CN114206855A - 用于Cbl-b抑制的氰基环丁基类化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于抑制泛素蛋白酶体通路中E3酶Cbl‑b的化合物、组合物和方法。所述化合物、组合物和方法可用于调节免疫系统，以治疗适合免疫系统调节的疾病，以及用于体内、体外或离体细胞的治疗。本发明还公开了包含Cbl‑b抑制剂和癌症疫苗的药物组合物，以及使用Cbl‑b抑制剂和癌症疫苗治疗癌症的方法；和包含Cbl‑b抑制剂和溶瘤病毒的药物组合物，以及使用Cbl‑b抑制剂和溶瘤病毒治疗癌症的方法。

Description

用于Cbl-b抑制的氰基环丁基类化合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.第119条要求并享有以下美国临时申请号的权益：于2019年5月17日提交的62/849,722；于2019年7月30日提交的62/880,437；于2019年8月19日提交的62/888,845；以及于2019年8月19日提交的62/888,870，其各自内容通过引用其全文并入本发明。
发明领域
本发明提供了用于抑制Cbl-b酶的化合物和组合物及其在体内、体外或离体调节免疫系统、治疗疾病和治疗细胞中的使用方法。本发明还提供了包含所述Cbl-b酶抑制剂和癌症疫苗的组合的药物组合物、试剂盒及治疗癌症的方法；和包含所述Cbl-b酶抑制剂和溶瘤病毒的组合的药物组合物、试剂盒及治疗癌症的方法。
发明背景
泛素蛋白酶体通路是一个复杂的系统，涉及蛋白质功能及分解代谢的调节。真核细胞中的蛋白质与泛素结合，泛素即是一种76个氨基酸、8.5千道尔顿的蛋白质。此种被称为泛素化的结合会导致靶蛋白的功能改变或降解。靶蛋白的泛素化通过一系列耦合反应发生，涉及泛素及一组称为E1、E2和E3酶的酶。泛素由泛素激活酶或E1酶激活。然后将泛素转移至泛素结合酶或E2酶中。最后，泛素连接酶或E3酶促进泛素从E2酶转移至靶蛋白。靶蛋白的多泛素化主要作为导致泛素结合蛋白被蛋白酶体降解的信号，在蛋白酶体中其经历蛋白水解。E3连接酶的泛素化亦会导致蛋白质活性、相互作用或定位的改变。泛素化调节多种生物学，包括细胞分裂、DNA修复及细胞信号传导。
细胞中蛋白质的合成及降解对于细胞周期调节、细胞增殖、细胞凋亡及许多其他细胞过程至关重要。因此，调节泛素蛋白酶体通路的能力为干预疾病过程提供了大量机会。干预机制可包括增强致癌基因产物的降解、降低肿瘤抑制蛋白的降解、调节免疫细胞应答、以及调节抗肿瘤免疫应答。
治疗性癌症疫苗已在许多临床试验中得到评估。然而，仅有两种治疗性癌症疫苗获准在美国使用。尤其是，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的卡介苗(Bacillus ofCalmette and Guerin)菌株已被批准用于治疗膀胱癌，且一种离体活化的自体细胞疫苗已被批准用于治疗前列腺癌。即便如此，接受癌症疫苗治疗的患者的应答率和总体生存率仍远低于理想水平。因此，本领域需要的是提高癌症疫苗功效的方法。
尽管已进行了大量使用溶瘤病毒治疗癌症的临床试验，但仅有一种溶瘤病毒被批准在美国及欧洲使用。特别是，talimogene laherparepvec是经遗传修饰的单纯疱疹病毒，被批准用于治疗黑素瘤。然而，即便是talimogene laherparepvec也未被证明可提高总生存率或使内脏转移患者受益。因此，本领域需要的是提高溶瘤病毒疗法功效的方法。
大约35种E2酶及超过500种E3酶在人基因组中编码。Casitas B谱系淋巴瘤原癌基因-b(Cbl-b)是一种E3泛素连接酶，其负调节T细胞活化(Wallner et al.,Clin DevImmunol,2012:692639)。发现调节E2或E3酶的药剂相应为针对涉及特定E2或E3酶的疾病过程的疗法提供了潜力。本专利申请涉及抑制一种此类E3酶(Casitas B谱系淋巴瘤原癌基因-b(Cbl-b))的药剂；与癌症疫苗联合使用的抑制Cbl-b的药剂，以及包含Cbl-b抑制剂和癌症疫苗的药物组合物；和与溶瘤病毒联合使用的抑制Cbl-b的药剂，以及包含Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒的药物组合物。
发明摘要
本发明公开了用于抑制Cbl-b酶的化合物和组合物及其在体内、体外或离体调节免疫系统、治疗疾病和治疗细胞中的使用方法。本发明还公开了使用Cbl-b抑制剂治疗癌症的方法。简言之，所述Cbl-b抑制剂可单独施用于患有癌症的个体或作为联合疗法的一部分与免疫检查点抑制剂、抗肿瘤剂和放射疗法中的一种或多种一同施用于患有癌症的个体。此外，用本发明公开的化合物或组合物在体内和/或体外治疗的细胞可用于治疗癌症的过继细胞疗法。
本发明提供了式(I)所示化合物：
Figure BDA0003470586280000021
或其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐，其中
Figure BDA0003470586280000022
是
Figure BDA0003470586280000023
Figure BDA0003470586280000024
Z1是CH或N；
Z2是CH或N；
R1是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
R2是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C3-C6环烷基；
R3是-CF3或环丙基；
R4是-CF3或环丙基；
X是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或
Figure BDA0003470586280000031
R5是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN；
R6是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基，其中R6的每个基团任选地被1至5个R7基团取代；
或R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环、稠合双环、或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1至2个选自由N和O组成的组的额外杂原子，和其中的每一个杂环基或杂芳基任选地被1至5个R8基团取代；
各R7分别独立地为卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN；
各R8分别独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、-CN、C1-C6烷基-CN、-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、羟基、或卤素，
或连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C6环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基；
各R9分别独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C1-C6烷基-OH；和
n是0或1。
在一些实施方案，
Figure BDA0003470586280000032
是
Figure BDA0003470586280000033
在一些实施方案，Z1是CH。在一些实施方案，Z1是N。
在一些实施方案，
Figure BDA0003470586280000034
是
Figure BDA0003470586280000035
Figure BDA0003470586280000036
在一些实施方案，
Figure BDA0003470586280000041
是
Figure BDA0003470586280000042
在一些实施方案，Z2是CH。在一些实施方案，Z2是N。
在一些实施方案，
Figure BDA0003470586280000043
是
Figure BDA0003470586280000044
Figure BDA0003470586280000045
在一些实施方案，R1是H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R1是H、-CH3、或-CF3。
在一些实施方案，R2是H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、或C3-C4环烷基。在一些实施方案，R2是H、-CH3、-CF3、-CHF2、-CH2F、或环丙基。
在一些实施方案，n是0。在一些实施方案，n是1。
在一些实施方案，X是H。在一些实施方案，X是C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，X是-CH3或-CF3。
在一些实施方案，X是
Figure BDA0003470586280000046
在一些实施方案，R5是H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R5是H、-CH3、-CF3、-CH2CN、或-CH2OH。
在一些实施方案，R6是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基，其中R6的每个基团任选地被1-5个R7基团取代。在一些实施方案，R6选自由以下组成的组：
Figure BDA0003470586280000047
在一些实施方案，各R7，当存在时，分别独立地为卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基-OH、或C1-C3烷基-CN。在一些实施方案，各R7，当存在时，分别独立地为F、-CH3、-CF3、-CH2OH、或-CH2CN。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子，和其中的每一个杂环基或杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成选自由以下组成的组的基团部分：
Figure BDA0003470586280000051
在一些实施方案，各R8，当存在时，分别独立地为C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基-OH、-CN、C1-C3烷基-CN、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、羟基、或卤素，或连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C4环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，各R8，当存在时，分别独立地为-CH3、-CH2CH3、-CF3、-CH2OH、-CN、-CH2CN、-CH2-O-CH3、羟基、或F，或连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺环丙基。
在一些实施方案，各R9分别独立地为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、或C1-C3烷基-OH。在一些实施方案，各R9分别独立地为H、-CH3、-CF3、或-CH2OH。
本发明还公开了选自表1中化合物的化合物，或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。本发明还公开了选自上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐的化合物，以及药学上可接受的辅料。
本发明还公开了调节免疫细胞活性的方法，所述方法包含使所述免疫细胞与有效量的上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐接触。
本发明还公开了在有需要的个体中治疗对Cbl-b活性抑制有应答的癌症的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了在有需要的个体中抑制Cbl-b活性的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了在有需要的个体中治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的方法，所述方法包含向所述个体施用上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了生成经修饰的免疫细胞的方法，所述方法包含在有效量的上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐存在下，培养包含免疫细胞的细胞群。
本发明还公开了包含Cbl-b抑制剂的经修饰的免疫细胞，其中所述Cbl-b抑制剂是上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了分离的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞已经与或与上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐接触。
本发明还公开了包含细胞群的组合物，所述细胞群包含分离的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞已经与或与上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐接触。
本发明还公开了抑制异常细胞增殖的方法，所述方法包含向有需要的个体施用有效量的分离的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞已经与或与上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐接触。
本发明还公开了抑制异常细胞增殖的方法，所述方法包含向有需要的个体施用包含细胞群的组合物，所述细胞群含有分离的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞已经与或与上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐接触。
本发明还公开了抑制异常细胞增殖的方法，所述方法包含施用有效量的上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了细胞培养组合物，其包含细胞群，所述细胞群包含免疫细胞和Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-b抑制剂是上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了药物组合物，其包含Cbl-b抑制剂以及佐剂和抗原中的一者或两者，其中所述Cbl-b抑制剂是上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
本发明还公开了制品，所述制品包含本发明公开的任何经修饰的免疫细胞、包含本发明公开的细胞群的任何组合物、本发明公开的任何细胞培养组合物、或本发明公开的任何药物组合物。
本发明还公开了试剂盒，所述试剂盒包含本发明公开的任何经修饰的免疫细胞或包含本发明公开的细胞群的任何组合物。
本发明还公开了使用Cbl-b抑制剂在制备治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述Cbl-b抑制剂是上文公开的或本发明公开的任何化合物、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐。
在本发明公开的任一实施方案中，所述Cbl-b蛋白可以是哺乳动物Cbl-b或人Cbl-b。
此外，本发明公开了Cbl-b抑制剂化合物、疫苗及包含Cbl-b抑制剂和疫苗的组合物，以及使用其在治疗癌症中的方法。所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗可施用于患有癌症的个体。
此外，本发明公开了Cbl-b抑制剂化合物、溶瘤病毒及包含Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒的组合物，以及使用其在治疗癌症中的方法。所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒可施用于患有癌症的个体。
本发明提供了免疫的方法，所述方法包含向有需要的个体施用有效量的小分子Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的疫苗。
本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的个体施用有效量的小分子Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。
本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的个体施用有效量的能够降低免疫细胞活化阈值的药剂，和向所述个体施用有效量的治疗性癌症疫苗；或向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。
本发明提供了包含癌症疫苗和小分子Cbl-b抑制剂的药物组合物，任选地其中所述组合物进一步包含药学上可接受的辅料。
本发明提供了用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)小分子Cbl-b抑制剂；(b)治疗性癌症疫苗；和(c)施用有效量的所述Cbl-b抑制剂和所述治疗性癌症疫苗以治疗个体癌症的说明书。
本发明提供了治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)药物组合物，其包含小分子Cbl-b抑制剂和治疗性癌症疫苗；和(b)施用有效量的包含所述Cbl-b抑制剂和所述治疗性癌症疫苗的所述药物组合物以治疗个体癌症的说明书。
本发明提供了药物组合物，其包含溶瘤病毒和小分子Cbl-b抑制剂，任选地其中所述组合物进一步包含药学上可接受的辅料。
本发明提供了用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)小分子Cbl-b抑制剂；(b)溶瘤病毒；和(c)施用有效量的所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒以治疗个体癌症的说明书。
并且，本发明提供了用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)药物组合物，其包含小分子Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒；和(b)施用有效量的包含所述小分子Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒的所述药物组合物以治疗个体癌症的说明书。
发明详述
本发明提供了抑制所述Cbl-b酶的化合物和药物组合物，以及使用此类化合物和药物组合物的治疗方法。所述化合物和组合物可用于在体内、体外或离体调节免疫系统、治疗疾病和治疗细胞的方法。此外，本发明提供了包含癌症疫苗和抑制所述Cbl-b酶的化合物的药物组合物，以及使用此类化合物、癌症疫苗和药物组合物的治疗方法。此外，本发明还提供了包含溶瘤病毒和抑制所述Cbl-b酶的化合物的药物组合物，以及使用此类化合物、溶瘤病毒和药物组合物的治疗方法。
T细胞活化和T细胞耐受性均是严格控制的过程，可调节对肿瘤的免疫应答，同时防止自身免疫。耐受性可防止免疫系统攻击表达“自身”或“自体”抗原的细胞。在外周耐受期间，识别“自身”或“自体”抗原的T细胞(即自身反应性T细胞)在遇到胸腺外的“自身”或“自体”抗原后在功能上变得无反应或被删除。因此，外周耐受过程对于预防自身免疫性疾病很重要。通常，癌细胞被经活化的T细胞清除，所述这些活化的T细胞识别在癌细胞表面表达的肿瘤抗原。然而，在癌症中，肿瘤微环境可支持T细胞对癌细胞的耐受性，这使得癌细胞能够避免被免疫系统识别并清除。癌细胞避免肿瘤免疫监视的能力可导致不受控制的肿瘤生长。因此，T细胞耐受性可能是T细胞功能障碍的一种形式。T细胞功能障碍的一般原理均是本领域众所周知的(参见Schietinger et al.,Trends Immunol.,35:51-60,2014)。可导致不受控制的肿瘤生长的其他类型的T细胞功能障碍包括T细胞耗竭(exhaustion)、T细胞衰老、和/或T细胞失能(T-cell anergy)。因此，治疗T细胞功能障碍，例如，通过增加T细胞活化、增加T细胞增殖、降低T细胞耐受性、和/或减少T细胞耗竭，可有利于预防或治疗癌症。免疫系统的其他细胞对于在免疫监视过程中识别并除去癌细胞均很重要。譬如，自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的淋巴细胞，能够识别并杀死癌细胞(参见Martinez-Losato etal.,Clin Cancer Res.,21:5048-5056,2015)。最近的研究还表明，具有不同表型和功能的B细胞亚群在抗肿瘤应答中表现出不同的作用(参见Saravaria et al.,Cell MolImmunol.,14:662-674,2017)。由于其在肿瘤监视中的作用，NK细胞和B细胞亦均可适合作为预防或治疗癌症的治疗靶点。
Cbl-b是RING型E3连接酶，由于其作为免疫活化的负调节因子的功能，在免疫系统中发挥着重要作用。Cbl-b在降低T细胞活化，从而增强或提高T细胞耐受性方面具有重要作用。研究发现，Cbl-b缺陷的T细胞显示出较低的抗原识别受体及共刺激分子(例如，CD28)活化的阈值。譬如，T细胞中Cbl-b的缺失解除了T细胞活化和增殖过程中对CD28共刺激的需求(参见Bachmaier et al.,Nature,403:211-216,2000)。此类cbl-b-/-T细胞在很大程度上抵抗T细胞失能，这是一种T细胞功能失活和T细胞增殖严重受损的耐受机制(参见Jeon etal.,Immunity,21:167-177,2004；和Schwartz et al.,Annu Rev Immunol.,21:305-34,2003)。为了支持这一点，cbl-b敲除小鼠中Cbl-b的缺失导致T细胞耐受性的诱导受损及自身免疫性恶化(参见Jeon et al.,Immunity,21:167-177,2004)。重要的是，小鼠体内Cbl-b的缺失亦会导致强烈的抗肿瘤应答，这主要取决于细胞毒性T细胞。一项研究表明，cbl-b-/-CD8+T细胞对T调节性细胞介导的抑制具有抗性，并表现出增强的活化及肿瘤浸润。初始cbl-b-/-CD8+T细胞的治疗性转移足以介导对已建立肿瘤的排斥(参见Loeser et al.,JExp Med.,204:879-891,2007)。最近的研究表明，Cbl-b在NK细胞活化中亦发挥作用。Cbl-b的基因缺失或其E3连接酶活性的靶向失活使NK细胞能够自发地排斥小鼠模型中的转移性肿瘤(参见Paolino et al.,Nature,507:508-512,2014)。
本发明提供了化合物和组合物，其均是Cbl-b的有效抑制剂并且可用于治疗诸如癌症的疾病的新方法。在一些实施方案，本发明提供的化合物和组合物均可用于调节免疫系统的方法，例如增加T细胞、NK细胞和B细胞的活化，以及在体内、体外或离体治疗此类细胞。
I.定义
本发明公开的药剂的“有效量”是足以实现特定目的的量。“有效量”可根据所述目的以经验和常规方式确定。药剂的“有效量”或“足够量”是足以产生所需生物学效应(例如有益结果，包括有益的临床结果)的量。在一些实施方案，术语“有效量”是指有效“治疗”个体(例如，诸如人的哺乳动物)的疾病或病症的药剂的量。
本发明使用的术语“Cbl-b”是指Cbl-b蛋白。所述术语还包括天然存在的Cbl-b变体，包括剪接变体或等位基因变体。所述术语还包括非天然存在的Cbl-b变体，例如重组Cbl-b蛋白或其截短变体，其通常保留天然存在的Cbl-b或天然存在的Cbl-b变体的结合能力(例如，与E2酶结合的能力)。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指其形式能够使活性成分的生物活性发挥作用的制剂，并且不包含对将要施用所述制剂或组合物的个体具有不可接受的毒性的附加组分。此类制剂或组合物可以是无菌的。除了包含溶瘤病毒外，此类制剂或组合物可以是无菌的。
