CN117693508A - T细胞疗法和dgk抑制剂的组合 - Google Patents

T细胞疗法和dgk抑制剂的组合 Download PDF

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Abstract

本文提供了涉及诸如过继T细胞疗法的T细胞疗法和二酰基甘油激酶(DGK)的抑制剂的方法、组合物和用途。所提供的方法、组合物和用途包括涉及在组合疗法中与T细胞疗法一起施用或使用一种或多种DGK抑制剂(DGKi)的那些，所述T细胞疗法诸如涉及用诸如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的重组受体工程化的细胞的基因工程化T细胞疗法。

Description

T细胞疗法和DGK抑制剂的组合
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月3日提交的美国临时申请号63/156,342的优先权，将所述临时申请的内容出于所有目的通过引用以其整体特此并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2022年2月28日创建的标题为735042024440SeqList.txt的文件提供，其大小为388千字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本在一些方面涉及包括诸如过继T细胞疗法的T细胞疗法和二酰基甘油激酶(DGK)的抑制剂的方法、组合物和用途。所提供的方法、组合物和用途包括涉及在组合疗法中与T细胞疗法一起施用或使用一种或多种DGK抑制剂(DGKi)的那些，所述T细胞疗法诸如涉及用诸如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的重组受体工程化的细胞的基因工程化T细胞疗法。
背景技术
多种策略可用于T细胞疗法，例如施用工程化T细胞用于过继疗法。例如，策略可用于工程化表达基因工程化抗原受体(如CAR或TCR)的T细胞，以及向受试者施用含有此类细胞的组合物。需要改进的策略来改善细胞疗法的T细胞的功效，例如，改善向受试者施用后细胞的持久性、活性和/或增殖。提供了满足此类需求的方法、组合物、试剂盒和系统。
发明内容
本文提供了一种治疗方法，所述方法包括：(a)向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞；以及(b)向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了用于在治疗疾病或病症的方法中使用的T细胞疗法和DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述方法包括：(a)向患有所述疾病或病症的受试者施用所述T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞；以及(b)向所述受试者施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了T细胞疗法和DGKα和/或DGKζ的抑制剂的组合在治疗疾病或病症的方法中的用途，所述方法包括：(a)向患有所述疾病或病症的受试者施用所述T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞；以及(b)向所述受试者施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了T细胞疗法和DGKα和/或DGKζ的抑制剂的组合在制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了用于在治疗受试者的疾病或病症的方法中使用的DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述方法包括向所述受试者施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中在开始施用所述抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了DGKα和/或DGKζ的抑制剂在治疗疾病或病症的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中在开始施用所述抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了DGKα和/或DGKζ的抑制剂在制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中在开始施用所述抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了一种拯救T细胞疗法的工程化T细胞免于耗竭的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了一种用于减少或延迟T细胞疗法的T细胞的T细胞耗竭发作的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述人DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα的抑制剂，而不是DGKζ的显著抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKζ的抑制剂，而不是DGKα的显著抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα和DGKζ的抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂不是其他DGK的显著抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是工程化T细胞受体(eTCR)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是自体的。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是同种异体的。
本文提供了一种治疗方法，所述方法包括：(a)向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞；以及(b)向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了一种拯救T细胞疗法的工程化T细胞免于耗竭的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
本文提供了一种用于减少或延迟T细胞疗法的T细胞的T细胞耗竭发作的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后1至28天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后为或约1天、为或约2天、为或约3天、为或约4天、为或约5天、或为或约6天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，在来自所述受试者的生物样品中总重组受体表达T细胞的至少或至少约10％、至少或至少约20％、至少或至少约30％、至少或至少约40％、或至少或至少约50％具有耗竭表型。
在一些任何所提供的实施方案中，当为或约在所述受试者的血液中检测到或可检测到所述T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时，或者在所述受试者的血液中检测到或可检测到所述T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时的约一周内，开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后7至21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后7至14天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后为或约7天、为或约8天、为或约9天、为或约10天、为或约11天、为或约12天、为或约13天、或为或约14天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后15至21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后为或约15天、为或约16天、为或约17天、为或约18天、为或约19天、为或约20天、或为或约21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂的施用的开始与所述T细胞疗法的施用并行进行。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之前开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞，其中，在开始施用所述T细胞疗法时，先前已经向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了用于在治疗疾病或病症的方法中使用的T细胞疗法，所述方法包括向患有所述疾病或病症的受试者施用所述T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞，并且在开始施用所述T细胞疗法时，先前已经向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了T细胞疗法在治疗疾病或病症中的用途，所述方法包括向患有所述疾病或病症的受试者施用所述T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞，并且在开始施用所述T细胞疗法时，先前已经向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
本文提供了T细胞疗法在制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞，并且在开始施用所述T细胞疗法时，先前已经向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和环磷酰胺的施用。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之前为或约1天或1天内、为或约2天或2天内、或为或约3天或3天内施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述T细胞疗法之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述T细胞疗法之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和环磷酰胺的施用。
在一些任何所提供的实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每日施用为约200-400mg/m2，包含端值，任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，和/或为约20-40mg/m2，任选地为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为约500mg/m2的环磷酰胺。在一些任何所提供的实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每日施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些任何所提供的实施方案中，在所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天向所述受试者施用所述T细胞疗法。
在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα的抑制剂，而不是DGKζ的显著抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKζ的抑制剂，而不是DGKα的显著抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα和DGKζ的抑制剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂不是其他DGK的显著抑制剂。
在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；每个Ra独立地是H或C1-3烷基；每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C3-4环烷基、C3-4氟环烷基、或-NO2；R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；R4a和R4b独立地是：(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基(thiophenyl)、甲基哌啶基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；R4d是-OCH3；每个Rc独立地是H或C1-2烷基；Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；m是零、1、2、或3；并且n是零、1或2。
在一些实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；每个R1a独立地是F、Cl、或-CN；每个Ra独立地是H或C1-3烷基；R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-2烷基、-CF3、环丙基、或-NO2；R4a和R4b独立地是：(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；并且每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1- 2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。
在一些实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：R1是-CN；R2是-CH3；R3是H、F、或-CN；R4是：
在一些实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
或者
在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物：
或其盐，其中：R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；每个Ra独立地是H或C1-3烷基；每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；R4a和R4b独立地是：(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；R4d是-OCH3；每个Rc独立地是H或C1-2烷基；Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；m是；零、1、2、或3；并且n是零、1或2。
在一些实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R4a和R4b独立地是：(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟基烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基、或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-4环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；每个Rx独立地是H或-CH3；并且m是1、2、或3。
在一些实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
R1是-CN；R2是-CH3；R5a是-CH3或-CH2CH3；并且R5c是-CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。
在一些实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
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在一些任何所提供的实施方案中，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
在一些任何所提供的实施方案中，将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效实现所述工程化T细胞的抗原特异性或抗原受体驱动活性增加的量、时间、持续时间和/或频率施用。
在一些任何所提供的实施方案中，将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效预防、抑制或延迟所述工程化T细胞中耗竭表型发作的量、时间、持续时间和/或频率施用。
在一些任何所提供的实施方案中，将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效地至少部分逆转所述工程化T细胞中耗竭表型的量、时间、持续时间和/或频率施用。
在一些任何所提供的实施方案中，所述表达所述重组受体的工程化T细胞的耗竭水平是通过测量所述表达所述重组受体的工程化T细胞的细胞表面上的一种或多种耗竭标记的水平来确定的。
在一些任何所提供的实施方案中，将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以从或从约0.25mg至约250mg的量施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以从或从约0.5mg至约100mg的量施用。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是工程化T细胞受体(eTCR)。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR是(利基迈仑赛(lisocabtagene maraleucel))、TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛(brexucabtageneautoleucel))、KYMRIAHTM(替沙仑赛(tisagenlecleucel))、YESCARTATM(阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel))、/>(艾基维仑赛(idecabtagene vicleucel))、或CARVYKTITM(西达基奥仑赛(ciltacabtagene autoleucel))的CAR。在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR是/>(利基迈仑赛)的CAR。在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR是TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)的CAR。在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR是KYMRIAHTM(替沙仑赛)的CAR。在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR是YESCARTATM(阿基仑赛)的CAR。在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR是CARVYKTITM(西达基奥仑赛)的CAR。
在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法是(利基迈仑赛)、TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)、KYMRIAHTM(替沙仑赛)、YESCARTATM(阿基仑赛)、/>(艾基维仑赛)、或CARVYKTITM(西达基奥仑赛)。在一些任
何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法是(利基迈仑赛)。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法是TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法是KYMRIAHTM(替沙仑赛)。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法是YESCARTATM(阿基仑赛)。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法是CARVYKTITM(西达基奥仑赛)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体结合靶抗原，所述靶抗原与所述疾病或病症相关，为所述疾病或病症所特有，和/或在所述疾病或病症的细胞或组织上表达。在一些任何所提供的实施方案中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病、或者感染性疾病。在一些任何所提供的实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些任何所提供的实施方案中，所述疾病或病症是为B细胞恶性肿瘤的癌症。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些任何所提供的实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些任何所提供的实施方案中，所述癌症是血液(液体)肿瘤。
在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1x105至1x109个总重组受体表达T细胞，包含端值。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1x105至5x108个总重组受体表达T细胞、1x106至2.5x108个总重组受体表达T细胞、5x106至1x108个总重组受体表达T细胞、1x107至2.5x108个总重组受体表达T细胞、或5x107至1x108个总重组受体表达T细胞，每个均包含端值。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1.5x107至6x108个总重组受体表达T细胞、1.5x108至6x108个总重组受体表达T细胞、或1.5x108至4.5x108个总重组受体表达T细胞，每个均包含端值。
在一些任何所提供的实施方案中，将所述T细胞疗法的细胞剂量肠胃外施用，任选地静脉内施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述T细胞疗法的细胞剂量静脉内施用。
在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法包括从所述受试者获得的原代T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是自体的。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是同种异体的。
在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法包括为CD4+或CD8+的T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法包括为CD4+和CD8+的T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞疗法包括为CD4+的T细胞和为CD8+的T细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用检查点拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述检查点拮抗剂是PD1/PD-L1轴拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述检查点拮抗剂是CTLA4拮抗剂。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
在一些任何所提供的实施方案中，所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD1拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述人PD-1拮抗剂是纳武单抗、派姆单抗或本文所述的任何其他PD-1拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述人PD-1拮抗剂是纳武单抗或其变体。
在一些任何所提供的实施方案中，所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD-L1拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述人PD-L1拮抗剂是阿替利珠单抗或本文所述的任何其他PD-L1拮抗剂。
在一些任何所提供的实施方案中，所述CTLA4拮抗剂是人CTLA4拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述人CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或本文所述的任何其他CTLA4拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述人CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或其变体，任选地相对于伊匹单抗具有降低的毒性的变体。在一些任何所提供的实施方案中，所述人CTLA4拮抗剂是相对于伊匹单抗具有降低的毒性的伊匹单抗变体。
在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂的同一天开始施用所述检查点拮抗剂。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂施用长达三个月的时间段。在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂施用长达六个月的时间段。
在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和所述检查点拮抗剂施用长达三个月的时间段。在一些任何所提供的实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和所述检查点拮抗剂施用长达六个月的时间段。
在一些任何所提供的实施方案中，如果在所述时间段结束时，所述受试者在所述治疗后展现出完全反应(CR)，或者所述疾病或病症在所述治疗后进展或缓解后复发，则停用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，如果在所述时间段结束时，所述受试者在所述治疗后展现出完全反应(CR)，或者所述疾病或病症在所述治疗后进展或缓解后复发，则停用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和所述检查点拮抗剂。
在一些任何所提供的实施方案中，如果在所述时间段结束时，所述受试者在所述治疗后展现出完全反应(CR)，或者所述癌症在所述治疗后进展或缓解后复发，则停用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂。在一些任何所提供的实施方案中，如果在所述时间段结束时，所述受试者在所述治疗后展现出完全反应(CR)，或者所述癌症在所述治疗后进展或缓解后复发，则停用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和所述检查点拮抗剂。
附图说明
图1A和图1B示出了在存在示例性DGK抑制剂(化合物17)的情况下，用CAR特异性抗独特型抗体刺激后，CAR表达T细胞中的激活和分化标记的表达。图1A示出了在用3μg/mL(左小图)或30μg/mL(右小图)的CAR特异性抗独特型抗体刺激之后，对各种激活和分化标记呈阳性的细胞％的log2倍数变化(存在化合物17相比于不存在化合物17)在供体之间的平均值。图1B示出了在用3μg/mL(左小图)或30μg/mL(右小图)的CAR特异性抗独特型抗体刺激之后，细胞MFI的log2倍数变化(存在化合物17相比于不存在化合物17)在供体之间的平均值。在图1A和图1B中，正值用圆圈指示。
图2示出了在存在化合物17或对照的情况下，用CAR特异性抗独特型抗体刺激的CAR表达细胞的生长曲线(孔中的细胞汇合百分比，如使用Incucyte成像系统监测的)。
图3示出了在存在化合物17(或对照)的情况下，与CD19抗原表达靶细胞，即K562.CD19细胞(高CD19表达；左小图)、Granta-519细胞(低CD19表达；中小图)和Raji细胞(中/高CD19表达；右小图)共培养的CAR表达T细胞所实现的特异性裂解的百分比。
图4示出了在CAR表达T细胞与K562.CD19细胞(圆形)、Granta-519细胞(正方形)，和Raji细胞(三角形)在存在化合物17的情况下共培养之后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。
图5A-图5B和图6A-图6B示出了在存在化合物17的情况下慢性刺激的CAR表达T细胞的再激发(并行处理)期间的细胞裂解活性和细胞因子产生。图5A示出了在存在化合物17的情况下与慢性刺激的CAR T细胞进行2D共培养期间的K562.CD19(左小图)、Granta-519(中小图)和Raji细胞(右小图)的肿瘤细胞数。图5B示出了在将CAR T细胞与K562.CD19细胞(圆形)、Granta-519细胞(正方形)和Raji细胞(三角形)进行2D共培养48小时后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。图6A示出了在与在慢性刺激期间曾用化合物17并行处理的CAR T细胞共培养的第9天，A549.CD19(左小图)和Granta-519肿瘤球体(右小图)的归一化的肿瘤体积。图6B示出了在将CAR T细胞与A549.CD19(圆形)和Granta-519肿瘤球体(正方形)进行3D共培养五天后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。
图7A-图7B和图8A-图8B示出了在存在化合物17的情况下慢性刺激的CAR表达T细胞再激发(拯救处理)期间的细胞裂解活性和细胞因子产生。图7A示出了在存在化合物17的情况下与CAR T细胞进行2D共培养期间的K562.CD19(左小图)、Granta-519(中小图)和Raji细胞(右小图)的肿瘤细胞数。图7B示出了在存在化合物17的情况下将CAR T细胞与K562.CD19细胞(圆形)、Granta-519细胞(正方形)和Raji细胞(三角形)进行2D共培养48小时后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。图8A示出了在存在化合物17的情况下与CAR T细胞共培养的第9天的A549.CD19(左小图)和Granta-519肿瘤球体(右小图)的归一化的肿瘤体积。图8B示出了在存在化合物17的情况下将CAR T细胞与A549.CD19(圆形)和Granta-519肿瘤球体(正方形)进行3D共培养五天后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。
图9和图10示出了在用化合物17进行拯救处理后，表达工程化T细胞受体(eTCR)的慢性刺激的T细胞的细胞裂解活性和增殖。图9示出了在存在化合物17的情况下与慢性刺激的eTCR T细胞共培养期间，在不同时间监测的CaSki细胞的肿瘤细胞数(左小图，用10μg/mL抗Vβ慢性刺激的eTCR T细胞；右小图，用20μg/mL抗Vβ慢性刺激的eTCR T细胞)。图10示出了两个供体的eTCR T细胞的细胞计数，如从左到右所示：(1)无化合物处理的慢性刺激的eTCRT细胞(对照)；(2)用化合物17处理的慢性刺激的eTCR T细胞；或(3)未慢性刺激的新鲜eTCRT细胞。
具体实施方式
本文提供了用于在治疗疾病或病症中使用的组合疗法，所述组合疗法涉及施用针对与所述疾病或病症相关的抗原的T细胞疗法和DGK抑制剂，所述T细胞疗法如嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法或工程化T细胞受体(eTCR)-T细胞疗法。在一些实施方案中，所述T细胞疗法是包含用于过继细胞疗法的T细胞的组合物，其中将所述细胞用靶向抗原的重组受体(例如CAR或eTCR)工程化。在一些实施方案中，所述疾病或病症可以是癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述DGKi是DGKα、DGKζ或者DGKα和DGKζ两者的抑制剂，如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物或其药学上可接受的盐。在一些方面，所提供的方法和用途增强或调节与T细胞疗法(例如CAR表达T细胞或eTCR表达T细胞)的施用相关的T细胞的增殖和/或活性。
基于T细胞的疗法，如过继T细胞疗法(包括涉及施用如下细胞的那些疗法，所述细胞表达对目的疾病或障碍具有特异性的重组抗原受体(如CAR或eTCR))可以有效治疗癌症以及其他疾病和障碍。重组受体(如CAR或eTCR)在T细胞表面上的工程化表达使得能够重定向T细胞特异性。在临床研究中，CAR-T细胞(例如抗CD19 CAR-T细胞)已经在白血病和淋巴瘤患者二者中产生了持久的完全反应(Porter等人(2015)Sci Transl Med.,7:303ra139；Kochenderfer(2015)J.Clin.Oncol.,33:540-9；Lee等人(2015)Lancet,385:517-28；Maude等人(2014)N Engl J Med,371:1507-17)。
在某些情况下，过继细胞疗法的可行途径可能并不总是完全令人满意。例如，在某些情况下，尽管在许多患有淋巴瘤的受试者中可以检测到CAR T细胞持久性，但是与患有ALL的受试者相比，在患有NHL的受试者中观察到的完全反应(CR)较少。更具体地，尽管已经报告在CAR T细胞输注之后高达80％(CR率47％至60％)的较高总反应率，但是在一些受试者中反应是短暂的，并且已经显示受试者在存在持久性CAR T细胞的情况下复发(Neelapu,58th Annual Meeting of the American Society of Hematology(ASH):2016；SanDiego,CA,USA.文献号LBA-6.2016；Abramson,Blood.2016年12月1日；128(22):4192)。另一项研究报告长期CR率为40％(Schuster,Ann Hematol.2016年10月；95(11):1805-10)。
在一些方面，对此的解释是T细胞疗法的循环T细胞(例如CAR表达T细胞)的免疫耗竭和/或T淋巴细胞群体的变化。在一些情况下，最佳功效可取决于所施用细胞的以下能力：识别并结合靶标(例如，靶抗原)，运输、定位至并成功进入受试者、肿瘤和其环境内的适当位点。在一些情况下，最佳功效可能取决于所施用细胞的以下能力：被激活，扩增，发挥各种效应子功能(包括细胞毒性杀伤和分泌各种因子如细胞因子)，持续(包括长期)，分化、转换或参与重编程为某些表型状态(如长期记忆、低分化和效应子状态)，避免或减少疾病局部微环境中的免疫抑制条件，在清除并重新暴露于靶配体或抗原后提供有效且稳健的回忆反应，以及避免或减少耗竭、无反应性、外周耐受、终末分化和/或分化为抑制状态。
在一些实施方案中，在施用于受试者后T细胞疗法的工程化细胞的暴露和持久性降低或下降。然而，观察结果表明，在一些情况下，增加表达重组受体的所施用细胞对于受试者的暴露(例如，随时间增加细胞数量或持续时间)可以改善过继细胞疗法的功效和治疗结局。在多个临床试验中向患有不同表达CD19的癌症的多名受试者施用不同的靶向CD19的表达CAR的T细胞后进行的初步分析揭示了表达CAR的细胞的更大和/或更长的暴露程度与治疗结局之间的相关性。此类结果包括患者存活率和缓解，甚至在具有严重或显著肿瘤负荷的个体中的患者存活率和缓解。
在一些实施方案中，在长期刺激或暴露于抗原和/或在肿瘤微环境中的条件下暴露之后，T细胞可以随着时间变得功能减退和/或展现出与耗竭状态相关的特征。在一些方面，这降低了T细胞针对抗原的持久性和功效，并限制了它们有效的能力。需要改进T细胞疗法的T细胞(例如CAR表达T细胞或eTCR表达T细胞)的功效和功能，特别是最小化、减少、预防或逆转功能减退或耗竭状态的方法。
二酰基甘油激酶(DGK)是介导二酰基甘油向磷脂酸转化，从而终止通过TCR信号传导通路传播的T细胞功能的脂质激酶。因此，DGK用作细胞内检查点，并且对DGK的抑制预期增强T细胞信号传导通路和T细胞激活。支持性证据包括DGKα或DGKζ的敲除小鼠模型，其显示出高反应性T细胞表型和改善的抗肿瘤免疫活性(Riese M.J.等人,Journal ofBiological Chemistry,(2011)7:5254-5265；Zha Y等人,Nature Immunology,(2006)12:1343；Olenchock B.A.等人,(2006)11:1174-81)。此外，观察到从人肾细胞癌患者分离的肿瘤浸润淋巴细胞过表达DGKα，从而导致受抑制的T细胞功能(Prinz,P.U.等人,JImmunology(2012)12:5990-6000)。因此，DGKα和DGKζ被视为癌症免疫疗法的靶标(Riese M.J.等人,Front Cell Dev Biol.(2016)4:108；Chen,S.S.等人,Front Cell Dev Biol.(2016)4:130；Avila-Flores,A.等人,Immunology and Cell Biology(2017)95:549-563；Noessner,E.,Front Cell Dev Biol.(2017)5:16；Krishna,S.等人,Front Immunology(2013)4:178；Jing,W.等人,Cancer Research(2017)77:5676-5686)。
所提供的方法是基于如下观察结果：DGKi(诸如如所述的示例性化合物17)改进T细胞功能，包括与T细胞的产生一种或多种细胞因子的能力、细胞毒性、扩增、增殖和持久性相关的功能。在一些方面，所提供的方法增强或调节与所述T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)的施用相关的T细胞的增殖和/或活性。发现此类方法和用途提供或实现了改善的或更大的T细胞功能，并从而改善了抗肿瘤功效。
本文还发现，此类DGKi(例如，化合物17)除了加强T细胞功能外，还展现出逆转、延迟或预防T细胞耗竭的作用，包括通过增加T细胞信号传导和/或改变在慢性(长期)刺激后被差异调节的一个或多个基因。因此，尽管在一些情况下，增加或加强T细胞活性的药剂可以将细胞驱动至耗竭状态，但是在本文中发现，此类DGKi(例如，化合物17)发挥对T细胞活性的加强作用的活性与T细胞耗竭不相关。在一些实施方案中，所提供的涉及此类DGKi(例如，化合物17)的化合物施用的方法能够加强T细胞的活性并延迟、限制、减少、抑制或预防耗竭。
此外，本文的观察结果显示，DGKi(例如化合物17)展现出拯救T细胞免于T细胞耗竭的活性，如通过在细胞已经显示耗竭的特征后恢复或部分恢复一种或多种T细胞活性。值得注意的是，本文的结果显示，使已经进行慢性刺激并展现耗竭的T细胞的特征的T细胞暴露于本文所述的DGKi(如化合物17)能够恢复活性或者使其活性恢复或部分恢复。本文的观察结果支持，与某些替代方法相比，所提供的方法还可以实现改善或更持久的反应，例如在特定的被治疗受试者组中如此。
这些观察是使用使T细胞(例如CAR T细胞)功能减退(例如细胞裂解和IL-2分泌减少)的慢性刺激测定进行的。使用此模型，检查工程化T细胞(例如CAR T细胞或eTCR T细胞)以评估当DGKi(如化合物17)在暴露于导致功能减退性耗竭状态的条件期间(并行)或之后(拯救)存在时，对工程化T细胞功能的影响。在用抗原进行再激发时，本文提供的发现表明，在此类条件期间并行处理工程化T细胞(例如CAR T细胞或eTCR T细胞)逆转了与T细胞功能减退相关的活性和表型，并且保留了更多的效应子功能。同样，结果显示，随后的DGKi(例如，化合物17)暴露可以挽救或恢复耗竭T细胞的T细胞功能，包括细胞因子产生和细胞裂解活性。此外，用不同的重组抗原受体(包括和CAR和eTCR)均观察到所述结果。
所提供的发现表明，在涉及T细胞疗法(如涉及施用工程化T细胞的组合物)的方法中的为DGKα、DGKζ或者DGKα和DGKζ两者的抑制剂的DGKi(如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物或其药学上可接受的盐)的组合疗法实现了改进的所述T细胞疗法的功能，如通过增强T细胞活性和减少、预防或延迟T细胞耗竭或者拯救细胞免于T细胞耗竭。在一些实施方案中，组合疗法涉及施用或使用T细胞疗法(例如，CAR T细胞或eTCR T细胞)和DGKi，所述DGKi是式(II)的化合物。在一些实施方案中，组合疗法涉及施用或使用T细胞疗法(例如CAR T细胞或eTCR T细胞)和DGKi，所述DGKi是为4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈或其立体异构体的化合物。在一些实施方案中，组合疗法涉及施用或使用T细胞疗法(例如，CAR T细胞或eTCR T细胞)和DGKi，所述DGKi是为4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈的化合物(化合物17)。在一些实施方案中，T细胞疗法(例如，施用工程化T细胞)与DGKi(例如，化合物17)的组合改善或增强了T细胞疗法的一种或多种功能和/或作用，如持久性、扩增、细胞毒性和/或治疗结局，例如杀伤肿瘤或其他疾病或靶细胞或降低肿瘤或其他疾病或靶细胞负荷的能力。
将在本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.组合疗法
本文在一些实施方案中提供了治疗方法，所述治疗方法包括向患有疾病或病症的受试者施用细胞疗法和DGK的抑制剂。在一些实施方案中，DGK的抑制剂是DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，细胞疗法是T细胞疗法。在一些实施方案中，T细胞疗法包括工程化T细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，重组受体是工程化T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，在T细胞疗法之前施用DGK抑制剂(例如，DGKα和/或DGKζ的抑制剂)，例如，施用所述抑制剂的开始在开始施用所述T细胞疗法之前进行、执行或发生。在一些实施方案中，DGK抑制剂(例如，DGKα和/或DGKζ的抑制剂)与T细胞疗法并行施用，例如，施用所述抑制剂的开始与所述T细胞疗法的施用并行进行、执行或发生。在一些实施方案中，在T细胞疗法之后施用DGK抑制剂(例如，DGKα和/或DGKζ的抑制剂)，例如，施用所述抑制剂的开始在开始施用所述T细胞疗法之后进行、执行或发生。
在一些实施方案中，本文还提供了治疗方法，所述治疗方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGK的抑制剂。在一些实施方案中，本文还提供了拯救细胞疗法的工程化细胞免于耗竭(例如，拯救T细胞疗法的工程化T细胞免于耗竭)的方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGK的抑制剂。在一些实施方案中，本文还提供了减少或延迟T细胞疗法的T细胞的T细胞耗竭发作的方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGK的抑制剂。在一些实施方案中，先前已经向所述受试者施用细胞疗法，例如T细胞疗法，用于治疗所述疾病或病症。
本文所述的组合疗法(例如，包括表达重组受体如嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞和DGK抑制剂)或包括所述工程化细胞和/或所述DGK抑制剂的组合物可用于多种治疗、诊断和预防适应证。例如，所述组合可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。此类方法和用途包括治疗性方法和用途，例如涉及将工程化细胞、DGK抑制剂和/或含有一者或两者的组合物施用于患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，将工程化细胞、DGK抑制剂和/或含有一者或两者的组合物以有效量施用以实现疾病或障碍的治疗。用途包括工程化细胞、DGK抑制剂和/或含有一者或两者的组合物在这样的方法和治疗中以及在用于进行这样的治疗性方法的药剂的制备中的用途。在一些实施方案中，所述方法是通过将工程化细胞、DGK抑制剂和/或含有一者或两者的组合物施用于患有或怀疑患有疾病或病症的受试者来进行的。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病、病症或障碍。在一些实施方案中，所述DGK抑制剂是如章节I-B中所述的任一种。在一些实施方案中，所述工程化细胞是如章节I和II中所述的任一种。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病或病症的病因相关和/或参与所述病因，例如抗原表达引起、加重或以其他方式参与这种疾病或病症。示例性疾病和病症包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如，癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或者感染性疾病(例如，由细菌、病毒或其他病原体引起)相关的疾病或病症。本文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，作为本文提供的方法的一部分施用的细胞疗法(例如，T细胞疗法)表达的重组受体(例如，CAR或TCR)的抗原结合结构域特异性地结合与疾病或病症相关的抗原。
在一些实施方案中，疾病或病症包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性疾病和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL。在一些实施方案中，NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。
在一些实施方案中，疾病或障碍是B细胞相关障碍。在所提供方法的一些任何所提供的实施方案中，疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。在所提供方法的一些任何所提供的实施方案中，自身免疫性疾病或障碍是系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关性血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、查加斯病(Chagas'disease)、格雷夫斯病(Grave'sdisease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺综合征(Reynaud'ssyndrome)、抗磷脂综合征、古德帕斯丘病(Goodpasture's disease)、川崎病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性肾小球肾炎。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，疾病或障碍是实体瘤或与非血液肿瘤相关的癌症。在一些实施方案中，疾病或障碍是实体瘤或与实体瘤相关的癌症。在一些实施方案中，疾病或障碍是胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫癌、胃癌、食管癌、头颈癌、黑色素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌或软组织肉瘤。在一些实施方案中，疾病或障碍是膀胱癌、肺癌、脑癌、黑色素瘤(例如，小细胞肺癌、黑色素瘤)、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些实施方案中，疾病或障碍是胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫癌、胃癌、食管癌、头颈癌、黑色素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌或软组织肉瘤。
在一些实施方案中，与疾病或病症相关的抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞激活因子受体(BAFF-R)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、δ样配体3(DLL3)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，疾病或病症是大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL。在一些实施方案中，NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。在任何此类实施方案中，疾病或病症已经复发或者是一种或多种先前治疗难治的(复发性或难治性疾病；R/R)。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合至与疾病或病症相关的抗原或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是BAFF-R、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30、或其组合。例如，在一些实施方案中，抗原是BAFF-R，并且CAR是如Qin等人,Science Translational Medicine 11(511):eaaw9414(2019)中所述。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD19。例如，重组受体可以是为阿基仑赛(Yescarta)、替沙仑赛(Kymriah)、或利基迈仑赛(Breyanzi)的CAR的CAR。在一些实施方案中，重组受体可以是为TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)的CAR的CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法(例如抗CD19 CAR T细胞疗法)是阿基仑赛(Yescarta)、替沙仑赛(Kymriah)、利基迈仑赛(Breyanzi)、或TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)。
在一些实施方案中，疾病或病症是大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，大B细胞淋巴瘤是复发性或难治性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，大B细胞淋巴瘤是非特指型弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(包括源自惰性淋巴瘤的DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤或大B细胞淋巴瘤或3B级滤泡性淋巴瘤。在一些实施方案中，由重组受体结合并且与大B细胞淋巴瘤相关的靶抗原是CD19。在一些实施方案中，重组受体是抗CD19CAR。在一些实施方案中，抗CD19 CAR是利基迈仑赛(Breyanzi)的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是抗CD19 CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，抗CD19 CAR T细胞疗法是利基迈仑赛(Breyanzi，参见Sehgal等人,2020,Journal of Clinical Oncology 38:15_增刊,8040；Teoh等人,2019,Blood 134(增刊_1):593；和Abramson等人,2020,The Lancet396(10254):839-852)。
在一些实施方案中，疾病或病症是套细胞淋巴瘤或B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在一些实施方案中，疾病或病症是复发性或难治性套细胞淋巴瘤或者复发性或难治性B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在一些实施方案中，由重组受体结合并且与疾病或病症相关的靶抗原是CD19。在一些实施方案中，重组受体是抗CD19 CAR。在一些实施方案中，抗CD19 CAR是TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是抗CD19 CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，抗CD19 CAR T细胞疗法是TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛，参见Mian和Hill,2021,Expert Opin Biol Ther；21(4):435-441；和Wang等人,2021,Blood 138(增刊1):744)。
在一些实施方案中，疾病或病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在一些实施方案中，疾病或病症是复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或者复发性或难治性急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在一些实施方案中，由重组受体结合并且与疾病或病症相关的靶抗原是CD19。在一些实施方案中，重组受体是抗CD19 CAR。在一些实施方案中，抗CD19 CAR是替沙仑赛(Kymriah)的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是抗CD19 CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，抗CD19 CAR T细胞疗法是替沙仑赛(Kymriah，参见Bishop等人,2022,N Engl J Med 386:629:639；Schuster等人,2019,N Engl J Med 380:45-56；Halford等人,2021,Ann Pharmacother 55(4):466-479；Mueller等人,2021,Blood Adv.5(23):4980-4991；和Fowler等人,2022,NatureMedicine 28:325-332)。
在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤是复发性或难治性B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤、由滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL、或滤泡性淋巴瘤。在一些实施方案中，由重组受体结合并且与B细胞淋巴瘤相关的靶抗原是CD19。在一些实施方案中，重组受体是抗CD19 CAR。在一些实施方案中，抗CD19 CAR是阿基仑赛(Yescarta)的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是抗CD19 CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，抗CD19 CAR T细胞疗法是阿基仑赛(Yescarta，参见Neelapu等人,2017,N Engl J Med 377(26):2531-2544；Jacobson等人,2021,The Lancet 23(1):P91-103；和Locke等人,2022,N Engl J Med 386:640-654)。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，重组受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(黏结蛋白聚糖-1、黏结蛋白聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中描述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO 2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，疾病或障碍是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或障碍与G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的表达和/或B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)或Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5))的表达相关的MM。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与MM相关的抗原，如特异性结合BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施方案中，与疾病或病症(例如，与MM)相关的靶抗原是BCMA。在一些实施方案中，重组受体是(艾基维仑赛)或CARVYKTITM(西达基奥仑赛)的CAR，例如抗BCMACAR。在一些实施方案中，T细胞疗法(例如抗BCMACAR T细胞疗法)是/>(艾基维仑赛)或CARVYKTITM(西达基奥仑赛)。
在一些实施方案中，疾病或病症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是复发性或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，由重组受体结合并且与多发性骨髓瘤相关的靶抗原是BCMA。在一些实施方案中，重组受体是抗BCMACAR。在一些实施方案中，抗BCMACAR是CARVYKTITM(西达基奥仑赛)的抗BCMACAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是抗BCMACAR T细胞疗法。在一些实施方案中，抗BCMA CAR T细胞疗法是CARVYKTITM(西达基奥仑赛，参见Berdeja等人,Lancet.2021年7月24日；398(10297):314-324；和Martin,摘要编号549[Oral],呈现于2021American Society of Hematology(ASH)Annual Meeting&Exposition)。
在一些实施方案中，疾病或病症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是复发性或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，由重组受体结合并且与多发性骨髓瘤相关的靶抗原是BCMA。在一些实施方案中，重组受体是抗BCMACAR。在一些实施方案中，抗BCMACAR是(艾基维仑赛)的抗BCMACAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是抗BCMACAR T细胞疗法。在一些实施方案中，抗BCMACAR T细胞疗法是/>(艾基维仑赛，参见Raje等人,2019,N Engl J Med 380:1726-1737；和Munshi等人,2021,N Engl JMed 384:705-716)。
在一些实施方案中，疾病或障碍是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1))的表达相关的CLL。在一些实施方案中，抗原是ROR1，并且疾病或障碍是CLL。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与CLL相关的抗原，如特异性结合ROR1。
在一些实施方案中，疾病或障碍是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1))的表达相关的NSCLC。在一些实施方案中，抗原是ROR1，并且疾病或障碍是NSCLC。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与NSCLC相关的抗原，如特异性结合ROR1。在一些实施方案中，CAR是如Specht等人,Cancer Res 79:4增刊,摘要P2-09-13中所描述的。
在一些实施方案中，疾病或障碍是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1))的表达相关的TNBC。在一些实施方案中，抗原是ROR1，并且疾病或障碍是TNBC。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与TNBC相关的抗原，如特异性结合ROR1。在一些实施方案中，CAR是如Specht等人,Cancer Res 79:4增刊,摘要P2-09-13中所描述的。
在一些实施方案中，疾病或障碍是小细胞肺癌(SCLC)，任选地复发性/难治性SCLC。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如DLL3)的表达相关的SCLC。在一些实施方案中，抗原是DLL3，并且疾病或障碍是SCLC。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与SCLC相关的抗原，如特异性结合DLL3。在一些实施方案中，CAR是如Byers等人,Journal of Clinical Oncology 37,第15期_增刊(2019)中所描述的。
在一些实施方案中，疾病或障碍是肾细胞癌(RCC)。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如CD70)的表达相关的RCC。在一些实施方案中，抗原是CD70，并且疾病或障碍是RCC。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与RCC相关的抗原，如特异性结合CD70。在一些实施方案中，CAR是如Panowski等人,Cancer Res 79(13增刊)2326(2019)中所描述的。
在一些实施方案中，疾病或障碍是急性髓系白血病(AML)。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如CD70)的表达相关的AML。在一些实施方案中，抗原是CD70，并且疾病或障碍是AML。在一些方面，重组受体(例如CAR或TCR)特异性结合与AML相关的抗原，如特异性结合CD70。在一些实施方案中，CAR是如Sauer等人,Blood 134(增刊_1):1932(2019)中所描述的。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
A.T细胞疗法的施用
在一些方面，本文提供的方法包括组合疗法，所述组合疗法通过将细胞疗法(例如T细胞疗法)与DGK抑制剂组合施用于患有疾病或病症(诸如如上所述的任何疾病或病症)的受试者。在一些方面，本文提供的方法包括将DGK抑制剂与细胞疗法(例如T细胞疗法)的施用组合(例如，在其之前、与其并行或在其之后)施用于受试者。在一些实施方案中，所提供的方法包括向先前已经被施用细胞疗法(例如T细胞疗法)用于治疗疾病或病症的受试者施用DGK抑制剂。在一些实施方案中，在向受试者施用DGKi之前，将细胞疗法(例如T细胞疗法)施用于受试者。在一些实施方案中，并行施用细胞疗法(例如T细胞疗法)和DGKi。
在一些实施方案中，细胞疗法是T细胞疗法。T细胞疗法可以包括用重组受体(如CAR或工程化TCR(例如eTCR))工程化的T细胞。在一些实施方案中，T细胞疗法包括表达靶向或结合与疾病或病症相关的抗原的CAR的T细胞(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)。在一些实施方案中，T细胞疗法包括表达靶向或结合与疾病或病症相关的抗原的eTCR的T细胞(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)。用于在所提供的方法中使用的T细胞疗法包括多种CAR表达T细胞或eTCR表达T细胞中的任一种。熟练技术人员可熟练地选择合适的重组受体(例如，CAR或eTCR)表达T细胞疗法用于治疗疾病或病症。T细胞疗法(CAR表达T细胞和eTCR表达T细胞)的例子描述于章节II。在一些实施方案中，T细胞疗法的T细胞对于所治疗的受试者是同种异体的。在一些实施方案中，T细胞疗法的T细胞对于所治疗的受试者是自体的。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法、组合物和制品以及试剂盒组合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从来源于这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后将细胞施用同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
T细胞疗法的细胞可以在配制用于施用的组合物中施用，或可替代地在配制用于单独施用的多于一种组合物(例如两种组合物)中施用。细胞一个或多个剂量可以包括特定数量或相对数量的细胞或工程化细胞，和/或所述组合物内两种或更多种亚型(如CD4与CD8T细胞)的限定比率或组合物。
可以将所述细胞通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过例如在不超过3天的时间段内细胞的多次推注施用，或通过细胞的连续输注施用来施用。在一些实施方案中，细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的施用是经由门诊递送进行的。
对于疾病的治疗，适当的剂量可以取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、先前疗法、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，适合将组合物和细胞一次或在一系列治疗中施用于受试者。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群体的生物学活性。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(例如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
在一些实施方案中，将T细胞疗法(如包括用重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化的细胞的T细胞疗法)的细胞剂量提供为组合物或配制品(如药物组合物或配制品)。此类组合物可以根据所提供的方法使用，如在预防或治疗疾病、病症和障碍中。
在一些实施方案中，用药学上可接受的载体配制T细胞疗法(如工程化T细胞(例如CAR细胞或CAR T细胞))。在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞或药剂和/或通过施用方法确定。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如以下中：Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。配制品或组合物还可含有多于一种活性成分，其可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应证、疾病或病症，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以组合形式适当地存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药学活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗功效或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复进行治疗直至发生所希望的对疾病症状的抑制。然而，其他施用方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。
可以使用标准施用技术、配制品和/或装置来施用所述细胞。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且施用至同一受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫反应细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。在施用治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，将药剂或细胞群体肠胃外施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者施用药剂或细胞群体。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更易于制备。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以是冻干的。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可能取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用药剂或细胞是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中施用于受试者。
在一些情况下，将细胞疗法作为包含细胞的单一药物组合物来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，其是通过例如在不超过3天的时间段内对细胞或药剂的多次推注施用或通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。
在一些实施方案中，根据所提供的组合治疗方法将细胞剂量施用于受试者。在一些实施方案中，剂量的大小或时间安排根据受试者的特定疾病或病症确定。鉴于所提供的描述，人们凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在某些实施方案中，向所述受试者施用约10万至约1000亿个细胞和/或每千克受试者体重所述细胞量的范围的细胞或细胞亚型的单独群体，如例如10万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)、100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)、约1000万至约6亿个细胞、约1亿至约6亿个细胞、约1亿至约4.5亿个细胞、约1.5亿个细胞至约3亿或4.5亿个细胞、或在这些范围和/或每千克受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，这些值是指重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞或TCR表达细胞)的数量；在其他实施方案中，它们是指施用的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至1x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，从或从约5x105至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，或从或从约1x106至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：至少或约至少1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106个、至少或约至少1x107个、至少或约至少1x108个此类细胞。
例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，那么剂量包括少于约5x108个总重组受体(例如，TCR或CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如在约1x106到5x108个此类细胞的范围内，如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如，TCR+或CAR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至1x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x106至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至1x108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x105至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或从或从约1x106至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，基因工程化的细胞的剂量包含从或从约1x105至5x108个总重组受体表达T细胞、1x105至2.5x108个总重组受体表达T细胞、1x105至1x108个总重组受体表达T细胞、1x105至5x107个总重组受体表达T细胞、1x105至2.5x107个总重组受体表达T细胞、1x105至1x107个总重组受体表达T细胞、1x105至5x106个总重组受体表达T细胞、1x105至2.5x106个总重组受体表达T细胞、1x105至1x106个总重组受体表达T细胞、1x106至5x108个总重组受体表达T细胞、1x106至2.5x108个总重组受体表达T细胞、1x106至1x108个总重组受体表达T细胞、1x106至5x107个总重组受体表达T细胞、1x106至2.5x107个总重组受体表达T细胞、1x106至1x107个总重组受体表达T细胞、1x106至5x106个总重组受体表达T细胞、1x106至2.5x106个总重组受体表达T细胞、2.5x106至5x108个总重组受体表达T细胞、2.5x106至2.5x108个总重组受体表达T细胞、2.5x106至1x108个总重组受体表达T细胞、2.5x106至5x107个总重组受体表达T细胞、2.5x106至2.5x107个总重组受体表达T细胞、2.5x106至1x107个总重组受体表达T细胞、2.5x106至5x106个总重组受体表达T细胞、5x106至5x108个总重组受体表达T细胞、5x106至2.5x108个总重组受体表达T细胞、5x106至1x108个总重组受体表达T细胞、5x106至5x107个总重组受体表达T细胞、5x106至2.5x107个总重组受体表达T细胞、5x106至1x107个总重组受体表达T细胞、1x107至5x108个总重组受体表达T细胞、1x107至2.5x108个总重组受体表达T细胞、1x107至1x108个总重组受体表达T细胞、1x107至5x107个总重组受体表达T细胞、1x107至2.5x107个总重组受体表达T细胞、2.5x107至5x108个总重组受体表达T细胞、2.5x107至2.5x108个总重组受体表达T细胞、2.5x107至1x108个总重组受体表达T细胞、2.5x107至5x107个总重组受体表达T细胞、5x107至5x108个总重组受体表达T细胞、5x107至2.5x108个总重组受体表达T细胞、5x107至1x108个总重组受体表达T细胞、1x108至5x108个总重组受体表达T细胞、1x108至2.5x108个总重组受体表达T细胞、或2.5x108至5x108个总重组受体表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x105个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约5x105个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约1x106个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约5x106个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约1x107个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约5x107个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约1x108个TCR或CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个TCR或CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个TCR或CAR表达细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1500万至10亿个总重组受体表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1500万至6亿个总重组受体表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1.5亿至6亿个总重组受体表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1.5亿至4.5亿个总重组受体表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x105个重组受体表达细胞、至少或至少约2.5x105个重组受体表达细胞、至少或至少约5x105个重组受体表达细胞、至少或至少约1x106个重组受体表达细胞、至少或至少约2.5x106个重组受体表达细胞、至少或至少约5x106个重组受体表达细胞、至少或至少约1x107个重组受体表达细胞、至少或至少约2.5x107个重组受体表达细胞、至少或至少约5x107个重组受体表达细胞、至少或至少约1x108个重组受体表达细胞、至少或至少约2.5x108个重组受体表达细胞、或至少或至少约5x108个重组受体表达细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至1x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，从或从约5x105至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，或从或从约1x106至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：至少或约至少1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106个、至少或约至少1x107个、至少或约至少1x108个此类细胞。
例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，那么剂量包括少于约5x108个总重组受体(例如，CAR或TCR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如在约1x106到5x108个此类细胞的范围内，如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如，CAR或TCR表达)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至1x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x106至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至1x108个总CD3+/重组受体+或CD8+/重组受体+细胞、从或从约5x105至1x107个总CD3+/重组受体+或CD8+/重组受体+细胞、或从或从约1x106至1x107个总CD3+/重组受体+或CD8+/重组受体+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至5x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，从或从约5x105至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，或从或从约1x106至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如，CAR+或TCR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至5x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x106至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个均包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含以下细胞数量的剂量：从或从约1x105至5x108个总CD3+/重组受体+或CD8+/重组受体+细胞、从或从约5x105至1x107个总CD3+/重组受体+或CD8+/重组受体+细胞、或从或从约1x106至1x107个总CD3+/重组受体+或CD8+/重组受体+细胞，每个均包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，如果受试者是人，那么所述剂量的CD8+ T细胞(包括在剂量中包括CD4+和CD8+ T细胞)包括在约1x106与5x108个之间的总重组受体(例如，CAR或TCR)表达CD8+细胞，例如，在约5x106至1x108个此类细胞的范围内，例如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或在任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD8+ T细胞、1x107至2.5x107个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞，每个均包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用或施用约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108或5x108个总重组受体表达CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，表达重组受体的T细胞)的剂量作为单一剂量施用于受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含许多细胞的剂量，所述剂量为至少或至少约或者为或为约0.1x106个细胞/kg受试者体重、0.2x106个细胞/kg、0.3x106个细胞/kg、0.4x106个细胞/kg、0.5x106个细胞/kg、1x106个细胞/kg、2.0x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg或5x106个细胞/kg。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含许多细胞的剂量，所述剂量在或在约0.1x106个细胞/kg受试者体重与1.0x107个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg与5x106个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg与3x106个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg与2x106个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg与1x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg受试者体重与5x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg与3x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg与2x106个细胞/kg之间、在或在约2.0x106个细胞/kg受试者体重与5x106个细胞/kg之间、在或在约2.0x106个细胞/kg与3x106个细胞/kg之间或者在或在约3.0x106个细胞/kg受试者体重与5x106个细胞/kg之间(每个都包含端值)。
在一些实施方案中，细胞的剂量包含在2x105或约2x105个细胞/kg与2x106或约2x106个细胞/kg之间，如在4x105或约4x105个细胞/kg与1x106或约1x106个细胞/kg之间或在6x105或约6x105个细胞/kg与8x105或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x105个细胞(例如抗原表达细胞，如CAR表达细胞或TCR表达细胞)/千克受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg或者不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的剂量包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如抗原表达细胞，如CAR表达细胞或TCR表达细胞)/千克受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或者至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在过继细胞疗法的情况下，给定“剂量”的细胞的施用包括以单一组合物和/或单次不间断施用的方式(例如，以单次注射或连续输注的方式)施用给定量或数量的细胞，并且还包括在指定时间段内(其为不超过3天)以在多个单独组合物或输注中提供的分割剂量的方式施用给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情况下，所述剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间段内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
