CN111787938A - 靶向bcma的嵌合抗原受体、靶向cd19的嵌合抗原受体及组合疗法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗与BCMA表达相关的疾病的组合物和方法。本发明还涉及施用靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)疗法和另外的治疗剂的方法。

Description

靶向BCMA的嵌合抗原受体、靶向CD19的嵌合抗原受体及组合 疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月15日提交的美国序列号62/586,834和2017年11月20日提交的美国序列号62/588,836的优先权，它们每一者的内容通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且所述序列表特此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2018年11月8日，名称为N2067-7145WO_SL并且大小为676,612字节。

技术领域

本发明一般涉及经工程化以表达靶向B细胞成熟抗原蛋白(BCMA)的嵌合抗原受体的细胞的用途，任选地将其与另外的治疗剂组合，用于治疗与BCMA表达相关的疾病。本发明进一步描述了BCMA靶向疗法的预后生物标记物。

背景技术

BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员。BCMA表达在具有长寿的浆细胞命运的终末分化的B细胞(包括浆细胞、浆母细胞和激活的B细胞和记忆B细胞的亚群)上是最高的。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的表达最近已与许多癌症、自身免疫性障碍和感染性疾病关联。BCMA表达增加的癌症包括一些血液系统癌症，如多发性骨髓瘤(MM)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、各种白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL))和胶质母细胞瘤。

考虑到对靶向诸如癌症等的疾病的改善的策略的持续需求，非常需要用于改善靶向BCMA的治疗剂的新组合物和方法，例如抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)疗法。

发明内容

本披露的特征至少部分地在于治疗与B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达BCMA CAR的细胞疗法。

在一个方面，本文披露了治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有III期高风险多发性骨髓瘤(例如，基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤)，从而治疗所述受试者。

在一个实施例中，所述受试者在施用表达BCMA CAR的细胞疗法之前已接受一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)。在一个实施例中，所述受试者对所述一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)已经有反应或正在产生反应。在一个实施例中，所述受试者在接受所述一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)后显示出完全反应、非常好的部分反应或部分反应。

在一个方面，本文披露了一种治疗患有与BCMA表达相关的疾病(例如III期高风险多发性骨髓瘤，例如基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤)的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述表达BCMA CAR的细胞疗法在一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)之后施用，其中所述受试者对所述一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)已经有反应或正在产生反应，例如，所述受试者在接受所述一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)后显示完全反应、非常好的部分反应或部分反应。

在一些实施例中，本文披露的方法还包括向受试者施用表达CD19CAR的细胞疗法。不希望受到理论的束缚，多发性骨髓瘤可以至少部分地由具有癌症干细胞特性的多发性骨髓瘤细胞的次要亚群介导，所述次要亚群类似于B淋巴细胞并且表达CD19。表达CD19 CAR的细胞疗法可通过靶向早期谱系癌细胞(例如癌症干细胞)、调节免疫反应、消耗调节性B细胞和/或改善肿瘤微环境而增加表达BCMA CAR的细胞疗法的功效。在一些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法在施用表达BCMA CAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。在一些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法与表达BCMA CAR的细胞疗法同时施用。

在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个细胞(例如，可存活的表达CAR的细胞)，例如约5x10⁸个细胞(例如，可存活的表达CAR的细胞)，次输注的约5x10⁸个细胞(例如，可存活的表达CAR的细胞)例如按单。

在一些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个细胞(例如，可存活的表达CAR的细胞)，例如约5x10⁸个细胞(例如，可存活的表达CAR的细胞)，例如按单次输注的约5x10⁸个细胞(例如，可存活的表达CAR的细胞)。

在一些实施例中，本文披露的方法还包括在施用所述表达BCMA CAR的细胞疗法或所述表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)。在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述表达CD19 CAR的细胞疗法在所述调整剂的施用完成后2、3或4天，例如3天后(例如，在施用最后剂量的淋巴细胞耗减剂后，例如在施用最后剂量的淋巴细胞耗减化疗后，例如在施用最后剂量的环磷酰胺和/或氟达拉滨后)施用。在一些实施例中，本文披露的方法还包括，在施用所述调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前，从所述受试者获得样品(例如，单采样品)并使用所述样品制造所述表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述表达CD19 CAR的细胞疗法。

在一些实施例中，本文披露的方法还包括在施用所述表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述表达CD19 CAR的细胞疗法之后，例如在施用所述表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述表达CD19 CAR的细胞疗法28、29、30、31或32天后，施用维持剂(例如来那度胺)。

在一个方面，本文披露了在患有与BCMA表达相关的疾病(例如III期高风险多发性骨髓瘤，例如基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤)的受试者中评价表达CAR的细胞疗法的有效性的方法，其中所述受试者已接受或正在接受所述表达CAR的细胞疗法，并且其中所述表达CAR的细胞疗法包括表达BCMA CAR的细胞疗法和表达CD19CAR的细胞疗法的组合，所述方法包括：

(i)获取所述受试者中，例如来自所述受试者的样品中抗SOX2免疫反应(例如，抗SOX2抗体反应或T细胞反应)水平的第一值，和/或

(ii)获取所述受试者中，例如来自所述受试者的样品中SOX2水平或活性(例如SOX2表达水平)的第二值，

在所述受试者开始接受所述表达CAR的细胞疗法后至少一个时间点，其中：

(1)所述第一值与第一参考值相比的增加，和/或与第二参考值相比第二值的降低，指示所述表达CAR的细胞疗法对所述受试者有效(例如，所述受试者对所述表达CAR的细胞疗法有反应)；并且

(2)所述第一值与第一参考值相比的降低，和/或所述第二值与第二参考值相比的增加，指示所述表达CAR的细胞疗法对所述受试者无效或效果极低(例如，所述受试者对所述表达CAR的细胞疗法没有反应或仅有最小反应)；其中：

(i)所述第一参考值是：

在所述至少一个时间点之前(例如，在所述受试者开始接受所述表达CAR的细胞疗法之前，或所述受试者开始接受所述表达CAR的细胞疗法之后但在所述至少一个时间点之前)，所述受试者中的抗SOX2免疫反应(例如抗SOX2抗体反应或T细胞反应)的水平；

在患有与BCMA表达相关的疾病的不同受试者中抗SOX2免疫反应(例如抗SOX2抗体反应或T细胞反应)的水平；或者

在患有与BCMA表达相关的疾病的受试者群体中抗SOX2免疫反应(例如抗SOX2抗体反应或T细胞反应)的平均水平；并且

(ii)所述第二参考值是：

在所述至少一个时间点之前(例如，所述受试者开始接受所述表达CAR的细胞疗法之前，或所述受试者开始接受所述表达CAR的细胞疗法之后但在所述至少一个时间点之前)，所述受试者中的SOX2水平或活性(例如SOX2表达水平)；

患有与BCMA表达相关的疾病的不同受试者中的SOX2水平或活性(例如SOX2表达水平)；或者

患有与BCMA表达相关的疾病的受试者群体中的平均SOX2水平或活性(例如SOX2表达水平)；

从而评价表达CAR的细胞疗法的有效性。

在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病(例如，基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤)的受试者的方法，所述方法包括：

响应于以下确定：在向所述受试者施用包括表达BCMA CAR的细胞疗法和表达CD19CAR的细胞疗法的组合的表达CAR的细胞疗法后，尚未实现或尚未鉴定为已实现所述受试者中，例如来自所述受试者的样品中，抗SOX2免疫反应水平(例如抗SOX2抗体反应或T细胞反应)的增加和/或SOX2水平或活性(例如SOX2表达水平)的降低，向所述受试者施用第二疗法或程序，

从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述第二疗法或程序选自化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、外科手术、放射程序、共刺激分子的激活剂、抑制分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法中的一种或多种。

在前述方法的某些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法包括表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述BCMA CAR包含表2或3中列出的任何BCMA scFv结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)和/或表2或3中列出的任何BCMA scFv结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)，或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法包括表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述BCMA CAR包含表2或3中列出的重链可变区(VH)和/或表2或3中列出的轻链可变区(VL)，或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法包括表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述BCMA CAR包含表2或3中列出的BCMA scFv结构域氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149)或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法包括表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述BCMA CAR包含表2或3中列出的全长BCMA CAR氨基酸序列(例如，未成熟BCMA CAR的氨基酸序列包含SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQID NO:113、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:233的氨基酸序列)或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法包括表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述BCMA CAR由表2或3中列出的核酸序列(例如，SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170)或与其具有95％-99％同一性的序列编码。

在前述方法的某些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法包括表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述CD19 CAR包含表6或7中列出的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)和/或表6或8中列出的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)，或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法包括表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述CD19 CAR包含表6中列出的任何CD19 scFv结构域氨基酸序列的重链可变区(VH)和/或表6中列出的任何CD19 scFv结构域氨基酸序列的轻链可变区(VL)，或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法包括表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述CD19 CAR包含表6所列出的CD19 scFv结构域氨基酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法包括表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述CD19 CAR包含表6所列出的全长CD19 CAR氨基酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的某些实施例中，所述表达CD19 CAR的细胞疗法包括表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中所述CD19 CAR由表6所列出的核酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列编码。

在前述方法的某些实施例中，所述受试者是人类患者。

在一个方面，本文披露了治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有多发性骨髓瘤，其中：

(i)所述受试者患有III期高风险多发性骨髓瘤，例如，基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤，

(ii)所述受试者显示β-2-微球蛋白≥5.5mg/L和高风险FISH特征：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)；

(iii)所述受试者显示β-2-微球蛋白≥5.5mg/L且LDH大于正常上限；

(iv)除超二倍体外，所述受试者显示>3个结构异常的中期核型；

(v)所述受试者患有浆细胞白血病，例如，所述受试者显示外周血中>20％的浆细胞；

(vi)所述受试者对Imid/PI组合(沙利度胺、来那度胺或泊马度胺与硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米组合)不能实现部分反应或更好的反应(例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5所述)；或者

(vii)在开始疗法后的六个月内，所述受试者开始接受Imid/PI组合的一线疗法，

从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法在一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)或二线疗法后，例如至少三个周期的所述一线疗法或二线疗法后施用，其中所述受试者对所述一线疗法或二线疗法已经有反应或正在产生反应，例如，在接受所述一线疗法或二线疗法后，所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者显示出完全反应、非常好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法在一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)或二线疗法后，例如至少三个周期的所述一线疗法或二线疗法后施用，其中所述受试者对所述一线疗法或二线疗法已经有反应或正在产生反应，例如，在接受所述一线疗法或二线疗法后，所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者显示出完全反应、非常好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一些实施例中，所述受试者尚未显示出或未正在显示出对所述一线疗法或二线疗法的完全反应或严格的完全反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一些实施例中，所述受试者对所述一线疗法或二线疗法已经显示出或正在显示出完全反应或严格的完全反应，其中所述受试者已经显示或正在显示最小的残留疾病，例如，如通过骨髓流式细胞术所测量的，例如，可通过流式细胞术在骨髓中检测到克隆浆细胞，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法在二线疗法后施用，其中所述受试者由于在一线疗法期间的疾病进展而进入到二线疗法，其中所述疾病进展发生在开始一线疗法后的六个月内。

在一些实施例中，所述受试者未接受高剂量美法仑或自体或同种异体干细胞移植。

在一些实施例中，所述方法还包括向受试者施用第一表达CD19 CAR的细胞疗法。

在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第一表达BCMACAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。

在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法在同一天施用，任选地，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法施用完成后至少一个小时施用。

在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法之后施用，其中如果所述受试者在施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法之后发展急性输注反应，则所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法后最多48小时(例如24、36或48小时)施用。

在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞(例如静脉内)。

在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，(例如静脉内)。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)。在一些实施例中，所述方法包括在施用所述-第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用环磷酰胺和氟达拉滨，任选地，其中：

(i)环磷酰胺以每天300mg/m²静脉内施用，持续三天；并且

(ii)氟达拉滨以每天30mg/m²静脉内施用，持续三天。

在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19CAR的细胞疗法在所述第一调整剂的施用完成后2、3或4天，例如3天后(例如，在施用最后剂量的淋巴细胞耗减剂后，例如在施用最后剂量的淋巴细胞耗减化疗后，例如在施用最后剂量的环磷酰胺和/或氟达拉滨后)施用。

在一些实施例中，所述方法还包括，在施用所述第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前，从所述受试者获得第一样品(例如，单采样品)并使用所述样品制造所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法。

在一些实施例中，所述方法还包括，在施用第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前以及在获得第一样品之后，从受试者获得第二样品(例如干细胞)以准备自体干细胞移植。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之后，例如，在以下中更晚的时间，向所述受试者施用维持剂(例如来那度胺)：

(i)所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或第一表达CD19 CAR的细胞疗法施用后26、27、28、29、30、31或32天，例如28天；或者

(ii)与治疗有关的≤2级毒性消退。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向受试者施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法，其中：

(i)自施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法以来，已经复发了约80-100天(例如，约90天)；

(ii)所述受试者的多发性骨髓瘤在施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法后已经进展；或者

(iii)所述受试者在施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法后已经表现出或正在表现出残留多发性骨髓瘤的客观证据。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向受试者施用所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法，其中在施用所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之后，例如在施用所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法后7-28天，受试者的>3％的外周血淋巴细胞是CD19+。

在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第二表达BCMACAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。

在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法在同一天施用，任选地，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法施用完成后至少一个小时施用。

在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法之后施用，其中如果所述受试者在施用第二表达BCMA CAR的细胞疗法之后发生急性输注反应，则所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法施用后最多48小时(例如24、36或48小时)施用。

在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞(例如静脉内)。

在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞(例如静脉内)。

在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法与所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法相同。

在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法相同。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用第二调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)。在一些实施例中，所述方法包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用环磷酰胺和氟达拉滨，任选地，其中：

(i)环磷酰胺以每天300mg/m²静脉内施用，持续三天；并且

(ii)氟达拉滨以每天30mg/m²静脉内施用，持续三天。在一些实施例中，所述方法包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用环磷酰胺，例如以1.5g/m²施用。

在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有高风险多发性骨髓瘤，例如，基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤。在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者正在接受或已经接受了一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)或二线疗法，例如，至少三个周期的所述一线疗法或二线疗法，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5所述，并且所述受试者自一线或二线疗法后尚未发生进展。在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者对受试者最近接受的疗法(例如，一线疗法或二线疗法)显示出很好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中：(i)所述受试者患有高风险多发性骨髓瘤，例如，基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤；(ii)所述受试者正在接受或已经接受了一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)或二线疗法，例如，至少三个周期的一线疗法或二线疗法，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述，并且所述受试者自所述一线疗法或二线疗法后尚未进展；以及(iii)所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者对所述受试者最近接受的疗法(例如，一线疗法或二线疗法)显示出很好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述，从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述受试者正在接受或已经接受一线疗法，并且尚未接受二线疗法。在一些实施例中，所述受试者自所述一线疗法后尚未进展。在一些实施例中，所述受试者正在接受或已经接受了二线疗法，并且尚未接受三线疗法，其中所述受试者由于在接受一线疗法期间或之后的疾病进展而进入到所述二线疗法，其中疾病进展发生在一线疗法开始的一年内或一线疗法完成的六个月内。在一些实施例中，所述受试者自二线疗法后尚未进展。

在一些实施例中，所述受试者尚未显示出或未正在显示出对受试者最近接受的疗法(例如一线疗法或二线疗法)的完全反应或严格的完全反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一些实施例中，所述受试者尚未接受细胞毒性化疗(例如，多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷或顺铂)，但以下情况除外：(a)所述受试者每周接受低剂量的环磷酰胺(例如，≤500mg/m²/周)，或(b)所述受试者已接受单个周期的环磷酰胺连续输注。在一些实施例中，在受试者接受细胞毒性化疗之前，从所述受试者分离出T细胞以制造第一表达BCMA CAR的细胞疗法。在一些实施例中，所述受试者尚未接受自体或同种异体干细胞移植。在一些实施例中，所述受试者在一年内启动了多发性骨髓瘤的全身疗法。

在一些实施例中，所述受试者显示出≥5.5mg/L的β-2-微球蛋白和高风险FISH特征：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)。在一些实施例中，所述受试者显示出≥5.5mg/L的β-2-微球蛋白和大于正常上限的LDH。在一些实施例中，所述受试者显示具有>3个除超二倍体性外的结构异常的中期核型。在一些实施例中，所述受试者患有浆细胞白血病，例如，受试者显示出在外周血中有>20％的浆细胞。在一些实施例中，所述受试者对Imid/PI组合(沙利度胺、来那度胺或泊马度胺与硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米组合)不能实现部分反应或更好的反应(例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5所述)。在一些实施例中，所述受试者在开始一线疗法的一年内(例如六个月内)用Imid/PI组合进行一线疗法；或在完成所述一线疗法的六个月内。

在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有高风险多发性骨髓瘤。在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者的多发性骨髓瘤在至少两个治疗方案后复发或对至少两个治疗方案而言难治，例如，蛋白酶体抑制剂和/或沙利度胺或其类似物(例如沙利度胺、来那度胺或泊马度胺)。在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者对受试者最近接受的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)显示出很好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一个方面，本文披露了治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中：(i)所述受试者患有高风险多发性骨髓瘤，(ii)所述受试者的多发性骨髓瘤在至少两个治疗方案例如蛋白酶体抑制剂和/或沙利度胺或其类似物(例如沙利度胺、来那度胺或泊马度胺)后复发或对至少两个治疗方案而言难治，和(iii)所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者对所述受试者最近接受的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)显示出很好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

在一些实施例中，所述受试者尚未显示出或未正在显示出对受试者最近接受的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)的完全反应或严格的完全反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。在一些实施例中，所述受试者在接受最近的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)后显示出可检测到的残留疾病。

在一些实施例中，所述受试者尚未接受抗BCMA细胞疗法，例如表达BCMA CAR的细胞疗法。在一些实施例中，所述受试者在接受美法仑和干细胞移植(例如自体干细胞移植)的一年内进展。

在一些实施例中，所述方法还包括向受试者施用第一表达CD19 CAR的细胞疗法。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法在同一天施用，任选地，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法施用完成后至少一个小时施用。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法之后施用，其中如果所述受试者在施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法之后发展急性输注反应，则所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法后最多48小时(例如24、36或48小时)施用。

在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，以及在第三个输注日接受总剂量的约60％。在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注，例如静脉内。

在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，以及在第三个输注日接受总剂量的约60％。在一些实施例中，所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注，例如静脉内。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)。在一些实施例中，所述方法包括在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施例中，环磷酰胺以每天300mg/m²静脉内施用，持续三天。在一些实施例中，氟达拉滨每天以30mg/m²静脉内施用，持续三天。在一些实施例中，所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一调整剂的施用完成后2、3或4天，例如3天后(例如，在施用最后剂量的淋巴细胞耗减剂后，例如在施用最后剂量的淋巴细胞耗减化疗后，例如在施用最后剂量的环磷酰胺和/或氟达拉滨后)施用。在一些实施例中，所述方法还包括，在施用所述第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前，从所述受试者获得第一样品(例如，单采样品)并使用所述样品制造所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法。在一些实施例中，所述方法还包括，在施用第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前以及在获得第一样品之后，从受试者获得第二样品(例如干细胞)以准备自体干细胞移植。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之后，例如以下中更晚的时间向受试者施用维持剂(例如来那度胺)：(i)施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法后26、27、28、29、30、31或32天，例如28天；或(ii)与治疗有关的≤2级的毒性消退。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向所述受试者施用第二表达BCMA CAR的细胞疗法，其中自施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以来已经过80-100天(例如90天)。在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向所述受试者施用第二表达BCMA CAR的细胞疗法，其中在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法后所述受试者的多发性骨髓瘤已经进展。在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向所述受试者施用第二表达BCMA CAR的细胞疗法，其中在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法后所述受试者已表现出或正在表现出残留多发性骨髓瘤的客观证据。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向受试者施用所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法，其中在施用所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之后，例如在施用所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法后7-28天，受试者的>3％的外周血淋巴细胞是CD19+。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法在同一天施用，任选地，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法施用完成后至少一个小时施用。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法之后施用，其中如果所述受试者在施用第二表达BCMA CAR的细胞疗法之后发生急性输注反应，则所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法施用后最多48小时(例如24、36或48小时)施用。

在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，以及在第三个输注日接受总剂量的约60％。在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞(例如静脉内)。

在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，以及在第三个输注日接受总剂量的约60％。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞(例如静脉内)。

在一些实施例中，所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法与所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法相同。在一些实施例中，所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第一表达CD19CAR的细胞疗法相同。

在一些实施例中，所述方法还包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用第二调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)。在一些实施例中，所述方法包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施例中，环磷酰胺以每天300mg/m²静脉内施用，持续三天。在一些实施例中，氟达拉滨每天以30mg/m²静脉内施用，持续三天。在一些实施例中，所述方法包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向受试者施用环磷酰胺，例如以1.5g/m²施用。

在前述方法的一些实施例中，所述第一或第二表达BCMA CAR的细胞疗法包含表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中：

(i)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的任何BCMA scFv结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)和/或表2或3中列出的任何BCMA scFv结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(ii)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的重链可变区(VH)和/或表2或3中列出的轻链可变区(VL)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iii)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的BCMA scFv结构域氨基酸序列(例如，SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:148和SEQ ID NO:149)或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iv)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的全长BCMA CAR氨基酸序列(例如，未成熟BCMA CAR的氨基酸序列包含SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:233的氨基酸序列)或与其具有95％-99％同一性的序列；或者

(v)所述BCMA CAR由表2或3中列出的核酸序列编码(例如，SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:170)或与其具有95％-99％同一性的序列。

在前述方法的一些实施例中，所述第一或第二表达CD19 CAR的细胞疗法包含表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中：

(i)所述CD19 CAR包含表6或7中列出的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)和/或表6或8中列出的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(ii)所述CD19 CAR包含表6中列出的任何CD19 scFv结构域氨基酸序列的重链可变区(VH)和/或表6中列出的任何CD19 scFv结构域氨基酸序列的轻链可变区(VL)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iii)所述CD19 CAR包含表6中列出的CD19 scFv结构域氨基酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iv)所述CD19 CAR包含表6中列出的全长CD19 CAR氨基酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列；或者