本发明使用的“辅料”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的赋形剂、载体、媒剂或稳定剂。通常生理学上可接受的辅料是pH缓冲水溶液。
提及药物组合物中描述的化合物、或主张药物组合物权利要求中描述的化合物，是指药物组合物中记载的由通式描述的化合物，不包括药物组合物的其他要素，即，不含载体、辅料等。
术语“治疗”或“处理”疾病是指执行一个方案，所述方案可包括向个体(人或其他受试者)施用一种或多种治疗剂，以努力在所述个体中获得有益或期望的结果，包括临床结果。有益或期望的临床结果包括，但不限于，减轻或改善一种或多种症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、防止疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、以及缓解(部分或全部)。“治疗”还可指与未接受治疗的个体的预期存活期相比延长了存活期。此外，“治疗”和“处理”可通过施用一剂一种或多种治疗剂而发生，或可在施用一系列剂量的一种或多种治疗剂时发生。“治疗”或“处理”不需要完全缓解体征或症状，也不需要治愈。“治疗”亦可指临床干预，例如向个体施用一种或多种治疗剂，旨在改变被治疗个体或细胞的自然病程(即，改变在无临床干预的情况下将发生的个体或细胞的进程)。术语“治疗剂”可指Cbl-b抑制剂、经修饰的免疫细胞或其组合物。
本发明使用的“个体”或“受试者”是哺乳动物。用于治疗目的的“哺乳动物”包括人类；非人灵长类动物；家养和农场动物；以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如犬、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案，所述个体或受试者是人。
本发明使用的术语“T细胞功能障碍”是指对抗原刺激的免疫应答性降低的状态。术语“T细胞功能障碍”包括T细胞耗竭和/或T细胞失能的共同要素，其中可能发生抗原识别，但随后的免疫应答对控制肿瘤生长无效。术语“T细胞功能障碍”还包括对抗原识别难治或无应答，譬如，将抗原识别转化为下游T细胞效应器功能(例如增殖、细胞因子生成和/或靶细胞杀伤)的能力受损。
术语“T细胞失能(T-cell anergy)”是指由于通过T细胞受体传递的信号不完整或不足导致对抗原刺激无应答的状态。“T细胞失能”亦可在没有共刺激的情况下在用抗原刺激时产生，导致细胞对抗原的后续活化变得难治，即使在共刺激的情况下亦是如此。
术语“T细胞耗竭”是指由于癌症期间可能发生的持续TCR信号传导而引起的T细胞功能障碍状态。其与失能的区别在于，其并非由不完整或有缺陷的信号传导产生，而是由持续的信号传导产生。其定义是效应器功能差、抑制性受体的持续表达、以及不同于功能效应T细胞或记忆T细胞的转录状态。
“T细胞功能障碍”是以T细胞对抗原刺激的应答性降低为特征的疾病或病症。应答性降低可能导致对肿瘤的无效控制。在一些实施方案，术语“T细胞功能障碍”包括癌症，例如血液学癌症或非血液学癌症。在一些实施方案，“T细胞功能障碍”是其中T细胞失能或具有降低的分泌细胞因子、增殖或执行细胞溶解活性的能力的病症。
“增强/提高T细胞功能”是指诱导、引起或刺激T细胞以具有持续或扩大的生物学功能，或重新活化或重活化耗竭或失活的T细胞。增强或提高的T细胞功能的实例包括与用Cbl-b抑制剂治疗前的T细胞状态相比，T细胞活化增加(例如细胞因子生成增加、T细胞活化标志物表达增加等)、T细胞增殖增加、T细胞耗竭减少、和/或T细胞耐受性降低。测定T细胞功能增强或提高的方法均是本领域已知的。
本发明使用的“增殖”是指细胞的增殖。增殖增加包括相对于基线值产生更多数量的细胞。增殖减少包括相对于基线值产生减少数量的细胞。在一些实施方案，所述细胞是免疫细胞，例如T细胞，并且需要增加增殖。在一些实施方案，所述细胞是癌细胞，并且需要减少增殖。
本发明使用的“烷基”是指饱和的直链(即，未支链化)或支链的一价烃链或其组合。特定的烷基基团是具有指定碳原子数的那些，例如，具有1至20个碳原子(“C1-C20烷基”)、具有1至10个碳原子(“C1-C10”烷基)、具有1至8个碳原子(“C1-C8烷基”)、具有1至6个碳原子(“C1-C6烷基”)、具有2至6个碳原子(“C2-C6烷基”)、或具有1至4个碳原子(“C1-C4烷基”)的烷基基团。烷基基团的实例包括但不限于，诸如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物类及异构体类，及其类似基团。
本发明使用的“烯基”是指具有至少一个烯属不饱和位点(即，具有至少一个式C＝C的基团部分)的不饱和直链(即，未支链化)或支链的一价烃链或其组合。特定的烯基基团是具有指定碳原子数的那些，例如，具有2至20个碳原子(“C2-C20烯基”)、具有2至10个碳原子(“C2-C10”烯基)、具有2至8个碳原子(“C2-C8烯基”)、具有2至6个碳原子(“C2-C6烯基”)、或具有2至4个碳原子(“C2-C4烯基”)的烯基基团。烯基基团可呈“顺式”或“反式”构型，或者，呈“E”或“Z”构型。烯基基团的实例包括但不限于，诸如乙烯基(或乙烯基)、丙-1-烯基、丙-2-烯基(或烯丙基)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基、其同系物类及异构体类等基团。
本发明使用的“炔基”是指具有至少一个炔属不饱和位点(即，具有至少一个式C≡C的基团部分)的不饱和直链(即，未支链化)或支链的一价烃链或其组合。特定的炔基基团是具有指定碳原子数的那些，例如，具有2至20个碳原子(“C2-C20炔基”)、具有2至10个碳原子(“C2-C10炔基”)、具有2至8个碳原子(“C2-C8炔基”)、具有2至6个碳原子(“C2-C6炔基”)、或具有2至4个碳原子(“C2-C4炔基”)的炔基基团。炔基基团的实例包括但不限于，诸如乙炔基(或乙炔基)、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、其同系物类及异构体类等基团。
本发明使用的“亚烷基”是指与烷基相同的残基，但具有二价。特定的亚烷基基团是具有1至6个碳原子(“C1-C6亚烷基”)、1至5个碳原子(“C1-C5亚烷基”)、1至4个碳原子(“C1-C4亚烷基”)、或1至3个碳原子(“C1-C3亚烷基”)的那些。亚烷基基团的实例包括但不限于，诸如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等基团。
本发明使用的“环烷基”是指非芳族、饱和或不饱和的环状一价烃结构。特定的环烷基基团是具有指定数目的环(即，环)碳原子的那些，例如，具有3至12个环碳原子(“C3-C12环烷基”)的环烷基基团。特定的环烷基是具有3至8个环碳原子(“C3-C8环烷基”)或具有3至6个环碳原子(“C3-C6环烷基”)的环状烃。环烷基可由一个环(例如环己基)或多个环(例如金刚烷基)组成，但不包括芳族(例如芳基)基团。包含多于一个环的环烷基可以是稠合、螺环或桥接的、或其组合。环烷基基团的实例包括但不限于，环丙基
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环丁基
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环戊基
Figure BDA0003470586280000113
环己基
Figure BDA0003470586280000114
1-环己烯基，3-环己烯基，环庚基
Figure BDA0003470586280000115
降莰基，及其类似基团。
本发明使用的“亚环烷基”是指与环烷基相同的残基，但具有二价(即，相对于一价)。特定的亚环烷基基团是具有3至12个环碳原子(“C3-C12亚环烷基”)、具有3至8个环碳原子(“C3-C8亚环烷基”)或具有3至6个环碳原子(“C3-C6亚环烷基”)的那些。亚环烷基的实例包括但不限于，亚环丙基
Figure BDA0003470586280000116
亚环丁基
Figure BDA0003470586280000117
亚环戊基
Figure BDA0003470586280000118
亚环己基
Figure BDA0003470586280000119
1,2-亚环己烯基，1,3-亚环己烯基，1,4-亚环己烯基，亚环庚基
Figure BDA00034705862800001110
亚降莰基，及其类似基团。
本发明使用的“芳基”是指具有单环(例如，苯基)或多个稠环(例如，萘基或蒽基)的芳族碳环基团，其中所述稠环中一个或多个环可能并非芳族。特定的芳基基团是具有6至14个环(即，环)碳原子(“C6-C14芳基”)的那些。具有多于一个环的芳基基团(其中至少一个环是非芳族的)，可在芳族环位置或非芳族环位置处连接至母体结构。在一个变体中，具有多于一个环的芳基基团(其中至少一个环是非芳族的)是在芳族环位置处连接至母体结构。芳基的实例包括但不限于，诸如苯基、萘基、1-萘基、2-萘基、1,2,3,4-四氢萘-6-基
Figure BDA0003470586280000121
等基团。
“碳环基”或“碳环”是指所有环成员均为碳原子的芳族或非芳族一价环状基团，例如环己基、苯基、1,2-二氢萘基等。
本发明使用的“亚芳基”是指与芳基相同的残基，但具有二价。特定的亚芳基是具有6至14个环碳原子(“C6-C14亚芳基”)的那些。亚芳基的实例包括但不限于，诸如亚苯基，邻亚苯基(即，1,2-亚苯基)，间亚苯基(即，1,3-亚苯基)，对亚苯基(即，1,4-亚苯基)，亚萘基，1,2-亚萘基，1,3-亚萘基，1,4-亚萘基，2,7-亚萘基，2,6-亚萘基等基团。
本发明使用的“杂芳基”是指具有1至14个环碳原子和至少一个环杂原子(包括但不限于，诸如N、O和S的杂原子)的不饱和芳族环状基团。杂芳基基团可具有单环(例如，吡啶基或咪唑基)或多个稠环(例如，吲哚啉基、吲哚基或喹啉基)，其中至少一个稠环是芳族的。特定的杂芳基基团是具有1至12个环碳原子和1至6个独立地选自由氮(N)、氧(O)和硫(S)组成的组的环杂原子的5至14个原子组成的环(“5至14个原子组成的杂芳基”)；具有1至8个环碳原子和1至4个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的5至10个原子组成的环(“5至10个原子组成的杂芳基”)；或具有1至5个环碳原子和1至4个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的5、6或7个原子组成的环(“5至7个原子组成的杂芳基”)。在一个变体中，杂芳基包括具有1至6个环碳原子和1至4个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的单环芳族5、6或7个原子组成的环。在另一变体中，杂芳基包括具有1至12个环碳原子和1至6个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的多环芳族环。具有多于一个环的杂芳基基团，其中至少一个环是非芳族的，可在芳族环位置或非芳族环位置处连接至母体结构。杂芳基的实例包括但不限于，诸如吡啶基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并[b]噻吩基、喹啉基、吲哚基、苯并噻唑基等基团。“杂芳基”亦包括诸如
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(2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮-2-基)的基团部分，其具有芳香互变异构结构
Figure BDA0003470586280000123
(1H-1,2,4-三唑-5-醇-1-基)。
本发明使用的“杂环基”和“杂环基团”俱是指具有指定原子数和杂原子数的非芳族、饱和或部分不饱和环状基团，或者如果未指定原子数或杂原子数，则具有至少3个环原子，1至14个环碳原子和至少一个环杂原子，包括但不限于诸如N、O和S的杂原子。杂环基团可具有单个环(例如，四氢噻吩基、噁唑烷基)或多个稠环(例如，十氢喹啉基、八氢苯并[d]噁唑基)。多个稠环包括但不限于，双环、三环和四环，以及桥环或螺环体系。杂环基团的实例包括但不限于，吖丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噁唑烷基、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基、3,6-二氢-2H-吡喃基、2,3-二氢-1H-咪唑基、及其类似基团。
本发明使用的“亚杂芳基”是指与杂芳基相同的残基，但具有二价。特定的亚杂芳基基团是具有1至12个环碳原子和1至6个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的5至14个原子组成的环(“5至14个原子组成的亚杂芳基”)；具有1至8个环碳原子和1至4个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的5至10个原子组成的环(“5至10个原子组成的亚杂芳基”)；或具有1至5个环碳原子和1至4个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的环杂原子的5、6或7个原子组成的环(“5至7个原子组成的亚杂芳基”)。亚杂芳基的实例包括但不限于，诸如亚吡啶基、亚苯并咪唑基、亚苯并三唑基、亚苯并[b]噻吩基、亚喹啉基、亚吲哚基、亚苯并噻唑基等基团。
“卤基”或“卤素”是指原子序数为9至85的第17族元素。卤素基团包括氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
“卤代烷基”、“卤代亚烷基”、“卤代芳基”、“卤代亚芳基”、“卤代杂芳基”及类似术语是指被至少一个卤素基团取代的基团部分。当卤代烷基基团部分或其他卤素取代的基团部分被一个以上的卤素取代时，可通过使用对应于所连接的卤素基团部分的数目的前缀来表示。例如，二卤代芳基、二卤代烷基、三卤代芳基、三卤代烷基等，是指被2个(“二”)或3个(“三”)卤素基团取代的芳基和烷基，其可以是但不一定是相同的卤素；因此，譬如，卤代芳基基团4-氯-3-氟苯基属于二卤代芳基的范围。卤代烷基基团的子集，其中烷基基团的每个氢(H)被卤素基团替代，则称为“全卤代烷基”。特定的全卤代烷基基团是三氟烷基(-CF3)。同理，“全卤代烷氧基”是指烷氧基基团，其中卤素取代构成烷氧基的烷基基团部分的烃中的每个氢(H)。全卤代烷氧基的实例是三氟甲氧基(-OCF3)。“卤代烷基”包括单卤代烷基、二卤代烷基、三卤代烷基、全卤代烷基、和烷基基团上可能的任何其他数目的卤代取代基；同理，对于其他基团，如卤代亚烷基、卤代芳基、卤代亚芳基、卤代杂芳基等亦是如此。
“氨基”是指基团–NH2。
“氧代”是指基团＝O，即与碳或其他化学元素双键键合的氧原子。
除非另有说明，否则“任选取代”是指基团未被取代或被一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)为所述基团列出的取代基取代，其中所述取代基可以相同或不同。在一个实施方案，任选取代的基团是未取代的。在一个实施方案，任选取代的基团具有一个取代基。在另一实施方案，任选取代的基团具有两个取代基。在另一实施方案，任选取代的基团具有三个取代基。在另一实施方案，任选取代的基团具有四个取代基。在一些实施方案，任选取代的基团具有1至2、1至3、1至4、或1至5个取代基。当存在多个取代基时，除非另有说明，否则每个取代基均是独立选择的。譬如，基团-N(C1-C4烷基)(C1-C4烷基)上的每个(C1-C4烷基)取代基均可以相互独立地选择，从而生成诸如–N(CH3)(CH2CH3)的基团，等等。
除了本发明公开内容外，术语“取代的”在用于修饰特定基团或原子团时，还可表示特定基团或原子团的一个或多个氢原子(H)各自彼此独立地被如本发明所定义的相同或不同取代基取代。在一些实施方案，被取代的基团具有1、2、3或4个取代基，1、2或3个取代基，1或2个取代基，或1个取代基。
除非另有说明，否则取代基可连接至指定基团或原子团上任何化学上可能的位置。因此，譬如，在一个实施方案，-C1-C8烷基-OH包括，例如，-CH2CH2OH和–CH(OH)-CH3、以及–CH2C(OH)(CH3)2、及其类似基团。作为进一步的实例，在一个实施方案，-C1-C6烷基-OH包括，例如，-CH2CH2OH和–CH(OH)-CH3、以及–CH2C(OH)(CH3)2、及其类似基团。作为进一步的实例，在一个实施方案，-C1-C6烷基-CN包括，例如，-CH2CH2CN和–CH(CN)-CH3、以及–CH2C(CN)(CH3)2、及其类似基团。
除非通式中指明了元素的特定同位素，否则本发明内容包括本发明所公开化合物的所有同位素体，诸如，例如化合物的氘代衍生物(其中H可以是2H，即氘(D))。氘代化合物可在药代动力学(ADME)特性方面提供有利变化。同位素体可在结构中的任何或所有位置处具有同位素置换，或者可在结构中的任何或所有位置处具有以天然丰度存在的原子。
本发明使用的“小分子”是指分子量为1,000道尔顿或更小的化合物。
氢原子亦可被接近的生物电子等排体替换，例如氟，只要此类替换产生稳定的化合物即可。
本发明内容还包括任何或所有立体化学形式，包括本发明所述化合物的任何对映异构体或非对映异构体形式，以及顺式/反式或E/Z异构体。除非在化学结构或名称中明确指出立体化学，否则所述结构或名称旨在包含所描述化合物的所有可能的立体异构体。此外，在描述特定立体化学形式的情况下，应理解所有其他立体化学形式，以及所公开化合物的一般非立体有择形式及任何比例的混合物，包括所公开化合物的两种或更多种立体化学形式以任何比例的混合物，使得包括化合物的外消旋、非外消旋、对映体富集和缩放的混合物，亦均被描述并包含在本发明中。还预期包含所公开化合物的组合物，例如基本上纯的化合物(包括其特定立体化学形式)的组合物。包含任何比例的所公开化合物的混合物的组合物亦包含在本发明内容中，包括包含所公开化合物的两种或更多种立体化学形式的任何比例的混合物的组合物，使得化合物的外消旋、非外消旋、对映体富集和缩放的混合物均包含在本发明中。如果对分子的一个或多个部分明确指出立体化学，而不对分子的另一个或多个部分明确指出立体化学，则所述结构旨在涵盖立体化学未明确指出的一个或多个部分的所有可能的立体异构体。本发明还包括本发明所述化合物的任何及所有互变异构体形式。
本发明旨在包括本发明所述化合物的所有盐类，以及所述化合物的此类盐的使用方法。在一个实施方案，所述化合物的盐包含药学上可接受的盐。药学上可接受的盐是可作为药品或药物施用于人和/或动物并且在施用时保留游离化合物(中性化合物或非盐化合物)的至少一些生物活性的那些盐。所需的碱性化合物的盐可通过本领域技术人员已知的方法通过用酸处理所述化合物来制备得到。无机酸的实例包括但不限于，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。有机酸的实例包括但不限于，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、磺酸、和水杨酸。亦可制备碱性化合物与氨基酸的盐类，例如天冬氨酸盐和谷氨酸盐。所需的酸性化合物的盐可通过本领域技术人员已知的方法通过用碱处理所述化合物来制备得到。酸化合物的无机盐的实例包括但不限于，碱金属和碱土金属盐类，例如钠盐、钾盐、镁盐和钙盐；铵盐；以及铝盐。酸化合物的有机盐的实例包括但不限于，普鲁卡因、二苄胺、N-乙基哌啶、N,N'-二苄基乙二胺、和三乙胺的盐类。亦可制备酸性化合物与氨基酸的盐类，例如赖氨酸盐。对于药学上可接受的盐的列表，参见，例如，P.H.Stahl and C.G.Wermuth(eds.)“Handbook ofPharmaceutical Salts,Properties,Selection and Use”Wiley-VCH,2011(ISBN:978-3-90639-051-2)。以下文献中亦公开了几种药学上可接受的盐：Berge,J.Pharm.Sci.66:1(1977)。
如生物学实施例1、8和/或12中所述，用于测定Cbl-b抑制的IC50值的Cbl-b活性测定试验(Cbl-b抑制试验)使用包含N端生物素化Avi标记的Cbl-b(一种用BODIPY FL标记的荧光标记抑制剂探针(实施例59))和测定缓冲液的混合物。在一个实施方案，用于测定抑制Cbl-b的IC50的Cbl-b活性测定试验(Cbl-b抑制试验)使用生物学实施例1、8和/或12中描述的条件，采用0.5nM Cbl-b(“高”终浓度)。在另一实施方案，用于测定抑制Cbl-b的IC50的Cbl-b活性测定试验(Cbl-b抑制试验)使用生物学实施例1、8和/或12中描述的条件，采用0.125nM Cbl-b(“低”终浓度)。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的本发明公开的某些特征亦可在单个实施方案中组合提供。相反，在单个实施方案的上下文中描述的本发明公开的各种特征，为了简洁起见，亦可单独提供或以任何合适的子组合提供。与由变量表示的化学基团有关的实施方案的所有组合均被本发明具体涵盖并且在本发明中公开，就像每个组合被单独且明确地公开一样，就此类组合包括稳定化合物(即，可分离、表征、及测试生物活性的化合物)而言。此外，在描述此类变量的实施方案中列出的化学基团的所有子组合亦均被本发明具体涵盖并且在本发明中公开，就像化学基团的每一个此种子组合在本发明中被单独且明确地公开一样。
应当理解，本发明中描述为“包括”或“包含”或“涵盖”的方面(案例)和实施方案包括“由…组成”及“基本上由…组成”的实施方案。
本发明及所附权利要求书中使用的单数形式“一个/种”和“所述”包括复数形式，除非另有说明或上下文意义清楚。譬如，“一种”辅料或“所述”辅料包括一种或多种辅料。
提及“大约”值，包括所述值的90％至110％。例如，大约500亿个细胞是指450到550亿个细胞，包括500亿个细胞。例如，“大约100度”的温度是指大约90度至大约110度的温度。
当给出化合物的编号数值范围时，除非明确排除，否则包括在所述这些编号数值范围内的所有化合物，包括任何指定的“a”和“b”。譬如，提及化合物41-43是指化合物41、化合物42和化合物43。
II.化合物
一方面，本发明提供了式(I)所示化合物：
Figure BDA0003470586280000161
或其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐，其中：
Figure BDA0003470586280000162
是
Figure BDA0003470586280000163
Z1是CH或N；
Z2是CH或N；
R1是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
R2是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C3-C6环烷基；
R3是-CF3或环丙基；
R4是-CF3或环丙基；
n是0或1；
X是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或
Figure BDA0003470586280000164
R5是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN；
R6是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基，其中R6的每个基团任选地被1-5个R7基团取代；
或R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子，和其中的每一个杂环基或杂芳基任选地被1-5个R8基团取代；
各R7分别独立地为卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN；
各R8分别独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、-CN、C1-C6烷基-CN、-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、羟基、或卤素，或连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C6环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基；和
各R9分别独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C1-C6烷基-OH。