术语“分割剂量”是指分割的剂量，使其在超过一天的时间内施用。这种类型的给药涵盖在本发明方法中并且被认为是单一剂量。在一些实施方案中，分割剂量的细胞在不超过三天的时间段内以共同包含剂量的细胞的多个组合物来施用。
因此，所述剂细胞可以以分割剂量的形式施用。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内施用受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
在一些实施方案中，细胞的剂量通常足够大以有效降低疾病负荷。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞的剂量基于细胞总数(或每kg体重的数量)和单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞的剂量基于单独群体中的细胞或单独细胞类型的所需总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，剂量基于此类特征的组合，此类特征如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的容忍差异或在所述容忍差异之内施用细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于细胞的最小数量或每单位体重细胞的最小数量。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量的一种或多种单独细胞群体或亚型的容忍差异或在所述容忍差异之内施用，如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细胞。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于最小的群体或亚型的细胞数量或每单位体重的最小的群体或亚型的细胞数量。
因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比率，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或子群体(例如，各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于所需的CD4+和/或CD8+细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，细胞在多种细胞群体或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的容忍范围下或容忍范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在为或约5:1与为或约5:1之间(或者大于约1:5且小于约5:1)，或者在为或约1:3与为或约3:1之间(或者大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或者大于约1:5且小于约2:1)，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、或1:5。在一些方面，容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR或TCR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化疗)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负荷、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，与细胞组合施用DGK抑制剂能够显著增加细胞的扩增或增殖，并且因此可以向受试者施用较低细胞剂量。在一些情况下，所提供的方法允许施用较低剂量的此类细胞，以实现与在不施用DGK抑制剂的情况下施用细胞疗法的方法中的剂量相同或更好的治疗功效，如比在不施用DGK抑制剂的情况下施用细胞疗法的方法中的剂量少至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。
在一些实施方案中，例如，所述剂量含有在或在约5.0x106与2.25x107、5.0x106与2.0x107、5.0x106与1.5x107、5.0x106与1.0x107、5.0x106与7.5x106、7.5x106与2.25x107、7.5x106与2.0x107、7.5x106与1.5x107、7.5x106与1.0x107、1.0x107与2.25x107、1.0x107与2.0x107、1.0x107与1.5x107、1.5x107与2.25x107、1.5x107与2.0x107、2.0x107与2.25x107之间。在一些实施方案中，细胞剂量含有一定数量的细胞，所述数量在至少或至少约5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、10x106与约15x106个重组受体表达细胞(如呈CD8+的重组受体表达细胞)之间。在一些实施方案中，这种剂量(如这种目标数量的细胞)是指在所施用的组合物中的总重组受体表达细胞。
在一些实施方案中，例如，较低剂量含有少于约5x106个细胞、重组受体(例如TCR或CAR)表达细胞、T细胞和/或PBMC/千克受试者体重，如少于约4.5x106、4x106、3.5x106、3x106、2.5x106、2x106、1.5x106、1x106、5x105、2.5x105或1x105个此类细胞/千克受试者体重。在一些实施方案中，较低剂量含有少于约1x105、2x105、5x105或1x106个此类细胞/千克受试者体重，或在前述任何两个值之间的范围内的值。在一些实施方案中，这些值是指重组受体表达细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指施用的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后大约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天施用。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量向受试者施用的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外的一个或多个剂量大于先前剂量。在一些实施方案中，可以向受试者施用一个或多个后续细胞剂量。在一些实施方案中，后续细胞剂量是在开始施用第一细胞剂量后大于或大于约7天、14天、21天、28天或35天施用。后续细胞剂量可以大于、大致等于或小于第一剂量。在一些实施方案中，可以重复T细胞疗法的施用(如第一和/或第二细胞剂量的施用)。
在一些实施方案中，开始施用细胞疗法(例如细胞剂量或分割细胞剂量的第一剂量)是在施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前(以前)、与其并行或在其之后(随后或以后)进行。在一些实施方案中，相对于开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，细胞疗法的施用的开始是如章节I-B-2中所述的任何实施方案中所述的。
在一些实施方案中，所述方法涉及，在施用T细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)的细胞剂量之后但在施用DGK抑制剂之前，评估来自受试者的样品的T细胞的一种或多种功能，如细胞的扩增或持久性，例如如通过血液中的水平或量或如本文所述的其他表型或所需结局(例如像章节III中所述的那些)确定的。在一些实施方案中，所述方法涉及，在施用T细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)的细胞剂量之后但在施用DGK抑制剂之前，评估来自受试者的样品中的一种或多种耗竭标记的表达。用于确定或评估组合疗法的方案的各种参数在章节III中描述。
B.DGKα和/或DGKζ抑制剂的施用
在一些方面，本文提供的方法包括组合疗法，所述组合疗法通过将DGK抑制剂与细胞疗法(例如T细胞疗法)组合施用于患有疾病或病症(诸如如上所述的任何疾病或病症)的受试者。可以在施用细胞疗法(例如T细胞疗法)之前、与其并行或在其之后施用DGKi。在一些方面，本文提供的方法包括向患有疾病或病症的受试者施用细胞疗法，例如T细胞疗法，其中所述受试者先前已经被施用DGK抑制剂。在一些实施方案中，将DGK抑制剂和细胞疗法(例如，T细胞疗法)并行施用于受试者。
在一些实施方案中，DGK的抑制剂是DGKα和/或DGKζ的抑制剂在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα的抑制剂。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKζ的抑制剂。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂抑制两种酶。可以如本文进一步所述测量酶抑制水平。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂不是其他DGK酶的显著抑制剂。
在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂增加免疫应答，例如通过增加T细胞活性。例如，DGKα和/或DGKζ的抑制剂可以增加初级T细胞信号传导，如例如由pERK/pPKC信号传导增加所证明的，这可以如本文进一步所述来测量。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂具有以下特性中的一种或多种：(i)其降低抗原刺激的阈值；(ii)增加CTL效应子功能；以及(iii)增强肿瘤细胞杀伤。当DGKα和/或DGKζ的抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能依赖于CD8+ T细胞，如例如在CT26动物模型中所示。当DGKα和/或DGKζ的抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能依赖于NK细胞，如例如在CT26动物模型中所示。当DGKα和/或DGKζ的抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能依赖于CD8+ T细胞和NK细胞，如例如在CT26动物模型中所示。当DGKα和/或DGKζ的抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能被CD4细胞耗竭增强，例如，在CT-26动物模型中。在某些实施方案中，在CT-26动物模型中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂增强AH1+四聚体抗原呈递。DGKα和/或DGKζ的抑制剂优选包括上述特性中的一种或多种，并且可以包括所有这些特性。
1.DGKα和/或DGKζ酶活性的示例性抑制剂
示例性化合物，如本文所述的式I的化合物及其药学上可接受的盐描述于WO2020/006018和WO 2020/006016中，将两者的内容通过引用具体并入本文。示例性化合物，如本文所述的式II的化合物及其药学上可接受的盐描述于PCT/US2020/048070中，将其内容通过引用具体并入本文。
在一些实施方案中，所提供的T细胞疗法和DGK抑制剂的组合疗法涉及施用或使用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C3-4环烷基、C3-4氟环烷基、或-NO2；
R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
在一些实施方案中，所提供的T细胞疗法和DGK抑制剂的组合疗法涉及施用或使用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；
每个R1a独立地是F、Cl、或-CN；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-2烷基、-CF3、环丙基、或-NO2；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
并且每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。
在一些实施方案中，所提供的T细胞疗法和DGK抑制剂的组合疗法涉及施用或使用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是-CN；
R2是-CH3；
R3是H、F或-CN；
R4是：
在一些实施方案中，所提供的T细胞疗法和DGK抑制剂的组合疗法涉及施用或使用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构或式(或其异构体)之一的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯
4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
8-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
4-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-6-甲氧基-1-甲基-1,2-二氢-1,5-萘啶-2-酮
/>
8-[(2S,5R)-4-{[2-(二氟甲基)-4-氟苯基]甲基}-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
8-[(2S,5R)-4-[1-(2,6-二氟苯基)乙基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
8-((3R)-4-((4-氯苯基)(5-氟吡啶-2-基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
8-[(2S,5R)-4-[双(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
在一些实施方案中，所提供的T细胞疗法和DGK抑制剂的组合疗法涉及施用或使用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物：
/>
或其盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-8碳环基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
在一些实施方案中，所提供的T细胞疗法和DGK抑制剂的组合疗法涉及施用或使用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物：
或其盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中：R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R4a和R4b独立地是：(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；(ii)C3-6碳环基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟基烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1- 2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rx独立地是H或-CH3；并且m是1、2、或3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中：R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；每个R1a独立地是F、Cl、或-CN；每个Ra独立地是H或C1-3烷基；R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R4a和R4b独立地是：(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、＝O、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；并且m是1、2、或3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中：R1是Cl或-CN；R2是-CH3；R4是-CH2R4a或-CHR4aR4b；R4a是环丙基、环丁基、环己基、双环[1.1.1]戊基、苯基、吡啶基、嘧啶基、噁二唑基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基、或氧代二氢苯并[d]噁唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-OCH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-OCH2(环丙基)、和环丙基；R4b是：(i)-CH3和-CH2CH3；或(ii)苯基、异噁唑基、噁二唑基、或噻唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CH3、-C(CH3)3、-CF3、-OCF3、和环丙基；每个R5独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、或-CH2OCH3；并且m是2。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中：R1是Cl、-CN、-OH、-CHF2、-CH2OH、-CH2OCH3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCHF2、-OCH2CH2OCH3、或-OCH2CH2N(CH3)2；R2是H、-CH3、或-CD3；R4是-CH2R4a或-CHR4aR4b；R4a是环己基、苯基、吡啶基、嘧啶基、噁二唑基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基、或氧代二氢苯并[d]噁唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-CH3、-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CH2OH、-CHF2、-CF3、-CH2Br、-CH2NH2、-CH2NHC(O)OCH3、-C(CH3)2CN、-OCH3、-OCD3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-OCH2CH2CF3、-OC(CH3)2CN、-OC(CH3)2CH2OH、-OC(CH3)2CH2OCH3、-N(CH3)2、-C(O)OCH3、环丙基、氰基环丙基、甲基环丙基、-O(环丙基)、-O((乙氧基羰基)环丙基)、吗啉基、吡咯烷酮基、四氢吡喃基、二氧戊环基、-CH2(吗啉基)、-CH2(二氟吗啉基)、-CH2(二甲基吗啉基)、-CH2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CH2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CH2(甲基哌嗪酮基)、-CH2(乙酰基哌嗪基)、-CH2(哌啶基)、-CH2(二氟哌啶基)、-CH2(甲氧基哌啶基)、-CH2(羟基哌啶基)、-C(CH3)2(吗啉基)、-OCH2(环丙基)、-OCH2(甲基环丙基)、-OCH2(甲基氮杂环丁烷基)、-OCH2(氧杂环丁烷基)、-OCH2(四氢吡喃基)、-OCH2(噻唑基)、或-OCH2CH2(环丙基)；R4b是：(i)-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、或-CH(CH3)2；或(ii)苯基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、或三唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CH3、-C(CH3)3、-CF3、-OCF3、和环丙基；每个R5独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2OCH2CH3、-CH2NH2、-CH2N3、或-CH2NHC(O)OCH3；并且m是2。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是Cl、-CN、-OH、-CHF2、-CH2OH、-CH2OCH3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCHF2、-OCH2CH2OCH3、或-OCH2CH2N(CH3)2。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是H、F、Cl、Br、-CN、-CH3、环丙基、-OCH3、或-NH2。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是Cl或-CN。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是H、被零至4个R2a取代的C1-2烷基、或被零至2个R2a取代的C3-4环烷基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是H或-CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是H、-CH3、或-CD3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是H。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R2是-CD3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CH2R4a或-CH2CH2R4a。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CH2R4a或-CD2R4a。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是苯基、吡啶基、四氢吡喃基、苯并噁嗪基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基、苯并噁嗪酮基、吲唑基、吲哚基、或喹啉基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CHF2、-CF3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-C(O)CH3、-C(O)OC(CH3)3、-N(CH3)2、氰基环丙基、和苯基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是苯基、吡啶基、或苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-OCH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-OCH2(环丙基)、和环丙基。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CH2R4a。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是苯基、吡啶基、四氢吡喃基、苯并噁嗪基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基、苯并噁嗪酮基、吲唑基、吲哚基、或喹啉基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CHF2、-CF3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-C(O)CH3、-C(O)OC(CH3)3、-N(CH3)2、氰基环丙基、和苯基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是苯基、吡啶基、或苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-OCH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-OCH2(环丙基)、和环丙基。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CH2R4a；并且R4a是C3-8碳环基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CH2R4a；并且R4a是C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟基烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是环己基、苯基、或苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基，各自被1至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CH(CH3)2、-CF3、-OCH2CH3、-OCF3、环丙基、和-OCH2(环丙基)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是：(i)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；并且R4b是苯基或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、和甲基哌啶基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是(i)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；并且R4b是苯基、异噁唑基、噁二唑基、或噻唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CH3、-C(CH3)3、-CF3、-OCF3、和环丙基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是苯基、吡啶基、或苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-OCH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-OCH2(环丙基)、和环丙基；并且R4b是苯基、异噁唑基、噁二唑基、或噻唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CH3、-C(CH3)3、-CF3、-OCF3、和环丙基。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是：(i)C3-6碳环基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6碳环基、4至10元杂环基、6至10元芳基、或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；并且R4b是苯基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、或三唑基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CH3、-C(CH3)3、-CF3、-OCF3、和环丙基。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是(i)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、单环或双环芳基、和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；并且R4b是被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；并且R4b是被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是苯基、吡啶基、或苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基，各自被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-OCH3、-OCH(CH3)2、-OCHF2、-OCF3、-OCH2(环丙基)、和环丙基；并且R4b是-CH3和-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是(i)C3-8碳环基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基、或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；并且R4b是-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4a是(i)C3-6碳环基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟基烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(ii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基、或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；并且R4b是-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、或-CH(CH3)2。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CN、-CH3、或-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CN。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH3或-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是1、2、或3；并且每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1- 2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中每个R5独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、或-CH2OCH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是零。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是1、2、或3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是1或2。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是1。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是2或3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是2。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中m是3。
在一个实施方案中，施用具有式(III)的结构的式(II)的化合物或其盐：
其中R5a、R5b、R5c、和R5d中的一个、两个、或三个各自是R5并且R5a、R5b、R5c、和R5d中的其余基团各自是氢。在一些实施方案中，施用式(III)的化合物或其盐，其中每个R5独立地是-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CHC(CH3)2、-CH2F、-C(CH3)2F、-CF(CH3)CH(CH3)2、-CH2OH、-C(CH3)2OH、-C(CH3)(OH)CH(CH3)2、-CH2OCH3、-C(O)C(CH3)2、-C(O)OH、-C(O)OCH3、-C(O)OC(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NH(环丙基)、-C(O)O(环丙基)、环丙基、苯基、甲基噁二唑基、或甲基吡啶基。在一些实施方案中，施用式(III)的化合物或其盐，其中每个R5独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2OCH2CH3、-CH2NH2、-CH2N3、或-CH2NHC(O)OCH3。
在一个实施方案中，施用具有式(IV)的结构的式(II)的化合物或其盐：
其中R5a和R5c各自是R5并且R5b和R5d各自是氢。在一些实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中(i)R5a是-CH3或-CH2CH3并且R5c是-CH3或-CH2CH3；或(ii)R5a是-CH3并且R5c是-CH2OH或-CH2OCH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH2CH3并且R5c是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH2CH3并且R5c是-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2OH。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2OCH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2OCH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2N3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2NH2。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH3并且R5c是-CH2NHC(O)OCH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH2OH并且R5c是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R5a是-CH2OCH3并且R5c是-CH3。
在一个实施方案中，施用具有以下结构的式(II)的化合物或其盐：
在一个实施方案中，施用具有以下结构的式(II)的化合物或其盐：
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在一个实施方案中，施用具有以下结构的式(II)的化合物或其盐：
在一个实施方案中，施用具有以下结构的式(II)的化合物或其盐：
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在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是：
(i)
(ii)
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(iii)
或者/>在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是H、Br、-CN、或-OCH3；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是：
在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是H、Br、-CN、或-OCH3；并且R2是-CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R5a是-CH3；并且R5c是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R5a是-CH3；并且R5c是-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R5a是-CH3；并且R5c是-CH2CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R5a是-CH2CH3；并且R5c是-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(IV)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R5a是-CH3；并且R5c是-CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH2CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；R2是-CH3；R4是-CHR4aR4b；并且R4b是-CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4a是被1至2个独立地选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CF3-OCF3、或-OCH2(环丙基)。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是被-CF3或-OCF3取代的苯基；并且R4b是-CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是被-CF3或-OCF3取代的苯基；并且R4b是-CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是被-CF3或-OCF3取代的苯基；并且R4b是-CH2CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是被-CF3或-OCF3取代的苯基；并且R4b是-CH2CH2CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是被1至2个独立地选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CF3-OCF3、或-OCH2(环丙基)；并且R4b是-CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4a是吡啶基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；并且R4a是被-CF3取代的吡啶基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是吡啶基；并且R4a是被Cl取代的苯基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a是被-CF3取代的吡啶基；并且R4b是被F取代的苯基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R4是-CHR4aR4b；R4a和R4b中的一个是被F取代的苯基；并且R4a和R4b中的另一个是被环丙基取代的噁二唑基。在一些实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中R1是-CN；并且R2是-CH3。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：4-((2S,5R)-4-((2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苄基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(4-(三氟甲氧基)苄基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苄基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(3,4,5-三氟苄基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(3,4-二氟苄基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(2-氯-4,5-二氟苄基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(2-氯-4-氟苄基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(4-异丙基苄基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(4-(环丙基甲氧基)苄基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(2-氟-4-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(4-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(4-环丙基-2-氟苄基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((4,4-二氟环己基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；或4-((2S,5R)-4-(4-乙氧基苄基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((4-氟苯基)(异噁唑-3-基)甲基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((5-环丙基异噁唑-3-基)(4-(三氟甲氧基)苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(21-22)；4-((2S,5R)-4-((4-环丙基噻唑-2-基)(4-氟苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(异噁唑-3-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((5-环丙基吡啶-2-基)(4-氟苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(吡啶-2-基(4-(三氟甲氧基)苯基)甲基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(23-24)；4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((5-环丙基异噁唑-3-基)(4-(三氟甲氧基)苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((5-环丙基异噁唑-3-基)(4-氟苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((2-环丙基噻唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(25-26)；4-((2S,5R)-4-((3-(叔丁基)-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(25-26)；4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2-乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-5-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2-乙基-4-((4-氟苯基)(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-5-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(27-28)；4-((2S,5R)-4-((4-环丙基噻唑-2-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(异噁唑-3-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((5-环丙基异噁唑-3-基)(4-(三氟甲氧基)苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5S)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5S)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-5-(羟基甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5S)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-5-(羟基甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((4-氟苯基)(2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((6-(二氟甲基)吡啶-2-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((3-溴-1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((6-(二氟甲基)吡啶-2-基)(4-氟苯基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5R)-4-((5-环丙基-1,2,4-噁二唑-3-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-4-((5-环丙基-1,2,4-噁二唑-3-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(双(4-氯苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-((4-氰基苯基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；或4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(3-(三氟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(17-18)；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(19-20)；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(2-氟-4-甲氧基苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-甲氧基苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-异丙氧基苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(4-(三氟甲氧基)苄基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基-2-氟苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(4-异丙氧基苯基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(4-甲氧基苯基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-氰基苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(二氟甲氧基)苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基-2-氟苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2-乙基-5-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2-乙基-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙基)-5-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2-乙基-5-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-氟苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(1-(3,4,5-三氟苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2,4-二氟苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-氯-2-氟苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3,4-二氟苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(二氟甲氧基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基-2-氟苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5S)-5-(羟基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；6-氯-4-((2S,5S)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5S)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5S)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5S)-5-(羟基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-((1-羟基-2-甲基丙-2-基)氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；6-氯-4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-((1-甲氧基-2-甲基丙-2-基)氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；6-氯-4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-((1-甲氧基-2-甲基丙-2-基)氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(甲氧基-d3)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(6-环丙基吡啶-3-基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(2-吗啉代-4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(2-氰基丙-2-基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(29-30)；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢苯并[d]噁唑-5-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(2-吗啉代嘧啶-5-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(甲氧基-d3)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-甲氧基苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(6-甲氧基吡啶-2-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(1-甲基环丙基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-氰基苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(二氟甲氧基)苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(6-甲基吡啶-3-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(二氟甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-异丙氧基苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(对甲苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-氯-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(6-(二氟甲氧基)吡啶-2-基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(31-32)；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(6-(三氟甲氧基)吡啶-2-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(2-吗啉代丙-2-基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-甲氧基苯基)-2-甲基丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(2-氰基丙-2-基)苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(2-环丙基苯并[d]噁唑-5-基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙氧基苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；(1S,2S)-2-(4-(1-((2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)乙基)苯氧基)环丙烷-1-甲酸乙酯；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-异丙氧基苯基)-2-甲基丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-(1-((2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)乙基)苯甲酸甲酯；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(吗啉代甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(羟基甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(溴甲基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-((4-甲氧基哌啶-1-基)甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((2,2-二甲基吗啉代)甲基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((4,4-二氟哌啶-1-基)甲基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(哌啶-1-基甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-((4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-((4-甲基-3-氧代哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(((R)-3-羟基哌啶-1-基)甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉代)甲基)苯基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢苯并[d]噁唑-5-基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基-2-氟苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(4-甲氧基苯基)丙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-乙氧基苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙氧基苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(4-甲氧基苯基)-2-甲基丙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(2-氰基丙-2-基)苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3,4-二氟苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-溴苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(4-异丙氧基苯基)-2-甲基丙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2,6-二氟苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(四氢-2H-丙-4-基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(1,3-二氧戊环-2-基)苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-4-(1-(4-异丙氧基苯基)丙基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(3,3,3-三氟丙氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-((四氢-2H-丙-4-基)甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(2-环丙基乙氧基)苯基)丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-((1-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-((1-甲基环丙基)甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(噻唑-2-基甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3-溴-4-(三氟甲基)苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(3-(吗啉代甲基)-4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3-((二甲基氨基)甲基)-4-(三氟甲基)苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(3-(哌啶-1-基甲基)-4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3-氰基-4-(三氟甲基)苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(氨基甲基)苯基)乙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；(4-(1-((2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)-2-乙基-5-甲基哌嗪-1-基)乙基)苄基)氨基甲酸甲酯；4-((2S,5R)-4-(1-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)乙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)-2-甲基丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(5-环丙基-1,3,4-噁二唑-2-基)-2-甲基丙基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；2-((2R,5S)-4-(6-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-2-(4-氟苯基)乙腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((2-氰基丙-2-基)氧基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-环丙基-2-氟苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5R)-4-(1-(4-(羟基甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(羟基甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(溴甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((2,2-二甲基吗啉代)甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(((1S,4S)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-(((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉代)甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((4,4-二氟哌啶-1-基)甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(4-((2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)乙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(33-34)；6-氯-4-((2S,5S)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5S)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5S)-5-(乙氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5S)-5-(叠氮基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-氯-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-5-(氨基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-氯-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5S)-5-(甲氧基甲基)-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2R,5R)-2-(羟基甲基)-5-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2R,5R)-2-(甲氧基甲基)-5-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2R,5R)-2-(甲氧基甲基)-5-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2R,5R)-5-乙基-2-(羟基甲基)-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-(甲基-d3)吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-(甲基-d3)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；6-氯-4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-(羟基甲基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-(甲氧基甲基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；6-氯-4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-甲氧基-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-乙氧基-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-6-甲氧基-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-6-乙氧基-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-(二氟甲基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；6-(二氟甲基)-4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-羟基-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-6-(二氟甲氧基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮；6-氯-4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(1-(3-(三氟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮(非对映异构体混合物)；4-((2S,5R)-2,5-二甲基-4-(1-(3-(三氟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-环丙基丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；4-((2S,5R)-4-(1-(3,3-二氟环丁基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；或4-((2S,5R)-4-(1-(4,4-二氟环己基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(17-18)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(19-20)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(21-22)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-4-((S)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-4-((R)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(23-24)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((R)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(25-26)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((R)-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((S)-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(27-28)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((S)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((R)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(29-30)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((S)-1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-4-((R)-1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(31-32)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是：
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(33-34)。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
在一个实施方案中，施用式(II)的化合物或其盐，其中所述化合物是1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
2.组合物和给药
本文所述的化合物，例如根据式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其药学上可接受的盐，可以通过适合于待治疗病症的任何方式施用，这可取决于对部位特异性治疗的需要或待递送的化合物的量。
本文还包括一类药物组合物，其包含化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其药学上可接受的盐；和一种或多种无毒、药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂(在本文中统称为“载体”材料)和，如果需要，其他活性成分。化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，可以通过任何合适的途径，优选以适合于这种途径的药物组合物的形式，并以对预期治疗有效的剂量施用。本文所述的化合物和组合物可以例如在含有常规药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位配制品中口服、粘膜、或亲本地(包括血管内、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、和胸骨内)施用。例如，药物载体可以含有甘露醇或乳糖和微晶纤维素的混合物。所述混合物可含有另外的组分，如润滑剂(例如，硬脂酸镁)和崩解剂(如交聚维酮)。载体混合物可以被填充到明胶胶囊中或压缩成片剂。例如，药物组合物可以作为口服剂型或输注剂施用。
DGK抑制剂的给药方案将根据已知因素(如特定药剂的药效学特征及其施用方式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康、医疗状况和体重；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗频率；施用途径；和患者的肾和肝功能)而变化。
作为通用指导，当用于所指示的作用时，每种活性成分的每日口服剂量的范围将在约0.001至约5000mg/天之间，优选在约0.01至约1000mg/天之间，并且最优选在约0.1至约250mg/天之间。经静脉内，在恒定速率输注期间，最优选的剂量的范围将是从约0.01至约10mg/kg/分钟。可以将如本文所述的DGK抑制剂以单次日剂量施用，或者可以将每日总剂量以每日两次、三次或四次的分剂量施用。
所述化合物典型地与合适的药物稀释剂、赋形剂或载体(在本文中统称为药物载体)混合施用，所述药物稀释剂、赋形剂或载体关于施用的预期形式(例如，口服片剂、胶囊、酏剂和糖浆)适当选择，并且与常规制药实践一致。
适用于施用的剂型(药物组合物)可以含有从约1毫克至约2000毫克活性成分/剂量单位。在这些药物组合物中，所述活性成分通常将以基于组合物总重量按重量计约0.1％-95％的量存在。
用于口服施用的典型胶囊含有至少一种DGK抑制剂(250mg)、乳糖(75mg)和硬脂酸镁(15mg)。将混合物通过60目筛并且填充到L号明胶胶囊中。
通过将至少一种DGK抑制剂(250mg)无菌放入小瓶中、无菌冷冻-干燥和密封来产生典型的可注射制剂。使用时，将小瓶中的内容物与2mL生理盐水混合以产生可注射制剂。
对于口服施用，本文所述的药物组合物可以呈例如片剂、胶囊、液体胶囊、混悬剂或液体的形式。优选将所述药物组合物制备成含有特定量的活性成分的剂量单位形式。例如，所述药物组合物可以以片剂或胶囊提供，所述片剂或胶囊包含在从约0.1至1000mg、优选从约0.25至250mg、更优选从约0.5至100mg范围内的量的活性成分。根据患者的状况和其他因素，对于人或其他哺乳动物的合适的日剂量可能有很大差异，但是可以使用常规方法确定。
无论选择何种施用途径，可以通过本领域技术人员已知的常规方法将如本文所述的用于施用的DGK抑制剂(其可以以合适的水合形式使用)和/或含有所述DGK抑制剂的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。
可以改变含有DGK抑制剂的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得活性成分对于特定患者、组合物和施用方式有效实现治疗反应而对患者无毒的量。所选剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄或代谢速率，吸收速率和程度，治疗的持续时间，与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和先前病史，以及医学领域中熟知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师可以以比实现治疗效果所需的水平更低的水平来开始在药物组合物中使用的DGK抑制剂的剂量，并且逐渐增加剂量直到实现效果。
通常，DGK抑制剂的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。通常此类有效剂量将取决于以上所述的因素。通常，用于患者的DGK抑制剂的口服、静脉内、脑室内和皮下剂量的范围将是从约0.01mg至约50mg/千克体重/天。如果需要，活性化合物的有效日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量施用，所述子剂量在全天中以适当的间隔分开施用，任选地，以单元剂型施用。在某些方面，给药是每天施用一次。
本文中考虑的任何药物组合物可以例如经由任何可接受且合适的口服制剂口服递送。示例性的口服制剂包括但不限于例如片剂、锭剂、糖锭剂、水性和油性混悬剂、可分散散剂或颗粒剂、乳剂、硬和软胶囊、液体胶囊、糖浆剂和酏剂。旨在用于口服施用的药物组合物可以根据本领域已知的用于制造旨在用于口服施用的药物组合物的任何方法来制备。为了提供药学上可口的制剂，药物组合物可以含有至少一种选自甜味剂、调味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂、和防腐剂的试剂。
片剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与适合于制造片剂的至少一种无毒的药学上可接受的赋形剂混合来制备。示例性的赋形剂包括但不限于例如惰性稀释剂，例如像碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如像微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，例如像淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶；以及润滑剂，例如像硬脂酸镁、硬脂酸和滑石粉。另外，片剂可以是未包衣的，或者通过已知技术包衣，以掩蔽尝起来令人不快的药物的不良味道，或延迟活性成分在胃肠道中的崩解和吸收，从而维持活性成分的作用持续更长时间。示例性水溶性遮味材料包括但不限于羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素。示例性延时材料包括但不限于乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
硬明胶胶囊可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种盐与至少一种惰性固体稀释剂(例如像碳酸钙、磷酸钙和高岭土)混合来制备。
软明胶胶囊可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种水溶性载体(例如像聚乙二醇)和至少一种油介质(例如像花生油、液体石蜡和橄榄油)混合来制备。
水性混悬剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与适合于制造水性混悬剂的至少一种赋形剂混合来制备。适合于制造水性悬浮液的示例性的赋形剂包括但不限于例如助悬剂，例如像羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如像天然存在的磷脂，例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如像聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如像十七烷乙烯-氧基鲸蜡醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如像聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；以及环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如像聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可以含有至少一种防腐剂，例如像对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯；至少一种着色剂；至少一种调味剂；和/或至少一种甜味剂，包括但不限于例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜。
油性混悬剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐悬浮在植物油(例如像花生油、橄榄油、芝麻油和椰子油)或者悬浮在矿物油(例如像液体石蜡)中来制备。油性混悬剂还可以含有至少一种增稠剂，例如像蜂蜡、硬石蜡和十六醇。为了提供可口的油性混悬剂，可以将上文已经描述的至少一种甜味剂和/或至少一种调味剂添加到油性混悬剂中。油性混悬剂可以进一步含有至少一种防腐剂，包括但不限于例如抗氧化剂，例如像丁基化羟基茴香醚和α-生育酚。
可分散散剂和颗粒剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种分散剂和/或润湿剂、至少一种助悬剂和/或至少一种防腐剂混合来制备。合适的分散剂、润湿剂和助悬剂如上已经所述。示例性防腐剂包括但不限于例如抗氧化剂，例如抗坏血酸。此外，可分散散剂和颗粒剂还可以含有至少一种赋形剂，包括但不限于例如甜味剂、调味剂和着色剂。
至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，例如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐的乳剂可以例如制备成水包油乳剂。包含式(I)或(II)的化合物，如选自化合物1至34的化合物的乳剂的油相可以由已知成分按已知方式构成。油相可以通过但不限于例如植物油(例如像橄榄油和花生油)、矿物油(例如像液体石蜡)及其混合物来提供。虽然所述相可以仅包含乳化剂，但是它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。合适的乳化剂包括但不限于例如天然磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如像脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如像聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯。优选地，亲脂性乳化剂与用作稳定剂的亲水性乳化剂一起使用。还优选的是包含油和脂肪两者。一种或多种乳化剂与或不与一种或多种稳定剂一起构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，其形成乳膏配制品的油性分散相。乳剂还可以含有甜味剂、调味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适用于用于治疗方法的配制品中的乳化剂和乳液稳定剂包括Tween 60、Span 80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、单独或与蜡一起的二硬脂酸甘油酯或本领域熟知的其他材料。
所述化合物，例如式(I)或(II)的那些，如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐，还可以例如通过任何药学上可接受的且合适的可注射形式静脉内、皮下和/或肌内递送。示例性的可注射形式包括但不限于例如无菌水溶液，其包含可接受的媒介物和溶剂，例如像水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液；无菌水包油微乳剂；以及水性或油性混悬剂。
用于肠胃外施用的配制品可以呈水性或非水性等渗无菌注射溶液或悬浮液的形式。这些溶液和混悬剂可由无菌粉末或颗粒使用在用于口服施用的配制品中提及的载体或稀释剂中的一种或多种或通过使用其他合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。可将化合物溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化钠、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其他辅料和施用模式在制药领域中是众所周知的。活性成分也可以通过注射作为与合适的载体(包括盐水、右旋糖或水)或与环糊精(即Captisol)、共溶剂增溶(即丙二醇)或胶束增溶(即Tween 80)的组合物来施用。
无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。所述可接受的可使用的媒介物和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌固定油作为溶剂或助悬介质。就此目的而言，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸可用于制备可注射剂。
无菌可注射水包油型微乳剂可例如如下制备：1)将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，例如选自化合物1至34的化合物，和/或其药学上可接受的盐，溶解于油相(例如大豆油与卵磷脂的混合物)中；2)将含有化合物，例如式(I)的化合物，和/或其药学上可接受的盐的油相与水和甘油的混合物组合；和3)处理该组合以形成微乳剂。
可根据本领域已知的方法来制备无菌水性或油性混悬剂。例如，可利用无毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇)制备无菌水溶液或混悬剂；且可利用无菌无毒性的可接受的溶剂或助悬介质(例如无菌不挥发性油(例如像合成的甘油一酯或甘油二酯)和脂肪酸(例如像油酸))制备无菌油性混悬剂。
可用于药物组合物的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型的表面活性剂诸如Tween类，聚乙氧基化蓖麻油诸如CREMOPHOR表面活性剂(BASF)，或其他类似的聚合物递送基质，血清蛋白诸如人血清白蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。也可有利地使用环糊精诸如α-、β-和γ-环糊精或化学改性衍生物诸如羟基烷基环糊精(包括2-和3-羟基丙基环糊精)或其他可溶性衍生物以有助于递送具有本文所述式的化合物。
