例中标记可用于协助从通常伴随融合蛋白的天然细胞成分中纯化sc-TCR蛋白。在其它实例中，蛋白标记可用于向可溶性蛋白中导入预定的化学切割位点或蛋白裂解位点。尤其是在DNA载体中，如在可溶性融合蛋白和Ig-C_L链或合适片段之编码序列之间导入一个标记编码片段，从而在有必要时可以将sc-TCR分子与Ig-C_L链或片段切开(即分开)。

本发明特别提供包括效应物的可溶性sc-TCR融合蛋白和不含融合Ig-C_L链或片段的sc-TCR分子，其中效应物为细胞毒素或可检测标记的适于诊断或成像研究的原子或化合物。sc-TCR融合蛋白和sc-TCR分子有多方面应用，包括细胞或组织的体内检测和/或成像，以及细胞的体外或体内损害或杀伤。靶细胞或组织常常包括一个或多个能选择性结合sc-TCR的配体。细胞实例包括肿瘤细胞如黑色素瘤细胞及病毒感染细胞(如，被巨细胞病毒之类的灵长类DNA病毒或AIDS病毒之类的灵长类RNA病毒感染的细胞)。

应用本发明或联合其它方案有可能减小或消除动物如哺乳动物体内不需要的免疫应答。大体上，本发明提供了通过提供包含在药学可接受制剂中的有效量sc-TCR蛋白而减小或消除哺乳动物体内免疫应答的治疗方法。或者，可溶性融合蛋白的sc-TCR部分可应用于治疗方法中。sc-TCR融合蛋白或sc-TCR一般能与一个或多个TCR，尤其是那些与致病性T细胞相关的TCR竞争配体(如抗原)。

本发明还提供增强本文之sc-TCR蛋白的特异性结合亲和力的方法。例如，未决的美国专利申请第08/813,781号公开了制备sc-TCR“突变型蛋白(mutein)”的方法，该“突变型蛋白”对抗原的特异性结合亲和力比相应TCR(即天然含有sc-TCR融合蛋白Vαβ链的TCR)的高约2-10倍。这类方法一般包括用标准的寡核苷酸定向引物诱变sc-TCR分子，以将一或多个预定氨基酸突变导入分子，从而增进特异性结合。所公开的sc-TCR突变型蛋白尤其可用于体外和体内，如参与对涉及不需要之免疫应答的T细胞的抑制或清除。该未决的美国专利申请中公开的方法能方便地适用于按所需增进本文之sc-TCR融合蛋白和sc-TCR分子的特异性结合。

此外，本发明的特点还在于制备与能TCR特异性结合之抗体(多克隆、单克隆或嵌合的)的方法。这类方法常包括用相当纯的sc-TCR蛋白样品作免疫原。有时优选用如sc-TCR分子作免疫原以使对免疫反应性Ig-C_L链或片段的免疫排斥作用减至最小。抗体实例有经常规杂交瘤技术所得单克隆抗体。抗体也可从包含一或多个sc-TCR表位的免疫原性肽生成。这些抗体有多种应用，包括检测生物学样品如血液、血清或组织标本中的致病性T细胞。如曾指出，抗体可通过减少靶T细胞与抗原或MHC/HLA肽复合体的相互作用而在体内或体外显著消除或抑制靶T细胞的活性。在某些设计方案中，经本领域内熟知方法使抗体共价连接适当的细胞毒性、抗代谢或可测性标记将很有帮助。

本发明进一步提供经对哺乳动物施用有效量sc-TCR蛋白或sc-TCR分子，包括由sc-TCR融合蛋白制备的sc-TCR，而诱导哺乳动物，尤其人类这样的灵长类的免疫应答的方法。若用于诱导免疫应答的是sc-TCR融合蛋白，优选Ig-C_L链或片段的单元型与所用宿主相容。利用这些免疫原，就有可能使哺乳动物对出现在T细胞(即靶T细胞)表面并涉及致病性或不需要的免疫应答的TCR抗原性结构产生免疫。这类T细胞可经常规方法鉴别，或有必要还可纯化并分析其增殖能力。鉴别、纯化和分析T细胞的方法如下述。

表现所需增殖应答的T细胞可建立细胞系，从中分离核酸并用于产生sc-TCR融合蛋白。可为靶的目的TCR抗原性结构常包括克隆型(clonotypic)表位、V-α或V-β家族特异性表位、构象表位和线性表位。抗TCR抗原性结构的免疫常抑制T细胞活性，从而减少或清除致病性T细胞或产生不利影响的T细胞。哺乳动物常通过施用免疫有效量(即能产生有效抗体效价)并包含在药学可接受混合物中的sc-TCR或sc-TCR融合蛋白进行免疫，以使靶T细胞被宿主免疫系统耗尽或清除。

本发明还涉及对能特异性结合TCR的小分子进行检测的试验。这类试验一般是体外筛选，其中本发明之sc-TCR蛋白与固相支持物(如微滴板)结合并与目的小分子在适于sc-TCR与该小分子特异性结合的条件下一起温育。例如，目的sc-TCR或sc-TCR融合蛋白可用于熟知的淘选型筛选以检测并分离特异性结合TCR V区的小分子。在一些实例中优选应用sc-TCR融合蛋白，以便使Ig-C_L或相应Ig-C_L片段与固相支持物结合，从而使支持物与sc-TCR V区的相互干扰减至最小。

本发明特别涉及用以检测能抑制超抗原或肽-MHC复合体与TCR之间特异性结合的小分子的筛选方法。一般而言，这类筛选方法涉及体外试验，其中本发明之sc-TCR蛋白与小分子及超抗原或肽-MHC复合体在允许可溶性融合蛋白形成特异性结合复合体的条件下一起温育。在单独的对照反应中，可溶性融合蛋白与超抗原或肽-MHC复合体在相同温育条件下温育。然后按常规蛋白结合试验技术选择能抑制超抗原或肽-MHC复合体与sc-TCR特异性结合的配体。

本发明还涉及检测经组合类型化学产生的配体的筛选方法。例如，在一项试验中，目的sc-TCR分子与固相支持物结合，并与第一已知配体如某超抗原及由常规组合化学产生的第二配体系列混合。第二配体系列的一个实例是常有一个预定氨基酸有差别的肽集合。然后将温育条件定为适合第一配体与sc-TCR蛋白的特异性结合的条件。第二配体系列中能有效阻断sc-TCR蛋白与第一配体相互作用的肽可按标准方法检测并分离。如此筛选测得的配体具有多种用途，包括用于药用组合物以及体外和体内检测APC。

本文参考的所有文献均为全文参考。以下非限制性实施例可举例说明本发明。

附图简述

图1A和1B图示pJRS149(1A)和pKC12.2(1B)载体。

图2为概述各种DNA载体之构建的流程图。

图3为概述从pKC12.2构建pKC45，pKC46(pSUN18)和pKC51 DNA载体的流程图。

图4图示PEN2 DNA载体。

图5图示pKC60和pKC67 DNA载体的插入物。

图6(6A-6G)列表显示用于构建下述DNA载体的寡核苷酸引物。图6A(SEQ ID NO：1-16)，图6B(SEQ ID NO：17-30)，图6C(SEQ ID NO：31-45)，图6D(SEQ ID NO：46-63)，图6E(SEQ ID NO：64-79)，图6F(SEQ ID NO：80-95)，图6G(SEQ ID NO：96-100)。

图7列表显示用于构建sc-TCR融合蛋白V-β链的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO：101-115)。

图8列表显示用于构建sc-TCR融合蛋白V-β链的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO：116-130)。

图9A和9B图示pKC60-m、pKC67-m、pKC73-m、pKC74-m、pKC75-m的插入物(9A)和pNAG-1-m和pNAG3-m的插入物(9B)。

图10图示含有sc-TCR融合蛋白的哺乳动物DNA表达载体。编码sc-TCR(“sc-TCR变体”)的DNA插入物与小鼠κ内含子和小鼠κ外显子融合。

图11(包括图11a和11b)列表显示用于构建sc-TCR融合蛋白的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO：7，10，60，75，131-145)。

图12显示产生于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的sc-TCR(DO11.10)κ融合蛋白的蛋白印迹。

图13显示纯化的sc-TCR(DO11.10)κ融合蛋白的蛋白印迹。

图14是用考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝胶，示纯化的sc-TCRκ融合蛋白的染色。

图15显示三结构域sc-TCR-κ融合蛋白和四结构域sc-TCR-κ融合蛋白瞬时表达的蛋白印迹。

图16图示sc-TCR(DO11.10)κ融合蛋白变异体瞬时表达的ELISA试验。

图17图示sc-TCR(p-149)κ融合蛋白之哺乳动物细胞表达的夹心ELISA试验。

图18图示p149 sc-TCR和p149 sc-TCRκ融合蛋白之哺乳动物细胞瞬时表达的夹心ELISA试验。

发明详述

如上简述，我们发现制备和应用完全可溶并有功能的sc-TCR是可能的。例如，有可能通过与Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段共价连接促进sc-TCR分子的可溶性表达。一般而言，sc-TCR蛋白包括V-α链与V-β链经单链肽连接序列共价连接。sc-TCR融合蛋白包括与V-α链或V-β链融合的Ig-C_L链或合适链片段。与Ig-C_L链或片段的融合可增强完全有功能的sc-TCR在多种细胞中的可溶性表达。

一般，此sc-TCR蛋白的制备可按本文所公开的过程，经公认的重组DNA技术完成。例如，质粒DNA的制备、DNA的限制酶剪切、DNA连接、将DNA导入细胞、细胞培养、所表达蛋白的分离和纯化均为已知技术。总参见Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第二版，1989)；和Ausubel等(1989)，分子生物学最新方案，John Wiley & Sons，纽约。

sc-TCR分子的一般结构及其制备和应用方法已公开于未决的美国专利申请第08/813,781号。

简而言之，sc-TCR分子包括经适当肽连接序列共价连接的V-α链和V-β链。例如，V-α链和V-β链可通过与V-α链C端和V-β链N端融合的适当肽连接序列共价连接。sc-TCR融合蛋白的V-α链和V-β链一般约200-400个氨基酸长，优选约300-350个氨基酸长，并与天然TCR的V-α链和V-β链至少90％相同，优选100％相同。术语“相同”指V-α链或V-β链的氨基酸100％同源于相应天然TCR的V-α链或V-β链。

sc-TCR分子的V-α链可再包含与V-β链C端融合的C-β链或其片段。V-α链还可包含与V-α链的C端及肽连接序列的N端融合的C-α链或其片段。通常在那些包含C-β链片段的融合蛋白中，片段长约50-126个氨基酸，且常不含最后的第127位半胱氨酸残基。而含C-α链的融合蛋白中，片段长可在约1-90个氨基酸的范围内变化(即最多至但不合最后的半胱氨酸的C-α链)。例如一个实施方案中，融合蛋白包含约1-72个氨基酸、位于第1至72位氨基酸的C-α链片段。在另一个实施方案中，C-α链片段约1-22个氨基酸，位于第1至第22位(亮氨酸)。C-α链片段通常不含任何半胱氨酸残基，一个例外是C_α90变异体包含两个半胱氨酸残基。为促进完全可溶并有功能的蛋白的表达，Ig-C_L链或合适片段共价连接于sc-TCR分子上，如连接于V-β链或C-β片段的C端。尽管一般并不优选，但Ig-C_L链或其片段可能共价连接于V-α链N端。在大多数实例中，Cα和Cβ链长度的选择将取决于几种参数，包括所选特定V链和可溶性融合分子的预期应用。

本发明的其它sc-TCR蛋白包括如两个肽连接序列，其中第一个肽连接序列融合在V-α链C端和V-β链N端之间。V-β链C端可与C-β链片段N端融合。第二个肽连接序列再与V-β链或C-β链片段的C端以及Ig-C_L链或其片段或效应物或标记分子等的N端融合。

在其它实施方案中，sc-TCR蛋白可通过将V-β链与V-α链经适当肽连接序列融合而制成，其中V-β链或C-β链片段的C端与V-α链的N端共价连接。Ig-C_L链或其片段可按需要共价连接于分子的C或N端，但一般优选连接于C端。

本发明之scTCR蛋白可包含一或多个融合蛋白标记。例如，就可溶性融合蛋白而言，蛋白标记可融合于sc-TCR V-β链(或C-β链片段)的C端以及Ig-C_L链或其片段的N端。sc-TCR融合蛋白可因此包括如两个蛋白标记，其中第一个标记融合在V-β链(或C-β链片段)的C端以及Ig-C_L链或其片段的N端，第二个标记(相同或不同的)融合在Ig-C_L链或其片段的C端。或者，单一的蛋白标记可融合于Ig-C_L链或其片段的C端。

也涉及诸如含有一或多个蛋白标记融合于V-α链N端的融合体之类的其它sc-TCR融合蛋白。

sc-TCR蛋白的肽连接序列通常选择成能使sc-TCR分子生成与天然TCR V-α链和V-β链的类似的结合位点。Vα链和Vβ链可衍生自未经诱导的T细胞，但大多数情况下V链是与病理如免疫相关失调或疾病有关的形式。

更尤其是，分隔Vα，β链的肽连接序列灵活地将V链定位于能特异性结合配体如目的抗原的口袋中。例如，结合sc-TCR融合蛋白的配体可用于调节T细胞活性，如下述试验所测。这类试验实例有体外试验，包括几个连续步骤：培养表达TCR的T细胞、用sc-TCR蛋白(或从中获得的sc-TCR)在允许TCR与配体结合的条件下与T细胞接触，然后评估可溶性融合蛋白是否能调节T细胞的活性。Ig-C_L链或Ig-C_L链片段与sc-TCR分子的融合在某些方案中可通过例如促进sc-TCR的可溶性表达及维持sc-TCR在水溶液如细胞培养液中的完整性而提高试验性能。

如上述，本发明sc-TCR融合蛋白之一包含与如sc-TCR分子C端共价连接的Ig-C_L链或合适Ig-C_L链片段。在一个实施方案中，sc-TCR融合蛋白包含融合的哺乳动物Ig-C_L链，优选小鼠或人类全长Ig-C_L链，如Cκ链。几种Ig-C_L链的核酸和蛋白序列业已公开。见如基础免疫学，(1993)第三版，W.Paul编，Rsen出版公司，纽约；和Kabat，E.A.等，(1991)有免疫学意义之蛋白的序列(第五版)公共健康服务机构，国立卫生研究所。

术语Ig-C_L链亦包括与所公开的全长序列有一或多个氨基酸替换或添加的区别的免疫球蛋白轻链恒定区。例如，可在所公开之Ig-C_L链序列一或两个链末端经如常规重组方法加入一个氨基酸。此外，重组方法可用于根据需要在链中替换指定氨基酸。氨基酸添加通常有约1-30个中性或亲水性氨基酸，优选约1-10个这类氨基酸。Ig-C_L链中一个氨基酸被另一个氨基酸替换应是保守或非保守的氨基酸替换。故Ig-C_L链序列中酪氨酸被苯丙氨酸替换就代表了氨基酸保守替换的实例，而精氨酸被丙氨酸替换是氨基酸非保守替换。正如下文将就Ig-C_L链片段而指出，含有融合的Ig-C_L链的sc-TCR融合蛋白将是完全可溶并有功能的。

此外，下文特别公开的优选Ig-C_L链序列中氨基酸的替换或添加将属于本发明范围内。

在某些实例中，应用Ig-C_L链片段如小鼠或人类Cκ链片段将十分有利。例如，当需要减小融合蛋白的分子量时，可以将适当的Ig-C_L链片段与sc-TCR分子融合。“适当的Ig-C_L链片段”或相关术语指当与目的sc-TCR分子融合时形成下文规定的完全可溶并有功能的sc-TCR融合蛋白的Ig-C_L片段。目的Ig-C_L链片段(包括Cκ和Cλ型)可按常规重组方法制备，如经PCR扩增小鼠或人类Cκ或Cλ链片段，然后将PCR产物连接至编码目的sc-TCR分子的DNA区段或载体上。如下文指出，可加工PCR产物使其包含限制酶剪切位点以利于克隆。适当的小鼠或人类Cκ链片段一般约在70-150个，优选约90-120个，更优选约100-110个氨基酸长度之间。适当的小鼠或人类Cκ链DNA序列的实例如下述。见实施例5、6和7。

本发明的sc-TCR是完全有功能并可溶的。术语“完全有功能”或类似术语指融合蛋白能特异性结合配体。检测这种特异性结合的试验已在此公开，包括常规免疫印迹技术如蛋白印迹。

术语“完全可溶”或类似术语指融合蛋白低速离心时不易自水溶液如细胞培养液中沉淀。而且，如果sc-TCR融合蛋白在高于约5-37℃的温度下，在中性或接近中性pH的条件下，有低浓度阴离子或非离子去污剂或不含去污剂时保持于水溶液中，则它是可溶性的。此时，可溶性蛋白常常有低沉降值，如少于约10-50svedberg单位。此处的水溶液通常含有缓冲化合物以稳定pH(一般在约pH5-9之间)和离子强度(在约2mM-500mM之间)。有时加入蛋白酶抑制剂或温和的非离子去污剂，必要时还可加入载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)至数毫克/毫升。含水缓冲液的实例有标准磷酸盐缓冲液、tris盐缓冲液或其它已知缓冲液以及细胞培养液。