在一些实施方案，
Figure BDA0003470586280000171
(即，所述环A基团部分)，是
Figure BDA0003470586280000172
在一些实施方案，Z1是CH。在其他实施方案，Z1是N。在一些实施方案，R3是-CF3。在其他实施方案，R3是环丙基。在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000173
在一些实施方案，Z2是CH。在其他实施方案，Z2是N。在一些实施方案，R4是-CF3。在其他实施方案，R4是环丙基。在一些实施方案，所述环A基团部分选自由以下组成的组：
Figure BDA0003470586280000174
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000175
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000176
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000177
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000181
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000182
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000183
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000184
在一些实施方案，所述环A基团部分是
Figure BDA0003470586280000185
在一些实施方案，R1是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R1是H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R1是H、-CH3、或-CF3。在一些实施方案，R1是H。
在一些实施方案，R1是C1-C6烷基。在一些实施方案，R1是C1-C3烷基。在一些实施方案，R1是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，R1是-CH3。
在一些实施方案，R1是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R1是包含1-13个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R1是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R1是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R1是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R1是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，R1是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，R1是-CF3。
在一些实施方案，R2是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C3-C6环烷基。在一些实施方案，R2是H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、或C3-C4环烷基。在一些实施方案，R2是H、-CH3、-CF3、-CHF2、-CH2F、或环丙基。
在一些实施方案，R2是H。
在一些实施方案，R2是C1-C6烷基。在一些实施方案，R2是C1-C3烷基。在一些实施方案，R2是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，R2是-CH3。
在一些实施方案，R2是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R2是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R2是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R2是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R2是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，R2是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，R2是-CF3、-CHF2、或-CH2F。
在一些实施方案，R2是C3-C6环烷基。在一些实施方案，R2是C3-C5环烷基。在一些实施方案，R2是C3-C4环烷基。在一些实施方案，R2是环丙基、环丁基、或环戊基。在一些实施方案，R2是环丙基。
在一些实施方案，n是1。在一些实施方案，n是0。
在一些实施方案，X是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或
Figure BDA0003470586280000191
在一些实施方案，X是H。在一些实施方案，X是C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，X是-CH3或-CF3。
在一些实施方案，X是C1-C6烷基。在一些实施方案，X是C1-C3烷基。在一些实施方案，X是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，X是-CH3。
在一些实施方案，X是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，X是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，X是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，X是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，X是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，X是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，X是-CF3。
在一些实施方案，X是
Figure BDA0003470586280000192
在一些实施方案，R5是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN。在一些实施方案，R5是H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R5是H、-CH3、-CF3、-CH2CN、或-CH2OH。在一些实施方案，R5是H。
在一些实施方案，R5是C1-C6烷基。在一些实施方案，R5是C1-C3烷基。在一些实施方案，R5是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，R5是-CH3。
在一些实施方案，R5是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R5是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R5是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R5是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R5是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，R5是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，R5是-CF3。
在一些实施方案，R5是C1-C6烷基-OH。在一些实施方案，R5是C1-C3烷基-OH。在一些实施方案，R5是-CH2OH、-CH2CH2-OH、-CH2CH2CH2-OH、或-C(CH3)2-OH。在一些实施方案，R5是-CH2OH。
在一些实施方案，R5是C1-C6烷基-CN。在一些实施方案，R5是C1-C3烷基-CN。在一些实施方案，R5是-CH2CN、-CH2CH2-CN、-CH2CH2CH2-CN、或-C(CH3)2-CN。在一些实施方案，R5是-CH2CN。
在一些实施方案，R6是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基，其中R6的每个基团任选地被1-5个R7基团取代。
在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的单环C3-C5环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的单环C4-C5环烷基。在一些实施方案，R6是环丙基、环丁基、或环戊基，其中R6的每个基团任选地被1-5个R7基团取代。在一些实施方案，R6是环丁基或环戊基，其中R6的每个基团任选地被1-5个R7基团取代。在一些实施方案，R6是被1-5个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是被1个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是被2个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是被3个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是被4个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是被5个R7基团取代的单环C3-C6环烷基。在一些实施方案，R6是未取代的单环C3-C6环烷基。
在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的稠合双环C4-C7环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的稠合双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被1-5个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被1个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被2个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被3个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被4个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被5个R7基团取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是未取代的稠合双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000211
其中–(R7)0-5代表构成稠合双环体系的两个环中任一个环的任选取代。在一些实施方案，稠合双环体系的两个环均被取代。在一些实施方案，稠合双环体系的两个环中的一个被取代而另一个环未被取代。在一些实施方案，稠合双环体系的两个环均未被取代。
在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的桥接双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被1-5个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被1个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被2个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被3个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被4个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被5个R7基团取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是未取代的桥接双环C4-C8环烷基。在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000212
其中–(R7)0-5代表构成桥接双环体系的任一碳原子处的任选取代。在一些实施方案，桥接双环C4-C8环烷基的所述桥接基团部分是C1-C3亚烷基。在一些实施方案，桥接双环C4-C8环烷基的所述桥接基团部分是-CH2-或-CH2CH2-。在一些实施方案，桥接双环C4-C8环烷基的所述桥接基团部分是-CH2-。
在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的螺双环C6-C8环烷基。在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的螺双环C5-C7环烷基。在一些实施方案，R6是被1-5个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被1个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被2个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被3个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被4个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是被5个R7基团取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是未取代的螺双环C5-C8环烷基。在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000221
其中–(R7)0-5代表构成螺双环体系的两个环中任一个环的任选取代。在一些实施方案，螺双环体系的两个环均被取代。在一些实施方案，螺双环体系的两个环中的一个被取代而另一个环未被取代。在一些实施方案，螺双环体系的两个环均未被取代。
在一些实施方案，R6是任选地被1-5个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是被1-5个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是被1个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是被2个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是被3个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是被4个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是被5个R7基团取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，R6是未取代的5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含1-3个选自由N、O和S组成的组的杂原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含2个氮原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含1个氧原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含2个氧原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含1个氧原子和1个氮原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含1个硫原子。在一些实施方案，所述5至6个原子组成的杂环基包含1个氮原子和1个硫原子。在一些实施方案，R6是四氢呋喃基、二氧杂环戊烷基、吡咯烷基、吡唑烷基、哌啶基、异噁唑烷基、或四氢吡喃基，其中R6的每个基团任选地被1-5个R7基团取代。在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000231
在一些实施方案，R6是选自由以下组成的组：
Figure BDA0003470586280000232
在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000233
在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000234
在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000235
在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000236
在一些实施方案，R6是
Figure BDA0003470586280000237
在一些实施方案，各R7分别独立地为卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN。在一些实施方案，各R7分别独立地为卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基-OH、或C1-C3烷基-CN。在一些实施方案，各R7分别独立地为F、-CH3、-CF3、-CH2OH、或-CH2CN。
在一些实施方案，R7是卤素。在一些实施方案，R7是Cl、F、或Br。在一些实施方案，R7是Cl或F。在一些实施方案，R7是F。
在一些实施方案，R7是C1-C6烷基。在一些实施方案，R7是C1-C3烷基。在一些实施方案，R7是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，R7是-CH3。
在一些实施方案，R7是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R7是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R7是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R7是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R7是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，R7是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，R7是-CF3。
在一些实施方案，R7是C1-C6烷基-OH。在一些实施方案，R7是C1-C3烷基-OH。在一些实施方案，R7是-CH2OH、-CH2CH2-OH、-CH2CH2CH2-OH、或-C(CH3)2-OH。在一些实施方案，R7是-CH2OH。
在一些实施方案，R7是C1-C6烷基-CN。在一些实施方案，R7是C1-C3烷基-CN。在一些实施方案，R7是-CH2CN、-CH2CH2-CN、-CH2CH2CH2-CN、或-C(CH3)2-CN。在一些实施方案，R7是-CH2CN。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子，和其中的每一个杂环基或杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环杂环基，所述5至10个原子组成的单环杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至8个原子组成的单环杂环基，所述5至8个原子组成的单环杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至7个原子组成的单环杂环基，所述5至7个原子组成的单环杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基被1个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基被2个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基被3个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基被4个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基被5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基是未取代的。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基包含1个氮原子和1个氧原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂环基包含2个氮原子。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的稠合双环杂环基，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成7至10个原子组成的稠合双环杂环基，所述7至10个原子组成的稠合双环杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基被1个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基被2个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基被3个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基被4个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基被5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基是未取代的。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基包含1个氮原子和1个氧原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基包含2个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基包含一个稠合至部分不饱和环的饱和环。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基包含一个稠合至第二饱和环的饱和环。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的稠合双环杂环基包含一个稠合至第二部分不饱和环的部分不饱和环。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的桥接杂环基，所述5至10个原子组成的桥接杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成6至10个原子组成的桥接杂环基，所述6至10个原子组成的桥接杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成6至9个原子组成的桥接杂环基，所述6至9个原子组成的桥接杂环基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基被1个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基被2个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基被3个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基被4个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基被5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基是未取代的。