本文所述的药学活性化合物可根据药学常规方法加工以产生用于施用于患者(包括人类和其他哺乳动物)的药物。所述药物组合物可以经受诸如灭菌的常规制药操作和/或可以含有常规佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液等。此类组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
所施用的化合物量和用本文所述的化合物和/或组合物对疾病病症进行治疗的给药方案取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、性别和医学状态、疾病类型、疾病严重性、施用途径和频率以及所使用的具体化合物。因此，给药方案可以广泛变化，但是可以使用标准方法常规确定。约0.001至100mg/kg体重、优选约0.0025与约50mg/kg体重之间、并且最优选约0.005至10mg/kg体重之间的日剂量可能是适当的。日剂量可以以每天一至四个剂量施用。其他给药时间安排包括每周一剂和每两天一剂。
出于治疗目的，通常将本文所述的活性化合物与一种或多种适于所指示的施用途径的佐剂组合。若口服施用，则可将所述化合物与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后压片或包囊以方便施用。上述胶囊或片剂可包括控释配制品，所述控释配制品可按活性化合物在羟丙基甲基纤维素中的分散体提供。
本文所述的药物组合物包含至少一种化合物，例如式(I)化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐，和任选的选自任何药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的另外药剂。本文所述的替代组合物包含化合物，例如式(I)或(II)的化合物，如选自本文所述的化合物1至34的化合物，或其前药，以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
在一些实施方案中，在施用细胞疗法(如T细胞疗法)之前、之后、期间、过程期间、同时、几乎同时、依次和/或间歇地开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，所述方法涉及在施用T细胞疗法之前开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在其他实施方案中，所述方法涉及在施用T细胞疗法之后开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，剂量时间表包括与T细胞疗法的施用同时或并行开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些实施方案中，在周期内施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，所述周期包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂的施用期，然后是不施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂的休息期。在一些实施方案中，周期的总天数，例如从开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂开始，为大于或大于约或者为约21天、28天、30天、40天、50天、60天或更长时间。
在一些实施方案中，开始施用DGKα和/或DGKζ抑制剂和开始施用T细胞疗法是在至少一个周期中的同一天进行，任选地并行进行。在一些实施方案中，在至少一个周期中开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂是在开始施用T细胞疗法之前进行。在一些实施方案中，在至少一个周期中开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂与开始施用T细胞疗法是并行进行或在同一天进行。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在开始T细胞疗法之前从或从约0至30天，例如0至15天、0至6天、0至96小时、0至24小时、0至12小时、0至6小时、或0至2小时、2小时至15天、2小时至6天、2小时至96小时、2小时至24小时、2小时至12小时、2小时至6小时、6小时至30天、6小时至15天、6小时至6天、6小时至96小时、6小时至24小时、6小时至12小时、12小时至30天、12小时至15天、12小时至6天、12小时至96小时、12小时至24小时、24小时至30天、24小时至15天、24小时至6天、24小时至96小时、96小时至30天、96小时至15天、96小时至6天、6天至30天、6天至15天、或15天至30天施用。在一些方面，在开始T细胞疗法之前不超过约96小时、72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时或1小时施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在细胞疗法(例如T细胞疗法)之前给予DGKα和/或DGKζ的抑制剂的一些任何此类实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂的施用以规则间隔继续进行，直到开始细胞疗法(例如T细胞疗法)和/或在开始细胞疗法(例如T细胞疗法)之后持续一定时间。
在一些实施方案中，在施用细胞疗法(例如T细胞疗法)之后，施用或进一步施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用细胞疗法(例如T细胞疗法)之后1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时、96小时、4天、5天、6天或7天、14天、15天、21天、24天、28天、30天、36天、42天、60天、72天或90天内或者约1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时、96小时、4天、5天、6天或7天、14天、15天、21天、24天、28天、30天、36天、42天、60天、72天或90天内施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在开始施用细胞疗法之后持续施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，如以规则间隔施用。
在一些实施方案中，在开始施用细胞疗法(例如T细胞疗法)之后至多或至多约1天、至多或至多约2天、至多或至多约3天、至多或至多约4天、至多或至多约5天、至多或至多约6天、至多或至多约7天、至多或至多约12天、至多或至多约14天、至多或至多约21天、至多或至多约24天、至多或至多约28天、至多或至多约30天、至多或至多约35天、至多或至多约42天、至多或至多约60天、或至多或至多约90天、至多或至多约120天、至多或至多约180天、至多或至多约240天、至多或至多约360天、或至多或至多约720天或更长时间施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些任何此类上述实施方案中，在开始施用细胞疗法(例如T细胞疗法)之前和之后施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些实施方案中，在受试者的血液中可检测到T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在血液中可检测到的T细胞疗法的细胞数量(在血液中已经可检测之后)不可检测或减少(任选地与施用所述T细胞疗法之后的前一时间点相比有所减少)时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在与在开始施用T细胞疗法之后在受试者的血液中可检测到的T细胞疗法的细胞的峰值或最大数量相比，在血液中可检测到的T细胞疗法的细胞数量减少1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多倍或减少超过1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多倍时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在受试者的血液中可检测到T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平之后，在受试者的血液中可检测的T细胞的细胞或源自所述T细胞的细胞的数量是受试者的血液中总外周血单个核细胞(PBMC)的小于小于10％、小于5％、小于1％或小于0.1％的时间时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在与在开始施用T细胞疗法之后未耗竭的在受试者的血液中可检测到的T细胞疗法的细胞的峰值或最大数量相比，耗竭的在血液中可检测到的T细胞疗法的细胞数量增加(例如，增加1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多倍或增加超过1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多倍)时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在受试者在用T细胞疗法治疗后展现出疾病进展和/或缓解后复发时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在受试者与在施用T细胞之前或之后并且在开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前的时间的肿瘤负荷相比展现出增加的肿瘤负荷时或之后(任选地之后立即或之后1至3天内)，开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些实施方案中，在至少一个周期内开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂是在开始施用T细胞疗法之后进行。在一些实施方案中，在开始施用T细胞疗法之后至少或约至少1天、至少或约至少2天、至少或约至少3天、至少或约至少4天、至少或约至少5天、至少或约至少6天、至少或约至少7天、至少或约至少8天、至少或约至少9天、至少或约至少10天、至少或至少约12天、至少或约至少14天、至少或至少约15天、至少或约至少21天、至少或至少约24天、至少或约至少28天、至少或约至少30天、至少或约至少35天或至少或约至少42天、至少或约至少60天、或至少或约至少90天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用T细胞疗法之后至少2天、之后至少1周、之后至少2周、之后至少3周或之后至少4周开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。其中在开始施用所述T细胞疗法之后2至35天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后2至28天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后2至21天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后2至14天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后7至21天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用所述T细胞疗法之后7至14天开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在开始施用T细胞疗法之后大于或大于约14天、15天、16天、17天、18天、19,天、20天、21天、24天或28天的时间开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些实施方案中，在开始细胞疗法之后，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每天施用几次、每天施用两次、每日施用、每隔一天施用、每周施用三次、每周施用两次、或每周施用一次。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每日施用。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每天施用两次。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每天施用三次。在其他实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每隔一天施用。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每日施用。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在施用期期间施用持续连续多天，如持续至多约连续7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂施用持续大于或大于约连续7天、大于或大于约连续14天、大于或大于约连续21天、大于或大于约连续约21天、或大于或大于约连续28天。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在施用期期间施用持续至多连续21天。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在施用期期间施用持续至多连续21天，其中所述周期包括大于30天，在开始施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂时开始。
在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在施用期期间施用持续不超过约连续7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或不超过连续30天。在某些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在21天的治疗周期内每日施用一次，持续14天。在某些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂在28天的治疗周期内每日施用一次，持续21天。在一些实施方案中，将eDGKα和/或DGKζ的抑制剂在施用期期间施用持续不超过连续14天。
在一些实施方案中，在周期内施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中所述周期包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂持续连续多天，随后是不施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂的休息期。在一些实施方案中，休息期是大于约1天、大于约连续3天、大于约连续5天、大于约连续7天、大于约连续8天、大于约连续9天、大于约连续10天、大于约连续11天、大于约连续12天、大于约连续13天、大于约连续14天、大于约连续15天、大于约连续16天、大于约连续17天、大于约连续18天、大于约连续19天、大于约连续20天、或大于约连续21天或更多天。在一些实施方案中，休息期是大于连续7天、大于连续14天、大于21天或大于28天。在一些实施方案中，休息期是大于约连续14天。在一些实施方案中，施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂的周期不含休息期。
在一些实施方案中，在周期内施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中将所述周期重复至少一次。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂施用至少2个周期、至少3个周期、至少4个周期、至少5个周期、至少6个周期、至少7个周期、至少8个周期、至少9个周期、至少10个周期、至少11个周期或至少12个周期。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个周期。
在一些实施方案中，在开始施用T细胞疗法之前或之后，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每日施用六次、每日施用五次、每日施用四次、每日施用三次、每日施用两次、每日施用一次、每隔一天施用、每三天施用、每周施用两次、每周施用一次或仅施用一次。在一些实施方案中，在施用T细胞疗法的时间段之前、期间、过程期间和/或之后，以规则间隔按多个剂量施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在施用T细胞疗法之前，以规则间隔按一个或多个剂量施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，在施用T细胞疗法之后，以规则间隔按一个或多个剂量施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，DGKα和/或DGKζ的抑制剂的一个或多个剂量可以与细胞疗法的剂量的施用同时发生。
在一些实施方案中，所述方法涉及向先前已经被施用过治疗有效量的DGKα和/或DGKζ的抑制剂的受试者施用T细胞疗法。在一些实施方案中，在向受试者施用表达重组受体的细胞的剂量之前，向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。在一些实施方案中，用DGKα和/或DGKζ的抑制剂治疗与细胞剂量的施用同时发生。在一些实施方案中，在施用细胞剂量之后施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每日施用，持续7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或超过21天。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每天施用两次，持续7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或超过21天。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每天施用三次，持续7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或超过21天。在一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂每隔一天施用，持续7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或超过21天。
在本文提供的方法的一些实施方案中，将DGKα和/或DGKζ的抑制剂和T细胞疗法同时或几乎同时施用。在某些实施方案中，以在治疗上足以至少部分地逆转T细胞疗法的T细胞的耗竭状态的时间、持续时间和量，向需要治疗的患者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
C.检查点抑制剂拮抗剂的施用
在一些任何前述实施方案中，组合疗法(例如，包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂和施用T细胞疗法的组合疗法)进一步包括向患有疾病或病症的受试者施用检查点拮抗剂(也称为检查点抑制剂)。在一些实施方案中，在施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前(以前)、与其并行或在其之后(随后或以后)施用检查点拮抗剂。在一些实施方案中，在施用T细胞疗法之前(以前)、与其并行或在其之后(随后或以后)施用检查点拮抗剂。
在一些实施方案中，组合疗法包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂、施用T细胞疗法、以及施用检查点抑制剂的拮抗剂。在一些实施方案中，组合疗法包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂、施用T细胞疗法、以及施用一种或多种检查点抑制剂的两种或更多种拮抗剂。
在一些实施方案中，检查点拮抗剂是PD1/PD-L1轴拮抗剂或抑制剂。在一些实施方案中，检查点拮抗剂是CTLA-4拮抗剂或抑制剂。在一些实施方案中，可以施用两种或更多种拮抗剂，其中一种是PD1/PD-L1轴拮抗剂或抑制剂，另一种是CTLA-4拮抗剂或抑制剂。
在一些实施方案中，组合疗法包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂、施用T细胞疗法、以及施用PD1/PD-L1轴拮抗剂。在一些实施方案中，组合疗法包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂、施用T细胞疗法、以及施用CTLA4拮抗剂。在一些实施方案中，所述组合疗法包括施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂、施用T细胞疗法、施用PD1/PD-L1轴拮抗剂、以及施用CTLA4拮抗剂。
在一些实施方案中，PD1/PD-L1轴拮抗剂是纳武单抗。在一些实施方案中，检查点抑制剂的拮抗剂是伊匹单抗。检查点抑制剂的拮抗剂可以是PCT/US202066198中所述的任一种，将所述文献的内容通过引用以其整体并入。
D.淋巴细胞清除治疗
在一些方面，所提供的方法可以还包括，例如在开始施用T细胞疗法之前或同时，施用一种或多种淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法包括施用磷酰胺，如环磷酰胺。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法可以包括施用氟达拉滨。
在一些方面，用免疫细胞清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。用淋巴细胞清除剂(包括环孢霉素和氟达拉滨的组合)预调理已经有效地改善转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在细胞疗法中的功效，包括改善转移细胞的反应和/或持久性。参见例如，Dudley等人,Science,298,850-54(2002)；Rosenberg等人,Clin Cancer Res,17(13):4550-4557(2011)。同样地，在CAR+ T细胞的情况下，几项研究已经掺入了淋巴细胞清除剂，最常见的是环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀或其组合，有时伴有低剂量辐射。参见Han等人Journal of Hematology&Oncology,6:47(2013)；Kochenderfer等人,Blood,119:2709-2720(2012)；Kalos等人,Sci Transl Med,3(95):95ra73(2011)；临床试验研究记录号：NCT02315612，NCT01822652。
可以进行这种预调理，目的是降低可能抑制所述疗法的功效的各种结局中的一种或多种的风险。这些结果包括被称为“细胞因子吸收”的现象，通过所述现象，T细胞、B细胞、NK细胞与TIL竞争稳态的和激活的细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15；通过调节性T细胞、NK细胞或免疫系统的其他细胞抑制TIL；负调节物对肿瘤微环境的影响。Muranski等人,NatClin Pract Oncol.12月；3(12):668-681(2006)。
因此，在一些实施方案中，所提供的方法还涉及向受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，所述方法涉及在施用细胞剂量之前向受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法含有化学治疗剂，如氟达拉滨和/或环磷酰胺。在一些实施方案中，细胞剂量和/或淋巴细胞清除疗法的施用经由门诊递送进行。
在一些实施方案中，所述方法包括在施用细胞剂量之前向受试者施用预调理剂，如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在第一或后续剂量之前至少2天如至少3、4、5、6或7天向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在施用细胞剂量之前不超过7天(如不超过6天、5天、4天、3天或2天)，向受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，将环磷酰胺每日施用一次，持续一天或两天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，向受试者施用剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与30mg/m2之间、或24mg/m2与26mg/m2之间的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用25mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每日施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或施用时间表(如上述那些)下的环磷酰胺以及任何剂量或施用时间表(如上述那些)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在施用细胞剂量之前，向受试者施用60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3个至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在输注细胞剂量之前施用预调理剂改善了治疗结局。例如，在一些方面，预调理改善了用剂量治疗的功效或者增加了重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞，如CAR表达T细胞)在受试者体内的持久性。在一些实施方案中，预调理治疗提高了无疾病存活率，如在细胞剂量后在一段给定的时间之后活着且没有展现出最少的残留或可分子检测的疾病的受试者的百分比。在一些实施方案中，增加了到中值无病存活率的时间。
在将所述细胞施用于受试者(例如人)后，在一些方面工程化细胞群体的生物活性通过许多已知方法中的任何一种来测量。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，所述工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。在一些方面，评估毒性结局、细胞的持久性和/或扩增和/或宿主免疫应答的存在或不存在。
在一些实施方案中，在输注细胞剂量之前施用预调理剂改进了治疗的结局(如通过改进用所述剂量治疗的功效)，或增加了重组受体表达细胞(例如，TCR或CAR表达细胞)在受试者中的持久性。因此，在一些实施方案中，在作为与DGK抑制剂和细胞疗法的组合疗法的方法中给予的预调理剂的剂量高于在不含DGK抑制剂的方法中给予的剂量。
II.T细胞疗法和工程化细胞
在一些实施方案中，用于根据所提供的组合疗法方法使用的T细胞疗法包括施用表达重组受体的工程化细胞，所述重组受体被设计用于识别和/或特异性结合与疾病或病症相关的分子并引起反应，如在与此类分子结合后针对此类分子的免疫应答。受体可以包括嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))和其他转基因抗原受体(包括转基因T细胞受体(TCR))。
在一些实施方案中，细胞含有或经工程化以含有工程化受体(例如工程化抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR))或T细胞受体(TCR)。还提供了此类细胞群体、含有此类细胞和/或富集此类细胞的组合物，如其中富集或选择某种类型的细胞如T细胞或CD8+或CD4+细胞。所述组合物包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供了用于向受试者(例如，患者)施用细胞和组合物的治疗方法。
因此，在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程化引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
A.重组受体
细胞通常表达重组受体如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体如转基因T细胞受体(TCR)。受体还包括其他嵌合受体。
1.嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，在提供的实施方案中采用的工程化细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记或配体)(例如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的CAR。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，其为碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区域，所述细胞内信号传导区域包括胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初级激活信号的胞质(细胞内)区域，例如，T细胞受体(TCR)组分的胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号传导部分的胞质信号传导结构域或区域)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在一些实施方案中，嵌合受体还含有特异性地结合至配体(例如抗原)抗原的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有特异性地结合至抗原的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。
在一些实施方案中，所述CAR是TCR样CAR，并且所述抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域经由接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或类似通过天然抗原受体(如TCR)的信号，并且任选地模拟或类似通过这种受体与共刺激受体的组合的信号。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括在例如国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、WO 2016/0046724、WO 2016/014789、WO 2016/090320、WO 2016/094304、WO 2017/025038、WO 2017/173256，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、8,479,118和9,765,342，以及欧洲专利申请号EP 2537416中所述的那些，和/或由Sadelain等人,Cancer Discov.,3(4):388-398(2013)；Davila等人,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,24(5):633-39(2012)；Wu等人,Cancer,18(2):160-75(2012)所述的那些，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。在一些方面，所述抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。CAR的例子包括如任何前述出版物中所披露的CAR，这些前述出版物如WO 2014031687；US 8,339,645；US 7,446,179；US2013/0149337；美国专利号7,446,190；美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人,J.Immunother.35(9):689-701(2012)；和Brentjens等人,Sci Transl Med.5(177)(2013)，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。所述嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原如在待由过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/或旨在诱导衰减反应的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或者一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)、或单结构域抗体(sdAb)(如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR)。在一些实施方案中，抗原结合片段包括通过柔性接头接合的抗体可变区。
在CAR中包括的抗原结合结构域包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
在某些实施方案中，多特异性结合分子(例如多特异性嵌合受体，如多特异性CAR)可以含有任何多特异性抗体，包括例如双特异性抗体、多特异性单链抗体，例如双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv和串联三-scFv。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的全部或部分重链可变区或者全部或部分轻链可变区的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)接合的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是单链抗体片段，例如单链可变片段(scFv)或双抗体或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是仅包含VH区的单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的scFv。
在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，其为碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在某些实施方案中，抗原或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞激活因子受体(BAFF-R)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、δ样配体3(DLL3)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达抗原、或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
用于根据本文提供的方法使用的示例性CAR T细胞疗法是本领域中已知的。适合于根据本文所提供的方法使用的CAR T细胞疗法包括以下文献中所述的任一种：Marofi等人,Stem Cell Res Ther 12:81(2021)；Townsend等人,J Exp Clin Cancer Res 37:163(2018)；Ma等人,Int J Biol Sci 15(12):2548-2560(2019)；Zhao和Cao,Front Immunol10:2250(2019)；以及Han等人,J Cancer 12(2):326-334(2021)，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
靶向EGFR的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03179007、NCT01869166、NCT02331693、NCT03182816、NCT03152435和NCT03525782中研究或正在研究的那些。靶向CD70的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03125577和NCT028307242中研究或正在研究的那些。靶向CD138的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT01886976和NCT03672318中研究或正在研究的那些。靶向CD38的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03464916、NCT03473496、NCT03473457、NCT03125577、NCT03222674和NCT032716322中研究或正在研究的那些。靶向CD123的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03473457、NCT03125577、NCT02937103、NCT03114670、NCT02159495、NCT03098355、NCT03222674、NCT03203369和NCT03190278中研究或正在研究的那些。靶向CD133的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03473457、NCT03356782、NCT02541370和NCT03423992中研究或正在研究的那些。靶向GPC3的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02905188、NCT02932956、NCT02715362、NCT03130712、NCT02395250、NCT02876978、NCT03198546、NCT02723942、NCT03084380、NCT03302403、NCT03146234和NCT02959151中研究或正在研究的那些。靶向CD5的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03081910中研究或正在研究的那些。靶向ROR1的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02706392中研究或正在研究的那些。靶向HerinCAR-PD1的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02873390和NCT02862028中研究或正在研究的那些。靶向HER2的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03500991、NCT03423992、NCT02713984、NCT01935843、NCT03267173、NCT02792114、NCT02442297、NCT00889954、NCT03423992、NCT01109095、NCT02706392、NCT00902044、NCT03389230、NCT02713984、NCT02547961和NCT01818323中研究或正在研究的那些。靶向EGFR806的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03179012中研究或正在研究的那些。靶向NY-ESO-1的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03029273中研究或正在研究的那些。靶向间皮素的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02930993、NCT03182803、NCT03030001、NCT02706782、NCT01583686、NCT03356795、NCT03054298、NCT03267173、NCT02792114、NCT02959151、NCT02580747、NCT02414269、NCT02465983、NCT03182803和NCT03323944中研究或正在研究的那些。靶向PSCA的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03198052、NCT02744287和NCT03267173中研究或正在研究的那些。靶向MG7的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02862704中研究或正在研究的那些。靶向MUC1的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03179007、NCT02587689、NCT02617134、NCT03198052、NCT03356795、NCT03267173、NCT03222674和NCT03356782中研究或正在研究的那些。靶向密封蛋白18.2的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03874897和NCT03159819中研究或正在研究的那些。靶向EpCAM的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02915445、NCT03013712、NCT02729493、NCT02725125、NCT02728882和NCT02735291中研究或正在研究的那些。靶向GD2的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT04099797、NCT03423992、NCT03356795、NCT02992210、NCT01953900、NCT02761915、NCT03373097、NCT02765243、NCT03423992、NCT03294954、NCT03356782和NCT02919046中研究或正在研究的那些。靶向VEGFR2的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT01218867中研究或正在研究的那些。靶向AFP的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03349255中研究或正在研究的那些。靶向连接蛋白4/FAP的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03932565中研究或正在研究的那些。靶向FAP的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT01722149中研究或正在研究的那些。靶向CEA的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02850536、NCT02349724、NCT03267173、NCT02959151和NCT01212887中研究或正在研究的那些。靶向Lewis Y的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03851146中研究或正在研究的那些。靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02932956中研究或正在研究的那些。靶向EGFRIII的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT01454596中研究或正在研究的那些。靶向IL-13Rα2的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02208362中研究或正在研究的那些。靶向CD171的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02311621中研究或正在研究的那些。靶向MUC16的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02311621中研究或正在研究的那些。靶向PSMA的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03356795、NCT03089203、NCT03185468和NCT01140373中研究或正在研究的那些。靶向AFP的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03349255中研究或正在研究的那些。靶向AXL的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03393936中研究或正在研究的那些。靶向CD20的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03893019和NCT04169932中研究或正在研究的那些。靶向CD80/86的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03198052中研究或正在研究的那些。靶向CD30的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03383965、NCT04134325和NCT04008394中研究或正在研究的那些。靶向c-MET的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03060356和NCT03638206中研究或正在研究的那些。靶向DLL-3的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03392064中研究或正在研究的那些。靶向DR5的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03638206中研究或正在研究的那些。靶向EpHA2的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02575261和NCT03423992中研究或正在研究的那些。靶向FR-α的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT00019136中研究或正在研究的那些。靶向gp100的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03649529中研究或正在研究的那些。靶向IL13Ra2的示例性CART细胞疗法包括在临床试验NCT02208362中研究或正在研究的那些。靶向MAGE-A1/3/4的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03356808和NCT03535246中研究或正在研究的那些。靶向LMP1的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02980315中研究或正在研究的那些。靶向EGFRVIII的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03283631、NCT02844062和NCT03170141中研究或正在研究的那些。靶向PD-L1 CSR的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02937844中研究或正在研究的那些。靶向CD19的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT02644655、NCT03744676、NCT01087294、NCT03366350、NCT03790891、NCT03497533、NCT04007029、NCT03960840、NCT04049383、NCT04094766、NCT03366324、NCT02546739、NCT03448393、NCT03467256、NCT03488160、NCT04012879、NCT03016377、NCT03468153、NCT03483688、NCT03398967、NCT03229876、NCT03455972、NCT03423706、NCT03497533和NCT04002401中研究或正在研究的那些，包括FDA批准产品(利基迈仑赛)、TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)、KYMRIAHTM(替沙仑赛)和YESCARTATM(阿基仑赛)。靶向BCMA的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03448978、NCT04182581、NCT03271632、NCT03473496、NCT03430011、NCT03455972、NCT02954445、NCT03322735、NCT03338972、NCT03318861、NCT02215967、NCT03093168、NCT03274219、NCT03302403、NCT03492268、NCT03288493、NCT03070327、NCT03196414、NCT03448978、NCT02958410、NCT03287804、NCT03473496、NCT03380039、NCT03430011、NCT03361748、NCT03455972、NCT02546167、NCT03271632和NCT03548207中研究或正在研究的那些(CARVYKTITM(西达基奥仑赛))。靶向BCMA的示例性CAR T细胞疗法还包括FDA批准产品/>(艾基维仑赛)和CARVYKTITM(西达基奥仑赛)。靶向CD33的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03473457、NCT02958397、NCT03126864和NCT03222674中研究或正在研究的那些。靶向GAP的示例性CART细胞疗法包括在临床试验NCT02932956中研究或正在研究的那些。靶向Zeushield的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03060343中研究或正在研究的那些。靶向DLL3的示例性CAR T细胞疗法包括在临床试验NCT03392064中研究或正在研究的那些。
在一些实施方案中，CAR是对BCMA(例如人BCMA)具有特异性的抗BCMACAR。先前已经描述了含有抗BCMA抗体(包括小鼠抗人BCMA抗体和人抗人BCMA抗体)的嵌合抗原受体，以及表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060、US 9,765,342、WO 2016/090320、WO 2016090327、WO 2010104949A2、WO 2016/0046724、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2017/025038和WO 2017173256，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，抗BCMA CAR的抗原结合结构域是单链抗体片段，如单链可变片段(scFv)或双抗体或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是仅包含VH区的单结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域是SEQ ID NO:113中所示的仅包含VH区的单结构域抗体。
在一些实施方案中，抗BCMA CAR含有抗原结合结构域(如scFv)，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016/090320或WO 2016090327中所述的抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，抗原结合结构域是含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在一些方面，VH区是或包括与SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40、42、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、181、183、185和187中任一个所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或VL区是或包括与SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、182、184、186和188中任一个所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗BCMACAR的抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:30中所示的VH和SEQ ID NO:31中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:32中所示的VH和SEQ ID NO:33中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:34中所示的VH和SEQ ID NO:35中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:36中所示的VH和SEQ ID NO:37中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:38所示的VH和SEQ ID NO:39所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:40中所示的VH和SEQ IDNO:41中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:42中所示的VH和SEQ ID NO:43中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ IDNO:77中所示的VH和SEQ ID NO:78中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:79中所示的VH和SEQ ID NO:80中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:81中所示的VH和SEQ ID NO:82中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:83中所示的VH和SEQ ID NO:84中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:85中所示的VH和SEQ IDNO:86中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:87中所示的VH和SEQ ID NO:88中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ IDNO:89中所示的VH和SEQ ID NO:90中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:91中所示的VH和SEQ ID NO:92中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:93中所示的VH和SEQ ID NO:94中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:95中所示的VH和SEQ ID NO:96中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:97中所示的VH和SEQ IDNO:98中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:99中所示的VH和SEQ ID NO:100中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQID NO:101中所示的VH和SEQ ID NO:102中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:103中所示的VH和SEQ ID NO:104中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:105中所示的VH和SEQ ID NO:106中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:107中所示的VH和SEQ ID NO:106中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:30中所示的VH和SEQ ID NO:108中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ IDNO:109中所示的VH和SEQ ID NO:110中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:111中所示的VH和SEQ ID NO:112中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:181中所示的VH和SEQ ID NO:182中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:183中所示的VH和SEQ ID NO:184中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:185中所示的VH和SEQ ID NO:186中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ IDNO:187中所示的VH和SEQ ID NO:188中所示的VL。在一些实施方案中，VH或VL具有展现出与任何前述VH或VL序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且保留与BCMA结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH区位于VL区的氨基末端。在一些实施方案中，VH区位于VL区的羧基末端。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头示于SEQ ID NO:70、72、73、74或189中。
在一些实施方案中，抗BCMACAR是如SEQ ID NO:126-177中所示的任一种。
在一些实施方案中，抗BCMACAR含有抗BCMA抗体CD115D.3的VH和VL。在一些实施方案中，抗BCMACAR含有SEQ ID NO:30中所示的VH和SEQ ID NO:31中所示的VL。在一些实施方案中，抗BCMACAR包含含有SEQ ID NO:249中所示的序列的scFv。在一些实施方案中，抗BCMACAR含有SEQ ID NO:152中所示的序列(参见WO 2016/094304)。在一些实施方案中，抗BCMACAR是ABECMA(艾基维仑赛(ide-cel))的抗BCMACAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是ABECMA(艾基维仑赛(ide-cel))。在一些实施方案中，
在一些实施方案中，抗BCMACAR含有抗BCMA单结构域抗体。在一些实施方案中，抗BCMACAR含有两个抗BCMA单结构域抗体。在一些实施方案中，抗BCMA CAR是Carvykti(西达基奥仑赛(cilta-cel))的抗BCMACAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是Carvykti(西达基奥仑赛(cilta-cel))。
在一些实施方案中，抗BCMACAR含有SEQ ID NO:36中所示的VH和SEQ ID NO:37中所示的VL。在一些实施方案中，抗BCMACAR包含含有SEQ ID NO:250中所示的序列的scFv。在一些实施方案中，抗BCMACAR含有SEQ ID NO:160中所示的序列。
在一些实施方案中，CAR是对CD19(例如人CD19)具有特异性的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性地识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自特异性地结合CD19的抗体或抗原结合片段，或者是特异性地结合CD19的抗体或抗原结合片段的变体。
在一些实施方案中，抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，示例性抗体或抗体片段包括在美国专利公开号WO 2014/031687、US2016/0152723和WO 2016/033570中所述的那些，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括源自FMC63的VH和/或VL，其在一些方面可以是scFv。在一些实施方案中，scFv和/或VH结构域源自FMC63。FMC63通常是指针对表达人来源的CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。FMC63抗体包含SEQ ID NO:44、45分别所示的CDRH1和H2，以及SEQ ID NO:46、47或66所示的CDRH3、以及SEQ ID NO:48所示的CDRL1、以及SEQ ID NO:49、50或67所示的CDR L2、以及SEQ ID NO:51、52或68所示的CDR L3序列。FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:48的CDRL1序列、SEQ ID NO:49的CDRL2序列和SEQ ID NO:51的CDRL3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:44的CDRH1序列、SEQ ID NO:45的CDRH2序列和SEQ ID NO:46的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53中所示的FMC63可变重链区和SEQ ID NO:54中所示的FMC63可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头示于SEQ ID NO:70、72、73、74或189中。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:69至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:55至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗CD19 CAR是(利基迈仑赛)的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是/>(利基迈仑赛)。
在一些实施方案中，抗CD19 CAR的抗原结合结构域包括源自SJ25C1的VH和/或VL，其在一些方面可以是scFv。SJ25C1是针对表达人来源的CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。SJ25C1抗体包含SEQ ID NO:59-61分别所示的CDRH1、H2和H3，以及SEQ ID NO:56-58分别所示的CDRL1、L2和L3序列。SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ IDNO:56的CDRL1序列、SEQ ID NO:57的CDRL2序列和SEQ ID NO:58的CDRL3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:59的CDRH1序列、SEQ ID NO:60的CDRH2序列和SEQ ID NO:61的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:62中所示的SJ25C1可变重链区和SEQ ID NO:63中所示的SJ25C1可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:64所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:65至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗CD19 CAR是TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)的抗CD19CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)。
在一些实施方案中，抗CD19 CAR是KYMRIAHTM(替沙仑赛)的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是KYMRIAHTM(替沙仑赛)。
在一些实施方案中，抗CD19 CAR是YESCARTATM(阿基仑赛)的抗CD19CAR。在一些实施方案中，T细胞疗法是YESCARTATM(阿基仑赛)。
在一些实施方案中，抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD20的抗体或抗体片段是作为或源自利妥昔单抗的抗体，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD22的抗体或抗体片段是作为或源自m971的抗体，如是m971 scFv。
在一些实施方案中，抗原是ROR1。在一些实施方案中，scFv含有源自对ROR1具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合ROR1的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2014/031687、WO 2016/115559和WO 2020/160050所示的抗体或抗体片段的VH和VL，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，抗原是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329、WO 2016/090312和WO 2020/092854所示的抗体或抗体片段的VH和VL，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，抗原是FcRL5。在一些实施方案中，scFv含有源自对FcRL5具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合FcRL5的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090337和WO 2017/096120所示的抗体或抗体片段的VH和VL，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，抗原是间皮素。在一些实施方案中，scFv含有源自对间皮素具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合间皮素的抗体或抗体片段是或含有来自US2018/0230429所示的抗体或抗体片段的VH和VL，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段(如scFv)，其包括接合两个抗体结构域或区域(如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区)的一个或多个接头。因此，抗体包括单链抗体片段，如scFv和双抗体，特别是人单链抗体片段，所述抗体通常包含接合两个抗体结构域或区域(如VH和VL区)的一个或多个接头。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，例如富含甘氨酸和丝氨酸的一种肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些接头。在一些实施方案中，所述接头还包括带电荷的残基，如赖氨酸和/或谷氨酸，它们可以改进溶解性。在一些实施方案中，所述接头还包括一个或多个脯氨酸。
在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一种或多种此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，所述接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸构成。所述接头的长度通常在约5个与约50个氨基酸之间，通常在为或约10个与为或约30个之间，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，并且在一些例子中长度在10个与25个氨基酸之间。示例性接头包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:19)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:71)的重复的接头，例如在这样的序列的2个、3个、4个和5个重复之间。示例性接头包括具有SEQ ID NO:72(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:189(ASGGGGSGGRASGGGGS)、SEQ ID NO:73(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或SEQ ID NO:74(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)中所示的序列或由其组成的那些。
在一些实施方案中，重组受体(如CAR)，例如重组受体(例如CAR)的抗体部分还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，例如铰链区(例如，IgG4铰链区、IgG1铰链区)、CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。
示例性间隔子(例如，铰链区)包括国际专利申请公开号WO 2014031687中所述的那些。在一些例子中，间隔子的长度为或为约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有以下的那些：至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，间隔子是具有至少特定长度的间隔子，例如具有至少100个氨基酸的长度，例如至少110个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个或250个氨基酸的长度。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人Cancer Res.,19:3153(2013)；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125-135；国际专利申请公开号WO2014031687；美国专利号8,822,647或公开申请号US2014/0271635。在一些实施方案中，间隔子包括免疫球蛋白铰链区、CH2区和CH3区的序列。在一些实施方案中，铰链、CH2和CH3中的一个或多个全部或部分源自IgG4或IgG2。在一些情况下，所述铰链、CH2和CH3源自IgG4。在一些方面，所述铰链、CH2和CH3中的一个或多个是嵌合的并且含有源自IgG4和IgG2的序列。在一些例子中，间隔子含有IgG4/2嵌合铰链、IgG2/4CH2区、和IgG4 CH3区。
在一些实施方案中，可以是免疫球蛋白的恒定区或其一部分的间隔子是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些实施方案中，间隔子具有序列ESKYGPPCPPCP(在SEQ ID NO:1中列出)。在一些实施方案中，间隔子具有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:3所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ IDNO:4所示的序列。在一些实施方案中，编码的间隔子是或含有SEQ IDNO:29中所示的序列。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的恒定区或部分。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:125所示的序列。
在一些实施方案中，间隔子可以全部或部分源自IgG4和/或IgG2，并且可以含有突变，例如在一个或多个结构域中的一个或多个单氨基酸突变。在一些例子中，氨基酸修饰是在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在一些实施方案中，氨基酸修饰是减少糖基化异质性的谷氨酰胺(Q)对天冬酰胺(N)的取代，例如全长IgG4Fc序列CH2区中位置177处的N177Q突变、或在全长IgG4 Fc序列CH2区中位置176处的N176Q。
其他示例性间隔子区包括源自CD8a、CD28、CTLA4、PD-1或FcγRIIIa的铰链区。在一些实施方案中，间隔子含有CD8a、CD28、CTLA4、PD-1或FcγRIIIa的截短的细胞外结构域或铰链区。在一些实施方案中，间隔子是截短的CD28铰链区。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有丙氨酸或者丙氨酸和精氨酸的接头，例如丙氨酸三联体(AAA)或RAAA(SEQ ID NO:180))是存在的并形成在scFv与CAR的间隔子区之间的连接。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:114所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:116所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQID NO:117-119中任一个所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:120所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:122所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:124所示的序列。
在一些实施方案中，间隔子具有展现出与SEQ ID NO:1、3、4、5或29、114、116、117、118、119、120、122、124或125中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
这个抗原识别结构域通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)进行刺激和/或激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然地与受体(例如CAR)中的结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下项的那些跨膜区(即，包含以下项的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD8a，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD154，CTLA-4或PD-1。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域实现的。跨膜结构域的示例性序列是或包含SEQ IDNO:8、115、121、123、178或179所示的序列。
细胞内信号传导结构域包括模拟或接近以下的那些：通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体的组合的信号、和/或仅通过共刺激受体的信号。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，例如介导T细胞刺激和/或激活和细胞毒性的TCRCD3链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种其他分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域刺激和/或激活免疫细胞(例如，被工程化以表达CAR的T细胞)的至少一种正常效应子功能或反应。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞裂解活性或T辅助细胞活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然情况下与此类受体协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞刺激和/或激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级刺激和/或激活的那些序列(初级胞质信号传导区域、结构域或序列)以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导区域、结构域或序列)。在一些方面，CAR包括这样的信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，所述CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导区域、结构域或序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导区域、结构域或序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自以下的那些：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施方案中，所述CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导区域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括初级胞质信号传导区域和共刺激信号传导组分。
在一些实施方案中，一种或多种不同的重组受体可以含有一个或多个不同的细胞内信号传导区域或结构域。在一些实施方案中，初级胞质信号传导区域被包括于一个CAR内，而共刺激组分由另一种受体(例如，识别另一种抗原的另一种CAR)提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
在一些方面，所述细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013))，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症所特有的抗原以外的抗原的CAR，由此通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在胞质部分中包含一个或多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和初级胞质信号传导区域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS的细胞内组分，如一个或多个细胞内信号传导区或结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导区域或结构域，例如来自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS，在一些情况下，在跨膜结构域与细胞内信号传导区域或结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS中的一种或多种。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体如CD28或CD137的细胞内信号传导结构域的信号；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜结构域通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述受体含有衍生出跨膜结构域的分子的细胞外部分，如CD28细胞外部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有源自T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其功能变体，如位于跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
例如，在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体还包括间隔子，其含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分，如Ig铰链，例如IgG4铰链，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人CD28(例如，登录号P10747.1)或CD8a(登录号P01732.1)的跨膜结构域或其变体，如包含SEQ ID NO:8、115、178或179所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8、115、178或179至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的一种或多种细胞内信号传导组分含有人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如在天然CD28蛋白的位置186-187具有LL至GG取代的结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:10或11中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:10或11至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB(例如，登录号Q07011.1)的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:12至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ的亚型3(登录号P20963.2)的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含如SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:13、14或15至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:125中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是或含有任选地连接至CH2和/或CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4源铰链。在一些实施方案中，间隔子是连接至CH2和CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4中所示。在一些实施方案中，间隔子是仅连接至CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，间隔子是CD8a铰链，如SEQ ID NO:117-119中任一个所示；FcγRIIIa铰链，如SEQ ID NO:124中所示；CTLA4铰链，如SEQ ID NO:120中所示；或PD-1铰链，如SEQ ID NO:122中所示。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28衍生的跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、CD28衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ衍生的信号传导结构域。
由施用至受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性结合至在所治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或为所治疗的疾病或病症或其细胞所特有的分子。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，所述细胞表达与抗原特异性地结合的CAR，所述抗原由所述疾病或病症的细胞或组织表达或与所述疾病或病症相关。非限制性示例性CAR序列示于SEQ IDNO:126-177中。
在一些实施方案中，编码的CAR序列可以还包括将CAR引导或递送至表达CAR的细胞表面的信号序列或信号肽。在一些实施方案中，信号肽源自跨膜蛋白。在一些例子中，信号肽源自CD8a、CD33或IgG。示例性信号肽包括SEQ ID NO:21、75和76中所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，CAR包括抗CD19抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如任何含有Ig铰链的间隔子或本文所述的其他间隔子)、含有CD28源跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、CD28源细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗CD19抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子或本文所述的其他间隔子)、CD28源跨膜结构域、4-1BB源细胞内信号传导结构域和CD3ζ源信号传导结构域。在一些实施方案中，此类CAR构建体还包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。