(v)所述CD19 CAR由表6中列出的核酸序列或与其具有95％-99％同一性的序列编码。

在前述方法的一些实施例中，所述受试者是人类患者。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序进行，或者步骤或元素必须彼此离散。

根据说明书和附图并且如权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是清楚的。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施例。出于说明本发明的目的，在附图实施例中示出了目前优选的实施例。然而，应该理解，本发明不限于附图中所示的实施例的精确布置和手段。

图1是临床试验示意图。PR＝部分反应。Cy/Flu＝环磷酰胺+氟达拉滨。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

如本文所用的，所述术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原。BCMA(也称为TNFRSF17，BCM或CD269)是肿瘤坏死受体(TNFR)家族的成员，并且主要在终末分化的B细胞(例如记忆B细胞)和浆细胞上表达。其配体称为TNF家族(BAFF)的B细胞激活物和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的基因在16号染色体上编码，产生长度为994个核苷酸的初级mRNA转录物(NCBI登录号NM_001192.2)，其编码184个氨基酸的蛋白质(NP_001183.2)。已经描述了衍生自BCMA基因座的第二反义转录物，其可以在调节BCMA表达中起作用。(Laabi Y.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],1994,22:1147-1154)。已经描述了具有未知意义的另外的转录物变体(Smirnova AS等人Mol Immunol.[分子免疫学],2008,45(4):1179-1183。已经鉴定出第二同种型，也称为TV4(Uniprot标识Q02223-2)。如本文所用，“BCMA”包括含有突变例如点突变的蛋白质，全长野生型BCMA的片段、插入、缺失和剪接变体。

如本文所用，术语“CD19”是指分化簇19蛋白，它是在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以登录号NM_001178098找到。如本文所用，“CD19”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。CD19在大多数B谱系癌症(包括例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤)上表达。具有表达CD19的其他细胞在下文“与CD19表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的早期标记物。参见例如，Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)。在一个方面，CART的抗原结合部分识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一个方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。

术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于进行所披露的方法。

术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指重组多肽构建体，所述重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。

在一个方面中，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个方面，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自4 1BB(即CD137)、CD27、ICOS、和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自共刺激分子的功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一个方面，CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。

包含靶向特定肿瘤标记物X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标记物)也称为XCAR。例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMACAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。

如本文所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，该蛋白质或多肽序列与抗原特异性结合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、骆驼科VHH结构域和由如二价片段的抗体片段形成的多特异性分子，该二价片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个或更多个(例如两个)Fab片段，或所连接的抗体的两个或更多个(例如两个)分离的CDR或其他表位结合片段。抗体片段也可以掺入单结构域抗体、多抗体、微抗体、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗体片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。

术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，所述scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。

如本文所用，所述术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸的序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“Chothia”编号方案)、或其组合。在Kabat编号方案下，在一些实施例中，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia编号方案下，在一些实施例中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，这些CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)，以及VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR组合物的部分可以以多种形式存在，例如其中抗原结合结构域表达为多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)，或例如人源化抗体)的一部分(Harlow等人,1999,于：Using Antibodies:A LaboratoryManual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],NY[纽约]；Harlow等人,1989,于：Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],New York[纽约]；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(在本文中也称为“抗靶标(例如，BCMA)结合结构域”)是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫反应的分子。免疫反应可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫反应的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以衍生自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。

术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段(包括但不限于例如减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数量、减少肿瘤转移数量、增加预期寿命、减少肿瘤细胞增殖、减少肿瘤细胞存活、或改善与癌性病症相关的各种生理症状)表现的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。

术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗癌作用”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来显现。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤细胞存活率降低。术语“自体的”是指衍生自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。

术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。

术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。

如本文所用，术语“单采血(apheresis)”是指本领域公认的体外过程，通过该过程，供体或患者的血液从该供体或患者移出并穿过分离出一种或多种所选择的特定成分的装置，并返回其余部分至该供体或患者的循环(例如，通过再输送)。因此，在“单采样品”的上下文中是指使用单采获得的样品。

术语“组合”是指呈一个剂量单位形式的固定组合；或组合施用，其中本发明的化合物与组合配偶物(partner)(例如下文所解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“共药剂(co-agent)”)可以在同一时间独立地施用或在时间间隔内分开地施用，特别是在这些时间间隔允许组合配偶物显示协作(例如协同)效应的情况下。单个组分可以包装在一个试剂盒中或分开包装。可在施用之前将一种或两种组分(例如粉末或液体)重构或稀释至所需剂量。如本文所用，术语“共同施用”或“组合施用”等意指涵盖向有需要的单个受试者(例如患者)施用所选择的组合配偶物，并且旨在包括其中药剂不一定通过相同的施用途径施用或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合”意指由多于一种活性成分的混合或组合所产生的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合两者。术语“固定组合”意指活性成分(例如本发明的化合物和组合配偶体)以单一实体或剂量的形式同时地施用给患者。术语“非固定组合”意指活性成分(例如本发明的化合物和组合配偶体)作为分开的实体同时地、并行地或顺序地施用给患者(没有特定的时间限制)，其中这种施用在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或更多种活性成分的施用。

术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。通过本文所述的方法治疗的优选的癌症包括多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。

“衍生自”(当该术语在本文中使用时)指示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。

短语“与BCMA表达相关的疾病”包括但不限于与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的疾病或与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或者与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与BCMA表达相关的疾病可包括与目前不表达BCMA(例如，因为比如由于用靶向BCMA的分子例如本文所述的BCMA抑制剂进行治疗导致BCMA表达已被下调)但曾经表达BCMA的细胞相关的病症。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是血液癌。在一个方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是分化的血浆B细胞的恶性肿瘤。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如一种或多种急性白血病，其包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与BMCA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的另外的癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)等等。在一些实施例中，癌症是多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或胶质母细胞瘤。在实施例中，与BCMA表达相关的疾病包括浆细胞增殖性障碍，例如无症状骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如恶性浆细胞病、单发性骨髓瘤、单发性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病、和PEP综合征)。与BCMA表达相关的其他疾病(例如野生型或突变型BCMA)表达包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、与BCMA的表达相关的癌前病症或增殖性疾病(例如野生型或突变型BCMA)，例如本文所述的癌症，例如前列腺癌(例如去势抗性或治疗抗性前列腺癌或转移前列腺癌)、胰腺癌、或肺癌。

与BCMA(例如野生型或突变BCMA)相关的非癌症相关病症包括病毒感染，例如，HIV；真菌感染，例如新型隐球菌(C.neoformans)；自身免疫性疾病，例如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、寻常型天疱疮和干燥综合征；炎症性肠病、溃疡性结肠炎；与粘膜免疫有关的移植有关同种异体免疫障碍；以及对其中体液免疫很重要的生物制剂(例如因子VIII)的有害免疫反应。在实施例中，与BCMA表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。

术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的置换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下项的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定测试改变的CAR。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导初级反应，从而介导信号转导事件，如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重构等。

术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其针对T细胞信号传导途径的至少一些方面提供以刺激方式调节TCR复合物的初级激活的一个或多个初级胞质信号传导序列。在一些实施例中，CAR内的含ITAM的结构域独立于内源性TCR复合物重现初级TCR的信号传导。在一个方面，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合而引发，并且其导致T细胞反应(包括但不限于增殖、激活、分化等)的介导。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，所述免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。

如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。在实施例中，细胞内信号结构域转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

细胞内信号传导结构域产生信号，该信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。

在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含衍生自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含衍生自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。

初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。

术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或者“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一个实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一个实施例中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:18或20提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。

共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。

细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。

术语“4-1BB”是指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人4-1BB氨基酸序列。“4-1BB共刺激结构域”是指4-1BB的共刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一个实施例中，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO:14提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。

当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫反应(例如促进免疫效应子反应)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。

当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应子功能或反应是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或反应的实例。

术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。

术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。

除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。

术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。

术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。

术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。

术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。

术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(Oxford BioMedica)的

基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAX^TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。

术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在所述位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中这些位置的一半(例如，长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果这些位置的90％(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所希望的特异性、亲和力、和能力的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。

“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。

术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。

在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。

术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则所述术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换，例如保守置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代，例如保守取代，可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res[核酸研究].19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志].260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。

术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。

术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。

术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标记物，例如谱系标记物，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,GeneTher[基因治疗]20018(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学·转化医学]20135(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]201219(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。

术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，所述细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要所述抗原存在于支持癌细胞的细胞上。

如在scFv的语境中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，以及n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，以及n＝10(SEQ ID NO:28)。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。在另一个实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:31)的多个重复。描述于WO2012/138475中的接头也包括在本发明的范围内，该专利通过引用并入本文。

如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。

如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。

如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施例中，聚A为50个与5000个之间(SEQ ID NO:32)，优选大于64个，更优选大于100个，最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调制mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。

如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。

如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。

如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性障碍的进展。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。

术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。

术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物、人)。

术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。

如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病症态来获得治疗效果。

如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病症态的预防或保护性治疗。

在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”是指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性障碍抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、卵巢癌、胰腺癌等等)或者浆细胞增殖性障碍，例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞及其子代。

术语“特异性结合”是指抗体或配体，其识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质，但是其中抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。

如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽(在最简单的实施例中典型地为两个)，当在免疫效应细胞中时这些多肽为细胞提供针对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在一些实施例中，RCAR包含至少细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含源自刺激分子和/或本文在CAR分子的语境中定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR中的多肽组并不是相互连续的，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，RCAR包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR在如本文所述的细胞(例如免疫效应细胞)，例如表达RCAR的细胞(本文还称为“RCARX细胞”)中表达。在一个实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一个实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。RCAR可以为表达RCAR的细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化表达RCAR的细胞的免疫效应特性。在实施例中，RCAR细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以提供对包含由该抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的特异性。

当该术语在本文中使用时，“膜锚”或“膜系链结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜的多肽或部分(例如肉豆蔻酰基)。

当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“开关结构域”是指实体(典型地是基于多肽的实体)，该实体在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合。该缔合导致连接到(例如融合到)第一开关结构域的第一实体和连接到(例如融合到)第二开关结构域的第二实体的功能偶联。第一开关结构域和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，所述开关是细胞内的。在实施例中，所述开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽(例如基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子(例如雷帕霉素类似物(rapalogue))。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如结合myc肽的scFv)，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个myc scFv的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如myc受体)，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。

当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子不在受试者中天然发生，或者不以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素(Rapamycin)或rapalogue，例如RAD001。

术语“生物等效的”是指产生与参考剂量或参考量的参考化合物(例如，RAD001)产生的效果等同的效果所需的除参考化合物(例如，RAD001)之外的药剂的量。在一个实施例中，所述效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70S6激酶抑制测量的，例如，如在体内或体外测定中评估的，例如，如通过本文所述的测定(例如Boulay测定，或通过蛋白质印迹进行的磷酸化S6水平的测量)所测量的。在一个实施例中，效果是如通过细胞分选所测量的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率的改变。在一个实施例中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参考化合物的参考剂量或参考量相同水平的P70S6激酶抑制的量或剂量。在一个实施例中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参考化合物的参考剂量或参考量相同水平的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率改变的量或剂量。

当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素，或催化性mTOR抑制剂)联合使用时，术语“低免疫增强剂量”是指mTOR抑制剂部分但不是完全抑制mTOR活性的剂量，例如，如通过P70S6激酶活性的抑制所测量的。本文讨论了用于评价mTOR活性的方法，例如通过抑制P70S6激酶。剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫反应。在一个实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)数量的减少和/或PD-1阴性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)数量的增加，或PD-1阴性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)/PD-1阳性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的比率增加。

在一个实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致初始T细胞的数量增加。在一个实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致以下中的一个或多个：

以下标记中的一个或多个例如在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达增加：CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2，例如记忆T细胞(例如记忆T细胞前体)上；

KLRG1在例如记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达减少；并且

记忆T细胞前体，例如具有以下特征中的任一个或组合的细胞的数量增加：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、降低的KLRG1以及增加的BCL2；

其中，例如，与未治疗的受试者相比，例如至少瞬时地发生上述任何变化。

如本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。

如本文所用的“复发的”或“复发”是指疾病(例如癌症)或疾病的体征和症状(如改善或响应期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的再现。例如，反应期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。

范围：贯穿本披露，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。

当该术语在本文中使用时，“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的，并且在下文更全面地描述。

以下更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据元素周期表,CAS版本,Handbook of Chemistry and Physics[物理化学手册],第75版,内封面进行鉴定，并且具体官能团通常如其中所述被定义。另外，有机化学的一般原理，以及特定的功能部分和反应性，描述于Thomas Sorrell,Organic Chemistry[有机化学],University ScienceBooks[大学科学书籍],索萨利托,1999；Smith and March,March’s Advanced OrganicChemistry[March的高级有机化学],第5版,John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司],纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[有机官能团转换],VCHPublishers,Inc.[VCH出版公司],纽约,1989；和Carruthers,Some Modern Methods ofOrganic Synthesis[有机合成的一些现代方法],第3版,Cambridge University Press[剑桥大学出版社],剑桥,1987。

如本文所用的术语“烷基”是指一价饱和的直链或支链烃，如1-12、1-10或1-6个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别称为C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₀烷基和C₁-C₆烷基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基等。

如本文所用的术语“烯基”和“炔基”是指在长度和可能的取代方面与上述烷基类似但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂肪族基团。示例性的烯基包括但不限于-CH＝CH₂和-CH₂CH＝CH₂。

如本文所用的术语“芳基”是指单环、双环或多环烃环系统，其中至少一个环是芳族环。代表性的芳基包括完全芳族的环系统，如苯基(例如(C₆)芳基)、萘基(例如(C₁₀)芳基)和蒽基(例如(C₁₄)芳基)，以及如下环系统，所述环系统中芳族碳环融合至一个或多个非芳族碳环，如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基(naphthimidyl)或四氢萘基等。

如本文所用的术语“碳环基”是指含有3-18个碳原子的单环或融合、螺-融合和/或桥接的双环或多环烃环系统，其中每个环是完全饱和的或含有一个或多个不饱和的单元，但其中没有环是芳族环。代表性的碳环基包括环烷基(例如环戊基、环丁基、环戊基、环己基等)和环烯基(例如环戊烯基、环己烯基、环戊二烯基等)。

如本文所用的术语“羰基”是指-C＝O。

如本文所用的术语“氰基”是指-CN。

如本文所用的术语“卤代(halo)”或“卤素(halogen)”是指氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)、或碘(碘代，-I)。

如本文所用的术语“杂烷基”是指单价饱和的直链或支链烷基链，其中所述链中的至少一个碳原子被杂原子如O、S或N取代，条件是在取代后，所述链包含至少一个碳原子。在一些实施例中，杂烷基基团可以包含例如1-12、1-10或1-6个碳原子，在本文中称为C₁-C₁₂杂烷基、C₁-C₁₀杂烷基和C₁-C₆杂烷基。在某些情况下，杂烷基基团包含1、2、3或4个独立选择的杂原子，代替所述烷基链中1、2、3或4个单独的碳原子。代表性的杂烷基包括-CH₂NHC(O)CH₃、-CH₂CH₂OCH₃、-CH₂CH₂NHCH₃、-CH₂CH₂N(CH₃)CH₃等。

如本文所用的术语“杂芳基”是指单环、双环或多环系统，其中至少一个环是芳族环并且包含杂原子；并且其中没有其他环是杂环基(如下定义)。代表性的杂芳基基团包括环系统，其中(i)每个环包含杂原子并且是芳族的，例如咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基；(ii)每个环是芳族的或碳环基，至少一个芳族环包含杂原子并且至少一个其他环是烃环，或例如吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、肉桂啉基、酞菁基、喹唑啉基、喹喔啉基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、苯恶嗪基、吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮、噻唑并-[4,5-c]-吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶基、5,6-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡咯基、4,5,6,7,8-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基；以及(iii)每个环是芳族的或碳环基，并且至少一个芳族环与另一个芳族环例如4H-喹啉基共有桥头杂原子。在某些实施例中，所述杂芳基是单环或双环，其中每个所述环含有5或6个环原子，其中1、2、3或4个所述环原子是独立地选自N、O和S的杂原子。

如本文所用的术语“杂环基”是指单环或融合、螺融合和/或桥接的双环和多环系统，其中至少一个环是饱和或部分不饱和的(但不是芳族的)并且包含杂原子。杂环基可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处附接至其侧基，并且任何所述环原子可以任选地被取代。代表性的杂环基包括环系统，其中(i)每个环是非芳族的并且至少一个环包含杂原子，例如四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯烷基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氮杂卓基、氧氮杂卓基、噻氮杂卓基、吗啉基和奎宁环基；(ii)至少一个环是非芳族的并且包含杂原子，并且至少一个其他的环是芳族碳环，例如1,2,3,4-四氢喹啉基；(iii)至少一个环是非芳族的并且包含杂原子，并且至少一个其他的环是芳族的并且包含杂原子，例如3,4-二氢-1H-吡喃并[4,3-c]吡啶基和1,2,3,4-四氢-2,6-萘啶基。在某些实施例中，所述杂环基是单环或双环，其中每个所述环含有3-7个环原子，其中1、2、3或4个所述环原子是独立地选自N、O和S的杂原子。

如本文所述，本发明的化合物可以含有“任选地取代的”部分。通常，术语“取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，是指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基取代。除非另有说明，否则“任选地取代的”基团可在该基团的每个可取代位置上具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置可被多于一个选自指定基团的取代基取代时，在每个位置的取代基可相同或不同。在本发明中设想的取代基的组合优选地是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。如本文所用，术语“稳定的”是指当经受允许其产生、检测以及在某些实施例中其回收、纯化以及用于一种或多种本文所披露的目的的用途的条件时，不会被实质改变的化合物。

如本文所用的术语“氧代”是指＝O。

如本文所用的术语“硫代羰基”是指C＝S。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和低级动物的组织接触，而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志](1977)66,1-19(通过引用并入本文)中详细地描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例有，与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、或丙二酸形成的氨基的盐，或通过使用本领域已知的其他方法如离子交换形成的氨基的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸钠、苯甲酸盐、硫酸氢钠、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸钠、柠檬酸盐、环戊酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸酯、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、碘化氢盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、氨酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当的碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N⁺(C_1-4烷基)₄ ^-盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。另外的药学上可接受的盐在适当时包括无毒的铵、季铵和使用抗衡离子例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的胺阳离子。

术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合的化合物形式。此物理性缔合可包括氢键合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。式(I)、式(I-a)和/或式(II)的化合物可以例如以结晶形式制备，并且可以被溶剂化。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。在某些情况下，溶剂化物能够分离(例如当一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时)。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物两者。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。

术语“水合物”是指与水缔合的化合物。典型地，化合物的水合物中包含的水分子的数量与水合物中的化合物分子的数量处于确定的比率。因此，化合物的水合物可以由例如通式R·x H₂O表示，其中R为化合物且x为大于0的数字。给定的化合物可以形成多于一种类型的水合物，包括例如一水合物(x为1)、低级水合物(x为大于0且小于1的数字，例如半水合物(R·0.5H₂O))和多水合物(x为大于1的数字，例如，二水合物(R·2H₂O)和六水合物(R·6H₂O))。

应当理解，具有相同分子式但是在其原子键合的性质或顺序或其原子空间排列上不同的化合物被称为“异构体”。其原子的空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。

不互为镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，且互为非重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”。例如，当化合物的中心不对称时，它会键合到四个不同的基团上，并且可能有一对对映异构体。对映异构体的特征在于其不对称中心的绝对构型，并由Cahn和Prelog的R序列和S序列规则描述，或由分子旋转偏振光平面的方式描述，称为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以单独的对映体或其混合物的形式存在。包含等比例对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。

术语“互变异构体”是指具有可互换形式的特定化合物结构并且在氢原子和电子移位方面变化的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为通过用酸或碱的处理它们快速地相互转化。互变异构的另一个实例是苯基硝基甲烷的酸-和硝基-形式，它们同样是通过用酸或碱处理而形成的。

互变异构形式可以与获得目的化合物的最优化学反应性和生物活性相关。

除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括该结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构和几何(或构象))形式；例如，每个非对称中心的R和S构型，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体，非对映异构体和几何(或构象)混合物都在本发明的范围内。除非另有说明，否则本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。另外，除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括仅在一个或多个同位素富集的原子存在下不同的化合物。例如，具有本发明结构的化合物，包括用氘或氚替换氢，或用富含¹³C-或¹⁴C-的碳替换碳，都在本发明的范围内。这样的化合物例如可用作分析工具，用作生物学测定中的探针或用作根据本发明的治疗剂。

在特定对映体是优选的情况下，在一些实施例中，它可以基本上不含相应的对映体，并且也可以称为“光学富集的”提供。如本文所用，“光学富集的”意指化合物由显著更大比例的一种对映异构体组成。在某些实施例中，化合物由按重量计至少约90％的优选的对映异构体组成。在其他实施例中，化合物由按重量计至少约95％、98％或99％的优选的对映异构体组成。优选的对映异构体可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶)从外消旋混合物中分离，或通过不对称合成制备。参见，例如，Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映体、外消旋体和拆分物](Wiley Interscience[威利跨学科],纽约,1981)；Wilen等人,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds[碳化合物的立体化学](McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and OpticalResolutions[拆分剂和光学拆分物表]第268页(E.L.Eliel,Ed.[编],Univ.of Notre DamePress[诺特丹大学出版社],诺特丹,IN 1972)。

本文的组合物和方法的各个方面在下文进一步详细描述。另外的定义在整个申请书中陈述。

详细描述

本发明至少部分地提供了一种治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的表达与BCMA结合的CAR分子的细胞(“表达BCMA CAR的细胞”)(例如细胞群)。在一些实施例中，所述与BCMA表达相关的疾病是血液癌症，例如ALL、CLL、DLBCL或多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述受试者患有III期高风险多发性骨髓瘤(例如基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤)，从而治疗所述受试者。在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法基于从患者样品中获取生物标记物的水平施用。在一些实施例中，将所述表达BCMA CAR的细胞疗法与第二疗法组合施用于受试者。在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法和第二疗法同时或顺序施用。在一些实施例中，所述第二疗法是表达CD19 CAR的细胞疗法。

嵌合抗原受体(CAR)

在一个方面，本文披露了使用表达CAR分子的细胞(例如细胞群)的方法。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域)。