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基包含1个氮原子和1个氧原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基包含2个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基的桥接基团部分是C1-C3亚烷基。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基的桥接基团部分是-CH2-。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的桥接杂环基的桥接基团部分是-CH2CH2-。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环杂芳基，所述5至10个原子组成的单环杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至8个原子组成的单环杂芳基，所述5至8个原子组成的单环杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至6个原子组成的单环杂芳基，所述5至6个原子组成的单环杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基被1个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基被2个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基被3个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基被4个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基被5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基是未取代的。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基包含1个氮原子和1个氧原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的单环杂芳基包含2个氮原子。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的双环杂芳基，所述5至10个原子组成的双环杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成6至10个原子组成的双环杂芳基，所述6至10个原子组成的双环杂芳基任选地被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基被1-5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基被1个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基被2个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基被3个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基被4个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基被5个R8基团取代。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基是未取代的。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基包含1个氮原子和1个氧原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基包含2个氮原子。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基包含一个稠合至饱和环的芳环。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基包含一个稠合至第二芳环的芳环。在一些实施方案，所述5至10个原子组成的双环杂芳基包含一个稠合至部分不饱和环的芳环。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成选自由以下组成的组的基团部分：
Figure BDA0003470586280000271
其中–(R8)0-5代表构成稠合或桥接双环体系的两个环中的任一个或单环体系的任何碳原子的任选取代。在一些实施方案，稠合或桥接双环体系的两个环均被取代。在一些实施方案，稠合或桥接双环体系的两个环中的一个被取代而另一个环未被取代。在一些实施方案，稠合或桥接双环体系的两个环均未被取代。
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000272
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000273
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000274
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000275
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000276
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000277
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000281
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000282
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000283
在一些实施方案，R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成
Figure BDA0003470586280000284
在一些实施方案，各R8分别独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、-CN、C1-C6烷基-CN、-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、羟基、或卤素。在一些实施方案，各R8分别独立地为C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基-OH、-CN、C1-C3烷基-CN、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、羟基、或卤素。在一些实施方案，各R8分别独立地为-CH3、-CH2CH3、-CF3、-CH2OH、-CN、-CH2CN、-CH2-O-CH3、羟基、或F。
在一些实施方案，R8是C1-C6烷基。在一些实施方案，R8是C1-C3烷基。在一些实施方案，R8是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，R8是-CH3或-CH2CH3。
在一些实施方案，R8是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R8是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R8是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R8是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R8是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，R8是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，R8是-CF3。
在一些实施方案，R8是C1-C6烷基-OH。在一些实施方案，R8是C1-C3烷基-OH。在一些实施方案，R8是-CH2OH、-CH2CH2-OH、-CH2CH2CH2-OH、或-C(CH3)2-OH。在一些实施方案，R8是-CH2OH。
在一些实施方案，R8是-CN。在一些实施方案，R8是C1-C6烷基-CN。在一些实施方案，R8是C1-C3烷基-CN。在一些实施方案，R8是-CH2CN、-CH2CH2-CN、-CH2CH2CH2-CN、或-C(CH3)2-CN。在一些实施方案，R8是-CH2CN。
在一些实施方案，R8是-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)。在一些实施方案，R8是-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)。在一些实施方案，R8是-(C1-C2亚烷基)-O-(C1-C2烷基)。在一些实施方案，R8是-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH2CH3、-CH2CH2-O-CH2CH3、或-CH2CH2-O-CH3。在一些实施方案，R8是-CH2-O-CH3。
在一些实施方案，R8是羟基。
在一些实施方案，R8是卤素。在一些实施方案，R8是Cl、F、或Br。在一些实施方案，R8是Cl或F。在一些实施方案，R8是F。
在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C6环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C4环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺环丙基。
在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C6环烷基。在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C5环烷基。在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺环丙基、螺环丁基、或螺环戊基。在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺环丙基。
在一些实施方案，连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺5至6个原子组成的杂环基。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基包含1-3个选自由N、O和S组成的组的杂原子。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基包含1个氮原子。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基包含2个氮原子。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基包含1个氧原子。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基包含2个氧原子。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基包含1个氮原子和1个氧原子。在一些实施方案，所述螺5至6个原子组成的杂环基是吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、四氢吡喃基、或硫杂环戊烷基。
在一些实施方案，各R9分别独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C1-C6烷基-OH。在一些实施方案，各R9分别独立地为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、或C1-C3烷基-OH。在一些实施方案，各R9分别独立地为H、-CH3、-CF3、或-CH2OH。
在一些实施方案，R9是H。在一些实施方案，至少一个R9是H。在一些实施方案，一个R9是H，而另一个R9是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C1-C6烷基-OH。在一些实施方案，一个R9是H，而另一个R9是C1-C6烷基。在一些实施方案，一个R9是H，而另一个R9是C1-C6烷基。在一些实施方案，一个R9是H，而另一个R9是-CH3。在一些实施方案，两个R9基团均为H。
在一些实施方案，R9是C1-C6烷基。在一些实施方案，R9是C1-C3烷基。在一些实施方案，R9是甲基、乙基、正丙基、或异丙基。在一些实施方案，R9是-CH3。在一些实施方案，两个R9基团分别独立地为C1-C6烷基。在一些实施方案，两个R9基团分别独立地为C1-C3烷基。在一些实施方案，两个R9基团均为-CH3。
在一些实施方案，R9是C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R9是包含1-7个卤素原子的C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，R9是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R9是包含1-7个卤素原子的C1-C3卤代烷基。在一些实施方案，R9是包含1-5个卤素原子的C1-C2卤代烷基。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子、溴原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子分别独立地选自由氯原子和氟原子组成的组。在一些实施方案，所述卤素原子均为氟原子。在一些实施方案，所述卤素原子是氯原子和氟原子的组合。在一些实施方案，R9是-CF3、-CCl3、-CF2Cl、-CFCl2、-CHF2、-CH2F、-CHCl2、-CH2F、或-CHFCl。在一些实施方案，R9是-CF3。
在一些实施方案，R9是C1-C6烷基-OH。在一些实施方案，R9是C1-C3烷基-OH。在一些实施方案，R9是-CH2OH、-CH2CH2-OH、-CH2CH2CH2-OH、或-C(CH3)2-OH。在一些实施方案，R9是-CH2OH。
在一些实施方案，式(I)所示化合物或其任何变体或方面具有式(I-a)所示的立体化学：
Figure BDA0003470586280000302
其中R1、R2、n、X和所述环A基团部分均如对式(I)的化合物所述。
在一些实施方案，所述化合物具有式(I-A)或(I-B)所示结构：
Figure BDA0003470586280000301
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9、Z1、Z2和n均如对式(I)的化合物所述。
在一些实施方案，所述化合物具有式(I-C)、(I-D)、(I-E)、(I-F)、(I-G)、(I-H)、(I-I)、或(I-J)所示结构：
Figure BDA0003470586280000311
其中R1、R2、R5、R6、R9和n均如对式(I)的化合物所述。
在一些实施方案，所述化合物具有式(II-A)、(II-B)、(II-C)、(II-D)、(II-E)、(II-F)、(II-G)、或(II-H)所示结构：
Figure BDA0003470586280000321
其中R1、R2、R5、R7、R9和n均如对式(I)的化合物所述，和
Figure BDA0003470586280000322
是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基。
在一些实施方案，所述化合物具有式(II-A-1)、(II-B-1)、(II-C-1)、(II-D-1)、(II-E-1)、(II-F-1)、(II-G-1)、或(II-H-1)所示结构：
Figure BDA0003470586280000331
其中R1、R2、R5、R7、R9和n均如对式(I)的化合物所述，和
Figure BDA0003470586280000341
是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基。
在一些实施方案，所述化合物具有式(III-A)、(III-B)、(III-C)、(III-D)、(III-E)、(III-F)、(III-G)、或(III-H)所示结构：
Figure BDA0003470586280000342
其中R1、R2、R8、R9和n均如对式(I)的化合物所述，和
Figure BDA0003470586280000351
是5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。
在一些实施方案，所述化合物具有式(III-A-1)、(III-B-1)、(III-C-1)、(III-D-1)、(III-E-1)、(III-F-1)、(III-G-1)、或(III-H-1)所示结构：
Figure BDA0003470586280000352
其中R1、R2、R8、R9和n均如对式(I)的化合物所述，和
Figure BDA0003470586280000361
是5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1-2个选自由N和O组成的组的额外杂原子。
在一些实施方案，所述化合物具有式(IV-A)或(IV-B)所示结构：
Figure BDA0003470586280000362
其中R1、R2、R3、R4、Z1、Z2和n均如对式(I)的化合物所述，和X是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，X是H。在一些实施方案，X是C1-C6烷基。在一些实施方案，X是C1-C6卤代烷基。
在一些实施方案，所述化合物具有式(IV-C)、(IV-D)、(IV-E)、(IV-F)、(IV-G)、(IV-H)、(IV-I)、或(IV-J)所示结构：
Figure BDA0003470586280000363
Figure BDA0003470586280000371
其中R1、R2和n均如对式(I)的化合物所述，和X是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，X是H。在一些实施方案，X是C1-C6烷基。在一些实施方案，X是C1-C6卤代烷基。
在一些实施方案，所述化合物具有式(IV-C-1)、(IV-D-1)、(IV-E-1)、(IV-F-1)、(IV-G-1)、(IV-H-1)、(IV-I-1)、或(IV-J-1)所示结构：
Figure BDA0003470586280000372
Figure BDA0003470586280000381
其中R1、R2和n均如对式(I)的化合物所述，和X是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基。在一些实施方案，X是H。在一些实施方案，X是C1-C6烷基。在一些实施方案，X是C1-C6卤代烷基。
在式(I)、(I-a)、(I-A)-(I-J)、(II-A)-(II-H)、(II-A-1)-(II-H-1)、(III-A)-(III-H)、(III-A-1)-(III-H-1)、(IV-A)-(IV-J)、或(IV-C-1)-(IV-J-1)的任一实施方案中，连接氰基基团的环丁基碳的绝对立体化学可以是(R)-(使用Cahn-Ingold-Prelog规则)。在式(I)、(I-a)、(I-A)-(I-J)、(II-A)-(II-H)、(II-A-1)-(II-H-1)、(III-A)-(III-H)、(III-A-1)-(III-H-1)、(IV-A)-(IV-J)、或(IV-C-1)-(IV-J-1)的任一实施方案中，连接氰基基团的环丁基碳的绝对立体化学可以是(S)-。
表1.本发明的代表性化合物
Figure BDA0003470586280000382
Figure BDA0003470586280000391
Figure BDA0003470586280000401
Figure BDA0003470586280000411
Figure BDA0003470586280000421
Figure BDA0003470586280000431
在一些实施方案，本发明提供了选自表1中化合物编号为1-58的化合物，或其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐。
一方面，本发明提供了制备本发明所述的式(I)所示化合物的方法。另一方面，本发明提供了用于制备式(I)所示化合物的中间体化合物。本发明还提供了作为测定探针并且任选地用例如荧光标记物进行标记的化合物。在另一方面，本发明提供了用于测定Cbl-b抑制的方法。在一个变体中，本发明提供了用于测定Cbl-b抑制的方法，其包含将Cbl-b与测定探针(例如用荧光标记物标记的测定探针)预孵育，然后将Cbl-b/测定探针混合物暴露于候选化合物，然后使用例如FRET信号检测法来确定所述测定探针是否被候选化合物置换以及置换的程度。
在本发明所述的任何药物组合物、方法或试剂盒中，Cbl-b抑制剂可选自以下专利申请中公开的一种或多种Cbl-b抑制剂：国际专利申请WO 2019/148005的化合物1-719(包括其“a”和“b”变体)或其中式(I-A)、式(I)、式(II-A)、式(II)、式(III-A)、式(III)、或式(IV)中任一所示的化合物。国际专利申请WO2019/148005的内容通过引用其全文并入本发明。
在一些实施方案，提供用于本发明所述组合物和方法的是表1中的化合物60和/或化合物56，或其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案，用于本发明公开的方法、药物组合物和试剂盒的小分子Cbl-b抑制剂的分子量为1,000道尔顿或更小，或约1,000道尔顿或更小。在另一实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量为900道尔顿或更小，或约900道尔顿或更小。在另一实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量为800道尔顿或更小，或约800道尔顿或更小。在另一实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量为750道尔顿或更小，或约750道尔顿或更小。在另一实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量为700道尔顿或更小，或约700道尔顿或更小。在另一实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量为650道尔顿或更小，或约650道尔顿或更小。在另一实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量为600道尔顿或更小，或约600道尔顿或更小。对于任一前述实施方案，小分子Cbl-b抑制剂的分子量下限可为100道尔顿、200道尔顿、或300道尔顿，或约100道尔顿、约200道尔顿、或约300道尔顿。
以下方案描述了合成本发明公开的化合物的方法。在合成过程中所产生的立体异构体的混合物，例如最终化合物的外消旋混合物，可使用常见的色谱方法例如超临界流体色谱与手性固定相、手性柱色谱或本领域已知的其他方法相结合，分离成各自的对映异构体。
方案I.