如上文指出，已发现很多sc-TCR分子在哺乳动物细胞中表达时即使未融合Ig-C_L链或其片段也是完全有功能并可溶的。例如，图9B下部所示pNAG3-m和p149-m载体编码的sc-TCR分子在下文特指的哺乳动物细胞中表达时完全有功能并可溶。pNAG3-m载体编码的sc-TCR分子中依次共价连接有：Vα链、Cα链、肽连接序列、Vβ链和Cβ链。公开的还有在Cα链中包含氨基酸缺失至多达全长Cα链的sc-TCR分子。参见图9A和9B下部以及图5所示pKC60载体。此外，未决的美国专利申请第08/813,781号公开了包含依次共价连接的：Vα链、Cα链片段、肽连接序列和Vβ链的sc-TCR分子的制备方法。因而，有可能制备包含修饰的(或缺失的)Cα和Cβ链、无Ig-C_L链或合适片段融合的各种sc-TCR分子。sc-TCR分子可根据在此所述方法检验在特定哺乳动物细胞中的可溶性表达。

本发明之sc-TCR大都由RNA、mRNA、cDNA或基因组DNA等核酸区段编码。通常，核酸区段为DNA区段。例如，本发明之DNA区段通常包括可操作连接的前导序列，以提供适当的细胞加工信号。一般而言，前导序列与编码sc-TCR的DNA序列的5’端融合。例如，前导序列可与编码V-α链(或在有些实施方案中是编码V-β链)之DNA序列的5’端融合。但应认识到，尽管是将特定前导序列与特定α或β链连接，但仍常常可用重组技术替换这些前导序列，而不会对融合蛋白的加工产生有害影响。故在一实施方案中，V-α链5’端与适当前导序列的3’端共价连接。前导序列大都约12-26个氨基酸残基长。设计用于插入细菌表达载体的DNA区段可包括Pel B序列，而用于插入哺乳动物细胞表达载体的DNA区段可包括Ig-C_L前导序列，如哺乳动物Cκ前导序列。下文将提供Cκ前导序列的实例。

术语“可操作连接”指遗传序列与核酸区段、或给定片段或序列的5’上游序列或3’下游序列有效地(即有功能地)连接。那些邻近序列常常对该核酸区段或序列在目的细胞类型中的加工和/或表达具有有利影响。

本发明用于细菌表达的DNA载体可包括启动子如trp操纵子启动子、lac启动子、trp-lac启动子、lac^uvs或phoA启动子。启动子实例如phoA，它在慢诱导条件下可持续数小时(如2-10小时)提供强烈的、受调节的表达。在适当培养条件下，大多数强启动子都能提供水平高达甚至超过宿主蛋白总量之10％的可溶性融合蛋白。

可溶性融合蛋白的单链V区可衍生自几乎任何TCR V区。合适的Vαβ链常常是那些免疫诱导后基因表达增加的链。分析TCR V链表达增加的方法已为人知(见如Hafler，D.A.等，实验医学杂志167：1313(1988)；Mantgazza，R.等，自身免疫力3，431(1990))。

sc-TCR融合蛋白可包含能方便得到基本全长编码序列的Vα、β链。自细胞中获得全长TCR V链序列的方法为已知。或者，Vα、β链区可通过对公开提供的、至少部分序列已知的Vα、β链进行PCR扩增而获得。Vβ基因序列的实例有Vβ8.1、Vβ6.1、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ2.1和Vβ2.3基因序列。见Abe等(1992)PNAS(USA)89：4066；Wang等，(1993)；PNAS(USA)90：188；Lahesma等(1993)免疫学杂志150：4125；Kotzin等(1991)PNAS(USA)88：9161；Uematsu等(1991)PNAS(USA)88：8534。其它TCR V链序列亦见Kabat，E.A.等(文献同上)和Chotia，C.等(1988)EMBO杂志7：3745。

此外，实施例3提供了用于PCR扩增各种V-α和V-β链的寡核苷酸引物。适当寡核苷酸引物的其它实例亦见图7和8。

若想从生物学来源获得TCR V链，可按标准免疫学方法鉴别目的TCR，包括应用主要结合TCR V区某表位并优选特异于该表位的TCR特异性抗体。通常，表面表达可通过已知技术如荧光显微术、流式细胞术、或免疫化学进行检测。特异性结合TCR可变区的很多抗体均为已知。见如已公开的PCT专利申请WO90/06758。

可通过本领域内已知的杂交方法，用针对各种TCR基因家族的寡核苷酸探针进行特异性杂交而直接探测，或优选在PCR扩增后探测所测TCR的DNA或RNA。一般执行高严谨度核酸杂交条件。术语“高严谨度杂交”指核酸在约65℃、0.1xSSC的条件下温育。见Sambrook等，文献同上。TCR DNA序列或其目的部分可直接从扩增的DNA或RNA获得并可根据需要亚克隆入适当载体。

已知有其它方法可获得TCR V区DNA。例如，含V区基因的目的TCR可通过对TCR或其相应于V区的优选部分测序而鉴别。DNA序列可在将DNA克隆进本领域内已知的适当测序载体之后或通过首先测定TCR的至少部分蛋白序列再测定DNA序列而测定。本领域内一般技术人员均知，上述操作及技术人员熟知的其它操作可用于成功鉴别目的TCR并从该TCR获得V区基因，从而制备出单链Vαβ构建体以与目的Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段融合。

更为特别的是，当需要从生物来源获得TCR V区DNA时，编码目的V-α和V-β链的DNA区段可从细胞如T细胞杂交瘤或细胞毒T细胞(CTL)获得。T细胞(如Ts、Tc或T_H细胞)可体内获得，或T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤(如D10或B12细胞系).参见以下实施例1。CTL可以是未经诱导的或可与啮齿类(如小鼠、大鼠、家兔)或灵长类(如人类或黑猩猩)的免疫系统致病性应答相关。例如，CTL或其它T细胞可来自已确诊或疑有以下疾病的病人：莱姆病、Kawasaki病、麻风病、癌症(即对肿瘤相关抗原如CEA的免疫应答)、或自身免疫病(尤其是与移植排斥有关的疾病)、多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、类风湿性关节炎和过敏；或传染病，尤其是与RNA或DNA病毒有关的传染病。具体的目标病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、流感病毒、肝炎病毒、痘病毒、EB病毒、腺病毒或多瘤病毒。CTL来源的实例是从已有腺癌和黑色素瘤的病人分离的抗原特异性CTL和TIL(见如，Cox等，科学(1994)264：716；Rosenberg，S.A.等N.Eng.J.Med.(1988)319：1676；Kawakami，Y.等，实验医学杂志(1994)180：347；Kawakami，Y.等PNAS(1994)91：6458)。

如前文关于自细胞获得V-α和V-β链的叙述，好几种可替换的方案可用于制备从中分离的核酸。更具体地说，为制备V-α和V-β链DNA，从那些证实了有所需TCR结合特异性的细胞中分离mRNA。这类方法一般包括应用合适的PCR方案，其中使用得自mRNA的第一链cDNA模板。然后可应用标准的重组技术制备所需α和β链。然后可修饰编码所需α和β链的DNA区段以便包含适当的肽连接序列和蛋白标记(若有必要)。

一般地，PCR方法中所用DNA寡核苷酸引物约长12-50个核苷酸，优选约长20-25个核苷酸。PCR寡核苷酸引物可适当包含限制位点以便按需要向PCR产物中加入特异性限制酶切割位点。引物实例均提供在随后的实施例和附图中。产生的PCR产物将包含扩增的V-α和V-β链序列，并可作修饰以便按所需包含核糖体结合位点、前导序列和启动子序列以得到融合蛋白的最佳表达。

编码目的sc-TCR分子的DNA区段可按下述方法大量制备(每克细菌细胞毫克量)。

以下提供的用于制备可溶性融合蛋白的特定sc-TCR包括带有哺乳动物V-α和V-β链的sc-TCR。实例有灵长类，尤其是人类和黑猩猩；啮齿类，如免疫原初小鼠如裸鼠或带有能表达HLA-A2抗原复合体的转基因的小鼠(Vitiello，A.等，实验医学杂志(1991)175，1002)。特定目标人群包括那些有上述任一病理如自身免疫病的人。包含来自不同哺乳动物的V-α和V-β链DNA序列的嵌合构建体可按已知方法构建，并也属于本发明范围内。

如上述，肽连接序列可有效地将融合蛋白V-α和V-β链定位，以形成配体结合口袋。可溶性融合蛋白因此能特异性结合配体如超抗原、或MHC/HLA肽复合体相关肽抗原、或小分子。特别指出，本发明目标之一是提供能与T细胞表面的天然TCR竞争的可溶并完全有功能的sc-TCR融合分子。术语“竞争”指可溶性融合蛋白能够以等同于或在某些情况下超过TCR对相同配体之特异性结合亲和力的水平结合配体。例如，根据下述方法，sc-TCR融合蛋白(或由其衍生的sc-TCR分子)能有与天然TCR大致相当或高出多达约2-10倍的结合亲和力。

通常，与缺少融合Ig-C_L链或其片段的sc-TCR分子相比，目的Ig-C_L链或合适Ig-C_L片段的融合对sc-TCR融合蛋白特异性结合力的减小不超过30％，优选不超过10％，更优选不超过5％或更低。结合试验实例已在此公开，包括下述标准蛋白印迹试验和表面等离子体激元共振(Surface Plasmon Resonance)试验。

在本发明的一个实施方案中，多肽连接序列有约7-20个氨基酸，优选约10-20个氨基酸，更优选约12-20个氨基酸。连接序列通常柔性地位于融合蛋白中，可使V-α和V-β链定位于可提供目的配体如肽抗原特异性结合的构象。连接序列优选主要包含带小侧链的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供最佳弹性。优选地，连接序列的约80％或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。优选连接序列不含任何可抑制弹性的脯氨酸残基。连接序列适当地连接于融合蛋白中V-α链的C端和V-β链的N端。见以下实施例1和2。

更尤其是，适当连接序列包括(GGGGS)4序列(即(Gly Gly Gly GlySer)4)，如JA302(SEQ ID NO：96)和JA301(SEQ ID NO：95)。优选地，所选连接序列共价连接于sc-TCR V-α链的C端残基和V-β链的第一个氨基酸之间。然而，如前述，也可能是其它肽连接序列构型，其中部分包含与Ig-C_L链或合适Ig-C_L链片段如Cκ链片段的融合。已公开多种可用于连接抗体可变区的多肽连接序列(见M.Whitlow等，方法：酶学方法手册，2：97-105(1991))。或者，可凭经验轻易鉴别其它合适的连接序列。例如，可以克隆并表达包含带连接序列的融合蛋白的编码DNA的DNA载体，并检验融合分子是否能结合抗原。一项试验实例是标准抗原结合试验如Harlow & Lane，文献同上所公开的。或者，可检验所表达的、含连接序列的融合蛋白调节T细胞活性的能力，如本文参考试验所测。见以下实施例8、10和11。连接序列的合适大小和序列也可通过基于融合蛋白之预定大小和形状的常规计算机模拟技术测定。肽连接序列实例有在V-α和V-β链之间的多肽连接序列末端包含适当的限制酶位点(如XhoI和SpeI)的那些。

多数实例中，编码目的sc-TCR分子的DNA区段可经基因工程重组进入适当的DNA载体。例如，在目的V链是经PCR扩增的实施方案中，寡核苷酸引物常在其两末端具有所需限制性位点，以便可用另一目的DNA区段替换该DNA区段。

因此，本发明之合适DNA载体是目的sc-TCR分子可轻易插入其中的载体。有时，当制备可溶性融合分子时，Ig-C_L链或合适Ig-C_L链片段将由该载体编码并通过连接与此DNA区段融合。其它实例中，Ig-C_L链或片段将在与载体连接之前与DNA区段融合。

本文所用术语“载体”指能掺入宿主细胞导致目的核酸区段如编码上述sc-TCR融合蛋白的区段或序列表达的任何目的核酸序列。载体可包括如线性核酸区段或序列、质粒、粘粒、噬菌粒和外源染色体DNA。特定地，载体可为重组DNA。本文所用术语“表达”或“基因表达”指目的核酸序列的蛋白产物的产生，包括DNA转录和RNA转录物的翻译。通常将编码本发明sc-TCR融合蛋白的DNA区段插入载体，优选DNA载体中，以便在合适的宿主细胞中复制该DNA区段。

在目的细胞中表达本发明sc-TCR蛋白的方案很多。例如，可将编码sc-TCR蛋白的DNA序列掺入DNA载体，方法已知如用酶在预定位点剪切载体，随后将DNA连接至载体。然后将含DNA序列的载体导入合适的宿主以进行sc-TCR蛋白的可溶性表达。合适载体的选择可凭经验根据与克隆方案相关的因素而定。例如，载体应与所用宿主细胞相容，并具有对其正确的复制子。而且，载体应能容纳将表达的编码该蛋白的DNA序列。优选载体能在哺乳动物细胞中表达可溶性蛋白，如inVitrogen供应的pCDNA3。其它可用于哺乳动物细胞的合适载体亦见Sambrook等，文献同上和Ausubel等，文献同上。通常，设计在细菌中表达、编码可溶性融合蛋白的DNA载体不含全长Cλ或Cκ内含子，但这些序列可包含于设计在能剪切RNA的哺乳动物细胞中表达的载体中。

优选将DNA载体设计成可在真核细胞，尤其是哺乳动物细胞中表达可溶性sc-TCR。必要时可安排DNA载体使之在细菌宿主中复制，从而可获得适量DNA载体。例如，DNA载体常包括(i)在大肠杆菌中有功能的复制起点；(ii)选择性抗生素抗性基因；(iii)强病毒启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子和可选择的CMV增强子元件；(iv)Ig-C_L前导序列；(v)目的sc-TCR分子，(vi)与Ig-C_L外显子连接的全长Ig-C_L内含子，(vii)生长激素多聚腺苷化序列如牛生长激素(bgh)poly A序列和(viii)选择性真核标记的编码DNA如与抗生素抗性基因(如新霉素)连接并与病毒性多聚腺苷化序列(如猴病毒40(SV40)poly A序列)融合的强病毒性启动子(如SV40启动子)。或者，DNA载体可包括上述(i)-(v)以及(vii)-(viii)，不含(vi)的与Ig-C_L外显子连接的全长Ig-C_L内含子。Ig-C_L前导序列的实例有小鼠κ前导序列。全长Ig-C_L内含子和外显子的实例有全长Cκ基因。适于哺乳动物细胞表达的DNA载体实例如图10(pSUN27载体)。见下述实施例5。

用于目的哺乳动物细胞的本发明DNA载体可经常规技术修饰以使之在其它哺乳细胞中的可溶性表达最优化。例如，上述编码新霉素抗性基因的真核标记可由编码腺苷激酶(TK)基因的DNA取代，从而促进sc-TCR融合蛋白在TK-(TK缺陷)哺乳动物细胞中表达。DNA载体可用本领域内已知的其它方法修饰，如改变启动子、抗生素抗性基因，用免疫球蛋白启动子、SV40、腺病毒或乳头瘤病毒启动子取代CMV启动子以使sc-TCR融合蛋白在目的哺乳动物细胞中得到最佳表达。或者，编码sc-TCR蛋白的DNA序列可根据需要插入适于酵母或昆虫细胞表达的已知载体。参见如，Ausubel等，文献同上及Summer & Smith，文献同上。

适用的宿主细胞可经各种方法转化，包括逆转录病毒转移、病毒或噬菌体感染、钙、脂质体或聚凝胺介导的转染、biolistic转移，或本领域内已知的其它这类技术。

前文已指出，有时在非哺乳动物细胞中表达可溶性融合蛋白可能比较理想。例如，适于在细菌中表达融合蛋白的宿主细胞包括易于转化并在培养基中表现快速生长的细胞。特别优选的宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。其它宿主细胞包括，酵母如酿酒酵母和昆虫细胞。昆虫细胞表达的细胞实例为杆状病毒能感染的细胞如Sf9细胞。亦参见，Summer & Smith(1988)杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，德克萨斯农业实验站公报(Texas Agricultural Experimental StationBulletin)第1555号，学院站(College Station)，德克萨斯州。

采用的细胞培养条件一般是稳定转化或转染的细胞系可因如在载体中加入适当的细胞选择标记(如抗生素抗性基因或G418)而得到选择的条件。表达sc-TCR融合蛋白的细胞可经已知过程如应用市售特异性结合V-α或V-β链的单克隆抗体的ELISA试验进行测定。或者可选用特异性结合可溶性融合蛋白Cκ或Cλ链(或片段)的单克隆抗体。单克隆抗体和适用的试验的实例提供在以下实施例中。