可以作为本文所述的CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列在表1中列出，其中aa代表氨基酸，na代表编码相应肽的核酸。

表1.CAR的不同组分的序列(aa-氨基酸序列，na-核酸序列)。

CAR抗原结合结构域

在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在一些实施例中，所述抗原结合结构域结合至：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn-Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α2；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；伸长因子2突变(ELF2M)；肾上腺素B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肾上腺素A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)；克劳丁6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，D组(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿激酶2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，位点K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；Wilms肿瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于12p染色体(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1，T细胞识别黑色素瘤抗原1；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；成对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期素B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠道羧酸酯酶；突变热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的可替代支架(如重组纤连蛋白结构域等)、T细胞受体(TCR)或其片段(例如，单链TCR)等。在一些情况下，抗原结合结构域衍生自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。

CAR跨膜结构域

关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以设计为包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜衍生的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如该细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白衍生的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如该细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域包含与所用的CAR的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在一个不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同CART中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。

跨膜结构域可以衍生自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C的一个或多个跨膜区。

在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一个实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一个实施例中，所述铰链或间隔子包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列(例如由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的跨膜结构域(例如由其组成)。

在一个方面，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔子包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的铰链。

在一个方面，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔子包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的铰链。

在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一个方面，接头包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:11的核苷酸序列编码。

在一个方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。

胞质结构域

CAR的细胞质结构域或区包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。

用于在本文所述CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的重组序列。

已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞激活是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。

初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。

在本发明中特别有用的含有ITAM的初级细胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一个实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ(例如本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。

在一个实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。

共刺激信号传导结构域

CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本发明的CAR的背景中使用的任何其他所希望的细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。在一个实施例中，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。

共刺激分子可以是除了抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，包含淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C以及PAG/Cbp。

所述CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一个实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。

在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。

在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。

在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:17的核酸序列编码。

在一个方面，本文描述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包括不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标或不同的靶标(例如，除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标，例如，CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3，或叶酸受体β))的第二CAR。在一个实施例中，第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但包含将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，该第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，该第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR，该第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，该第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在另一个方面，本披露的特征是表达CAR的细胞(例如，CART细胞)的群体。在一些实施例中，表达CAR的细胞群包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施例中，CART细胞群可包括表达CAR(所述CAR具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达具有不同抗原结合结构域(例如，本文所述的不同癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，不同于由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域所结合的癌症相关抗原的本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域))的CAR的第二细胞。作为另一个实例，表达CAR的细胞群可包括表达CAR(该CAR包括本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达CAR(该CAR包括除如本文所述的癌症相关抗原以外的靶标的抗原结合结构域)的第二细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞群包括，例如表达包含初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包含次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。

在另一个方面，本披露的特征是一个细胞群，其中所述群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR；和表达另一种药剂(例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂)的第二细胞。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD-1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)。在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一个实施例中，所述药剂包含例如，抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽包含本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27、OX40或CD28，例如，如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。

BCMA CAR

在一个方面，本文披露的CAR结合至BCMA。示例性BCMA CAR可包括WO2016/014565的表1或16中披露的序列，其通过引用并入本文。BCMA CAR构建体可包括任选的前导序列；任选的铰链结构域，例如CD8铰链结构域；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域；细胞内结构域，例如4-1BB细胞内结构域；和功能性信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在某些实施例中，这些结构域邻接并在同一阅读框中以形成单个融合蛋白。在其他实施例中，结构域在分开的多肽中，例如，在如本文描述的RCAR分子中。

表2和3披露了示例性BCMA CAR分子或其片段的序列。在某些实施例中，所述全长BCMA CAR分子包含披露于表2和3中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列、或基本上(例如，95％-99％)与其相同的序列。

可以用于抗BCMA CAR构建体的另外的示例性BCMA靶向序列披露于WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，将其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。

表2.示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸序列和核酸序列。还提供了每个scFv的氨基酸序列可变重链和可变轻链序列。

表3.另外的示例性BCMA CAR序列

RNA转染

本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括一种编码CAR的RNA构建体，该RNA构建体可以直接转染到细胞中。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸、和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:276)。这样产生的RNA可以有效转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。

在一个方面，抗BCMA CAR由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码抗BCMA CAR的mRNA引入免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)以产生表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)。

在一个实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入到细胞。使用聚合酶链式反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所希望模板是本发明的CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有抗肿瘤抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区、跨膜结构域(例如，CD8a的跨膜结构域)；以及胞质区，该胞质区包括细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。

在一个实施例中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。

使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(可读框)，包括5'和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一个实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。

可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。

也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。

5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改良RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。

在一个实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，该RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。

为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，该RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的可读框上游。在一个优选的实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。

在优选的实施例中，mRNA具有5'端帽和3'聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，该多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。

在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超出模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003))。

将聚A/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有聚A/T 3'伸展段的DNA模板的方法。

转录DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有聚T尾(如100T尾)(SEQ IDNO:277)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:278))的反向引物来产生，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)来产生。聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施例中，聚(A)尾在100个与5000个腺苷之间(SEQ ID NO:279)。

在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一个实施例中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300与400个核苷酸之间(SEQ ID NO:280)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。

5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。5’帽可以使用本领域已知和本文所述的技术提供(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生化科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯],330:958-966(2005))。

通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，该序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞通透性和存活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。

非病毒递送方法

在一些方面，可以使用非病毒方法将编码本文所述的CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。

在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。

使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人.Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961-2971；Huang等人.Mol.Ther.[分子疗法]16(2008):580-589；Grabundzija等人.Mol.Ther.[分子疗法]18(2010):1200-1209；Kebriaei等人.Blood.[血液]122.21(2013):166；Williams.MolecularTherapy[分子疗法]16.9(2008):1515-16；Bell等人.Nat.Protoc.[自然实验手册]2.12(2007):3153-65；以及Ding等人.Cell.[细胞]122.3(2005):473-83，所有这些文献均通过引用并入本文。

SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从运载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与运载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将它插入到宿主细胞的基因组中。参见例如Aronovich等人，见上文。

示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人,Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，所有文献均通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献均通过引用并入本文。

SBTS的使用允许转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，该细胞例如使用转座子系统(如，SBTS)稳定地表达本文所述的CAR。

根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如质粒)递送至细胞(例如，T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共同递送至宿主细胞中。

在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述的CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞。

在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。

编码CAR的核酸构建体

本发明还提供了编码一种或多种本文所述CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子以信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子以DNA构建体提供。

因此，在一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域(例如，共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链)的细胞内信号传导结构域。

编码所需分子的核酸序列可以使用本领域中已知的重组方法获得，诸如像通过从表达所述基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括所述基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从含有所述基因的细胞和组织分离。替代性地，目的基因可以合成产生，而不是克隆。

本发明还提供了其中插入本发明的DNA的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复(LTR)、和目的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(例如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713)。

在另一个实施例中，包含编码本发明所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，可以使用转座子(如睡美人(sleeping beauty))、CRISPR、CAS9、和锌指核酸酶来完成编码CAR的核酸的表达。见下文June等人2009Nature ReviewsImmunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，该文献通过引用并入本文。

简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。

使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，这些专利通过引用以其整体并入本文。在另一个实施例中，本发明提供了一种基因疗法载体。

可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且封装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。

另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。

能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已经显示出有效地驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。

启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB(Epstein-Barr)病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，所述分子开关能够当需要所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。

WT PGK启动子

(SEQ ID NO:281)

示例性截短的PGK启动子：

PGK100：

(SEQ ID NO:282)

PGK200：

(SEQ ID NO:283)

PGK300：

(SEQ ID NO:284)

PGK400：

(SEQ ID NO:285)

载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记物)。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择性标记基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者都可以侧接适当的调控序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。

报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS快报479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调制启动子驱动的转录的能力。

在一个实施例中，载体可以进一步包含编码第二CAR的核酸。在一个实施例中，第二CAR包括针对以下靶标的抗原结合结构域：在急性髓性白血病细胞上表达的靶标，例如像CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3；或在B细胞上表达的靶标，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。在一个实施例中，所述载体包含编码特异性结合第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR的核酸序列，以及编码特异性结合第二不同抗原并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR的核酸。在一个实施例中，载体包含编码第一BCMA CAR的核酸和编码第二CAR的核酸，该第一BCMA CAR包括BCMA结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，该第二CAR靶向除BCMA之外的抗原(例如在AML细胞上表达的抗原，例如CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3；或在B细胞上表达的抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)，并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，载体包含编码第一BCMA CAR的核酸和编码第二CAR的核酸，该第一BCMACAR包括BCMA结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，该第二CAR特异性结合除BCMA之外的抗原(例如，在AML细胞上表达的抗原，例如CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3；或在B细胞上表达的抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)，并且包括抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在一个实施例中，载体包含编码本文所述的BCMA CAR的核酸和编码抑制性CAR的核酸。在一个实施例中，抑制性CAR包含结合存在于正常细胞而非癌细胞(例如，另外表达BCMA的正常细胞)上的抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ的细胞内结构域。

在实施例中，载体可以包含编码CAR(例如，本文所述的BCMA CAR)和第二CAR(例如，抑制性CAR或特异性结合除BCMA之外的抗原(例如在AML细胞上表达的抗原，例如CD123、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β；或B细胞表达抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)的CAR)的两种或更多种核酸序列。在此类实施例中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同读框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在这方面，两种或更多种CAR可以例如被一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括以下，其中所述GSG残基是任选的：

T2A：(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:286)

P2A：(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:287)

E2A：(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:288)

F2A：(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:289)

将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约)。将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。

用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。

适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring公司获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从阿万蒂极性脂质有限公司(亚拉巴马州伯明翰)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991 Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。

无论用于将外源性核酸引入对宿主细胞中的方法还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。

本发明进一步提供了包含编码CAR的核酸分子的载体。在一个方面，可以将CAR载体直接转导到细胞，例如T细胞或NK细胞中。在一个方面，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一个方面，哺乳动物NK细胞是人NK细胞。

细胞的来源

在扩增和遗传修饰之前，细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞))的来源从受试者获得。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。

在本发明的某些方面，可以使用本领域可获得的任意数量的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)系。在本发明的某些方面，可以从来自受试者收集的血液单位(使用本领域技术人员已知的任意数量的技术(如Ficoll^TM分离))获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一个方面，可以洗涤由单采术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替代的方面，洗涤溶液缺乏钙并且可缺乏镁，或者可缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。

在不存在钙的情况下的初始激活步骤可以导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力-A(PlasmaLyte A)、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。

应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫疗法的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。

在一个方面，通过裂解红细胞和耗减单核细胞(例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗)从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+T细胞。例如，在一个方面，通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合珠(如

M-450 CD3/CD28 T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一个方面，该时间段是约30分钟。在另一个方面，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另一个方面，该时间段为至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个优选的方面，该时间段是10至24小时。在一个方面，孵育时间段是24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在该过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他所希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中还可以使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受进一步轮次的选择。

可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标记的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。在某些方面，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、和FoxP3+的调节性T细胞。在某些方面，可能需要富集CD127低的细胞。替代性地，在某些方面，T调节性细胞被抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法耗减。

本文所述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，所述亚群是T调节性细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节性耗减的细胞群含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体IL-2从该群体除去T调节性细胞(例如CD25+ T细胞)。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段与如本文所述的底物缀合。

在一个实施例中，使用来自Miltenyi^TM的CD25耗减药剂从该群体除去T调节性细胞(例如CD25+ T细胞)。在一个实施例中，细胞与CD25耗减药剂的比率是1e7个细胞至20uL、或1e7个细胞至15uL、或1e7个细胞至10uL、或1e7个细胞至5uL、或1e7个细胞至2.5uL、或1e7个细胞至1.25uL。在一个实施例中，例如对于T调节性细胞(例如CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另外的方面，使用6、7、8、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。

在一个实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群包括约6x 10⁹个CD25+ T细胞。在其他方面，有待耗减的免疫效应细胞群包括约1x 10⁹至1x 10¹⁰个CD25+ T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施例中，所得T调节性耗减的细胞群具有2x 10⁹个T调节细胞(例如CD25+细胞)或更少(例如1x 10⁹、5x 10⁸、1x 10⁸、5x 10⁷、1x 10⁷、或更少个CD25+细胞)。

在一个实施例中，使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从该群体除去T调节性细胞(例如CD25+细胞)。在一个实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。

不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达CAR的细胞产物过程中降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如T_REG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减T_REG细胞的方法是本领域已知的。减少T_REG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、及其组合。

在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低例如，耗减)T_REG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减T_REG细胞。

在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施例中，减少T_REG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。

在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。

在一个实施例中，有待除去的细胞群既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标记物的细胞)。在一个实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行除去、或者在所述耗减之后、或以另一种顺序除去。

本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。

本文所述的方法可以还包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞，从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群，所述细胞群适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一个实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。

还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。在实施例中，检查点抑制剂是PD1或PD-L1。在一个实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。

在一个实施例中，可以选择表达IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B、和穿孔素中的一种或多种、或其他适当分子(例如其他细胞因子)的T细胞群。用于筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号：WO 2013/126712中所述的方法确定。

为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。

在相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒(如珠))，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个方面，所用细胞的浓度为5×10e6/ml。在其他方面，使用的浓度可以是约1×10⁵/ml至1×10⁶/ml，以及其间的任何整数值。

在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。

在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所描述进行解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法激活之前在室温静置1小时。

在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞(如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)，以便稍后用于细胞疗法(例如，T细胞疗法)，用于将受益于细胞疗法(例如，T细胞疗法)的任何数量的疾病或病症，如本文所述的那些。在一个方面，血液样品或单采取自基本健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采取自基本健康的受试者，该受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将感兴趣的细胞分离并冷冻供以后使用。在某些方面，可以扩增、冷冻免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并在随后的时间里使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另外的方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。

在本发明的另一个方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或经改善的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强移植和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病症，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在疗法后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。

在一个实施例中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在一个实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。

在其他实施例中，已经被、或将被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，该mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应子细胞(例如T细胞)的数量、或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率。

在一个实施例中，T细胞群是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传途径产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。

在一个实施例中，T细胞群是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达IkarosRNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传途径产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。替代性地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。

在实施例中，T细胞群是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。

在一个实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。

CAR细胞(包括同种异体CAR细胞)的修饰

在本文描述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，所述细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类和/或β-2微球蛋白(β₂m))表达的同种异体T细胞。同种异体CAR的组合物及其方法已经在例如WO 2016/014565的第227-237页中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，细胞(例如T细胞或NK细胞)经修饰以减少TCR和/或HLA和/或β₂m和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷和TGFRβ)的表达，例如使用本文所述方法，例如siRNA、shRNA、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)转录激活子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。

在一些实施例中，细胞(例如T细胞或NK细胞)经工程化以表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一个实施例中，这种修饰改善了患者体内细胞的持久性。

T细胞的激活和扩增

T细胞通常可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法来激活和扩增。

通常，本发明的T细胞可以通过与表面接触而扩增，该表面与刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体附接。具体地，可以如本文所描述刺激T细胞群，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C激活因子(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，

法国)，可以如本领域公知的其他方法来使用(Berg等人,Transplant Proc.[移植进展]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学方法杂志]227(1-2):53-63,1999)。

在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一个方面，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些方面，两种药剂都可以在溶液中。在一个方面，这些试剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于激活和扩增本发明中的T细胞。

在一个方面，将两种药剂固定在珠上，或者在同一珠上，即“顺式”，或者在分离的珠上，即“反式”。通过举例，提供初级激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一个方面，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率用于CD4+ T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用如下比率的与珠结合的抗CD3:CD28抗体，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定方面，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定方面，使用1:100 CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:75CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在另一个方面，使用1:50 CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:30 CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个优选方面，使用1:10 CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:3 CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在又一个方面，使用3:1 CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。

颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些方面范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在另外的方面包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个优选的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一个方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一个特定方面，优选的颗粒:细胞的比率为1:5。在另外的方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一个方面，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外颗粒在之后每天或每隔一天添加到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一个方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，各种其他比率可适用于本发明。具体地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一个方面，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。

在本发明的另外的方面，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将珠和细胞分离，并且然后培养细胞。在可替代方面，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在另一个方面，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。

通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28所附接的顺磁珠(3x28个珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，10⁴至10⁹个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的

M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子(如钙和镁))中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶标细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文内。在某些方面，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿个细胞/ml、60亿个细胞/ml、50亿个细胞/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且在某些方面是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。

在一个实施例中，例如通过本文描述的方法扩增用编码CAR(例如本文描述的CAR)的核酸转导的细胞。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一个实施例中，将细胞(例如，本文所述的BCMA CAR细胞)在培养物中扩增5天，所得的细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、激活、迁移、或其组合。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的BCMA CAR细胞)显示出抗原刺激后在细胞倍增方面增加至少一倍、两倍、三倍或四倍。在一个实施例中，使细胞(例如，本文所述的表达BCMA CAR的细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得的细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的BCMA CAR的细胞)显示出促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml计增加至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。

在本发明的一个方面，可以将混合物培养若干个小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一个方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一个方面，将珠和T细胞一起培养约八天。在一个方面，将珠和T细胞一起培养2-3天。还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，Minimal Essential Media或RPMI Media 1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，该培养基可以含有增殖和存活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、优化剂，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待输注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO₂)。

在一个实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当介质(例如本文描述的介质)中扩增，该白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如，如通过本文描述的方法(如流式细胞术)所测量的。在一个实施例中，细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)的存在下扩增。

在实施例中，本文描述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从细胞群除去T调节性细胞(例如CD25+ T细胞)。本文描述了从细胞群除去T调节性细胞(例如CD25+ T细胞)的方法。在实施例中，这些方法(例如制造方法)还包括使细胞群(例如其中T调节性细胞(如CD25+ T细胞)已耗减的细胞群；或先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。

在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。

在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一个实施例中，所述接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+ T细胞)的存活和增殖。

已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群，该T细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性亚群，则将该亚群扩增到更大程度可能是有益的。

此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标记之外，其他表型标记物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制激活的T细胞产物。

一旦构建BCMA CAR，即可以使用各种测定来评估分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞，在不存在再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。评估BCMA CAR效果的测定在下面进一步详细描述

原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR的T细胞(CD4⁺和CD8⁺ T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，然后在还原条件下进行裂解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR。相同的T细胞亚群用于在非还原条件下的SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。

可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR⁺ T细胞的体外扩增。例如将CD4⁺和CD8⁺T细胞的混合物用αCD3/αCD28aAPC刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术，在培养的第6天在CD4⁺和/或CD8⁺ T细胞亚群中评估GFP荧光。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。替代性地，在第0天将CD4⁺和CD8⁺ T细胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天使用表达CAR连同eGFP(使用2A核糖体跳跃序列)的双顺反子慢病毒载体转导。在洗涤后，用表达BCMA的细胞(如多发性骨髓瘤细胞系或K562-BCMA)再刺激培养物。每隔一天以100IU/ml向培养基中添加外源IL-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计算GFP⁺ T细胞。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。

还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR⁺ T细胞扩增。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。

动物模型也可用于测量CART活性。例如，可以使用利用人BCMA特异性CAR⁺ T细胞来治疗免疫缺陷小鼠中的原发性人多发性骨髓瘤的异种移植模型。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在建立MM后，将小鼠随机分配至治疗组。可以将不同数量的BCMA CART细胞注射至携带MM的免疫缺陷小鼠中。以每周一次的间隔评估动物的疾病进展和肿瘤负荷。使用时序检验比较组的存活曲线。此外，还可以分析免疫缺陷小鼠中T细胞注射后4周的绝对外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞计数。给小鼠注射多发性骨髓瘤细胞，在3周后注射经工程化为表达BCMA CAR的T细胞，例如通过编码连接至eGFP的CAR的双顺反子慢病毒载体。通过在注射前与模拟转导的细胞混合将T细胞标准化为45％-50％输入的GFP⁺ T细胞，并通过流式细胞术确认。在1周的间隔评估动物的白血病。使用时序检验比较CAR⁺ T细胞组的存活曲线。

先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。简而言之，通过将洗涤的T细胞与表达BCMA的K562细胞混合来在微量滴定板中进行CAR介导的增殖的评估，或在使用前用γ辐射照射其他表达BCMA的骨髓瘤细胞。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至具有KT32-BBL细胞的培养基以用作用于刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8⁺ T细胞离体扩增。使用CountBright^TM荧光珠(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Carlsbad，CA))和流式细胞术(如由制造商描述的)在培养基中计数T细胞。使用用eGFP-2A连接的表达CAR的慢病毒载体进行工程化的T细胞，通过GFP表达来鉴定CAR⁺ T细胞。对于不表达GFP的CAR+ T细胞，用生物素化的重组BCMA蛋白和二级抗生物素蛋白-PE缀合物来检测CAR+ T细胞。还用特异性单克隆抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))同时检测T细胞上的CD4+和CD8⁺表达。根据制造商说明书，使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD生物科学公司，圣地牙哥，加利福尼亚州)对再刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光，并根据制造商说明书分析数据。

可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如，Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在37℃下将51Cr(作为NaCrO4，马萨诸塞州波士顿的新英格兰核公司(New England Nuclear,Boston,MA))加入靶细胞(例如，表达BCMA的K562细胞系和原代多发性骨髓瘤细胞)2小时，频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤两次，并接种至微量滴定板中。将效应T细胞与完全RPMI的孔中的靶细胞以不同比率的效应细胞:靶细胞(E:T)混合。还制备了仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X 100洗涤剂溶液(总释放，TR)的另外的孔。在37℃孵育4小时后，收获来自每个孔的上清液。然后使用γ颗粒计数器(帕卡德仪器公司(Packard Instrument Co.)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)测量释放的51Cr。每种条件进行至少一式三份，并且使用下式计算裂解百分比：％裂解＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER代表每种实验条件释放的平均51Cr。替代性地，也可以使用Bright-Glo^TM萤光素酶测定法评估细胞毒性。