在一些实施方案中，CAR包括抗BCMA抗体或片段(如本文所述的任何抗人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子或本文所述的其他间隔子)、CD28跨膜结构域、CD28细胞内信号传导结构域、和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗BCMA抗体或片段(如本文所述的任何抗人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子或本文所述的其他间隔子)、CD28跨膜结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域、和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，此类CAR构建体还包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，CAR包括抗BCMA抗体或片段(如本文所述的任何抗人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、来自CD8α的铰链区和跨膜结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
2.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR结合(例如特异性地结合)或识别自身抗体。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(例如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗性干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，如美国专利申请公开US2017/0051035中所述的任一种。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为细胞质信号传导结构域或区域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导区域、能够在T细胞中刺激和/或诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的细胞内信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，自身抗原的选择可能是由于其识别与特定疾病状态(例如，自身免疫性疾病，如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒黏蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
3.TCR
在一些实施方案中，提供工程化的细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。在一些方面，TCR是或包括重组TCR。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且其能够与结合至MHC分子的肽特异性结合。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合体(MHC)分子的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是小于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，它们通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上的三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的加工肽部分相互作用而言最为重要。在一些情况下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情况下，β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情况下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或其识别贡献最大或者是主要负责的CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical MicrobiologyReviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune Systemin Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有两个与细胞膜相邻的免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常基于Kabat编号为氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”,USDept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常基于Kabat编号为链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat为链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子如CD3及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，所述链如通过一个或多个二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，重组受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如，肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞，如来自T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以从TCR序列的知识合成地产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，TCR文库可以从CD4+或CD8+细胞产生。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源(即，正常TCR文库)扩增。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源(即，患病TCR文库)扩增。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克隆或组装以由接头隔开。取决于受试者和细胞的来源，文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，如通过例如α或β链的诱变，使TCR经历定向进化。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对肽的CTL活性。在一些方面，例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR可以通过如结合活性来选择，例如对抗原的特定亲和力或亲合力。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如具有更高的对特定MHC-肽复合物的亲和力)的TCR。在一些实施方案中，定向进化是通过展示方法来实现，包括但不限于酵母展示(Holler等人,(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人,(2000)Proc Natl Acad Sci U SA,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人,(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人,(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
根据本文提供的方法用于所述用途的示例性TCR T细胞疗法是本领域中已知的。适合于根据本文提供的方法使用的TCR T细胞疗法包括描述于以下文献中的任一种：Zhao和Cao,Front Immunol 10:2250(2019)；Ping等人,Protein Cell 9(3):254-266(2018)；以及Zhang和Wang,Technol Cancer Res Treat 18:1533033819831068(2019)，将每个文献的内容通过引用以其整体并入。
靶向PRAME的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03503968和NCT02743611中研究或正在研究的那些。靶向MAGE-A3/A6的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03139370中研究或正在研究的那些。靶向CEA的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT00923806中研究或正在研究的那些。靶向MAGE-A3/12的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT01273181中研究或正在研究的那些。靶向MAGE-A10的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT02592577、NCT03391791和NCT02989064中研究或正在研究的那些。靶向NY-ESO-1的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT01343043、NCT03029273、NCT03462316、NCT01892293、NCT01352286、NCT01567891、NCT01350401、NCT02588612、NCT03691376和NCT03168438中研究或正在研究的那些。靶向AFP的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03132792中研究或正在研究的那些。靶向HA-1的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03326921中研究或正在研究的那些。靶向WT1的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT02550535和NCT02770820中研究或正在研究的那些。靶向Gp100的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT00923195和NCT02889861中研究或正在研究的那些。靶向CMV的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT02988258中研究或正在研究的那些。靶向MART-1的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT00091104中研究或正在研究的那些。靶向HBV的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT02719782中研究或正在研究的那些。靶向P53的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT00393029中研究或正在研究的那些。靶向HPV-16E6的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03578406和NCT02280811中研究或正在研究的那些。靶向HPV-16E7的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT02858310中研究或正在研究的那些。靶向SL9的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT00991224中研究或正在研究的那些。靶向TGFβII的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03431311中研究或正在研究的那些。靶向MCPyV的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03747484中研究或正在研究的那些。靶向TRAIL的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT00923390中研究或正在研究的那些。靶向EBV的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03648697中研究或正在研究的那些。靶向KRAS的示例性TCR T细胞疗法包括在临床试验NCT03190941和NCT03745326中研究或正在研究的那些。
在一些实施方案中，用于生产或产生目标TCR的靶多肽的肽是已知的或可以按常规容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于在产生TCR或抗原结合部分中使用的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，按常规使用计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类结合模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人,(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的蛋白酶体和免疫蛋白酶体的HLA-A0201结合基序和切割位点是已知的。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001中)和SYFPEITHI(参见Schuler等人,SYFPEITHI,Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.in Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变。在一些实施方案中，TCR可以源自各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞的表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，TCR在细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，scTCR可以使用合适的已知方法来产生，参见例如，Soo Hoo,W.F.等人,PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人,PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人,J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中融合至其C末端的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有TCRα可变结构域，其通过肽接头共价连接至TCRβ可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段、由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段以及将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成的第一区段和由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成的第二区段以及任选地将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成的第一区段和由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成的第二区段以及任选地将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从或从约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:17)
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，所述共价二硫键将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。
在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一残基，如取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些方面，TCR或其抗原结合片段与源自HPV16 E6蛋白、HPV16 E7蛋白的肽表位和/或在被HPV感染的细胞上表达的肽表位结合。在一些实施方案中，在MHC分子的情况下，TCR或其抗原结合片段结合或识别HPV 16E6或E7的肽表位。HPV是在大部分情况下的宫颈癌的致病生物，并且已经牵涉于肛门癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌和口咽癌以及其他癌症。通常，HPV基因组包含含有六个开放阅读框(E1、E2、E4、E5、E6和E7)的早期区域，所述开放阅读框编码参与细胞转化和复制的蛋白质；以及含有两个开放阅读框(L1和L2)的晚期区域，所述开放阅读框编码病毒衣壳的蛋白质。通常，E6和E7是可影响细胞周期调节并有助于癌症形成的致癌基因。例如，E6基因产物可以引起p53降解，并且E7基因产物以引起成视网膜母细胞瘤(Rb)失活。
在一些方面，在MHC分子(如MHC I类分子)的情况下，TCR或其抗原结合片段识别或结合HPV 16E6或E7表位。在一些方面，MHC I类分子是人白细胞抗原(HLA)-A2分子，包括其任何一种或多种亚型，例如HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206或*0207。在一些情况下，不同群体之间亚型的频率可能不同。例如，在一些实施方案中，超过95％的HLA-A2阳性高加索人群体是HLA-A*0201，而据报道在中国人群体中所述频率是大约23％HLA-A*0201、45％HLA-A*0207、8％HLA-A*0206和23％HLA-A*0203。在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A*0201。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段识别或结合至HPV16 E6或HPV 16E7的表位或区域，如含有SEQ ID NO:192-199中任一个所示的氨基酸序列且如表1所示的肽表位。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对HPV 16E7蛋白或HPV 16E7蛋白的一部分具有抗原特异性。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段识别或结合至源自HPV 16E7的作为或包含E7(11-19)YMLDLQPET(SEQ ID NO:196)的肽表位。
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在一些实施方案中，识别或结合至HPV 16表位的TCR或其抗原结合片段包括如以下文献中所述的任一种；US20190062398A1；US20190225692A1；US20190321401A1；和WO2019070541A1，将每个参考文献的内容通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段包括以下文献中发现的识别或结合至HPV 16E7蛋白或HPV 16E7蛋白的一部分的TCR序列(例如，α和β链的组合)：US20190062398A1；US 20190225692A1；US20190321401A1；和WO 2019070541A1。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段包括以下文献中发现的识别或结合至HPV 16E7(11-19)的TCR序列(例如，α和β链的组合)：US20190062398A1；US20190225692A1；US20190321401A1；和WO 2019070541A1。
在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有具有如SEQ IDNO:202中所示的可变α(Vα)链中所含CDR1、CDR2和CDR3的Vα链，所述β链含有具有如SEQ IDNO:208中所示的可变β(Vβ)链中所含CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链，所述α链含有具有分别在SEQ ID NO:203、204和205中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vα链和具有分别在SEQ ID NO:209、210和211中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有SEQ ID NO:202中所示的Vα链，所述β链含有SEQ ID NO:208中所示的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含SEQ ID NO:201中所示的α链和SEQ ID NO:207中所示的β链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体含有由SEQ ID NO:200中所示的核苷酸序列编码的α链和由SEQ ID NO:206中所示的核苷酸序列编码的β链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体由SEQ ID NO:212中所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有具有如SEQ IDNO:215中所示的可变α(Vα)链中所含具有CDR1、CDR2和CDR3的Vα链，所述β链含有具有如SEQID NO:218中所示的可变β(Vβ)链中所含具有CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链，所述α链含有具有分别在SEQ ID NO:219、220和221中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vα链和具有分别在SEQ ID NO:222、223和224中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有SEQ ID NO:215中所示的Vα链，所述β链含有SEQ ID NO:218中所示的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含SEQ ID NO:214中所示的α链和SEQ ID NO:217中所示的β链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体含有由SEQ ID NO:213中所示的核苷酸序列编码的α链和由SEQ IDNO:216中所示的核苷酸序列编码的β链。
在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有具有如SEQ IDNO:227中所示的可变α(Vα)链中所含CDR1、CDR2和CDR3的Vα链，所述β链含有具有如SEQ IDNO:230中所示的可变β(Vβ)链中所含CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链，所述α链含有具有分别在SEQ ID NO:231、232和233中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vα链和具有分别在SEQ ID NO:234、235和236中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有SEQ ID NO:227中所示的Vα链，所述β链含有SEQ ID NO:230中所示的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含SEQ ID NO:226中所示的α链和SEQ ID NO:229中所示的β链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体含有由SEQ ID NO:225中所示的核苷酸序列编码的α链和由SEQ ID NO:228中所示的核苷酸序列编码的β链。
在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有具有如SEQ IDNO:239中所示的可变α(Vα)链中所含CDR1、CDR2和CDR3的Vα链，所述β链含有具有如SEQ IDNO:242中所示的可变β(Vβ)链中所含CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链，所述α链含有具有分别在SEQ ID NO:243、244和245中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vα链和具有分别在SEQ ID NO:246、247和248中所示的CDR1、CDR2和CDR3的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含α链和β链，所述α链含有SEQ ID NO:239中所示的Vα链，所述β链含有SEQ ID NO:242中所示的Vβ链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体包含SEQ ID NO:238中所示的α链和SEQ ID NO:241中所示的β链。在一些实施方案中，TCR或其功能变体含有由SEQ ID NO:237中所示的核苷酸序列编码的α链和由SEQ ID NO:240中所示的核苷酸序列编码的β链。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方式扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备所述重组表达载体。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其与编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子以及在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，为了生成编码TCR的载体，将α和β链从自表达目的TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
4.多靶向
在一些实施方案中，细胞和方法包括多靶向策略，如在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种受体识别相同或不同的抗原，并且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：PCT公开号WO 2014055668 A1(描述了激活和共刺激CAR的组合，例如靶向两种不同的抗原，所述抗原在脱靶(例如，正常细胞)上单独存在，但是在待治疗的疾病或病症的细胞上仅一起存在)和Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013)(描述了表达激活和抑制性CAR的细胞，例如其中激活CAR结合同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病或病症的细胞上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些细胞)。
例如，在一些实施方案中，细胞包括表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，所述受体通常在特异性结合第一受体所识别的抗原(例如，第一抗原)后，能够将激活信号诱导至细胞。在一些实施方案中，细胞还包括第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受体，所述受体通常在特异性结合第二受体所识别的第二抗原后，能够将共刺激信号诱导至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)能够将激活信号诱导至细胞。在一些实施方案中，受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导或细胞中蛋白质表达的变化，导致启动免疫应答(例如ITAM磷酸化)和/或启动ITAM介导的信号转导级联、形成免疫突触和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、激活一种或多种转录因子(例如NF-κB和/或AP-1)和/或诱导因子(例如细胞因子)的基因表达、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体(如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一和第二受体包括不同共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域两者。
在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱导的激活信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答例如为稳健且持续的免疫应答，例如增加的基因表达，细胞因子和其他因子的分泌，以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，单独的第一受体的连接和单独的第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫反应。在一些方面，如果仅连接一个受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无反应，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接多种受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现所需反应，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或执行免疫效应子功能(如靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示的。
在一些实施方案中，表达重组受体的细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013))，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症所特有的抗原以外的抗原的CAR，由此通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如，以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的结合激活细胞或诱导反应，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导了抑制或减弱该反应的信号。例子是激活性CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如，可以使用这种策略，其中激活性CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体与在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原结合。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共同刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这种抑制性分子的信号传导结构域或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，使得其用于减弱例如由激活和/或共刺激CAR诱导的细胞应答。
在一些实施方案中，多靶向策略用于以下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，通过需要连接两个分开的和单独特异性抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方案中，多种抗原(例如第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或疾病或病症上(例如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(如正常或未患病细胞或组织，和/或工程化细胞本身)上表达。在此类实施方案中，通过需要连接多个受体以实现细胞的反应，实现特异性和/或功效。
B.用于基因工程化的细胞和细胞的制备
表达受体并通过所提供的方法施用的细胞包括工程化细胞。基因工程通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸引入含有细胞的组合物中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化。
在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞及其子群体，如由以下各项所定义的那些子群体：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型和子群体包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达这样的核酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，所提供的细胞和/或含有此类细胞的组合物中的基因和/或基因产物(和/或其表达)被减少、缺失、消除、敲除或破坏。在一些方面，此类基因和/或基因产物包括编码TCRα(TRAC)和/或TCRβ(TRBC)的一个或多个基因(或其产物)，例如以减少或阻止内源TCR和/或其链在细胞(例如T细胞)中的表达。在一些实施方案中，细胞(例如T细胞)表达工程化TCR(例如，如章节II-A-3中所述的任一种)。在一些实施方案中，减少或阻止内源TCR表达可以导致工程化TCR与内源TCR的链之间的错配风险或机会降低，从而产生新的TCR，其可能潜在地导致不希望的或非计划中的抗原识别的风险更高和/或副作用，和/或可能降低所需外源TCR的表达水平。在一些方面，与不减少或阻止TCR表达的细胞相比，减少或阻止内源TCR表达可以增加工程化TCR在细胞中的表达，如增加1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。例如，在一些情况下，由于与内源TCR和/或与具有错配链的TCR竞争参与允许复合物在细胞表面上表达的恒定CD3信号传导分子，可能发生工程化或重组TCR的次优表达。在一些实施方案中，通过基因编辑，例如使用锌指核酸酶(ZFN)、TALEN或具有切割TCR基因的工程化单一指导RNA(gRNA)的CRISPR/Cas系统，进行减少、缺失、消除、敲除或破坏。在一些实施方案中，使用针对编码特定TCR(例如，TCR-α和TCR-β)的靶核酸的抑制性核酸分子来减少内源TCR的表达。在一些实施方案中，抑制性核酸是或含有或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应的shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、微小RNA(miRNA前体)或微小RNA(miRNA)。用于减少或防止内源性TCR表达的示例性方法是本领域已知的，参见例如美国专利号9,273,283；美国公开号US2011/0158957、US2014/0301990、US 2015/0098954、US2016/0208243、US2016/272999和US2015/056705；国际PCT公开号WO 2014/191128、WO 2015/136001、WO 2015/161276、WO 2016/069283、WO 2016/016341、WO 2017/193107、WO 2017/093969、WO 2019/070541和WO 2019/195492；以及Osborn等人(2016)Mol.Ther.24(3):570-581。
在本文提供的一些实施方案中，同源定向修复(HDR)可用于模板多核苷酸的特定部分在基因组中的特定位置(例如TRAC、TRBC1和/或TRBC2基因座)处的靶向整合，所述模板多核苷酸的特定部分包含转基因，例如编码任何所提供的重组受体例如重组T细胞受体(TCR)的核酸序列。在一些实施方案中，将包含编码重组T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段或链的核酸序列(例如转基因)的模板多核苷酸引入在T细胞受体α恒定区(TRAC)基因和/或T细胞受体β恒定区(TRBC)基因内的靶位点具有遗传破坏的细胞例如免疫细胞中。在一些实施方案中，将编码重组TCR或其抗原结合片段或链的核酸序列或转基因通过同源定向修复(HDR)靶向整合在靶位点处或附近。在特定实施方案中，在靶位点处或附近的整合是在TRAC和/或TRBC基因的编码序列的一部分内，如例如在靶位点下游或3'的编码序列的一部分内。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自其的处理的样品。
在一些方面，衍生出或分离细胞的样品是血液或源自血液的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、富集所需组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，细胞基于一种或多种特性来分离，所述特性如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或耐药性。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通式”离心机(例如，Cobe2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞中一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与特异性结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞分离。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离的情况下，阴性选择可能特别有用。
分离无需导致特定细胞群体或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要使不表达所述标记的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗竭是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要使所有此类细胞完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗竭表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时对多个细胞类型进行阳性选择。
例如，在一些方面，T细胞的特定子群体(如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞))是通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+ T细胞。
在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群体，或经由阴性选择耗竭特定细胞群体来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表面标记特异性结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞子群体上表达或以相对更高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成子群体。
在一些实施方案中，使CD8+细胞进一步富集或耗竭幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择来实现。在一些实施方案中，富集中枢记忆T(TCM)细胞以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类子群体中特别稳健。参见Terakura等人,Blood.1:72-82(2012)；Wang等人,J Immunother.35(9):689-701(2012)。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以使PBMC富集或耗竭CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分，如使用抗CD8和抗CD62L抗体来进行。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗竭和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面依序以任一顺序进行。在一些方面，将用于制备CD8+细胞群体或子群体的基于CD4表达的相同选择步骤也用于生成CD4+细胞群体或子群体，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分二者都被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性两种级分。然后阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群体，将CD4+ T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分离或分开细胞和细胞群体(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell Behavior In vitro and In vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群体上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday的美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen的美国专利号4,795,698和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他例子。
孵育通常在如下条件下进行，由此附着于磁性颗粒或珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与样品内细胞上的细胞表面分子(如果存在的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经历另外的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性颗粒经由对一种或多种标记具特异性的一抗的包衣附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，保持磁响应颗粒附着于细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，保持所述颗粒附着于所述细胞以向患者施用。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)进行的。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶细胞被标记并从异质细胞群体中耗竭。
在某些实施方案中，使用如下系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或制备步骤中的一个或多个。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如PCT公开号WO 2009/072003或US20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结局和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和多种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌无热原溶液中供应的、抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群体是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群体被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群体在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodig系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理单元，其允许自动洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培育室，其实现细胞培养方案例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人,JImmunother.35(9):651-660(2012)；Terakura等人,Blood.1:72-82(2012)；和Wang等人,JImmunother.35(9):689-701(2012)。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗竭)本文所述的细胞群体，其中流体流中携载针对多种细胞表面标记染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集并富集(或耗竭)本文所述的细胞群体。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片与基于FACS的检测系统的组合收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群体(参见例如，WO 2010/033140；Cho等人,Lab Chip 10,1567-1573(2010)；和Godin等人,J Biophoton.1(5):355-376(2008))。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标记来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化来孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或者用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重组抗原受体。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3抗体。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法可以进一步包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，孵育是根据多种技术，如以下中所述的那些技术来进行：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人,J Immunother.35(9):651-660(2012)；Terakura等人,Blood.1:72-82(2012)；和/或Wang等人,J Immunother.35(9):689-701(2012)。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单个核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，将PBMC用范围为约3000至3600拉德的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞添加到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐射LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，针对巨细胞病毒抗原来产生抗原特异性T细胞系或克隆。
C.用于基因工程的核酸、载体和方法
在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的核酸分子来进行工程化。还提供了编码重组受体的核酸分子，以及含有此类核酸和/或核酸分子的载体或构建体。
在一些情况下，编码重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽源自跨膜蛋白。在一些例子中，信号肽源自CD8a、CD33或IgG。信号肽的非限制性示例性例子包括例如，SEQ ID NO:21中所示的CD33信号肽、SEQ ID NO:75中所示的CD8a信号肽、或SEQ ID NO:76中所示的信号肽或其经修饰的变体。
在一些实施方案中，编码重组受体的核酸分子含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，核酸分子含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。在一些实施方案中，核酸分子可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入核酸分子的宿主(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述核酸分子是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，核酸分子可以含有调节/控制元件，如启动子、增强子、内含子、聚腺苷酸化信号、Kozak共有序列、以及剪接受体或供体。在一些实施方案中，核酸分子可以含有与编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的核苷酸序列可操作连接的非天然启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。在一些实施方案中，所述启动子由RNA聚合酶II识别(例如CMV、SV40早期区域或腺病毒主要晚期启动子)。在另一个实施方案中，启动子由RNA聚合酶III识别(例如U6或H1启动子)。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子以及在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，所述启动子是或包含组成型启动子。示例性组成型启动子包括例如猿病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施方案中，组成型启动子是合成或修饰的启动子。在一些实施方案中，启动子是或包含MND启动子，它是一种含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成启动子(参见Challita等人(1995)J.Virol.69(2):748-755)。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是病毒启动子。在另一个实施方案中，启动子是非病毒启动子。
在另一个实施方案中，启动子是受调节的启动子(例如诱导型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子或阻抑型启动子。在一些实施方案中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或者是其类似物或能够由Lac阻遏因子或四环素阻遏因子或其类似物结合或识别。在一些实施方案中，核酸分子不包括调节元件，例如启动子。
在一些实施方案中，编码重组受体(例如CAR或其他抗原受体)的核酸分子还包括编码标记的核酸序列和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括标记(例如替代标记，如细胞表面标记)，所述标记可以用于确认使细胞表达受体(如细胞表面受体的截短形式，如截短的EGFR(tEGFR))的转导或工程化。在一些实施方案中，一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可以用于检测已经引入了核酸分子(例如编码重组受体的核酸分子)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在某些实施方案中，替代标记是由编码重组受体的同一核酸分子编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽(如2A序列，如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短形式，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:7或28中列出的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗()或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374；和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如替代标记)包括CD34的全部或部分(例如，截短形式)、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式的)CD34、NGFR、或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO 2014031687中披露的任一种。例如，所述标记可以是截短EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或28所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或28至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:6至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子例如在编码CAR的序列的下游还包括编码T2A核糖体跳跃元件的序列和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:6中所示的T2A核糖体跳跃元件或展现出与SEQ ID NO:6至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，还可以产生表达抗原受体(例如，CAR)的T细胞以表达截短的EGFR(EGFRt)作为非免疫原性选择表位(例如，通过引入编码由T2A核糖体开关隔开的CAR和EGFRt的构建体以从同一构建体表达两种蛋白质)，然后可以使用其作为标记来检测此类细胞(参见例如，美国专利号8,802,374)。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:7或28所示的tEGFR序列或展现出与SEQ ID NO:7或28至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，单一启动子可以指导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如，编码参与调节代谢途径的分子和编码重组受体)，所述基因由编码自切割肽(例如2A序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))的序列彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被处理成单独蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可导致核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如de Felipe.Genetic Vaccinesand Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic5:616-626(2004))。许多2A元件在本领域是已知的。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A，例如SEQ ID NO:27)、来自马鼻炎A病毒的2A序列(E2A，例如SEQ ID NO:26)、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的2A序列(T2A，例如SEQ ID NO:6或23)和来自猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1的2A序列(P2A，例如SEQ ID NO:24或25)，如美国专利公开号20070116690中所述。
在一些实施方案中，标记是并非在T细胞上天然发现或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即并非被将细胞过继转移至其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标记不提供治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或原本发挥一定所需作用的分子，如在体内所遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的反应。
将编码重组受体的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些情况下，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者有毒性。因此，在一些情况下，工程化细胞包括导致细胞在体内(如在过继免疫疗法中施用时)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，工程化细胞，使得它们可以由于施用它们的患者的体内状况的改变而被消除。阴性选择性表型可以由赋予对所施用的药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 2:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的几个物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；以及Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群体摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情况下，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在所述培养的至少一部分的同时或期间将所述细胞工程化。
在一些方面，对细胞进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改进治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改进安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如以下中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)和Riddell等人,Human Gene Therapy3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而得到的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
III.示例性治疗结局及其评估方法
在本文所提供的方法、组合物、组合、用途、试剂盒和制品的一些实施方案中，所提供的组合疗法产生一种或多种治疗结局，如与任何一种或多种与疗法或治疗相关的参数相关的特征，如下文所述。在一些实施方案中，所述方法是如章节I中所述的任一种。在一些实施方案中，所述方法还包括对T细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的T细胞)的暴露、持久性和增殖的评估。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，细胞(例如，免疫疗法(例如T细胞疗法)所施用的细胞)的暴露、或延长的扩增和/或持久性，和/或所述细胞的细胞表型或功能活性的变化可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量。在一些实施方案中，此类测定可以用于确定或确认在施用本文所提供的组合疗法之前、期间或之后，T细胞(例如T细胞疗法)的功能。
在一些实施方案中，组合疗法还可以包括一个或多个筛选步骤以鉴定用组合疗法治疗和/或继续组合疗法的受试者，和/或评估治疗结局和/或监测治疗结局的步骤。在一些实施方案中，评估治疗结局的步骤可以包括评价和/或监测治疗和/或鉴定施用疗法的进一步或剩余步骤和/或重复疗法的受试者的步骤。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估可以用于确定本文所提供的组合疗法的剂量、频率、持续时间、时机和/或顺序。
在一些实施方案中，可以在施用所提供的组合疗法的一个或多个步骤(例如，施用T细胞疗法(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或施用DGK抑制剂)之前、期间、过程期间或之后使用本文所述的任何筛选步骤和/或对治疗结局的评估。在一些实施方案中，在进行本文所提供的任何方法之前、期间、过程期间或之后进行评估。在一些实施方案中，在进行本文所提供的方法之前进行评估。在一些实施方案中，在进行本文所提供的方法的一个或多个步骤之后进行评估。在一些实施方案中，在施用所提供的组合疗法的一个或多个步骤之前进行评估，例如以筛选并鉴定适合于和/或易于接受组合疗法的患者。在一些实施方案中，在施用所提供的组合疗法的一个或多个步骤期间、过程期间或之后进行评估，例如以评估中间或最终治疗结局，例如以确定治疗功效和/或确定是否继续或重复治疗和/或确定是否施用组合疗法的剩余步骤。
在一些实施方案中，治疗结局包括改善的免疫功能，例如基于细胞的疗法所施用的T细胞和/或体内内源T细胞的免疫功能。在一些实施方案中，示例性治疗结局包括但不限于增强的T细胞增殖、增强的T细胞功能活性、免疫细胞表型标记表达的变化，如与施用至所述受试者的工程化T细胞(例如TCR或CAR-T细胞)相关的此类特征。在一些实施方案中，示例性治疗结局包括降低的疾病负荷(例如肿瘤负荷)、改善的临床结局和/或增强的治疗功效。
在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估包括评估基于细胞的疗法所施用的T细胞的存活和/或功能。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估包括评估细胞因子或生长因子的水平。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估包括评估疾病负荷和/或改善，例如评估肿瘤负荷和/或临床结局。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估中的任一者可以包括本文所述和/或本领域中已知的任何评估方法和/或测定，并且可以进行一次或多次，例如，在施用所述组合疗法的一个或多个步骤之前、在所述施用期间、在所述施用的过程期间或在所述施用之后进行。与可以在本文所提供的方法的一些实施方案中评估的治疗结局相关的示例性参数集包括外周血免疫细胞群体谱和/或肿瘤负荷。
在一些实施方案中，所述方法影响细胞疗法在受试者体内的功效。在一些实施方案中，与通过不施用DGK抑制剂的方法所实现的相比，在施用具有DGK抑制剂(例如，如章节I-B中所述的任一种)的方法中的细胞剂量之后，受试者体内重组受体表达(例如TCR或CAR表达)细胞的持久性、扩增和/或存在更大。在一些实施方案中，如与其中在不存在DGK抑制剂的情况下向受试者施用T细胞疗法的方法相比，评估所施用的T细胞疗法(例如，TCR或CAR表达T细胞)在受试者中的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，如与在不存在DGK抑制剂的情况下向受试者施用T细胞疗法的方法相比，所述方法导致所施用的T细胞在受试者体内展现出增加或延长的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，如与其中在不存在DGK抑制剂的情况下向受试者施用表达重组受体的细胞的剂量的方法相比，施用DGK抑制剂降低受试者的疾病负荷(例如肿瘤负荷)。在一些实施方案中，如与其中在不存在DGK抑制剂的情况下向受试者施用表达重组受体的细胞的剂量的方法相比，施用DGK抑制剂减少受试者的骨髓原始细胞。在一些实施方案中，如与其中在不存在DGK抑制剂的情况下向受试者施用表达重组受体的细胞的剂量的方法相比，施用DGK抑制剂导致改进的临床结局，例如，客观反应率(ORR)、无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。
在一些实施方案中，可以在施用组合疗法的一个或多个步骤之前筛选受试者。例如，可以在施用组合治疗之前筛选受试者的疾病和/或疾病负荷(例如肿瘤负荷)的特征，以确定施用组合疗法的适合性、反应性和/或易感性。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估可以用于确定本文所提供的组合疗法的剂量、频率、持续时间、时机和/或顺序。
在一些实施方案中，可以在施用组合疗法的一个步骤之后筛选受试者，以确定和鉴定接受组合治疗的剩余步骤和/或监测治疗功效的受试者。在一些实施方案中，在施用DGK抑制剂之前和/或在施用DGK抑制剂之后评估所施用的T细胞的数量、水平或量和/或所施用的T细胞的增殖和/或活性。
在一些实施方案中，确定或评估与不同的评估时间点、不同条件、参考点和/或不同受试者的相同参数或结局的水平、值或测量值相比的参数或结局的水平、值或测量值的变化和/或改变(例如，增加、升高、降低或减少)。例如，在一些实施方案中，可以确定与不同条件(例如，在施用DGK抑制剂之前)中的相同参数相比，特定参数(例如，样品中工程化T细胞的数量)的倍数变化(例如，增加或降低)。在一些实施方案中，确定两个或更多个参数的水平、值或测量值，并比较相对水平。在一些实施方案中，将所确定的参数的水平、值或测量值与来自对照样品或未处理样品的水平、值或测量值进行比较。在一些实施方案中，将所确定的参数的水平、值或测量值与在不同时间点来自同一受试者的样品的水平进行比较。可以将在单独参数的定量中获得的值组合用于疾病评估的目的，例如通过使用多参数分析对参数的水平、值或测量值形成算术或逻辑运算。在一些实施方案中，可以计算两个或更多个特定参数的比率。
A.T细胞暴露、持久性和增殖
在一些实施方案中，与疗法或治疗结局相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结局和/或监测治疗结局的参数)是或包括对T细胞(例如，基于T细胞的疗法所施用的T细胞)的暴露、持久性和增殖的评估。在一些实施方案中，可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量本文所提供的方法中细胞的增加的暴露或延长的扩增/或持久性，和/或细胞的细胞表型或功能活性的变化，所述细胞是例如免疫疗法(例如，T细胞疗法)所施用的细胞。在一些实施方案中，可以在施用本文所提供的组合疗法的一个或多个步骤之前或之后，使用此类测定来确定或确认用于免疫疗法(例如，T细胞疗法)的T细胞的功能。
在一些实施方案中，DGK抑制剂的施用被设计成促进受试者对细胞(例如，基于T细胞的疗法所施用的T细胞)的暴露，例如通过促进所述细胞随时间的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，如与其中在不存在DGK抑制剂的情况下向受试者施用T细胞疗法的方法相比，T细胞疗法展现出在受试者中增加的或延长的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，所提供的方法增加受试者对所施用的细胞的暴露(例如，增加的细胞数量或随时间的持续时间)和/或改善免疫疗法(例如，T细胞疗法)的功效和治疗结局。在一些方面，如与其他方法相比，所述方法的有利之处在于，对表达重组受体的细胞(例如，TCR或CAR表达细胞)的更大和/或更长程度的暴露改善治疗结局。即使在具有严重肿瘤负荷的个体中，此类结局也可以包括患者的存活和缓解。
在一些实施方案中，如与在不存在DGK抑制剂的情况下仅施用T细胞相比，DGK抑制剂的施用可以增加受试者中对细胞(例如，基于T细胞的疗法所施用的T细胞)的最大暴露、总暴露和/或暴露持续时间。
在一些实施方案中，在施用T细胞之后且在施用DGK抑制剂之前、期间和/或之后，检测表达重组受体的细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的TCR或CAR表达细胞)在受试者中的存在和/或量。在一些方面，使用定量PCR(qPCR)评估表达重组受体的细胞(例如，基于T细胞的疗法所施用的TCR或CAR表达细胞)在受试者的血液或血清或器官或组织样品(例如，疾病部位，例如肿瘤样品)中的量。在一些方面，持久性被定量为每微克DNA(例如从样品获得的总DNA)中编码受体(例如，TCR或CAR)的DNA或质粒的拷贝，或者被定量为每微升样品(例如，血液或血清)中或者每微升样品的外周血单个核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数中受体表达细胞(例如，TCR或CAR表达细胞)的数量。
在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)之后为或至少为4、7、10、14、18、21、24、27或28天，在受试者中检测细胞。在一些方面，在施用T细胞之后为或至少为2、4或6周，或者3、6、或12、18、或24、或30或36个月，或者1、2、3、4、5年或更多年，检测细胞。
在一些实施方案中，如与通过替代性方法(如涉及在不存在DGK抑制剂的情况下仅施用免疫疗法(例如，施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞))的那些)可实现的相比，通过所述方法在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂之后，受体表达细胞(例如TCR或CAR表达细胞)在受试者中的持久性更强。
指示扩增和/或持久性的细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的暴露(例如，数量)可以根据以下方面来陈述：暴露至受试者的细胞的最大数量、可检测细胞或高于某一数量或百分比的细胞的持续时间、细胞数量相对于时间的曲线下面积和/或其组合和其指示物。此类结局可以使用已知方法来评估，例如使用qPCR来检测与特定样品(例如，血液、血清、血浆或组织，如肿瘤样品)中核酸或DNA的总量相比，编码重组受体的核酸的拷贝数；和/或使用流式细胞术测定，通常使用对受体具特异性的抗体来检测表达受体的细胞。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，所述功能细胞是诸如能够结合至和/或中和所述疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的细胞，和/或能够诱导针对所述疾病或病症的细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞。
在一些方面，增加的受试者对细胞的暴露包括增加的细胞扩增。在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)后和/或在施用DGK抑制剂后，受体表达细胞(例如，TCR或CAR表达细胞)在受试者体内扩增。在一些方面，与其他方法(如涉及在不施用DGK抑制剂的情况下施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)的那些方法)相比，所述方法导致更大的细胞扩增。
在一些方面，所述方法导致所施用的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，检测细胞的高峰比例。例如，在一些实施方案中，在受试者的血液或疾病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分或T细胞级分)中，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂后的峰值或最大水平下，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞表达重组受体(例如，TCR或CAR)。
在一些实施方案中，所述方法导致受试者的血液或血清或其他体液或器官或组织中的最大浓度为每微克DNA至少100、500、1000、1500、2000、5000、10,000或15,000个拷贝的编码受体(例如，TCR或CAR)的核酸，或为外周血单个核细胞(PBMC)总数、单个核细胞总数、T细胞总数或总微升数中至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的表达受体(例如，表达TCR或CAR)的细胞。在一些实施方案中，表达受体的细胞被检测为受试者的血液中总PBMC的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或在T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂之后在这个水平下持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或52周，或在这样的施用后持续1、2、3、4或5年或更多年。
在一些方面，所述方法导致例如受试者的血清、血浆、血液或组织(例如肿瘤样品)中，每微克DNA中编码重组受体(例如TCR或CAR)的核酸的拷贝数增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。
在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)之后或在施用DGK抑制剂之后至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天或更多天，表达受体的细胞在受试者的血清、血浆、血液或组织(例如，肿瘤样品)中是可检测的(例如，通过指定方法，如qPCR或基于流式细胞术的检测方法)，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂之后持续至少或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周或更多周。
在一些方面，在受试者或其体液、血浆、血清、组织或隔室中，例如在其血液(例如外周血)或疾病部位(例如肿瘤)中，可检测到或存在至少约1x102、至少约1x103、至少约1x104、至少约1x105、或至少约1x106、或至少约5x106、或至少约1x107、或至少约5x107、或至少约1x108个重组受体表达(例如TCR-CAR表达)细胞，和/或每微升至少10个、25个、50个、100个、200个、300个、400个或500或1000个受体表达细胞(例如每微升至少10个所述细胞)。在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)后和/或在施用DGK抑制剂后，在所述受试者中可检测到这种数量或浓度的细胞持续至少约20天、至少约40天、或至少约60天，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年。此类细胞数量可以如通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法来检测，并使用已知方法外推至总细胞数量。参见例如，Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)；Park等人,Molecular Therapy 15(4):825-833(2007)；Savoldo等人,JCI 121(5):1822-1826(2011)；Davila等人,(2013)PLoSONE 8(4):e61338；Davila等人,Oncoimmunology 1(9):1577-1583(2012)；Lamers,Blood2011 117:72-82；Jensen等人,Biol Blood Marrow Transplant 2010年9月；16(9):1245-1256；Brentjens等人,Blood 2011118(18):4817-4828。
在一些方面，在施用细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂后在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周或至少约6周，或至少约2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月或者至少2年或3年，例如在外周血或骨髓或其他隔室中，如通过免疫组织化学、PCR和/或流式细胞术测量的每100个细胞中编码重组受体的核酸的拷贝数(例如载体拷贝数)为至少0.01、至少0.1、至少1或至少10。在一些实施方案中，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)或DGK抑制剂后约1周、约2周、约3周或至少约4周的时间，或在这种施用后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或者至少2或3年的时间，每微克基因组DNA中表达受体(例如，TCR-CAR)的载体的拷贝数为至少100、至少1000、至少5000、或至少10,000、或至少15,000或至少20,000。
在一些方面，在施用细胞之后(例如，在开始施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)之后)和/或施用DGK抑制剂之后至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年或超过3年的时间，在受试者、其血浆、血清、血液、组织和/或患病部位(例如，肿瘤部位)中，由所述细胞表达的受体(例如TCR或CAR)是通过定量PCR(qPCR)或通过流式细胞术可检测的。
在一些实施方案中，如与通过替代性给药方案(在不存在施用DGK抑制剂的情况下向受试者施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞))所实现的相比，在施用T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂之后表达受体(例如，TCR或CAR)的细胞在受试者的体液、血浆、血清、血液、组织、器官和/或患病部位(例如，肿瘤部位)中的浓度随时间变化的曲线下面积(AUC)更大。
在一些方面，所述方法导致所施用的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，检测细胞的高峰比例。例如，在一些实施方案中，在受试者的血液、血浆、血清、组织或疾病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分或T细胞级分)中，在T细胞(例如，TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂后，在峰值或最大水平时，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的所述细胞表达重组受体(例如，TCR或CAR)。
在一些方面，在施用DGK抑制剂的受试者体内，细胞剂量的增加或延长的扩增和/或持久性与受试者体内肿瘤相关结局的益处相关。在一些实施方案中，肿瘤相关结局包括受试者体内肿瘤负荷的降低或骨髓原始细胞的减少。在一些实施方案中，在施用所述方法后，肿瘤负荷的降低量为或至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与已经用不涉及施用DGK抑制剂的方法治疗的受试者相比，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积在细胞剂量后降低至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
B.T细胞功能活性
在一些实施方案中，与疗法或治疗结局相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结局和/或监测治疗结局的参数)包括T细胞的活性、表型、增殖或功能中的一种或多种。在一些实施方案中，可以使用本领域中用于评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能的任何已知测定。在施用细胞和/或DGK抑制剂之前和/或之后，在一些实施方案中，测量工程化细胞群体的生物活性，例如通过多种已知方法中的任一种来测量。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，可以使用已知的任何合适的方法测量工程化的细胞破坏靶细胞的能力，所述方法如例如以下文献中所述的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。
在一些实施方案中，可以在施用细胞和/或DGK抑制剂之前和/或之后评估T细胞(如表达重组(例如，TCR或CAR)的T细胞)，以评估或确定所述T细胞是否展现耗竭的特征。在一些情况下，可以通过监测T细胞功能的丧失来评估耗竭，所述T细胞功能的丧失为例如减少或降低的抗原特异性或抗原受体驱动活性，例如减少或降低的产生细胞因子或驱动针对靶抗原的细胞裂解活性的能力。在一些情况下，还可以通过监测在T细胞(例如CD4和/或CD4T细胞)上与耗竭表型相关的表面标记的表达来评估耗竭。耗竭标记包括抑制性受体，如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3。
在一些实施方案中，在施用于受试者后和/或在长期暴露于抗原后随时间推移观察到这种减少或降低的活性。
在特定实施方案中，所提供的方法(i)实现抗原特异性或抗原受体驱动活性的所述增加，并且(ii)预防、抑制或延迟耗竭表型的所述发作和/或逆转所述耗竭表型。在一些实施方案中，所述量、持续时间和/或频率有效于(i)实现抗原特异性或抗原受体驱动活性的所述增加，并且(ii)预防、抑制或延迟耗竭表型的所述发作。在其他实施方案中，所述量、持续时间和/或频率有效于(i)实现抗原特异性或抗原受体驱动活性的所述增加，并且(ii)预防、抑制或延迟耗竭表型的所述发作以及逆转所述耗竭表型。
在一些实施方案中，关于T细胞或T细胞群体的耗竭表型包括：在相同条件下与参考T细胞群体相比，所述T细胞或多个T细胞上一种或多种耗竭标记(任选地2、3、4、5或6种耗竭标记)的表面表达的水平或程度的增加，或者展现所述表面表达的所述T细胞群体的百分比的增加；或在相同条件下与参考T细胞群体相比，在暴露于抗原或抗原受体特异性药剂时，由所述T细胞或T细胞群体展现出的活性水平或程度的降低。在一些实施方案中，所述水平、程度或百分比的增加是大于或大于约1.2倍、大于或大于约1.5倍、大于或大于约2.0倍、大于或大于约3倍、大于或大于约4倍、大于或大于约5倍、大于或大于约6倍、大于或大于约7倍、大于或大于约8倍、大于或大于约9倍、大于或大于约10倍或更多。在其他实施方案中，所述水平、程度或百分比的降低是大于或大于约1.2倍、大于或大于约1.5倍、大于或大于约2.0倍、大于或大于约3倍、大于或大于约4倍、大于或大于约5倍、大于或大于约6倍、大于或大于约7倍、大于或大于约8倍、大于或大于约9倍、大于或大于约10倍或更多。
在某些实施方案中，通过评估一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2、GM-CSF和TNFα)的表达和/或分泌和/或通过评估细胞裂解活性来测量细胞的生物活性。
在一些实施方案中，对T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能的测定包括但不限于ELISPOT、ELISA、细胞增殖、细胞毒性淋巴细胞(CTL)测定、与T细胞表位、抗原或配体结合、或细胞内细胞因子染色、增殖测定、淋巴因子分泌测定、直接细胞毒性测定和有限稀释测定。在一些实施方案中，可以测量T细胞的增殖反应，例如通过将3H-胸苷、BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)或2'-脱氧-5-乙炔基尿苷(EdU)掺入T细胞的DNA中或使用诸如羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)、CellTrace Violet或膜染料PKH26等染料的染料稀释测定。
在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能包括测量T细胞的细胞因子产生，和/或测量来自受试者的生物样品(例如血浆、血清、血液和/或组织样品，例如肿瘤样品)中的细胞因子产生。在一些情况下，此类所测量的细胞因子可以包括但不限于白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD107a和/或TGF-β(TGFβ)。测量细胞因子的测定是众所周知的，并且包括但不限于ELISA、细胞内细胞因子染色、流式微珠阵列、RT-PCR、ELISPOT、流式细胞术和在存在测试样品的情况下测试对相关细胞因子有反应的细胞的反应性(例如，增殖)的生物测定。