设计用于在细菌中复制和表达目的可溶性融合蛋白的载体包括如，(i)在大肠杆菌中有功能、衍生自如pBR322、优选众所周知的pUC19载体的复制起始区；(ii)选择性抗生素抗性基因，如青霉素和/或新霉素抗性基因；(iii)转录终止区，如大肠杆菌trp操纵子的终止区；(iv)转录启动子，如phoA、tac、tac-lac、lacZ、lac^uvs、T7或T3启动子；(v)前导序列，如pelB或ompA前导序列；(vi)编码与目的Ig-C_L链或合适Ig-C_L链片段，如全长小鼠或人类Cκ外显子融合的sc-TCR的DNA区段；及(vii)转录终止子，如来自大肠杆菌核糖体RNA位点的T1T2序列。或者，载体可包括上述(i)-(vii)，只是sc-TCR不含融合的Ig-C_L链或片段。

在细菌表达用DNA载体中包含特殊核苷酸序列可在慢诱导条件下辅助sc-TCR融合蛋白的可溶性表达。例如，下述phoA启动子和pelB前导序列可用于在慢诱导条件下表达sc-TCR融合蛋白。参见以下实施例6。在构建体中还可包含强翻译起始序列以提高翻译效率。用于哺乳动物细胞表达的优选起始序列是Kozak共有序列(CCACCATG)(SEQ ID NO：97)。

DNA载体的前导序列可适宜指导融合蛋白表达在宿主细胞膜或宿主细胞培养液中，该序列常包括限制酶位点，使编码如目的V-α链的DNA可方便地连接于构建体。适宜地，限制酶位点可掺入在前导序列的3’端，有时本文称之为连接序列，长度如约2-10个密码子，并与V-α链相连，使V-α链编码区通常为V-α编码区的第一个氨基酸。例如，一个限制酶位点是Sfi I位点，但也可将其它限制位点插在V-α链编码区之前，以使V-α链能更为便利地插入载体构建体。如上述，这类限制酶位点联合常位于V-α链起点的第二限制酶位点的应用，使得可快速、直接地插入各种编码V-α链，或V-α，C-α链的序列。优选的前导序列包含强翻译起始位点，而且有时还在它们的mRNA 3’端包含帽位点。如上述，前导序列实例包括细菌表达用的pelB和OmpA，哺乳动物细胞表达用的Cκ小鼠κ链前导序列。

sc-TCR蛋白可以各种方式在细菌中表达。例如，编码sc-TCR融合蛋白的DNA载体在细菌中的表达可通过长时间(约2-8小时)慢诱导细胞完成。例如，如下实施例6述，DNA载体可制成包括与Sc-TCR蛋白编码序列可操作连接的phoA(强)启动子。宿主细胞可随后用该DNA载体转化，并使宿主细胞培养液中磷酸盐在几个小时内耗竭，常约2-10个小时，更优选约4-6小时。

由本文DNA载体编码的sc-TCR蛋白可经多种标准技术纯化。例如，如上述，可溶性融合蛋白可包含一或多个蛋白标记(相同或不同)，包括带有化学或蛋白酶切割位点的标记。特别是，蛋白标记可以是在生理pH下带电荷的多肽，如6xHIS。在此实施方案中，可使用适宜的合成基质纯化融合蛋白。更特别地，该合成基质可以是市售sepharose基质，如Ni-Sepharose或这类能在约pH6-9结合6XHIS标记的其它适宜基质。其它适宜标记包括能特异性结合市售单克隆抗体的EE或myc表位。通常，能与抗体，如单克隆抗体特异性结合的各种表位均能作为蛋白标记。其它适宜的合成基质包括已附着了能特异性结合本发明sc-TCR蛋白的抗体的基质。蛋白标记实例包括带有肠激酶、因子Xa、蛇毒或凝血酶剪切位点的那些标记。参见如，已公布的PCT专利申请WO 96/13593。

表达的sc-TCR蛋白可用已知方法分离并纯化，如免疫亲和层析、免疫吸附、免疫沉淀等等。重要的是，制备过程应该不至于为获得大量融合蛋白而要求比较长时间的分离步骤。根据以下详述的蛋白纯化方法，大多数sc-TCR蛋白的产量为每约50-100克宿主细胞糊产2-20毫克。

为制备在此公开的sc-TCR蛋白，一般将细胞提取物或宿主细胞培养物离心，所得上清经亲和或免疫亲和层析，如蛋白A或蛋白G亲和层析或利用能特异性结合所表达sc-TCR融合蛋白的抗体的免疫亲和层析方案而纯化。这类抗体的实例如市售能特异性结合sc-TCR的V-α链或V-β链的单克隆抗体。这样的抗体实例如得自Pharmagen的H57、MR5-2和F23.1。或者，可用能特异性结合sc-TCR蛋白中免疫球蛋白链的市售抗独特型抗体纯化sc-TCR融合蛋白。这类抗体的应用实例提供在以下实施例5中。蛋白的单克隆抗体亲和纯化众所周知，并已公开，如参见Harlow & Lane的《抗体：实验室手册》(1988)一书。

如上述，本发明之sc-TCR蛋白以可溶并完全有功能的形式提供。因此，sc-TCR蛋白将稳定地分泌至培养基中并能特异性结合目的配体如肽抗原或合成性小分子。更特别地，sc-TCR蛋白在生理条件下、在离液剂如去污剂等基本缺乏或完全缺乏时一般保持稳定。因此，这类可溶性蛋白一般不包括富含疏水氨基酸如发现于TCR跨膜区的那些氨基酸的区。但有时可包括其适宜部分，只要sc-TCR保持完全可溶即可。即，融合蛋白的表达不会导致在相应宿主细胞中形成大量的包涵体。包涵体用显微镜或常规生化技术如离心沉降可轻易测得。

本发明的sc-TCR蛋白可如上述制备，也可按以下实施例制备。编码目的V-α或V-β链的DNA可来自如T细胞、T细胞杂交瘤系、或公共提供的V-α和V-β链序列，如上述。DNA可经PCR、克隆或其它适当方法扩增。例如，可将编码目的V-α链的DNA克隆至适当载体，然后克隆编码目的V-β链和适当单链连接序列的DNA以产生所需sc-TCR。如上述，有时sc-TCR包含编码C-α和/或C-β链片段的DNA。对于可溶性sc-TCR融合蛋白，sc-TCR分子构建体还与Ig-C_L链或片段，如小鼠或人类Cκ链或合适Cκ链片段融合。正如前文已指出，编码Cκ链的DNA可经PCR扩增并与编码sc-TCR的DNA连接。或者，Cκ链可包含在DNA载体，如Near等(见下文)所公开的那些中。再将编码融合蛋白的DNA区段导入该DNA载体。DNA载体随后在宿主细胞中表达，收获融合蛋白，必要时纯化。

本发明之sc-TCR融合蛋白一般由包含依次以下共价连接的DNA区段编码：启动子/前导序列/V-α链/单链连接序列/V-β链/Cκ链；启动子/前导序列/V-α链/单链连接序列/V-β链，C-β链片段/Cκ链；启动子/前导序列/V-α链，C-α链/单链连接序列/V-β链/Cκ链；或启动子/前导序列/V-α链，C-α链片段/单链连接序列/V-β链，C-β链片段/Cκ链。sc-TCR分子的实例如上所述，除了Cκ链不由该DNA区段编码。将编码sc-TCR蛋白的DNA载体导入目的细胞，包括本文公开的特异性表达系统，以使融合蛋白可溶性表达。

在此提供的sc-TCR蛋白可经常规方法修饰以包括多种共价连接的效应物或标记。适宜的效应物或标记包括具有所需生物学、化学或生理特性的那些。更特别地，效应物分子可以是如植物或细菌来源的细胞毒素，诸如白喉毒素(DT)、志贺毒素、相思豆毒蛋白、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、皂素(saporin)、假单胞菌外毒素(PE)、美洲商陆抗病毒蛋白或gelonin。这些毒素的生物活性片段为本领域内已知，包括如DT A链和蓖麻毒蛋白A链。此外，毒素可以是在细胞表面具有活性的制剂，如磷脂酶类(如磷脂酶C)。而且，效应物分子可以是化疗药物如去乙酰长春碱酰胺、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、阿霉素、博来霉素或顺铂。或者，效应物分子可以是适用于诊断或成像研究的可检测性标记分子，如碘131、钇90、铼188或铋212之类的放射性核素。已公开的有关含有效应物或标记的蛋白制备和应用参见如，Moskaug等，生物化学杂志264，15709(1989)；Pastan，I.等，细胞47，641，1986；Pastan等，作为新型治疗制剂的重组毒素，生物化学年鉴61，331，(1992)；“嵌合毒素”Olsnes和Phil，Pharmac.Ther.，25，355(1982)；已公开的PCT专利申请WO 94/29350；已公开的PCT专利申请WO 94/04689；和美国专利第5,620,939号。

有关利用在此公开的sc-TCR融合分子和不含融合Ig-CL链(或片段)的sc-TCR分子进行诊断和成像研究的其它方法和材料的公开内容，亦参见A.K.Abbas(见下文)及后续讨论。

含有共价连接的效应物分子的可溶性sc-TCR蛋白有多种重要用途。例如，该sc-TCR蛋白可用于将效应物分子送至能特异性结合sc-TCR的特定细胞。因而，sc-TCR蛋白提供了选择性损伤和杀死含此配体之细胞的方法。可由sc-TCR蛋白损伤或杀死的细胞或组织实例包括能表达一或多种可与sc-TCR特异性结合的配体的肿瘤和病毒感染细胞。易受损伤或杀死的细胞或组织可根据本文公开的方法轻易地进行分析。

与效应物分子融合的sc-TCR蛋白的特别实例如下：诸如以下实施例6和7公开的p149 sc-TCR之类的sc-TCR可用图9B所示pNAG1或pNAG3载体转染哺乳动物细胞而产生。sc-TCR p149蛋白识别呈递于人类HLA抗原中的由人类野生型p53肿瘤抑制蛋白加工的肽片段；HLA-2.1。sc-TCR p149及其肽配体已述于Theobald，M.J.等，PNAS(USA)(1995)，92：11993。此肽序列为STPPPGTRV(SEQ ID NO.146)。肿瘤抑制蛋白p53的表达在恶性细胞中上调。已显示50％的肿瘤在其表面表达的p53水平增高(Holliston，M.D.等，科学(1991)，253：49)。因此，特异于该表位的sc-TCR分子可用毒素标记，将该毒素送至表达p53肽片段HLA-2.1配体的恶性细胞。这种靶特异性免疫治疗可只针对恶性细胞进行有效杀伤。体外测量细胞毒活性的方法已为人知，包括下述常规生活力试验。带有与效应物连接的p149 sc-TCR的sc-TCR分子具有其它重要用途。例如，该sc-TCR分子可用于选择性杀伤表达p149肽的人类乳腺癌细胞。可进行体外研究，其中标记有毒素的p149分子杀伤乳腺癌细胞的能力可利用非放射活性细胞毒性试验根据Eu3+释放细胞毒性分析评估(Bouma，G.J.等，(1992)人类免疫学(Hum.Immunol.)35：85)。带有融合的效应物分子的sc-TCR分子可轻易地进行体内检验。例如，可通过将表达p149/HLA-A2.1的乳腺癌细胞移植到HLA/A2转基因小鼠中进行体外研究(Theobald等，(1995)文献同上)。可将毒素标记的sc-TCR p149分子按预定剂量注射给小鼠，测量肿瘤大小的变化可指示sc-TCR分子的效力。此外，存活时间可作为评估新型抗肿瘤疗法效力的第二标准。

已知还有其它适宜的效应物或标记分子。例如其中之一是在生理pH下荷电的多肽如6xHIS。此时，sc-TCR分子或可溶性sc-TCR融合蛋白可用能在约pH6-9特异性结合6xHIS标记的市售金属-sepharose基质如Ni-sepharose纯化。EE表位和myc表位也是合适的蛋白标记，这些表位可被一或多种市售单克隆抗体特异性结合。

本发明sc-TCR融合蛋白的分子量可根据很多因素变化，包括是否选择了全长Cκ或Cλ链或其合适片段，或是否应用了一或多种蛋白标记。通常，可溶性融合蛋白的分子量大于约45kDA，其中的V-α和V-β链分子量大于约20kDA，更常常介于约21-26kDa之间。本发明之融合蛋白的分子量通常约50-75kDa。所有上述分子量均根据常规分子量大小测量试验如SDS-PAGE凝胶电泳测定。总见Sambrook等，文献同上，Harlow & Lane，文献同上；Ausubel等，文献同上。

在一些方案中，将本发明之sc-TCR蛋白制备成多价将十分有利，如可增加sc-TCR的效价。简而言之，可将一至四个(相同或不同)蛋白用如标准生物素-抗生物素蛋白标记技术共价连接在一起、或与适宜固相支持物如胶乳颗粒偶联而制成多价sc-TCR蛋白。化学交联的蛋白(如与dendrimer交联)也是适宜的多价蛋白。例如，该蛋白可通过包含编码带化学反应性侧链的氨基酸残基如Cys或His的序列而修饰。这类带化学反应性侧链的氨基酸可位于融合蛋白中的多个位置，优选远离sc-TCR的抗原结合区。例如，可溶性融合蛋白C-β链C端可与包含这类反应性氨基酸的蛋白纯化标记或其它融合蛋白共价连接。包含适宜侧链可使两个或更多融合蛋白化学连接到dendrimer颗粒上，形成多价分子。Dendrimer是表面可带有多种不同官能团中任何一种的合成性化学多聚体(D.Tomalia，Aldrichimica Acta，26：91：101(1993))。可根据本发明进行应用的dendrimer实例如E9 starburst多胺dendrimer和E9comburst polyamine dendrimer，它们可连接半胱氨酸残基。

构建编码本发明之可溶性蛋白及其它生长制剂，尤其是T细胞共同刺激因子如B-7基因家族之类(如B7-1或B7-2)的DNA载体，以便增强含有融合蛋白的细胞的活性可能也比较合乎需要。

本发明之可溶性蛋白可用于检测和鉴定超抗原。例如，本发明之方法可用于对T细胞的未鉴定表位作图，进行如下：编码随机肽文库的序列或已选定肽的序列可提供在肽文库中。然后用本发明的可溶性sc-TCR蛋白筛选此文库，优选用带有可检测标记的融合蛋白(如标有放射性原子或发光分子)。从融合分子中释放出融合蛋白所特异性结合的肽并随后扩增。对肽进行序列分析可鉴定融合蛋白所结合的序列。此外，可检验已克隆的肽序列对表达相应于融合蛋白V-α和V-β链之TCR的T细胞的结合。多种随机肽文库可任选其一应用。参见如，J.Scott等，科学(1990)249：386；J.Devlin等，科学(1990)249：404；S.Cwirla等，PNAS(USA)，(1990)；87：6378；J.Hammer等，实验医学杂志(1992)176：1007；Rhode，P.R.等，免疫学杂志(1996)157：4885；及D.O’Sullivan等，免疫学杂志(1991)147：2663。

有很高利用价值的单链I类和II类MHC/肽复合体(在其中常称为scMHC I类和II类复合体)见已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617，以及提交于1995年2月1日的未决美国专利申请流水号08/382,454号。已公开的PCT专利中请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617，以及未决的美国专利申请流水号08/382,454号还公开了极有价值的体外和体内T细胞结合试验，它们可方便地适用于检验在此公开的sc-TCR蛋白。已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617，以及未决的美国专利申请流水号08/382,454的内容均引入本文作为参考。

本发明之sc-TCR蛋白调节T细胞活性的能力(即降低或消除T细胞活性如增殖)可按上述已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617以及上述未决的美国专利申请流水号08/382,454中的试验和进行该试验的材料容易地进行测定。

更特别地，如上述已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617号，以及上述未决的美国专利申请流水号08/382,454所公开，可进行体外试验以测定分子是否能调节T细胞活性。这类试验经改造可测定sc-TCR蛋白的功能。总之，一个试验实例可经如下1-4步连续步骤完成。T细胞可适当表达这样一种标记，该标记可进行分析、可指示T细胞的活化、或活化后对T细胞活性的调节作用。因此，如上述专利申请所述，可应用活化时表达白细胞介素-2(IL-2)的小鼠T细胞杂交瘤DO11.10。测定IL-2的浓度可证实特定sc-TCR融合分子是否能调节T细胞杂交瘤的活性(如减少IL-2的产生量)。这类合适试验一般可按以下步骤执行：

1.获得包含对应于本发明之sc-TCR蛋白的TCR的T细胞杂交瘤或T细胞。

2.然后在可增殖的条件下培养T细胞杂交瘤或T细胞。

3.随后将增殖的T细胞杂交瘤或T细胞与一或多种sc-TCR融合蛋白接触。

4.将T细胞杂交瘤或T细胞与能特异性结合该TCR并活化T细胞杂交瘤或T细胞的配体接触。配体实例包括抗原如超抗原(带有上述呈递肽的sc-MHC I类或II类复合体)、或适当的APC。