成像技术可用于评估荷肿瘤的动物模型中CAR的特定运输和增殖。例如，Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。简而言之，给NOD/SCID/γc^-/-(NSG)小鼠或其他免疫缺陷小鼠静脉内注射多发性骨髓瘤细胞，7天后用CAR构建体电穿孔，4小时后注射BCMA CART细胞。将T细胞用慢病毒构建体稳定转染以表达萤火虫萤光素酶，并将小鼠针对生物发光成像。替代性地，单次注射CAR⁺ T细胞在多发性骨髓瘤异种移植模型中的治疗效果和特异性可以如下所述测量：给NSG小鼠注射经转导为稳定表达萤火虫萤光素酶的多发性骨髓瘤细胞，然后在几天后进行单次尾静脉注射BCMA CAR构建体电穿孔的T细胞。在注射后的各个时间点对动物成像。例如，可以产生第5天(处理前2天)和第8天(CAR⁺PBL后24小时)的代表性小鼠中的萤火虫萤光素酶阳性肿瘤的光子密度热图。

替代性地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：披露了表达CAR的细胞的检测和/或定量(例如体外或体内(例如临床监测))；免疫细胞扩增和/或激活；和/或涉及CAR配体使用的CAR特异性选择。在一个示例性实施例中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，如本文所述的CAR抗原分子)。

在一个方面，披露了用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于体外或体内检测和/或定量表达CAR的细胞(例如，临床监测患者中的表达CAR的细胞，或给患者给药)。该方法包括：

提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包含标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；

获取表达CAR的细胞(例如，获取含有表达CAR的细胞的样品，如制造样品或临床样品)；

在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测表达CAR的细胞与CAR配体的结合。

在另一个方面，披露了扩增和/或激活细胞(例如，免疫效应细胞)的方法。该方法包括：

提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；

在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述表达CAR的细胞与CAR配体(例如，如本文所述的CAR配体)接触，从而产生激活的和/或扩增的细胞群。

在某些实施例中，CAR配体存在于(例如，固定或附接至)底物(例如非天然存在的底物)上。在一些实施例中，底物是非细胞底物。非细胞底物可以是选自例如板(例如微量滴定板)、膜(例如硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠的固体支持物。在实施例中，CAR配体存在于底物中(例如，在底物表面上)。CAR配体可以与底物共价或非共价(例如，交联)固定、附接、或缔合。在一个实施例中，CAR配体与珠附接(例如，共价附接)。在前述实施例中，免疫细胞群可以在体外或离体扩增。该方法可以进一步包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞的群，例如，使用本文所述的任何方法。

在其他实施例中，扩增和/或激活细胞的方法还包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定在底物(例如一个或多个珠)上，从而提供增加的细胞扩增和/或激活。

在另一个方面，提供了用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及根据CAR配体的结合选择细胞。

在其他实施例中，提供了用于耗减、减少和/或杀伤表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；并且基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一个实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在另一个实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。

可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，该文献的内容通过引用并入。在一个实施例中，抗独特型抗体分子识别抗CD19抗体分子，例如抗CD19 scFv。例如，抗独特型抗体分子可以竞争与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1的结合(描述于Jena等人,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838)；可以与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1具有相同的CDR(例如，使用Kabat定义、Chothia定义、或Kabat和Chothia定义的组合，VH CDR1，VH CDR2，CH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个)；可以与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1一样具有一个或多个(例如2个)可变区，或可以包含CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1。在一些实施例中，根据Jena等人描述的方法制备抗独特型抗体。在另一个实施例中，抗独特型抗体分子是WO 2014/190273中描述的抗独特型抗体分子。在一些实施例中，抗独特型抗体分子与WO 2014/190273的抗体分子(如，136.20.1)具有相同的CDR(例如，VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的一个或多个，例如全部)；可以具有WO 2014/190273的抗体分子的一个或多个(例如2个)可变区，或可以包含WO 2014/190273的抗体分子，如136.20.1。在其他实施例中，抗CAR抗体结合例如如WO 2014/190273中描述的CAR分子的细胞外结合结构域的恒定区。在一些实施例中，抗CAR抗体结合CAR分子的细胞外结合结构域的恒定区，例如重链恒定区(例如，CH2-CH3铰链区)或轻链恒定区。例如，在一些实施例中，抗CAR抗体竞争与WO 2014/190273中描述的2D3单克隆抗体的结合，该抗CAR抗体与如WO 2014/190273中描述的2D3具有相同的CDR(例如，VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的一个或多个，例如全部)，或具有2D3的一个或多个(例如，2个)可变区，或包含2D3。

在一些方面和实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群进行了优化，例如，如2014年7月31日提交的美国序列号62/031,699中所述，该专利的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8⁺或CD4⁺))相比，优化的T细胞亚群显示了增强的持久性。

在一些实施例中，CD4⁺ T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD4⁺ T细胞(例如ICOS域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CD8⁺ T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD8⁺ T细胞(例如，4-1BB域、CD28域，或ICOS域以外的其他共刺激结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR。

在一个方面，本文描述了治疗受试者(例如患有癌症的受试者)的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的：

1)包含CAR的CD4⁺ T细胞(CAR^CD4+)

所述方法包括：

抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域，例如靶向BCMA的抗原结合结构域；

跨膜结构域；并且

细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS域；并且

2)包含CAR的CD8⁺ T细胞(CAR^CD8+)，该CAR包含：

抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域，例如靶向BCMA的抗原结合结构域；

跨膜结构域；并且

细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB域、CD28域、或除ICOS域之外的另一种共刺激结构域；

其中CAR^CD4+和CAR^CD8+彼此不同。

任选地，该方法进一步包括施用：

3)包含CAR的第二CD8+ T细胞(第二CAR^CD8+)，该CAR包含：

抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域，例如特异性结合BCMA的抗原结合结构域；

跨膜结构域；并且

细胞内信号传导结构域，其中第二CAR^CD8+包含细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，不存在于CAR^CD8+上，并且任选地，不包含ICOS信号传导结构域。

其他测定法(包括本领域已知的那些测定法)也可用于评估本发明的BCMA CAR构建体。

治疗应用

BCMA相关疾病和/或障碍

在一个方面，本发明提供治疗与BCMA表达相关的疾病的方法。在一个方面，本发明提供治疗疾病的方法，其中部分肿瘤对BCMA呈阴性，部分肿瘤对BCMA呈阳性。例如，本发明的CAR可用于治疗已经历与BCMA表达升高相关的疾病的治疗的受试者，其中已经历BCMA水平升高的治疗的受试者表现出与BCMA水平升高相关的疾病。在实施例中，本发明的CAR可用于治疗已经历与BCMA表达相关的疾病的治疗的受试者，其中已经历与BCMA表达相关的治疗的受试者表现出与BCMA表达相关的疾病。

在一个实施例中，本发明提供治疗疾病的方法，其中BCMA在正常细胞和癌细胞上表达，但在正常细胞上以较低水平表达。在一个实施例中，所述方法还包括选择以这样的亲和力结合的本发明的CAR：该亲和力允许BCMA CAR结合并杀伤表达BCMA的癌细胞，但小于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的表达BCMA的正常细胞被杀伤，例如如通过本文所述的测定法所确定。例如，可以使用杀伤测定，如基于Cr51 CTL的流式细胞术。在一个实施例中，BCMA CAR具有抗原结合结构域，该抗原结合结构域对于靶抗原具有10^-4M至10^-8M，例如10^-5M至10^-7M，例如10^-6M或10^-7M的结合亲和力KD。在一个实施例中，BCMA抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如，本文所述的抗体)低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。

在一个方面，本发明涉及包含BCMA CAR的载体，该BCMA CAR可操作地连接至启动子，用于在哺乳动物免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)中表达。在一个方面，本发明提供表达BCMA CAR的重组免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，用于治疗表达BCMA的肿瘤，其中表达BCMA CAR的重组免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)被称为表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)。在一个方面，本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)能够使肿瘤细胞接触其表面上表达的本发明的至少一种BCMA CAR，以使得表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)靶向肿瘤细胞并抑制肿瘤的生长。

在一个方面，本发明涉及抑制表达BCMA的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括使肿瘤细胞接触本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)，以使得表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)响应于抗原而激活并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长受到抑制。

在一个方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括将本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)施用于受试者，从而治疗受试者中的癌症。可以通过本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)治疗的癌症的实例是与BCMA表达相关的癌症。

本发明包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)输注给有此需要的受体。输注的细胞能够杀伤受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)能够在体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。在各个方面，在将细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于患者之后，施用于患者或其后代的细胞(例如，T细胞或NK细胞)在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

本发明还包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)经修饰(例如，通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)输注给有此需要的受体。输注的细胞能够杀伤受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在将免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于患者之后，施用于患者的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)存在少于一个月，例如三周、两周、一周。

不希望受任何特定理论的束缚，CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)引发的抗肿瘤免疫反应可以是主动或被动免疫反应，或者可以是由于直接与间接免疫反应。在一个方面，CAR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)表现出响应于表达BCMA的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和有效的细胞溶解活性，抵抗可溶性BCMA抑制，介导旁杀伤和介导已建立的人类肿瘤的消退。例如，在表达BCMA的肿瘤的异质区域内的无抗原肿瘤细胞可能易受BCMA重定向免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的间接破坏，该BCMA重定向免疫效应细胞先前已经与邻近的抗原阳性癌细胞发生反应。

在一个方面，本发明的完全人CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以是用于哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的一个类型的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。

关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物中之前，在体外进行以下中的至少一者：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。

离体程序是本领域熟知的，并在下文更全面地讨论。简而言之，从哺乳动物(例如，人)分离细胞，并用表达本文披露的CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。所述哺乳动物受体可以是人类，并且所述CAR修饰的细胞相对于受体可以是自体的。替代性地，相对于受体，细胞可以是同种异体的、同基因的或异种异体的。

造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序描述于美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何具体方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物收集来自外周血收获物或骨髓外植体的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增这类细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。

除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供了用于体内免疫以引发针对患者中的抗原的免疫反应的组合物和方法。

通常，如本文描述激活和扩增的细胞可以用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。具体而言，本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)用于治疗与BCMA表达相关的疾病、障碍和病症。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于患上与BCMA表达相关的疾病、障碍和病症风险的患者。因此，本发明提供了治疗或预防与BCMA表达相关的疾病、障碍和病症的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于有此需要的受试者。

在一个方面，本发明的表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)可用于治疗增殖性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或者癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期。在一个方面，癌症是血癌。血液癌病状是癌症的类型，如白血病和影响血液、骨髓和淋巴系统的恶性淋巴组织增生症。在一个方面，血液癌是白血病或血癌。与BCMA相关的疾病或障碍的实例是多发性骨髓瘤(也称为MM)(参见Claudio等人,Blood.[血液]2002,100(6):2175-86；和Novak等人,Blood.[血液]2004,103(2):689-94)。多发性骨髓瘤，也称为浆细胞骨髓瘤或卡勒氏病(Kahler’s disease)，是以骨髓中异常或恶性血浆B细胞积聚为特征的癌症。通常，癌细胞侵入邻近的骨骼，破坏骨骼结构并导致骨痛和骨折。大多数骨髓瘤病例的特征还在于副蛋白(也称为M蛋白或骨髓瘤蛋白)的产生，该副蛋白是恶性浆细胞的克隆增殖过量而产生的异常免疫球蛋白。根据国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)的诊断标准，血清副蛋白水平超过30g/L即诊断为多发性骨髓瘤(参见Kyle等人,(2009),Leukemia.[白血病]23:3-9)。多发性骨髓瘤的其他症状或体征包括肾功能减退或肾功能衰竭、骨病变、贫血、高钙血症和神经症状。

国际骨髓瘤工作组已经确定了区分多发性骨髓瘤与其他浆细胞增殖性障碍的标准(参见Kyle等人,(2009),Leukemia.[白血病]23:3-9)。必须满足以下所有三个标准：

-克隆骨髓浆细胞≥10％

-存在血清和/或尿单克隆蛋白(除真正的非分泌性多发性骨髓瘤患者之外)

-可归因于潜在浆细胞增殖性障碍的终末器官损害的证据，具体为：

ο高钙血症：血清钙≥11.5mg/100ml

ο肾功能不足：血清肌酸酐>1.73mmol/l

ο贫血：正常色素性正常红细胞贫血，血红蛋白值>2g/100ml，低于正常下限，或血红蛋白值<10g/100ml

ο骨病变：溶骨性病变、严重骨质减少或病理性骨折。

可以通过本文所述的组合物和方法治疗的其他浆细胞增殖性障碍包括但不限于无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。

将两种分期系统用于进行多发性骨髓瘤的分期：国际分期系统(ISS)(参见Greipp等人,(2005),J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]23(15):3412-3420，通过引用以其整体并入本文)和Durie-Salmon分期系统(DSS)(参见Durie等人(1975),Cancer[癌症]36(3):842-854，通过引用以其整体并入本文)。这两种分期系统汇总于下表中：

表4.用于多发性骨髓瘤分期的分期系统

*迪里-萨蒙分期系统还包括指定肾功能状态的亚分类。在分期编号后加上“A”或“B”的名称，其中“A”指示肾功能相对正常(血清肌酸酐值<2.0mg/dL)，B指示肾功能异常(血清肌酸酐值>2.0mg/dL)。

多发性骨髓瘤的第三个分期系统称为修订版国际分期系统(R-ISS)(参见PalumboA,Avet-Loiseau H,Oliva S等人,Journal of clinical oncology:official journal ofthe American Society of Clinical Oncology[年美国临床肿瘤学会官方杂志]2015；33:2863-9，通过引用以其整体并入本文)。R-ISS I期包括ISS I期(血清β2-微球蛋白水平<3.5mg/L，血清白蛋白水平≥3.5g/dL)，无高风险CA[del(17p)和/或t(4；14)和/或t(14；16)]和正常LDH水平(小于正常范围的上限)。R-ISS III期包括ISS III期(血清β2-微球蛋白水平>5.5mg/L)和高风险CA或高LDH水平。R-ISS II期包括所有其他可能的组合。

可以基于如下中公开的IMWG 2016标准确定患者的应答：如Kumar S等人,International Myeloma Working Group consensus criteria for response andminimal residual disease assessment in multiple myeloma[国际骨髓瘤工作组多发性骨髓瘤的反应和最小残留疾病评估的共识标准].The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346，通过引用以其整体并入本文。表5提供了IMWG 2016反应评估标准。

表5.IMWG反应评估标准(包括最小残留病(MRD)标准)

多发性骨髓瘤和相关疾病的标准治疗包括化疗、干细胞移植(自体或同种异体)、放疗和其他药物疗法。经常使用的抗骨髓瘤药物包括烷基化剂(例如，苯达莫司汀、环磷酰胺和美法仑(melphalan))、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))、皮质类固醇(例如，地塞米松和泼尼松)和免疫调节剂(例如，沙利度胺(thalidomide)和来那度胺或

)或它们的任何组合。双膦酸盐药物也经常与标准抗MM治疗组合施用以预防骨质流失。年龄超过65-70岁的患者不太可能进行干细胞移植。在某些情况下，双自体干细胞移植是年龄不超过60岁且对第一次移植反应不佳的患者的选择。本发明的组合物和方法可以与多发性骨髓瘤的任何目前处方治疗组合施用。

多发性骨髓瘤治疗的第一期是诱导疗法。诱导疗法的目的是减少骨髓中的浆细胞以及由浆细胞产生的分子(例如蛋白质)的数量。诱导疗法通常包括以下2种或3种药物的组合：靶向疗法、化疗或糖皮质激素。针对可以进行干细胞移植的患者的诱导疗法

用于干细胞移植的患者通常年龄在70岁或更小，并且总体上身体健康。患者可以先进行诱导疗法，然后进行大剂量化疗和干细胞移植。诱导疗法通常给与几个周期，并且可能包括以下中的一种或多种药物：CyBorD方案-环磷酰胺(Cytoxan、Procytox)、硼替佐米(Velcade)和地塞米松(Decadron，Dexasone)；VRD方案-硼替佐米、来那度胺(Revlimid)和地塞米松；沙利度胺(Thalomid)和地塞米松；来那度胺和低剂量地塞米松；硼替佐米和地塞米松；VTD方案-硼替佐米、沙利度胺和地塞米松；硼替佐米、环磷酰胺和泼尼松；硼替佐米、多柔比星(阿霉素)和地塞米松；地塞米松；或脂质体多柔比星(Caelyx，Doxil)、长春新碱(Oncovin)和地塞米松

针对无法进行干细胞移植的患者的诱导疗法

无法进行干细胞移植的患者可以使用以下中的一种或多种药物进行诱导疗法：CyBorD方案-环磷酰胺、硼替佐米和地塞米松；来那度胺(Revlimid)和低剂量地塞米松；MPT方案-美法仑、泼尼松和沙利度胺；VMP方案-硼替佐米、美法仑和泼尼松；MPL方案-美法仑、泼尼松和来那度胺；美法仑和泼尼松；硼替佐米和地塞米松；地塞米松；脂质体多柔比星、长春新碱和地塞米松；沙利度胺和地塞米松；VAD方案-长春新碱、多柔比星和地塞米松；或VRD方案-硼替佐米、来那度胺和地塞米松。

与BCMA相关的疾病或病症的另一个实例是霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(参见Chiu等人,Blood.[血液]2007,109(2):729-39；He等人,J Immunol.[免疫学杂志]2004,172(5):3268-79)。

霍奇金氏淋巴瘤(HL)也称为霍奇金病，是起源于白细胞或淋巴细胞的淋巴系统癌症。构成淋巴瘤的异常细胞称为里德-斯德伯格(Reed-Sternberg)细胞。在霍奇金氏淋巴瘤中，癌症从一个淋巴结组扩散到另一个淋巴结组。根据里德-斯德伯格细胞形态和里德-斯德伯格细胞周围的细胞组成(通过淋巴结活检确定)，霍奇金氏淋巴瘤可细分为四种病理亚型：结节性硬化HL、混合细胞亚型、淋巴细胞富集或淋巴细胞优势、淋巴细胞耗减。一些霍奇金氏淋巴瘤也可以是结节性淋巴细胞优势型霍奇金氏淋巴瘤，或者可以是未指明的。霍奇金氏淋巴瘤的症状和体征包括颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结无痛性肿胀、发烧、盗汗、体重减轻、疲劳、瘙痒或腹痛。

非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)包括多种血癌，血癌包括除霍奇金氏淋巴瘤之外的任何类型的淋巴瘤。非霍奇金氏淋巴瘤的亚型主要通过细胞形态学、染色体畸变和表面标记物来分类。NHL亚型(或与NHL相关的癌症)包括B细胞淋巴瘤，诸如但不限于伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、B细胞淋巴细胞性白血病(B-PLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，血管内大B细胞淋巴瘤和原发性纵隔B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤(例如，滤泡中心淋巴瘤、滤泡小分裂细胞)、毛细胞白血病、高级别B细胞淋巴瘤(伯基特样)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(华氏巨球蛋白血症)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(例如结外边缘区B细胞淋巴瘤或与粘膜相关的淋巴样组织(MALT)淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区B细胞淋巴瘤)、浆细胞瘤/骨髓瘤、前体B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(PB-LBL/L)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)；以及T细胞淋巴瘤，诸如但不限于间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(例如冒烟型、慢性、急性和淋巴瘤性)、血管中心性淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(例如蕈样真菌病、塞扎里综合征等)、结外自然杀手/T细胞淋巴瘤(鼻型)、肠病型肠道T细胞淋巴瘤、大颗粒淋巴细胞性白血病、前体T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/L)、T细胞慢性淋巴细胞性白血病/前淋巴细胞性白血病(T-CLL/PLL)和非特指型外周T细胞淋巴瘤。霍奇金氏淋巴瘤的症状和体征包括颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结无痛性肿胀、发烧、盗汗、体重减轻、疲劳、瘙痒、腹痛、咳嗽或胸痛。

霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的分期是相同的，是指体内癌细胞的扩散程度。在I期中，淋巴瘤细胞位于一个淋巴结组中。在II期中，淋巴瘤细胞存在于至少两个淋巴结组中，但两组均位于膈肌的同一侧，或组织或器官的一部分以及膈肌的同一侧的器官附近的淋巴结。在III期中，淋巴瘤细胞位于隔膜两侧的淋巴结中，或这些淋巴结组附近或脾脏中的组织或器官的一部分。在IV期中，淋巴瘤细胞存在于至少一个器官或组织的几个部分，或淋巴瘤细胞位于器官中和隔膜的另一侧的淋巴结中。除罗马数字分期名称之外，分期也可以用字母A、B、E和S来描述，其中A是指无症状的患者，B是指有症状的患者，E是指其中淋巴瘤存在于淋巴系统外的组织中的患者，S是指其中淋巴瘤存在于脾脏中的患者。

霍奇金氏淋巴瘤通常用放疗、化疗或造血干细胞移植来治疗。非霍奇金氏淋巴瘤最常见的疗法是R-CHOP，它由四种不同的化疗药物(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)和利妥昔单抗

组成。通常用于治疗NHL的其他疗法包括其他化学治疗剂、放疗、干细胞移植(自体或同种异体骨髓移植)或生物疗法，如免疫疗法。生物治疗剂的其他实例包括但不限于利妥昔单抗

托西莫单抗

依帕珠单抗

和阿仑单抗(alemtuzumab)

本发明的组合物和方法可以与霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤的任何目前处方治疗组合施用。

BCMA表达也与瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)(也称为淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL))相关联。(参见Elsawa等人,Blood.[血液]2006,107(7):2882-8)。瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症以前被认为与多发性骨髓瘤相关联，但最近被归类为非霍奇金氏淋巴瘤的亚型。WM的特征在于不受控制的B细胞淋巴细胞增殖，导致贫血并产生过量的副蛋白或免疫球蛋白M(IgM)，所述副蛋白使血液变稠并导致高粘滞综合征。WM的其他症状或体征包括发烧、盗汗、疲劳、贫血、体重减轻、淋巴结病变或脾肿大、视力模糊、头晕、鼻出血、牙龈出血、不常见的瘀伤、肾功能损伤或衰竭、淀粉样变性或周围神经病变。

WM的标准治疗包括化疗，特别是利妥昔单抗

其他化学治疗药物(如苯丁酸氮芥

环磷酰胺

氟达拉滨

克拉屈滨

长春新碱和/或沙利度胺)可以组合使用。皮质类固醇(如泼尼松)也可以与化疗组合给予。血浆单采术或血浆交换通常在患者的整个治疗过程中使用，以通过从血液中除去副蛋白来缓解一些症状。在某些情况下，干细胞移植是一些患者的选择。