在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能包括评估细胞表型，例如特定细胞表面标记的表达。在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)中T细胞激活标记、T细胞耗竭标记和/或T细胞分化标记的表达。在一些实施方案中，在施用之前评估细胞表型。在一些实施方案中，在施用细胞疗法和/或DGK抑制剂期间或之后评估细胞表型。用于评估的T细胞激活标记、T细胞耗竭标记和/或T细胞分化标记包括已知用于特定T细胞子集的任何标记，例如CD25、CD38、人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、CD69、CD44、CD137、KLRG1、CD62L低、CCR7低、CD71、CD2、CD54、CD58、CD244、CD160、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)和/或基于T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)(参见例如，Liu等人,Cell Death and Disease(2015)6,e1792)。在一些实施方案中，耗竭标记是以下中的任何一种或多种：PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、2B4、CD160、CD39、VISTA和TIGIT。在一些实施方案中，所评估的细胞表面标记是CD25、PD-1和/或TIM-3。在一些实施方案中，所评估的细胞表面标记是CD25。
在一些方面，检测表达水平包括进行体外测定。在一些实施方案中，体外测定是免疫测定、基于适配体的测定、组织学或细胞学测定或mRNA表达水平测定。在一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧流免疫测定、抑制测定或亲合力测定来检测所述一种或多种因子、效应子、酶和/或表面标记各自的一种或多种的一个或多个参数。在一些实施方案中，细胞因子和/或表面标记的检测是使用特异性结合至少一种生物标记的结合试剂来确定的。在一些情况下，结合试剂是抗体或其抗原结合片段、适配体或核酸探针。
在一些实施方案中，施用DGK抑制剂提高循环CAR T细胞的水平。
C.疾病负荷
在一些实施方案中，与疗法或治疗结局相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结局和/或监测治疗结局的参数)包括肿瘤或疾病负荷。免疫疗法(如T细胞疗法(例如，TCR或CAR表达T细胞))和/或DGK抑制剂的施用可以降低或预防受试者的疾病或病症的扩增或负荷。例如，在疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的B细胞恶性肿瘤，和/或改善预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
在一些方面，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物的施用通常降低或预防所述受试者中所述疾病或病症的扩大或负荷。例如，在疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的B细胞恶性肿瘤，和/或改善预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
在一些实施方案中，与在不施用DGK抑制剂的情况下给予免疫疗法(如T细胞疗法(例如TCR或CAR表达T细胞))的替代方法相比，所提供的方法导致所治疗受试者的降低的肿瘤负荷。肿瘤负荷不一定在接受组合疗法的所有受试者中都实际上降低，但是如基于临床数据，肿瘤负荷在所治疗受试者中平均地降低，其中用这种组合疗法治疗的大多数受试者表现出降低的肿瘤负荷，如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的用所述组合疗法治疗的受试者表现出降低的肿瘤负荷。
疾病负荷可以涵盖受试者体内或受试者的器官、组织或体液(如肿瘤的器官或组织或例如可指示转移的另一位置)中疾病细胞的总数。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下可以在血液、淋巴或骨髓中检测和/或定量肿瘤细胞。在一些实施方案中，疾病负荷可以包括肿瘤的质量、转移的数量或程度和/或骨髓中存在的原始细胞的百分比。
在一些实施方案中，受试者患有淋巴瘤或白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残留白血病来确定。在一些实施方案中，受试者患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，受试者患有MM或DBCBL。
在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准(Luganocriteria)。(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.4(1):5)。在一些方面，反应评估利用任何临床、血液学和/或分子方法。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应包括视情况使用正电子发射断层成像(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可以包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，在使用PET-CT评估嗜FDG组织学的反应的情况下，可以使用5分量表。在一些方面，5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取中度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应涉及在不同可测量部位处的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或激活的韦氏环(Waldeyer's ring)或结节外位点中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累位点的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外位点，并且靶淋巴结/淋巴结肿块的病灶的最长横径(LDi)必须复原至≤1.5cm。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态，如果不确定则应是IHC阴性。其他位点可以包括对器官肿大的评估，其应复原至正常。在一些方面，评估未测量的病灶和新病灶，其在CR的情况下应不存在(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.4(1):5)。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的部分反应(PR)涉及在不同可测量部位的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残余肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残留疾病。在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外部位的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量值进行计算。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评价应指示残余摄取，所述残余摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情况下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他位点可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经复原>50％。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，其在PR的情况下应不存在/正常，已复原但没有增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.,4(1):5)。
在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为在疾病(如B细胞恶性肿瘤)治疗期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总存活期(OS)被描述为从诊断或开始治疗疾病(如B细胞恶性肿瘤)的日期到被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活时的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在B细胞恶性肿瘤治疗结束后，所述受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括B细胞恶性肿瘤的复发或某些症状的发作，所述症状如已经扩散到骨骼的B细胞恶性肿瘤引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从开始治疗起时间段之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始疗法后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，反应可持续大于3个月或大于6个月。
在一些方面，使用RECIST标准确定客观肿瘤反应。(Eisenhauer等人,EuropeanJournal of Cancer 45(2009)228-247)。在一些方面，使用RECIST标准确定对于靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面中，如使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减少至<10mm。在其他方面中，如使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线总直径为参考，靶病灶的直径总和减小至少30％。在其他方面，疾病进展(PD)被描述为以研究中的最小总和(这包括基线总和，如果基线总和在研究中最小的话)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，所述总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面，疾病稳定(SD)被描述为以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
在MM的情况下，评估疾病负荷程度的示例性参数包括诸如以下的参数：克隆浆细胞数量(例如，在骨髓活检中>10％或在来自其他组织的活检中的任何量；浆细胞瘤)、单克隆蛋白(副蛋白)在血清或尿液中的存在、感觉与浆细胞障碍相关的终末器官损害的证据(例如，高钙血症(校正钙>2.75mmol/l)；骨髓瘤引起的肾功能不全；贫血(血红蛋白<10g/dl)；和/或骨病灶(溶解性病灶或具有压缩性骨折的骨质疏松症))。
在DLBCL的情况下，评估疾病负荷程度的示例性参数包括诸如以下的参数：细胞形态(例如，中心母细胞、免疫母细胞和间变细胞)、基因表达，miRNA表达和蛋白质表达(例如，BCL2、BCL6、MUM1、LMO2、MYC和p21的表达)。
在一些方面，受试者(如患有CLL的受试者)的反应率基于国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(IWCLL)反应标准(Hallek等人,Blood 2008年6月15日；111(12):5446-5456)。在一些方面，这些标准描述如下：完全缓解(CR)，其在一些方面要求依据免疫表型分析不存在外周血克隆淋巴细胞、不存在淋巴结病、不存在肝肿大或脾肿大、不存在全身症状和令人满意的血细胞计数；完全缓解伴随不完全骨髓恢复(CRi)，其在一些方面被描述为上述CR，但没有正常的血细胞计数；部分缓解(PR)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数下降≥50％、淋巴结病减少≥50％或肝或脾减小≥50％，以及外周血细胞计数改善；疾病进展(PD)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数增加≥50％至>5x109/L、淋巴结病增加≥50％、肝或脾大小增加≥50％、里希特转化或由于CLL所致的新的血细胞减少；以及疾病稳定，其在一些方面被描述为不符合CR、CRi、PR或PD的标准。
在一些实施方案中，如果在施用细胞剂量的1个月内，受试者的淋巴结大小小于或小于约20mm、大小小于或小于约10mm或大小小于或小于约10mm，则受试者展现出CR或OR。
在一些实施方案中，在受试者的骨髓中(或在大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的根据所述方法治疗的受试者的骨髓中)没有检测到CLL的指标克隆。在一些实施方案中，通过IgH深度测序评估CLL的指标克隆。在一些实施方案中，在施用细胞之后等于或约或者至少为或至少约1、2、3、4、5、6、12、18或24个月的时间未检测到指标克隆。
在一些实施方案中，如果例如如通过光学显微术检测，骨髓中存在大于或等于5％原始细胞，如骨髓中大于或等于10％原始细胞、骨髓中大于或等于20％原始细胞、骨髓中大于或等于30％原始细胞、骨髓中大于或等于40％原始细胞或骨髓中大于或等于50％原始细胞，则受试者展现出形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，受试者可以展现完全缓解，但存在小部分形态学上(通过光学显微术技术)不可检测的残留白血病细胞。如果受试者展现出在骨髓中小于5％原始细胞并且展现出可分子检测的B细胞恶性肿瘤，则称所述受试者展现出微小残留病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的B细胞恶性肿瘤可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任何一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定由染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定B细胞恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤的分子检测可以检测100,000个正常细胞中的少至1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中的至少或大于1个白血病细胞，则受试者展现出可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术不能检测到受试者体内的白血病细胞。
在白血病的情况下，可以通过评估血液或骨髓中残留的白血病来确定疾病负荷程度。在一些实施方案中，如果骨髓中存在大于或等于5％的原始细胞(例如，如通过光学显微镜检查检测)，则受试者表现出形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，对于白血病，受试者可展现出完全缓解，但是存在小部分形态学不可检测(通过光学显微镜检查技术)的残留白血病细胞。如果受试者展现出在骨髓中小于5％原始细胞并且展现出可分子检测的B细胞恶性肿瘤，则称所述受试者展现出微小残留病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的B细胞恶性肿瘤可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任何一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定由染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定B细胞恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤的分子检测可以检测100,000个正常细胞中的少至1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中的至少或大于1个白血病细胞，则受试者展现出可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术不能检测到受试者体内的白血病细胞。
在一些实施方案中，与紧接在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和/或DGK抑制剂之前的时间的疾病负荷相比，所述方法和/或细胞疗法(如T细胞疗法，例如TCR或CAR表达T细胞)和/或DGK抑制剂的施用降低疾病负荷。
在一些方面，免疫疗法(例如T细胞疗法)和/或DGK抑制剂的施用可以预防疾病负荷的增加，并且这可以通过疾病负荷无变化来证实。
在一些实施方案中，如与使用替代疗法(如其中所述受试者在不存在DGK抑制剂的施用的情况下接受免疫疗法(例如单独的T细胞疗法)的疗法)通过可比较方法会观察到的降低相比，所述方法降低疾病或病症的负荷(例如肿瘤细胞数、肿瘤大小、患者存活或无事件存活的持续时间)至更大程度和/或持续更长时间段。在一些实施方案中，与通过单独施用每一种药剂(例如向未接受过免疫疗法(例如T细胞疗法)的受试者施用DGK抑制剂；或向未接受过DGK抑制剂的受试者施用免疫疗法(例如T细胞疗法))所实现的降低相比，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和DGK抑制剂的组合疗法之后，疾病负荷被降低至更大程度或持续更长时间段。
在一些实施方案中，检测、评估或测量受试者中疾病或病症的负荷。在一些方面，可以通过检测疾病细胞或疾病相关细胞(例如，肿瘤细胞)在受试者体内或在受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中的总数来检测疾病负荷。在一些实施方案中，通过测量转移的数量或程度来评估疾病负荷(例如肿瘤负荷)。在一些方面，评估受试者的存活、特定时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，指定疾病或病症负荷的量度。在一些实施方案中，用于确定的示例性参数包括指示疾病或病症(例如肿瘤)的改善或改良的特定临床结局。此类参数包括：疾病控制的持续时间，所述疾病控制包括完全反应(CR)、部分反应(PR)或疾病稳定(SD)(参见例如，实体瘤中的反应评价标准(ResponseEvaluation Criteria In Solid Tumors，RECIST)指南)、客观反应率(ORR)、无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。可以设定参数的具体阈值以确定本文所提供的组合疗法方法的功效。
在一些方面，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)之前，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)之后但在施用DGK抑制剂之前，和/或在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和DGK抑制剂两者后，测量或检测疾病负荷。在多次施用所述组合疗法的一个或多个步骤的情况下，在一些实施方案中，可以在施用任何步骤、剂量和/或施用周期之前或之后，或者在施用任何步骤、剂量和/或施用周期之间的时间，测量疾病负荷。
在一些实施方案中，与紧接在施用DGK抑制剂和免疫疗法(例如T细胞疗法)之前相比，所提供的方法将所述负荷的降低或降低至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与紧接在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和/或DGK抑制剂之前相比，在施用免疫疗法(例如T细胞疗法)和DGK抑制剂之后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积减少至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，通过所述方法降低疾病负荷包括诱导形态学完全缓解，例如如在施用(例如，开始)所述组合疗法后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、或多于6个月时所评估的。
在一些方面，例如如通过多参数流式细胞术测量的，对微小残留病的测定是阴性的，或微小残留病的水平小于约0.3％、小于约0.2％、小于约0.1％或小于约0.05％。
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法提高受试者的无事件存活率或总存活率。例如，在一些实施方案中，在本文所提供的组合疗法方法后6个月时，通过所述方法治疗的受试者的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用所述方法治疗的受试者展现出无事件存活、无复发存活或存活至少6个月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方案中，至进展的时间得到改善，如至进展的时间大于6个月或大于约6个月或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9或10年。
在一些实施方案中，与其他方法相比，在通过所述方法治疗后，复发概率有所减小。例如，在一些实施方案中，在组合疗法方法后6个月时，复发概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
在一些情况下，确定所施用细胞(例如，过继转移细胞)的药代动力学，以评估利用度，例如，所施用细胞的生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被施用工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)；蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)；直接引入CAR中的特定位点中的表位标签(如Strep-标签序列)，借此使用Strep-标签的结合试剂直接评估CAR(Liu等人(2016)NatureBiotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)；以及与CAR多肽特异性地结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(例如CAR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有抗体西妥昔单抗()或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434。
在一些实施方案中，可以在施用细胞疗法之后的时间段确定从患者获得的生物样品(例如，血液)中CAR+ T细胞的数量，例如，以确定细胞的药代动力学。在一些实施方案中，在受试者的血液中或在通过所述方法如此治疗的大多数受试者中可检测的CAR+ T细胞(任选CAR+CD8+ T细胞和/或CAR+CD4+ T细胞)的数量是大于1个细胞/μL、大于5个细胞/μL或大于10个细胞/μL。
IV.毒性和不良结局
在所提供的方法的实施方案中，在施用了所提供的组合疗法(其包括细胞疗法(例如，T细胞疗法)和DGK抑制剂)的受试者中，监测所述受试者的毒性或其他不良结局，包括治疗相关结局，例如细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)。在一些实施方案中，进行所提供的方法以降低毒性结局或症状、毒性促进特征、因子或特性(如与重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性相关或指示其的症状或结局)的风险。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不导致高比率或可能性的毒性或毒性结局，或者降低毒性或毒性结局(如重度神经毒性(NT)或重度细胞因子释放综合征(CRS))的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不导致以下事件或不增加以下事件的风险：重度NT(sNT)、重度CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的血浆CRP水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供方法治疗的受试者未展现出任何分级的CRS或任何分级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现出高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出重度毒性结局(例如重度CRS或重度神经毒性)，如未展现出3级或更高分级的神经毒性和/或未展现出重度CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。
在一些方面，针对毒性结局的风险监测受试者和/或所述方法降低毒性结局的风险，所述毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物产品后可能发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509-1518(2013)；以及Kochenderfer等人,Blood 119,2709-2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。
通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症应答和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。重度的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他重度的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如抗IL-6抗体，例如托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。
CRS的结局、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或施用实现或不实现给定的CRS相关结局、体征或症状的情况下，可以指定特定结局、体征和症状和/或其量或程度。
在施用CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注CAR表达细胞后6-20天时发生。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。
与CRS相关的示例性结局包括发热、僵直、寒战、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫发作样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结局包括疲劳、恶心、头痛、癫痫发作、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、转氨酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。
在一些实施方案中，与CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。
示例性CRS相关结局包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结局进一步包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)进行。
在一些实施方案中，CRS相关的血清因子或CRS相关的结局包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平(如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。
在一些实施方案中，在T细胞疗法治疗和/或DGK抑制剂治疗之前、期间或之后监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面，一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。
已经研发出CRS标准，其显现出与CRS的发作相关联，以预测哪些患者更可能有发生sCRS的风险(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状二者密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95)。在一些实施方案中，反映CRS分级的标准是下表2中详述的那些标准。
在一些实施方案中，认为受试者响应或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“重度CRS”(“sCRS”)，条件是在施用后所述受试者展示：(1)在至少38摄氏度发热至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少两种的至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5，和/或(b)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少一种的至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5；和(c)至少一种毒性临床体征，如低血压(需要至少一种静脉内血管作用加压药)或缺氧(PO2<90％)或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和/或癫痫)。在一些实施方案中，重度CRS包括3级或更高分级的CRS，如表2中所列。
在一些实施方案中，与重度CRS或3级或更高分级，如4级或更高分级的CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如在指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如与至少两种细胞因子(例如，由以下各项组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的治疗前水平相比，例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，重度CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，CRS(如重度CRS)包括以下的组合：(1)持续发热(至少38摄氏度的发热至少三天)和(2)CRP的血清水平为至少或至少约20mg/dL。在一些实施方案中，CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续施用中增加血管加压药的剂量。
在一些实施方案中，重度CRS或3级CRS涵盖丙氨酸转氨酶的增加、天冬氨酸转氨酶的增加、寒战、发热性嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。
可以指定测量或检测各种结局的方法。
在一些方面，疗法(如细胞疗法)的毒性结局是神经毒性或重度神经毒性或与神经毒性或重度神经毒性相关或指示神经毒性或重度神经毒性。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫(任选地如通过脑电图[EEG]确认)、β淀粉样蛋白(Aβ)水平升高、谷氨酸水平升高和氧自由基水平升高。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见例如，Guido Cavaletti&Paola Marmiroli NatureReviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。
在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经病学变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，神经病学变化的恢复是在sCRS的其他症状消退后发生。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会加速神经病学变化消退的时间或程度。
在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“重度神经毒性”，条件是在施用后所述受试者展示以下中的限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的症状：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(如感官知觉失真，导致异常和不适感)、神经痛(如沿神经或神经组的剧烈疼痛感)，和/或感觉异常(如感觉神经元的功能紊乱，导致在没有刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和温的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，重度神经毒性包括3级或更高分级的神经毒性，如表3中所列。在一些实施方案中，如果症状或3级神经毒性持续10天或更长时间，则认为重度神经毒性为延长的3级。
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结局或因素，包括与重度CRS或3级或更高分级的CRS相关的症状、结局或因素。例如，根据本发明方法治疗的受试者可能缺少可检测的CRS(例如，重度CRS或3级或更高分级的CRS)的症状、结局或因素和/或具有减少的所述症状、结局或因素，如所述的(例如表2中所列)任何症状、结局或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本发明方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本发明方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。
在一些实施方案中，所述方法减轻与神经毒性相关的结局，包括对神经系统和/或脑的损伤，如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子(如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基)的水平。
在一些实施方案中，毒性结局是剂量限制性毒性(DLT)。在一些实施方案中，毒性结局是剂量限制性毒性的不存在。在一些实施方案中，剂量限制性毒性(DLT)被定义为任何3级或更高分级的毒性，如通过任何已知或公开的用于评估特定毒性的指南所描述或评估，如上述任何指南并且包括国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CommonTerminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)4.0版。
在一些实施方案中，所提供的实施方案导致毒性(例如CRS或神经毒性或重度CRS或神经毒性，例如3级或更高分级的CRS或神经毒性)的发生率或发生风险低，如通过根据所提供的组合疗法施用一定剂量的T细胞观察到的和/或通过所提供的制品或组合物观察到的。在一些情况下，这允许在门诊基础上施用所述细胞疗法。在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如TCR+或CAR+ T细胞)的剂量)是在门诊基础上进行，或者不需要使受试者住院，如需要过夜停留的住院。
在一些方面，在施用细胞剂量之前或与其同时没有向根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用细胞疗法(例如T细胞(例如TCR+或CAR+ T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)施用用于治疗任何毒性的干预，除非或直到受试者展现毒性(如神经毒性或CRS)的体征或症状。
在一些实施方案中，如果施用细胞疗法(例如T细胞(例如TCR+或CAR+ T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)展现发热，则给予受试者治疗或指示受试者接受或施用治疗，以减轻发热。在一些实施方案中，将受试者的发热表征为受试者的体温等于或高于某一阈值温度或水平(或在所述阈值温度或水平下测量)。在一些方面，阈值温度是与至少低度发热、与至少中度发热和/或与至少高度发热相关的温度。在一些实施方案中，阈值温度是特定的温度或范围。例如，阈值温度可以是为或约或至少或至少约38、39、40、41或42摄氏度，和/或可以是为或约38摄氏度至为或约39摄氏度的范围、为或约39摄氏度至为或约40摄氏度的范围、为或约40摄氏度至为或约41度的范围、或为或约41摄氏度至为或约42摄氏度的范围。
在一些实施方案中，被设计为减轻发热的治疗包括用退热药治疗。退热药可以包括降低发热的任何药剂、组合物或成分，如已知具有退热作用的许多药剂中的一种，如NSAID(如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、水杨酸盐(如阿司匹林、水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛、对乙酰氨基酚、安乃近、萘丁美酮、Phenaxone、安替比林、解热药。在一些实施方案中，退热药是对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，可以最多每四小时以12.5mg/kg的剂量口服或静脉内施用对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，退热药是或包含布洛芬或阿司匹林。
在一些实施方案中，如果发热是持续发热，则向受试者施用用于治疗毒性的替代性治疗。对于在门诊基础上治疗的受试者，如果受试者已经和/或被确定为患有或患有持续发热，则指示所述受试者返回医院。在一些实施方案中，如果受试者展现等于或高于相对阈值温度的发热，并且在指定治疗(如被设计为减轻发热的治疗，如使用退热药(例如NSAID或水杨酸盐，例如，布洛芬、对乙酰氨基酚或阿司匹林)的治疗)后，所述受试者的发热或体温不下降，或者不下降指定量或超过指定量(例如超过1℃，并且通常不会变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃)的情况下，所述受试者已经和/或被确定为或认为患有持续发热。例如，如果受试者展现或被确定为展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热即使在用诸如对乙酰氨基酚的退热药治疗后，在6小时时间段内、在8小时时间段内、或在12小时时间段内或在24小时时间段内，没有降低或没有降低超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，或降低或降低约1％、2％、3％、4％或5％，则所述受试者被认为具有持续发热。在一些实施方案中，退热药的剂量是通常在这种受试者中有效减轻发热或特定类型的发热的剂量，特定类型的发热如与细菌或病毒感染(例如，局部或全身感染)相关的发热。
在一些实施方案中，如果受试者展现等于或高于相关阈值温度的发热，并且在受试者的发热或体温没有变动约或超过约1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃的情况下，所述受试者已经患有和/或被确定为或认为患有持续发热。通常，高于或等于某一量的变动的这种不存在是在给定的时间段内测量(如，在24小时、12小时、8小时、6小时、3小时或1小时的时间段内，其可以从发烧的最初体征或最初高于所指示阈值的温度起测量)。例如，在一些实施方案中，如果受试者展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，这种发热的温度在6小时时间段内、8小时时间段内、或12小时时间段内或24小时时间段内没有变动超过或超约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，则所述受试者被认为或被确定为展现持续发热。
在一些实施方案中，这种发热是持续发热；在一些方面，有可能诱导所述毒性的初始疗法(如所述细胞疗法，如T细胞(例如TCR+或CAR+ T细胞)的剂量)后，在已经确定受试者患有持续发热时，如在这种确定或首次这种确定的一、二、三、四、六、六小时或更短时间内，治疗所述受试者。
在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，施用用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，施用所述一种或多种靶向毒性的疗法。
V.制品和试剂盒
还提供了制品，所述制品含有DGKα和/或DGKζ的抑制剂和用于T细胞疗法的组分(例如，工程化细胞)和/或其组合物。制品可以包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，容器容纳组合物，所述组合物自身或与另一种组合物组合地有效治疗、预防和/或诊断病症。在一些实施方案中，容器具有无菌接入端口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶(包括具有可被注射针刺穿的塞子的那些溶液袋、小瓶)或用于口服施用剂的瓶子或小瓶。标签或包装说明书可以指示将组合物用于治疗疾病或病症。
制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括用于T细胞疗法的工程化细胞(例如，章节I-A中所述的任何组合物)；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括第二试剂，如DGKα和/或DGKζ的抑制剂(例如，章节I-B中所述的任何抑制剂)。制品可以进一步包括其中含有组合物的第三容器，其中所述组合物包括检查点抑制剂(例如，如章节I-C中所述的任一种)。制品还可以包括包装说明书，其指示组合物可以用于治疗特定病症。可替代地或另外地，制品还可以包括另一种或相同的容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂。它还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和/或注射器。
VI.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所陈述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括所述限值中的之一或两者的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用术语“约”是指本技术领域中容易知道的相应值的通常误差范围。本文提及“约”某一值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，“受试者”是人。除非另有明确说明，否则如本文所用，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用用于指人。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结局或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结局的影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，该受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用的，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数之外在其他方面相同的条件相比时，或者可替代地，与另一种情况相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在施用的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如药物配制品或工程化细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效动力学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重、以及所施用的免疫调节多肽或工程化细胞。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用免疫调节多肽、工程化细胞或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(如序列表中所示)的叙述是指，在使用标准比对算法(如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，人们员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。一般来说，为了鉴定对应位置，将氨基酸序列比对以使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,New.Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,MStockton Press,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已将其引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与它们操作性地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入感兴趣的结合分子(例如抗体)、和针对所希望的活性(例如保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员更换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
“DGKα和/或DGKζ的抑制剂”是指“DGKα和/或DGKζ酶活性的抑制剂”，两者均指人DGKα和/或人DGKζ的抑制剂，例如具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:190所示氨基酸序列、不含DGKα中天然存在的氨基酸(例如，His尾部或某些N末端氨基酸)的DGKα，以及具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:191所示氨基酸序列、不含DGKζ中天然存在的氨基酸(例如，His尾部或某些N末端氨基酸)的DGKζ。
如本文所用的靶蛋白，例如DGK、PD-1、PD-L1和CTLA4，是指人靶蛋白，除非另有明确说明或上下文另有明确说明。例如，“鼠DGK”是指DGK的鼠形式，因为它是专门指出的。
如本文所用，短语“化合物和/或其药学上可接受的盐”是指至少一种化合物、所述化合物的至少一种盐或其组合。例如，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐包括式(I)的化合物、两种式(I)的化合物、式(I)的化合物的药学上可接受的盐、式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种药学上可接受的盐、以及式(I)的化合物的两种或更多种药学上可接受的盐。
除非另外指示，否则具有不饱和化合价的任何原子均被假定为具有足以满足化合价的氢原子。
在说明书通篇中，本领域技术人员可选择基团和其取代基以提供稳定的部分和化合物。
根据本领域使用的惯例，在本文的结构式中使用
来描绘作为部分或取代基与核心或骨架结构的附接点的键。
如本文所用，术语“卤基”和“卤素”是指F、Cl、Br和I。
术语“氰基”是指基团-CN。
术语“氨基”是指基团-NH2。
术语“氧代基”是指基团＝O。
如本文所用，术语“烷基”是指含有例如从1至12个碳原子、从1至6个碳原子和从1至4个碳原子的支链和直链饱和脂族烃基二者。烷基的例子包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、2-乙基丁基、3-甲基戊基和4-甲基戊基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定基团可能含有的碳原子的数目。例如，“C1-4烷基”表示具有一至四个碳原子的直链和支链烷基。
如本文所用的术语“氟烷基”旨在包括被一个或多个氟原子取代的支链和直链饱和脂族烃基两者。例如，“C1-4氟烷基”旨在包括被一个或多个氟原子取代的C1、C2、C3和C4烷基。氟烷基的代表性例子包括但不限于-CF3和-CH2CF3。
术语“氰基烷基”包括被一个或多个氰基取代的支链和直链饱和烷基两者。例如，“氰基烷基”包括-CH2CN、-CH2CH2CN、和C1-4氰基烷基。
术语“氨基烷基”包括被一个或多个胺基团取代的支链和直链饱和烷基两者。例如，“氨基烷基”包括-CH2NH2、-CH2CH2NH2、以及C1-4氨基烷基。
术语“羟基烷基”包括被一个或多个羟基取代的支链和直链饱和烷基二者。例如，“羟基烷基”包括-CH2OH、-CH2CH2OH和C1-4羟基烷基。
术语“烯基”是指含有从2至12个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃自由基。示例性的此类基团包括乙烯基或烯丙基。例如，“C2-6烯基”表示具有二至六个碳原子的直链和支链烯基。
术语“炔基”是指含有从2至12个碳原子和至少一个碳至碳三键的直链或支链烃自由基。示例性的此类基团包括乙炔基。例如，“C2-6炔基”表示具有二至六个碳原子的直链和支链炔基。
如本文所用，术语“环烷基”是指通过从饱和环碳原子上除去一个氢原子而由非芳族单环或多环烃分子衍生的基团。环烷基的代表性例子包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定环烷基可能含有的碳原子的数目。例如，“C3-6环烷基”表示具有三至六个碳原子的环烷基。
如本文所用的术语“烷氧基”是指通过氧原子附接到母体分子部分的烷基，例如甲氧基(-OCH3)。例如，“C1-3烷氧基”表示具有一至三个碳原子的烷氧基。
术语“氟烷氧基”和“-O(氟烷基)”表示通过氧键(-O-)附接的如上文定义的氟烷基。例如，“C1-4氟烷氧基”旨在包括C1、C2、C3、和C4氟烷氧基。
术语“亚烷基(alkalenyl)”是指与核心或骨架结构具有两个附接点的饱和碳链。亚烷基具有结构-(CH2)n-，其中n是1或更大的整数。亚烷基连接的例子包括-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、和-(CH2)2-4-。
本文中采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理益处/风险比率的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
化合物，例如式(I)或式(II)的化合物，可以形成可用于本文所述方法的药学上可接受的盐。除非另有说明，否则提及一种化合物应理解为包括提及其一种或多种药学上可接受的盐。术语“一种或多种盐”表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式药学上可接受的盐。此外，术语“一种或多种盐”可以包括两性离子(内盐)，例如当式(I)的化合物含有碱性部分(如胺或吡啶或咪唑环)以及酸性部分(如羧酸)时。优选药学上可接受的(即无毒的，生理上可接受的)盐，例如像其中阳离子对盐的毒性或生物活性没有显著贡献的可接受的金属盐和胺盐。然而，其他盐可以例如用于可在制备期间采用的分离或纯化步骤中，并且因此在本文中考虑。化合物，例如式(I)的化合物的盐可以例如通过以下方式来形成：使化合物，例如式(I)的化合物与一定量的酸或碱(如当量的量)在介质(如所述盐在其中沉淀的介质)中或在水性介质中反应，随后冻干。
示例性酸加成盐包括乙酸盐(如与乙酸或三卤乙酸(例如三氟乙酸)形成的那些)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(与盐酸形成)、氢溴酸盐(与溴化氢形成)、氢碘化物、马来酸盐(与马来酸形成)、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐(与甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(如与硫酸形成的那些)、磺酸盐(如本文中提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate)(如甲苯磺酸盐(tosylate))、十一烷酸盐等。
示例性的碱式盐包括铵盐；碱金属盐，如钠盐、锂盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；钡盐、锌盐和铝盐；与有机碱(例如，有机胺)的盐，所述有机碱诸如三烷基胺(如三乙胺)、普鲁卡因、二苄胺、N-苄基-β-苯乙胺、1-二苯羟甲胺(ephenamine)、N,N'-二苄乙烯-二胺、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苄胺、二环己胺或类似的药学上可接受的胺；以及与氨基酸的盐，所述氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸等。碱性含氮基团可以用以下试剂季铵化：如低级烷基卤化物(例如，甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸盐(例如，二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸盐)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基的氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如，苄基和苯乙基的溴化物)以及其他试剂。优选的盐包括单盐酸盐、硫酸氢盐、甲磺酸盐、磷酸盐或硝酸盐。
化合物，例如式(I)的化合物可以作为无定形固体或结晶固体提供。可以采用冻干来提供呈固体的化合物，例如式(I)的化合物。
还应当理解，化合物例如式(I)的化合物的溶剂化物(例如水合物)也可以用于本文所述的方法中。术语“溶剂化物”是指化合物例如式(I)化合物与一个或多个溶剂分子(无论是有机的还是无机的)的物理缔合。此物理缔合包括氢键。在某些情况下，溶剂化物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子被掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离溶剂化物两者。示例性溶剂化物包括水合物、乙醇合物、甲醇合物、异丙醇合物、乙腈溶剂化物和乙酸乙酯溶剂化物。溶剂化方法是本领域已知的。
各种形式的前药是本领域熟知的，并且描述于：
a)The Practice of Medicinal Chemistry,Camille G.Wermuth等人,第31章,(Academic Press,1996)；
b)Design of Prodrugs,由H.Bundgaard编辑(Elsevier,1985)；
c)A Textbook of Drug Design and Development,P.Krogsgaard-Larson和H.Bundgaard编辑第5章,第113-191页(Harwood Academic Publishers,1991)；以及
d)Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism,Bernard Testa和JoachimM.Mayer,(Wiley-VCH,2003)。
此外，可以在化合物，例如式(I)的化合物制备之后将其分离并且纯化以获得含有按重量计等于或大于99％的量的化合物，例如式(I)的化合物(“基本上纯的”)的组合物，然后如本文所述使用或配制所述组合物。此类“基本上纯的”化合物，例如式(I)的化合物，也在本文中考虑。
“稳定的化合物”和“稳定的结构”意在指示化合物足够稳健以经受住从反应混合物中分离至有用程度的纯度并且配制成有效的治疗剂。用于本文的化合物旨在表现为稳定的化合物。
本文所述的化合物旨在包括在本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。通过一般举例且没有限制，氢的同位素包括氘(D)和氚(T)。碳的同位素包括13C和14C。同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的未经标记的试剂来制备。
VII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种治疗方法，所述方法包括：
(a)向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞；以及
(b)向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
2.根据实施方案1所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
3.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
4.一种拯救T细胞疗法的工程化T细胞免于耗竭的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
5.一种用于减少或延迟T细胞疗法的T细胞的T细胞耗竭发作的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后1至28天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后为或约1天、为或约2天、为或约3天、为或约4天、为或约5天、或为或约6天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，在来自所述受试者的生物样品中总重组受体表达T细胞的至少或至少约10％、至少或至少约20％、至少或至少约30％、至少或至少约40％、或至少或至少约50％具有耗竭表型。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中当为或约在所述受试者的血液中检测到或可检测到所述T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时，或者在所述受试者的血液中检测到或可检测到所述T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时的约一周内，开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
10.根据实施方案1-6和8-9中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后7至21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
11.根据实施方案1-6和8-10中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后7至14天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
12.根据实施方案1-6和8-11中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后为或约7天、为或约8天、为或约9天、为或约10天、为或约11天、为或约12天、为或约13天、或为或约14天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
13.根据实施方案1-6和8-10中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后15至21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
14.根据实施方案1-6、8-10和13中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后为或约15天、为或约16天、为或约17天、为或约18天、为或约19天、为或约20天、或为或约21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
15.根据实施方案1所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂的施用的开始与所述T细胞疗法的施用并行进行。
16.根据实施方案1所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之前开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
17.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞，其中，在开始施用所述T细胞疗法时，先前已经向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
18.根据实施方案16或实施方案17所述的方法，其中在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
19.根据实施方案16-18所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之前为或约1天或1天内、为或约2天或2天内、或为或约3天或3天内施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中，在施用所述T细胞疗法之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
21.根据实施方案18-20中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每日施用为约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2，包含端值的环磷酰胺，和/或为约20-40mg/m2，任选地为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为约500mg/m2的环磷酰胺。
22.根据实施方案18-21中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每日施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
23.根据实施方案18-22中任一项所述的方法，其中在所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天向所述受试者施用所述T细胞疗法。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα的抑制剂，而不是DGKζ的显著抑制剂。
25.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKζ的抑制剂，而不是DGKα的显著抑制剂。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα和DGKζ的抑制剂。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂不是其他DGK的显著抑制剂。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、
被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C3-4环烷基、C3-4氟环烷基、或-NO2；
R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、
-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3
个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零
至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、
-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、
-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、
被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；
每个R1a独立地是F、Cl、或-CN；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-2烷基、-CF3、环丙基、或-NO2；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、
-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
并且每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、
-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是-CN；
R2是-CH3；
R3是H、F或-CN；
R4是：
31.根据实施方案28所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
/>
/>
或者
32.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物：
或其盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、
-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、
-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、
-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、
-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、
-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、
-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、
-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、
-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、
-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、
-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、
-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
33.根据实施方案32所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3或-P(O)(CH3)2；
R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R4a和R4b独立地是：
(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、
-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟基烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、
-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、
-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、
-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、
-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、
-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、
-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、
-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、
-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rx独立地是H或-CH3；并且
m是1、2或3。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
R1是-CN；
R2是-CH3；
R5a是-CH3或-CH2CH3；并且
R5c是-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
35.根据实施方案32所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
/>
36.根据实施方案32所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效实现所述工程化T细胞的抗原特异性或抗原受体驱动活性增加的量、时间、持续时间和/或频率施用。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效预防、抑制或延迟所述工程化T细胞中耗竭表型发作的量、时间、持续时间和/或频率施用。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效地至少部分逆转所述工程化T细胞中耗竭表型的量、时间、持续时间和/或频率施用。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述表达所述重组受体的工程化T细胞的耗竭水平是通过测量所述表达所述重组受体的工程化T细胞的细胞表面上的一种或多种耗竭标记的水平来确定的。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以从或从约0.25mg至约250mg的量施用。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以从或从约0.5mg至约100mg的量施用。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述重组受体是工程化T细胞受体(eTCR)。
44.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述重组受体结合靶抗原，所述靶抗原与疾病或病症相关，为疾病或病症所特有，和/或在疾病或病症的细胞或组织上表达。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病、或者感染性疾病。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是为B细胞恶性肿瘤的癌症。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
50.根据实施方案47-49中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
51.根据实施方案47-49中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液(液体)肿瘤。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1x105至1x109个总重组受体表达T细胞，包含端值。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1x105至5x108个总重组受体表达T细胞、1x106至2.5x108个总重组受体表达T细胞、5x106至1x108个总重组受体表达T细胞、1x107至2.5x108个总重组受体表达T细胞、或5x107至1x108个总重组受体表达T细胞，每个均包含端值。
54.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1.5x107至6x108个总重组受体表达T细胞、1.5x108至6x108个总重组受体表达T细胞、或1.5x108至4.5x108个总重组受体表达T细胞，每个均包含端值。
55.根据实施方案1-54中任一项所述的方法，其中将所述T细胞疗法的细胞剂量肠胃外施用，任选地静脉内施用。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法包括从所述受试者获得的原代T细胞。
57.根据实施方案1-56中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是自体的。
58.根据实施方案1-56中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是同种异体的。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法包括为CD4+或CD8+的T细胞。
60.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法包括为CD4+和CD8+的T细胞。
61.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用检查点拮抗剂。
62.根据实施方案61所述的方法，其中所述检查点拮抗剂是PD1/PD-L1轴拮抗剂。
63.根据实施方案61所述的方法，其中所述检查点拮抗剂是CTLA4拮抗剂。
64.根据实施方案1-61中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
65.根据实施方案62或实施方案64所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD1拮抗剂。
66.根据实施方案65所述的方法，其中所述人PD-1拮抗剂是纳武单抗、派姆单抗或本文所述的任何其他PD-1拮抗剂。
67.根据实施方案65或实施方案66所述的方法，其中所述人PD-1拮抗剂是纳武单抗或其变体。
68.根据实施方案62或实施方案64所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD-L1拮抗剂。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述人PD-L1拮抗剂是阿替利珠单抗或本文所述的任何其他PD-L1拮抗剂。
70.根据实施方案63或实施方案64所述的方法，其中所述CTLA4拮抗剂是人CTLA4拮抗剂。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述人CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或本文所述的任何其他CTLA4拮抗剂。
72.根据实施方案70或实施方案71所述的方法，其中所述人CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或其变体，任选地相对于伊匹单抗具有降低的毒性的变体。
73.根据实施方案61-72中任一项所述的方法，其中在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂的同一天开始施用所述检查点拮抗剂。
74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂施用长达三个月的时间段。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂施用长达六个月的时间段。
76.根据实施方案74或实施方案75所述的方法，其中如果在所述时间段结束时，所述受试者在所述治疗后展现出完全反应(CR)，或者所述癌症在所述治疗后进展或缓解后复发，则停用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂。
VIII.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1：DGK抑制剂的合成
DGKi化合物1
4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
DGKi化合物2
1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯
/>
DGKi化合物3
(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
DGKi化合物4
(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
DGKi化合物5
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
DGKi化合物6和7
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
DGKi化合物8
4-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-6-甲氧基-1-甲基-1,2-二氢-1,5-萘啶-2-酮
DGKi化合物9
8-[(2S,5R)-4-{[2-(二氟甲基)-4-氟苯基]甲基}-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
DGKi化合物10
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
DGKi化合物11
8-[(2S,5R)-4-[1-(2,6-二氟苯基)乙基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
DGKi化合物12-14
8-((2S,5R)-4-(1-(2,4-二氟苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
中间体1
6-氰基-3-(N-甲基乙酰胺基)吡啶甲酸乙酯
在室温下向3-(N-甲基乙酰胺基)-1-(l1-氧烷基)-1l4-吡啶-2-甲酸乙酯(50g，210mmol)在DCM(500mL)中的搅拌的淡黄色溶液中添加三甲基甲硅烷基氰化物(39.4mL，294mmol)。将反应混合物搅拌10min并且将混合物冷却至-10℃。接下来，经15min通过50mL加料漏斗添加苯甲酰氯(34.1mL，294mmol)，然后经20min通过50mL加料漏斗缓慢添加TEA(41.0mL，294mmol)。在TEA添加期间观察到放热反应。反应混合物变成混浊混合物(TEA盐)，将其在相同温度下搅拌2.5h。将反应用10％NaHCO3溶液(500mL)淬灭并用DCM(3x300mL)萃取。将合并的有机溶液用盐水(2x250mL)洗涤，然后经Na2SO4干燥并浓缩，以得到浅黄色粗材料。将粗材料通过正相RediSep硅胶柱在上使用EA/石油醚作为洗脱剂进行纯化。将产物通过65％-70％EA/石油醚分离，将级分浓缩，以得到呈淡棕色液体的6-氰基-3-(N-甲基乙酰胺基)吡啶甲酸乙酯(43g，83％产率)；LCMS：m/z＝248.0(M+H)；rt 1.255min；LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75X 3mm-2.6μm)；流动相A：水:乙腈(98:2)(含10mM甲酸铵)；流动相B：水:乙腈(2:98)(含10mM甲酸铵)；梯度：经4分钟20％-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100％-20％B，流速1.5mL/min。
中间体2
8-羟基-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
在-78℃下经10min向6-氰基-3-(N-甲基乙酰胺基)吡啶甲酸乙酯(0.9g，3.64mmol)在四氢呋喃(10mL)中的搅拌溶液中添加KHMDS(4.80mL，4.37mmol)。将反应混合物搅拌15min。经30min将反应混合物缓慢升温至室温，然后再搅拌90min。将反应混合物冷却至0℃。将反应用饱和碳酸氢钠溶液(70mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯(2x100mL)稀释。收集水层并将其用1.5N HCL酸化以将pH调节至约3.0。将混合物搅拌15min以形成固体物质，将其通过布氏漏斗过滤，以得到呈棕色固体的8-羟基-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(550mg，75％产率)。LCMS：m/z＝202.0(M+H)；rt 0.361min；LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75X 3mm-2.6μm)；流动相A：水:乙腈(98:2)(含10mM甲酸铵)；流动相B：水:乙腈(2:98)(含10mM甲酸铵)；梯度：经4分钟20％-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100％-20％B，流速1.5mL/min。
中间体3
8-氯-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
向8-羟基-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(0.55g，2.73mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加POCl3(1.53mL，16.4mmol)。将反应混合物经5min加热至85℃并搅拌16h。将反应混合物在减压下浓缩以得到粗材料。将反应混合物冷却至0℃。将反应用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)淬灭。将反应用DCM(3x100mL)稀释。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下蒸发，以得到呈棕色固体的8-氯-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(0.25g，29.1％产率)。LCMS：m/z＝220.2(M+H)；rt 1.528min；LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75X 3mm-2.6μm)；流动相A：水:乙腈(98:2)(含10mM甲酸铵)；流动相B：水:乙腈(2:98)(含10mM甲酸铵)；梯度：经4分钟20％-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100％-20％B，流速1.5mL/min。
中间体4
立体化学：A
(氰基甲基)三甲基碘化鏻
(氰基甲基)三甲基碘化鏻根据Zaragoza,F.等人，J.Org.Chem.2001,66,2518-2521中描述的通用方法制备。在1L圆底烧瓶中，将在甲苯中的三甲基磷烷(100mL，100mmol)用THF(50.0mL)和甲苯(50.0mL)稀释，并且在冰浴上冷却。将反应混合物剧烈搅拌，同时逐滴添加碘乙腈(7mL，16.7g，68.3mmol)，以产生棕褐色沉淀物。移除冷却浴并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将烧瓶置于超声发生器中以破碎任何结块的固体。将反应混合物再搅拌4小时。将固体通过过滤收集并且在真空下干燥，以得到(氰基甲基)三甲基碘化鏻(16.6g，68.3mmol，68.3％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.03(d,J＝16.4Hz,2H),2.05(d,J＝15.4Hz,9H)。
中间体5
立体化学：同手性
8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈TFA盐
向6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(65g，195mmol)和(2R,5S)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(43.9g，205mmol)在乙腈(1.3L)中的溶液中添加DIPEA(0.102L，585mmol)。将溶液在80℃下搅拌6小时。去除溶剂，并且将粗残余物在硅胶上进行色谱分析(在100％乙酸乙酯中的产物Rf 0.4)。获得产物(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75g，189mmol，97％产率)。LCMS：m/z＝398.2(M+H)；rt 2.7min。方法：柱-Kinetex XB-C18(75X3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵)。
在0℃下向(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30g，75mmol)在乙酸乙酯(1000mL)中的溶液中添加HCl(在二噁烷中的4M)(189mL，755mmol)，并且使温度达到室温，同时搅拌6h。LC/MS分析显示在0.60RT处约90％产物物质，连同在0.44RT处约4％的酰胺副产物物质(与腈水解一致)。将反应混合物用甲基叔丁基醚(MTBE，2000mL)稀释，搅拌15min，并且将产物的HCl盐过滤，用MTBE(100ml)洗涤。将HCl盐溶解于水(300ml)中并且使用10％碳酸氢钠水溶液将pH调节至约8。将有机部分用DCM(5x250ml)萃取。将合并的有机层用水(2x300mL)洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩，以得到8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(20g，65.2mmol，86％产率)。LCMS：m/z＝298.2(M+H)；rt 0.5min。方法：柱-KinetexXB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.70(d,J＝12,3.2Hz,1H),6.29(s,1H),3.80(dd,J＝8.8Hz,1H)3.70(m,1H),3.65(s,3H),3.29(m,2H),2.80(m,2H),1.19(d,J＝6Hz,3H),1.15(d,J＝6Hz,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ161.9,155.0,138.5,137.0,128.2,125.0,122.2,117.2,111.3,56.5,51.9,50.0,49.5,29.0,18.8,15.4。