5.将T细胞杂交瘤或T细胞与适当的共同刺激因子接触以提供活化必需的信号。随后分析T细胞杂交瘤或T细胞的标记如IL-2的产生。24小时后，IL-2产量减少如40％或更多，说明sc-TCR融合蛋白结合了配体并因此调节了T细胞的活性。

如上已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617，以及上述未决的美国专利申请流水号08/382,454所述，试验中所用T细胞常常在适合于增殖的条件下温育。例如，将DO11.10 T细胞杂交瘤在约37℃、5％CO₂，于完全培养基(添加了10％FBS、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺及5×10^-5M 2-巯基乙醇的RPMI 1640)上温育。可以将浓度通常为10^-8-10^-5M的系列稀释的融合蛋白加入T细胞培养基中。T细胞活化信号优选由已携带相应抗原的抗原呈递细胞提供。据信使用使T细胞活化略低于最高水平的抗原剂量和APC数目能更好地检测融合蛋白对T细胞应答的抑制作用。与sc-TCR融合蛋白接触后IL-2产量的减少，说明融合蛋白能调节T细胞活性。

如已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617，以及上述未决的美国专利申请流水号08/382,454所述，不测量表达蛋白如IL-2，而可通过用本领域内公认的放射性标记技术测量抗原依赖性T细胞增殖的变化而测定对T细胞活化的调节。例如，可在试验培养基中加入可检测性标记(如氚标记)的核苷酸。DNA中掺入这样的标记核苷酸的量可作为T细胞增殖的度量。这项试验不适用于无需抗原呈递便能生长的T细胞，如T细胞杂交瘤。它适用于测量分离自哺乳动物的未转化T细胞活化的调节。与融合蛋白接触后T细胞增殖水平降低，说明此分子可调节T细胞活性并抑制免疫应答。优选使用体外T细胞增殖试验测量融合蛋白对体内T细胞集落扩展中抗原特异性改变的影响。IL-2产生或T细胞增殖的测量可用于测定sc-TCR融合蛋白是否能改变T细胞的活化。例如，与融合蛋白接触后APC刺激的T细胞的IL-2产量的减少说明融合分子可调节T细胞活性并抑制T细胞介导的免疫应答。

一般而言，适用于这些试验的T细胞均由转化的T细胞系如T细胞杂交瘤或分离自哺乳动物(如人类等灵长类或小鼠、大鼠、家兔等啮齿类)的T细胞提供。其它适用的T细胞包括：1)可公开获得的或可通过已知方法制备的T细胞杂交瘤，2)T辅助细胞和3)T细胞毒细胞，优选细胞毒性CD8+细胞。T细胞可用已知方法从哺乳动物中分离。参见如，R.Shimonkevitz等，实验医学杂志，(1983)158：303。

体内试验也可能适用于测定可溶性融合蛋白调节T细胞活性的能力，包括抑制或钝化T细胞发育的能力。例如，可分析sc-TCR融合蛋白抑制免疫球蛋白类别转换(即IgM转换成IgG)的能力。参见如P.Linsley等，科学，(1992)257：792-795。

用到可溶性sc-TCR蛋白的诊断方法还包括体内诊断性成像和HLA分型(参见如A.K.Abbas，细胞和分子免疫学，第328页，W.B.Saunders Co.1991)。用于体内成像的融合蛋白带有放射性标记(如¹²⁵I、³²P、⁹⁹Tc)或可施用于哺乳动物、且试验对象可用已知过程扫描对sc-TCR的结合的其它可检测标记。对哺乳动物的这种分析可辅助对多种疾病包括如伴有APC之不利表达的免疫系统失调的诊断和治疗。

这些试验还可用于评估sc-TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc-TCR)在自身免疫病治疗中的应用。例如，如已公开的PCT专利申请PCT/US95/09816和PCT/US97/01617，以及上述未决的美国专利申请流水号08/382,454所述，实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是小鼠自身免疫病，并是公认的多发性硬化症模型。在一项试验实例中，小鼠经处理患上EAE，然后施用适当的sc-TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc-TCR)。接着评估动物以确定EAE的进展在施用融合蛋白或sc-TCR后是否受到抑制或阻止。

本发明sc-TCR蛋白诱导免疫应答(包括针对前述特定疾病进行免疫接种)的能力可轻易通过体内试验测定。例如，可以将该sc-TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc-TCR)施用于小鼠等哺乳动物，在开始用药及随后的一定时间间隔(如施用sc-TCR的2、5和8周后)时多次取血样。从血样中收集血清，分析是否因免疫接种产生了抗体。抗体浓度可按标准的免疫技术测定。

本发明还提供经施用编码sc-TCR蛋白的DNA序列而在哺乳动物，特别是人类等灵长类的细胞中表达该蛋白的方法。优选地，可根据已知方法将携带融合蛋白编码区、受到合适启动子如CMV启动子的适当控制的DNA直接注射于试验对象的骨骼肌。有关施用质粒DNA、受施对象的细胞对该DNA的吸收以及蛋白的表达方法已有报道(参见J.Ulmer等，科学，(1993)259：1745-1749)。对于可溶性融合蛋白，优选所编码的Ig-C_L链或其片段与所用宿主为免疫相容。

本发明之sc-TCR蛋白具有多种治疗用途。例如，可以施用该sc-TCR蛋白以减少或消除哺乳动物的免疫应答，如治疗患有或疑有癌症、传染病、过敏或自身免疫病(如多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、类风湿性关节炎等等)的人类等哺乳动物。可经任何一种适宜的用药方式给药，诸如直接施用编码该融合蛋白的DNA。那些遭受或将要遭受不必要的免疫应答所带来痛苦的人，如接受诸如心脏、肾脏、皮肤或其它器官移植手术的病人也适合这类治疗。在有关移植物排斥反应的情形下，治疗最好开始于手术前。

根据本发明，有多种方法可用于减少或消除哺乳动物的免疫应答。其中，一种减少不必要免疫应答的治疗方法是施用有效量的目的sc-TCR融合体以减少或消除致病性T细胞与超抗原或肽-MHC复合体之间的相互作用。从而可选择性控制T细胞介导的免疫应答如T细胞的增殖、分化、活化或B淋巴细胞的激活。优选地，该融合蛋白具有与介导不必要免疫应答的致病性T细胞至少相同或优选更强的对抗原的特异性结合亲和力。此时尤其优选上述已证实对配体的特异性结合亲和力增强的sc-TCR融合蛋白突变型蛋白。融合的Ig-C_L链或片段可用于通过常规免疫试验鉴定结合至靶细胞的融合蛋白。

sc-TCR蛋白、衍生自合适sc-TCR融合蛋白的sc-TCR、或根据在此公开的方法制备的抗体可通过注射如腹膜内注射或静脉注射施用于哺乳动物。融合蛋白，至少是用于治疗的那些分子，优选产自哺乳动物细胞或其它适宜细胞，并在使用前纯化，以使之基本上或完全不含热原质。治疗的最佳用量可通过常规方法确定，一般根据多种因素包括用药途径、病人体重、总的身体状况、性别及本领域内技术人员认定的其它这类因素而变化。

用药可以是单剂或或间隔数天或数周的多剂。术语“单剂”在此可以是一次释放的单剂，也可以是缓释剂。试验对象可以是哺乳动物(如人类或牛等牲畜以及狗和猫等宠物)，包括以包含sc-TCR、sc-TCR融合蛋白或抗体的药用组合物进行的治疗。本发明的这类药用组合物均按本领域内已知过程制备和应用。例如，包含药用有效量融合蛋白的制剂可以单剂或多剂容器如封闭的安瓿和小瓶的形式提供，也可冻干贮存(此时只要求在使用前加入无菌液态载体如注射用水)。对于多种用途还优选用脂质体制剂。胃肠道外施用的其它组合物也适于此，包括含水和不含水的无菌注射液(其中可能含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与受者血液等渗的溶质)；含水和不含水的无菌悬浮液(其中可能有悬浮剂和增稠剂)。

包括减少或消除T细胞应答的本发明方法也可与已知免疫抑制剂、抗病毒试剂、抗癌剂或抗炎剂联合应用，以更有效地治疗T细胞介导的疾病。例如，该融合蛋白可与常规免疫抑制药物如环孢菌素或抗炎剂如皮质类固醇和非类固醇类药物联合用于治疗自身免疫病和过敏。

如上述，sc-TCR蛋白(或衍生自目的sc-TCR融合蛋白的sc-TCR分子)可用于按本领域内已知技术产生抗体，并常常制成该融合蛋白的纯化样品。选用于产生抗体的sc-TCR融合蛋白可如上述从Ig-C_L链或片段裂解下来，以减少针对该免疫球蛋白链的免疫反应。如此获得的sc-TCR可作为免疫原使用。抗体也可由包含目的sc-TCR的一或多个表位的免疫原性肽生成。

更特别地，抗体的制备可通过单独用sc-TCR蛋白的纯化样品、如上述分离自目的sc-TCR融合蛋白或免疫原性肽的sc-TCR分子，或联合使用合适载体，对哺乳动物进行免疫接种而完成。优选地，用该sc-TCR分子作为免疫原。适合的哺乳动物包括典型的实验动物如绵羊、山羊、家兔、豚鼠、猪、大鼠和小鼠。优选用大鼠和小鼠，尤其是小鼠获得单克隆抗体。抗原施用于哺乳动物的合适途径可任选如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或皮内注射。最佳免疫间隔、免疫剂量等可在相对较大范围内变动，并可根据此公开内容凭经验确定。典型的过程包括经数周多次注射抗原。用常规技术从免疫动物血清中收集抗体并筛选出特异于sc-TCR的抗体。尤其感兴趣的是特异性结合V-α或V-β链的抗体，特别是其中的高变区，包括识别其上的线性或构象表位的抗体。单克隆抗体的产生可在能生产抗体的细胞、及采用形成杂交瘤细胞的标准融合技术用于生成单克隆抗体的那些细胞中完成。参见G.Kohler等(1975)，自然，256：456。通常，这包括使抗体生产细胞与永生化细胞系如骨髓瘤细胞融合，产生杂交细胞。或者，单克隆抗体可用Huse等(1989)，科学，256：1275的方法自细胞中产生。

一个合适的方案是在约2-7个月内对小鼠腹膜内免疫接种包含纯化sc-TCR复合体的组合物。然后可以取出免疫小鼠的脾细胞。取脾细胞之前分析免疫小鼠血清中对sc-TCR具有特异性的抗体的效价。然后将取出的小鼠脾细胞与带有诸如次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(HGPRT^-)或胸苷激酶缺陷(TK^-)之类标记的适当同基因或异基因(优选异基因)淋巴样细胞系融合。优选用骨髓瘤细胞作为淋巴样细胞系。以如约1比4的比例将骨髓瘤细胞和脾细胞混合。细胞可采用聚乙二醇(PEG)法融合。参见G.Kohler等，自然，文献同上。将如此克隆到的杂交瘤培养于培养基如RPMI-1640上。参见G.E.More等(1967)，美国医学会杂志，199：549。通过如放射免疫分析或酶免疫分析法筛选融合操作后培养的杂交瘤分泌能与纯化的sc-TCR特异性结合的抗体的情况。可用ELISA按标准方法筛选含抗体的血清。在这类筛选中显示阳性结果的杂交瘤可扩增并用有限稀释法克隆。最好再进行筛选，选出能结合溶液中以及生物样品中的sc-TCR的抗体。所分离的抗体可用任何适当的免疫技术包括亲和层析进一步纯化。

在有些应用中，可能需要生成能特异性结合sc-TCR的嵌合抗体衍生物，如组合了非人类动物可变区和人类恒定区的抗体分子，因而使抗体在人类试验者体内比相应的非嵌合抗体免疫原性更小。可制备各种类型的这类嵌合抗体，包括通过如产生人类可变区嵌合体，其中可变区部分、尤其是抗原结合区的保守区为人类来源，而只有高变区为非人类来源。有关人源化嵌合抗体及其产生方法的讨论参见S.L.Morrison，(1985)科学，229：1202；Oi等(1986)，生物技术，4：214；Teng等(1983)，PNAS，U.S.A.，80：7308；Kozbor等(1983)，今日免疫学，4：7279；Olsson等(1982)，酶学方法，9：3。

如上述，sc-TCR蛋白可按标准诱变技术轻易地修饰以提高对目的配体的特异性结合。例如，目的sc-TCR可通过分离有肽连接序列如上述连接的合适V-α和V-β链的编码DNA区段而制备。必要时DNA可与Ig-C_L连接，然后在目的V-α或V-β链内进行诱变如定点诱变。诱变方法的实例有丙氨酸扫描诱变(参见如Nisbet，I.T.等，(1985)基因分析技术2，23；Hines，J.C.，基因(1980)11，207；亦参见Sambrook等，文献同上)。若要调节sc-TCR融合蛋白的特异性结合亲和力，所选突变常为可影响sc-TCR互补决定区(即CDR，有时称为高变区)的结合亲和力的那些氨基酸替换。更特别地，这种氨基酸替换可以是保守或非保守替换，在本文中指sc-TCR中一个氨基酸被另一个氨基酸替换。在一些实例中，替换包括一个氨基酸被具有基本相似的化学特点的另一个氨基酸替换(保守的)。在另一些实例中，替换包括一个氨基酸被具有基本不同化学特点的另一个氨基酸替换(非保守的)。因此，sc-TCR中酪氨酸残基被苯丙氨酸残基替换代表的是保守型氨基酸替换，而丙氨酸残基被脯氨酸残基替换代表的是非保守替换。本领域内技术人员将能理解，诱变还可包括改变分隔sc-TCR之V-α和V-β链的肽连接序列的长度或氨基酸组成。此外，可诱变Ig-C_L链或片段以按需要改变其长度或氨基酸组成。但在大多数实例中，诱变针对的是V-α或V-β链，在融合蛋白的V-α或V-β链中平均产生一个氨基酸替换的突变。诱变程度可通过对诱变后V-α或V-β链的DNA测序而方便地进行分析。

优选地，V-α或V-β链的诱变将使sc-TCR融合蛋白对配体的特异性结合水平比天然TCR增加至少约2倍。

尽管是不太优选的方法，仍可用已知的化学诱变技术按所需对sc-TCR融合蛋白进行修饰。

本发明还提供了检测能抑制配体和T细胞受体间特异性结合的分子的方法。该方法包括在有能特异性结合T细胞受体的配体存在时温育单链T细胞受体融合蛋白，在有该配体和目的分子存在时温育该单链T细胞受体融合蛋白；评价在有和无该分子时，该配体和该单链T细胞受体融合蛋白之间的相互作用，其中有该分子时融合蛋白与配体间的相互作用比无该分子时弱说明该分子能抑制该配体和该T细胞受体之间的特异性结合。必要时此方法可用sc-TCR分子取代sc-TCR融合蛋白。

本文中术语抗体一般指完整的免疫球蛋白，也指能与该可溶性融合蛋白的sc-TCR分子结合的免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性片段包含抗体结合位点(即能特异性结合融合蛋白的peritope)。抗体片段的实例有，如Fab、F(v)、Fab’、F(ab’)2片段、还原免疫球蛋白的二硫键得到的“半分子”、单链免疫球蛋白或其它合适抗原结合片段(参见如Bird等(1988)，科学，242；Huston等(1988)，PNAS(USA)，85：5879；Webber等(1995)，分子免疫学，32：249)。抗体或其免疫活性片段可以是动物的(如小鼠或大鼠等啮齿类)、或嵌合形式(参见Morrison等(1984)，PNAS，81：6851；Jones等(1986)，自然，321)。

术语“特异性结合”或类似术语指在此公开的、能结合另一分子而形成特异性结合对的分子。但此分子不识别或结合其它分子，正如蛋白印迹ELISA、RIA、移动抑制试验、酶免疫分析、竞争试验、饱和试验或领域内已知的其它蛋白结合试验所测定。总参见Ausubel等，文献同上；Sambrook等，文献同上；Harlow和Lane，文献同上以及其中引用的有关检测分子间特异性结合之方法实例的参考文献。

相当纯的可溶性融合蛋白或核酸均至少约90-95％纯，优选至少98-99％纯或更纯，以便药用。一旦部分纯化或达到实质性纯度，该可溶性融合蛋白就可用于治疗(包括离体地)，或如本文所述在开发或执行体外或体内试验时应用。

本文提到的所有文件均全文引入本文作为参考。

以下非限制性实施例用以举例说明本发明。

实施例1-可溶性sc-TCR融合蛋白的构建

小鼠DO11.10细胞TCR的DNA序列已有报道(Kappler，J.等PNAS(1994)91 8462)。该TCR识别并结合I-A^d MHC II类分子中跨越第323-329位氨基酸的小鸡卵白蛋白肽(即OVA)。编码TCR的DNA一般按Kappler & Marrack，文献同上所述方法进行制备。