与BCMA相关的疾病或病症的另一个实例是脑癌。具体而言，BCMA的表达与星形细胞瘤或胶质母细胞瘤有关(参见Deshayes等人,Oncogene.[癌基因]2004,23(17):3005-12,Pelekanou等人.,PLoS One.[公共科学图书馆：综合]2013,8(12):e83250)。星形细胞瘤是由星形胶质细胞产生的肿瘤，星形胶质细胞是脑中的一种神经胶质细胞类型。胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤或GBM)是星形细胞瘤的最恶性形式，并且被认为是脑癌的最晚期(IV期)。胶质母细胞瘤有两种变体：巨细胞胶质母细胞瘤和神经胶质肉瘤。其他星形细胞瘤包括幼年毛细胞星形细胞瘤(JPA)、纤维性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤(PXA)、胚胎发育不良性神经上皮瘤(DNET)和退行性星形细胞瘤(AA)。

与胶质母细胞瘤或星形细胞瘤相关的症状或体征包括脑部压力增加、头痛、癫痫发作、记忆丧失、行为改变、身体一侧运动或感觉丧失、语言功能障碍、认知缺损、视力缺损、恶心、呕吐以及手臂或腿部虚弱。

手术移除肿瘤(或切除)是尽可能多地除去神经胶质瘤而不损伤或对正常周围脑损伤最小的标准治疗。通常在手术后使用放疗和/或化疗来抑制和减缓来自任何其余癌细胞或卫星病灶的复发疾病。放射疗法包括全脑放疗(常规体外束辐射)、靶向三维适形放射疗法和靶向放射性核素。通常用于治疗胶质母细胞瘤的化疗剂包括替莫唑胺(temozolomide)、吉非替尼或厄洛替尼和顺铂。血管生成抑制剂(如贝伐单抗(Bevacizumab)

)通常也与化疗和/或放疗组合使用。

支持性治疗经常也用于缓解神经症状和改善神经功能，并且与本文所述的任何癌症疗法组合施用。主要支持性药剂包括抗惊厥药和皮质类固醇。因此，本发明的组合物和方法可以与任何标准或支持性治疗组合使用，以治疗胶质母细胞瘤或星形细胞瘤。

与BCMA表达相关的非癌症相关疾病和障碍也可以通过本文披露的组合物和方法治疗。与BCMA表达相关的非癌症相关疾病和障碍的实例包括但不限于：病毒感染；例如，HIV、真菌感染，例如新型隐球菌(C.neoformans)；肠易激综合征；溃疡性结肠炎和与粘膜免疫有关的疾病。

本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群)组合施用。

本发明提供用于治疗癌症的组合物和方法。在一个方面，癌症是血液癌症，包括但不限于作为白血病或淋巴瘤的血癌。在一个方面，本发明的所述表达CAR的细胞(例如CART细胞或表达CAR的NK细胞)可用于治疗癌症和恶性肿瘤，诸如但不限于，例如急性白血病，包括但不限于，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病症，包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症，以及为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病症集合的“白血病前期”等。此外，与BCMA表达相关的疾病包括但不限于例如表达BCMA的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增殖性疾病。

在实施例中，本文描述的组合物可用于治疗疾病，包括但不限于浆细胞增殖性障碍(例如，无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤))、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。

在实施例中，本文描述的组合物可用于治疗疾病，包括但不限于癌症，例如本文所述的癌症，例如前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、胰腺癌、肺癌。

本发明还提供用于抑制增殖或减少表达BCMA的细胞群的方法，该方法包括使包含表达BMCA的细胞的细胞群接触本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)。在一个具体方面，本发明提供用于抑制增殖或减少表达BCMA的癌细胞群的方法，该方法包括使表达BCMA的癌细胞群接触本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)。在一个方面，本发明提供用于抑制增殖或减少表达BCMA的癌细胞群的方法，该方法包括使表达BMCA的癌细胞群接触本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)使髓性白血病或与表达BCMA的细胞相关的另一种癌症的受试者或动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量(quantity/number)、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。

本发明还提供用于预防、治疗和/或控制与表达BCMA的细胞相关的疾病(例如，血液癌或表达BCMA的非典型癌症)的方法，该方法包括将本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)施用于有此需要的受试者。在一个方面，受试者是人。与表达BCMA的细胞相关的障碍的非限制性实例包括病毒或真菌感染，以及与粘膜免疫相关的障碍。

本发明还提供用于预防、治疗和/或控制与表达BCMA的细胞相关的疾病的方法，该方法包括将本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)施用于有此需要的受试者。在一个方面，受试者是人。

本发明提供用于预防与表达BCMA的细胞相关的癌症复发的方法，该方法包括将本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMACAR的NK细胞)施用于有此需要的受试者。在一个方面，该方法包括将有效量的本文所述的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)与有效量的另一种疗法的组合施用于有此需要的受试者。

使用生物标记物评价CAR有效性、受试者适用性或样品适合性的方法

在另一个方面，本发明的特征在于评估或监测受试者(例如，患有癌症，例如血液学癌症的受试者)中表达CAR的细胞疗法(例如，BCMA CAR疗法)的有效性、或用于CAR疗法(例如，BCMA CAR疗法)的样品(例如，单采样品)的适合性的方法。该方法包括获取CAR疗法有效性、受试者适用性或样品适合性的值，其中所述值指示表达CAR的细胞疗法的有效性或适合性。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，表达CAR的细胞疗法包括多个(例如，一群)表达CAR的免疫效应细胞，例如多个(例如，一群)T细胞或NK细胞或它们的组合。在一个实施例中，表达CAR的细胞疗法是BCMACAR疗法。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在接受表达CAR的细胞疗法之前、期间或之后评估受试者。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与无反应者相比，反应者(例如，完全反应者)具有或被鉴定为具有更高水平或活性的GZMK、PPF1BP2或初始T细胞中的一者、两者或更多者(全部)。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与反应者相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高水平或活性的IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效应T细胞或调节性T细胞中的一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或更多者(例如，全部)。

在一个实施例中，复发者是与非复发者相比具有或被鉴定为具有以下中的一种或多种(例如，2、3、4种或全部)的表达水平增加的患者：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C和HLA-DQB1和/或与非复发者相比，以下中的一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或全部)的表达水平降低的患者：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1和EIF1AY的患者。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的免疫细胞耗竭标记物(例如，一种、两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1、PD-L1、TIM-3和/或LAG-3))的百分比。在一个实施例中，与来自反应者的PD-1或LAG-3表达免疫效应细胞的百分比相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1、PD-L1或LAG-3表达免疫效应细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)(例如，表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+ T细胞)的百分比。

在一个实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种耗竭标记物(例如，共表达PD-1、PD-L1和/或TIM-3)的免疫细胞)的百分比。在其他实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种耗竭标记物(例如，共表达PD-1和LAG-3)的免疫细胞)的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，与表达CAR的细胞疗法的反应者(例如，完全反应者)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，部分反应者具有或被鉴定为具有比反应者更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，无反应者具有或被鉴定为具有PD1/PD-L1+CAR+的耗竭表型和LAG3的共表达。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，与反应者(例如，完全反应者)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，部分反应者具有或被鉴定为具有比反应者更高的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，单采样品中CD8+CD27+CD45RO-T细胞的存在是受试者对表达CAR的细胞疗法(例如，BCMACAR疗法)的反应的阳性预测因子。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，单采样品中PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+ T细胞的高百分比是受试者对表达CAR的细胞疗法(例如，BCMACAR疗法)的反应的不良预后预测因子。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，反应者(例如，完整或部分反应者)具有以下特征中的一者、两者、三者或更多者(或全部)：

(i)与参考值(例如，无反应者数量的CD27+免疫效应细胞)相比，具有更多数量的CD27+免疫效应细胞；

(ii)(i)与参考值(例如，无反应者数量的CD8+ T细胞)相比，具有更多数量的CD8+T细胞；

(iii)与参考值(例如，无反应者数量的表达一种或多种检查点抑制剂的细胞)相比，具有更少数量的表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或KLRG-1的检查点抑制剂或组合)的免疫细胞；或者

(iv)与参考值(例如，无反应者数量的静息T_EFF细胞、静息T_REG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞)相比，具有更多数量的静息T_EFF细胞、静息T_REG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞中的一者、二者、三者、四者或更多者(全部)或它们的组合。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(vi)的细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFN-γ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα中的一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或更多者(或全部)或它们的组合。细胞因子可以选自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFa中的一者、二者、三者、四者或更多者(全部)。在一个实施例中，细胞因子的增加水平或活性选自IL-17a和CCL20中的一者或二者，这指示反应增加或复发减少。

在实施例中，可以根据临床标准进一步评估由本文的方法鉴定的反应者、无反应者、复发者或无复发者。例如，完全反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的完全反应，例如完全缓解。如本文所述，可以例如使用NCCN

或Cheson等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]17:1244(1999)和Cheson等人,“Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma[修订版恶性淋巴瘤治疗反应标准]”,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]25:579-586(2007)(两者均通过引用以其整体并入本文)鉴定完全反应。部分反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的部分反应，例如部分缓解。例如可以使用如本文所述的NCCN

或Cheson标准来鉴定部分反应。无反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者未表现出对治疗的反应，例如患者疾病稳定或疾病进展。例如可以使用如本文所述的NCCN

或Cheson标准来鉴定无反应者。

替代性地，或与本文披露的方法组合，响应于所述值，进行以下中的一项、两项、三项、四项或更多项：

例如，将表达CAR的细胞疗法施用于反应者或无复发者；

施用改变剂量的表达CAR的细胞疗法；

改变表达CAR的细胞疗法的排程或时程；

例如，将另外的药剂与表达CAR的细胞疗法(例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂)组合施用于无反应者或部分反应者；

在用表达CAR的细胞疗法治疗之前，将增加受试者中的较年轻的T细胞的数量的疗法施用于无反应者或部分反应者；

修改表达CAR的细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞，或例如针对被鉴定为无反应者或部分反应者的受试者而言，增加转导效率；

例如针对无反应者或部分反应者或复发者，施用替代疗法；或者

如果受试者为或被鉴定为无反应者或复发者，则例如通过CD25耗减、施用环磷酰胺、抗GITR抗体中的一者或多者或它们的组合来减少T_REG细胞群和/或T_REG基因签名。

在某些实施例中，用抗GITR抗体预治疗受试者。在某些实施例中，在输注或再输注之前用抗GITR抗体治疗受试者。

组合疗法

本文所述的表达CAR的细胞可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在该病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，第一治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，治疗因组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如，与第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所观察到的结果相比，使用较少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗使症状减少更大的程度，或对第一治疗观察到类似的情况。在一些实施例中，与一种治疗不存在的情况下递送另一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与所述障碍相关的有他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。

可以将本文所述的表达CAR的细胞和至少一种另外的治疗剂同时(以相同或分开的组合物)、或依序施用。对于依次施用，可以首先施用本文所述的表达CAR的细胞并且可以其次施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。

可以将CAR疗法和/或其他治疗剂、程序或方式在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间施用。可以将CAR疗法在其他治疗之前、与治疗并行、治疗后或在障碍缓解期施用。

当组合施用时，可以将CAR疗法和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部以比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)、或全部的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。在其他实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如第二药剂或第三药剂)、或全部的导致期望效果(例如治疗癌症)的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。

CD19 CAR

在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法与表达CD19 CAR的细胞疗法组合施用。

在一个实施例中，所述CD19 CAR的抗原结合结构域具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63scFv片段相同或相似的结合特异性。在一个实施例中，所述CD19 CAR的抗原结合结构域包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。

在一些实施例中，所述CD19 CAR包含根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。WO2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。

在一个方面，所述亲本鼠scFv序列是在PCT公开WO2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体。在一个实施例中，所述抗CD19结合结构域是WO 2012/079000中所述的scFv。

在一个实施例中，所述CAR分子包含在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，其提供鼠来源的特异性结合至人CD19的scFv片段。

在一个实施例中，CD19 CAR包含在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。在实施例中，氨基酸序列是

(MALPVTALLLPLALLLHAARP)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:290)或与其基本上同源的序列。信号肽的任选序列以大写字母和大括号示出。

在一个实施例中，氨基酸序列是：

Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:291)或与其基本上同源的序列。

在一个实施例中，所述CD19 CAR具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。在实施例中，CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，通过用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自身失活、复制缺陷型慢病毒(LV)运载体的转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。

在其他实施例中，CD19 CAR包含根据通过引用并入本文的WO2014/153270的表3的抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。

对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)反应。人源化CD19 CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将所述文献通过引用以其整体并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。

在一些实施例中，CD19 CAR构建体描述于PCT公开WO 2012/079000中(通过引用并入本文)，并且鼠CD19 CAR和scFv构建体的氨基酸序列在下表6中示出，或者是与前述序列中的任一种基本上相同的序列(例如，与本文所述的任何序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性)。

表6.CD19 CAR构建体

含有人源化抗CD19 scFv结构域的CD19 CAR构建体描述于PCT公开WO 2014/153270(通过引用并入本文)中。

抗CD19 scFv结构域的鼠和人源化CDR序列的序列对于重链可变结构域示出在表7中并且对于轻链可变结构域示出在表8中。SEQ ID NO是指表6中发现的那些。

表7.CD19抗体的重链可变结构域CDR(Kabat)SEQ ID NO

候选物	HCDR1	HCDR2	HCDR3
				murine_CART19	SEQ ID NO:331	SEQ ID NO:332	SEQ ID NO:333
人源化_CART19a	SEQ ID NO:337	SEQ ID NO:338	SEQ ID NO:339
				人源化_CART19b	SEQ ID NO:343	SEQ ID NO:344	SEQ ID NO:345
人源化_CART19c	SEQ ID NO:349	SEQ ID NO:350	SEQ ID NO:351

表8.CD19抗体的轻链可变结构域CDR(Kabat)SEQ ID NO

候选物	LCDR1	LCDR2	LCDR3
				murine_CART19	SEQ ID NO:334	SEQ ID NO:335	SEQ ID NO:336
人源化_CART19a	SEQ ID NO:340	SEQ ID NO:341	SEQ ID NO:342
				人源化_CART19b	SEQ ID NO:346	SEQ ID NO:347	SEQ ID NO:348
人源化_CART19c	SEQ ID NO:352	SEQ ID NO:353	SEQ ID NO:354

可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood,[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及美国基因与细胞治疗学会第16届年会(ASGCT)(五月15-18日，盐湖城)2013,Abst[摘要]10。

示例性的CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR，例如，在本文所述的一个或多个表格中，或Xu等人,Blood[血液]123.24(2014):3750-9、Kochenderfer等人,Blood[血液]122.25(2013):4129-39、Cruz等人,Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207中描述的抗CD19 CAR，这些文献每个通过引用以其整体并入本文。

化学治疗剂

在一些实施例中，所述表达BCMA CAR的细胞疗法与化学治疗剂组合施用。示例性化疗剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑珠单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调制剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。

考虑用于组合疗法的一般化疗药剂包括阿那曲唑

比卡鲁胺

硫酸博莱霉素

白消安

白消安注射液

卡培他滨

N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂

卡莫司汀

苯丁酸氮芥

顺铂

克拉屈滨

环磷酰胺(

或

)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷

阿糖胞苷脂质体注射液

达卡巴嗪

更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素

柠檬酸柔红霉素脂质体注射液

地塞米松、多西他赛

盐酸多柔比星

依托泊苷

磷酸氟达拉滨

5-氟尿嘧啶

氟他胺

tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲

伊达比星

异环磷酰胺

伊立替康

L-天冬酰胺酶

甲酰四氢叶酸钙、美法仑

6-巯基嘌呤

甲氨蝶呤

米托蒽醌(mitoxantrone)

吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇

phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、polifeprosan 20共卡莫司汀植入物

柠檬酸它莫西芬

替尼泊苷

6-硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)

注射用托泊替康盐酸盐

长春花碱

长春新碱

和长春瑞滨

示例性的烷化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil

Uracil nitrogen

氮芥(chlormethine)

环磷酰胺

Revimmune^TM)、异环磷酰胺

美法仑

苯丁酸氮芥

哌泊溴烷

三乙烯蜜胺

三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺

噻替派

白消安

卡莫司汀

洛莫司汀

链脲佐菌素

和达卡巴嗪

另外的示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂

替莫唑胺

和

放线菌素(也称为放线菌素-D，

美法仑(也称为L-PAM、L-肌溶素和苯丙氨酸芥末，

六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、

卡莫斯汀

苯达莫司汀

白消安

和

卡铂

洛莫斯汀(也称为CCNU，

顺铂(也称为CDDP、

和

苯丁酸氮芥

环磷酰胺(

和

)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、

Altretamine(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、

异环磷酰胺

泼尼丁星；丙咔嗪

甲乙胺(也称为氮芥菜、芥子碱和甲乙胺盐酸盐，

链霉素

噻替派(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、

环磷酰胺

和盐酸苯达莫司汀

示例性mTOR抑制剂包含例如坦罗莫司；地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.0^4,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且描述于PCT公布号WO 03/064383中)；依维莫司(

或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，

)；塞马莫德(CAS164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N²-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:355)、内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。

示例性的免疫调节剂包括，例如阿夫土珠(可从

获得)；吡非司亭

来那度胺(CC-5013，

沙利度胺

actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白介素1、白介素2和干扰素γ的人细胞因子的混合物，CAS951209-71-5，可从IRX Therapeutics获得)。

示例性蒽环类药物包括，例如多柔比星(

和

博来霉素

柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸柔比霉素，

柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，

米托蒽醌(DHAD，

表柔比星(Ellence^TM)；伊达比星

丝裂霉素C

格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。

长春花生物碱的实例包括，例如酒石酸长春瑞滨

长春新碱

和长春地辛

长春碱(又称硫酸长春碱、长春花碱和VLB，

和

和长春瑞滨

示例性蛋白体抑制剂包含硼替佐米

卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-((S)-4-甲基-1-(((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；马里佐布(marizomib)(NPI-0052)；柠檬酸艾沙佐米(MLN-9708)；迪兰佐布(delanzomib)(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

生物聚合物递送方法

在一些实施例中，如本文所披露的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫反应)和/或可生物降解的聚合物。

合适的生物聚合物的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-戊乙酰基a-D-半乳糖)、纤维素、几丁质、壳聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原、羟基磷灰石、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基-己酸酯)(PHBHHx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、丝、大豆蛋白、和大豆蛋白分离物，单独地或以任何浓度和任何比率与任何其他聚合物组合物组合。生物聚合物可以用粘附或迁移促进分子(例如，与淋巴细胞的胶原受体结合的胶原模拟肽、和/或刺激性分子)强化或修饰以增强待递送细胞的递送、扩增或功能(例如，抗癌活性)。生物聚合物支架可以是可注射的，例如凝胶或半固体、或固体组合物。

在一些实施例中，在递送至受试者之前，将本文所述的表达CAR的细胞接种到生物聚合物支架上。在实施例中，生物聚合物支架进一步包含一种或多种本文所述的另外的治疗剂(例如，另一种表达CAR的细胞、抗体、或小分子)或例如并入或缀合到支架的生物聚合物的增强表达CAR的细胞活性的药剂。在实施例中，生物聚合物支架被注射(例如，瘤内、或通过外科手术植入)到肿瘤处或足以介导抗肿瘤作用的肿瘤附近。生物聚合物组合物及其递送方法的另外的实例描述于Stephan等人,Nature Biotechnology[自然生物技术],2015,33:97-101；和WO 2014/110591中。

药物组合物和治疗

本发明的药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文描述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。

在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。

当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文所述T细胞的药物组合物按以下剂量施用：10⁴至10⁹个细胞/kg体重，在一些情况下为10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。

在某些方面，可能需要将激活的T细胞施用于受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采术)，根据本发明激活来自血液的T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞重新输注入患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自10cc至400cc抽血的T细胞激活。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的T细胞激活。

能以任何常规方式施用主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文描述的组合物。在一个方面，通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的T细胞组合物。在一个方面，本发明的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)组合物通过静脉内注射来施用。可以将表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位。

在具体的示例性方面，受试者可经历白细胞单采术，其中离体收集、富集或耗减白细胞以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。这些免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)分离物可以通过本领域已知的方法来扩增，并进行处理，使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建体，从而产生本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或与移植同时，受试者接受本发明的扩增的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或NK细胞)的输注。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

在实施例中，例如在施用表达本文所述的CAR(例如，本文所述的BCMA结合CAR)的一种或多种细胞之前，对受试者进行淋巴细胞耗减。在实施例中，淋巴细胞清除包括施用美法仑、cytoxan、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。

有待向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和该治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来进行人类施用的剂量的缩放。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg的范围内，通常每天施用持续1与30天之间的时间。优选的每天剂量是每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天最多40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。

在一个实施例中，例如使用体外转录将CAR引入免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且受试者(例如，人)接受本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的初始施用，以及本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前一次施用后的小于15天(例如在14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)施用。在一个实施例中，每周将本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于受试者(例如，人)超过一次，例如每周施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)2次、3次或4次。在一个实施例中，受试者(例如，人受试者)每周接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的超过一次施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(本文也称为周期)，然后不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)一周，然后给受试者施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次另外施用(例如，每周施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)超过一次)。在另一个实施例中，受试者(例如，人受试者)接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)超过一个周期，并且每个周期之间的时间小于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施例中，每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，每周施用3次。在一个实施例中，施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。

在一个方面，使用慢病毒病毒载体(如慢病毒)来产生表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)。以这种方式产生的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)将具有稳定的CAR表达。

在一个方面，使用病毒载体如γ逆转录病毒载体(例如本文描述的γ逆转录病毒载体)产生表达CAR的细胞，例如CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。

在一个方面，表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)在转导后瞬时表达CAR载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。CAR的瞬时表达可能受RNA CAR载体递送的影响。在一个方面，通过电穿孔将CAR RNA转导进细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

使用瞬时表达的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)(特别是与携带鼠scFv的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)一起)治疗的患者可能产生的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。

不受该理论的束缚，据信这种过敏反应可能是由患者发展体液抗CAR反应，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为当存在暴露于抗原的10至14天中断时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。

如果患者在瞬时CAR疗法过程中具有产生抗CAR抗体反应的高风险(如由RNA转导产生的那些)，则表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)输注中断不应持续超过十至十四天。