Figure BDA0003470586280000441
其中R1、R2、R3、X、Z1和n均如对式(I)的化合物所定义；Y是Br或NH2；和Ra和Rb均为合适的保护基团。
通式I-9所示化合物如方案I中所述合成得到。硼酸酯I-1与烯烃I-2在铑催化下偶联得到酯I-3。通过酰肼形成(I-4)、环化、及脱硫组装三唑以提供化合物I-6。将化合物I-6(其中Y是NH2)用溴酯I-8处理以提供化合物I-9，随后通过用取代的哌啶进行还原胺化将其转化为化合物I-10。在钯催化下用哌啶衍生物I-7处理化合物I-6(其中Y是Br)，直接提供化合物I-10。
方案II.
Figure BDA0003470586280000451
其中R1、R2、R4、X、Z2和n均如对式(I)的化合物所定义；Rb是合适的保护基团；和Yb是醛或溴甲基。
方案II概述了通式II-5所示化合物的合成。甲基吡啶或嘧啶II-1被氧化以提供式II-2的醛或溴甲基。然后通过还原胺化或用取代胺置换来安装氨基基团X以提供化合物II-3，然后在碱性条件下酯水解以提供化合物II-4。然后用偶联剂如HATU或T3P将羧酸II-4偶联至胺I-6以提供酰胺II-5。
方案III.
Figure BDA0003470586280000452
其中X、R3和Z1均如对式(I)的化合物所定义。
在方案I中概述的一般合成中使用的通式I-5所示中间体化合物根据方案III合成得到。醛III-1通过还原胺化与取代的胺偶联以提供中间体III-2，将其用氨处理以提供式I-5的化合物。
化合物12、18-21、25、31、49和53-57在生物学实施例1的Cbl-b抑制试验中表现出小于1nM的IC50值，和在一个实施方案用于本发明公开的药物组合物和方法。化合物4、11、16、17、23、39、40、44和48在生物学实施例1的Cbl-b抑制试验中表现出介于1nM和小于2nM之间的IC50值，和在一个实施方案用于本发明公开的药物组合物和方法。化合物1、2、5、6、13-15、22、24、26-30、32-37、41-43、45、47、50和58在生物学实施例1的Cbl-b抑制试验中表现出介于2nM和小于5nM之间的IC50值，和在一个实施方案用于本发明公开的药物组合物和方法。化合物7、9、38、46和52在生物学实施例1的Cbl-b抑制试验中表现出介于5nM和小于20nM之间的IC50值，和在一个实施方案用于本发明公开的药物组合物和方法。化合物3、8、10和51在生物学实施例1的Cbl-b抑制试验中表现出20nM或更大的IC50值，和在一个实施方案用于本发明公开的药物组合物和方法。
在各种实施方案中，并且如本发明进一步所描述的，如通过生物学实施例1的Cbl-b抑制试验所测定，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物，和使用本发明所述化合物或组合物的方法)具有小于1nM、介于1nM和小于2nM之间、介于2nM和小于5nM之间、介于5nM和小于20nM之间、或20nM及更大的IC50值。在进一步的实施方案，并且如本发明进一步所描述的，如通过生物学实施例1的Cbl-b抑制试验所测定，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物，和使用本发明所述化合物或组合物的方法)具有小于1nM的IC50值。在进一步的实施方案，并且如本发明进一步所描述的，如通过生物学实施例1的Cbl-b抑制试验所测定，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物，和使用本发明所述化合物或组合物的方法)具有介于1nM和小于2nM之间的IC50值。在进一步的实施方案，并且如本发明进一步所描述的，如通过生物学实施例1的Cbl-b抑制试验所测定，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物，和使用本发明所述化合物或组合物的方法)具有介于2nM和小于5nM之间的IC50值。在进一步的实施方案，并且如本发明进一步所描述的，如通过生物学实施例1的Cbl-b抑制试验所测定，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物，和使用本发明所述化合物或组合物的方法)具有介于5nM和小于20nM之间的IC50值。在进一步的实施方案，并且如本发明进一步所描述的，如通过生物学实施例1的Cbl-b抑制试验所测定，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物，和使用本发明所述化合物或组合物的方法)具有20nM及更大的IC50值。
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的免疫细胞(例如，T细胞)分泌IL-2，在1微摩尔或0.3微摩尔的抑制剂浓度下，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物)相对于基线诱导≤15倍、15-20倍之间、或大于20倍的变化。
对于用抗CD3抗体刺激的免疫细胞(例如，T细胞)分泌IL-2，在3微摩尔或1微摩尔的抑制剂浓度下，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物)相对于基线诱导小于0.4倍、0.40–0.85倍之间、或大于0.85倍的变化。
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的免疫细胞(例如，T细胞)的细胞表面上的CD25染色，在1微摩尔或0.3微摩尔的抑制剂浓度下，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物)相对于基线诱导≤1.24倍、1.24–1.39倍之间、或大于1.39倍的变化。
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的免疫细胞(例如，T细胞)的细胞表面上的CD25染色，在3微摩尔或1微摩尔的抑制剂浓度下，本发明提供的化合物(以及包含本发明所述化合物的组合物)相对于基线诱导≤1.00倍、1.05–1.15倍之间、或大于1.15倍的变化。
III.方法、药物和用途
本发明提供了用于调节免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)活性的方法，例如通过使所述免疫细胞与有效量的本发明所述Cbl-b抑制剂或其组合物接触。本发明还提供了生成具有经调节活性的所述免疫细胞(本发明称为“经修饰的免疫细胞”)的体外方法，其中所述经修饰的免疫细胞可通过离体方法施用于有需要的个体(例如，患有癌症的个体)。本发明进一步提供了在有需要的个体(例如，患有癌症的个体)中调节应答的体内方法，其中所述方法包含施用有效量的本发明所述Cbl-b抑制剂或其组合物。此外，本发明提供了在个体体内淋巴调节后生成经扩增的淋巴细胞群体的体外方法，其中所述淋巴调节是由于向所述个体施用有效量的本发明所述Cbl-b抑制剂或其组合物而发生。然后可将经扩增的淋巴细胞群体施用于所述个体。然后可将经扩增的淋巴细胞群体施用于患有癌症的个体。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞或所述经扩增的淋巴细胞群体由包含从所述个体获得的免疫细胞的生物样品(例如，包含外周血单核细胞的血样或包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的肿瘤活检)产生。
此外，本发明提供了用作治疗性活性物质的Cbl-b抑制剂。本发明提供了用于治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的Cbl-b抑制剂。此外，本发明提供了用于治疗癌症的Cbl-b抑制剂。本发明进一步提供了使用Cbl-b抑制剂在制备治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的药物中的用途。本发明还提供了使用Cbl-b抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途。此外，本发明提供了包含Cbl-b抑制剂作为用于治疗癌症的联合疗法的一部分的治疗方法、药物和用途，所述治疗癌症的联合疗法涉及免疫检查点抑制剂、抗肿瘤剂和放射疗法中的一种或多种。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，所述癌症是血液学癌症，例如淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。在本发明的治疗方法、药物和用途的其他实施方案中，所述癌症是非血液学癌症，例如肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
血液学癌症包括但不限于一种或多种白血病，例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性粒细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学疾病，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、滤泡性小细胞淋巴瘤或滤泡性大细胞淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、和“白血病前期”，其均是由于髓系血细胞的无效生成(或发育不良)而联合起来的各种血液学疾病。
非血液学癌症包括但不限于，神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、胃癌、脑癌、肺癌(例如，NSCLC)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌、和头颈癌。
在一些案例中，Cbl-b抑制剂在治疗疾病或病症(例如癌症)中的有效性通过评估临床结果(例如肿瘤尺寸或肿瘤数量的减少、和/或存活率)来测定。在一些实施方案，“治疗癌症”包含根据所述实体瘤的疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in SolidTumors，RECIST 1.1版)，如(参见，例如Eisenhauer et al.,Eur J Cancer,45:228-247,2009；和Nishino et al.,Am J Roentgenol,195:281-289,2010)所述，来评估患者对治疗方案的反应。根据RECIST 1.1确定目的抗肿瘤反应的疗效评价标准包括：完全缓解(CR)；部分缓解(PR)；疾病进展(PD)；和疾病稳定(SD)。
A.细胞的分离和处理
本发明提供了用于制备和加工生成并用于本发明方法中的免疫细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的方法。本发明使用的术语“经修饰的免疫细胞”是指已经培养、孵育和/或已经与有效量的Cbl-b抑制剂接触以调节所述免疫细胞活性的免疫细胞或包含所述免疫细胞的细胞群。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞可用于免疫疗法，例如与过继性免疫疗法方法结合使用。
1.样本
在一些实施方案，待修饰的免疫细胞或包含所述待修饰的免疫细胞的细胞群均从样本，诸如生物样本，例如从个体(例如，人)获得或衍生的样本，分离得到。在一些实施方案，从中分离得到免疫细胞的个体是患有特定疾病或病症(例如，癌症)或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的个体。在一些实施方案，个体是需要特定治疗干预的人，例如过继细胞疗法，其中免疫细胞被分离、加工和/或修饰。因此，在一些实施方案，从所述个体分离的细胞是原代细胞(例如，原代人细胞)。如本发明所用，术语“原代细胞”是指直接从哺乳动物生物体液或组织(例如，人生物体液或组织)分离的细胞。
在一些实施方案，待修饰的免疫细胞是造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、和/或NK细胞。如本发明所用，术语“造血细胞”包括造血干细胞和造血祖细胞。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞存在于异质细胞群或包含异质细胞群的组合物中。譬如，待修饰的免疫细胞可以是存在于异质细胞群中的造血细胞，所述异质细胞群包含诸如源自组织或器官的经分化细胞的细胞。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞存在于同质细胞群或包含同质细胞群的组合物中。譬如，待修饰的免疫细胞可以是存在于仅含造血细胞的同质细胞群中的造血细胞。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞或包含待修饰的免疫细胞的细胞群包括免疫细胞的一个或多个亚群。譬如，免疫细胞的一个或多个亚群可以是CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，例如由功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、定位、持续能力、表面标志物谱、细胞因子分泌谱、和/或分化程度定义的那些。
在一些实施方案，本发明所述的生物样本包括直接取自个体的组织、体液及其他样品，以及从一个或多个处理步骤(例如，分离、离心、遗传工程(例如，用编码重组嵌合受体的病毒载体进行转导)、清洗、和/或孵育)产生的样品。生物样本可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样本包括但不限于体液，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液，组织和器官样品(例如来自含有肿瘤的组织或器官的样品)，包括由此衍生的加工样品。在一些实施方案，所述生物样本是生物流体样品或生物组织样品。在一些实施方案，所述生物样本是生物组织样品。在一些案例中，免疫细胞所源自或分离自的生物样本是血液或血液来源的样品，或源自单采血液成分法或白细胞分离法产品。
示例性生物样本包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体、或其他器官，和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，生物样本包括来自自体来源(即，从需要细胞疗法的个体获得或衍生得到)和同种异体来源(即，从需要细胞疗法的个体以外的个体或来源获得或衍生得到)的样品。
在一些实施方案，待修饰的免疫细胞或包含所述待修饰的免疫细胞的细胞群源自细胞系(例如，T细胞系、B细胞系、NK细胞系等)。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞或包含所述待修饰的免疫细胞的细胞群获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物、或猪。
2.细胞处理和分离
在一些实施方案，待修饰的免疫细胞的分离包括一个或多个制备和/或细胞分离步骤。所述一个或多个细胞分离步骤可以是基于非亲和性的分离或基于亲和性的分离。作为实例，基于非亲和性的分离可以是包含待修饰的免疫细胞的组合物的离心。在一些实施方案，所述基于非亲和性的分离方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心由外周血制备白细胞。基于亲和性的分离方法可包括使包含待修饰的免疫细胞的组合物与抗体包被的珠粒接触。本发明所涵盖的抗体包被珠粒包括但不限于包被有抗体的磁珠类(例如，由Life Technologies,Carlsbad,CA销售的
Figure BDA0003470586280000492
由Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA销售的
Figure BDA0003470586280000491
微珠；或由StemcellTechnologies,Vancouver,BC,Canada销售的EasySepTM Direct RapidSpheresTM)，所述抗体结合在所述待修饰的免疫细胞表面上表达的标志物。在一些实施方案，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，例如对一种或多种表面标志物(例如，CD4+、CD8+等)呈阳性或以其他方式表达高水平的一种或多种表面标志物(例如，CD4+、CD8+等)的细胞。阳性选择可基于靶细胞(例如，待修饰的免疫细胞)与试剂结合并保留以供进一步使用的技术。譬如，可使用与抗CD3抗体偶联的磁珠(例如
Figure BDA0003470586280000501