可简述为，用oligo-dT包被的磁珠按厂家(Dynal)建议从1×10⁶个DO11.10细胞中分离mRNA。将含C-α特异性“反向(back)”引物KC113(SEQ ID NO.6)与DO11.10 mRNA的混合物温育制成TCRα链的cDNA。再向混合物中加入常规量的核苷酸和逆转录酶以形成cDNA。用相似的方法，但用“反向”引物KC111(SEQ ID NO.4)替换KC113引物制备β链cDNA。以α链cDNA为模板，用引物KC112(SEQ ID NO.5)和KC113进行PCR以扩增一段650bp的5’XhoI-3’XmaIα链片段。一段750bp的链片段用引物KC111和KC110(SEQ ID NO.3)经PCR扩增而得，其5’和3’端分别有SfiI和SpeI位点。

由DO11.10 TCR构建sc-TCR，其中有共价连接的V-α和V-β链。有时，V-α链还包含C-α链片段和C-β链片段(见图5)。一般Cα链片段长约9个氨基酸，但在以下实施例4中公开了更大的C-α链。C-β链通常在紧邻全长C-β链中的第127位半胱氨酸残基之前的第126位氨基酸处被截短。我们发现，带有该半胱氨酸残基对sc-TCR表达极其不利。

实施例2-用于在大肠杆菌中表达sc-TCR融合蛋白的载体

包含与噬菌体衣壳蛋白(基因III或基因VIII)融合的sc-TCR分子的编码DNA区段的DNA载体的构建已述于上述未决的美国专利申请第08/813,781号。可简述为，为构建这些编码可溶性融合蛋白的DNA载体，对选自上述未决的美国专利申请的DNA载体进行修饰。参见实施例4-7。

A.DNA载体pJRS149

DNA载体pJRS149是具有pBluScript^TM(Invitrogen)骨架的噬菌粒。

B.DNA载体pKC12

如图1所示，将编码噬菌体基因III的DNA克隆至pKC12载体。

C.DNA载体pKC14和pKC15

以fd tet噬菌体(ATCC录入号37000)为模板，用OPR156(“正向”，SEQ ID NO.58)和OPR157(“反向”，SEQ ID NO.59)引物PCR扩增噬菌体基因VIII的DNA序列。再将基因VIII的PCR产物以XmaI-EcoRI片段形式克隆至载体pLL001中，产生载体pKC14。pLL001质粒衍生自PUC-19 DNA，其中在多接头区含有XmaI和EcoRI位点。此位点便于亚克隆基因VIII片段。此外，pLL001载体可作为穿梭载体用于克隆基因VIII DNA。将一段96bpNcoI-EcoRI片段如图1所示克隆至pJRS149载体中，便可由pKC14衍生载体pKC15。NcoI-EcoRI片段包含有多克隆位点(如SfiI，NcoI，SpeI，XhoI和XmaI)的合成性多接头、pelB前导序列、phoA启动子和基因VIII基因。载体pKC15带有源自pJRS149骨架的另一个pelB前导序列，能使基因克隆处于双顺反子操纵子控制之下。

D.DNA载体pKC16和pKC18

以α链cDNA为模板，使用引物KC113(SEQ ID NO.6)(“正向”)和KC112(SEQ ID NO.5)(“反向”)扩增TCR V-α、C-α基因，可从pKC16克隆XhoI-XmaI片段。以β链cDNA为模板、以KC110(SEQ ID NO.3)(“正向”)和KC111(SEQ ID NO.4)(“反向”)为引物经PCR扩增得到V-β、C-β基因片段，并克隆至pKC15中，形成pKC18。

E.DNA载体pKC27、pKC42和pKC44

经退火引物JA301(SEQ ID NO.95)和JA302(SEQ ID NO.96)制备(G4S)4多接头，构建载体pKC27。再将接头以SpeI-XhoI片段的形式克隆至pKC15载体。然后分别将V-α13.1和V-β、C-β区克隆至pKC27 DNA。简短说，V-α13.1基因片段经利用引物KC114(SEQ ID NO.7)(“正向”)和KC126(“反向”)(SEQ ID NO.19)、以载体pKC16 DNA为模板的PCR扩增而得。将V-α13.1基因作为SfiI-SpeI片段克隆至pKC42。pKC18用XhoI和XmaI消化后凝胶纯化V-β8.2和C-β链DNA。将此片段克隆至pKC42，制成pKC44载体。总之，pKC44载体包括sc-TCR，此sc-TCR是在phoA启动子的转录控制之下的sc-TCR/基因VIII融合蛋白。

F.pKC12、pKC45、pKC46和pKC51 DNA载体

从pKC12构建载体pKC45、pKC46和pKC51的过程见图3，并如下述。

修饰pKC12载体以使编码实施例1之sc-TCR的DNA在lacZ启动子的转录控制下表达。简短说，将已退火的引物KC134(SEQ ID NO.27)(“正向”)和KC135(SEQ ID NO.28)(“反向”)克隆至pKC12，使pKC12得到修饰，而产生载体pKC45。这样的修饰在已带有SfiI和EcoRI位点的pKC12多接头区加入了XmaI位点。此外，pKC45在EE-标记的5’端连接了编码基因III的DNA序列，还含有琥珀终止密码子。

琥珀终止密码子使sc-TCR融合蛋白在诸如XL1-blue的lacI^q琥珀抑制子宿主内的表达减少至约15-20％。为了将编码sc-TCR/基因III融合蛋白的DNA克隆至pKC45，用SfiI和XmaI切割pKC44 DNA。然后对sc-TCR片段进行凝胶纯化，克隆至pKCA5，产生pKC46。sc-TCR在pKC46中的插入如图3示，它与EE标记和基因III衣壳蛋白融合。

用XmaI和EcoRI消化pKC44和pKC46载体，使sc-TCR/基因VIII融合蛋白受控于lacZ启动子的转录控制。基因VIII DNA序列自消化后的pKC44DNA分离，作为SfiI-EcoRI片段克隆至凝胶纯化的载体pKC46 DNA中，产生pKC51。将pKC51中的sc-TCR插入片段与基因VIII衣壳蛋白融合。与载体pKC46不同的是，pKC51载体不包含EE标记或琥珀终止密码子。

实施例3-将编码融合蛋白的DNA克隆至DNA载体pEN2

实施例1产生的可溶性sc-TCR的表达可通过如图4示亚克隆至pEN2载体而增加。pEN2载体包括phoA启动子、基因10核糖体结合点及已修饰的pelB前导序列。在pEN2骨架中插入sc-TCR的pKC60和pKC67如图5示及下述。

A.构建DNA载体pKC60

pKC60载体通过将一段1204bp的SfiI-EcoRI片段导入pEN2而得。SfiI-EcoRI片段由V-α、V-β和C-β区组成。该片段是通过以pKC51的DNA为模板、用引物KC114(“正向”SEQ ID NO.7)和JWTCR208(“反向”SEQ ID NO.75)扩增而得。JWTCR209引物在C-β区3’端包含EE标记和XmaI位点。XmaI位点的加入有利于基因III和基因VIII的基因克隆。pKC60载体通过将上述sc-TCR XmaI-EcoRI片段克隆至pEN2载体而得。

B.构建DNA载体pKC61

为产生截短的sc-TCR，用引物KC115(“正向”SEQ ID NO.8)和JWTCR209(“反向”SEQ ID NO.74)经PCR扩增pKC46的V-α、V-β序列。将所得PCR扩增产物亚克隆至载体pKC60，产生载体pKC61。pKC61再在其EE标记序列的3’端加入6Xhis标记而修饰。

C.构建pKC62和pKC64 DNA载体

编码噬菌体基因III的DNA以TCR215(SEQ ID NO 6F)和218(SEQ IDNO 64)为引物、pKC46载体DNA为模板进行扩增，然后克隆至pKC60以产生载体pKC64。基因VIII的基因以TCR212(SEQ ID NO 71)和213(SEQ IDNO 70)为引物、pKC51载体DNA为模板进行扩增，再克隆至pKC60以产生载体pKC62。

D.DNA载体pKC63和pKC65的构建

基因III(pKC65)和基因VIII(pKC63)融合蛋白的相应目的基因片段经PCR扩增后克隆至pKC61载体骨架中。pKC65和pKC63因此都含有引物序列中编码的6xHis尾.

E.DNA载体pKC66和pKC67的构建

以pKC51的DNA为模板、用引物KC114(正向SEQ ID NO：7)和JWTCR217(反向SEQ ID NO：66)扩增包含V-α以及C-α链片段前8个氨基酸的SfiI-SpeI片段，制备pKC66和pKC67载体。为产生pKC66和pKC67载体，用KC114和JWTCR217引物扩增TCR DNA，然后将扩增的DNA亚克隆至已用SfiI和SpeI消化了的pKC62或pKC60中。这些载体各包含C-α区N端的8个氨基酸残基。将载体用于构建下述TCR文库。载体pKC66包含基因VIII的基因。

正如未决的美国专利申请第08/813,781号所述，DNA载体pKC46(pSUN18)和pKC62(pSUN19)已依照布达佩斯条约保藏于12301 Parklawn大街，Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。这些DNA载体是于1997年2月26日保藏在ATCC的，录入号为97895(pSUN18)和97896(pSUN19)。DNA载体pKC62(pSUN19)有phoA启动子、修饰的pelB序列、基因10核糖体结合点及噬菌体基因VIII启动子。DNA载体pKC46(pSUN18)有lacZ启动子、EE标记及噬菌体基因III蛋白。这些DNA载体可在大肠杆菌或其它合适的宿主中按常规方法培养。

DNA载体pKC46(pSUN18)和pKC62(pSUN19)均设计为能容纳多种Vα、Vβ-Cβ及多肽连接序列。两种DNA载体的Vα链可用SfiI和SpeI经限制性消化切出。Vβ-Cβ链可经XhoI-XmaI限制性消化切出。此外，这些DNA载体使得能够经SpeI和XhoI限制性消化而替换肽连接序列。

实施例4-载体pKC24、pKC73、pKC74、pKC75的构建

如下述构建DNA载体以作为与小鼠IgGκ链的融合蛋白形式表达实施例1中的DO11.11 sc-TCR。

为制备带有编码与小鼠IgGκ链融合之DO11.11 sc-TCR的DNA区段的DNA载体，用引物KC114(SEQ ID NO：7)和KC117(SEQ ID NO 10)经PCR再次扩增pKC16的VαCα链，产生5’SfiI-3’SpeI片段。将此DNA克隆至pKC15并测序。将正确片段限制性消化，连接至已被SfiI-SpeI消化的pKC15 DNA中，产生pKC24载体。pKC15和pKC16构建体的衍化已在上述实施例2C和2D中有述。

然后以pKC24 DNA为模板、用引物KC114(SEQ ID NO：7)和KC165(SEQ ID NO 131)、KC114和KC166(SEQ ID NO 132)以及KC114和KC167(SEQ ID NO 133)经PCR扩增，产生附加了不同长度C-α链的V-α链。将这些PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体系统(Promega)以便测定DNA序列。将正确片段经限制性消化并克隆至表达载体pKC60。在所有三个片段中，C-α链片段均结束于半胱氨酸残基。这一“终末”半胱氨酸残基被变为丝氨酸残基，但内部的所有半胱氨酸残基均未突变。最后的构建体pKC73带有C-α链的22个氨基酸，pKC74有72个氨基酸，pKC75有90个氨基酸(即完整C-α链)。pKC73、pKC74和pKC75 DNA载体插入物图示于图9A。

V-βC-β链用引物JWTCR222(SEQ ID NO.60)和JWTCR208(SEQ IDNO.75)PCR扩增为5’SfiI-3’XmaI片段。测序后，克隆至表达载体作为只有β链的阴性对照。

实施例5-可溶性DO11.10 sc-TCR融合蛋白的构建在哺乳动物细胞中和表达

能够大量生产的可溶性sc-TCR将是非常合乎需要的。为提高可溶性蛋白表达的水平，将sc-TCR构建体克隆至哺乳动物细胞表达系统。

按上述实施例3A，E制备的大肠杆菌DNA构建体pKC60和pKC67用引物KC169(SEQ ID NO.143)和KC170(SEQ ID NO.144)再次进行PCR扩增，产生5’AgeI-3’BstBI sc-TCR-IgGκ链(Cκ)融合基因。TCR-IgCκ表达载体的构建如下：载体骨架为质粒pCDNA3(Invitrogen)。用HindIII/XhoI切割该质粒，并插入“轻链多接头”DNA区段以产生开始的“轻链载体”。此接头包含限制性位点HindIII、KpnI、ClaI、PmlI、EcoRV、AgeI、XmaI、BamHI和XhoI以便于随后经克隆产生质粒pCDNA.LCPL。将带有轻链前导序列、抗CKMBκ轻链基因组片段和3’UTR的SmaI/BclIDNA区段克隆至pCDNA3.LCPL的EcoRV/BamHI位点。此片段中的小鼠κ内含子、外显子和3’UTR衍生自Richard Near博士提供的pNeo/26-IOVL(Near，R.等，(1990)，分子免疫学27：91-909)。然后进行诱变以消除NruI(209bp)、MluI(229bp)和BstBI(2962bp)，并导入NheI(1229bp)和BamHI(1214bp)位点，产生pCDNA3mut.LCPL.LCVK。

载体再经进一步修饰以除去可变的轻链CKMB Vκ。具体做法是，用EcoRV/XhoI消化质粒pCDNA3mut.LCPL.LCVK，插入带有EcoRV、AgeI、BstBI和XhoI位点的接头寡核苷酸片段，产生pSUN9。

DO11.10 sc-TCR用引物对KC169正向(5’gAg gTg ACC ggT gAg CagTAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g-3’)和KC170反向(5’gTg gAg TTCgAA Aag TgT ACT TAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g-3)进行PCR扩增后，作为AgeI/BstBI片段克隆至pSUN6载体，以构建pSUN27载体(pKC60-M)并表达该载体得到sc-TCR-κ恒定区融合蛋白。

pSun27模板DNA也可用引物KC169(SEQ ID NO.143)和KC201(SEQID NO.145)进行PCR扩增，产生不含IgGκ链融合体的5’AgeI-3’BstBIsc-TCR。pKC73、pKC74和pKC75 DNA也可用引物对经PCR扩增产生sc-TCR和sc-TCR-IgG Cκ融合片段，以连接至适当的哺乳动物表达载体中。

例如，将DO11.10 sc-TCR-IgG Cκ融合片段克隆至pGEM-T Easy载体系统(Promega)以便DNA测序。将正确片段限制性消化并克隆至哺乳动物表达载体。所得哺乳动物表达载体包含CMV启动子、新霉素抗性基因、小鼠IgGκ前导序列、小鼠κ内含子和小鼠κ恒定区外显子序列。所得载体命名为pKC60-M(pSUN27)和pKC67-M。这些载体的sc-TCR插入物如图9A所示。载体如图10所示。

用冷PBS清洗CHO细胞以备转染。将细胞重悬浮于PBS中并与10-40μg PvuI线性化的pKC60KM混合。冰上置10分钟后，细胞用设置为传送250伏、960μFd脉冲的Gene Pulser(BioRad)进行电穿孔。经脉冲的细胞置于冰上，加入10％IMDM培养基(IMDM、10％FBS、2mM谷氨酰胺、5000单位/ml青霉素、5000μg/ml链霉素)。将细胞稀释后加入96孔板中。37℃10％CO₂温育过夜后，将细胞培养于新霉素选择性培养基(IMDM、0.77mg/ml G418)中，每3-7天换一次培养基。“模拟”转染用细胞和PBS进行，作为阴性对照。

用抗独特型抗体、抗DO11.10 TCR mAb、KJ-1在ELISA试验中筛选表达可溶性sc-TCR-IgG Cκ分子的转染体。已公开的关于sc-TCR的报道已证实，功能性TCR与对抗独特型单克隆抗体(mAb)的结合之间具有十分密切的关系，即抗独特型mAb所识别的sc-TCR可主要识别MHC相关肽。参见Relter，Y.等，(1995)免疫2，281-287。为筛选转染体，96孔板用KJ-1的碳酸氢钠缓冲液，pH8.2被动包被过夜。在试验日，用3-5％脱脂奶粉(NFDM)封闭板至少1小时。洗涤各孔，将转染体上清加入板中。温育并洗板后，板上加生物素化的抗Cβ mAb H57-597(ATCC录入号HB-218)作用30分钟，然后洗板并与链霉抗生物素蛋白-HRP温育。加入TMB底物，用1N硫酸猝灭反应，经读取450nM的吸收值而鉴别出阳性孔。大肠杆菌中产生的sc-TCR的纯化产物作为标准参照物。

鉴别出的阳性转染体较多，但只选用来自最高稀释板的克隆作扩大培养。4克隆在自原始96孔板开始传代之前，再次用ELISA检验。根据这一定量筛选，克隆产生的可溶性DO11.10 sc-TCR-IgG Cκ均在200-400ng/ml的范围内。这些资料明确指示，可溶性sc-TCR-IgG Cκ融合蛋白具有正确折叠的Vα和Vβ对。