实例

通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实例制备和利用本发明的组合物并实践所要求保护的方法。以下工作实例具体指出了本发明的不同方面，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。

实例1：在使用或不使用huCART19的情况下，作为高风险多发性骨髓瘤的标准一线或二线疗法的巩固的CART-BCMA的1期研究

实验设计：图1描绘了组合抗CD19 CAR T细胞和抗BCMA CAR T细胞作为高风险多发性骨髓瘤(MM)患者的一线疗法的巩固的1期研究的总体设计。在这项组合CAR T细胞的研究中，在针对高风险MM的一线疗法后，CART-BCMA将与CART19(也称为CTL119)共同施用；这项研究替代了在针对MM的一线疗法后单独施用CART19的先前的开放性研究，该研究因预期基于CART-BCMA的组合(NCT 02794246)而提早结束。

对于CART-BCMA+CART19的该1期研究，靶标群体是在修订版国际分期系统中定义为第3阶段的对一线疗法有反应的高风险多发性骨髓瘤患者(Palumbo A,Avet-Loiseau H,Oliva S等人Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology[临床肿瘤学杂志：美国临床肿瘤学会官方杂志]2015；33:2863-9，通过引用以其整体并入本文)。假设在这种情况下(与复发/难治性情况相比)CAR T细胞会更有效，因为用于制造的T细胞在功能上受到较高的疾病负荷和许多先前的MM疗法的损害较少；还假设在这种情况下，由于较低的疾病负荷，CAR T细胞将更安全，这预期导致较不明显的体内初始CAR T细胞增殖。与我们的1期研究相比，该研究还增加了输注前调整方案氟达拉滨，氟达拉滨已在大多数其他CAR T细胞研究中使用，并可能促进CAR T细胞在体内的长期存活(Turtle CJ,Hanafi L-A,Berger C等人Science translationalmedicine[科学转化医学]2016；8:355ra116-355ra116)，并将CART-BCMA作为单次输注而不是分剂量输注进行施用。最后，将向输注后30天没有过度毒性的受试者施用护理标准的来那度胺维持疗法。鉴于输注方案的这些新方面，所述研究将从单独使用CART-BCMA的按5x10⁸个CAR T细胞剂量进行的3患者安全性试运行(run-in)开始，这是我们1期研究确定的安全剂量。如果未观察到过量毒性，将另外招募3名患者接受CART-BCMA和CART19治疗，同样剂量为5x10⁸个细胞。这项研究中的CART19剂量将比我们的先导CART19+ASCT研究中所用的剂量高10倍，其中由于担心CART19与ASCT的毒性，细胞剂量较低；这旨在增加从CART19的添加中受益的可能性。如果在组合治疗方案中未观察到过度毒性，则研究将进入随机化期，在此期，受试者将单独接受CART-BCMA或接受CART-BCMA+CART19，直到总共治疗了20名受试者，10名各自接受了CART-BCMA单一疗法和CART-BCMA+CART19组合疗法。所述研究的主要终点是这种途径的安全性。尽管假设添加CART19可改善无进展生存期，但所述研究无权进行这种比较。相反，随机化的部分将允许比较单一疗法和组合治疗组之间的相关终点，以评价CART19消除抵抗CART-BCMA的去分化BCMA^dim MM细胞(将通过流式细胞术在治疗后获得的骨髓(BM)细胞上进行分析)以及CART19是否靶向MM干细胞(MMSC)的证据。

可以通过以下来分析CART19是否靶向MMSC：(1)确定CART19是否诱导针对干细胞抗原Sox2的免疫反应(例如抗体反应和/或T细胞反应)；和/或(2)评价Sox2作为患者样品中MMSC的临床生物标记物的表达。

实例2：在使用或不使用huCART19的情况下，作为高风险多发性骨髓瘤的标准一线或二线疗法的巩固的CART-BCMA的1期研究

研究总结

研究设计

这是一项开放标签的1期研究，用以评估在使用或不使用huCART19(也称为CTL119)的情况下，表达具有串联TCRζ和4-1BB(TCRζ/4-1BB)共刺激结构域的BCMA(B细胞成熟抗原)特异性嵌合抗原受体的自体T细胞(称为“CART-BCMA”)作为对高风险多发性骨髓瘤一线或二线疗法有反应的患者的巩固的安全性和药效学。

在这项研究中评估的方案基于已建立的CART-BCMA的安全性，该安全性已在UPCC14415/IRB#822756中在复发/难治性骨髓瘤患者中1.5g/m²的环磷酰胺剂量之后按分次输注的5x10⁸个细胞的剂量证明。这项研究测试了CART-BCMA(1)作为对多发性骨髓瘤的早期疗法的巩固，(2)作为单次而非分剂量输注，(3)在淋巴细胞耗减化疗方案中加入氟达拉滨，(4)与huCART19组合，以及(5)在进展或未能实现严格完全反应的受试者中进行计划的重新输注(Kumar S,Paiva B,Anderson KC等人International Myeloma Working Groupconsensus criteria for response and minimal residual disease assessment inmultiple myeloma[国际骨髓瘤工作组多发性骨髓瘤的反应和最小残留疾病评估的共识标准].The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；17(8):e328-e346)。

研究登记将由两个研究期组成：a).安全性试运行期，以及b).随机化期。在每个研究期中，受试者将被登记入以下两个群组之一：

1.群组1：CART-BCMA单一疗法-在环磷酰胺+氟达拉滨化疗后3天(+/-1天)按单次输注5x10⁸个CART-BCMA细胞进行施用

2.群组2：CART-BCMA+huCART19-在环磷酰胺+氟达拉滨化疗后3天(+/-1天)以单次输注5x10⁸个CART-BCMA细胞+单独的单次输注5x10⁸个huCART19细胞施用

随机化期

在随机化期，受试者将被随机化(1:1比率)以接受单独的CART-BCMA(群组1)或CART-BCMA+huCART19(群组2)。CAR T细胞疗法后，在输注后28天进行首次正式反应评估或在方案相关毒性消退至≤2级后(以较晚者为准)，治疗研究者判断受试者符合资格接受护理标准维持疗法。

将对毒性和骨髓瘤反应进行标准的临床评估。将进行相关分析以评估CART-BCMA和huCART19扩增/持久性和表达靶抗原的细胞的耗减的药代动力学/药效学，对克隆性多发性骨髓瘤亚群的影响以及抗骨髓瘤免疫力(包括针对骨髓瘤干细胞抗原的免疫力)。

额外的CAR T细胞输注

如果满足以下条件，则在初次输注后，受试者将有资格获得额外的CAR T细胞剂量：

1.受试者对任何先前的CAR T细胞输注均未经历剂量限制性毒性(DLT)。

2.与CAR T细胞和/或淋巴结耗减化疗可能/确定相关的不良事件已恢复至基线或≤2级。

3.自先前的CAR T细胞输注起已经复发了90天，或者在最后一次CAR T细胞输注之后受试者的多发性骨髓瘤已经进展。

4.根据研究者的判断，受试者具有残留多发性骨髓瘤的客观证据。研究者将确定受试者是否有残留多发性骨髓瘤的客观证据。

5.根据研究者的判断，额外的CAR T细胞输注的风险和收益是平衡的。

6.从最初的制造开始，仍然存在最小可接受剂量的CAR T细胞。

7.仅群组2受试者：>3％的外周血淋巴细胞是CD19+。如果<3％的外周血淋巴细胞是CD19+，并且受试者符合上述所有其他标准，则研究者判断受试者可以接受CART-BCMA的额外输注。

如果满足上述标准，并且研究仍在开放，则受试者最多只能接受两次额外的CAR T细胞输注。

目的

主要目的：

1)评价作为使用环磷酰胺+氟达拉滨进行的淋巴细胞耗减后标准的一线或二线多发性骨髓瘤疗法的巩固的CART-BCMA(按单一剂量5x10⁸个CAR⁺细胞)的安全性。

2)在此临床环境中评价与CART-BCMA一起施用的huCART19的安全性。

次要目的：

1)在每种CAR T细胞方案(CART-BCMA单一疗法或CART-BCMA+huCART19组合)后评估临床结果。

a.评估常规反应标准、最小残留疾病(MRD)阴性的达成(根据IMWG 2016标准(Kumar S等人The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))以及PET-阴性反应的达成(通过PET/CT检测到FDG-avid疾病不存在)。

i.对第一剂量的反应

ii.对后续剂量的反应

b.反应持续时间、无进展生存期和总体生存率

c.通过igH测序进行分子MRD

2)在此临床环境中评价CART-BCMA和huCART19的扩增和持久性动力学。将初始输注后的扩增和持久性以及生物活性程度与后续输注进行比较。

3)评价huCART19对CART-BCMA耐药性和克隆性多发性骨髓瘤细胞相关参数的影响，例如：

a.通过流式细胞仪和免疫组织化学测定的克隆BCMA^dim/neg或CD19+浆细胞的持久性

b.使用骨髓样品的体外菌落形成测定法测量的多发性骨髓瘤克隆形成的耗减

c.诱导抗Sox2和其他抗骨髓瘤的免疫反应

d.克隆CD19⁺ B细胞的耗减

4)评价单采产物和CART-BCMA/huCART19细胞的细胞组成。

5)评价输注后维持疗法对CAR T细胞持久性和表型以及CAR相关不良事件的影响。

6)表征在CART-BCMA+/-huCART19之后仍然存在的多发性骨髓瘤细胞的表型(细胞表面免疫表型，基因表达谱)。

诊断和主要纳入标准

一线或二线疗法后未实现严格完全反应的高风险多发性骨髓瘤成年患者。

研究药剂、剂量和方案

研究药剂：

·CART-BCMA细胞：表达具有串联TCRζ和4-1BB(TCRζ/4-1BB)共刺激结构域的BCMA(B细胞成熟抗原)特异性嵌合抗原受体的自体T细胞。

·huCART19细胞：用慢病毒载体转导以表达抗CD19 scFVTCRζ的自体T细胞：4-1BB。也称为CTL119细胞。

·环磷酰胺/氟达拉滨：细胞毒性化疗剂可在CAR T细胞产物施用前用于淋巴细胞耗减。

剂量和施用途径：

·CART-BCMA细胞：静脉内输注5x10⁸个细胞；最小可接受输注剂量为1x10⁸。

·huCART19细胞：静脉内输注5x10⁸个细胞；最小可接受输注剂量为1x10⁸。

·环磷酰胺和氟达拉滨：静脉内输注环磷酰胺300mg/m²和氟达拉滨30mg/m²。

方案：

·CART-BCMA细胞：第0天单次输注。

·huCART19细胞：CART-BCMA输注完成后第0天进行单次输注(适用受试者)。

·环磷酰胺/氟达拉滨：给与超过3天；如下排定，以使化疗的最后一天落在第一次CAR T细胞输注(第0天)前3天(+/-1天)。

额外的CAR T细胞输注：

对于满足所需资格标准的受试者，可以任选地以至少三个月的间隔或在疾病进展时输注额外的CAR T细胞剂量。

对于第二次及以后的CAR T细胞输注，默认方案(单独CART-BCMA对比CART-BCMA+huCART19)将是受试者初次接受输注的方案。然而，如果剩余的huCART19细胞不足以配制可接受的剂量和/或<3％的外周血淋巴细胞为CD19+，则可以将CART-BCMA单独输注到先前接受过CART-BCMA和huCART19的受试者中。然而，尚无足够CART-BCMA剂量的群组2受试者不符合单独使用huCART19进行额外输注的资格。

介绍

CAR T细胞作为多发性骨髓瘤巩固疗法的依据

“巩固疗法”是指对先前疗法有反应后的治疗，以延长反应和/或降低复发/进展的风险。在多发性骨髓瘤中，采用诸如来那度胺、硼替佐米和地塞米松等方案的标准一线疗法通常与大剂量美法仑和自体干细胞移植(ASCT)一起巩固使用。这项研究涉及使用CAR T细胞疗法而非ASCT作为一线疗法的巩固。

这项研究将招募对一线或二线疗法有反应的受试者，并在广泛暴露于细胞毒性化疗之前收集T细胞用于制造CAR T细胞。预计与在复发/难治性环境中收获的细胞相比，在这种临床环境中收获的T细胞将导致更具临床活性的CAR T细胞产物。这种预期源自对经CART19治疗的CLL患者的发现，这些发现显示临床结果与早期记忆T细胞表型的存在强烈相关(Fraietta JA,Lacey SF,Wilcox NS等人Biomarkers of Response to Anti-CD19Chimeric Antigen Receptor(CAR)T-Cell Therapy in Patients with ChronicLymphocytic Leukemia[慢性淋巴细胞性白血病患者中对抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的反应的生物标记物].Blood[血液].2016；128(22):57)。多发性骨髓瘤进展伴随着耗竭T细胞表型的发展(Chung DJ,Pronschinske KB,Shyer JA等人T-cell Exhaustion inMultiple Myeloma Relapse after Autotransplant:Optimal Timing of Immunotherapy[自体移植后多发性骨髓瘤复发中的T细胞耗竭：免疫疗法的最佳时机].Cancer ImmunolRes[癌症免疫研究].2016；4(1):61-71)。随着患者通过多个治疗线而进展，随着疾病负荷的增加和患者接受越来越积极的治疗，T细胞库可能会逐渐受损，通常具有广泛的细胞毒性作用机制。

评价巩固疗法疗效的挑战是如何区分对研究疗法的反应与对先前疗法的反应。为了避免这种局限性，该方案将登记对象限制为尽管接受了至少三个周期但对既往疗法至少实现轻微反应但未完全反应的受试者，此时反应典型地会“趋于平稳”(即无法通过进一步的疗法明显改善)。此外，受试者将推迟采用高剂量美法仑和ASCT的标准巩固到以后的治疗线，并接受环磷酰胺和氟达拉滨，它们本身预期不会在这种群体中作为淋巴细胞耗减疗法实现显著的抗骨髓瘤反应。因此，通过这项研究设计，我们希望能够将观察到的任何多发性骨髓瘤反应归因于CAR T细胞的临床活性。

组合CAR T细胞疗法

赘生物克隆的罕见靶标阴性亚群的选择和生长是已记录的对CAR T细胞疗法有抗性的机制。同时靶向两种抗原可能会绕过这种抗性机制，并增加以单剂量消除克隆的所有免疫表型亚群的可能性。在一些接受CART-BCMA的受试者中，在最初反应后，存在表达BCMA-dim和CD19的多发性骨髓瘤细胞的富集，这表明huCART19的共同施用可能阻止CART-BCMA后的进展。

连续CAR T细胞输注

由于在消除所有疾病之前输注的CAR T细胞的体内功能性能力丧失，在最初输注CAR T细胞后残留疾病可能会持续存在。尽管体内CART-BCMA细胞有低水平的持久性，但许多最初对CART-BCMA有反应的受试者后来都发生进展。该发现表明在最初的体内扩增浪潮之后，CAR T细胞产物的丧失。由于在所有分析的患者中BCMA表达仍于复发中存在，因此残留疾病可能对额外CART-BCMA剂量的重输注敏感。因此，该方案包括对CAR T细胞进行连续输注的规定，只要最初制造产物中剩余足够的剂量即可。预期该规定将在此临床环境中针对连续CART-BCMA和huCART19输注生成安全性、药代动力学和药效学数据，以及初步的临床反应数据。这一规定也是由于越来越多认识到，极低水平的残留骨髓瘤在临床上很重要，并且应该被靶定。即使是常规定义的完全反应的受试者，其预后也会因最小残留疾病(MRD)的持续性而有所不同(Munshi NC,Avet-Loiseau H,Rawstron AC等人Association ofMinimal Residual Disease With Superior Survival Outcomes in Patients WithMultiple Myeloma:A Meta-analysis[多发性骨髓瘤患者中最小残留疾病与优越的生存结果的关系：荟萃分析].JAMA Oncol[美国医学会杂志肿瘤学].2017；3(1):28-35)。

受试者选择

纳入标准

1.根据IMWG 2014标准(Rajkumar SV,Dimopoulos MA,Palumbo A等人,International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis ofmultiple myeloma[国际骨髓瘤工作组更新的多发性骨髓瘤诊断标准].The LancetOncology[柳叶刀肿瘤学].2014；15(12):e538-548)，受试者必须诊断为多发性骨髓瘤，具有以下任何高风险特征：

a.β-2-微球蛋白≥5.5mg/L并且LDH高于正常上限。注：在启动全身疗法之前未测量β-2-微球蛋白的受试者可能会根据启动全身疗法后获得的测量结果合格。

b.高风险FISH特征：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)，结合β-2-微球蛋白≥5.5mg/L(修订版ISS 3期)。注：在启动全身疗法之前未测量β-2-微球蛋白的受试者可能会根据启动全身疗法后获得的测量结果合格。

c.除超二倍体外，具有>3个结构异常的中期核型。

d.登记前任何时间的浆细胞白血病(外周血中>20％浆细胞)。

e.无法对“imid/PI”组合(沙利度胺、来那度胺或泊马度胺与硼替佐米、依沙佐米或卡非佐米组合)实现部分反应或更好(根据IMWG 2016标准(Kumar S等人.The LancetOncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))。

f.开始疗法的六个月内在用“imid/PI”组合进行的一线疗法时发生进展(根据IMWG 2016标准(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))。

2.关于先前的骨髓瘤疗法，受试者必须符合以下标准：

a.受试者必须处于一线多发性骨髓瘤疗法，但以下情况除外：如果受试者在一线疗法开始的六个月内发生此类进展而在一线疗法期间因疾病进展进入二线疗法，则符合资格。治疗线由IMWG 2016标准定义(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346)。

b.受试者不得经历自体或同种异体干细胞移植。

c.在登记前，受试者必须启动≤1年的多发性骨髓瘤全身疗法。

d.受试者必须已经接受了当前方案的至少3个完整周期并且总体上对先前疗法至少实现最小反应(如IMWG 2016标准所定义(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))。

e.受试者不得接受细胞毒性化疗(例如，多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂)，但以下情况除外：

i.每周低剂量环磷酰胺(≤500mg/m²/周)

ii.连续输注环磷酰胺，如果限于单个周期。

3.根据IMWG 2016标准(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346)，受试者登记时必须未实现完全反应或严格的完全反应，除非可通过流式细胞术在骨髓中检测到克隆性浆细胞。(即，如果可以通过骨髓流式细胞术记录最小的残留疾病，则具有完全反应或严格完全反应的受试者是符合资格的)。

4.受试者必须签署书面知情同意书。

5.受试者必须≥18岁。

6.受试者必须具有适当的重要器官功能：

a.血清肌酐≤2.5或肌酐耗减率≥30ml/min(根据CKD-EPI测量或估算)，且不依赖于透析。

b.绝对中性粒细胞计数≥1000/μl，血小板计数≥50,000/μl(如果骨髓浆细胞的细胞构成≥50％，则≥30,000/μl)。

c.SGOT≤正常值上限的3倍和总胆红素≤2.0mg/dl(高胆红素血症归因于吉尔伯特综合征的患者除外)。

d.左心室射血分数(LVEF)≥45％。LVEF评估必须在登记8周内进行。

7.除可归因于多发性骨髓瘤疗法的周围神经病变外，先前/正在进行的疗法中的毒性必须根据CTCAE 4.03标准恢复至≤2级或受试者先前的基线。

8.受试者的ECOG体能状态必须为0-2。

9.受试者必须愿意放弃一线ASCT。

10.具有生殖潜力的受试者必须同意使用可接受的避孕方法。

排除标准

1.孕妇或哺乳期妇女

2.白细胞单采术静脉通道不足或禁忌。

3.活动性乙型肝炎、丙型肝炎或HIV感染，或其他活动性、不受控制的感染。

4.如概述的，任何无法控制的医学或精神障碍都将被排除参与。

5.NYHA III级或IV级心力衰竭、不稳定型心绞痛或近期(6个月以内)心肌梗塞病史或持续性(>30秒)室性快速型心律失常。

6.具有活动性自身免疫性疾病，包括结缔组织病、葡萄膜炎、结节病、炎性肠病或多发性硬化症，或有严重的自身免疫性疾病史(经研究者判断)，需要长期的免疫抑制疗法。

7.先前或活动性中枢神经系统(CNS)受累(例如软脑膜疾病，实质性肿块)伴有骨髓瘤。除非存在可疑症状或放射照像术发现，否则无需对此进行筛查(例如腰椎穿刺)。即使骨髓瘤CSF阴性，颅内延伸并累及硬脑膜的颅骨疾病受试者也将被排除在外。

研究药物

CART-BCMA细胞

CART-BCMA细胞是自体T细胞，经工程化以表达对BCMA具特异性的细胞外单链抗体(scFv)，该抗体与细胞内信号传导分子相连，该分子由串联信号传导结构域组成，该串联信号传导结构域由与4-1BB共刺激结构域连接的TCRζ信号传导模块组成。将CART-BCMA细胞冷冻保存在可输注冷冻介质中，并分配在输注袋中。CART-BCMA细胞将以单次输注施用。靶标CART-BCMA剂量为5x10⁸个转导的细胞，最小可接受的输注剂量为1x10⁸个转导的细胞。将配制剂量以实现包含5x10⁸个CAR T细胞的最大剂量数；即，为了增加可用剂量的数量，剂量不会降低到5x10⁸个CAR T细胞的靶标值以下。

huCART19细胞

huCART19细胞是自体T细胞，经工程化以表达对CD19具特异性的细胞外单链抗体(scFv)，该抗体与细胞内信号传导分子相连，该分子由串联信号传导结构域组成，该串联信号传导结构域由与4-1BB共刺激结构域连接的TCRζ信号传导模块组成。将CTL119细胞冷冻保存在可输注冷冻介质中，并分配在输注袋中。huCART19细胞将以单次输注施用。靶标huCART19剂量为5x10⁸个转导的细胞，最小可接受的输注剂量为1x10⁸个转导的细胞。将配制剂量以实现包含5x10⁸个CAR T细胞的最大剂量数；即，为了增加可用剂量的数量，剂量不会降低到5x10⁸个CAR T细胞的靶标值以下。