中间体6
8-氯-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
在含有8-羟基-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(192mg，0.780mmol)的2打兰小瓶中添加磁力搅拌棒和乙腈(3.1mL)。接下来，将DIEA(0.272mL，1.560mmol)添加到悬浮液中。将反应混合物搅拌1-2分钟直到反应混合物变为均匀的黄色溶液。向反应混合物中添加三氯氧磷(0.131mL，1.404mmol)。将小瓶在氮下加盖，并且通向油起泡器。将反应混合物在室温搅拌1.5小时，然后将苄基三乙基氯化铵(200mg，0.878mmol)添加到反应混合物中。将小瓶在氮气氛下加盖，并且浸入油浴(65℃)中并且加热1小时。将反应混合物冷却，并且使用旋转蒸发器在真空中除去反应挥发物。反应残余物溶解在乙酸乙酯中，倒入含有冰(约10mL)的烧杯中，并且然后转移到分液漏斗中。将水相用乙酸乙酯萃取。将有机萃取物合并，并且顺序地用1.5M K2HPO4、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。将有机萃取物经硫酸镁干燥，过滤，并且在真空中除去溶剂以得到204mg棕色结晶固体。LCMS：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水，含0.05％三氟乙酸；流动相B：100％乙腈，含0.05％三氟乙酸；温度：40℃；梯度：经1.5分钟2％-98％B，然后在98％B下保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。保留时间＝1.01min.；观察到的加合物：[M+H]；观察到的质量：265.0(弱离子化)。1H NMR(氯仿-d)δ8.03(d,J＝8.8Hz,1H),7.89-7.97(m,1H),3.82(s,3H)。
中间体7
8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈TFA盐
向6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(65g，195mmol)和(2R,5S)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(43.9g，205mmol)在乙腈(1.3L)中的溶液中添加DIPEA(0.102L，585mmol)。将溶液在80℃下搅拌6小时。去除溶剂，并且将粗残余物在硅胶上进行色谱分析(在100％乙酸乙酯中的产物Rf 0.4)。获得产物(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75g，189mmol，97％产率)。LCMS：m/z＝398.2(M+H)；rt 2.7min。方法：柱-Kinetex XB-C18(75X3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵)。
在0℃下向(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30g，75mmol)在乙酸乙酯(1000mL)中的溶液中添加HCl(在二噁烷中的4M)(189mL，755mmol)，并且使温度达到室温，同时搅拌6h。LC/MS分析显示在0.60RT处约90％产物物质，连同在0.44RT处约4％的酰胺副产物物质(与腈水解一致)。将反应混合物用甲基叔丁基醚(MTBE，2000mL)稀释，搅拌15min，并且将产物的HCl盐过滤，用MTBE(100ml)洗涤。将HCl盐溶解于水(300ml)中并且使用10％碳酸氢钠水溶液将pH调节至约8。将有机部分用DCM(5x250mL)萃取。将合并的有机层用水(2x300mL)洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩，以得到8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(20g，65.2mmol，86％产率)。LCMS：m/z＝298.2(M+H)；rt 0.5min。方法：柱-KinetexXB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.70(d,J＝12,3.2Hz,1H),6.29(s,1H),3.80(dd,J＝8.8Hz,1H)3.70(m,1H),3.65(s,3H),3.29(m,2H),2.80(m,2H),1.19(d,J＝6Hz,3H),1.15(d,J＝6Hz,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ161.9,155.0,138.5,137.0,128.2,125.0,122.2,117.2,111.3,56.5,51.9,50.0,49.5,29.0,18.8,15.4。立体化学：同手性。
合成DGKi化合物1的方法
4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
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向6-溴-3-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(80mg，0.194mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.102mL，0.582mmol)和(2S,5R)-1-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪的HCl盐(75mg，0.214mmol)。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将残余物溶解在乙酸乙酯(15mL)中。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将粗残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用24g快速柱，用石油醚中的50％-80％EtOAc洗脱。将级分在减压下浓缩，以得到4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈(95mg，85％产率)；LCMS：m/z＝578.2(M+H)；rt 3.916min。
合成DGKi化合物2的方法
1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯
在氮气氛下向8-氯-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(22.90mg，0.104mmol)在DMA(1mL)和叔丁醇(4mL)中的搅拌溶液中添加1-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-2-甲酸甲酯的TFA盐(40mg，0.087mmol)和碳酸铯(85mg，0.261mmol)，然后添加氯(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)(3.37mg，4.34μmol)。将反应容器浸入70℃的油浴中。将浴温经2min升至90℃并且将反应混合物搅拌16h。将反应混合物通过硅藻土床过滤并且在高真空下浓缩，以产生棕色胶状物。将粗材料用以下条件经由制备型HPLC纯化：柱：Sunfire C18，19x150mm，5μm颗粒；流动相A：含乙酸的10mM乙酸铵pH 4.5；流动相B：乙腈；梯度：经15分钟30％-100％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：17mL/min。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯(3.5mg，6.23μmol，7.17％产率)。LCMS：m/z＝530.2(M+H)；rt 2.20min。LC-MS方法：柱-XBridge BEH XP C18(50x2.1mm 2.5μm)；流速1.1mL/min；梯度时间3min；温度：50℃，0％溶剂B至100％溶剂B；在220nm处监测(溶剂A：95％水:5％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：5％水:95％乙腈；10mM甲酸铵)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.16(d,J＝8.8Hz,1H),8.08(d,J＝9.0Hz,1H),7.57(dd,J＝8.8,5.6Hz,2H),7.42-7.28(m,2H),7.22-7.08(m,4H),6.14(s,1H),5.17(s,1H),4.78(d,J＝12.2Hz,1H),3.64(d,J＝12.0Hz,1H),3.59(s,3H),3.54(s,3H),3.45-3.35(m,2H),3.15(dd,J＝12.5,3.9Hz,1H),3.04(td,J＝11.7,2.9Hz,1H),2.71-2.63(m,1H)。
合成DGKi化合物3的方法
(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
向6-溴-3-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(100mg，0.243mmol)在乙腈(8mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.127mL，0.728mmol)和(R)-1-(双(4-氟苯基)甲基)-2-甲基哌嗪的HCl盐(82mg，0.243mmol)。将反应混合物经5min加热至85℃并搅拌1h。在高真空下浓缩反应混合物，以得到棕色胶状物。将粗化合物使用12g硅胶柱通过(60％-67％乙酸乙酯/石油醚)纯化以得到呈棕色胶状物的(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈(90mg，42.7％产率)；LCMS：m/z＝566.0(M+2H)；rt 2.23min。LC-MS方法：柱-AQUITY UPLC BEH C18(3.0x50mm)1.7μm；流动相A：缓冲液:乙腈(95:5)；流动相B：缓冲液:乙腈(5:95)，缓冲液：10mM乙酸铵；梯度：经2.0分钟20％-100％B，然后在100％B下保持0.2分钟，流速0.7mL/min。
合成DGKi化合物4的方法
(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
在氮下向(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈(90mg，0.159mmol)在NMP(5mL)中的搅拌溶液中添加锌(2.085mg，0.032mmol)和氰化锌(37.4mg，0.319mmol)。继续用氮吹扫3min并且添加dppf(5.30mg，9.57μmol)和Pd2(dba)3(14.6mg，0.016mmol)。将反应混合物经5min加热至80℃并搅拌4h。将反应混合物通过硅藻土床过滤并且在高真空下浓缩，以得到棕色胶状物。将粗材料通过制备型HPLC纯化。HPLC方法：柱-SUNFIRE C18(150mm x19mm ID，5μm)；流动相A：含10mM乙酸铵的水；流动相B：乙腈；梯度：经3.0分钟40％-60％B，流速17mL/min，然后在60％-100％B下保持17分钟，流速17mL/min。将含有产物的级分合并并且在高真空下浓缩。然后将样品用(EtOH\H2O，1:3)稀释并且冻干过夜，以得到呈淡黄色固体的(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈(50mg，61.4％产率)。LCMS：m/z＝511.2(M+H)；rt 3.520min。LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75x3mm-2.6μ)；流动相A：水:乙腈(98:2)(含10mM甲酸铵)；流动相B：水:乙腈(2:98)(含10mM甲酸铵)；梯度：经4分钟20％-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100％-20％B，流速1.5mL/min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.26(d,J＝8.8Hz,1H),8.15(d,J＝9.0Hz,1H),7.56(dd,J＝11.9,8.7Hz,2H),7.57(dd,J＝11.7,8.8Hz,2H),7.16(t,J＝8.9Hz,4H),4.90(s,1H),4.10(d,J＝13.0Hz,1H),4.01(d,J＝12.5Hz,1H),3.86(dd,J＝12.2,2.9Hz,1H),3.66-3.55(m,1H),3.53(s,3H),3.08-2.97(m,1H),2.97-2.90(m,1H),2.90(s,1H),1.03(d,J＝6.6Hz,3H)。
合成DGKi化合物5的方法
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
在2打兰密封反应容器中，将8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈TFA盐(41.1mg，100μmol)、(4-氟苯基)(苯基)甲醇(28.3mg，140μmol)和(氰基甲基)三甲基碘化鏻(48.6mg，200μmol)在乙腈(200μl)中合并。添加Hunig碱(75μL，429μmol)，并且将反应混合物在110℃下加热2小时。将反应混合物直接注射到12g硅胶柱上并且用在己烷中的20％-100％乙酸乙酯洗脱，以得到呈非对映异构体混合物的实施例182。分析LC\MS条件：注射体积＝3μL，开始％B 0，最终％B100，梯度时间2min，流速1mL/min，波长220nm，溶剂对乙腈/水/TFA，溶剂A10％乙腈、90％水/0.05％TFA，溶剂B10％水、90％乙腈/0.05％TFA，柱Acquity BEH C18 2.1X 50mm 1.7μm，烘箱温度＝40℃。LC\MS结果；保留时间1.4分钟，观察到的质量482.5(M+)。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在47％B下保持0分钟，经20分钟47％-87％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到14.4mg标题化合物(30％产率)。计算的分子量481.575。LC\MS条件QC-ACN-TFA-XB：观察到的MS离子482.2，保留时间1.6分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.18-8.10(m,1H),8.06(d,J＝8.8Hz,1H),7.68-7.48(m,4H),7.39-7.26(m,2H),7.25-7.08(m,3H),6.00(s,1H),4.67(br s,1H),4.59(br d,J＝6.7Hz,1H),3.76-3.62(m,1H),3.55(br d,J＝12.8Hz,1H),3.15-3.04(m,1H),2.90-2.81(m,1H),2.36(br dd,J＝17.4,11.9Hz,1H),1.35-1.28(m,3H),1.24(s,1H),1.07(br t,J＝5.6Hz,3H)。
合成DGKi化合物6和7的方法
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
使用手性固相色谱法将实施例5分离成单独的非对映异构体：柱：Chiralpak OJ-H，21x250mm；5微米，流动相：90％CO2/10％甲醇，流速条件：45mL/min，检测器波长：225nm，注射详情：500μL，15mg溶解于1mL甲醇/乙腈中。
第一种洗脱的非对映异构体，实施例6(66.4mg)，以20.2％产率被分离。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.1；保留时间：2.49min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.11；保留时间：1.75min。
第二种洗脱的非对映异构体，实施例7(71.7mg)，以21.9％产率被分离。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.11；保留时间：2.51min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.1；保留时间：1.76min。
合成DGKi化合物8的方法
4-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-6-甲氧基-1-甲基-1,2-二氢-1,5-萘啶-2-酮
将4-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-甲氧基-1-甲基-1,5-萘啶-2(1H)-酮(50mg，0.165mmol)和1-(溴(4-氯苯基)甲基)-4-氟苯(49.5mg，0.165mmol)与二异丙基乙胺(0.173mL，0.992mmol)在乙腈(3mL)中合并，并且将反应混合物在55℃下加热过夜。LC/MS指示反应完成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在42％B下保持0分钟，经25分钟42％-82％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。计算的分子量521.03。LC\MS条件QC-ACN-AA-XB：观察到的MS离子521.1，保留时间2.77分钟。
合成DGKi化合物9的方法
8-[(2S,5R)-4-{[2-(二氟甲基)-4-氟苯基]甲基}-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
向8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(30mg，0.081mmol)的DMF(2mL)溶液中添加2-(二氟甲基)-4-氟苯甲醛(16.86mg，0.097mmol)。将溶液在室温下搅拌1小时。添加氰基硼氢化钠(15.22mg，0.242mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。LC/MS分析指示反应完成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在55％B下保持0分钟，经20分钟31％-95％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量是13.0mg，并且通过LCMS分析估计的纯度是100％。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridgeC18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：456.08；保留时间：1.39min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：456.07；保留时间：2.22min。％B经3min，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：456.07；保留时间：2.22min。
合成DGKi化合物10的方法
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
向8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈TFA盐(68.6mg，60％wt.，0.1mmol)、(氰基甲基)三甲基碘化鏻(48.6mg，0.200mmol)和(4-氟苯基)(对甲苯基)甲醇(26.0mg，0.120mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(0.105mL，0.600mmol)。将反应混合物在110℃下搅拌2小时，然后第二次添加(氰基甲基)三甲基碘化鏻(48.6mg，0.200mmol)、(4-氟苯基)(对甲苯基)甲醇(26.0mg，0.120mmol)和Hunig碱(0.058mL，0.300mmol)。将反应混合物在110℃下再搅拌2小时。将粗反应混合物直接注射到12g Si-RediSep Rf上，通过己烷中的20％-100％乙酸乙酯进行快速色谱法。合并含有产物的级分并且通过真空干燥。将所得粗材料进一步用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；梯度：在20％B下保持0分钟，经25分钟20％-60％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。非对映异构体产物TFA盐的产量为47.1mg。
将非对映异构体产物用以下条件通过SFC-手性色谱法拆分为两种非对映异构体：柱：手性AD，30x250mm，5微米颗粒；流动相：80％CO2/20％IPA(含0.1％DEA)；流速：100mL/min；柱温：25℃。将标题化合物作为第2洗脱峰收集，>91％de。计算的分子量495.602。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：97.6％；观察到的质量：496.26；保留时间：2.52min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：98.2％；观察到的质量：496.28；保留时间：1.73min。
合成DGKi化合物11的方法
8-[(2S,5R)-4-[1-(2,6-二氟苯基)乙基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
向2-(1-溴乙基)-1,3-二氟苯(15.12mg，0.065mmol)和5-甲基-6-氧代-8-(哌嗪-1-基)-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈TFA盐(34.0mg，60％wt.，0.05mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(0.052mL，0.300mmol)。将混合物在55℃下搅拌2小时。LCMS指示完全转化为产物。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在37％B下保持0分钟，经20分钟37％-77％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为12.1mg。计算的分子量437.495。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：438.14；保留时间：2.36min。注射2条件：柱：Waters XBridgeC18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：438.14；保留时间：1.2min。
合成DGKi化合物12-14的方法
8-((2S,5R)-4-(1-(2,4-二氟苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
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向8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(29.7mg，0.1mmol)和1-(1-溴丙基)-2,4-二氟苯(25.9mg，0.110mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(87μL，0.500mmol)。将混合物在55℃的热板上搅拌16小时。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；梯度：在3％B下保持0分钟，经25分钟3％-43％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。立体化学：非对映异构体混合物。
DGKi化合物12合成的非对映异构体混合物通过使用SFC-手性色谱法用以下条件下进一步分离以拆分两种同手性非对映异构体：柱：手性OD，30x250mm，5微米颗粒；流动相：15％IPA/85％CO 2(含0.1％DEA)；流速：100mL/min；检测器波长：220nm。
将DGKi化合物13为第一个洗脱峰收集，95％de。立体化学：同手性。
将DGKi化合物14(异构体2)作为第二个洗脱峰收集，95％de。立体化学：同手性。
合成DGKi化合物15的方法
8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
将DMF用氮鼓泡1小时。在1打兰小瓶中装入锌(0.95mg，0.015mmol)、溴(三叔丁基膦)钯(I)二聚体(9.96mg，0.013mmol)和4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-3-硝基-1,5-萘啶-2(1H)-酮(21.38mg，0.037mmol)。添加经鼓泡的DMF(0.3mL)并且将混合物在氮下加盖并且浸入50℃油浴中15分钟。添加二氰基锌(2.86mg，0.024mmol)。将反应混合物在氮下加盖并且浸入50℃油浴中3小时。LC/MS分析指示反应完成。将粗材料用以下条件通过制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，19x200mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：经15分钟50％-90％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/分钟。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。分离出标题化合物(11.4mg)，产率为59.7％。
替代性合成：将8-氯-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(750mg，2.83mmol)的DMF(6mL)溶液与1-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪(899mg，3.12mmol)组合，然后添加Hunig碱(0.990mL，5.67mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。LC/MS分析表明反应完成。将粗材料过滤并且通过制备型HPLC使用含乙酸铵的乙腈水溶液作为缓冲液进行纯化以得到1.02g黄色固体。使用两次分析型LC/MS注射以确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流速：1.0mL/分钟；检测：在220nm下的UV。注射2条件：柱：WatersAcquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流速：1.0mL/分钟；检测：在220nm下的UV。注射1结果：纯度：100％；观察到的质量：517.0；保留时间：2.4分钟。注射2结果：纯度：98.4％；观察到的质量：517.0；保留时间：1.7分钟。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.9Hz,1H),7.40(dd,J＝8.5,5.5Hz,4H),7.02(t,J＝8.7Hz,4H),4.34(s,1H),3.68(s,3H),3.62-3.55(m,4H),2.64(br s,4H)。13C NMR(126MHz,氯仿-d)δ163.0,161.0,155.4,147.0,138.0,137.7,137.7,135.9,132.4,129.5,129.2,129.2,126.0,123.1,116.5,115.8,115.6,74.3,51.6,51.2,29.7。
合成DGKi化合物16的方法
8-[(2S,5R)-4-[双(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
向(氰基甲基)三甲基碘化鏻(46.2mg，0.19mmol)、二对甲苯基甲醇(23.46mg，0.108mmol)和8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈TFA盐(72.4mg，54％wt，0.095mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(0.10mL，0.57mmol)。将反应混合物在110℃下搅拌2小时。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在55％B下保持0分钟，经20分钟55％-95％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为23.4mg。计算的分子量491.639。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mmx50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.75min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：492.21；保留时间：2.77min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.75min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：492.2；保留时间：1.71min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.15(d,J＝8.5Hz,1H),8.04-8.09(m,1H),7.81(s,4H),7.57-7.63(m,2H),7.12-7.19(m,2H),6.00(s,1H),4.82(s,1H),4.52-4.63(m,1H),3.64-3.76(m,1H),3.51-3.58(m,4H),2.99-3.10(m,1H),2.86(br d,J＝8.5Hz,1H),2.28-2.37(m,1H),1.31(d,J＝6.5Hz,3H),1.07(d,J＝6.5Hz,3H)。13CNMR(100.66MHz,DMSO-d6)δppm 162.4,160.9,159.9,153.5,148.0,138.7,138.6,135.0,132.6,129.3(d,J＝8.0Hz),128.8(d,J＝10.0Hz),124.0,122.8,118.6,117.5,115.6,115.4,109.8,104.8,69.0,51.8,49.4,48.9,47.2,28.6,13.4,7.4。
DGKi化合物17和18
4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
向4-((2S,5R)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈TFA盐(0.12g，0.27mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.14mL，0.82mmol)、1-(1-氯丙基)-4-(三氟甲基)苯(0.12g，0.55mmol)和碘化钠(0.04g，0.27mmol)。将反应混合物在85℃下加热16h。将反应混合物冷却至室温并且将溶剂在减压下去除，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化[HPLC方法：柱：Sunfire C18，150x19mmID，5μm；流动相A：在水中的10mM乙酸铵；流动相B：乙腈；梯度：经18分钟0-100％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：17mL/min]。将级分在减压下浓缩并且从EtOH/H2O(1:5)中冻干，获得化合物17和18。
化合物17：(10mg，7％产率)；LCMS：m/z＝513.3(M+H)；rt 2.52min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1)mm，2.5μm流动相A：95％水:5％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,J＝6.6Hz,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(d,J＝7.1Hz,2H),5.83-5.48(m,1H),4.98-4.86(m,1H),3.64(br.s.,1H),3.43(s,3H),3.08(d,J＝9.8Hz,1H),2.93-2.82(m,2H),2.42-2.26(m,1H),2.13-2.08(m,1H),1.98-1.82(m,3H),1.66-1.54(m,1H),1.44-1.31(m,1H),0.98-0.91(br.s.,3H),0.69-0.53(m,6H)。
化合物18：(3mg，2％产率)；LCMS：m/z＝513.3(M+H)；rt 2.54min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1)mm，2.5μm流动相A：95％水:5％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.28-8.19(m,1H),8.01-7.95(m,1H),7.72(d,J＝7.8Hz,2H),7.58(d,J＝8.6Hz,2H),6.06-5.28(m,1H),5.08-4.76(m,1H),3.64-3.50(m,2H),3.43(s,3H),3.16-3.08(m,1H),2.25-2.14(m,2H),2.00-1.83(m,3H),1.57-1.53(m,3H),1.03-0.89(m,3H),0.65-0.54(m,6H)。
DGKi化合物19和20
4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
在室温下向4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈TFA盐(70mg，0.22mmol)在乙腈(2mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.12mL，0.67mmol)、1-(1-氯乙基)-4-(三氟甲基)苯(93mg，0.45mmol)、碘化钠(33.6mg，0.22mmol)并且在85℃下加热16h。将反应混合物冷却至室温并且将溶剂在减压下去除，将残余物溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化[HPLC方法：柱：Sunfire C18(150mm x19.2mm ID，5μm)，流动相A＝在水中的10mM乙酸铵，流动相B＝乙腈，流速：19mL/min]，将级分在减压下浓缩，用EtOH/H2O(1:5)稀释并且冻干，以得到化合物19和20。
化合物19：(9mg，8％产率)；LCMS：m/z＝485.1(M+H)；rt 2.34min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1mm)mm，2.5μm流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-3；％B：0-100。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.32-8.17(m,1H),8.05-7.94(m,1H),7.76-7.66(m,2H),7.66-7.55(m,2H),6.11-5.42(m,1H),5.10-4.79(m,1H),3.78-3.59(m,2H),3.44(s,3H),3.17-3.05(m,1H),2.64-2.55(m,1H),2.26-2.09(m,1H),1.65-1.34(m,3H),1.31-1.16(m,5H),1.01(br t,J＝7.1Hz,3H)。
化合物20：(9mg，8％产率)；LCMS：m/z＝485.1(M+H)；rt 2.29min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1mm)mm，2.5μm流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-3；％B：0-100。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.24(br d,J＝8.6Hz,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.3Hz,2H),7.61(br d,J＝8.3Hz,2H),5.87-5.63(m,1H),5.10-4.79(m,1H),3.90-3.80(m,1H),3.44(s,3H),3.46-3.15(m,1H),2.89-2.73(m,2H),2.41-2.34(m,1H),1.63-1.34(m,5H),1.29(br d,J＝6.1Hz,3H),0.79-0.64(m,3H)。
DGKi化合物21和22
4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
向4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈TFA盐(0.5g，1.17mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(1.02mL，5.86mmol)，然后添加2-(溴(4-氟苯基)甲基)-5-(三氟甲基)吡啶(0.78mg，2.35mmol)。将反应混合物在80℃下加热3小时。将反应混合物冷却至室温且将溶剂在减压下去除，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：INERTSIL ODS21.2X250mm，5μm；流动相A：在水中的0.1％TFA；流动相B：乙腈；梯度：经14分钟30％-80％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：17mL/min)，将级分在减压下浓缩并且从(EtOH/H2O，1:5)中冻干，以得到化合物21和化合物22。
化合物21：140mg，21％产率；LCMS：m/z＝566.2(M+H)；rt 3.26min；(LCMS方法：柱；柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.83(br s,1H),8.19-8.31(m,2H),7.95-8.12(m,2H),7.53-7.63(m,2H),7.12-7.26(m,2H),5.41-6.26(m,1H),4.79-5.20(m,2H),3.60-3.74(m,1H),3.44(s,3H),2.73-2.87(m,1H),2.22-2.42(m,2H),1.40-1.68(m,5H),0.53-0.71(m,3H)。
化合物22：155mg，23％产率；LCMS：m/z＝566.2(M+H)；rt 3.25min；(LCMS方法：柱；柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.92(s,1H),8.17-8.27(m,2H),7.90-8.02(m,2H),7.60-7.67(m,2H),7.14-7.22(m,2H),5.52-6.07(m,1H),4.87-5.08(m,2H),3.39-3.71(m,4H),2.69-2.78(m,1H),2.37-2.45(m,1H),1.37-1.69(m,5H),0.58-0.77(m,3H)。
DGKi化合物23-24
(4-((2S,5R)-4-((4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
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向4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(100mg，0.32mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.3mL，1.60mmol)，然后添加2-(溴(4-氯苯基)甲基)吡啶(181mg，0.64mmol)。将反应混合物在80℃下加热3h。将反应混合物冷却至室温并且将溶剂在减压下去除，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：Cellulose-5(250*20ID)5微米；流动相A：在IPA中的0.1％DEA；流动相B：在ACN中的0.1％DEA；梯度：90％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：18mL/min)，将级分在减压下浓缩并且从(EtOH/H2O，1:5)中冻干，以得到化合物23和化合物24。
化合物23：24mg，14％产率；LCMS：m/z＝514.2(M+H)；rt 2.94min；(LCMS方法：柱；柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.52(d,J＝4.5Hz,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.96-8.02(m,1H),7.75-7.81(m,1H),7.59-7.68(m,3H),7.39(d,J＝8.5Hz,2H),7.22-7.29(m,1H),5.54-5.95(m,1H),4.81-5.07(m,2H),3.39-3.68(m,5H),2.69-2.76(m,1H),2.35-2.44(m,1H),1.37-1.67(m,5H),0.58-0.67(m,3H)。
化合物24：22mg，13％产率；LCMS：m/z＝514.2(M+H)；rt 2.94min；(LCMS方法：柱；柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.41-8.45(m,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.96-8.02(m,1H),7.78-7.85(m,2H),7.53-7.61(m,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.20-7.26(m,1H),5.52-5.97(m,1H),4.87-5.04(m,1H),4.78-4.86(m,1H),3.37-3.71(m,4H),2.72-2.78(m,1H),2.54-2.63(m,1H),2.35-2.46(m,1H),1.40-1.64(m,5H),0.58-0.70(m,3H)。
DGKi化合物25和26
4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
在室温下向2-((2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-2-(4-氟苯基)乙酸(0.045g，0.09mmol)、N-羟基环丙烷甲脒(9.4mg，0.09mmol)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加BOP(0.01g，0.23mmol)和三乙胺(0.04mL，0.23mmol)。在2小时后，将反应混合物在110℃下加热3h。将反应混合物冷却至室温并且在减压下蒸发，以得到粗产物，将其经由制备型HPLC纯化。手性分离方法：柱：DAD-1-Cellulose-2(250X 4.6mm)，5微米。流动相：在乙腈中的0.1％DEA，流速：2.0mL\min。
化合物25：(1.9mg，6％产率)；LCMS：m/z＝543.3(M+H)；rt 2.21min；LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1)mm，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)时间(min)：0-3；％B：0-100。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.29-8.16(m,1H),8.06-7.92(m,1H),7.75-7.58(m,2H),7.26(m,2H),6.01-5.32(m,1H),5.28(br s,1H),5.00-4.79(m,1H),3.66-3.56(m,1H),3.43(s,3H),2.65-2.57(m,1H),2.44-2.34(m,2H),2.18-2.00(m,1H),1.95-1.74(m,2H),1.68-1.34(m,2H),1.15-1.02(m,2H),0.93-0.83(m,2H),0.81-0.62(m,6H)。
化合物26：(1.0mg，3％产率)；LCMS：m/z＝543.3(M+H)；rt 2.20min；LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1)mm，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)时间(min)：0-3；％B：0-100。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.23(d,J＝8.8Hz,1H),8.06-7.91(m,1H),7.62(dd,J＝6.2,7.5Hz,2H),7.26(t,J＝8.8Hz,2H),5.92-5.31(m,1H),5.29(s,1H),4.96-4.78(m,1H),3.60-3.50(m,1H),3.43(s,3H),3.25-3.10(m,1H),2.97-2.75(m,2H),2.27-1.65(m,3H),1.49-1.24(m,2H),1.11-0.97(m,2H),0.94-0.75(m,5H),0.74-0.50(m,3H)。
DGKi化合物27和28
4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
向4-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(1g，3.35mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(5.9mL，33.5mmol)，然后添加2-(溴(4-氟苯基)甲基)-5-(三氟甲基)吡啶(2.24g，6.70mmol)。将反应混合物在80℃下加热4小时。将反应混合物冷却至室温并且将溶剂在减压下去除，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：Sunfire C18，150x19 mm ID，5μm；流动相A：在水中的0.1％TFA；流动相B：乙腈:MeOH(1:1)；梯度：经20分钟50％-100％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：19mL/min)，将级分在减压下浓缩并且从(EtOH/H2O，1:5)中冻干，以得到化合物27和化合物28。
化合物27：110mg，6％产率；LCMS：m/z＝552.2(M+H)；rt 3.09min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：20％-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.83(s,1H),8.22(d,J＝9.0Hz,2H),8.11-7.95(m,2H),7.71-7.58(m,2H),7.25-7.13(m,2H),5.76-5.44(m,1H),5.13-4.67(m,2H),3.86-3.49(m,1H),3.44(s,3H),3.19-3.08(m,1H),2.84(dd,J＝3.8,12.3Hz,1H),2.38-2.26(m,1H),1.67-1.39(m,3H),1.11-0.86(m,3H)。
化合物28：145mg，8％产率；LCMS：m/z＝552.2(M+H)；rt 3.09min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流速：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.91(s,1H),8.27-8.16(m,2H),7.99(d,J＝9.0Hz,2H),7.69-7.57(m,2H),7.23-7.13(m,2H),5.77-5.41(m,1H),5.09-4.62(m,2H),3.90-3.65(m,1H),3.44(s,3H),3.14-3.02(m,1H),2.80-2.74(m,1H),1.61-1.40(m,3H),1.10-0.93(m,3H)[1H被溶剂峰遮挡]。
DGKi化合物29和30
4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
向4-((2S,5R)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈HCl盐(200mg，0.55mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.3mL，1.65mmol)、碘化钠(83mg，0.55mmol)和1-(1-氯丙基)-4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯(268mg，1.1mmol)。将反应混合物在80℃下加热16h。使反应混合物冷却至室温。添加另一批1-(1-氯丙基)-4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯(268mg，1.102mmol)并继续再加热16h。将反应混合物冷却，将溶剂在减压下去除并且将残余物溶解于乙酸乙酯(10x20mL)中。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在减压下浓缩，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化。HPLC方法：柱：EXRS(20X 250mm，5μm)，流动相A-在水R中的10mM乙酸铵，流动相A-B:乙腈，流速：20mL/min。
将级分1在减压下浓缩，并且将产物用(EtOH/H2O，1:5)稀释并且冻干，以得到化合物29(35mg，11.6％产率)；LCMS：m/z，533.4[M+H]+，rt 1.57min；LCMS方法：柱：KINETIX XBC18(75x3mm，2.6μm)；流动相A：在水中的10mM乙酸铵(pH3.3)，流动相B：乙腈。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.97(d,J＝9.0Hz,1H),7.33(m,1H),6.62-6.92(m,2H),5.29-6.06(m,1H),4.70-5.05(m,1H),3.82(m,3H),3.43(s,3H),2.99-3.10(m,1H),2.80-2.87(m,1H),2.63-2.78(m,1H),2.33(s,1H),1.74-2.11(m,3H),1.51-1.66(m,1H),1.17-1.46(m,3H),0.84-1.01(m,3H),0.61-0.78(m,6H),0.53-0.61(m,2H),0.29-0.35(m,2H)。
将级分2在减压下浓缩，并且将产物用(EtOH/H2O，1:5)稀释并且冻干，以得到化合物30(37mg，12.35％产率)；LCMS：m/z，533.4[M+H]+，rt 2.72min；LCMS方法：柱：KINETIX XBC18(75x3mm，2.6μm)；流动相A：在水中的10mM乙酸铵(pH3.3)，流动相B：乙腈。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.13-8.35(m,1H),7.98(m,1H),7.38(m,1H),6.61-6.89(m,2H),5.18-6.15(m,1H),4.66-5.13(m,1H),3.63-3.90(m,3H),3.43(s,3H),3.25(m,1H),3.00-3.15(m,1H),2.63-2.70(m,1H),2.26-2.38(m,1H),1.81(m,3H),1.35-1.61(m,2H),1.15-1.26(m,2H),0.88-1.00(m,3H),0.61-0.71(m,6H),0.51-0.59(m,2H),0.32(m,2H)。
DGKi化合物31和32
4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
向4-((2S,5R)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈HCl盐(0.4g，1.1mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.6mL，3.31mmol)，然后添加1-(1-氯丁基)-4-三氟甲基)苯(0.783g，3.31mmol)和碘化钠(0.165g，1.102mmol)。将反应混合物在85℃下加热16h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯洗涤，并且将滤液在减压下浓缩，以得到粗化合物，将其通过制备型HPLC(HPLC方法：柱：YMC ExRS(250mm x21.2mm，5μm)，流动相A＝在水中的10mM乙酸铵pH 4.5，流动相B＝乙腈，梯度：经2分钟80％B，然后在100％B下保持16分钟；流速：19mL/min)纯化，以得到化合物31和32。
化合物31：(10mg，1.7％产率)，LCMS：m/z＝527.4(M+H)；rt 2.626min；[LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1mm)，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAC；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30-8.16(m,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.3Hz,2H),7.56(br d,J＝7.8Hz,2H),5.86-5.44(m,1H),5.01-4.77(m,1H),3.730-3.718(m,1H),3.46(s,3H),3.43-3.35(m,1H)3.13-3.01(m,1H),2.93-2.75(m,2H),2.38-2.26(m,1H),2.17-1.74(m,3H),1.63-1.22(m,3H),1.01-0.86(m,4H),0.84-0.75(m,3H),0.73-0.54(m,3H)。
化合物32：(7.2mg，1.23％产率)，LCMS：m/z＝527.3(M+H)；rt 2.654min；[LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1)mm，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAC；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流速：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.29-8.15(m,1H),7.96-8.02(m,1H),7.70(d,J＝8.1Hz,2H),7.58(br d,J＝8.1Hz,2H),6.09-5.22(m,1H),5.13-4.66(m,1H),3.68-3.52(m,2H),3.43(s,3H),3.28-3.04(m,2H),2.60-2.53(m,1H),2.25-2.12(m,1H),2.04-1.68(m,3H),1.60-1.29(m,3H),1.05-0.74(m,7H),0.59(t,J＝7.5Hz,3H)。
DGKi化合物33和34
1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
在室温下在氩气氛下向6-氯-1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮(0.1g，0.19mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加氰化锌(0.046g，0.39mmol)、锌(0.7mg，9.8μmol)和三乙胺(0.1mL，0.59mmol)，然后添加二氯[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦基)氧杂蒽]钯(II)(0.015g，0.02mmol)。将反应混合物在90℃下加热过夜。将反应混合物用EtOAc(50mL)稀释并通过垫过滤，用额外的乙酸乙酯(2x50mL)洗涤。将滤液用水(50mL)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩，以得到粗产物，将其通过制备型HPLC(HPLC方法：柱：YMC EXRS(250x19mm，5μm)；流动相A：在水中的10mM乙酸铵pH约4.5；流动相B：乙腈，流速：20mL/min)纯化，以得到化合物33和化合物34。
化合物33：(13mg，14％产率)。LCMS：m/z＝499.3[M+H]+；rt 2.376min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1mm，2.5μm)；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAc；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流速：1.1mL/min；温度：50℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)＝8.22(br d,J＝8.8Hz,1H),7.98(d,J＝8.8Hz,1H),7.70-7.72(m,2H),7.59-7.61(m,2H),5.84-5.59(m,1H),5.10-4.67(m,1H),3.91-3.75(m,1H),3.38-3.43(m,4H),2.86-2.70(m,2H),2.47-2.36(m,1H),1.63-1.51(m,1H),1.47-1.18(m,8H),0.9-0.99(m,1H),0.75-0.59(m,3H)。
化合物34：(13mg，13％产率)；LCMS：m/z＝499.3[M+H]+；rt 2.436min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x2.1mm，2.5μm)；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAc；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流速：1.1mL/min；温度：50℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)＝8.25(br d,J＝2.4Hz,1H),8.06-7.92(m,1H),7.77-7.65(m,2H),7.65-7.54(m,2H),6.09-5.44(m,1H),5.04-4.68(m,1H),3.81-3.59(m,2H),3.44(s,3H),3.28-3.13(m,1H),2.52-2.61(m,1H),2.24-2.05(m,1H),1.72-1.48(m,2H),1.47-1.15(m,8H),0.98-0.75(m,3H)。
生物学测定
本文所述化合物的药理特性可以通过许多生物测定来确认。
1.体外DGK抑制测定
使用挤出脂质体(DGKα和DGKζLIPGLO测定)或洗涤剂/脂质胶束底物(DGKα和DGKζ测定)进行DGKα和DGKζ反应。在50mM MOPS pH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2、1μM CaCl2和1mM DTT(测定缓冲液)中进行反应。使用洗涤剂/脂质胶束底物的反应还含有50mM辛基B-D-吡喃葡萄糖苷。对于洗涤剂/脂质胶束反应，脂质底物浓度为11mM PS和1mM DAG。对于挤出脂质体反应，脂质底物浓度为2mM PS、0.25mM DAG和2.75mM PC。反应在150μM ATP中进行。对于DGKα和DGKζ的酶浓度为5nM。
如下进行化合物抑制研究：将溶解于DMSO中的每种测试化合物的50nL液滴(对于每种化合物，最高浓度10mM，11点3倍稀释系列)转移至白色1536孔板(Corning3725)的孔中。通过将2.5mL 4x酶溶液(在测定缓冲液中的20nM DGKα或DGKζ(如下所述制备))和2.5mL4x脂质体或4x洗涤剂/脂质胶束溶液(组成在以下所述)合并来制备5mL酶/底物溶液(2x最终反应浓度)并且将其在室温下孵育10分钟。接下来，将1μL2x酶/底物溶液添加到含有测试化合物的孔中并且通过添加1μL 300uM ATP开始反应。允许反应进行1h，此后添加2μL Glo试剂(Promega V9101)并且孵育40分钟。接下来，添加4μL激酶检测试剂并且孵育30分钟。使用EnVision酶标仪记录发光。从通过无酶对照反应(100％抑制)和仅媒介物反应(0％抑制)产生的ATP转化率来计算抑制百分比。以11种浓度评价化合物以确定IC50。
4x洗涤剂/脂质胶束的制备
通过以下方式制备洗涤剂/脂质胶束：将15g磷脂酰丝氨酸(Avanti 840035P)和1g二酰基甘油(800811O)合并，并且溶解在2L圆底烧瓶中的150mL氯仿中。通过旋转蒸发在高真空下除去氯仿。通过剧烈混合将所得的无色胶粘性油状物重新悬浮在400mL 50mM MOPSpH 7.5、100mM NaCl、20mM NaF、10mM MgCl2、1μM CaCl2、1mM DTT和200mM辛基葡糖苷中。将脂质/洗涤剂溶液分成5mL等分试样并且储存于-80℃。
4x脂质体制备
对于4x脂质体溶液，脂质组成是5mol％DAG(Avanti 800811O)、40mol％PS(Avanti840035P)和55mol％PC(Avanti 850457)，总脂质浓度为15.2mg/mL。将PC、DAG和PS溶解在氯仿中，合并，并且在真空中干燥成薄膜。将脂质在50mM MOPS pH 7.5、100mM NaCl、5mMMgCl2中水合至20mM，并且冻融五次。将脂质悬浮液通过100nm聚碳酸酯过滤器挤出十一次。进行动态光散射以确认脂质体的尺寸(半径为50-60nm)。将脂质体制剂储存在4℃下长达四周。
人DGKα和DGKζ的杆状病毒表达
根据制造商的方案使用Bac-至-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)产生人DGK-α-TVMV-His-pFBgate和人DGK-ζ-转录变体-2-TVMV-His-pFBgate杆状病毒样品。用于表达DGK-α和DGK-ζ的DNA分别具有SEQ ID NO:251和252。以1:1500的病毒/细胞比使用受感染的Sf9细胞实现杆状病毒扩增，并且在转染后在27℃下生长65小时。
在来自GE Healthcare Bioscience的Cellbag 50L WAVE-生物反应器系统20/50中进行每种蛋白质的表达放大。将12L 2×106个细胞/mL的在ESF921昆虫培养基(Expression System)中生长的Sf9细胞(Expression System，加利福尼亚州戴维斯)用病毒储液以1:200的病毒/细胞比感染，并且使其在感染后在27℃下生长66-68小时。通过在RC12BP离心机中在4℃下以2000rpm离心20min来收获受感染的细胞培养物。将细胞沉淀储存于-70℃下直到纯化。
人DGK-α和DGK-ζ的纯化
从受Sf9杆状病毒感染的昆虫细胞糊纯化全长人DGKα和DGKζ，其各自表达含有TVMV可切割C末端六His标签序列(分别为SEQ ID NO:190和191)并且如上所述产生。通过氮空化方法用氮弹(Parr Instruments)裂解细胞，并且通过离心使裂解物澄清。在Purifier Plus系统上使用三个连续的柱色谱步骤将澄清的裂解物纯化至约90％同质性。这三步柱色谱法包括镍亲和树脂捕获(即HisTrap FF粗品，GE Healthcare)，然后是尺寸排阻色谱法(即对于DGK-α为HiLoad 26/600Superdex 200制备级，GE Healthcare，并且对于DGK-ζ为HiPrep 26/600Sephacryl S 300_HR，GE Healthcare)。第三步是离子交换色谱法，并且对于两种亚型有所不同。使用Q-Sepharose阴离子交换色谱法(GE Healthcare)精制DGKα。使用SP Sepharose阳离子交换色谱法(GE Healthcare)精制DGKζ。将蛋白质以≥2mg/mL的浓度递送。两种蛋白质的配制缓冲液相同：50mM Hepes，pH 7.2，500mM NaCl、10％v/v甘油，1mM TCEP，和0.5mM EDTA。
2.Raji CD4 T细胞IL2测定
使用预激活的CD4 T细胞和Raji细胞在4μL体积中进行1536孔IL-2测定。在测定之前，通过用分别为1.5μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的α-CD3、α-CD28和PHA处理将CD4 T细胞预激活。将Raji细胞用10,000ng/mL的葡萄球菌肠毒素B(SEB)处理。首先将连续稀释的化合物转移至1536孔测定板(Corning，#3727)，然后添加2μL预激活的CD4T细胞(最终密度为6000个细胞/孔)和2μL经SEB处理的Raji细胞(2000个细胞/孔)。在37℃/5％CO2培养箱中孵育24小时后，将4μl IL-2检测试剂添加到测定板(Cisbio，#64IL2PEC)中。在Envision读板器上读取测定板。为了评估化合物的细胞毒性，将Raji或CD4 T细胞与连续稀释的化合物一起孵育。孵育24小时后，添加4μL Cell Titer Glo(Promega，#G7572)，并且在Envision读板器上读取板。使用四参数逻辑斯谛公式y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))计算50％有效浓度(IC50)，其中A和B分别表示最小和最大激活或抑制％，C是IC50，D是希尔斜率(hill slope)并且x表示化合物浓度。
3.CellTiter-Glo CD8 T细胞增殖测定
将冷冻的幼稚人CD8 T细胞在RPMI+10％FBS中解冻，在37℃下孵育2h，并且计数。将384孔组织培养板在4℃下用20μl在普通RPMI中0.1μg/mL的抗人CD3包被过夜，将其从板上移除，然后将20k/40μL CD8 T细胞(具有0.5μg/mL可溶性抗人CD28)添加到每个孔中。在细胞铺板后立即将化合物用echo仪器添加(echoed)到细胞板。在37℃培养箱中培养72h后，将10μL CellTiter-glo试剂(Promega目录号G7570)添加到每个孔中。将板剧烈振荡5min，在室温下再孵育15min，并且在Envision上读取CD8 T细胞增殖。在分析中，0.1μg/mL抗CD3和0.5μg/mL抗CD28刺激的CD8 T细胞信号为背景。将3μM参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈用于设置100％范围，并且将EC50设置为绝对50％以归一化数据。
4.DGK AP1-报告物测定
使用来自SABiosciences的Cignal Lenti AP1报告物(luc)试剂盒(CLS-011L)产生Jurkat AP1-萤光素酶报告物。
使用Echo550仪器将化合物从Echo LDV板转移至384孔板(白色，实心底部，不透明的PE CulturPlate 6007768)的单独的孔。样品量为30nL/孔；以及每个源板一个目标板。通过将40mL细胞(2x20mL)转移至干净的50mL锥形管中来制备细胞悬液。通过离心(1200rpm；5min；环境温度)浓缩细胞。去除上清液，并且将所有细胞悬浮在RPMI(Gibco 11875)+10％FBS中，以使浓度为1.35x106个细胞/ml。使用多通道移液器手动添加细胞，将30μL/孔的细胞悬液添加到含有所述化合物的384孔TC板中，4.0x104个细胞/孔。将细胞板在37℃和5％CO2下孵育20分钟。
在孵育过程中，通过将3μL aCD3(1.3mg/mL)与10mL培养基混合[最终浓度＝0.4μg/mL]来制备抗CD3抗体(αCD3)溶液。接下来，将1.5μl aCD3(1.3mg/mL)与0.5mL培养基混合[最终浓度＝4μg/ml]。20分钟后，将10μL培养基添加到第1列的所有孔(孔A至M)中，并且向第1列(行N至P)中添加10μL/孔的αCD3(4ug/mL)用于参考。然后使用多通道移液器添加10μL/孔的αCD3(0.4ug/mL)。将αCD3刺激的+/-化合物处理的细胞在37℃ 5％CO2下孵育6小时。
在此孵育期间，将Steady-Glo(Promega E2520)试剂缓慢解冻至环境温度。接下来，使用多滴式Combi-分配器添加20μL Steady-Glo试剂/孔。通过离心(2000rpm，环境温度，10秒)去除气泡。将细胞在室温下孵育5分钟。通过使用Envision读板仪根据发光方案测量相对光单位(RLU)来表征样品。使用参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈分析术语以相对于100％抑制进行归一化。
5.鼠细胞毒性T淋巴细胞测定
开发了抗原特异性细胞裂解T细胞(CTL)测定，以在功能上评价DGKα和DGKζ抑制剂增强效应T细胞介导的肿瘤细胞杀伤活性的能力。从OT-1转基因小鼠分离的CD8+T细胞识别抗原呈递细胞MC38，其呈递卵清蛋白来源的肽SIINFEKL。同源抗原的识别启动了OT-1抗原特异性CD8+ T细胞的细胞裂解活性。
如下产生功能化CTL细胞：将OT-1脾细胞从8-12周龄小鼠分离，并且在1μg/mL的SIINFEKL肽和10U/mL的mIL2的存在下扩增。三天后，添加具有mIL2 U/ml的新鲜培养基。在扩增的第5天，分离出CD8+ T细胞并且准备好使用。激活的CTL细胞可以冷冻储存6个月。单独地，将一百万个MC38肿瘤细胞用1μg/mL的SIINFEKL-OVA肽在37℃下脉冲3小时。将细胞用新鲜培养基洗涤(3X)以去除过量肽。最后，将在96孔U形底板中用DGK抑制剂预处理1小时的CTL细胞与负载抗原的MC38肿瘤细胞以1:10的比率合并。然后将细胞在700rpm下旋转5min，并且放置在37℃的孵化器中过夜。24小时后，收集上清液以通过购自Perkin Elmer的AlphaLisa分析IFN-γ细胞因子水平。
6.PHA增殖测定
将来自冷冻储备物的植物血凝素(PHA)刺激的胚细胞在补充有10％胎牛血清(Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯)的RPMI培养基(Gibco，ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)中孵育一小时，然后添加到384孔板的单独孔(10,000个细胞/孔)中。将化合物转移至384孔板的单独孔中，并且将经处理的细胞在含有人IL2(20ng/mL)的培养基中在37℃ 5％CO2下保持72h，然后根据制造商的说明(Promega，威斯康星州麦迪逊)使用MTS试剂[3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓]测量生长。通过比较IL2刺激(0％抑制)与未刺激对照(100％抑制)之间的值来计算抑制百分比。基于对IL2刺激与未刺激处理之间的倍数诱导的50％抑制来计算抑制浓度(IC50)的确定。
7.人CD8 T细胞IFN-γ测定
将冷冻的幼稚人CD8 T细胞在AIM-V培养基中解冻，在37℃下孵育2h，并且计数。将384孔组织培养板在4℃下用20μL在PBS中0.05μg/mL的抗人CD3涂布过夜，将其从板上去除，然后将40,000个细胞/40微升CD8 T细胞和0.1μg/mL可溶性抗人CD28添加到每个孔中。细胞铺板后，立即使用Echo液体处理器将化合物转移到细胞板上。在37℃培养箱中孵育20h后，将3微升/孔的上清液转移到新的384孔白色测定板中，以进行细胞因子测量。
使用AlphLISA试剂盒(目录号AL217)如制造商手册(Perkin Elmer)所述定量干扰素-γ(IFN-γ)。将来自每个孔的计数转换为IFN-γ浓度(pg/mL)。通过将0.05μg/mL抗CD3加0.1μg/mL抗CD28设置为基线，并且将3μM的参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈与抗CD3加抗CD28的共刺激设置为100％激活来确定化合物EC50值。
8.人CD8 T细胞pERK测定
将冷冻的幼稚人CD8 T细胞在AIM-V培养基中解冻，在37℃下孵育2h，并且计数。将CD8阳性T细胞以在AIM-V培养基中20,000个细胞/孔添加到384孔组织培养板中。将一种化合物添加到每个孔中，然后以0.3μg/mL的最终浓度添加珠结合的抗人CD3和抗CD28 mAb。将细胞在37℃下孵育10分钟。通过添加来自AlphaLISA Surefire试剂盒(Perkin Elmer，目录号ALSU-PERK-A)的裂解缓冲液终止反应。将裂解物(5μL/孔)转移到新的384孔白色测定板中进行pERK激活测量。
通过将抗CD3加抗CD28设置为基线并且将3μM的8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈与抗CD3加抗CD28的共刺激设置为100％激活来确定化合物EC50值。
9.人全血IFN-γ测定
将从健康供体获得的人静脉全血(22.5μL/孔)在加湿的95％空气/5％CO2培养箱中在37℃下用化合物预处理一小时。将所述血液用2.5μL抗人CD3和抗CD28 mAb各自以1μg/mL的最终浓度在37℃下刺激24小时。使用AlphLISA试剂盒(目录号AL217)测量上清液中的IFN-γ。
通过将抗CD3加抗CD28设置为基线并且将3μM的参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈与抗CD3加抗CD28的共刺激设置为100％激活来确定化合物EC50值。
表A列出了在DGKα和DGKζ脂质体(LIPGLO)测定中测量的体外DGK抑制IC50活性值。
本文所述的化合物具有作为DGKα和DGKζ酶中之一或两者的一种或多种抑制剂的活性，并且因此可以用于治疗与抑制DGKα和DGKζ活性相关的疾病。
实施例2：化合物17对CAR-T细胞功能的影响
评估用示例性DGKi(化合物17)处理的嵌合抗原受体(CAR-T细胞)工程化的T细胞的T细胞功能。
含有表达示例性抗CD19 CAR的T细胞的T细胞组合物是通过如下过程从来自两名健康成年人供体的白细胞单采术样品产生的，所述过程包括通过从每个供体的样品中单独选择CD4+和CD8+细胞对T细胞进行基于免疫亲和力的选择，从而得到分别富集CD8+和CD4+细胞的两种组合物。将富集的CD4+和CD8+组合物的细胞用抗CD3/抗CD28珠单独激活，并用编码抗CD19 CAR的载体进行慢病毒转导。抗CD19 CAR含有源自鼠抗体的抗CD19单链可变片段(scFv)(源自FMC63的可变区)、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区、和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体中的表达构建体还含有编码CAR表达的替代表面标记的序列，所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与CAR编码序列隔开。然后在存在刺激试剂的情况下单独孵育转导的CD4+或CD8+ T细胞群体用于细胞扩增。将扩增的CD4+细胞和CD8+细胞分别配制并冷冻保存，并且储存。
在使用之前，解冻冷冻保存的CD4+和CD8+CAR工程化的细胞组合物，并且将每个供体以约1:1CD4:CD8比率合并，以制备组合的CD4+CAR+和CD8+CAR+ T细胞组合物。然后评估在用板结合的CAR特异性抗独特型抗体刺激组合的CAR-T细胞组合物期间(参见例如，WO2018/023100)或者在与CD19表达细胞共培养期间，用第0天添加的不同浓度(0.1nM、1nM、10nM、100或1000nM)的化合物17处理的效果。
A.T细胞表型
在存在化合物17的情况下，将组合的CAR-T细胞组合物的大约20,000个细胞用3μg/ml或30μg/ml板结合的CAR特异性抗独特型抗体刺激。在48小时刺激之后，将T细胞用抗体针对各种激活和分化标记进行表面染色，并且通过流式细胞术分析所评估的标记阳性的细胞的百分比(％阳性)和所评估的标记的表达的平均荧光强度(MFI)。测定与在没有用化合物17处理的情况下的表达相比，表面标记的表达的来自两个健康供体的％阳性细胞或MFI的平均log2倍数变化值。
图1A示出了在用3μg/mL(左小图)或30μg/mL(右小图)的CAR特异性抗独特型抗体刺激之后，对各种激活和分化标记呈阳性的细胞％的log2倍数变化(存在化合物17相比于不存在化合物17)在供体之间的平均值。图1B示出了在用3μg/mL(左小图)或30μg/mL(右小图)的CAR特异性抗独特型抗体刺激之后，细胞MFI的log2倍数变化(存在化合物17相比于不存在化合物17)在供体之间的平均值。在图1A和图1B中，正值用圆圈指示。如图1A和图1B二者中所示，在存在化合物17的情况下刺激的CAR表达细胞具有增加的CD69和PD-1的表达以及降低的CD27和CD62L的表达，这与更多的在存在化合物17的情况下刺激后具有激活的效应子表型的细胞一致。这种对细胞表型的影响是剂量依赖性的，特别是对于用更高浓度的CAR特异性抗独特型抗体(30μg/mL)刺激的细胞。
B.增殖
使用Incucyte成像系统，监测在存在化合物17的情况下用30μg/mL板结合的抗CAR抗独特型抗体刺激期间的T细胞增殖，持续七天。通过分析细胞图像的占据面积(汇合％)随时间的变化来监测细胞增殖；随着细胞增殖，汇合增加。
图2示出了在存在化合物17或对照的情况下刺激的细胞的生长曲线(孔中的细胞汇合百分比)。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式三份的值。如所示，在刺激期间化合物17的存在不影响T细胞增殖。
C.细胞裂解功能
在存在化合物17的情况下将组合的CAR-T细胞组合物与各种CD19表达淋巴瘤细胞以2.5:1的效应子:靶标比率共培养之后，评估用化合物17处理的T细胞的细胞裂解功能。将靶淋巴瘤细胞用NucLight Red(NLR)标记以允许通过显微镜检查对其进行追踪。通过测量在四至七天的时间段内存活靶细胞的损失来评估细胞裂解活性，如通过红色荧光信号所确定(使用活细胞分析系统，Essen Bioscience)。
图3示出了在存在化合物17(或对照)的情况下，当与CD19抗原表达靶细胞，即K562.CD19细胞(高CD19表达；左小图)、Granta-519细胞(低CD19表达；中小图)和Raji细胞(中/高CD19表达；右小图)共培养时，CAR表达细胞所实现的特异性裂解的百分比。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式三份的值。如所示，在共培养期间化合物17的存在不影响细胞裂解功能。
D.细胞因子产生
48小时后，从上述CAR表达T细胞和CD19表达肿瘤细胞在存在化合物17的情况下的共培养物中收集上清液。通过对收集的细胞上清液进行meso scalediscovery(MSD)分析，从上清液中测量细胞因子的产生。
图4示出了在存在化合物17的情况下与K562.CD19细胞(圆形)、Granta-519细胞(正方形)和Raji细胞(三角形)共培养后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)的以pg/mL计的上清液浓度。如所示，在共培养期间化合物17的存在导致所有三种细胞因子的产生的剂量依赖性增加，其中更高浓度的化合物17导致在与Granta-519细胞(低CD19表达)共培养期间特别是对于IL-2产生的最大影响。
E.总结
总之，这些结果表明，在不影响CAR T细胞增殖或细胞裂解功能的情况下，用化合物17处理增加了CAR T细胞的细胞因子产生以及具有激活效应表型的CD4+和CD8+CAR表达细胞的数量。此外，在这些测定中未观察到化合物17对T细胞活力的影响。这些结果与在急性刺激条件下，化合物17的存在增强了CAR-T细胞激活的观察结果一致。
实施例3：用化合物17并行处理的慢性刺激的CAR-T细胞的评估
评估了化合物17阻断或减少慢性刺激的CAR T细胞耗竭的能力。
为了模拟慢性刺激的条件，将如实施例1中所述的从两名健康成人供体产生的组合的CAR-T细胞组合物的约20,000个抗CD19 CAR表达T细胞与30μg/mL板结合的CAR特异性抗独特型抗体(参见例如，WO 2018/023100)在37℃下一起孵育七天的时间段。在这七天时间段期间，将工程化CAR T细胞用在第0天添加的化合物17(0.1-1000nM)或媒介物对照并行处理。与实施例1在急性刺激后观察到的结果相似，在慢性刺激期间T细胞与化合物17的并行孵育增加了刺激的细胞中高度激活的CAR-T细胞群体，特别是高表达CD69和PD-1的细胞群体。
然后在不存在化合物17的情况下用CD19表达肿瘤细胞或肿瘤球体对刺激的CAR T细胞进行再激发，并且评估细胞裂解活性和细胞因子产生。
A.2D CD19+肿瘤
为了评估细胞裂解功能，将刺激的CAR-T细胞组合物与各种CD19表达淋巴瘤细胞以2.5:1的效应子:靶标比率共培养。将肿瘤细胞工程化以表达NucLight Red(NLR)，并且通过监测肿瘤细胞数。图5A示出了在存在用化合物17并行处理的情况下与慢性刺激的CAR T细胞进行2D共培养期间的K562.CD19(左小图)、Granta-519(中小图)和Raji细胞(右小图)的肿瘤细胞数。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。如所示，在T细胞的慢性刺激期间与DGKi孵育以剂量依赖性方式降低了CAR-T细胞针对CD19表达淋巴瘤细胞的细胞裂解活性。特别地，在慢性刺激期间用较高浓度的化合物17处理降低了CAR T细胞的细胞裂解活性。
48小时后，从上述慢性刺激的CAR表达T细胞和CD19表达肿瘤细胞的共培养物中收集上清液。通过对收集的细胞上清液进行meso scalediscovery(MSD)分析，从上清液中测量细胞因子的产生。图5B示出了在与K562.CD19细胞(圆形)、Granta-519细胞(正方形)和Raji细胞(三角形)进行2D共培养48小时后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。结果表明，在慢性刺激期间用化合物17处理导致所有三种细胞因子产生的剂量依赖性增加。
B.3D球形CD19+肿瘤
为了进一步评估慢性刺激的细胞的活性，将曾用DGKi并行处理的慢性刺激的CAR-T细胞与A549 CD19+肿瘤球体或Granta-519肿瘤球体以1:2的效应子与靶标比率一起孵育长达14天，以再激发CAR-T细胞。将肿瘤球体工程化以表达红色荧光染料，以允许在测定期间通过显微术监测肿瘤细胞裂解。
通过监测随时间变化的荧光(指示肿瘤细胞裂解)来评估慢性刺激的CAR表达T细胞的抗原特异性细胞裂解活性。将肿瘤体积(相对于时间零归一化)测量为红色校准单位数(RCU)xμm2面积。图6A示出了在与在慢性刺激期间曾用化合物17并行处理的CAR T细胞共培养的第9天，A549.CD19(左小图)和Granta-519肿瘤球体(右小图)的归一化的肿瘤体积。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。在3D培养物(图6A)中，在慢性刺激期间用化合物17处理适度降低了CAR T细胞的细胞裂解活性。
在第5天从上述具有慢性刺激的CAR表达T细胞的肿瘤球体培养物中收集上清液。通过对收集的细胞上清液进行meso scalediscovery(MSD)分析，从上清液中测量细胞因子的产生。图6B示出了在与A549.CD19(圆形)和Granta-519肿瘤球体(正方形)进行3D共培养五天后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。如所示，在慢性刺激期间用化合物17处理导致所有三种细胞因子的产生的剂量依赖性增加，与2D肿瘤细胞培养物中的结果类似。
实施例4：用化合物17拯救处理后慢性刺激的CAR-T细胞的评估
评估了化合物17从耗竭中拯救慢性刺激的CAR T细胞的能力。
如实施例2中所述(但是在慢性刺激期间不存在化合物17)，将如实施例1中所述产生的抗CD19 CAR表达T细胞用板结合CAR特异性抗独特型抗体慢性刺激七天。相反，在用CD19表达肿瘤细胞再激发期间，将慢性刺激的CAR T细胞用化合物17处理，之后评估细胞裂解活性和细胞因子产生。
A.2D CD19+肿瘤
在存在DGKi(0-1000nM)的情况下，将慢性刺激的CAR-T细胞与各种CD19表达淋巴瘤细胞以2.5:1效应子:靶标比孵育。将肿瘤细胞用NucLight Red(NLR)标记，并且通过监测肿瘤细胞数。图7A示出了在存在化合物17的情况下与CAR T细胞进行2D共培养期间的K562.CD19(左小图)、Granta-519(中小图)和Raji细胞(右小图)的肿瘤细胞数。如图7A所示，在共培养期间用更高浓度的化合物17拯救处理改善了CAR T细胞针对K562.CD19和Granta-519细胞的细胞裂解活性，但是没有改变针对Raji细胞的细胞裂解活性。
48小时后，从上述慢性刺激的CAR表达T细胞和CD19表达肿瘤细胞的共培养物中收集上清液。通过对收集的细胞上清液进行meso scalediscovery(MSD)分析，从上清液中测量细胞因子的产生。图7B示出了在存在化合物17的情况下与K562.CD19细胞(圆形)、Granta-519细胞(正方形)和Raji细胞(三角形)进行2D共培养48小时后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。如所示，在共培养期间用化合物17拯救处理导致所有三种细胞因子的产生(在与Granta-519细胞2D培养期间IL-2产生除外)的剂量依赖性增加。
B.3D球形CD19+肿瘤