载体pSUN27已按布达佩斯条约保藏于上述地址的ATCC。该DNA载体于1997年9月17日保藏于ATCC，录入号209276。载体pSUN27包括CMV启动子、小鼠轻链前导序列、Kozak共有序列、小鼠Cκ基因内含子和外显子序列。参见图10，及Near等，文献同上。

载体pSUN27经设计能使各种sc-TCR分子与小鼠Cκ融合。例如，为将所需sc-TCR分子插入pSUN27载体，载体的多接头序列可用限制酶AgeI和BstBI消化并连接至已用AgeI和BstBI或ClaI消化的sc-TCR分子上。此外，载体pSUN9能容纳多种Ig-C_L链或其它Ig-C_L链片段。例如，为构建含有人类Cκ链的可溶性融合蛋白，可用BstBI和XhoI消化pSUN9。人类κ片段是将pDRHK载体用EcoNI和XhoI消化得到的，并克隆至pSUN9的BstBI和XhoI位点。

载体pDRHK已按布达佩斯条约存放于上述地址的ATCC。该DNA载体于1997年9月17日存放于ATCC，录入号209274。载体pDRHK为哺乳动物表达载体，包括CMV启动子、小鼠IgCκ前导肽、克隆区、小鼠κ内含子和人类κ恒定区外显子序列。

图12显示了由CHO细胞产生的单链TCR(DO11.10)-κ融合体的蛋白印迹。上清取自亲和纯化之前(第2道)和层析收集部分(第3道)。将5μl样品与2x SDS裂解缓冲液按1∶1的比例混合，在12％SDS-PAGE上按变性及非还原条件电泳。用两步检测系统检测蛋白。首先，将膜用生物素标记的H57mAb(1∶5000的稀释度)进行探测，然后，使膜与链霉抗生物素蛋白辣根过氧化酶(1∶2500)一起温育。数据表明CHO细胞表达了sc-TCR-κ融合体，提示与CNBr活化的sepahrose珠偶联的H57mAb可用于从培养上清中有效取出sc-TCR-κ融合体。

图13显示了纯化的sc-TCR(DO11.10)-κ融合体的蛋白印迹。对含有sc-TCR-κ融合体(参见图12)的培养上清300ml进行H57 mAb亲和柱层析。按标准的亲和层析过程进行，用0.1M甘氨酸pH3.0从层析柱中洗脱sc-TCR-κ融合体。第1道代表大肠杆菌中产生的sc-TCR(DO11.10)(阳性对照)，迁移到大约50千道尔顿(kD)。第2-4道代表纯化的sc-TCR(DO11.10)-κ融合体从最高浓度(第2道)到最低浓度(第4道)的稀释液。膜用与图12所述基本相同的方法探测。

图14显示纯化的sc-TCR-κ融合体的考马斯亮兰染色。纯化经两个抗体亲和柱完成。第一步，使含有sc-TCR-κ融合体的培养上清通过KJ-1抗体柱。KJ-1是识别DO11.10 TCR中正确配对的Vα和Vβ链的抗克隆型mAb。第1(最强)-3(最弱)道代表纯化的sc-TCR-κ融合体的各等份。从KJ-1层析柱收集含有纯化sc-TCR-κ融合体的级分后，使样品通过H57 mAb柱。第5和6道说明正确大小的蛋白分子的富集。将样品在12％SDS-PAGE上按变性和非还原条件电泳，然后用考马斯亮兰染色。

另外还进行了三结构域sc-TCR-κ融合体和四结构域sc-TCR-κ融合体瞬时表达的研究。COS细胞分别用质粒pKC60-M(pSUN27)、三结构域sc-TCR或pKC75-M、四结构域sc-TCR进行瞬时转染。48小时后，取1ml培养上清与0.5μg mAb F23.1(抗Vb8.2)一起温育过夜。第二天用山羊抗小鼠抗体包被的磁珠(Dynal)使sc-TCR-κ融合体与F23.1 mAb形成的免疫复合体沉淀。充分洗涤后，将磁珠悬浮于1x SDS裂解液10μl中并煮沸。在12％SDS-PAGE上按变性和非还原条件电泳并转移蛋白后，用生物素标记的H57mAb和链霉抗生物素蛋白-HRP偶联物探测尼龙膜上的sc-TCR-κ融合分子。结果如图15所示。第1道为阴性对照F23.1，与模拟转染的COS细胞的上清一起温育；第2道为pSUN27(三结构域sc-TCR，由Vα-VβCβ-κ融合体组成)；第4和5道为pKC75-M的两种不同分离物(四结构域sc-TCR，另包含Cα片段)。显然，四结构域sc-TCR-κ融合体的表达即使不比三结构域sc-TCR的好，也是同水平的，而且不同于pSUN27 sc-TCR-κ融合体的表达，pKC75-M融合体的均二聚体和单体以大致相等比例存在。

图16显示瞬时表达的sc-TCR(DO11.10)-κ融合变体的ELISA。sc-TCR融合体的分析用夹心ELISA进行，其中利用KJ-1抗克隆型mAB进行捕获，用生物素标记的H57 mAB及链霉抗生物素蛋白HRP检测结合的sc-TCR-κ融合体。

图17显示检测哺乳动物细胞中sc-TCR(p-149)-κ融合蛋白表达的夹心ELISA。各孔用特异于Vα2.3的mAb包被，结合的sc-TCR融合体用抗Vβ11的mAb或mAb H57检测。

图18显示sc-TCR p149和sc-TCR p149-κ融合蛋白在COS细胞中的瞬时表达。所设计的sc-TCR为含有或不含有κ恒定区的Vα-Cα_8.2-Vβ/Cβ。表达的蛋白用夹心ELISA检测，其中细胞用α-V_α2.1 mAb包被，受体通过与α-V_β11.0生物素标记的mAb和链霉抗生物素蛋白-HRP偶联物结合而检测。

实施例6-可溶性p-149 sc-TCR融合蛋白在大肠杆菌中的构建和表达

T细胞克隆p149识别受HLA-A2.1限制化的Hu野生型p53的一段肽(STPPPGTRV)。参见Theobald，M.等(1995)PNAS(USA)92，11993-11997。T细胞受体基因已如上述克隆为三结构域单链形式，以产生可溶性TCR和功能性受体分子。

简短说，自T细胞克隆分离mRNA，用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)制备cDNA。以此cDNA为模板用引物KC171(SEQ ID NO.134)和KC173(SEQ ID NO.136)进行聚合酶链式反应(PCR)，以产生5’SfiI-3’SpeI Vβ链片段，再用引物KC171(SEQ ID NO.134)和KC174(SEQ ID NO.137)进行PCR产生其中含有Cβ链的7个氨基酸的相似Vβ片段。相同的cDNA再作为PCR模板，以引物KC172(SEQ ID NO.135)和KC176(SEQ ID NO.138)产生5’XhoI-3’XmaI VβCβ链片段。Cβ链在紧邻其全长链中第127位半胱氨酸残基之前被截短。

将α和β链片段克隆至pGEM-T Easy载体系统进行DNA测序。将正确片段限制性消化，克隆至表达载体pKC60或pKC67，以产生Vα-(G₄S)₄-VβCβ sc-TCR分子。

pKC60和pKC67载体用相应限制酶消化以切出上述编码单链分子的基因片段，并连接p-149α和β链片段。新载体命名为pNAG1和pNAG2。pNAG1和pNAG2的DNA插入物如图9B示。

含VβCβ基因的DNA区段用引物KC199(SEQ ID NO.139)和KC176(SEQ ID NO.138)PCR扩增为5’SfiI-3’XmaI片段。经测序并克隆至表达载体作为只含β链的阴性对照。

K91大肠杆菌细胞用sc-TCR构建体pNAG1转化。转化细胞在高磷酸盐培养基上培养过夜以防止蛋白诱导，然后洗涤细胞，重新悬浮于缺乏磷酸盐的培养基中以使sc-TCR蛋白表达。简短说，在摇瓶中培养过夜后，细胞在缺乏磷酸盐的培养基中多次洗涤。sc-TCR融合蛋白的表达通过将洗过的细胞重新悬浮于缺乏磷酸盐的培养基中而启动。诱导约4小时后，收获细胞。通常4小时的诱导时间可得到合适水平的可溶性sc-TCR融合蛋白，蛋白印迹可检测。受控于phoA启动子对照的sc-TCR融合蛋白可通过将细胞培养在3和10升发酵罐或其它大批量制备容器如生物反应器中，而获得较高产量(如约10-400mg之间)。

我们发现，sc-TCR融合蛋白在慢诱导条件下的表达促进了融合蛋白的可溶性表达。

实施例7-可溶性p-149 sc-TCR融合蛋白在哺乳动物细胞中的构建和表达

用大肠杆菌DNA构建体pNAG1和pNAG2作模板，以引物KC203(SEQ IDNO.140)和KC204(SEQ ID NO.141)进行PCR产生5’AgeI-3’ClaI sc-TCR-κ链融合片段。可用引物KC203(SEQ ID NO.140)和KC205(SEQ IDNO.142)经PCR扩增相同的模板DNA而产生5’AgeI-3’ClaI sc-TCR，以表达不含κ链的蛋白。哺乳动物细胞用此DNA转染，经ELISA方法筛选sc-TCR蛋白的表达。

实施例8-sc-TCR融合蛋白株的生产

比较合乎需要的是选择特定的大肠杆菌菌株以使sc-TCR融合蛋白的可溶性表达达到最高水平。例如，可分析好几株已知的大肠杆菌菌株表达sc-TCR融合蛋白的能力(如XL1-B、MM294、TB1、UT5600和K91Kan)。简短说，宿主细胞株可用如pKC60、pKC73、pKC74或pKC75转化，在适于所编码的sc-TCR融合蛋白表达的条件下培养。然后在磷酸盐培养基中于30℃培养转化株。sc-TCR融合蛋白的诱导通过在缺乏磷酸盐的培养基中培养而进行。sc-TCR表达水平可经多种常规方法测定，包括用特异性识别sc-TCR融合蛋白的抗体进行探测的蛋白印迹。

简短说，蛋白印迹操作如下：在12％SDS-PAGE凝胶上加5OD/ml转化细胞悬浮液5μl，按标准的蛋白印迹技术转移至印迹膜上。用如抗EE标记的抗体(得到加利福尼亚圣迭戈的圣迭戈大学Gernot Walter’s实验室许可)探测印迹膜可检测sc-TCR。或者，可用其它抗EE抗体和EE标记(如Pharmacia的类似产品)。抗体结合后，加入山羊抗小鼠HRP标记的偶联物(Jackson实验室)。

未决的美国专利申请第08/813,781号中发现，大肠杆菌K91KAN菌株十分适于表达含sc-TCR分子的融合蛋白，尤其是pKC60载体。K91KAN菌株可产生大量的本发明之sc-TCR融合蛋白。

实施例9-sc-TCR融合蛋白的纯化

在此公开的sc-TCR融合蛋白必要时可从转化细胞中按常规方法经免疫层析纯化。包含噬菌体衣壳蛋白的sc-TCR融合蛋白的纯化方案已在未决的美国专利申请第09/813,781号中公开。

简言之，其中一个适宜纯化方案如下。层析柱可按每ml蛋白A包被的sepharose磁珠与约5mg仓鼠抗小鼠αβTCR抗体H57-597(ATCC录入号HB-218)偶联。将发酵罐中生产的细胞糊50g溶于100ml溶解液(0.05M Tris，pH8.0，150mM NaCl和5mM EDTA)得到大肠杆菌裂解物。重新悬浮的细胞两次通过French Press进行裂解。不溶物经10,000g离心20分钟除去。留下上清，以0.2ml/min的流速上样于抗体柱。随后用20倍柱体积的PBS洗层析柱，结合的sc-TCR融合蛋白用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，按1ml级分收集于含有0.05ml 2M Tris，pH8.0的管中。将含有sc-TCR的级分集中，对4升PBS透析过夜。第二天将纯化的蛋白用centricon过滤器(分子量截留值100)浓缩5-10倍。

sc-TCR融合蛋白制备物可用好几种方法评估其纯度，如SDS-PAGE凝胶电泳再考马斯亮兰染色。蛋白完整性可用上述实施例5的方法测定，或用抗体H57-597测定。或者，对于可操作连接有EE标记的DNA载体，可用EE标记抗体作探针。EE抗体识别一个9氨基酸的线性表位。抗-Glu-Glu(EE)EEEEYMPME(SEQ ID NO 98)。

实施例10-sc-TCR融合蛋白的鉴定

公开于未决的美国专利申请第08/813,781号的以下试验可用于鉴定本发明的sc-TCR融合蛋白。

A.分子量

如上述实施例5就DO11.10 sc-TCR融合蛋白所指出，其它sc-TCR融合蛋白的分子量可经标准SDS-PAGE凝胶电泳再染色如银染色或考马斯亮兰染色而测定。美国专利申请第08/813,781号提供了对sc-TCR分子用SDS-PAGE电泳测定分子量的实施例。预计大多数sc-TCR蛋白的分子量在40-60Kd之间，优选在约45-58Kd之间。

B.抗体竞争

一套抗αβTCR mAb可用于鉴定本文公开的sc-TCR融合蛋白，尤其是含小鼠κ链的蛋白。例如，仓鼠mAb H57-597可识别C-β区的一个表位。通过竞争试验分析结合单链可变区链上空间位置接近之表位的选定抗体之间的竞争效应是有可能的。例如，MR5-2和H57-597抗体可用于对包含合适Vα，Vβ区的sc-TCR融合蛋白上的表位作图。如未决的美国专利申请第08/813,781号所公开，已发现MR5-2和H57-597抗体识别的表位在空间位置上十分接近。可用其它抗体进一步鉴定可溶性融合蛋白中的sc-TCR部分，包括那些特异性识别标记物如9氨基酸EE序列的抗体。

C.构象折叠

有多种抗独特型mAb可用于检验本文之sc-TCR融合蛋白中Vα，β区是否正确折叠。例如，如未决的美国专利申请第08/813,781号公开，pKC60 DNA载体编码的融合蛋白确能正确折叠，证据是它可结合抗Vβ8.2抗体(MR5-2和F23.1)以及抗独特型mab KJ1(Kappler & Marrack博士所赠)。简言之，将sc-TCR融合蛋白与抗Vβ8.2抗体一起于4℃温育过夜，第二天与山羊抗小鼠抗体包被的磁珠(Dynal)结合。室温(RT)再温育该材料1小时。按常规过程使免疫复合体沉淀。然后用0.5ml PBS+0.5M NaCl充分洗涤磁珠以除去非特异结合的蛋白。经4次洗涤后，将磁珠重新悬浮于含或不含β-巯基乙醇的SDS裂解液50μl中，煮沸3分钟。取出磁珠，将溶液上样于12％SDS-PAGE凝胶上，在120伏电压下电泳1小时。电泳样品，用HRP标记的抗TCR抗体(得自Pharmingen的H57)或抗EE标记抗体探测印迹膜进行蛋白印迹。

上述实施例5公开了可用于检验DO11.10 sc-TCR融合蛋白是否正确折叠的特殊抗独特型抗体。

D.表面等离子体激元共振(BioCore)

表面等离子体激元共振可用于鉴定本发明之sc-TCR融合蛋白。例如，如未决的美国专利申请第08/813,781号所公开，pKC51编码的sc-TCR融合蛋白可以用表面等离子体激元共振鉴定。融合蛋白用标准的夹心试验检测，首先将sc-TCR分子捕获在包被有MR5-2或H57抗体的生物传感器芯片上(按厂商Pharmacia建议)。通常，若用其中一种抗体捕获sc-TCR融合蛋白，另一种抗体则用于形成三明治复合体。数据表明，这两种抗体识别可变区链的不同区域并竞争结合sc-TCR。

超抗原(即SAg)无需MHC形式的呈递便能结合某些V-β链。TCR和SAg之间的相互作用发生在V-β链的第4高变区(HV4)。由于SAg与HV4区的相互作用依赖于构象，故可应用表面等离子体激元共振测定sc-TCR融合蛋白是否能结合包被在芯片上的SAg。已知SAg能与TCR V-β8.2结合。已报道的用表面等离子体激元共振的最高亲和力为5×10^-5摩尔，由此使相互作用与TCR-MHC/肽的相互作用相当。

对包含可结合超抗原之单链可变区的sc-TCR融合蛋白的构建也包括在本发明的范围内。其中，如未决的美国专利申请第08/813,781号所公开，被称为SEC3的链球菌SAg(毒素技术，Tampa Fl.)可结合包含V-β8.2区的sc-TCR分子。如已公开，超抗原经标准的胺偶联化学法偶联到芯片上。纯化的融合蛋白以2μl/min的流速通过芯片，浓度范围约2μM-16μM。作为对照，融合蛋白对空白芯片的非特异结合与对SEC3包被芯片的特异性结合的测定实验平行进行。有关结合的数据通过比较sc-TCR与这两种芯片结合的差别进行总结。数据表明，sc-TCR分子与芯片上的SEC3 SAg之间存在特异性相互作用。这些数据说明sc-TCR分子包含一个正确构象的V-β8.2区。