CD3人微珠)对CD3+的T细胞进行阳性选择。阴性选择可基于保留未与试剂结合的靶细胞(例如，待修饰的免疫细胞)的技术。譬如，可使用阴性选择从外周血单核细胞(PMBC)中分离出总的人原代T细胞，其中针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物在包含PBMC的样品中孵育，然后经由磁珠通过样品以去除表达那些表面标志物的细胞并保留样品中剩余的细胞用于后续处理。在一些实施方案，所述免疫细胞或包含所述待修饰的免疫细胞的细胞群在一种或多种试剂存在下进行清洗、离心和/或孵育，例如以去除不需要的成分、富集所需成分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实施例，所述免疫细胞基于一种或多种特性(例如，密度、粘附特性、尺寸、敏感性、和/或对特定成分的抗性)进行分离。细胞分离步骤无需特定细胞的100％富集或去除。在一些实施方案，特定类型的免疫细胞(例如，CD4+T细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比。在一些实施方案，例如通过阴性选择去除或耗尽非目的特定类型的细胞是指减少此类细胞的数量或百分比。
在一些实施方案，免疫细胞或包含所述免疫细胞的细胞群是从个体的循环血液，例如通过单采血液成分法或白细胞分离术得到。在一些案例中，包含待修饰的免疫细胞的样本含有淋巴细胞(包括T细胞、B细胞和NK细胞)，以及单核细胞、粒细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些案例中，含有除红细胞和血小板以外的细胞。
在一些实施方案，清洗从个体收集的血细胞，例如以除去血浆部分并将包含待修饰的免疫细胞的细胞群置于合适的缓冲液或培养基中，以用于后续处理步骤。在一些实施方案，包含待修饰的免疫细胞的细胞群用磷酸盐缓冲盐水洗。在一些实施方案，所述清洗溶液不含钙和/或镁。在一些案例中，清洗步骤通过半自动“流通式”离心机完成。在一些案例中，清洗步骤通过切向流过滤来完成。在一些实施方案，所述待修饰的免疫细胞或含有所述待修饰的免疫细胞的细胞群在清洗后重悬于多种合适的缓冲液，例如无钙和/或无镁的磷酸盐缓冲盐水中。在一些实施方案，去除血细胞样品的成分并将所述待修饰的免疫细胞或包含所述待修饰的免疫细胞的细胞群直接重悬于合适的细胞培养基中。
在本发明的生物学实施例2和生物学实施例3中描述了用于处理和/或分离来自样本的免疫细胞(例如，造血细胞)的代表性方法，所述样本包含含有所述造血细胞的细胞群(例如，包含PBMC的样品)。处理和/或分离免疫细胞(例如造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、和/或NK细胞)的方法和技术均是本领域众所周知的。参见，例如美国专利申请号2017/0037369；美国专利申请号2012/0148553；美国专利号6,461,645；美国专利号6,352,694；和美国专利号7,776,562。
3.孵育和治疗
本发明提供了通过使免疫细胞(诸如上述经处理和/或分离的免疫细胞)与有效量的本发明所述Cbl-b抑制剂接触来调节所述免疫细胞活性的方法。本发明还提供了通过本发明所述的任何方法生成的经修饰的免疫细胞，例如通过在有效量的Cbl-b抑制剂存在下培养含有免疫细胞(例如，上述处理和/或分离的免疫细胞)的细胞群以调节免疫细胞活性，从而生成所述经修饰的免疫细胞。
在一些实施方案，在将所述免疫细胞与本发明提供的Cbl-b抑制剂接触之前，将所述待修饰的免疫细胞(例如，上述经处理和/或分离的免疫细胞)在合适的培养基中孵育和/或培养。在一些实施方案，所述待修饰的免疫细胞在合适的培养基中孵育和/或培养以同时使所述免疫细胞与本发明提供的Cbl-b抑制剂接触。
所述经处理和/或分离的待修饰的免疫细胞或包含所述待修饰的免疫细胞的细胞群可在体外进行分化和/或扩增。在一些实施方案，所述待修饰的免疫细胞是造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞和/或NK细胞。在一些实施方案，所述待修饰的免疫细胞在所述免疫细胞分化和/或扩增之前，于包含本发明所述的Cbl-b抑制剂的合适细胞培养基中孵育。在一些实施方案，所述待修饰的免疫细胞在所述免疫细胞分化和/或扩增之后，于包含本发明所述的Cbl-b抑制剂的合适细胞培养基中孵育。所述免疫细胞在与有效量的本发明提供的Cbl-b抑制剂接触以调节所述免疫细胞活性时被修饰(即，经修饰的免疫细胞)。在一些实施方案，所述待修饰的免疫细胞未在体外进行分化和/或扩增，因此同已与Cbl-b抑制剂接触的所述经修饰的免疫细胞是相同的细胞类型。譬如，T细胞可在包含Cbl-b抑制剂的合适培养基中培养而不分化所述T细胞。在其他实施方案，所述待修饰的免疫细胞在体外进行分化和/或扩增，因此同已与Cbl-b抑制剂接触的所述经修饰的免疫细胞是不同的细胞类型。譬如，造血细胞可在包含Cbl-b抑制剂以及驱动所述造血细胞分化为成熟造血细胞的其他药剂的合适培养基中孵育。因此，在本发明实施方案的一些案例中，所述经修饰的免疫细胞是造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞和/或NK细胞。免疫细胞的扩增和/或分化方法均是本领域众所周知的。参见，例如，国际专利申请号WO 2017/037083。
有效量的Cbl-b抑制剂是与参比样品相比足以调节免疫细胞活性的Cbl-b抑制剂的量或浓度。参比样品可以是未与Cbl-b抑制剂接触的免疫细胞。在一些实施方案，添加至包含所述待修饰的免疫细胞的组合物(例如，细胞培养基)的Cbl-b抑制剂的浓度是从约1pM至约100μM，约5pM至约100μM，约10pM至约100μM，约20pM至约100μM，约40pM至约100μM，约60pM至约100μM，约80pM至约100μM，约1nM至约100μM，约3nM至约100μM，约10nM至约100μM，约15nM至约100μM，约20nM至约100μM，约40nM至约100μM，约60nM至约100μM，约80nM至约100μM，约0.1μM至约100μM，约0.1μM至约90μM，约0.1μM至约80μM，约0.1μM至约70μM，约0.1μM至约60μM，约0.1μM至约50μM，约0.1μM至约40μM，约0.1μM至约30μM，约0.1μM至约20μM，约0.1μM至约10μM，约0.2μM至约10μM，或约0.3μM至约8μM。在一些实施方案，添加至包含所述待修饰的免疫细胞的组合物(例如，细胞培养基)的Cbl-b抑制剂的浓度是约1pM，约2pM，约3pM，约4pM，约5pM，约10pM，约20pM，约30pM，约40pM，约50pM，约60pM，约70pM，约80pM，约90pM，约1nM，约3nM，约5nM，约10nM，约20nM，约40nM，约50nM，约80nM，约0.1μM，约0.2μM，约0.3μM，约0.4μM，约0.5μM，约1μM，约5μM，约10μM，约15μM，约20μM，约25μM，约30μM，约40μM，约50μM，约60μM，约70μM，约80μM，约90μM，或约100μM。在一些实施方案，添加至包含所述待修饰的免疫细胞的组合物(例如，细胞培养基)的Cbl-b抑制剂的浓度是约0.3μM，约1μM，或约4μM。在一些实施方案，添加至包含所述待修饰的免疫细胞的组合物(例如，细胞培养基)的Cbl-b抑制剂的浓度是约1μM或约8μM。
与参比样品相比，有效量的Cbl-b抑制剂与免疫细胞接触足够长的时间以调节所述免疫细胞活性。参比样品可以是未与所述Cbl-b抑制剂接触但与包含所述免疫细胞和所述Cbl-b抑制剂的组合物(例如，细胞培养基)孵育相同时间长度的免疫细胞。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂与所述免疫细胞接触和/或孵育约1分钟至约1小时，约5分钟至约1小时，约10分钟至约1小时，约15分钟至约1小时，约20分钟至约1小时，约30分钟至约1小时，约45分钟至约1小时，约1小时至约2小时，约1小时至约4小时，约1小时至约6小时，约1小时至约8小时，约1小时至约12小时，约1小时至约24小时，约2小时至约24小时，约6小时至约7小时，约6小时至约24小时，约8小时至约24小时，约10小时至约24小时，约15小时至约24小时，约20小时至约24小时，约12小时至约48小时，约24小时至约48小时，或约36小时至约48小时。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂与所述免疫细胞接触和/或孵育约1分钟，约5分钟，约10分钟，约15分钟，约20分钟，约30分钟，约40分钟，约50分钟，约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约12小时，约14小时，约16小时，约18小时，约20小时，约22小时，或约24小时。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂与所述免疫细胞接触和/或孵育约1天至约7天，约2天至约7天，约3天至约7天，约4天至约7天，约5天至约7天，或约6天至约7天。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂与所述免疫细胞接触和/或孵育约7天至约14天，约14天至约21天，或约21天至约28天。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂与所述免疫细胞接触和/或孵育约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，或约14天。
在一些实施方案，所述免疫细胞或包含所述免疫细胞的细胞群在合适的条件下孵育以诱导所述免疫细胞增殖、扩增、活化和/或存活。孵育期间的合适条件包括但不限于使用细胞培养基、温度、孵育时间、刺激剂(例如，抗CD3和/或抗CD28抗体)的存在情况、以及任何其他有益药剂(例如生长因子类、细胞因子类、趋化因子类、和/或重组可溶性受体类)的存在情况中的一种或多种。
在一些实施方案，诱导免疫细胞增殖、扩增、活化和/或存活的合适条件包括提供包含能够活化所述免疫细胞(例如，NK细胞)的药剂的刺激条件。譬如，诱导T细胞增殖、扩增、活化和/或存活的合适条件包括提供刺激条件，所述刺激条件包含能够激活T细胞中的细胞内信号传导的药剂。T细胞的完全活化通常需要T细胞受体识别抗原(本发明称为“TCR”(信号1))以及共刺激物例如CD28(信号2)的识别。在一些案例中，一种或多种药剂开启或启动T细胞中TCR复合物介导的细胞内信号级联反应。例如，第一药剂可结合TCR复合物的组分以使T细胞活化，第二药剂可结合T细胞表面上的共刺激分子从而刺激所述经活化的T细胞。在一些实施方案，第一药剂通过与CD3特异性结合来刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号(例如，抗CD3抗体)。在进一步的实施方案中，T细胞表面上的共刺激分子可以是CD28，并且第二药剂与CD28特异性结合(例如，抗CD28抗体)。此类药剂包括但不限于抗体类、二价抗体片段类、和结合分子类，例如对TCR复合物组分具有特异性的那些(例如，抗CD3抗体)和/或对共刺激受体具有特异性的那些(例如，抗CD28抗体)。在一些实施方案，与CD3特异性结合的药剂是抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段(例如(Fab)2′片段或二价scFv片段)、抗CD3抗体的一价抗体片段(例如，Fab片段、Fv片段或scFv片段)、或CD3结合分子(例如，适体)。在一些实施方案，与CD28特异性结合的药剂是抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段(例如(Fab)2′片段或二价scFv片段)、抗CD28抗体的一价抗体片段(例如，Fab片段、Fv片段或scFv片段)、或CD28结合分子(例如，适体)。譬如，本发明提供的一种或多种试剂(例如，抗CD3抗体和抗CD28抗体)可与固体支持物(例如珠粒)结合，或与抗Fc抗体交联。在一些实施方案，扩增方法步骤还可包含向培养基中加入抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案，添加至细胞培养基中的刺激剂包括一种或多种细胞因子，例如但不限于IL-2、IL-7、IL-15和IL-21中的一种或多种。譬如，可以至少约10单位/mL的浓度将IL-2添加至包含所述免疫细胞和药剂(例如，抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)的细胞培养基中。
在一些实施方案，诱导T细胞增殖、扩增、活化和/或存活的合适条件包括提供能够通过T细胞受体(TCR)复合物激活细胞内信号传导的刺激条件或药剂，以及如本发明所述的Cbl-b抑制剂。在一些实施方案，将所述免疫细胞或包含所述免疫细胞的细胞群与通过特异性结合CD3来刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号的第一药剂(例如，抗CD3抗体)一同孵育。在进一步的实施方案中，将所述免疫细胞或包含所述免疫细胞的细胞群与通过特异性结合CD3来刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号的第一药剂(例如，抗CD3抗体)，与共刺激分子CD28结合的第二药剂(例如，抗CD28抗体)，以及与浓度为约1pM至约100μM(例如，约0.3μM、约1μM、或约4μM)的Cbl-b抑制剂一同孵育。在一些实施方案，当存在Cbl-b抑制剂时诱导T细胞增殖、扩增、活化和/或存活的合适条件无需通过共刺激分子(例如，CD28)进行刺激。将T细胞与Cbl-b抑制剂或其组合物接触可绕过T细胞进入活化状态所需的共刺激的需求。在某些实施方案，所述免疫细胞或包含所述免疫细胞的细胞群与通过特异性结合CD3来刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号的第一药剂(例如，抗CD3抗体)，以及与浓度为约0.001μM至约1,000μM、约0.01μM至约100μM、约0.1μM至约10μM、或约0.1μM至约50μM(例如，约1μM或约8μM)的Cbl-b抑制剂一同孵育。
在调节免疫细胞活性的方法的一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，和调节T细胞活性包含增加的T细胞活化和/或增加的T细胞增殖。即使在与TCR复合物的组分结合的活化剂(例如，抗CD3抗体)存在下，以及在结合共刺激分子的刺激剂(例如，抗CD28抗体)存在下，本发明实施方案所涵盖的T细胞亦可处于耐受状态。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含在抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合存在下，使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，增加T细胞活化和/或增加T细胞增殖)无需经由共刺激CD28分子的刺激。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含在单独存在抗CD3抗体的情况下使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与一种或多种活化T细胞的药剂(例如，抗CD3抗体)接触，其中所述药剂不包括刺激CD28共刺激分子的药剂(例如，抗CD28抗体)。
在一些实施方案，所述免疫细胞是T细胞，和调节T细胞活性包含提高的T细胞活化和/或提高的T细胞增殖。譬如，诸如在存在活化T细胞的药剂(例如，抗CD3抗体)时，并且在一些进一步的实施方案中，在存在刺激T细胞的药剂(例如，抗CD28抗体)时，本发明实施方案所涵盖的T细胞可处于活化状态。使T细胞与Cbl-b抑制剂或其组合物接触可降低活化所需的阈值，因此在存在活化剂(例如，抗CD3抗体)和在一些进一步的实施方案中存在刺激剂(例如，抗CD28抗体)的情况下，可提高T细胞活化和/或增殖。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含在抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合存在下，使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，提高T细胞活化和/或提高T细胞增殖)无需经由共刺激CD28分子的刺激。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含在单独存在抗CD3抗体的情况下，使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，调节T细胞活性的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与一种或多种活化T细胞的药剂(例如，抗CD3抗体)接触。