还在存在DGKi的情况下与慢性刺激的CAR-T细胞孵育的CD19表达肿瘤球体培养物中评估细胞裂解活性。在存在DGKi(0-1000nM)的情况下，将A549 CD19+肿瘤球体或Granta-519肿瘤球体与抗CD19 CAR表达T细胞以1:2的效应子与靶标比率孵育长达14天。将肿瘤球体工程化以表达红色荧光染料，以允许在测定期间通过显微术监测肿瘤细胞裂解。通过监测随时间变化的荧光评估细胞裂解活性，并且将肿瘤体积(相对于时间零归一化)测量为红色校准单位数(RCU)xμm2面积。图8A示出了在存在化合物17的情况下与CAR T细胞共培养的第9天的A549.CD19(左小图)和Granta-519肿瘤球体(右小图)的归一化的肿瘤体积。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。如所示，在共培养期间用化合物17拯救处理改善了CAR T细胞针对A549.CD19和Granta-519肿瘤球体两者的细胞裂解活性。
在第5天从上述具有慢性刺激的CAR表达T细胞的肿瘤球体培养物中收集上清液。通过对收集的细胞上清液进行meso scalediscovery(MSD)分析，从上清液中测量细胞因子的产生。图8B示出了在存在化合物17的情况下与A549.CD19(圆形)和Granta-519肿瘤球体(正方形)进行3D共培养五天后，IFNγ(左小图)、IL-2(中小图)和TNFα(右小图)以pg/mL计的上清液浓度。示出了由两种不同的健康供体制造的细胞组合物的一式两份的值。在球体共培养期间用化合物17拯救处理导致所有三种细胞因子产生的剂量依赖性增加。
C.总结
总之，这些结果表明，在CAR T细胞的再激发期间，用化合物17拯救处理可以改善细胞裂解功能和细胞因子的产生，尤其是在肿瘤球体培养物中。结合上述实施例中的结果，这些结果与以下结论一致：用化合物17延迟处理可以增强或增加T细胞响应于CAR抗原的性能，并且可以减少或逆转CAR T细胞中的耗竭状态或慢性刺激状态。
实施例5：评估对慢性刺激的eTCR细胞用化合物17处理
评估了化合物17拯救用T细胞受体(eTCR)工程化的慢性刺激的T细胞免于耗竭的能力。
通过基于免疫亲和力的方法从健康供体中分离出原代人CD4+和CD8+ T细胞。将分离的CD4+和CD8+ T细胞合并并且用抗CD3/抗CD28试剂刺激，然后用编码抗人乳头瘤病毒16(抗HPV16)eTCR的慢病毒载体转导。编码eTCR的β链和α链的核苷酸序列被编码2A核糖体跳跃元件的序列隔开。转导后，在进一步评估之前，将细胞在含有人血清和细胞因子的培养基中培养9-10天。
为了评估用化合物17拯救处理对细胞裂解功能的影响，在不存在化合物17的情况下，使用10μg/mL或20μg/mL的板结合的针对TCR Vβ链的抗体将eTCR细胞刺激六天。
在慢性刺激之后，在存在100nM的化合物17的情况下,将eTCR-T细胞与HPV表达CaSki细胞以2.5:1的效应子:靶标比率共培养。作为对照，将在不存在化合物17的情况下慢性刺激的eTCR细胞与CaSki细胞共培养。将CaSki细胞用NucLight Red(NLR)转导，并且通过监测肿瘤细胞数。
图9示出了在与存在化合物17的情况下慢性刺激的eTCR T细胞共培养期间，在不同时间监测的CaSki细胞的肿瘤细胞数(左小图，用10μg/mL抗Vβ慢性刺激的eTCR T细胞；右小图，用20μg/mL抗Vβ慢性刺激的eTCR T细胞)。如所示，用肿瘤细胞培养期间存在的化合物17进行拯救处理能够改善慢性刺激的eTCR细胞的细胞裂解功能。此结果与实施例3中显示的关于CAR表达T细胞的观察结果一致，这表明DGK抑制能够逆转或拯救用不同抗原受体工程化的T细胞的耗竭状态或慢性刺激状态。
在另一个评估DGKi拯救或逆转耗竭的活性的实验中，如上所述，将eTCR T细胞在不存在化合物17的情况下慢性刺激6天。然后，在存在100nM化合物17的情况下，将慢性刺激的eTCR T细胞或未慢性刺激的刚解冻的eTCR T细胞用20μg/mL的针对eTCR的Vβ链的板结合抗体再刺激7天。作为对照，将慢性刺激的eTCR T细胞在不存在化合物17的情况下再刺激7天。在7天的再刺激结束时，确定了细胞计数。
图10示出了两个供体的eTCR T细胞的细胞计数，如从左到右所示：(1)无化合物处理的慢性刺激的eTCR T细胞(对照)；(2)用化合物17处理的慢性刺激的eTCR T细胞；或(3)未慢性刺激的新鲜eTCR T细胞。如所预期的，在不存在用化合物17处理的情况下，与新鲜eTCR T细胞相比，慢性刺激的T细胞增殖的能力总体降低(比较条件(1)和(3))。然而，用化合物17处理慢性刺激的T细胞会导致eTCR T细胞增殖增加。这些结果进一步证实了在随后的抗原受体依赖性再刺激期间DGKi逆转或拯救T细胞免于耗竭的能力。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
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序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> T细胞疗法与DGK抑制剂的组合
<130> 735042024440
<140> PCT/US2022/018579
<141> 2022-03-02
<150> US 63/156,342
<151> 2021-03-03
<160> 252
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) (aa)
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
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<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) (nt)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 3
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1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
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115
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
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165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
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210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
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Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
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1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
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1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
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Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
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Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
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<213> 智人 (Homo sapiens)
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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
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Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
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<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
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Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
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<213> 智人 (Homo sapiens)
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<223> CD3ζ
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 16
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 17
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 18
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 人BCMA的细胞外结构域 (GenBank编号
NP_001183.2)
<400> 18
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 20
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的人IgG1 Fc
<400> 20
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33信号肽
<400> 21
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 22
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-Fc构建体
<400> 22
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
20 25 30
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
35 40 45
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
50 55 60
Val Lys Gly Thr Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp
65 70 75 80
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala
85 90 95
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
100 105 110
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
115 120 125
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
130 135 140
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
145 150 155 160
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
180 185 190
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
195 200 205
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
210 215 220
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
225 230 235 240
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
245 250 255
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
260 265 270
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
275 280 285
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
290 295 300
Gly Lys
305
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 23
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 24
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 25
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 26
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 27
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 27
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 28
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 28
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 29
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 29
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 30
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 31
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 32
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 33
Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 35
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 37
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 39
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 41
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 43
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 44
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 45
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H3
<400> 46
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 47
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L1
<400> 48
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L2
<400> 49
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 50
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 51
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 52
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 55
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
<400> 56
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 57
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 58
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 59
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 60
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 61
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 62
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 63
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 65
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 66
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 67
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 68
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 69
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 70
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 71
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 71
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 72
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 73
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 74
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 74
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a信号肽
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 76
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Glu Met Gly Ala Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ile Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Thr Tyr Leu Gly Gly Leu Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 80
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 81
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Trp Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 82
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ala Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 83
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Arg Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg His Val Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Gln Glu His Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe Tyr Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asp Phe Trp Ser Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 88
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Tyr Thr Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Pro Glu Tyr Ser Ser Ser Ile Trp His Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 90
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Ala His Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 91
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Pro Leu Gln Glu Pro Pro Tyr Asp Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 92
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Val Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser His Asp Met Trp Ser Glu Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 94
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Pro Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Asn Leu
85 90 95
Asn Val His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 95
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 96
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 97
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 98
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Arg Ser Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ala His Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 100
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Ser Pro
85 90 95
Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 102
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Asn Lys Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 103
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 104
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Gly Ser Pro
85 90 95
Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 105
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 106
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 106
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 107
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 107
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Leu Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys
85 90 95
Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Cys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 108
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 110
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 111
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 111
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 112
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA sdAb
<400> 113
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ile Cys Ile Ser Arg Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ala Asp Cys Ser Gly Tyr Leu Arg Asp Tyr Glu Phe Arg
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28间隔子
<400> 114
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 115
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a TM
<400> 115
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
20 25
<210> 116
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28间隔子 (截短的)
<400> 116
Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys
1 5 10 15
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
20 25 30
<210> 117
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a铰链
<400> 117
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
1 5 10 15
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 118
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a铰链
<400> 118
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 119
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a铰链
<400> 119
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 120
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTLA4铰链
<400> 120
Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro
1 5 10 15
Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro
20 25 30
Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp
35
<210> 121
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTLA4 TM
<400> 121
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser
20
<210> 122
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1铰链
<400> 122
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
1 5 10 15
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
20 25 30
Gln Phe Gln Thr Leu Val
35
<210> 123
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1 TM
<400> 123
Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp
1 5 10 15
Val Leu Ala Val Ile
20
<210> 124
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcyRIIIa铰链
<400> 124
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
1 5 10 15
<210> 125
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1铰链
<400> 125
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 126
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 126
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Glu Met Gly Ala Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Arg Ile Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
245 250 255
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
260 265 270
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
275 280 285
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
290 295 300
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
305 310 315 320
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
325 330 335
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
340 345 350
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
355 360 365
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
370 375 380
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
385 390 395 400
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
405 410 415
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
420 425 430
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
435 440 445
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 127
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 127
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ile Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
165 170 175
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ala Glu Met Gly Ala Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
245 250 255
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
260 265 270
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
275 280 285
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
290 295 300
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
305 310 315 320
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
325 330 335
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
340 345 350
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
355 360 365
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
370 375 380
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
385 390 395 400
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
405 410 415
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
420 425 430
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
435 440 445
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 128
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Thr Tyr Leu Gly Gly Leu Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser
145 150 155 160
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn
165 170 175
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
210 215 220
Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Leu Gly Leu Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
245 250 255
Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys
260 265 270
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
275 280 285
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
290 295 300
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
305 310 315 320
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
325 330 335
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
340 345 350
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg
465
<210> 129
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 129
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
130 135 140
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
145 150 155 160
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr Tyr Leu Gly Gly Leu Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
245 250 255
Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys
260 265 270
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
275 280 285
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
290 295 300
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
305 310 315 320
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
325 330 335
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
340 345 350
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg
465
<210> 130
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Trp Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
115 120 125
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Ala Ala Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
Arg Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
245 250 255
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
260 265 270
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
275 280 285
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
290 295 300
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
305 310 315 320
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
325 330 335
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
340 345 350
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
355 360 365
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
370 375 380
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
405 410 415
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
420 425 430
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
435 440 445
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450
<210> 131
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 131
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ala Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
130 135 140
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile
165 170 175
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180 185 190
Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
210 215 220
Ser Trp Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
245 250 255
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
260 265 270
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
275 280 285
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
290 295 300
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
305 310 315 320
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
325 330 335
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
340 345 350
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
355 360 365
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
370 375 380
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
405 410 415
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
420 425 430
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
435 440 445
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450
<210> 132
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 132
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Arg Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
180 185 190
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg His Val Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys
245 250 255
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
260 265 270
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
275 280 285
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
290 295 300
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
305 310 315 320
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
325 330 335
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
370 375 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 133
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 133
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg His Val Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu
115 120 125
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Arg Gly Arg Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys
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Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
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Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 134
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Cys Gln Gln Arg Phe Tyr Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
245 250 255
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
260 265 270
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
275 280 285
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
305 310 315 320
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
325 330 335
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
355 360 365
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
370 375 380
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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
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420 425 430
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450 455
<210> 135
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 135
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
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Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met
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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 136
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Leu
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Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
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<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 137
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Tyr Thr Phe Pro Phe
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu Lys
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Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
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<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 139
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
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Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
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<210> 140
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 140
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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165 170 175
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Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe
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Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Val Trp Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Leu Asp Asn Glu
245 250 255
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260 265 270
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
275 280 285
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
290 295 300
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
305 310 315 320
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<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 141
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Val Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met
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His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
165 170 175
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
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210 215 220
Gly Pro Leu Gln Glu Pro Pro Tyr Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
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245 250 255
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
260 265 270
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
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Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
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50 55 60
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
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130 135 140
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Arg Ser Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Pro Ala His Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
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Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
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Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
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<220>
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1 5 10 15
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<223> 抗BCMA CAR
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<223> 抗BCMA CAR
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<223> 抗BCMA CAR
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 抗BCMA CAR
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Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
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465
<210> 169
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 169
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<210> 170
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 170
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
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Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
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225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro
245 250 255
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
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340 345 350
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 175
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr
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435 440
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA CAR
<400> 176
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<220>
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<400> 177
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195 200 205
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
610 615 620
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
625 630 635 640
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650 655
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 179
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a TM
<400> 179
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20
<210> 180
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接肽
<400> 180
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1
<210> 181
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 181
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 182
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 182
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser
85 90 95
Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 183
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 183
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Arg Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 185
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 185
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 186
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 186
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp Arg Ser Arg Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 187
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链 (VH) 抗BCMA
<400> 187
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 188
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链 (VL) 抗BCMA
<400> 188
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 189
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 189
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 190
<211> 751
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> DGKα
<400> 190
Met Ala Lys Glu Arg Gly Leu Ile Ser Pro Ser Asp Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Gln Lys Tyr Met Glu Tyr Ser Thr Lys Lys Val Ser Asp Val Leu Lys
20 25 30
Leu Phe Glu Asp Gly Glu Met Ala Lys Tyr Val Gln Gly Asp Ala Ile
35 40 45
Gly Tyr Glu Gly Phe Gln Gln Phe Leu Lys Ile Tyr Leu Glu Val Asp
50 55 60
Asn Val Pro Arg His Leu Ser Leu Ala Leu Phe Gln Ser Phe Glu Thr
65 70 75 80
Gly His Cys Leu Asn Glu Thr Asn Val Thr Lys Asp Val Val Cys Leu
85 90 95
Asn Asp Val Ser Cys Tyr Phe Ser Leu Leu Glu Gly Gly Arg Pro Glu
100 105 110
Asp Lys Leu Glu Phe Thr Phe Lys Leu Tyr Asp Thr Asp Arg Asn Gly
115 120 125
Ile Leu Asp Ser Ser Glu Val Asp Lys Ile Ile Leu Gln Met Met Arg
130 135 140
Val Ala Glu Tyr Leu Asp Trp Asp Val Ser Glu Leu Arg Pro Ile Leu
145 150 155 160
Gln Glu Met Met Lys Glu Ile Asp Tyr Asp Gly Ser Gly Ser Val Ser
165 170 175
Gln Ala Glu Trp Val Arg Ala Gly Ala Thr Thr Val Pro Leu Leu Val
180 185 190
Leu Leu Gly Leu Glu Met Thr Leu Lys Asp Asp Gly Gln His Met Trp
195 200 205
Arg Pro Lys Arg Phe Pro Arg Pro Val Tyr Cys Asn Leu Cys Glu Ser
210 215 220
Ser Ile Gly Leu Gly Lys Gln Gly Leu Ser Cys Asn Leu Cys Lys Tyr
225 230 235 240
Thr Val His Asp Gln Cys Ala Met Lys Ala Leu Pro Cys Glu Val Ser
245 250 255
Thr Tyr Ala Lys Ser Arg Lys Asp Ile Gly Val Gln Ser His Val Trp
260 265 270
Val Arg Gly Gly Cys Glu Ser Gly Arg Cys Asp Arg Cys Gln Lys Lys
275 280 285
Ile Arg Ile Tyr His Ser Leu Thr Gly Leu His Cys Val Trp Cys His
290 295 300
Leu Glu Ile His Asp Asp Cys Leu Gln Ala Val Gly His Glu Cys Asp
305 310 315 320
Cys Gly Leu Leu Arg Asp His Ile Leu Pro Pro Ser Ser Ile Tyr Pro
325 330 335
Ser Val Leu Ala Ser Gly Pro Asp Arg Lys Asn Ser Lys Thr Ser Gln
340 345 350
Lys Thr Met Asp Asp Leu Asn Leu Ser Thr Ser Glu Ala Leu Arg Ile
355 360 365
Asp Pro Val Pro Asn Thr His Pro Leu Leu Val Phe Val Asn Pro Lys
370 375 380
Ser Gly Gly Lys Gln Gly Gln Arg Val Leu Trp Lys Phe Gln Tyr Ile
385 390 395 400
Leu Asn Pro Arg Gln Val Phe Asn Leu Leu Lys Asp Gly Pro Glu Ile
405 410 415
Gly Leu Arg Leu Phe Lys Asp Val Pro Asp Ser Arg Ile Leu Val Cys
420 425 430
Gly Gly Asp Gly Thr Val Gly Trp Ile Leu Glu Thr Ile Asp Lys Ala
435 440 445
Asn Leu Pro Val Leu Pro Pro Val Ala Val Leu Pro Leu Gly Thr Gly
450 455 460
Asn Asp Leu Ala Arg Cys Leu Arg Trp Gly Gly Gly Tyr Glu Gly Gln
465 470 475 480
Asn Leu Ala Lys Ile Leu Lys Asp Leu Glu Met Ser Lys Val Val His
485 490 495
Met Asp Arg Trp Ser Val Glu Val Ile Pro Gln Gln Thr Glu Glu Lys
500 505 510
Ser Asp Pro Val Pro Phe Gln Ile Ile Asn Asn Tyr Phe Ser Ile Gly
515 520 525
Val Asp Ala Ser Ile Ala His Arg Phe His Ile Met Arg Glu Lys Tyr
530 535 540
Pro Glu Lys Phe Asn Ser Arg Met Lys Asn Lys Leu Trp Tyr Phe Glu
545 550 555 560
Phe Ala Thr Ser Glu Ser Ile Phe Ser Thr Cys Lys Lys Leu Glu Glu
565 570 575
Ser Leu Thr Val Glu Ile Cys Gly Lys Pro Leu Asp Leu Ser Asn Leu
580 585 590
Ser Leu Glu Gly Ile Ala Val Leu Asn Ile Pro Ser Met His Gly Gly
595 600 605
Ser Asn Leu Trp Gly Asp Thr Arg Arg Pro His Gly Asp Ile Tyr Gly
610 615 620
Ile Asn Gln Ala Leu Gly Ala Thr Ala Lys Val Ile Thr Asp Pro Asp
625 630 635 640
Ile Leu Lys Thr Cys Val Pro Asp Leu Ser Asp Lys Arg Leu Glu Val
645 650 655
Val Gly Leu Glu Gly Ala Ile Glu Met Gly Gln Ile Tyr Thr Lys Leu
660 665 670
Lys Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Lys Cys Ser Glu Ile Thr Phe His
675 680 685
Thr Thr Lys Thr Leu Pro Met Gln Ile Asp Gly Glu Pro Trp Met Gln
690 695 700
Thr Pro Cys Thr Ile Lys Ile Thr His Lys Asn Gln Met Pro Met Leu
705 710 715 720
Met Gly Pro Pro Pro Arg Ser Thr Asn Phe Phe Gly Phe Leu Ser Gly
725 730 735
Ser Ser Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
740 745 750
<210> 191
<211> 944
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> DGKζ
<400> 191
Met Glu Pro Arg Asp Gly Ser Pro Glu Ala Arg Ser Ser Asp Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Glu Arg Asp Ala Gly Pro Glu
20 25 30
Pro Asp Lys Ala Pro Arg Arg Leu Asn Lys Arg Arg Phe Pro Gly Leu
35 40 45
Arg Leu Phe Gly His Arg Lys Ala Ile Thr Lys Ser Gly Leu Gln His
50 55 60
Leu Ala Pro Pro Pro Pro Thr Pro Gly Ala Pro Cys Ser Glu Ser Glu
65 70 75 80
Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Asp Trp Ser Glu Ser Ala Thr Tyr Gly
85 90 95
Glu His Ile Trp Phe Glu Thr Asn Val Ser Gly Asp Phe Cys Tyr Val
100 105 110
Gly Glu Gln Tyr Cys Val Ala Arg Leu Gln Lys Ser Val Ser Arg Arg
115 120 125
Lys Cys Ala Ala Cys Lys Ile Val Val His Thr Pro Cys Ile Glu Gln
130 135 140
Leu Glu Lys Ile Asn Phe Arg Cys Lys Pro Ser Phe Arg Glu Ser Gly
145 150 155 160
Ser Arg Asn Val Arg Glu Pro Thr Phe Val Arg His His Trp Val His
165 170 175
Arg Arg Arg Gln Asp Gly Lys Cys Arg His Cys Gly Lys Gly Phe Gln
180 185 190
Gln Lys Phe Thr Phe His Ser Lys Glu Ile Val Ala Ile Ser Cys Ser
195 200 205
Trp Cys Lys Gln Ala Tyr His Ser Lys Val Ser Cys Phe Met Leu Gln
210 215 220
Gln Ile Glu Glu Pro Cys Ser Leu Gly Val His Ala Ala Val Val Ile
225 230 235 240
Pro Pro Thr Trp Ile Leu Arg Ala Arg Arg Pro Gln Asn Thr Leu Lys
245 250 255
Ala Ser Lys Lys Lys Lys Arg Ala Ser Phe Lys Arg Lys Ser Ser Lys
260 265 270
Lys Gly Pro Glu Glu Gly Arg Trp Arg Pro Phe Ile Ile Arg Pro Thr
275 280 285
Pro Ser Pro Leu Met Lys Pro Leu Leu Val Phe Val Asn Pro Lys Ser
290 295 300
Gly Gly Asn Gln Gly Ala Lys Ile Ile Gln Ser Phe Leu Trp Tyr Leu
305 310 315 320
Asn Pro Arg Gln Val Phe Asp Leu Ser Gln Gly Gly Pro Lys Glu Ala
325 330 335
Leu Glu Met Tyr Arg Lys Val His Asn Leu Arg Ile Leu Ala Cys Gly
340 345 350
Gly Asp Gly Thr Val Gly Trp Ile Leu Ser Thr Leu Asp Gln Leu Arg
355 360 365
Leu Lys Pro Pro Pro Pro Val Ala Ile Leu Pro Leu Gly Thr Gly Asn
370 375 380
Asp Leu Ala Arg Thr Leu Asn Trp Gly Gly Gly Tyr Thr Asp Glu Pro
385 390 395 400
Val Ser Lys Ile Leu Ser His Val Glu Glu Gly Asn Val Val Gln Leu
405 410 415
Asp Arg Trp Asp Leu His Ala Glu Pro Asn Pro Glu Ala Gly Pro Glu
420 425 430
Asp Arg Asp Glu Gly Ala Thr Asp Arg Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn
435 440 445
Asn Tyr Phe Ser Leu Gly Phe Asp Ala His Val Thr Leu Glu Phe His
450 455 460
Glu Ser Arg Glu Ala Asn Pro Glu Lys Phe Asn Ser Arg Phe Arg Asn
465 470 475 480
Lys Met Phe Tyr Ala Gly Thr Ala Phe Ser Asp Phe Leu Met Gly Ser
485 490 495
Ser Lys Asp Leu Ala Lys His Ile Arg Val Val Cys Asp Gly Met Asp
500 505 510
Leu Thr Pro Lys Ile Gln Asp Leu Lys Pro Gln Cys Val Val Phe Leu
515 520 525
Asn Ile Pro Arg Tyr Cys Ala Gly Thr Met Pro Trp Gly His Pro Gly
530 535 540
Glu His His Asp Phe Glu Pro Gln Arg His Asp Asp Gly Tyr Leu Glu
545 550 555 560
Val Ile Gly Phe Thr Met Thr Ser Leu Ala Ala Leu Gln Val Gly Gly
565 570 575
His Gly Glu Arg Leu Thr Gln Cys Arg Glu Val Val Leu Thr Thr Ser
580 585 590
Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Asp Gly Glu Pro Cys Lys Leu Ala Ala
595 600 605
Ser Arg Ile Arg Ile Ala Leu Arg Asn Gln Ala Thr Met Val Gln Lys
610 615 620
Ala Lys Arg Arg Ser Ala Ala Pro Leu His Ser Asp Gln Gln Pro Val
625 630 635 640
Pro Glu Gln Leu Arg Ile Gln Val Ser Arg Val Ser Met His Asp Tyr
645 650 655
Glu Ala Leu His Tyr Asp Lys Glu Gln Leu Lys Glu Ala Ser Val Pro
660 665 670
Leu Gly Thr Val Val Val Pro Gly Asp Ser Asp Leu Glu Leu Cys Arg
675 680 685
Ala His Ile Glu Arg Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Ala Gly Ala Lys
690 695 700
Ser Pro Thr Cys Gln Lys Leu Ser Pro Lys Trp Cys Phe Leu Asp Ala
705 710 715 720
Thr Thr Ala Ser Arg Phe Tyr Arg Ile Asp Arg Ala Gln Glu His Leu
725 730 735
Asn Tyr Val Thr Glu Ile Ala Gln Asp Glu Ile Tyr Ile Leu Asp Pro
740 745 750
Glu Leu Leu Gly Ala Ser Ala Arg Pro Asp Leu Pro Thr Pro Thr Ser
755 760 765
Pro Leu Pro Thr Ser Pro Cys Ser Pro Thr Pro Arg Ser Leu Gln Gly
770 775 780
Asp Ala Ala Pro Pro Gln Gly Glu Glu Leu Ile Glu Ala Ala Lys Arg
785 790 795 800
Asn Asp Phe Cys Lys Leu Gln Glu Leu His Arg Ala Gly Gly Asp Leu
805 810 815
Met His Arg Asp Glu Gln Ser Arg Thr Leu Leu His His Ala Val Ser
820 825 830
Thr Gly Ser Lys Asp Val Val Arg Tyr Leu Leu Asp His Ala Pro Pro
835 840 845
Glu Ile Leu Asp Ala Val Glu Glu Asn Gly Glu Thr Cys Leu His Gln
850 855 860
Ala Ala Ala Leu Gly Gln Arg Thr Ile Cys His Tyr Ile Val Glu Ala
865 870 875 880
Gly Ala Ser Leu Met Lys Thr Asp Gln Gln Gly Asp Thr Pro Arg Gln
885 890 895
Arg Ala Glu Lys Ala Gln Asp Thr Glu Leu Ala Ala Tyr Leu Glu Asn
900 905 910
Arg Gln His Tyr Gln Met Ile Gln Arg Glu Asp Gln Glu Thr Ala Val
915 920 925
Gly Ser Ser Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
930 935 940
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E6(18-26)
<400> 192
Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu
1 5
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E6(29-38)
<400> 193
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E6(52-60)
<400> 194
Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val
1 5
<210> 195
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E7(86-93)
<400> 195
Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
1 5
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E7(11-19)
<400> 196
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E7(85-93)
<400> 197
Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
1 5
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E7(82-90)
<400> 198
Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val
1 5
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> HPV E7(7-15)
<400> 199
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu
1 5
<210> 200
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57 α可变区 + 恒定区
<400> 200
atggtgctga agttttctgt gagcatcctg tggattcagc tggcctgggt gtccacccag 60