未决的美国专利申请第08/813,781号公布，pKC60载体产生的融合蛋白根据Biocore的测定可与SEC3超抗原结合。相关的Biocore实验可对本发明之能结合超抗原的sc-TCR融合蛋白进行以测定是否正确折叠。

实施例11-融合蛋白在OVA特异性T细胞杂交瘤结合试验中的活性

检验包含sc-MHC I类或II类分子的MHC复合体功能的试验已由上述已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617以及上述未决的美国专利申请流水号08/382,454公开。更具体地说，公开的PCT申请PCT/US97/01617公开了T细胞杂交瘤细胞试验、用于这类试验的细胞(如DO11.10)、带有共价连接或非共价结合的呈递肽(如OVA或HSV gD12肽)的sc-MHC I类和II类分子。

已公开的试验均特别适于测定本文sc-TCR融合蛋白的功能。一般而言，这些试验都是基于细胞的竞争抑制试验，可用于测定sc-TCR融合蛋白的功能及生物活性。例如，上述实施例1和2中产生的可溶性融合蛋白可用于阻断DO11.10细胞中超抗原或抗原参与MHC分子中。根据上述方法，相互作用通过测量IL-2的产量而检测。

A)细胞杂交瘤细胞试验

已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617以及未决的美国专利申请流水号08/382,454公开了一种T细胞杂交瘤试验。这类试验可方便用于检验本发明之sc-TCR融合蛋白的功能。

简言之，DO11.10T细胞杂交瘤系可表达特异于小鸡卵白蛋白之17氨基酸肽片段(第323-339位氨基酸)的细胞表面T细胞受体。OVA肽由表达小鼠II类MHC分子I-Ad的APC呈递给DO11.10细胞。当肽被适当APC呈递时，DO11.10细胞通过产生IL-2进行应答，而IL-2的产生可用来衡量T细胞的活化。一项T细胞杂交瘤细胞试验的实例如下述。

将sc-IA^d/OVA复合体与sc-TCR融合蛋白一起稀释在DPBS(无Mg²⁺和Ca²⁺离子)中，并用来包被96孔板。优选地，sc-IA^d/OVA肽包括共价连接的呈递肽。室温温育过夜后，各孔用无Mg²⁺和Ca²⁺离子的DPBS洗两次。将约1×10⁵ DO11.10细胞在包被或未包被0.5μg MHC/肽分子的孔中37℃温育4或7小时。在相关实验中，sc-TCR融合蛋白可与DO11.10细胞一起加入。

为证实DO11.10细胞系衍生的sc-TCR融合蛋白(参见上述实施例1和2)的特异性，可应用第二种T细胞杂交瘤(gD)，该杂交瘤也是IAd限制性的，但能识别HSV肽。gD T细胞杂交瘤已公开于PCT申请PCT/US97/01617中。利用该试验可证实：sc-TCR融合蛋白能抑制DO11.10杂交瘤细胞产生IL-2，而对gD 12T细胞杂交瘤的IL-2生产抑制效应很小(如果有的话)。在含完全培养基(RPMI 1640，添加了10％FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺)的96孔平底板上进行培养。温育4或7小时后，用IL-2夹心ELISA法分析培养上清中是否有IL-2。

适于检测IL-2的方案已公开在已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617以及未决的美国专利申请流水号08/382,454和08/596,387中。适宜的IL-2夹心ELISA实验程序基本如PharMingen所述进行。简短说，用50μl的2μg/ml大鼠抗小鼠IL-2抗体包被各孔。4℃温育过夜后抗体通过被动扩散而结合到塑料上。用PBS/0.5％吐温20洗板两次，然后每孔加入100μl细胞培养上清，室温温育4小时。再用PBS/吐温洗板六次，然后加入第二抗体即生物素化的大鼠抗小鼠IL-2抗体。将该抗体室温温育1小时，然后用PBS/吐温洗板六次。最后，每孔加入100μl的25μg/ml链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温温育30分钟。用PBS/吐温洗板8次后，加入100μl ABTS底物，在OD405nm读取信号。通过对IL-2标准曲线绘图而定量确定产生的IL-2的浓度。

用于活化DO11.10和gD12细胞的I-A^d/肽分子的最佳剂量为可提供略次于最强应答的剂量。因此，实验可在包被了0.5μg I-A^d/肽的孔中温育4或7小时而完成。

通常可检验本发明之可溶性sc-TCR融合蛋白阻止DO11.10细胞产生IL-2的量于10^-9-10^-4M浓度范围的能力。可用约10∶1至1∶1摩尔比的可溶性sc-TCR和包被于板上的可溶性I-A^d/肽分子进行实验。浓度可根据需要调节。最佳情况下，与可溶性sc-TCR融合蛋白预先温育后DO11.10的IL-2产量比gD12的IL-2产量减少，说明可溶性sc-TCR融合蛋白能以TCR特异性方式抑制免疫应答。

由于TCR与MHC/肽的结合亲和力较低，故在抑制试验中用sc-TCR融合蛋白并非总能观察到IL-2产生减少。但通过如下述产生多价sc-TCR融合蛋白可提高相互作用的亲和力。通过提高sc-TCR融合蛋白的亲和力(并阻止它们解离)，几乎没有TCR能有机会结合MHC/肽复合体。

实施例12-多价融合蛋白的制备

有好几种已知方法可用于制备多价分子。多价sc-TCR融合蛋白可通过将本发明之sc-TCR融合蛋白按标准方法生物素化，再在加入链霉抗生物素蛋白后交联分子而制备。生物素-链霉抗生物素蛋白的偶联可产生多价sc-TCR融合蛋白，通常为四聚体形式。

这样的多价sc-TCR融合蛋白也可通过将融合蛋白根据已知方法(参见如Newman，S.L.等，免疫学杂志(1995)154，753)共价连接于胶乳珠(Polysciences，Inc.Warrington，PA)上而制备。例如，sc-TCR融合蛋白可直接通过氨基或二硫基与胶乳珠偶联。用链霉抗生物素蛋白或可特异性结合sc-TCR的抗体包被胶乳珠都可使sc-TCR的变性减至最小。例如，如果sc-TCR如上述包括EE标记，便可用EE标记抗体包被胶乳珠。

实施例13-sc-TCR融合蛋白体外对抗原刺激的T细胞增殖的影响

可检验本发明之sc-TCR融合蛋白抑制抗原刺激的T细胞增殖的能力。

例如，在上述已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617以及未决的美国专利申请流水号08/382,454的一个实施方法中，T细胞首先从哺乳动物如小鼠中分离。例如，用于完全弗氏佐剂中的50μg OVA323-339-KLH皮下接种于BALB/C小鼠(MHC II类：I-Ad)的尾根部可得到OVA致敏的T细胞(参见Harlow & Lane，文献同上)。例如，可间隔7天进行两次免疫接种，第二次注射的一周后，可处死小鼠，取出腹股沟淋巴结和体侧淋巴结，制成单细胞悬液。然后将单细胞悬液在尼龙纤维和Sephadex G-10柱上温育以耗尽抗原呈递细胞。可将纯化的T细胞群再单与Click’s培养基温育，或与溶于Click’s培养基中的sc-TCR融合蛋白一起温育。

BALB/c小鼠的活化B细胞可作为APC用于常规B细胞增殖试验中。例如，B细胞可制备如下：加50μg/ml LPS(即脂多糖)将脾细胞培养48-72小时，此时可通过在Ficoll/Hypaque(Pharmacia)上经密度梯度离心分离活化的细胞。用OVA 323-339肽对活化B细胞脉冲3小时，充分洗涤，用多聚甲醛固定以抑制B细胞增殖，再加入纯化T细胞本身中或T细胞加上sc-TCR融合蛋白混合物中。参见细胞免疫学可选方法，(1980)B.B.Mishell & S.M.Hiigi W.H.Freeman and Co.San Francisco。

可加入上述实施例1-2所制备的sc-TCR融合蛋白以抑制T细胞对APC的结合。

可在96孔圆底微滴板上进行标准B细胞增殖试验，试验在37℃、5％CO₂中进行3-5天。可用WST-1(Boehringer Manngeim)试剂对板上的孔脉冲4小时，然后终止培养。再记录培养物的光密度。sc-TCR融合蛋白存在时肽反应性T细胞增殖的程度可指示小鼠经免疫接种后发生的TH细胞应答(即克隆扩充)。

实施例14-sc-TCR融合蛋白体内对抗原刺激的T细胞增殖的影响

还可按上述已公开的PCT申请PCT/US95/09816以及未决的美国专利申请流水号08/382,454和08/596,387中公开的方法检验本发明之sc-TCR融合蛋白体内对T细胞克隆扩充的抑制。

例如，三个检验组可如下设置：可对15只BALB/c小鼠腹膜内(IP)注射完全弗氏佐剂中的约10-100μg OVA 323-339-KLH偶联物，以诱导对OVA 323-339肽的免疫应答。免疫前1天以及OVA-KLH免疫的2天后，5只小鼠IP注射由DO11.10细胞产生的sc-TCR融合蛋白(实施例1和2)约10-100μg的PBS溶液。sc-TCR融合蛋白将与I-Ad/OVA MHCII类分子结合，减少或消除TCR分子参与抗原特异性T细胞。剩下10只小鼠可作为对照。例如其中5只可接受PBS，另5只接受sc-TCR融合蛋白。免疫的10天后处死小鼠。取出淋巴结，制成单细胞悬液。使该悬液在尼龙纤维和Sephdex G-10柱上温育以耗尽抗原呈递细胞。

所得纯化T细胞群可与被OVA 323-339肽脉冲的APC一起温育。可用BALB/c小鼠的活化B细胞作为增殖试验中的APC。B细胞的制备如下：将小鼠脾细胞与50μg/ml LPS混合培养48-72小时，此时可在Lymphoprep上经密度梯度离心分离活化的细胞。然后用OVA 323-339肽对活化B细胞进行脉冲3小时，充分洗涤，用多聚甲醛固定以抑制B细胞增殖，再加至纯化的T细胞中。

可在96孔圆底微滴板上进行T细胞增殖试验，试验条件为37℃、5％CO₂，3-5天。可用WST-1试剂对板上的孔脉冲4小时，然后终止培养并读取不同吸光度。该试验中肽反应性T细胞增殖的程度可指示小鼠免疫后发生的TH细胞应答(即克隆扩充)。预计sc-TCR融合蛋白与OVA-KLH或与HSV-KLH一起注射，将能限制克隆扩充量及后续OVA反应性T细胞系的体外增殖，而不影响HSV反应性T细胞系的扩充。

实施例15-小鼠自身免疫病的抑制

试验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是一种自身免疫病，一般被认为是多发性硬化症的动物模型。两种蛋白的致脑炎区：髓鞘脂碱性蛋白(MBP第91-103位氨基酸)和蛋白脂质蛋白(PLP第139-151位氨基酸)已得到鉴定。参见Martin，R.等(1992)免疫学年鉴10：153。

在SJL小鼠中，经致脑炎肽免疫或MBP反应性T细胞过继转移后可诱发EAE。为测定可溶性抗MBP 91-103或抗PLP 139-151 T细胞受体的治疗能否预防T细胞活化后的EAE进程，可对SJL小鼠体内注射MBP 91-103和PLP 139-151反应性T细胞母细胞。适于检测这类小鼠中T细胞扩充的试验已公开于上述已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617以及未决的美国专利申请流水号08/382,454中。

正如上述已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617以及未决的美国专利申请流水号08/382,454所述，在SJL小鼠背部免疫接种于完全弗氏佐剂中的约400μg MBP 91-103可诱导EAE。10-14天后，如上述收获定域引流(regional draining)淋巴结细胞，在24孔板上按每孔6×10⁶细胞的量加入RPMI 1640培养基/10％胎牛血清/1％青霉素/链霉素/50μg/ml MBP 1.5ml进行培养。经4天的体外刺激后，通过Ficoll/Hypaque密度梯度离心(Pharmacia)收获MBP 91-103反应性T细胞母细胞，用PBS洗两次，然后每只小鼠注射1.3×10⁷细胞。

接受了致脑炎性MBP 91-103反应性T细胞的小鼠可再在当天、第3和7天静脉注射含有特异于MBP 91-103之Vαβ链的sc-TCR融合蛋白100μg、含有特异于PLP 139-151之Vαβ链的sc-TCR融合蛋白100μg(阴性对照)、或生理盐水(空白对照)(总剂量为300μg)。可进行临床和组织学评估以证实对MBP 91-103+IA有反应性的sc-TCR分子抑制小鼠EAE的进程。

如上述已公开的PCT申请PCT/US95/09816、PCT/US97/01617号以及未决的美国专利申请流水号08/382,454所述，为了用PLP肽139-151诱导SJL小鼠的EAE，可对小鼠免疫接种溶于PBS并按1∶1的比例与包含4mg/ml结核分枝杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂混合的PLP肽139-151。小鼠可随后接种152μg肽佐剂复合体。当天及48小时后，所有动物接受400ng百日咳毒素。然后如上述进行EAE的过继转移。

根据上述方法(参见实施例1)，可自正常及患有EAE病的SJC小鼠获得TCR DNA。此TCR DNA可用于构建sc-TCR，用于与适当DNA载体连接形成本发明之包含小鼠κ链或其合适片段的sc-TCR融合蛋白。然后可根据上述实施例表达并在必要时纯化PLP或MBP反应性sc-TCR融合蛋白。还可再检验sc-TCR融合蛋白预防EAE发展的能力。

本文就本发明的优选实施方案进行了描述。但本领域内技术人员清楚，理解了本文公开内容后，可在本发明精神和范围内进行各种修改和改进。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：Sunol Molecular Corporation

(ii)发明题目：可溶性单链T细胞受体蛋白

(iii)序列数：146

(iv)通讯地址：

(A)地址：Dike，Bronstein，Roberts & Cushman，LLp

(B)街名：130 Water Street

(C)城市：Boston

(D)州名：MA

(E)国家：美国

(F)邮编：02109

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：I BM可兼容机

(C)操作系统：DOS

(D)软件：FastSEQ的Windows 2.0版

(vi)当前申请信息：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：

(Vii)在先申请资料：

(A)申请号：08/943,086

(B)申请日：1997年10月2日

(Viii)代理人/代理机构信息：

(A)姓名：Corless，Peter F

(B)登记号：33,860

(C)参考/文档号：47594-PCT

(iX)电信信息：

(A)电话：617-523-3400

(B)电传：617-523-6440

(C)电报：

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1

CGGCCATGGC CCAGCTGCAG ACTAGTGC 28

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

GGCCGCACTA GTCTGCAGCT GGGCCATGGC CGGCT 35

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3

CTCGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCGAGGCT GCAGTCACCC AAAGC 45

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4

CTTCCTCACT AGTACAGTCT GCTCGGCCCC AG 32

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5

GATGGCCTCG AGGAGCAGGT GGAGCAGCTT 30

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6

GACTAGCCCG GGACAGGGAA CGTCTGAACT GGG 33

(2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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CTCGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCGAGCAG GTGGAGCAGC TTCCT 45

(2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9

CTCGCGCCCG GGACAGTCTG CTCGGCCCCA GGC 33

(2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10

CTCGCGACTA GTACAGGGAA CGTCTGAACT GGG 33

(2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11

CTCGCGCCCG GGGTCTGCTC GGCCCCAGGC 30

(2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12

CTCGCGACTA GTGGGAACGT CTGAACTGGG 30

(2)SEQ ID NO：13的资料：

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(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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CTCGCGACTA GTGTCTGCTC GGCCCCAGGC 30

(2)SEQ ID NO：14的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑构型：线性

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(A)长度：15个碱基对

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CGCCTGGTAC TGAGC 15

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(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

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CCACCCTCAG AACCG 15

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(A)长度：39个碱基对

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GGGGGGGAAT TCTATTAGCT TGCTTTCGAG GTGAATTTC 39

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GATCCCTCCT GGACACGCAG GATGGAAGGA AGCTGCTCCA CCTGCTCAGC ACGAACAACA 60

CGGTCGTCGA TCGGTTCCGG CGGGGC 86

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(A)长度：86个碱基对

(B)类型：核酸

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CATGGCCCCG CCGGAACCGA TCGACGACCG TGTTGTTCGT GCTGAGCAGG TGGAGCAGCT 60

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(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

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GAGGTGGAAT TCTATTAAGA CTCCTTATTA CGCAGTATG 39

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(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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GAGGAGGTGG TGACTAGAAG CAGGTTCTGG GTTCTGGATG TTTGGCTCTA CAGTGAG 57

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(A)长度：51个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

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(C)链型：单链

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GAGGTGCCCG GGACTGTTGA AAGTTGTTTA GC 32

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(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：69