在一些实施方案，所述免疫细胞是T细胞，和调节T细胞活性包含减少的T细胞功能障碍，包括减少的T细胞耗竭、降低的T细胞耐受性、和/或减少的T细胞失能。T细胞功能障碍的一般原理是本领域众所周知的(参见，例如Schietinger et al.,Trends Immunol.,35:51-60,2014)。免疫耐受是一个过程，其是免疫系统正常功能的一部分。抗原特异性免疫耐受性的特征是对抗原的应答性降低，这是由于先前暴露于所述抗原所致。当特定的淋巴细胞(如T细胞)遇到抗原时，淋巴细胞可能被活化，导致抗原特异性免疫应答，或者淋巴细胞(如T细胞)可能被灭活或消除，从而导致抗原特异性免疫耐受。在一些案例中，耐受性可由克隆失能、外周克隆缺失、T细胞抑制、和/或其他形式的抗原特异性耐受性引起。在一些实施方案，耐受性可由失能的诱导产生或以失能的诱导为特征。在一些案例中，失能可由在无共刺激的情况下将T细胞暴露于抗原引起。在无共刺激信号的情况下，单独通过TCR延长抗原识别可能会导致失能(即功能性无应答)。失能T细胞可能对随后的抗原攻击具有抵抗力，并且可能能够抑制其他免疫应答。通常，在自然环境中，耐受性涉及对自身抗原的非反应性或非生成性反应。然而，在某些情况下，可诱导对“非自身”抗原的耐受性。因此，在一些案例中，识别外周组织中自身抗原的成熟T细胞无法随后对这些抗原作出应答的相同机制亦可能调节对外来或“非自身”抗原(例如，癌症细胞表达的抗原)的无应答。因此，即使在刺激剂(例如，与共刺激分子如CD28结合的药剂)存在下，本发明实施方案所涵盖的T细胞亦可处于耐受状态。将T细胞与本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物接触可绕过T细胞功能障碍(例如T细胞耐受性、T细胞失能、和/或T细胞耗竭)的某些方面。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，降低T细胞耐受性、降低T细胞失能、和/或减少T细胞耗竭)的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在本发明方法的一些实施方案中，调节T细胞活性(例如，降低T细胞耐受性、降低T细胞失能、和/或减少T细胞耗竭)包含使T细胞在抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合存在下与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在本发明方法的一些实施方案中，调节T细胞活性(例如，降低T细胞耐受性、降低T细胞失能、和/或减少T细胞耗竭)的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与抗CD3抗体和抗CD28抗体的组合接触。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，降低T细胞耐受性、降低T细胞失能、和/或减少T细胞耗竭)无需经由共刺激CD28分子的刺激。在本发明方法的一些实施方案中，调节T细胞活性(例如，降低T细胞耐受性、降低T细胞失能、和/或减少T细胞耗竭)的方法包含使T细胞在单独的抗CD3抗体存在下与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，降低T细胞耐受性、降低T细胞失能、和/或减少T细胞耗竭)的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与一种或多种活化T细胞的药剂(例如，单独的抗CD3抗体)接触。
T细胞活化和T细胞耐受性均是调节免疫应答的严格控制过程。因此，本发明提供了调节T细胞活性的方法，其中调节T细胞活性包含增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭、和/或降低的T细胞耐受性。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭、和/或降低的T细胞耐受性)的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在本发明方法的一些实施方案中，调节T细胞活性(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭、和/或降低T细胞耐受性)包含使T细胞在抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合存在下与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在本发明方法的一些实施方案中，调节T细胞活性(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭、和/或降低T细胞耐受性)的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭、和/或降低T细胞耐受性)无需经由共刺激CD28分子的刺激。在本发明方法的一些实施方案中，调节T细胞活性(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭、和/或降低T细胞耐受性)的方法包含使T细胞在单独的抗CD3抗体存在下与有效量的本本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，调节T细胞活性(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭、和/或降低T细胞耐受性)的方法包含使T细胞与有效量的Cbl-b抑制剂或其组合物接触，其中所述T细胞先前已与一种或多种活化T细胞的药剂(例如，抗CD3抗体)接触。
在本发明方法的一些实施方案中，增加的T细胞活化包含增加来自所述经活化的T细胞微环境中的T细胞或周围免疫细胞(例如，髓系细胞)的一种或多种细胞因子的生成。在一些实施方案，所述一种或多种细胞因子包括但不限于：IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-18、TNFα和GM-CSF。在一些实施方案，所述细胞因子是以下中的一种或多种：IL-2、IFN-γ、TNFα和GM-CSF。在一些实施方案，所述细胞因子是趋化因子。在一些实施方案，所述一种或多种趋化因子包括但不限于：IP-10、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、GROα、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1和MCP-3。细胞因子表达增加可通过ELISA进行测定。
在本发明方法的一些实施方案中，增加的T细胞活化包含增加一种或多种T细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种T细胞活化标志物包括但不限于：CD25、CD44、CD62L、CD69、CD152(CTLA4)、CD154、CD137和CD279。在一些实施方案，所述T细胞活化标志物是以下中的一种或多种：CD25、CD69和CTLA4。细胞表面标志物的表达增加可通过FACS进行测定。
用于实验测定增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭和/或降低的T细胞耐受性的方法均是本领域众所周知的。在一些实施方案，测定T细胞活化的代表性方法可在本发明提供的生物学实施例2中获悉。在一些实施方案，测定增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭和/或降低的T细胞耐受性的代表性体外和体内方法均可在本发明提供的生物学实施例3中获悉。
在调节免疫细胞活性的方法的一些实施方案中，免疫细胞是B细胞，和调节B细胞活性包含增加的B细胞活化。在一些实施方案，增加的B细胞活化包含增加一种或多种B细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种B细胞活化标志物包括但不限于：CD69、CD86和MHC II类(例如，HLA-DR)。在一些实施方案，B细胞活化标志物是CD69。细胞表面标志物的表达增加可通过FACS进行测定。在一些实施方案，增加的B细胞活化包含增加信号通路(例如，由ERK、JNK和Syk介导的那些)中蛋白质的活化。可通过使用试剂(例如，本领域可获得的抗磷酸化抗体)测定蛋白质上的磷酸化水平来检测所述蛋白质的增加活化。
在调节免疫细胞活性的方法的一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞，和调节NK细胞活性包含增加的NK细胞活化。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含一种或多种细胞因子的分泌。在一些实施方案，所述一种或多种细胞因子包括但不限于：IFN-γ、TNFα和MIP-1β。增加的细胞因子表达可通过ELISA进行测定。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含增加一种或多种NK细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种NK细胞活化标志物包括但不限于：CD69和CD107a。细胞表面标志物的表达增加可通过FACS进行测定。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包括增加对靶细胞(例如，肿瘤细胞，包括原发性肿瘤细胞，以及细胞系衍生的肿瘤细胞，例如K562细胞系)的杀伤。
用于实验测定增加的B细胞活化及增加的NK细胞活化的方法均是本领域公知的(参见，例如Fauriat et al.,Blood.115:2167-76,2010；Beano et al.,J.Transl.Med.,6:25 2008；Claus et al.,J.Immunol.Methods,341:154-64,2009；和Fujisaki et al.,Cancer Res.69:4010-4017,2009)。在一些实施方案，测定B细胞活化的代表性方法可在本发明提供的生物学实施例3中获悉。在一些实施方案，测定NK细胞活化的代表性方法可在本发明提供的生物学实施例3中获悉。
免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)的活性调节可通过测定目的参数(例如，细胞因子分泌)的基线值来测定。譬如，T细胞活化，例如从与Cbl-b抑制剂接触的细胞的体外实验获得的样品中的T细胞活化，可在接触或施用所述Cbl-b抑制剂之前进行测定，以确定基线值。然后在接触或施用所述Cbl-b抑制剂后获得T细胞活化的参考值。将参考值与基线值进行比较以确定由于接触或施用所述Cbl-b抑制剂或其组合物而引起的T细胞活化的量。譬如，在一些实施方案，与基线值相比，样品中的免疫细胞(例如，T细胞)活化增加至少0.1倍，其中在使所述免疫细胞(例如，T细胞)与Cbl-b抑制剂或其组合物接触之前获得基线值。在一些实施方案，免疫细胞(例如，T细胞)活化比基线值增加至少约0.1倍、约0.2倍、约0.3倍、约0.4倍、约0.5倍、约0.6倍、约0.7倍、约0.8倍、约0.9倍、约1倍、约2倍、约4倍、约6倍、约8倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约75倍、或约100倍(例如，约0.1倍至约100倍，或约1倍至约100倍)。免疫细胞活化可通过测定活化的生物标志物例如细胞因子分泌增加、活化标志物(例如，细胞表面标志物)的细胞表面表达增加、或下游信号通路中蛋白质的磷酸化增加来评估。可针对被测试的参数以及免疫细胞被处理的条件来确定指示免疫细胞活化的相对于基线值的倍数。譬如，为了测定T细胞活化，可由用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得基线值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。然后由用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得参考值，其中所述T细胞已经与Cbl-b抑制剂接触或与Cbl-b抑制剂接触。然后可通过所获得的参考值来确定免疫细胞活化的阳性反应。可获得类似的参考值测定值并将其与用于评估T细胞活化、T细胞增殖、T细胞耗竭、T细胞耐受性、B细胞活化、和/或NK细胞活化的基线值进行比较。可利用本领域众所周知的技术以及生物学实施例2和生物学实施例3中提供的技术获得所述这些参数的测定值。
如本发明所用，术语“基线”或“基线值”可指在施用本发明公开的治疗剂(例如，包含本发明所述的Cbl-b抑制剂的组合物)之前或在施用所述治疗剂开始时的测定值或表征。可将基线值与参考值进行比较以确定免疫细胞功能的增加或减少(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭、和/或降低T细胞耐受性)。如本发明所用，术语“参考”或“参考值”可指在施用本发明公开的治疗剂(例如，包含本发明所述的Cbl-b抑制剂的组合物)之后的测定值或表征。参考值可在实验时间进程、剂量方案或治疗周期期间或在实验时间进程、剂量方案或治疗周期完成时测定一次或多次。“参考值”可以是绝对值、相对值、具有上限和/或下限的值、值范围、平均值、中值、平均值、或与基线值相比的值。同理，“基线值”可以是绝对值、相对值、具有上限和/或下限的值、值范围、平均值、中值、平均值、或与参考值相比的值。参考值和/或基线值可得自一个样品(例如，从个体获得的一个样品)、两个不同的样品(例如，从两个不同的个体获得的样品)、或一组样品(例如，从一组两个、三个、四个、五个或更多个体获得的样品)。
在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)的基线值的至少2.5倍。在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)的基线值的至少1.3倍。在一些实施方案，可从单独用抗CD3抗体刺激的T细胞获得基线值，其中所述细胞不与Cbl-b抑制剂一同孵育。在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下单独用抗CD3抗体刺激的T细胞的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从单独用抗CD3抗体刺激的T细胞获得的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)的基线值的至少0.1倍。在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下单独用抗CD3抗体刺激的T细胞的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从单独用抗CD3抗体刺激的T细胞获得的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)的基线值的至少0.6倍。
在一些案例中，本发明提供了生成经修饰的免疫细胞的方法，其包含在有效量的本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物存在下，培养含有免疫细胞的细胞群以调节免疫细胞活性，从而生成所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、或自然杀伤(NK)细胞。
在用于生成经修饰的免疫细胞的方法的一些实施方案中，待修饰的免疫细胞是选自由以下组成的组的细胞：造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、和NK细胞。在一些实施方案，所述方法进一步包含用刺激剂例如细胞因子或结合由免疫细胞表达的活化蛋白的抗体(例如，抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)培养所述免疫细胞。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞是在包含所述免疫细胞的细胞群中，其中所述细胞群作为来自个体的样本而获得。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞是在包含所述免疫细胞的细胞群中，其中所述细胞群是通过培养来自个体的生物样本(例如，血液样本、骨髓样本等)而获得。在一些实施方案，所述免疫细胞通过将包含免疫细胞的细胞群与Cbl-b抑制剂或其组合物接触进行修饰，从而生成经修饰的免疫细胞。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞是选自由以下组成的组的细胞：造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、和NK细胞。在一些实施方案，所述免疫细胞是与所述经修饰的免疫细胞相同的细胞类型。例如，所述免疫细胞可以是灭活的T细胞，而所述经修饰的免疫细胞可以是活化的T细胞。在一些实施方案，所述免疫细胞是与所述经修饰的免疫细胞不同的细胞类型。例如，所述免疫细胞可以是造血干细胞，而所述经修饰的免疫细胞可以是从所述造血干细胞分化的NK细胞。在生成经修饰的免疫细胞的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包含回收所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案，包含所述免疫细胞的细胞群、所述免疫细胞或所述经修饰的免疫细胞均来自个体(例如，人)。在一些实施方案，所述免疫细胞或所述经修饰的免疫细胞分别是人免疫细胞或人经修饰的免疫细胞。
本发明进一步提供了通过本发明描述的任一方法生成的经修饰的免疫细胞，例如在有效量的Cbl-b抑制剂存在下培养包含免疫细胞的细胞群以调节免疫细胞活性，从而生成所述经修饰的免疫细胞。
在一些实施方案，本发明提供的Cbl-b抑制剂是细胞膜可渗透的。因此，在一些实施方案，本发明提供的经修饰的免疫细胞可包含本发明所述的Cbl-b抑制剂，例如在所述经修饰的免疫细胞的细胞质中包含本发明所述的Cbl-b抑制剂。