CART-BCMA和huCART19输注

产物将按顺序方式施用，首先将CART-BCMA细胞融化并输注，然后将huCART19细胞融化并输注，这必须在完成CART-BCMA输注后至少一小时进行。这段时间内huCART19产物必须保持在干冰上。

最初CAR T细胞输注前的淋巴细胞耗减化疗

在初始CAR T细胞输注之前，将以每天环磷酰胺300mg/m²+氟达拉滨30mg/m²的方案施用淋巴细胞耗减化疗，持续三天。必须排定淋巴细胞耗减化疗，以使疗法的最后一天落在CAR T细胞输注前3天(+/-1天)。

为了研究目的作为本研究的一部分时，环磷酰胺和氟达拉滨均为FDA批准的药剂，将根据FDA批准的标签和标准机构规范进行制备和输注。对于该方案，优选的止吐预用药是恩丹西酮16mg和地塞米松12mg，在每次化疗输注前每天施用；该方案可以根据治疗研究者的判断而改变。研究者可根据需要使用其他标准的家用止吐药(例如恩丹西酮、普鲁氯嗪、劳拉西泮)。根据研究者的判断，对于估算GFR<80mL/min的受试者，可降低氟达拉滨剂量。

在随后的CAR T细胞输注之前进行淋巴细胞耗减化疗

在随后的CAR T细胞输注之前，将以环磷酰胺+氟达拉滨方案(如上所述)或单次输注环磷酰胺1.5g/m²进行淋巴细胞耗减化疗。依据对在首次CAR T细胞输注之前施用的淋巴细胞耗减化疗的耐受性和整体临床状况的指导，根据研究者的判断在这两种方案中进行选择。将排定淋巴细胞耗减化疗，以使疗法的最后一天落在CAR T细胞输注前3天(+/-1天)。

对于1.5g/m²环磷酰胺，优选的止吐预用药是恩丹西酮24mg和地塞米松12mg，随后是环磷酰胺后两天每天两次恩丹西酮8mg。接受环磷酰胺1.5g/m²的受试者也将接受1L生理盐水的静脉内预水合。

研究程序

该研究包括(1)筛选期、(2)由单采和CAR T细胞产物制备组成的制造期、(3)由淋巴细胞耗减化疗和CAR T细胞输注组成的治疗期以及(4)随访。

进入前评价/筛选

在进入前评价期间，将要求受试者提供知情同意书以及进行相关研究的研究用骨髓抽吸物和髓活检。可以在受试者仍在接受一线疗法的同时进行该活检。还可以由研究人员判断将样品送去进行标准解剖病理学或遗传分析(FISH、细胞遗传学、下一代测序等)。

单采

宾夕法尼亚大学医院单采中心进行了大容量单采程序。在此程序中，针对CAR T细胞获得了PBMC。

自体干细胞动员和收集

如果受试者在未来的治疗线中考虑使用大剂量的美法伦和自体干细胞移植，则在登记后但在输注CAR T细胞之前，只要尊重对术前化疗和骨髓生长因子使用的限制，就可以进行自体干细胞动员和收集。预期(但不是必需)在白细胞单采术后，将进行自体干细胞的动员和收集，以制造CAR T细胞。

输注前评估

受试者将在7天内输注CAR T细胞之前进行评估，以获得输注前的基线临床和骨髓瘤状态，并评估进行CAR T细胞输注的资格。

淋巴细胞耗减化疗

将排定淋巴细胞耗减化疗，以使淋巴细胞耗减化疗的最后一天落在CAR T细胞输注前3天+/-1天。

CAR T细胞输注

化疗完成后3天(+/-1天)开始输注CAR T细胞。每种CAR T细胞产物(CART-BCMA和huCART19)将作为单独的单次输注施用。对于同时接受CART-BCMA和huCART19的受试者，将首先施用CART-BCMA，并且在完成CART-BCMA输注后立即开始huCART19输注。

万一在输注huCART19之前对CART-BCMA发生急性输注反应，研究人员判断可将huCART19输注最多延迟48小时。如果在预用药和huCART19输注之间经过了>4小时，将重新施用预用药。如果huCART19输注被延迟，并且受试者在最初排定的输注时间的48小时内未能稳定下来允许huCART19输注，除非申办者批准进一步延迟，否则huCART19剂量将被取消。

输注后评估

受试者将在第+2、+4、+7、+10、+14和+21(+/-1天)和+28(+/-3天)返回诊所进行评价。

维持疗法

可以在第28天评价后开始，或者一旦可能/肯定与CAR T细胞和/或淋巴细胞耗减化疗相关的不良事件恢复到基线或≤2级(以较晚者为准)，就可以进行维持疗法。除了这些限制，是否以及何时启动维持疗法的决定将取决于研究者的判断。维持方案的选择也由研究者判断。来那度胺单一疗法是优选的维持疗法，如果可能，应避免含类固醇的方案。

每月(+/-7天)评价和季度评价

受试者将返回诊所进行每月(+/-7天)评价，进行评价直到输注CAR T细胞后六个月。经过六个月评价后，受试者将在输注后长达一年经受季度评估(+/-14天)。

研究相关性研究评估

标准研究外周血抽取将由以下组成：

1.EDTA管(即紫顶管)中约25mL外周血用于PBMC和核酸分离

2.在普通塑料管(即红顶管)中约5mL外周血用于血清分离

骨髓抽吸物的靶标收集体积将为10-20mL。对于指定用于标准解剖病理学和相关研究的骨髓抽吸物样品，约2-5mL将被分配到标准解剖学病理学，其余用于相关研究。可用于相关研究的抽吸物将分为以下：约1-3mL至塑料管(即红顶管)以进行血清分离，其余部分至EDTA试管(即紫顶管)以进行PBMC和核酸分离。

对于标准解剖病理学(如适用)和相关研究，骨髓芯活检的靶标长度为1cm。该长度可以在执行该程序的临床医生的判断下从单独的活检或单个活检的分区中获得。

以下是计划用于外周血和(如适用)骨髓抽吸物的相关测定：

1.用于检测huCART19和CART-BCMA细胞的流式细胞术和qPCR。

2.用于多发性骨髓瘤细胞(骨髓抽吸物)上靶抗原表达以及最小残留疾病检测/表征的流式细胞术。

3.通过流式细胞仪和/或分子方法对T细胞亚群进行表型分型。

4.通过免疫球蛋白重链测序对最小残留疾病进行分子检测/表征。

5.在骨髓芯活检时针对靶抗原表达以及T细胞和骨髓其他细胞成分的表征的免疫组织化学分析。

6.可溶性标记物的sBCMA/BAFF/APRIL ELISA。

实例3：在使用或不使用huCART19的情况下，作为高风险多发性骨髓瘤的标准一线或二线疗法的巩固的CART-BCMA的1期研究

研究总结

研究设计

这是一项开放标签的1期研究，旨在评估对高风险多发性骨髓瘤的一线或二线疗法有反应的患者和对挽救疗法有反应的复发/难治性多发性骨髓瘤患者中，在使用或不使用huCART19的情况下，CART-BCMA的安全性、药效学和抗骨髓瘤作用。

在这项研究中评估的方案基于已建立的CART-BCMA的安全性，该安全性已在UPCC14415/IRB#822756中在复发/难治性骨髓瘤患者中1.5g/m²的环磷酰胺剂量之后按分次输注的5x10⁸个细胞的剂量证明。这项研究测试了CART-BCMA(1)作为多发性骨髓瘤的早期疗法的巩固和复发/难治性多发性骨髓瘤的标准挽救疗法的巩固，(2)向淋巴细胞耗减化疗方案中加入氟达拉滨，(3)与huCART19组合，和(4)作为单次而非分剂量输注。

所述研究将在三个登记期以逐步方式将这些变化引入CART-BCMA方案：

·A期：安全性试运行用于测试在先前两种方案后复发/难治性骨髓瘤但对其当前疗法有反应的患者中，用环磷酰胺+氟达拉滨进行淋巴细胞耗减化疗后按分剂量输注CART-BCMA+huCART19的安全性。

·A期扩增：扩增A期群组以增加对作为复发/难治性环境中的巩固途径的组合CART-BCMA/huCART19方案的安全性、药效学和抗骨髓瘤作用的了解。登记入A期扩增可能会与B期同时进行。

·B期：随机化期，对一线或二线疗法有反应的患者将在用环磷酰胺+氟达拉滨进行淋巴细胞耗减化疗后以分剂量输注接受单独的CART-BCMA(群组1)或CART-BCMA+huCART19(群组2)。

·C期：单剂量输注期，用以在对一线或二线疗法有反应的患者中进行环磷酰胺+氟达拉滨的淋巴细胞耗减化疗后，以单剂量输注单独CART-BCMA(组1)和以单剂量输注CART-BCMA+huCART19(组2)的安全性。

在整个研究过程中，每种产品的CART-BCMA和huCART19的靶标剂量均为5x10⁸个表达CAR的细胞。“群组1”是指分配单独接受CART-BCMA的一组受试者；“群组2”是指分配接受CART-BCMA+huCART19的一组受试者。分剂量输注将由在第一个输注日的10％剂量(一种或两种产物)、第二个输注日的30％剂量(一种或两种产物)或第三个输注日的60％剂量(一种或两种产物)组成。由于排程的限制或为了观察可疑的早期细胞因子释放综合征或其他毒性，输注天数可能会分布在7个日历日内。在用环磷酰胺+氟达拉滨完成淋巴细胞耗减化疗后3天(+/-1天)开始输注。

安全性试运行期(A期).

为了测试这种新的组合CAR T细胞途径的安全性，该安全性试运行将登记高风险多发性骨髓瘤的受试者，这些受试者在两个既往治疗线中复发/难治，但对当前疗法有反应。三名受试者在环磷酰胺+氟达拉滨淋巴细胞耗减化疗后3天(+/-1天)开始接受CART-BCMA+huCART19。在每个受试者的方案开始中(即，淋巴细胞耗减化疗的第一天)，将设置21天的等待期。安全性暂停将持续到所有三名受试者完成28天的随访，并由医学总监和首席研究员进行正式的DLT评估。如果在输注的前三名受试者中发生了DLT，则进一步的登记/输注将被推迟，直到申办者医学总监和主要研究人员进行正式的安全审查，并且任何建议的方案变更均已得到适当监督机构的实施和批准。然后，安全性试运行将进一步扩增，以登记多达六个可评价的受试者。

如果未根据医务总监和主要研究人员的评估确定DLT，则累积的安全性数据将提交给FDA进行审查和确认，研究可进入随机化期(B期)。

如果根据医务总监和主要研究人员的评估鉴定了DLT，并且安全性试运行期已扩增为最多可登记六个可评估受试者，则安全性试运行结束时将召开数据和安全监控委员会(DSMB)会议(在所有计划的受试者都到达+28天的时间点之后)，以评估研究是否可以进入随机化期(B期)。同时，累积的安全性数据将被提交给FDA，以审查和确认群组进展。

A期扩增期

一旦在A期安全性试运行期确立了CART-BCMA/huCART19组合疗法的安全性(即，根据医务总监和主要研究人员的评估未鉴定DLT)，将进行A期扩增，其中A期靶标群体(对标准挽救疗法方案有反应的复发/难治性多发性骨髓瘤患者)将同时接受CART-BCMA和huCART19。一旦开放，就可以与B期同时进行A期扩增的登记。

随机化期(B期)

安全性试运行期完成后，对一线或二线疗法有反应的高风险骨髓瘤患者将在环磷酰胺+氟达拉滨化疗后3天(+/-1天)开始被随机化(1:1)接受单独的CART-BCMA(群组1)或CART-BCMA+huCART19(群组2)。登记将继续进行，直到总共20名受试者接受输注，靶标是每个群组10名可评价的受试者(1:1随机化)。在随机化期，受试者之间无需等待期。

DSMB会议将在随机化期结束时(在所有受试者都到达+28天的时间点之后)进行，以评价研究是否可以进行到单剂量输注期(C期)。同时，累积的安全性数据将被提交给FDA，以审查和确认群组进展。

单剂量输注期(C期)

该期将评估单剂量输注CART-BCMA单一疗法和CART-BCMA+huCART19组合的安全性。该期将登记对一线或二线疗法有反应的高风险多发性骨髓瘤患者。首先，三名受试者将在环磷酰胺+氟达拉滨化疗后3天(+/-1天)接受单剂量CART-BCMA单一疗法(群组1)。安全性暂停会一直持续到所有3名受试者完成28天的随访为止。接下来，三名受试者将在环磷酰胺+氟达拉滨化疗后的同一天(群组2)、3天(+/-1天)接受CART-BCMA+huCART19单剂量顺序输注。在每个受试者的方案开始中(即，淋巴细胞耗减化疗的第一天)，将设置21天的等待期。如果发生DLT，则进一步的登记/输注将被推迟，直到申办者医学总监和主要研究人员进行正式的安全审查，并且任何建议的方案变更均已得到适当监督机构的实施和批准。最多6位可评价的受试者将参加C期(每个群组3位)。

CAR T细胞疗法后，在输注后28天进行首次正式反应评估或在方案相关毒性消退至≤2级后(以较晚者为准)，由治疗研究者判断处于所有期的受试者符合资格接受护理标准维持疗法。

将对毒性和骨髓瘤反应进行标准的临床评估。将进行相关分析以评估CART-BCMA和huCART19扩增/持久性和表达靶抗原的细胞的耗减的药代动力学/药效学，对克隆性多发性骨髓瘤亚群的影响以及抗骨髓瘤免疫力(包括针对骨髓瘤干细胞抗原的免疫力)。

目的

主要目的

1)评价作为用环磷酰胺+氟达拉滨进行淋巴细胞耗减后标准的一线或二线多发性骨髓瘤疗法的巩固的CART-BCMA的安全性。

2)评价与CART-BCMA一起作为新诊断的多发性骨髓瘤患者的一线或二线疗法的巩固和作为复发/难治性多发性骨髓瘤患者的补救疗法的巩固施用的huCART19的安全性。

次要目的

1)在每种CAR T细胞方案(CART-BCMA单一疗法或CART-BCMA+huCART19组合)后评估临床结果。

a.评估常规反应标准、MRD阴性的达成(根据IMWG 2016标准(Kumar S等人TheLancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))以及PET-阴性反应的达成(通过PET/CT可检测到FDG-avid疾病不存在)。

b.反应持续时间、无进展生存期和总体生存率

c.通过IgH测序进行分子MRD

2)在此临床环境中评价CART-BCMA和huCART19的扩增和持久性动力学。

3)评价huCART19对CART-BCMA耐药性和克隆性多发性骨髓瘤细胞相关参数的影响，例如：

a.通过流式细胞仪和免疫组织化学测定的克隆BCMAdim/neg或CD19+浆细胞的持久性

b.使用骨髓样品的体外菌落形成测定法测量的多发性骨髓瘤克隆形成的耗减

c.诱导抗Sox2和其他抗骨髓瘤的免疫反应

d.克隆CD19+B细胞的耗减

4)评价单采产物和CART-BCMA/huCART19细胞的细胞组成。

5)评价输注后维持疗法对CAR T细胞持久性和表型以及CAR相关不良事件的影响。

6)表征在CART-BCMA+/-huCART19之后仍然存在的多发性骨髓瘤细胞的表型(细胞表面免疫表型，基因表达谱)。

诊断和主要纳入标准

A期(安全性试运行)：成年高风险多发性骨髓瘤患者，所述多发性骨髓瘤对两个既往治疗线而言复发/难治，但对当前疗法有反应。

A期扩增：患有多发性骨髓瘤的成年人，所述多发性骨髓瘤对既往两个治疗线而言复发/难治，但对当前疗法有反应。

B期(随机化期)和C期(单剂量输注期)：一线或二线疗法后未实现严格完全反应的高风险多发性骨髓瘤成年患者。

研究药剂、剂量和方案

研究药剂：

·CART-BCMA细胞：表达具有串联TCRζ和4-1BB(TCRζ/4-1BB)共刺激结构域的BCMA(B细胞成熟抗原)特异性嵌合抗原受体的自体T细胞。

·huCART19细胞：用慢病毒载体转导以表达抗CD19 scFVTCRζ的自体T细胞：4-1BB。也称为CTL119细胞。

·环磷酰胺和氟达拉滨：细胞毒性化疗剂可在CAR T细胞产物施用前用于淋巴细胞耗减。

剂量和施用途径：

·CART-BCMA细胞：静脉内输注5x10⁸个细胞；最小可接受输注剂量为0.5x10⁸。

·huCART19细胞：静脉内输注5x10⁸个细胞；最小可接受输注剂量为0.5x10⁸。

·环磷酰胺和氟达拉滨：静脉内输注环磷酰胺300mg/m²和氟达拉滨30mg/m²

方案：

·CART-BCMA细胞：分剂量和单剂量输注

·huCART19细胞：分剂量和单剂量输注。

·环磷酰胺/氟达拉滨：给与超过3天；如下排定，以使化疗的最后一天落在第一次CAR T细胞输注(第0天)前3天(+/-1天)。

施用持续时间

基于要输注的总体积和每分钟10-20mL的建议输注速率。

研究期总结

A期：靶标群体(N＝3-6)包括以下患者：(1)多发性骨髓瘤高风险患者；(2)2种既往方案后复发或对至少两种方案而言难治；(3)对当前方案显示出最小或更好的反应。CART-BCMA和huCART19以分剂量输注施用：

·剂量1：0.5x 10⁸ CART-BCMA+0.5x 10⁸ huCART19

·剂量2：1.5x 10⁸ CART-BCMA+1.5x 10⁸ huCART19

·剂量3：3.0x 10⁸ CART-BCMA+3.0x 10⁸ huCART19

A期扩增：靶标群体(N＝7)包括以下患者：(1)2种既往方案后复发或对至少两种方案而言难治；(2)对当前方案显示出最小反应或更好的反应。CART-BCMA和huCART19以分剂量输注施用：

·剂量1：0.5x 10⁸ CART-BCMA+0.5x 10⁸ huCART19

·剂量2：1.5x 10⁸ CART-BCMA+1.5x 10⁸ huCART19

·剂量3：3.0x 10⁸ CART-BCMA+3.0x 10⁸ huCART19

B期：靶标群体(N＝20)包括以下患者：(1)多发性骨髓瘤高风险患者；(2)对一线或二线疗法有反应；(3)对当前治疗方案显示出最小或更好的反应。患者被随机分入两个群组。

在群组1中，患者以分剂量输注接受单独CART-BCMA：

·剂量1：0.5x 10⁸ CART-BCMA

·剂量2：1.5x 10⁸ CART-BCMA

·剂量3：3.0x 10⁸ CART-BCMA

在群组2中，CART-BCMA和huCART19以分剂量输注施用：

·剂量1：0.5x 10⁸ CART-BCMA+0.5x 10⁸ huCART19

·剂量2：1.5x 10⁸ CART-BCMA+1.5x 10⁸ huCART19

·剂量3：3.0x 10⁸ CART-BCMA+3.0x 10⁸ huCART19

C期：靶标群体(N＝3-6)包括以下患者：(1)多发性骨髓瘤高风险患者；(2)对一线或二线疗法有反应；(3)对当前治疗方案显示出最小或更好的反应。患者被随机分入两个群组。群组1(N＝3)中的患者以单剂量输注接受5x 10⁸个CART-BCMA细胞。群组2(N＝3)中的患者以单剂量输注接受5x 10⁸个CART-BCMA细胞和5x 10⁸个huCART19细胞。

介绍

这是一项1期研究，用以评价在多发性骨髓瘤患者中使用或不使用huCART19的情况下作为巩固疗法的CART-BCMA。这项研究基于Penn申办的在复发/难治性多发性骨髓瘤(UPCC#14415/IRB#822756)患者中进行的CART-BCMA的1期研究的结果。与UPCC#14415/PennIRB#822756相比，本研究旨在评价对CART-BCMA施用进行以下修改的安全性，研究者认为这将增加对CART-BCMA的反应率和反应持续时间，并简化其施用：

·在患者疾病过程的早期施用CART-BCMA：进行这种修改的理由是，CART-BCMA在患有复发/难治性疾病的受试者中的临床疗效可能受到疾病负荷高和广泛的既往疗法所造成的治疗前T细胞库功能缺陷的限制。对一线或二线疗法有反应的受试者将具有较低的疾病负担，并且将已暴露于较少的细胞毒性化疗。

·施用CAR T细胞作为巩固疗法：在患有晚期多发性骨髓瘤的患者中，在患者对其最近疗法有反应而不是继续进展的同时启动CAR T细胞的制造可能会增加CAR T细胞产物的效力，并降低等待CAR T细胞制造时与疾病相关的并发症发展的可能性。

·在环磷酰胺之外，氟达拉滨在淋巴细胞耗减化疗方案中的应用：氟达拉滨的添加预期增加体内CAR T细胞扩增和持久性的可能性，这被认为是持续疗效所需的。

·按单次而非分剂量输注施用：这旨在简化输注时间表并实现huCART19的共同施用(见下文)。

·共同施用huCART19：添加huCART19的理由是，表达CD19的多发性骨髓瘤细胞具有克隆性，并介导对CART-BCMA的抗性。

A期和A期扩增群组靶向的是复发/难治的患者群体，在这些群体中，标准疗法只能实现短期疾病控制。尽管本研究的B期和C期需要在早期治疗线中进行高风险干预，但研究群体是高风险多发性骨髓瘤患者，他们未能实现对一线疗法的完全反应；在该群体中使用标准疗法的预后较差证明了这种新途径相关的风险。

CAR T细胞作为多发性骨髓瘤巩固疗法的依据

“巩固疗法”是指对先前疗法有反应后的治疗，以延长反应和/或降低复发/进展的风险。这项研究将评估在两种不同临床情况下作为巩固的CAR T细胞：(1)对标准抢救疗法有反应的复发/难治性多发性骨髓瘤患者(A期和A期扩增)，以及(2)在最近诊断为高风险多发性骨髓瘤的对标准的一线或二线疗法有反应的患者(B期和C期)。

在复发/难治性环境中，一些患者在CAR T细胞制造过程中进展多发性骨髓瘤并发症，从而无法施用CART-BCMA。为了减少在CAR T细胞制造过程中病态疾病进展的可能性并可能增加持久反应的可能性，本研究的A期和A期扩增将集中于对标准挽救疗法有反应的复发/难治性多发性骨髓瘤患者。对标准抢救疗法有反应但仍具有可检测到的残留疾病的患者，预后仍然较差，适合进行研究药物的临床试验。