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：70

GAGGTGGAAT TCTATTAGCT TGCTTTCGAG G 31

(2)SEQ ID NO：71的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：71

GAGGTGCCCG GGGCTGAGGG TGACGATCCC G 31

(2)SEQ ID NO：72的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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AATTCTCATC AGTGATGATG GTGATGGTGC 30

(2)SEQ ID NO：73的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：73

CCGGGCACCA TCACCATCAT CACTGATGAG 30

(2)SEQ ID NO：74的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：56个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：74

GTGGAGCCCG GGTTCCATCG GCATGTACTC TTCTTCCTCT ACAACTGTGA GTCTGG 56

(2)SEQ ID NO：75的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：64个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：75

GAGGTGGAAT TCTCACCCGG GTTCCATCGG CATGTACTCT TCTTCCTCGT CTGCTCGGCC 60

CCAG 64

(2)SEQ ID NO：76的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：61个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：76

GAGGTGCTGC AGGTTCCATC GGCATGTACT CTTCTTCCTC GTCTAGACGG CCCCAGGCCT 60

C 61

(2)SEQ ID NO：77的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：77

GTGGAGCTGC AGGGTCTAGA CGGCCCCAGG CCTC 34

(2)SEQ ID NO：78的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：59个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：78

GTGGAGCTGC AGGTGATCCA CCCCCTCCAG ATCCACCCCC TCCGTCTGCT CGGCCCCAG 59

(2)SEQ ID NO：79的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：79

GTGGAGAAGC TTTGCCGAGC AGGTGGAGCA GC 32

(2)SEQ ID NO：80的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：80

GGGGGGGAGG TGCTGGAGCG AGGCAGCAGT CACC 34

(2)SEQ ID NO：81的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：81

GAGCCCACTA GTTTGGCTCT ACAGTGAGTT TGGTG 35

(2)SEQ ID NO：82的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：65个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：82

CTAGACCAGC AAATCTGCAC CCACAGAATC CCTAGGACAG CTCCCAGGTT CCTCTGCATG 60

GTGGA 65

(2)SEQ ID NO：83的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：65个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：83

AGCTTCCACC ATGCAGAGGA ACCTGGGAGC TGTCCTAGGG ATTCTGTGGG TGCAGATTTG 60

CTGGT 65

(2)SEQ ID NO：84的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：84

GATCGGTCTA GAGGTGAGCA GGTGGAGCAG CTTCC 35

(2)SEQ ID NO：85的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：85

GCCTGGAGAC TCAGCCATG 19

(2)SEQ ID NO：86的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：86

GAAGTACATG GCTGAGTCTC C 21

(2)SEQ ID NO：87的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：87

GATGAACGTT CCAGATTCCA TGG 23

(2)SEQ ID NO：88的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：88

CCCAAATCAA TGTGCCGAAA AC 22

(2)SEQ ID NO：89的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：53个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：89

CTAGAACACA GGAGACTGGA GAGCACGAAG AAGAGCCTGG AGCCCATGGT GGA 53

(2)SEQ ID NO：90的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：90

GCTCTCCTTG TAGGCCTGAG 20

(2)SEQ ID NO：91的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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GTACTTCTGT GCCAGCGGTG 20

(2)SEQ ID NO：92的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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GAGCAATTAT AGCTACTGCC TG 22

(2)SEQ ID NO：93的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：93

GGTCTGGAGG CCTTGTATCC 20

(2)SEQ ID NO：94的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：53个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：94

AGCTTCCACC ATGGGCTCCA GGCTCTTCTT CGTGCTCTCC AGTCTCCTGT GTT 53

(2)SEQ ID NO：95的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：65个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：95

TCGAGGAACC GCCACCGCCA GAACCGCCGC CACCGGAACC ACCACCGCCG CTGCCACCGC 60

CACCA 65

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(i)序列特征：

(A)长度：65个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：96

CTAGTGGTGG CGGTGGCAGC GGCGGTGGTG GTTCCGGTGG CGGCGGTTCT GGCGGTGGCG 60

GTTCC 65

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(i)序列特征：

(A)长度：8个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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CCACCATG 8

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(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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Glu G1u G1u Glu Tyr Met Pro Met Glu

1 5

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(A)长度：63个碱基对

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(C)链型：单链

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ATGAAATACC TGCTGCCGAC CGCAGCTGCT GGTCTGCTGC TGCTGGCGGC CCAGCCGATG 60

GCC 63

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(i)序列特征：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：100

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gln Pro Ala Met

20

(2)SEQ ID NO：101的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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GCCGGCCATG GCCRGTGCTG TCRTCTCTC 30

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(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGAMRCCM ARGTSACCC 29

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(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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GCCGGCCATG GCCGATGTGA AAGTAACCC 29

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGAMRCWG MCRTYTMCC 29

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCARKGCTG GDGTCACTC 29

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGRTRCTG GAGTCTCCC 29

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGATGCTR GARTCACCC 29

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGATTCTG GAGTCACAC 29

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGAYGCTG GWGTTATCC 29

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGATGCTG RYRTTAYCC 29

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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GCCGGCCATG GCCGAAGCTG GAGTTACTCA G 31

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(B)类型：核酸

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GCCGGCCATG GCCGATGCTA CTATTCATCA ATGGCC 36

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(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

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GCTGCCACCG CCACCCACCT TGTTCAGGTC C 31

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(B)类型：核酸

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GCTGCCACCG CCACCCACGT TTTCAGGTCC 30

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GGAGGCGGCG GTTCTGCTAA GAGACCACMC AGCC 34

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GGAGGCGGCG GTTCTCAGAA GRTAACTCAA RCSC 34

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GGAGGCGGCG GTTCTCAGTC KGTGASCCAG C 31

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(A)长度33个碱基对

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GGAGGCGGCG GTTCTCAGAG AGTGACTCA GCC 33

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GGAGGCGGCG GTTCTCWGMA SGTGRAACAA RGTCC 35

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GGAGGCGGCG GTTCTCAGCA AGTTAAGCAA AATTC 35

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GGAGGCGGCG GTTCTGAGAR TGTGGRGCWG CATC 34

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(B)类型：核酸

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GGAGGCGGCG GTTCTAAKGA RGTGGMGCAG RRTYC 35

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(A)长度：32个碱基对

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GGAGGCGGCG GTTCTCAGCT GCTGGAGCAG AG 32

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(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

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GGAGGCGGCG GTTCTCAAMA GRKAGAASAG RATYC 35

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(B)类型：核酸

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GGAGGCGGCG GTTCTGGACA AARCMTTGAR CAG 33

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(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

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GGAGGCGGCG GTTCTAAGGA CCAAGTGTTT CAG 33

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(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

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TTCATAGACT AGTAGGGTCA GGGTTCTGG 29

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(B)类型：核酸

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CCACCGCCAC CGTCGCCCGC CACCACCAAG GCCATCCGCC GCCAAGA 47

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gAggAggTggTgACTAgTgCTgAgggTgCTgTCCTgAg

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(B)类型：核酸

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GAGGAGGTGA CTAGTGCTGG TGAAGCTTGT CTGG 34

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GAGGAGGTGG TGACTAGTAC TGGGAACGTC TGAACTGGG 39

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(i)序列特征：

(A)长度：41个碱基对

(B)类型：核酸

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GAGGTGGAGG CCCAGCCGGC CATGGCCCAG GTGAGACAAA G 41

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(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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GAGGTGGAGC TCGAGCAATG CTGCTGGTGT CATCCAAAC 39

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(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

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GAGGTGGAGA CTAGTGTCAA GGTTGACCTG AAG 33

(2)SEQ ID NO：137的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

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GAGGTGGAGA CTAGTAGCAGGTTCTGGGTT CTG 33

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(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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GAGGTGGAGC CCGGGGTCTG CTCGGCCCCA GGC 33

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(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：139

GGCCCAGCCG CCAATGCTGG TGTCATCCAA AC 32

(2)SEQ ID NO：140的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：140

GAGGTGACCG GTCAGCAGGT GAGACAAAGT CC 32

(2)SEQ ID NO：141的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：141

GTGGAGATCG ATAAAGTGTA CTTACGTTTG TCTGCTCGGC CCCAG 45

(2)SEQ ID NO：142的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：53个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：142

GTGGAGATCG ATAAGTGTAC TTACGTTTTC ATTAACAGTC TGCTCGGCCC CAG 53

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(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：143

GAGGTGACCG GTGAGCAGGT GGAGCAGCTT CC 32

(2)SEQ ID NO：144的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：144

GTGGAGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTGT CTGCTCGGCC CCA 43

(2)SEQ ID NO：145的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：145

GTGGAGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTTC ATTAGTCTGC TCGGCCCCA 49

(2)SEQ ID NO：146的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑构型：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：146

Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val

1 5

Claims

1.含有依次共价连接的以下部分的可溶性融合蛋白：1)T细胞受体V-α链，2)肽连接序列，3)T细胞受体V-β链，4)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β链片段，以及5)免疫球蛋白轻链恒定区或其片段。

2.权利要求1的可溶性融合蛋白，其中还包含共价连接于T细胞受体V-α链C端与肽连接序列N端之间的T细胞受体C-α链或片段。

3.权利要求2的可溶性融合蛋白，其中T细胞受体C-α链片段长5-90个氨基酸。

4.权利要求2的可溶性融合蛋白，其中T细胞受体C-β链片段长50-126个氨基酸。

5.权利要求1的可溶性融合蛋白，其中肽连接序列长2-25个氨基酸。

6.权利要求1的可溶性融合蛋白，其中免疫球蛋白轻链恒定区为Cκ链或Cκ链片段。

7.权利要求6的可溶性融合蛋白，其中Cκ链片段长90-110个氨基酸。

8.权利要求1的可溶性融合蛋白，其中V-α链和V-β链与细胞毒性T细胞上的T细胞受体V链有至少90％相同。

9.权利要求1的可溶性融合蛋白，其中所述T细胞受体的V区已人源化。

10.权利要求1的可溶性融合蛋白，其中所述T细胞受体的C区已人源化。

11.权利要求2的可溶性融合蛋白，其中所述C-α链或其片段缺少至少一个半胱氨酸残基。

12.含有依次共价连接的以下部分的可溶性融合蛋白：1)T细胞受体V-α链，2)肽连接序列，3)T细胞受体V-β链，4)T细胞受体在C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β链片段，以及5)Cκ链、Cλ链或它们的片段之一。

13.权利要求12的可溶性融合蛋白，其中还包含共价连接于V-α链和肽连接序列之间的T细胞受体C-α链或片段。

14.权利要求12的可溶性融合蛋白，其中还包含共价连接于该可溶性融合蛋白上的至少一种蛋白标记。

15.权利要求14的可溶性融合蛋白，其中还包含共价连接于C-β链片段和Cκ链、Cλ链或它们的片段之间的蛋白标记。

16.权利要求12的可溶性融合蛋白，其中还包括共价连接的效应物分子。

17.权利要求16的可溶性融合蛋白，其中该效应物分子为细胞毒素或适于诊断或成像研究的可检测性标记的分子。

18.通过使权利要求15的可溶性融合蛋白与能切割该蛋白标记的试剂接触而产生的单链T细胞受体。

19.含有依次共价连接的以下成分的可溶性融合蛋白：1)T细胞受体V-α链，2)T细胞受体C-α链或其片段，3)肽连接序列，4)T细胞受体V-β链，5)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基处截短的C-β链片段，6)免疫球蛋白轻链恒定区或其片段。

20.包含共价连接之两序列的DNA区段，第一序列编码单链T细胞受体，该单链T细胞受体包含依次共价连接的以下部分：(1)T细胞受体V-α链；(2)肽连接序列；(3)T细胞受体V-β链；以及(4)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β片段；第二序列编码Cκ链、Cλ链或它们的片段，其中该DNA片段还包含启动子、翻译起始信号及与第一序列可操作连接的前导序列。

21.权利要求20的DNA区段，其中由第一序列编码的单链T细胞受体上的C-β链片段共价连接于V-β链C端和第二序列所编码的Cκ链、Cλ链或其片段的N端之间。

22.权利要求20的DNA区段，其中由第一序列编码的单链T细胞受体还包含共价连接于V-α链C端和肽连接序列N端之间的C-α链片段。

23.包含可溶性融合蛋白编码序列的DNA区段，该蛋白序列中包含依次共价连接的以下部分：1)T细胞受体V-α链，2)肽连接序列，3)T细胞受体V-β链，4)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β链片段，以及5)Cκ链、Cλ链或它们的片段之一。

24.权利要求23的DNA区段，其中还包含编码位于T细胞受体V-α链和肽连接序列之间的T细胞受体C-α链片段的序列。

25.权利要求23的DNA区段，其中还包含编码前导序列的序列、翻译起始信号及启动子。

26.权利要求25的DNA区段，其中还包含编码一个或多个蛋白标记的序列。

27.权利要求25的DNA区段，其中启动子为phoA，前导序列为大肠杆菌的pelB，其中该DNA区段还包含来自基因10序列的核糖体结合位点。

28.权利要求25的DNA区段，其中启动子为与巨细胞病毒增强子元件可操作连接的巨细胞病毒启动子，前导序列为小鼠κ链前导序列。

29.包含权利要求20或23的DNA区段的DNA载体。

30.对权利要求1所述可溶性融合蛋白进行分离的方法，该方法包括：

将包含该融合蛋白编码序列的DNA载体导入宿主细胞，

在可使该融合蛋白表达的条件下于培养基中培养该宿主细胞，及

从宿主细胞或培养基中纯化该融合蛋白以分离该可溶性融合蛋白。

31.权利要求30的方法，其中该方法还包括使培养后基质或宿主细胞的提取物与能特异性结合该融合蛋白的抗体接触。

32.分离可溶性单链T细胞受体的方法，所述单链T细胞受体包含依次共价连接的以下部分：1)T细胞受体V-α链，2)肽连接序列，3)T细胞受体V-β链，以及4)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β链片段，该方法包括：

将包含权利要求1所述可溶性融合蛋白编码序列的DNA载体导入宿主细胞，所述融合蛋白包含与免疫球蛋白轻链恒定区或片段共价连接的单链T细胞受体，

在可使该可溶性单链T细胞受体融合蛋白表达的条件下于培养基中培养该宿主细胞，和

从宿主细胞或培养基中纯化该单链T细胞受体融合蛋白；及

将融合的免疫球蛋白轻链恒定区或其片段与单链T细胞受体分开，以分离该可溶性单链T细胞受体。

33.分离可溶性单链T细胞受体的方法，所述单链T细胞受体包含依次共价连接的以下部分：1)T细胞受体V-α链，2)T细胞受体C-α链或其片段，3)肽连接序列，4)T细胞受体V-β链，5)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基处截短的C-β链片段，6)免疫球蛋白轻链恒定区或其片段，该方法包括：

将包含所述单链T细胞受体编码序列的DNA载体导入哺乳动物细胞，

在可使该单链T细胞受体表达的条件下于培养基中培养该哺乳动物细胞，

从哺乳动物细胞或培养基中纯化该单链T细胞受体以分离单链T细胞受体。

34.权利要求1所述融合蛋白在制备可用于诱导哺乳动物体内免疫应答、使该哺乳动物对致病性T细胞表面上的T细胞受体表位产生免疫的药物中的用途。

35.权利要求1所述融合蛋白在制备可用于抑制哺乳动物体内T-细胞活化的药物中的用途。

36.可特异性结合T细胞受体之抗体的制备方法，该方法包括将权利要求1所述融合蛋白以有效量施用于哺乳动物。

37.在体外对细胞进行杀伤的方法，该方法包括：

提供包含有依次共价连接的以下部分的可溶性单链T细胞受体融合蛋白：1)T细胞受体V-α链，2)肽连接序列，3)T细胞受体V-β链，4)在T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β链片段，5)Cκ链、Cλ链或其片段之一，和6)效应物分子，

使该可溶性单链T细胞受体融合蛋白与具有能特异性结合该单链T细胞受体融合蛋白之配体的细胞进行接触；及

由该单链T细胞受体融合蛋白杀死该细胞。

38.权利要求37的方法，其中该细胞为肿瘤细胞或病毒感染的细胞。

39.包含与单链T-细胞受体共价连接的免疫球蛋白轻链恒定区或其片段的可溶性融合蛋白，其中所述单链T-细胞受体包含按下述顺序共价连接的以下部分：(1)T细胞受体V-α链；(2)肽连接序列；(3)T细胞受体V-β链；和(4)在单链T细胞受体C-β链最后一位半胱氨酸残基前截短的C-β链片段，所述C-β链片段与包含70-150个氨基酸的免疫球蛋白轻链恒定区片段相连接。

40.权利要求39的可溶性融合蛋白，其中所连接的免疫球蛋白轻链恒定区片段长为90-120个氨基酸。

41.权利要求40的可溶性融合蛋白，其中所连接的免疫球蛋白轻链恒定区片段长为100-110个氨基酸。

42.权利要求40的可溶性融合蛋白，其中C-β链片段与免疫球蛋白轻链恒定区之间的连接处包含另一个肽连接序列。