ctcctggagc agagccccca gttcctgtcc atccaggagg gcgagaacct gaccgtgtac 120
tgcaacagct cttctgtctt ttcatcactg cagtggtata gacaagaacc gggtgaaggt 180
ccagttctgc tggtgaccgt cgtcaccggc ggcgaggtga agaagctaaa gcgcctgacg 240
ttccagttcg gagacgcgcg gaaggactcg tcgctgcaca tcaccgccgc ccagcccggc 300
gacaccggcc tgtacctgtg cgctggcgcg cgcaacttca acaagttcta cttcggcagc 360
ggcaccaagc tgaacgtgaa accgaatatc cagaatccgg accccgcggt atatcaactg 420
cgcgactcaa aatcatccga taagagtgtc tgtttgttta ctgacttcga cagtcaaact 480
aatgtctctc agagcaaaga ttccgatgtc tacatcactg acaagtgcgt tctggatatg 540
cggagcatgg attttaagtc caactccgcc gtagcctggt ccaacaagtc agactttgcc 600
tgtgcaaatg ctttcaacaa ctcaattatc cctgaggaca ctttctttcc ttcaccggag 660
tcctcatgcg atgttaaact ggtcgaaaaa tcttttgaga cggatacgaa cctcaacttc 720
caaaatttga gcgttattgg ctttaggatt ctgcttctca aggttgcggg gttcaatctc 780
ctgatgacgt tgcggctttg gagcagctaa 810
<210> 201
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57 α可变区 + 恒定区
<400> 201
Thr Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr
35 40 45
Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln
50 55 60
Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln
65 70 75 80
Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Arg Asn Phe Asn
85 90 95
Lys Phe Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asn Val Lys Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser
115 120 125
Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val
130 135 140
Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu
145 150 155 160
Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser
165 170 175
Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile
180 185 190
Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys
195 200 205
Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn
210 215 220
Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe
225 230 235 240
Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 202
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57 α可变区
<400> 202
Thr Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr
35 40 45
Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln
50 55 60
Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln
65 70 75 80
Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Arg Asn Phe Asn
85 90 95
Lys Phe Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asn Val Lys Pro
100 105 110
<210> 203
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57 α CDR1
<400> 203
Ser Val Phe Ser Ser
1 5
<210> 204
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57 α CDR2
<400> 204
Val Val Thr Gly Gly Glu Val
1 5
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57 α CDR3
<400> 205
Ala Gly Ala Arg Asn Phe Asn Lys Phe Tyr
1 5 10
<210> 206
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β可变区 + 恒定区
<400> 206
atgctcctgc tgcttctgct cctcgggccc ggcagcggtc tcggcgccgt cgtgtcgcag 60
cacccgtcgt gggtgatttg caagagcgga acgagcgtga agatcgagtg ccgctcgctc 120
gacttccagg ccacaaccat gttctggtac cgccagtttc ccaagcagag cctcatgctg 180
atggccacaa gcaatgaagg cagcaaggcc acttatgaac agggcgtgga gaaggacaag 240
tttctgatca accacgcctc cctgaccctg tccaccctca ctgtgaccag cgcccaccct 300
gaggacagca gcttctacat ctgcagcgcc cgcagctgga ggggcggcct ggagcagttc 360
ttcggccctg gcacccggct gacagtgctg gaagatctga agaacgtctt cccacctgag 420
gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg 480
tgtctggcca ccggcttcta tcccgatcac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540
gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac 600
gacagcagat actgcctgag cagcagactg agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc 660
agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 720
caggatagag ccaagcctgt gacacagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 780
tgtggcttta ccagcgagag ctaccagcag ggcgtgctgt ctgccacaat cctgtacgag 840
atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 900
atggtcaagc ggaaggatag cagaggc 927
<210> 207
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β可变区 + 恒定区
<400> 207
Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr
20 25 30
Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala
35 40 45
Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys
50 55 60
Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr
65 70 75 80
Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala
85 90 95
Arg Ser Trp Arg Gly Gly Leu Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg
100 105 110
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
115 120 125
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
130 135 140
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
145 150 155 160
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
165 170 175
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
180 185 190
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
195 200 205
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
210 215 220
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
225 230 235 240
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
245 250 255
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
260 265 270
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
275 280 285
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
290 295
<210> 208
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β可变区
<400> 208
Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr
20 25 30
Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala
35 40 45
Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys
50 55 60
Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr
65 70 75 80
Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala
85 90 95
Arg Ser Trp Arg Gly Gly Leu Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg
100 105 110
Leu Thr Val Leu
115
<210> 209
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β CDR1
<400> 209
Asp Phe Gln Ala Thr Thr
1 5
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β CDR2
<400> 210
Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala
1 5
<210> 211
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β CDR3
<400> 211
Ser Ala Arg Ser Trp Arg Gly Gly Leu Glu Gln Phe
1 5 10
<210> 212
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 57β-P2A-α
<400> 212
atgctgctgc ttctgctgct tctggggcca ggctccgggc ttggtgctgt cgtctctcaa 60
catccgagct gggttatctg taagagtgga acctctgtga agatcgagtg ccgttccctg 120
gactttcagg ccacaactat gttttggtat cgtcagttcc cgaaacagag tctcatgctg 180
atggcaactt ccaatgaggg ctccaaggcc acatacgagc aaggcgtcga gaaggacaag 240
tttctcatca accatgcaag cctgaccttg tccactctga cagtgaccag tgcccatcct 300
gaagacagca gcttctacat ctgcagtgct agatcttggc gggggggcct tgagcagttc 360
ttcgggccag ggacacggct caccgtgcta gaagatctga agaacgtctt cccacctgag 420
gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg 480
tgtctggcca ccggcttcta tcccgatcac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540
gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac 600
gacagcagat actgcctgag cagcagactg agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc 660
agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 720
caggatagag ccaagcctgt gacacagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 780
tgtggcttta ccagcgagag ctaccagcag ggcgtgctgt ctgccacaat cctgtacgag 840
atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 900
atggtcaagc ggaaggatag cagaggcgga agcggcgcca caaacttctc actgctgaaa 960
caggctggcg acgtggagga gaatcctggc ccaatggtcc tgaaattctc cgtgtccatt 1020
ctttggattc agttggcatg ggtgagcacc cagctgctgg agcagagccc tcagtttcta 1080
agcatccaag agggagaaaa tctcactgtg tactgcaact cctcaagtgt tttttccagc 1140
ttacaatggt acagacagga gcctggggaa ggtcctgtcc tcctggtgac agtagttacg 1200
ggtggagaag tgaagaagct gaagagacta acctttcagt ttggtgatgc aagaaaggac 1260
agttctctcc acatcactgc agcccagcct ggtgatacag gcctctacct ctgtgcagga 1320
gctcgcaact tcaacaaatt ttactttgga tctgggacca aactcaatgt aaaaccaaat 1380
atccagaatc cggaccccgc ggtatatcaa ctgcgcgact caaaatcatc cgataagagt 1440
gtctgtttgt ttactgactt cgacagtcaa actaatgtct ctcagagcaa agattccgat 1500
gtctacatca ctgacaagtg cgttctggat atgcggagca tggattttaa gtccaactcc 1560
gccgtagcct ggtccaacaa gtcagacttt gcctgtgcaa atgctttcaa caactcaatt 1620
atccctgagg acactttctt tccttcaccg gagtcctcat gcgatgttaa actggtcgaa 1680
aaatcttttg agacggatac gaacctcaac ttccaaaatt tgagcgttat tggctttagg 1740
attctgcttc tcaaggttgc ggggttcaat ctcctgatga cgttgcggct ttggagcagc 1800
<210> 213
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37 α可变区 + 恒定区
<400> 213
atgaagaaac tgctggccat gatcctgtgg ctgcagctgg atagactgag cggcgagctg 60
aaggtggaac agaaccctct gttcctgagc atgcaagagg gcaagaacta caccatctac 120
tgcaactaca gcaccaccag cgaccggctg tactggtaca gacaggatcc aggcaagagc 180
ctggaaagcc tgttcgtgct gctgagcaat ggcgccgtga aacaagaggg tagactgatg 240
gccagcctgg acaccaaggc cagactgagc acactgcaca ttacagccgc cgtgcacgat 300
ctgagcgcca cctatttttg tgccggctac tctggcgccg gaagctacca gctgacattt 360
ggcaagggca ccaagctgag cgtgatcccc 390
<210> 214
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37 α可变区 + 恒定区
<400> 214
Glu Leu Lys Val Glu Gln Asn Pro Leu Phe Leu Ser Met Gln Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asn Tyr Thr Ile Tyr Cys Asn Tyr Ser Thr Thr Ser Asp Arg Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Ser Leu Glu Ser Leu Phe Val
35 40 45
Leu Leu Ser Asn Gly Ala Val Lys Gln Glu Gly Arg Leu Met Ala Ser
50 55 60
Leu Asp Thr Lys Ala Arg Leu Ser Thr Leu His Ile Thr Ala Ala Val
65 70 75 80
His Asp Leu Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Gly
85 90 95
Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile Pro
100 105 110
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
130 135 140
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
145 150 155 160
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
165 170 175
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
180 185 190
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
195 200 205
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
210 215 220
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
225 230 235 240
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 215
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37 α可变区
<400> 215
Glu Leu Lys Val Glu Gln Asn Pro Leu Phe Leu Ser Met Gln Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asn Tyr Thr Ile Tyr Cys Asn Tyr Ser Thr Thr Ser Asp Arg Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Ser Leu Glu Ser Leu Phe Val
35 40 45
Leu Leu Ser Asn Gly Ala Val Lys Gln Glu Gly Arg Leu Met Ala Ser
50 55 60
Leu Asp Thr Lys Ala Arg Leu Ser Thr Leu His Ile Thr Ala Ala Val
65 70 75 80
His Asp Leu Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Gly
85 90 95
Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile Pro
100 105 110
<210> 216
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37β可变区 + 恒定区
<400> 216
atgggaacaa gactgctgtg ttgggtcgtg ctgggcttcc tgggcacaga tcatacaggt 60
gccggtgtct ctcagagccc cagatacaag gtggccaagc gcggacagga tgtggccctg 120
agatgtgatc ctatcagcgg ccacgtgtcc ctgttctggt atcagcaggc tctcggacag 180
ggccccgagt tcctgaccta ctttcagaat gaggcccagc tggacaagag cggcctgcct 240
agcgatagat tcttcgccga aagacccgag ggcagcgtgt ccacactgaa gatccagaga 300
acccagcaag aggacagcgc cgtgtacctg tgtgcctcta gtctgctgct gggcgcctac 360
ggctacacat ttggctctgg caccagactg accgtggtc 399
<210> 217
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37β可变区 + 恒定区
<400> 217
Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg Gly
1 5 10 15
Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr
35 40 45
Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg
50 55 60
Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu
85 90 95
Leu Leu Gly Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro
165 170 175
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
180 185 190
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
195 200 205
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
210 215 220
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
225 230 235 240
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val
245 250 255
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
260 265 270
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
275 280 285
Lys Asp Phe
290
<210> 218
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37β可变区
<400> 218
Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg Gly
1 5 10 15
Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr
35 40 45
Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg
50 55 60
Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu
85 90 95
Leu Leu Gly Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Val
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37 α CDR1
<400> 219
Thr Thr Ser Asp Arg
1 5
<210> 220
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37 α CDR2
<400> 220
Leu Leu Ser Asn Gly Ala Val
1 5
<210> 221
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37 α CDR3
<400> 221
Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr
1 5 10
<210> 222
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37β CDR1
<400> 222
Ser Gly His Val Ser
1 5
<210> 223
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37β CDR2
<400> 223
Phe Gln Asn Glu Ala Gln
1 5
<210> 224
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 37β CDR3
<400> 224
Ala Ser Ser Leu Leu Leu Gly Ala Tyr Gly Tyr Thr
1 5 10
<210> 225
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49 α可变区 + 恒定区
<400> 225
atgatgaagt ccctgcgggt gctgctggtc atcctgtggc tgcaactgag ctgggtctgg 60
tcccagcaga aagaggtgga acagaacagc ggccctctgt ctgttcctga aggcgctatc 120
gccagcctga actgcaccta cagcgataga ggcagccaga gcttcttctg gtacagacag 180
tacagcggca agagccccga gctgatcatg ttcatctaca gcaacggcga caaagaggac 240
ggccggttta cagcccagct gaacaaggcc agccagtacg tgtccctgct gatcagagat 300
agccagccta gcgacagcgc cacctatctg tgcgccgtga atatcggcac cagcggcacc 360
tacaagtaca tcttcggcac cggcaccaga ctgaaggtgc tggct 405
<210> 226
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49 α可变区 + 恒定区
<400> 226
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ile Gly Thr Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Lys Val Leu
100 105 110
Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
195 200 205
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
210 215 220
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
225 230 235 240
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 227
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49 α可变区
<400> 227
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ile Gly Thr Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Lys Val Leu
100 105 110
Ala
<210> 228
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49β可变区 + 恒定区
<400> 228
atggatacct ggctcgtgtg ctgggccatc ttcagcctgc tgaaagccgg actgaccgag 60
cctgaagtga cccagacacc tagccaccaa gtgacacaga tgggccaaga agtgatcctg 120
cgctgcgtgc ccatcagcaa ccacctgtac ttctactggt acagacagat cctgggccag 180
aaagtggaat tcctggtgtc cttctacaac aacgagatca gcgagaagtc cgagatcttc 240
gacgaccagt tcagcgtgga aagacccgac ggcagcaact tcaccctgaa gatcagaagc 300
accaagctcg aggacagcgc catgtacttt tgcgccagca caccccggta cagctacgag 360
cagtatttcg gccctggcac cagactgacc gtgaca 396
<210> 229
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49β可变区 + 恒定区
<400> 229
Glu Pro Glu Val Thr Gln Thr Pro Ser His Gln Val Thr Gln Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Ile Leu Arg Cys Val Pro Ile Ser Asn His Leu Tyr Phe
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile Leu Gly Gln Lys Val Glu Phe Leu Val Ser
35 40 45
Phe Tyr Asn Asn Glu Ile Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Asp Asp Gln
50 55 60
Phe Ser Val Glu Arg Pro Asp Gly Ser Asn Phe Thr Leu Lys Ile Arg
65 70 75 80
Ser Thr Lys Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val
100 105 110
Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
115 120 125
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
130 135 140
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
145 150 155 160
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
165 170 175
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
180 185 190
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
195 200 205
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
210 215 220
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
225 230 235 240
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
245 250 255
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
260 265 270
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
275 280 285
Asp Ser Arg Gly
290
<210> 230
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49β可变区
<400> 230
Glu Pro Glu Val Thr Gln Thr Pro Ser His Gln Val Thr Gln Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Ile Leu Arg Cys Val Pro Ile Ser Asn His Leu Tyr Phe
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile Leu Gly Gln Lys Val Glu Phe Leu Val Ser
35 40 45
Phe Tyr Asn Asn Glu Ile Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Asp Asp Gln
50 55 60
Phe Ser Val Glu Arg Pro Asp Gly Ser Asn Phe Thr Leu Lys Ile Arg
65 70 75 80
Ser Thr Lys Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Pro
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val
100 105 110
Thr
<210> 231
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49 α CDR1
<400> 231
Asp Arg Gly Ser Gln Ser
1 5
<210> 232
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49 α CDR2
<400> 232
Ile Tyr Ser Asn Gly Asp
1 5
<210> 233
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49 α CDR3
<400> 233
Ala Val Asn Ile Gly Thr Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile
1 5 10
<210> 234
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49β CDR1
<400> 234
Ser Asn His Leu Tyr
1 5
<210> 235
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49β CDR2
<400> 235
Phe Tyr Asn Asn Glu Ile
1 5
<210> 236
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 49β CDR3
<400> 236
Ala Ser Thr Pro Arg Tyr Ser Tyr Glu Gln Tyr
1 5 10
<210> 237
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53 α可变区 + 恒定区
<400> 237
atggccagcg ctcctatctc tatgctggcc atgctgttca ccctgagcgg actgagagca 60
cagtctgtgg cccagcctga ggaccaagtg aatgtggccg agggcaatcc cctgaccgtg 120
aagtgtacct acagcgtgtc cggcaatccc tacctgtttt ggtacgtgca gtaccccaac 180
cggggcctgc agttcctgct gaagtacatc accggcgaca acctggtcaa gggcagctat 240
ggattcgagg ccgagttcaa caagagccag accagcttcc acctgaagaa acccagcgct 300
ctggtgtccg atagcgccct gtatttctgc gccgtcagag attttggcag cggcacctac 360
aagtacatct tcggcaccgg caccagactg aaggtgctgg ct 402
<210> 238
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53 α可变区 + 恒定区
<400> 238
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50 55 60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Lys
100 105 110
Val Leu Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
115 120 125
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
130 135 140
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
145 150 155 160
Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
165 170 175
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
180 185 190
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
195 200 205
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
210 215 220
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
225 230 235 240
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250 255
<210> 239
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53 α可变区
<400> 239
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50 55 60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Lys
100 105 110
Val Leu Ala
115
<210> 240
<211> 404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53β可变区 + 恒定区
<400> 240
atgggcacaa gcctgctgtg ttgggtcgtg ctgggctttc tgggcacaga tcatacaggc 60
gccggtgtca gccagtctcc tcggtacaaa gtgaccaagc gcggacagga tgtggccctg 120
agatgcgatc ctatctctgg ccacgtgtcc ctgtactggt acagacaggc tctcggacag 180
ggccccgagt tcctgaccta cttcaattac gaggcccagc aggacaagag cggcctgcct 240
aacgatagat tcagcgccga aagacccgag ggcagcatca gcacactgac catccagaga 300
accgagcaga gggacagcgc catgtacaga tgtgcctcta gcggcagcgg caccagcggc 360
tacaatgagc agtttttcgg ccctggcacc agactgacag tgct 404
<210> 241
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53β可变区 + 恒定区
<400> 241
Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr Lys Arg Gly
1 5 10 15
Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr
35 40 45
Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro Asn Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala Ser Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Ser Gly Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg
100 105 110
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
115 120 125
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
130 135 140
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
145 150 155 160
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
165 170 175
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
180 185 190
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
195 200 205
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
210 215 220
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
225 230 235 240
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
245 250 255
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
260 265 270
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
275 280 285
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
290 295
<210> 242
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53β可变区
<400> 242
Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr Lys Arg Gly
1 5 10 15
Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr
35 40 45
Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro Asn Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala Ser Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Ser Gly Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg
100 105 110
Leu Thr Val Leu
115
<210> 243
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53 α CDR1
<400> 243
Val Ser Gly Asn Pro Tyr
1 5
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53 α CDR2
<400> 244
Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val
1 5
<210> 245
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53 α CDR3
<400> 245
Ala Val Arg Asp Phe Gly Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile
1 5 10
<210> 246
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53β CDR1
<400> 246
Ser Gly His Val Ser
1 5
<210> 247
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53β CDR2
<400> 247
Phe Asn Tyr Glu Ala Gln
1 5
<210> 248
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR 53β CDR3
<400> 248
Ala Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ser Gly Tyr Asn Glu Gln Phe
1 5 10
<210> 249
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA scFv
<400> 249
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 250
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA scFv
<400> 250
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 251
<211> 2256
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> DGKα
<400> 251
atggccaagg agaggggcct aataagcccc agtgattttg cccagctgca aaaatacatg 60
gaatactcca ccaaaaaggt cagtgatgtc ctaaagctct tcgaggatgg cgagatggct 120
aaatatgtcc aaggagatgc cattgggtac gagggattcc agcaattcct gaaaatctat 180
ctcgaagtgg ataatgttcc cagacaccta agcctggcac tgtttcaatc ctttgagact 240
ggtcactgct taaatgagac aaatgtgaca aaagatgtgg tgtgtctcaa tgatgtttcc 300
tgctactttt cccttctgga gggtggtcgg ccagaagaca agttagaatt caccttcaag 360
ctgtacgaca cggacagaaa tgggatcctg gacagctcag aagtggacaa aattatccta 420
cagatgatgc gagtggctga atacctggat tgggatgtgt ctgagctgag gccgattctt 480
caggagatga tgaaagagat tgactatgat ggcagtggct ctgtctctca agctgagtgg 540
gtccgggctg gggccaccac cgtgccactg ctagtgctgc tgggtctgga gatgactctg 600
aaggacgacg gacagcacat gtggaggccc aagaggttcc ccagaccagt ctactgcaat 660
ctgtgcgagt caagcattgg tcttggcaaa cagggactga gctgtaacct ctgtaagtac 720
actgttcacg accagtgtgc catgaaagcc ctgccttgtg aagtcagcac ctatgccaag 780
tctcggaagg acattggtgt ccaatcacat gtgtgggtgc gaggaggctg tgagtccggg 840
cgctgcgacc gctgtcagaa aaagatccgg atctaccaca gtctgaccgg gctgcattgt 900
gtatggtgcc acctagagat ccacgatgac tgcctgcaag cggtgggcca tgagtgtgac 960
tgtgggctgc tccgggatca catcctgcct ccatcttcca tctatcccag tgtcctggcc 1020
tctggaccgg atcgtaaaaa tagcaaaaca agccagaaga ccatggatga tttaaatttg 1080
agcacctctg aggctctgcg gattgaccct gttcctaaca cccacccact tctcgtcttt 1140
gtcaatccta agagtggcgg gaagcagggg cagagggtgc tctggaagtt ccagtatata 1200
ttaaaccctc gacaggtgtt caacctccta aaggatggtc ctgagatagg gctccgatta 1260
ttcaaggatg ttcctgatag ccggattttg gtgtgtggtg gagacggcac agtaggctgg 1320
attctagaga ccattgacaa agctaacttg ccagttttgc ctcctgttgc tgtgttgccc 1380
ctgggtactg gaaatgatct ggctcgatgc ctaagatggg gaggaggtta tgaaggacag 1440
aatctggcaa agatcctcaa ggatttagag atgagtaaag tggtacatat ggatcgatgg 1500
tctgtggagg tgatacctca acaaactgaa gaaaaaagtg acccagtccc ctttcaaatc 1560
atcaataact acttctctat tggcgtggat gcctctattg ctcatcgatt ccacatcatg 1620
cgagagaaat atccggagaa gttcaacagc agaatgaaga acaagctatg gtacttcgaa 1680
tttgccacat ctgaatccat cttctcaaca tgcaaaaagc tggaggagtc tttgacagtt 1740
gagatctgtg ggaaaccgct ggatctgagc aacctgtccc tagaaggcat cgcagtgcta 1800
aacatcccta gcatgcatgg tggctccaac ctctggggtg ataccaggag accccatggg 1860
gatatctatg ggatcaacca ggccttaggt gctacagcta aagtcatcac cgaccctgat 1920
atcctgaaaa cctgtgtacc agacctaagt gacaagagac tggaagtggt tgggctggag 1980
ggtgcaattg agatgggcca aatctatacc aagctcaaga atgctggacg tcggctggcc 2040
aagtgctctg agatcacctt ccacaccaca aaaacccttc ccatgcaaat tgacggagaa 2100
ccctggatgc agacgccctg tacaatcaag atcacccaca agaaccagat gcccatgctc 2160
atgggcccac ccccccgctc caccaatttc tttggcttct tgagcggatc ctcggagaca 2220
gtgcggtttc agggacacca ccaccatcac cactga 2256
<210> 252
<211> 2838
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> DGKζ
<400> 252
atggagccgc gggacggtag ccccgaggcc cggagcagcg actccgagtc ggcttccgcc 60
tcgtccagcg gctccgagcg cgacgccggt cccgagccgg acaaggcgcc gcggcgactc 120
aacaagcggc gcttcccggg gctgcggctc ttcgggcaca ggaaagccat cacgaagtcg 180
ggcctccagc acctggcccc ccctccgccc acccctgggg ccccgtgcag cgagtcagag 240
cggcagatcc ggagtacagt ggactggagc gagtcagcga catatgggga gcacatctgg 300
ttcgagacca acgtgtccgg ggacttctgc tacgttgggg agcagtactg tgtagccagg 360
atgctgcaga agtcagtgtc tcgaagaaag tgcgcagcct gcaagattgt ggtgcacacg 420
ccctgcatcg agcagctgga gaagataaat ttccgctgta agccgtcctt ccgtgaatca 480
ggctccagga atgtccgcga gccaaccttt gtacggcacc actgggtaca cagacgacgc 540
caggacggca agtgtcggca ctgtgggaag ggattccagc agaagttcac cttccacagc 600
aaggagattg tggccatcag ctgctcgtgg tgcaagcagg cataccacag caaggtgtcc 660
tgcttcatgc tgcagcagat cgaggagccg tgctcgctgg gggtccacgc agccgtggtc 720
atcccgccca cctggatcct ccgcgcccgg aggccccaga atactctgaa agcaagcaag 780
aagaagaaga gggcatcctt caagaggaag tccagcaaga aagggcctga ggagggccgc 840
tggagaccct tcatcatcag gcccaccccc tccccgctca tgaagcccct gctggtgttt 900
gtgaacccca agagtggggg caaccagggt gcaaagatca tccagtcttt cctctggtat 960
ctcaatcccc gacaagtctt cgacctgagc cagggagggc ccaaggaggc gctggagatg 1020
taccgcaaag tgcacaacct gcggatcctg gcgtgcgggg gcgacggcac ggtgggctgg 1080
atcctctcca ccctggacca gctacgcctg aagccgccac cccctgttgc catcctgccc 1140
ctgggtactg gcaacgactt ggcccgaacc ctcaactggg gtgggggcta cacagatgag 1200
cctgtgtcca agatcctctc ccacgtggag gaggggaacg tggtacagct ggaccgctgg 1260
gacctccacg ctgagcccaa ccccgaggca gggcctgagg accgagatga aggcgccacc 1320
gaccggttgc ccctggatgt cttcaacaac tacttcagcc tgggctttga cgcccacgtc 1380
accctggagt tccacgagtc tcgagaggcc aacccagaga aattcaacag ccgctttcgg 1440
aataagatgt tctacgccgg gacagctttc tctgacttcc tgatgggcag ctccaaggac 1500
ctggccaagc acatccgagt ggtgtgtgat ggaatggact tgactcccaa gatccaggac 1560
ctgaaacccc agtgtgttgt tttcctgaac atccccaggt actgtgcggg caccatgccc 1620
tggggccacc ctggggagca ccacgacttt gagccccagc ggcatgacga cggctacctc 1680
gaggtcattg gcttcaccat gacgtcgttg gccgcgctgc aggtgggcgg acacggcgag 1740
cggctgacgc agtgtcgcga ggtggtgctc accacatcca aggccatccc ggtgcaggtg 1800
gatggcgagc cctgcaagct tgcagcctca cgcatccgca tcgccctgcg caaccaggcc 1860
accatggtgc agaaggccaa gcggcggagc gccgcccccc tgcacagcga ccagcagccg 1920
gtgccagagc agttgcgcat ccaggtgagt cgcgtcagca tgcacgacta tgaggccctg 1980
cactacgaca aggagcagct caaggaggcc tctgtgccgc tgggcactgt ggtggtccca 2040
ggagacagtg acctagagct ctgccgtgcc cacattgaga gactccagca ggagcccgat 2100
ggtgctggag ccaagtcccc gacatgccag aaactgtccc ccaagtggtg cttcctggac 2160
gccaccactg ccagccgctt ctacaggatc gaccgagccc aggagcacct caactatgtg 2220
actgagatcg cacaggatga gatttatatc ctggaccctg agctgctggg ggcatcggcc 2280
cggcctgacc tcccaacccc cacttcccct ctccccacct caccctgctc acccacgccc 2340
cggtcactgc aaggggatgc tgcaccccct caaggtgaag agctgattga ggctgccaag 2400
aggaacgact tctgtaagct ccaggagctg caccgagctg ggggcgacct catgcaccga 2460
gacgagcaga gtcgcacgct cctgcaccac gcagtcagca ctggcagcaa ggatgtggtc 2520
cgctacctgc tggaccacgc ccccccagag atccttgatg cggtggagga aaacggggag 2580
acctgtttgc accaagcagc ggccctgggc cagcgcacca tctgccacta catcgtggag 2640
gccggggcct cgctcatgaa gacagaccag cagggcgaca ctccccggca gcgggctgag 2700
aaggctcagg acaccgagct ggccgcctac ctggagaacc ggcagcacta ccagatgatc 2760
cagcgggagg accaggagac ggctgtggga tcctcggaga cagtgcggtt tcagggacac 2820
caccaccatc accactga 2838

Claims (78)

1.一种治疗方法，所述方法包括：
(a)向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法，其中所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞；以及
(b)向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
3.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
4.一种拯救T细胞疗法的工程化T细胞免于耗竭的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
5.一种用于减少或延迟T细胞疗法的T细胞的T细胞耗竭发作的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂，其中，在开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，先前已经向所述受试者施用T细胞疗法用于治疗疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后1至28天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后为或约1天、为或约2天、为或约3天、为或约4天、为或约5天、或为或约6天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂时，在来自所述受试者的生物样品中总重组受体表达T细胞的至少或至少约10％、至少或至少约20％、至少或至少约30％、至少或至少约40％、或至少或至少约50％具有耗竭表型。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中当为或约在所述受试者的血液中检测到或可检测到所述T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时，或者在所述受试者的血液中检测到或可检测到所述T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时的约一周内，开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
10.根据权利要求1-6和8-9中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后7至21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
11.根据权利要求1-6和8-10中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后7至14天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
12.根据权利要求1-6和8-11中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后为或约7天、为或约8天、为或约9天、为或约10天、为或约11天、为或约12天、为或约13天、或为或约14天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
13.根据权利要求1-6和8-10中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后15至21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
14.根据权利要求1-6、8-10和13中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后为或约15天、为或约16天、为或约17天、为或约18天、为或约19天、为或约20天、或为或约21天开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂的施用的开始与所述T细胞疗法的施用并行进行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之前开始施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
17.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者施用T细胞疗法用于治疗所述疾病或病症，所述T细胞疗法包括表达重组受体的工程化T细胞，其中，在开始施用所述T细胞疗法时，先前已经向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之前为或约1天或1天内、为或约2天或2天内、或为或约3天或3天内施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，在施用所述T细胞疗法之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每日施用为约200-400mg/m2，包含端值，任选地为或约300mg/m2的环磷酰胺，和/或为约20-40mg/m2，任选地为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为约500mg/m2的环磷酰胺。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每日施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中在所述淋巴细胞清除疗法之后2至7天向所述受试者施用所述T细胞疗法。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα的抑制剂，而不是DGKζ的显著抑制剂。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKζ的抑制剂，而不是DGKα的显著抑制剂。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是DGKα和DGKζ的抑制剂。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂不是其他DGK的显著抑制剂。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C3-4环烷基、C3-4氟环烷基、或-NO2；
R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3、或-P(O)(CH3)2；
每个R1a独立地是F、Cl、或-CN；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R3是H、F、Cl、Br、-CN、C1-2烷基、-CF3、环丙基、或-NO2；
R4a和R4b独立地是：
(i)被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基、或杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CH)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基、和杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
并且每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa、或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是-CN；
R2是-CH3；
R3是H、F或-CN；
R4是：
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
或者
32.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物：
或其盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至4个R1a取代的C3-4环烷基、被零至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe、或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、或-NRaRa；
每个Ra独立地是H或C1-3烷基；
每个Re独立地是被零至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2是H、被零至4个R2a取代的C1-3烷基、或被零至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R4是-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b、或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地是：
(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-6烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re、或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟基烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-4烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
R4d是-OCH3；
每个Rc独立地是H或C1-2烷基；
Rd是被零至1个选自以下的取代基取代的苯基：F、Cl、-CN、-CH3、和-OCH3；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-6烷基、被零至4个Rg取代的C2-4烯基、被零至4个Rg取代的C2-4炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至4个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地是F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)、或-NRcRc；
m是零、1、2、或3；并且
n是零、1或2。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1是H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被零至4个R1a取代的C1-3烷基、被零至3个R1a取代的环丙基、被零至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3或-P(O)(CH3)2；
R2是H或被零至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地是F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基、或C3-4炔基；
R4a和R4b独立地是：
(i)-CN或被零至4个独立地选自以下的取代基取代的C1-4烷基：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基、或5至10元杂芳基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟基烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟基烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、和Rd；或
(iii)被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代的C1-3烷基，所述环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被零至3个Rf取代；
每个Rf独立地是F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基、和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被零至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-NRcRc；
R4c是C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被零至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基、和-CN；
每个R5独立地是-CN、被零至4个Rg取代的C1-5烷基、被零至4个Rg取代的C2-3烯基、被零至4个Rg取代的C2-3炔基、被零至4个Rg取代的C3-4环烷基、被零至3个Rg取代的苯基、被零至3个Rg取代的噁二唑基、被零至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被零至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rx独立地是H或-CH3；并且
m是1、2或3。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
R1是-CN；
R2是-CH3；
R5a是-CH3或-CH2CH3；并且
R5c是-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
35.据权利要求32所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
/>
36.据权利要求32所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂是具有以下结构的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效实现所述工程化T细胞的抗原特异性或抗原受体驱动活性增加的量、时间、持续时间和/或频率施用。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效预防、抑制或延迟所述工程化T细胞中耗竭表型发作的量、时间、持续时间和/或频率施用。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以有效地至少部分逆转所述工程化T细胞中耗竭表型的量、时间、持续时间和/或频率施用。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述表达所述重组受体的工程化T细胞的耗竭水平是通过测量所述表达所述重组受体的工程化T细胞的细胞表面上的一种或多种耗竭标记的水平来确定的。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以从或从约0.25mg至约250mg的量施用。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂以从或从约0.5mg至约100mg的量施用。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述重组受体是工程化T细胞受体(eTCR)。
44.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述CAR是(利基迈仑赛)、TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)、KYMRIAHTM(替沙仑赛)、YESCARTATM(阿基仑赛)、/>(艾基维仑赛)、或CARVYKTITM(西达基奥仑赛)的CAR。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的方法，其中所述T细胞疗法是(利基迈仑赛)、TECARTUSTM(布瑞基奥仑赛)、KYMRIAHTM(替沙仑赛)、YESCARTATM(阿基仑赛)、(艾基维仑赛)、或CARVYKTITM(西达基奥仑赛)。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述重组受体结合靶抗原，所述靶抗原与所述疾病或病症相关，为所述疾病或病症所特有，和/或在所述疾病或病症的细胞或组织上表达。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病、或者感染性疾病。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是为B细胞恶性肿瘤的癌症。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
53.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液(液体)肿瘤。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1x105至1x109个总重组受体表达T细胞，包含端值。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1x105至5x108个总重组受体表达T细胞、1x106至2.5x108个总重组受体表达T细胞、5x106至1x108个总重组受体表达T细胞、1x107至2.5x108个总重组受体表达T细胞、或5x107至1x108个总重组受体表达T细胞，每个均包含端值。
56.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的细胞剂量包含从或从约1.5x107至6x108个总重组受体表达T细胞、1.5x108至6x108个总重组受体表达T细胞、或1.5x108至4.5x108个总重组受体表达T细胞，每个均包含端值。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中将所述T细胞疗法的细胞剂量肠胃外施用，任选地静脉内施用。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法包括从所述受试者获得的原代T细胞。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是自体的。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法的T细胞对于所述受试者是同种异体的。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法包括为CD4+或CD8+的T细胞。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法包括为CD4+和CD8+的T细胞。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用检查点拮抗剂。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述检查点拮抗剂是PD1/PD-L1轴拮抗剂。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述检查点拮抗剂是CTLA4拮抗剂。
66.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
67.根据权利要求64或权利要求66所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD1拮抗剂。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述人PD-1拮抗剂是纳武单抗或派姆单抗。
69.根据权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述人PD-1拮抗剂是纳武单抗或其变体。
70.根据权利要求64或权利要求66所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD-L1拮抗剂。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述人PD-L1拮抗剂是阿替利珠单抗。
72.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述CTLA4拮抗剂是人CTLA4拮抗剂。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述人CTLA4拮抗剂是伊匹单抗。
74.根据权利要求72或权利要求73所述的方法，其中所述人CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或其变体，任选地相对于伊匹单抗具有降低的毒性的变体。
75.根据权利要求63-74中任一项所述的方法，其中在施用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂的同一天开始施用所述检查点拮抗剂。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂施用长达三个月的时间段。
77.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中在开始施用所述T细胞疗法之后将所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂施用长达六个月的时间段。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中如果在所述时间段结束时，所述受试者在所述治疗后展现出完全反应(CR)，或者所述疾病或病症在所述治疗后进展或缓解后复发，则停用所述DGKα和/或DGKζ的抑制剂和任选地所述检查点拮抗剂。
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