在多发性骨髓瘤中，采用诸如来那度胺、硼替佐米和地塞米松等方案的标准一线疗法通常与大剂量美法仑和自体干细胞移植(ASCT)一起巩固使用。用ASCT巩固可延长多发性骨髓瘤患者的总体生存率60-62。在现代多发性骨髓瘤治疗过程中，ASCT的最佳时机尚不确定。从历史上看，ASCT是在对一线疗法产生反应后进行的。这项研究涉及使用CAR T细胞疗法而非ASCT作为一线疗法的巩固。两项正在进行的大型随机研究正在比较一线疗法后的ASCT与后来的治疗线后的ASCT。初步结果表明，两组之间的总体生存率无差异3，这表明推迟的ASCT产生与作为一线疗法的巩固的ASCT相当的长期结果。因此，推迟ASCT有利于用CART细胞疗法进行一线疗法的研究性巩固，预期不会损害受试者的结果。

这项研究的B期和C期将登记对一线或二线疗法有反应的受试者，并在广泛暴露于细胞毒性化疗之前收获T细胞用于制造CAR T细胞。预计与在复发/难治性环境中收获的细胞相比，在这种临床环境中收获的T细胞将导致更具临床活性的CAR T细胞产物。这种预期根源于用CART19治疗的CLL患者的发现，显示临床结果与早期记忆T细胞表型的存在强烈相关63。多发性骨髓瘤进展伴随着耗竭T细胞表型的发展64。随着患者通过多个治疗线而进展，随着疾病负荷的增加和患者接受越来越积极的治疗，T细胞库可能会逐渐受损，通常具有广泛的细胞毒性作用机制。这些因素——渐增的疾病负荷和免疫抑制疗法——可能会限制CAR T细胞疗法在复发/难治性疾病患者中的临床疗效。

在Penn进行的先前研究中，有先例评价作为多发性骨髓瘤早期疗法的巩固的新的细胞疗法。几项研究调查了使用作为CAR T细胞制造基础的相同技术的离体激活和扩增后，在护理标准ASCT后输注自体T细胞。在这些研究中，在对一线疗法产生反应之后但在ASCT之前，收获T细胞用于制造。这种途径的初步研究证明，通过将疫苗接种与自体T细胞输注相组合，可以增强ASCT后的免疫重建65-70。在UPCC 01411中，在这种环境下首次使用了基因修饰的T细胞。在这项研究中，T细胞通过针对癌性睾丸抗原(NY-ESO1或MAGE-A3，取决于受试者的HLA类型)的亲和力增强T细胞受体进行转导。在接受靶向NY-ESO1的T细胞的群组中，有9/10名受试者在输注≥2年后在外周血中表现出工程化细胞的持久性，这表明从该患者群体制造的工程化T细胞可以实现长期的体内持久性71。

评价巩固疗法疗效的挑战是如何区分对研究疗法的反应与对先前疗法的反应。例如，在UPCC 01411中，在高剂量美法仑和ASCT之后立即施用T细胞，这使得难以将对美法仑的临床反应与对工程化T细胞的临床反应区分开。为了避免这种局限性，该方案将登记对象限制为尽管接受了至少三个周期但对既往疗法至少实现轻微反应但未完全反应的受试者，此时反应典型地会“趋于平稳”(即无法通过进一步的疗法明显改善)。此外，受试者将推迟采用高剂量美法仑和ASCT的标准巩固到以后的治疗线，并接受环磷酰胺和氟达拉滨，它们本身预期不会在这种群体中作为淋巴细胞耗减疗法实现显著的抗骨髓瘤反应。因此，通过这项研究设计，我们希望能够将观察到的任何多发性骨髓瘤反应归因于CAR T细胞的临床活性。

受试者选择

纳入标准

1.根据IMWG 2014标准(Rajkumar SV等人,The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学].2014；15(12):e538-548)，受试者必须诊断为多发性骨髓瘤，具有以下任何高风险特征：A期扩增的受试者不需要具有任何高风险特征：

a.β-2-微球蛋白≥5.5mg/L并且LDH高于正常上限。注：在启动全身疗法之前未测量LDH和/或β-2-微球蛋白的受试者可能会根据启动全身疗法后获得的测量结果合格。

b.高风险FISH特征：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)，结合β-2-微球蛋白≥5.5mg/L(即修订版ISS 3期)。注：在启动全身疗法之前未测量β-2-微球蛋白的受试者可能会根据启动全身疗法后获得的测量结果合格。

c.除超二倍体外，具有>3个结构异常的中期核型

d.登记前任何时间的浆细胞白血病(外周血中>20％浆细胞)

e.无法对用“imid/PI”组合(沙利度胺、来那度胺或泊马度胺与硼替佐米、依沙佐米或卡非佐米组合)进行的初始疗法实现部分反应或更好(根据IMWG 2016标准(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346)。

f.一线疗法的早期进展，定义为进展(根据IMWG 2016标准(Kumar S等人.TheLancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))

i.在开始用“imid/PI”组合进行的一线疗法的一年内

ii.在完成用“imid/PI”组合进行的一线疗法的六个月内(即接受“imid/PI”组合的患者，过渡到观察或维持疗法，并在此过渡的六个月内进展)

iii.高剂量美法仑和自体干细胞移植一年内(仅A期受试者)

2.关于先前的骨髓瘤疗法，受试者必须符合以下标准：

a.A期和A期扩增：

a.受试者必须患有在至少两种方案后复发或对至少两种方案而言难治的疾病，所述至少两种方案包括蛋白酶体抑制剂和沙利度胺类似物(沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)。难治性定义为疗法中或停止疗法60天内的疾病进展。

b.受试者必须对其当前方案至少实现最小反应(如IMWG 2016标准所定义(KumarS等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))。

c.受试者必须未曾接受抗BCMA细胞疗法的既往疗法。受试者可能已经接受了其他BCMA定向的药剂(例如抗BCMA抗体-药物偶联物或双特异性抗体)的治疗。

b.B期和C期：

a.受试者必须处于一线多发性骨髓瘤疗法，但以下情况除外：如果受试者在一线疗法开始的六个月内发生此类进展而在一线疗法期间因疾病进展进入二线疗法，则符合资格。治疗线由IMWG 2016标准定义(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346)。

b.受试者不得接受细胞毒性化疗(例如，多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂)，但以下情况除外：

i.每周低剂量环磷酰胺(≤500mg/m²/周)

ii.连续输注环磷酰胺，如果限于单个周期。

c.受试者不得经历自体或同种异体干细胞移植。

d.在登记前，受试者必须启动≤1年的多发性骨髓瘤全身疗法。

e.受试者必须已经接受了当前方案的至少3个完整周期并且对最近的治疗线至少实现最小反应(如IMWG 2016标准所定义(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346))。

3.根据IMWG 2016标准(Kumar S等人.The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；2016；17(8):e328-e346)，受试者登记时必须未实现完全反应或严格的完全反应，除非可通过流式细胞术在骨髓中检测到克隆性浆细胞。(即，如果可以通过骨髓流式细胞术记录最小的残留疾病，则具有完全反应或严格完全反应的受试者是符合资格的)。

4.受试者必须签署书面知情同意书。

5.受试者必须≥18岁。

6.受试者必须具有适当的重要器官功能：

a.血清肌酐≤2.5或肌酐耗减率≥30ml/min(根据CKD-EPI测量或估算)，且不依赖于透析。

b.绝对中性粒细胞计数≥1000/μl，并且血小板计数≥50,000/μl(如果骨髓浆细胞的细胞构成≥50％，则≥30,000/μl)。

c.SGOT≤正常值上限的3倍和总胆红素≤2.0mg/dl(高胆红素血症归因于吉尔伯特综合征的患者除外)。

d.左心室射血分数(LVEF)≥45％。LVEF评估必须在登记8周内进行。

7.除可归因于多发性骨髓瘤疗法的周围神经病变外，先前/正在进行的疗法中的毒性必须根据CTCAE 5.0标准恢复至≤2级或受试者先前的基线。

8.受试者的ECOG体能状态必须为0-2。

9.受试者必须愿意放弃一线ASCT。

10.如方案第4.3节所述，具有生殖潜力的受试者必须同意使用可接受的避孕方法。

排除标准

1.孕妇或哺乳期妇女

2.白细胞单采术静脉通道不足或禁忌。

3.活动性乙型肝炎、丙型肝炎或HIV感染，或其他活动性、不受控制的感染。

4.如概述的，任何无法控制的医学或精神障碍都将被排除参与。

5.NYHA III类或IV心力衰竭(见附录2)、不稳定型心绞痛或近期(6个月以内)心肌梗塞病史或持续性(>30秒)心律失常。

6.具有活动性自身免疫性疾病，包括结缔组织病、葡萄膜炎、结节病、炎性肠病或多发性硬化症，或有严重的自身免疫性疾病史(经研究者判断)，需要长期的免疫抑制疗法。

7.先前或活动性中枢神经系统(CNS)受累(例如软脑膜疾病，实质性肿块)伴有骨髓瘤。除非存在可疑症状或放射照像术发现，否则无需对此进行筛查(例如腰椎穿刺)。即使骨髓瘤CSF阴性，颅内延伸并累及硬脑膜的颅骨疾病受试者也将被排除在外。

研究药物

CART-BCMA细胞

CART-BCMA细胞是自体T细胞，经工程化以表达对BCMA具特异性的细胞外单链抗体(scFv)，该抗体与细胞内信号传导分子相连，该分子由串联信号传导结构域组成，该串联信号传导结构域由与4-1BB共刺激结构域连接的TCRζ信号传导模块组成。将CART-BCMA细胞冷冻保存在可输注冷冻介质中，并分配在输注袋中。CART-BCMA细胞将在A期和B期(第0天10％剂量，第1天30％剂量，第2天60％剂量)或C期(第0天单次输注)作为分剂量施用。靶标CART-BCMA剂量为5x10⁸个转导的细胞，最小可接受的输注剂量为0.5x108个转导的细胞。将配制剂量以至少实现10％剂量的最小可接受剂量。随后的剂量将根据可用的细胞数来配制。

huCART19细胞

huCART19细胞是自体T细胞，经工程化以表达对CD19具特异性的细胞外单链抗体(scFv)，该抗体与细胞内信号传导分子相连，该分子由串联信号传导结构域组成，该串联信号传导结构域由与4-1BB共刺激结构域连接的TCRζ信号传导模块组成。将huCART19细胞冷冻保存在可输注冷冻介质中，并分配在输注袋中。huCART19细胞将在A期和B期以分剂量输注(第0天10％剂量，第1天30％剂量，第2天60％剂量)或在第0天单次输注(C期)施用。靶标huCART19剂量为5x10⁸个转导的细胞，最小可接受的输注剂量为0.5x10⁸个转导的细胞。将配制剂量以至少实现10％剂量的最小可接受剂量。随后的剂量将根据可用的细胞数来配制。

A期，A期扩增和仅B期：接受后续CAR T细胞输注的资格(30％+60％剂量)：

1.与之前的研究访视相比，患者不应在体能或临床状态上经历显著变化，主治医师或PI认为这会增加实验性细胞输注的风险。

2.经历新的实验室异常的患者(治疗研究者或PI认为可能会对受试者的安全性或者受试者接受CAR T细胞的进一步输注的能力产生不利影响)可能会延迟其输注，直到治疗研究者和PI均确定其在临床上适合进行CART-BCMA细胞输注。

3.如果主治医师和/或PI认为患者可能正在经历细胞因子释放综合征(CRS)的体征/症状或其他严重的CART相关毒性，则可以抢先延迟30％和60％的输注，以便在每次后续输注之前进行更长的观察和监测。单个孤立的温度升高本身并不能确定CRS，但研究人员应考虑将输注延迟24小时以观察这种情况下的受试者。如果发生抢先的延迟，则所有输注必须在+7天结束之前完成。

淋巴细胞耗减化疗

在初始CAR T细胞输注之前，将以每天环磷酰胺300mg/m²+氟达拉滨30mg/m²的方案施用淋巴细胞耗减化疗，持续三天。必须排定淋巴细胞耗减化疗，以使疗法的最后一天落在第一CAR T细胞输注前3天(+/-1天)。

为了研究目的作为本研究的一部分时，环磷酰胺和氟达拉滨均为FDA批准的药剂，将根据FDA批准的标签和标准机构规范进行制备和输注。对于该方案，优选的止吐预用药是恩丹西酮16mg和地塞米松12mg，在每次化疗输注前每天施用；该方案可以根据治疗研究者的判断而改变。研究者可根据需要使用其他标准的家用止吐药(例如恩丹西酮、普鲁氯嗪、劳拉西泮)。根据研究者的判断，对于估算GFR<80mL/min的受试者，可降低氟达拉滨剂量。

等同物

本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容特此通过引用以其整体并入本文。虽然已经参照具体方面披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等同变化。

Claims (52)

1.一种治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中：

(i)所述受试者患有高风险多发性骨髓瘤，例如，基于修订版国际分期系统的III期高风险多发性骨髓瘤；

(ii)所述受试者正在接受或已经接受了一线疗法(例如诱导疗法，例如包含来那度胺、硼替佐米或地塞米松中的一种、两种或全部的诱导疗法)或二线疗法，例如，至少三个周期的所述一线疗法或二线疗法，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5所述，并且所述受试者自一线或二线疗法后尚未发生进展；并且

(iii)所述受试者已显示出至少最小反应，例如，所述受试者对所述受试者最近接受的疗法(例如，一线疗法或二线疗法)显示出很好的部分反应、部分反应或最小反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述，

从而治疗所述受试者。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者正在接受或已经接受一线疗法，并且尚未接受二线疗法。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者正在接受或已经接受了二线疗法，并且尚未接受三线疗法，其中所述受试者由于在接受一线疗法期间或之后的疾病进展而进入到所述二线疗法，其中疾病进展发生在所述一线疗法开始的一年内或所述一线疗法完成的六个月内。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未显示出或未正在显示出对所述受试者最近接受的疗法(例如所述一线疗法或所述二线疗法)的完全反应或严格的完全反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：

(i)所述受试者未接受细胞毒性化疗(例如，多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂)，但以下情况除外：

(a)所述受试者每周接受低剂量的环磷酰胺(例如，≤500mg/m²/周)，或

(b)所述受试者已经接受了单个周期的环磷酰胺连续输注；或者

(ii)在所述受试者接受细胞毒性化疗之前，从所述受试者分离出T细胞以制造所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受自体或同种异体干细胞移植。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者在一年内启动了多发性骨髓瘤的全身疗法。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中：

(i)所述受试者显示β-2-微球蛋白≥5.5mg/L和高风险FISH特征：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)；

(ii)所述受试者显示β-2-微球蛋白≥5.5mg/L且LDH大于正常上限；

(iii)除超二倍体外，所述受试者显示出具有>3个结构异常的中期核型；

(iv)所述受试者患有浆细胞白血病，例如，所述受试者显示外周血中>20％的浆细胞；

(v)所述受试者对Imid/PI组合(沙利度胺、来那度胺或泊马度胺与硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米组合)不能实现部分反应或更好的反应(例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5所述)；或者

(vi)所述受试者在开始一线疗法的一年(例如六个月内)内在用Imid/PI组合进行的一线疗法时进展；或在完成所述一线疗法的六个月内。

9.一种治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法，其中：

(i)所述受试者患有高风险多发性骨髓瘤，

(ii)所述受试者的多发性骨髓瘤在至少两种方案(例如，蛋白酶体抑制剂和/或沙利度胺或其类似物(例如，沙利度胺，来那度胺或泊马度胺))后复发或已对至少两种方案而言难治，并且

(iii)所述受试者对所述受试者最近接受的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)至少显示出至少最小反应，例如，所述受试者已显示出非常好的部分反应、部分反应或最小反应，例如基于IMWG 2016标准，例如表5中所述，

从而治疗所述受试者。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述受试者尚未显示出或未正在显示出对所述受试者最近接受的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)的完全反应或严格的完全反应，例如，基于IMWG 2016标准，例如，如表5中所述。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述受试者在接受最近的疗法(例如三线疗法，例如挽救疗法，例如标准的挽救疗法)后显示出可检测到的残留疾病。

12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受抗BCMA细胞疗法。

13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述受试者在接受美法仑和干细胞移植(例如自体干细胞移植)的一年内进展。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第一表达CD19 CAR的细胞疗法。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法在同一天施用，任选地，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法施用完成后至少一个小时施用。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法之后施用，其中如果所述受试者在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法之后发展急性输注反应，则所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法后最多48小时(例如24、36或48小时)施用。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，并且在第三个输注日接受总剂量的约60％。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注，例如静脉内。

22.如权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，并且在第三个输注日接受总剂量的约60％。

25.如权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如静脉内。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述第一表达BCMACAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向所述受试者施用第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)。

27.如权利要求26所述的方法，所述方法包括在施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向所述受试者施用环磷酰胺和氟达拉滨，任选地，其中：

(i)环磷酰胺以每天300mg/m²静脉内施用，持续三天；并且

(ii)氟达拉滨以每天30mg/m²静脉内施用，持续三天。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第一调整剂的施用完成后2、3或4天，例如3天后(例如，在施用最后剂量的淋巴细胞耗减剂，例如最后剂量的所述淋巴细胞耗减化疗，例如最后剂量的环磷酰胺和/或氟达拉滨后)施用。

29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前，从所述受试者获得第一样品(例如，单采样品)并使用所述样品制造所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法。

30.如权利要求29所述的方法，所述方法还包括在施用所述第一调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)之前以及在获得所述第一样品之后，从所述受试者获得第二样品(例如干细胞)以准备自体干细胞移植。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述第一表达BCMACAR的细胞疗法和/或所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法后，例如，在以下中更晚的时间，向所述受试者施用维持剂(例如来那度胺)：

(i)所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法和/或第一表达CD19 CAR的细胞疗法施用后26、27、28、29、30、31或32天，例如28天；或者

(ii)与治疗有关的≤2级毒性消退。

32.如权利要求31所述的方法，所述方法还包括在施用所述维持剂之后向所述受试者施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法，其中：

(i)自施用所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法以来，已经复发了80-100天(例如90天)；

(ii)所述受试者的多发性骨髓瘤在施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法后已经进展；或者

(iii)所述受试者在施用第一表达BCMA CAR的细胞疗法后已经表现出或正在表现出残留多发性骨髓瘤的客观证据。

33.如权利要求32所述的方法，所述方法还包括在施用所述维持剂之后，向所述受试者施用所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法，其中在施用所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之后，例如在施用所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法之后7-28天，所述受试者的>3％的外周血淋巴细胞是CD19+。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法之前、同时或之后施用。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法在同一天施用，任选地，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法施用完成后至少一个小时施用。

36.如权利要求33所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法之后施用，其中如果所述受试者在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法之后发展急性输注反应，则所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法在所述第二表达BCMACAR的细胞疗法施用后最多48小时(例如24、36或48小时)施用。

37.如权利要求32-36中任一项所述的方法，其中所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以单次输注施用。

39.如权利要求37所述的方法，其中所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，并且在第三个输注日接受总剂量的约60％。

40.如权利要求32-39中任一项所述的方法，其中所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如静脉内。

41.如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注或分剂量输注施用。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以单次输注施用。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以分剂量输注施用，例如，其中所述受试者在第一个输注日接受总剂量的约10％，在第二个输注日接受总剂量的约30％，并且在第三个输注日接受总剂量的约60％。

44.如权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法以如下的剂量施用：约1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如按单次输注的约5x10⁸个可存活的表达CAR的细胞，例如静脉内。

45.如权利要求32-44中任一项所述的方法，其中所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法与所述第一表达BCMA CAR的细胞疗法相同。

46.如权利要求33-45中任一项所述的方法，其中所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法与所述第一表达CD19 CAR的细胞疗法相同。

47.如权利要求32-46中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述第二表达BCMACAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向所述受试者施用第二调整剂(例如淋巴细胞耗减剂，例如淋巴细胞耗减化疗，例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)。

48.如权利要求47所述的方法，所述方法包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向所述受试者施用环磷酰胺和氟达拉滨，任选地，其中：

(i)环磷酰胺以每天300mg/m²静脉内施用，持续三天；并且

(ii)氟达拉滨以每天30mg/m²静脉内施用，持续三天。

49.如权利要求47所述的方法，所述方法包括在施用所述第二表达BCMA CAR的细胞疗法和/或所述第二表达CD19 CAR的细胞疗法之前，向所述受试者施用环磷酰胺，例如以1.5g/m²施用。

50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述第一或第二表达BCMA CAR的细胞疗法包含表达BCAM CAR的细胞(例如细胞群)，其中：

(i)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的任何BCMA scFv结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)和/或表2或3中列出的任何BCMA scFv结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(ii)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的重链可变区(VH)和/或表2或3中列出的轻链可变区(VL)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iii)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的BCMA scFv结构域氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149)或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iv)所述BCMA CAR包含表2或3中列出的全长BCMA CAR氨基酸序列(例如，未成熟BCMACAR的氨基酸序列包含SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:233的氨基酸序列)或与其具有95％-99％同一性的序列；或者

(v)所述BCMA CAR由表2或3中列出的核酸序列编码(例如，SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:170)或与其具有95％-99％同一性的序列。

51.如权利要求14-50中任一项所述的方法，其中所述第一或第二表达CD19 CAR的细胞疗法包含表达CD19 CAR的细胞(例如细胞群)，其中：

(i)所述CD19 CAR包含表6或7中列出的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)和/或表6或8中列出的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个或多个(例如，全部三个)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(ii)所述CD19 CAR包含表6中列出的任何CD19 scFv结构域氨基酸序列的重链可变区(VH)和/或表6中列出的任何CD19 scFv结构域氨基酸序列的轻链可变区(VL)，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iii)所述CD19 CAR包含表6中列出的CD19 scFv结构域氨基酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列；

(iv)所述CD19 CAR包含表6中列出的全长CD19 CAR氨基酸序列，或与其具有95％-99％同一性的序列；或者

(v)所述CD19 CAR由表6中列出的核酸序列或与其具有95％-99％同一性的序列编码。

52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类患者。

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