在一些案例中，本发明提供了分离的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞已与本发明所述的Cbl-b抑制剂或其组合物接触或与本发明所述的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞是T细胞、B细胞、或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞是造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、或NK细胞。
在所述分离的经修饰的免疫细胞的一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞是T细胞，和所述T细胞表现出增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭、和/或降低的T细胞耐受性。在一些实施方案，增加的T细胞活化包含增加来自所述活化的T细胞微环境中的T细胞或周围免疫细胞(例如，髓系细胞)的一种或多种细胞因子的生成。在一些实施方案，所述一种或多种细胞因子包括但不限于：IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-18、TNFα和GM-CSF。在一些实施方案，所述一种或多种细胞因子是以下中的一种或多种：IL-2、IFN-γ、TNFα和GM-CSF。在一些实施方案，所述细胞因子是趋化因子。在一些实施方案，所述一种或多种趋化因子包括但不限于：IP-10、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、GROα、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1和MCP-3。在一些实施方案，增加的T细胞活化包含增加一种或多种T细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种T细胞活化标志物包括但不限于：CD25、CD44、CD62L、CD69、CD152(CTLA4)、CD154、CD137和CD279。在一些实施方案，所述一种或多种T细胞活化标志物包括但不限于：CD25、CD69和CTLA4。在一些实施方案，所述T细胞活化标志物是CD25和/或CD69。在一些实施方案，所述T细胞已与抗CD3抗体接触或与抗CD3抗体接触。在一些实施方案，所述T细胞已与抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触或与抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触。
在所述分离的经修饰的免疫细胞的一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞是NK细胞，和所述NK细胞表现出增加的NK细胞活化。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含一种或多种细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα和/或MIP-1β)的分泌增加。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含一种或多种NK细胞活化标志物(例如，CD69和/或CD107a)的细胞表面表达增加。
在所述分离的经修饰的免疫细胞的一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞是B细胞，和所述B细胞表现出增加的B细胞活化。在一些实施方案，增加的B细胞活化包含一种或多种B细胞活化标志物(例如，CD69、CD86和/或HLA-DR)的细胞表面表达增加。
在本发明提供的方法或经修饰的免疫细胞的任何实施方案的一些中，所述免疫细胞或经修饰的免疫细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞)。在一些实施方案，所述免疫细胞或经修饰的免疫细胞是人细胞。
在一些案例中，孵育是根据诸如美国专利号6,040,177；Klebanoff et al.,JImmunother.,35:651-660,2012；Terakura et al.,Blood,119:72-82,2012；和Wang etal.,J Immunother.,35:689-701,2012中描述的那些技术进行。
可将本发明提供的待修饰的免疫细胞或经修饰的免疫细胞工程化以表达重组嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案，CAR从其N端到C端包含：细胞外配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域、及活化细胞质信号传导结构域。在一些实施方案，CAR从其N端到C端包含：细胞外配体结合结构域、跨膜结构域、及活化细胞质信号传导结构域。所述免疫细胞可进行工程化以在与本发明提供的Cbl-b抑制剂接触之前、期间或之后表达重组嵌合受体(例如，CAR)。在一些实施方案，待修饰的免疫细胞是T细胞(例如，CD4+T细胞或CD8+T细胞)。在进一步的实施方案中，T细胞包含重组嵌合受体，例如CAR。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞是经修饰的T细胞(例如，CD4+T细胞或CD8+T细胞)。在进一步的实施方案中，所述经修饰的T细胞包含重组嵌合受体，例如CAR。生成表达重组嵌合受体的免疫细胞的方法均是本领域众所周知的，例如通过载体(例如，病毒载体)将编码所述重组嵌合受体(例如，CAR)的核酸引入免疫细胞(例如，T细胞)。参见，例如国际专利申请号WO2017/096329和美国公开号US 2017/0204372。
特别地，本发明提供了生成经扩增的淋巴细胞群体的方法，所述方法包含：(a)从患有癌症的个体获得包含淋巴细胞的生物样品，其中所述个体已经接受或正在接受有效量的作为单药疗法或作为联合疗法的一部分的Cbl-b抑制剂，和(b)在包含至少一种T细胞生长因子的细胞培养基中培养淋巴细胞以生成经扩增的淋巴细胞群体。在一些实施方案，所述淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案，所述淋巴细胞是已经分离自或分离自患有癌症的哺乳动物受试者的肿瘤的TIL。在其他实施方案，所述淋巴细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案，所述至少一种T细胞生长因子包含由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组中的一种或多种，任选地其中所述至少一种T细胞生长因子包含IL-2。在一些实施方案，所述细胞培养基进一步包含抗CD3抗体，或抗CD3抗体和抗CD28抗体两者。在一些实施方案，所述细胞培养基进一步包含Cbl-b抑制剂。在一些实施方案，所述细胞培养基进一步包含经辐照的饲养细胞。在一些实施方案，所述个体是人患者。本发明还提供了包含通过上述方法生成的经扩增的TIL群体以及生理学上可接受的缓冲液的组合物。
在一些实施方案，分离和处理待修饰或已经修饰的免疫细胞(即，经修饰的免疫细胞)的方法包括在分离、孵育(例如，与Cbl-b抑制剂孵育)和/或工程化(例如，将编码重组嵌合受体的核酸引入免疫细胞)之前或之后，冷冻(例如，冷冻保存)所述细胞的步骤。可使用本领域已知的多种冷冻溶液和参数。
B.过继细胞疗法
所述经修饰的免疫细胞，例如通过本发明所述的方法生成的经扩增的淋巴细胞群体或其组合物，可用作治疗有需要的个体(例如，患有癌症的个体)的方法中的治疗剂。此类治疗方法包括过继细胞疗法。在一些实施方案，治疗方法包括从个体分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程化，如本发明所述，并在冷冻保存之前或之后将其重新引入同一个体。在一些实施方案，治疗方法包括从个体分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程化，如本发明所述，并在冷冻保存之前或之后将其重新引入不同的个体。
因此，在一些案例中，本发明提供了在个体中调节免疫应答的方法，所述方法包含将有效量的本发明所述的经修饰的免疫细胞或其组合物施用于有需要的个体(例如，患有T细胞功能障碍的个体)。在一些实施方案，所述个体患有癌症。在一些实施方案，本发明提供了治疗对Cbl-b活性抑制有应答的癌症的方法，所述方法包含向患有对Cbl-b活性抑制有应答的所述癌症的个体施用有效量的本发明所述的经修饰的免疫细胞或其组合物。在一些实施方案，本发明提供了抑制异常细胞增殖的方法，所述方法包含向有需要的个体施用有效量的本发明所述的经修饰的免疫细胞或其组合物。如本发明所用，术语“异常细胞增殖”包括增生或癌细胞增殖。癌细胞可源自血液学癌症，例如淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。在其他实施方案，癌细胞可源自非血液学癌症，例如肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
在某些实施方案，向需要治疗的个体(例如患有癌症或T细胞功能障碍的个体)施用组合物，所述组合物包含范围为约100万至约1000亿个细胞，例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或由上述任意两个值定义的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由上述任意两个值定义的范围)，和在一些情况下，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)，或所述这些范围之间的任意值的本发明提供的经修饰的免疫细胞。
所述经修饰的免疫细胞及其组合物可使用标准给药技术、制剂和/或装置进行施用。本发明提供了用于所述组合物的储存和给药的制剂和装置，例如注射器和小瓶。包含所述经修饰的免疫细胞的制剂或药物组合物包括用于静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内给药的那些。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞经肠胃外进行给药。如本发明所用，术语“肠胃外”包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下和腹腔内给药。在一些实施方案，使用通过静脉内、腹腔内或皮下注射的外周全身递送将所述细胞群施用于受试者。所述经修饰的免疫细胞的组合物可作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液、或粘性组合物，其在一些案例中可缓冲至选定的pH值。粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织的更长接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可通过将所述经修饰的免疫细胞掺入溶剂中来制备无菌可注射溶液，例如与合适的载体、稀释剂或辅料(例如，无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖、或其类似物)混合。
在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞与一种或多种附加治疗剂或连同另一种治疗干预，同时或以任何顺序依次共同施用。譬如，在本发明的一些治疗方案中，将所述经修饰的免疫细胞和Cbl-b抑制剂两者施用于有需要的哺乳动物受试者，其中所述Cbl-b抑制剂是式(I)、(I-a)、(I-A)-(I-J)、(II-A)-(II-H)、(II-A-1)-(II-H-1)、(III-A)-(III-H)、(III-A-1)-(III-H-1)、(IV-A)-(IV-J)、或(IV-C-1)-(IV-J-1)所示化合物、或其任何变体。因此，在一些实施方案，所述治疗方案包含过继细胞疗法和化学疗法两者。
在将所述经修饰的免疫细胞施用于个体(例如，人)之后，可通过本领域已知的方法测定所述经修饰的免疫细胞群的生物活性。要评估的参数包括经修饰的免疫细胞或其他免疫细胞在体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)与抗原的特异性结合。在一些实施方案，可使用细胞毒性测定法来测定经修饰的免疫细胞破坏靶细胞的能力(参见，例如Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32:689-702,2009；和Herman etal.,J.Immunological Methods,285:25-40,2004)。在一些实施方案，还可通过测定某些细胞因子(例如，IL-2和IFNγ)的表达和/或分泌来测定所述经修饰的免疫细胞的生物活性。
C.Cbl-b抑制剂的给药
在一些案例中，Cbl-b抑制剂或其组合物可直接施用于个体以调节免疫应答、治疗疾病或病症(例如，癌症和/或异常细胞增殖)和/或抑制个体的Cbl-b活性。Cbl-b抑制剂可以是表1所示化合物、其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案，本发明提供了调节免疫应答的方法，所述方法包含向个体施用有效量的本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物以调节所述个体的免疫应答。在一些实施方案，所述个体患有癌症，例如本发明所述的血液学癌症或非血液学癌症。
在一些实施方案，本发明提供了治疗对Cbl-b活性抑制有应答的癌症的方法，所述方法包含向个体施用有效量的本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物以治疗对Cbl-b活性抑制有应答的癌症。在一些实施方案，所述癌症是本发明所述的血液学癌症或非血液学癌症。
在一些实施方案，本发明提供了抑制异常细胞增殖(例如，增生)的方法，所述方法包含向个体施用有效量的本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物以抑制所述个体异常细胞增殖。
在一些实施方案，本发明提供了抑制Cbl-b活性的方法，所述方法包含向个体施用有效量的本发明提供的Cbl-b抑制剂或其组合物以抑制所述个体的Cbl-b活性。
在一些实施方案，例如在调节有需要的个体(例如，患有T细胞功能障碍的个体)免疫应答，治疗个体疾病或病症(例如，个体癌症和/或异常细胞增殖)，和/或抑制个体的Cbl-b活性中，活性剂的适当剂量将取决于待治疗的病况、疾病或病症的类型(如上文所定义)，所述病况、疾病或病症的严重程度和病程，无论施用药剂是为了预防还是治疗目的，既往治疗，受试者的临床病史及对Cbl-b抑制剂的应答，以及主治医师的判断力。
Cbl-b抑制剂或其组合物一次或在一系列治疗中适当地施用于个体。在一些实施方案，所述治疗包括多次施用Cbl-b抑制剂或其组合物，其中施用之间的间隔可以变化。譬如，第一次施用和第二次施用之间的间隔为约1个月，后续施用之间的间隔为约3个月。在一些实施方案，Cbl-b抑制剂以固定剂量施用。在一些实施方案，Cbl-b抑制剂以基于个体体重的固定剂量(例如，mg/kg)施用于个体。
在本发明的一些案例中，所述癌症是血液学癌症。譬如，所述血液学癌症可以是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。在本发明的其他案例中，所述癌症是非血液学癌症。尤其是，所述非血液学癌症可以是癌(carcinoma)、肉瘤、或黑素瘤。
在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂与一种或多种附加治疗剂或连同另一种治疗干预，同时或以任何顺序依次共同施用。譬如，在本发明的一些治疗方案中，将所述Cbl-b抑制剂和经修饰的免疫细胞两者施用于有需要的哺乳动物受试者，其中所述Cbl-b抑制剂是式(I)、(I-a)、(I-A)-(I-J)、(II-A)-(II-H)、(II-A-1)-(II-H-1)、(III-A)-(III-H)、(III-A-1)-(III-H-1)、(IV-A)-(IV-J)、或(IV-C-1)-(IV-J-1)所示化合物、或其任何变体。所述Cbl-b抑制剂可以是表1所示化合物、其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐。因此，在一些实施方案，所述治疗方案包含过继细胞疗法和化学疗法两者。
在一些实施方案，本发明方法(例如，调节个体免疫应答的方法)中施用Cbl-b抑制剂的有效性可通过测定分离自受治疗个体的样本(例如，血液样本)中存在的免疫细胞的生物活性来评估。譬如，可测定在细胞毒性测定法中采用Cbl-b抑制剂治疗后分离自个体的免疫细胞破坏靶细胞的能力来评估治疗功效。在一些实施方案，样本(例如，血液样本)中存在的免疫细胞的生物活性可通过测定某些细胞因子(例如，IL-2和IFNγ)的表达和/或分泌来测定。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的附加治疗剂。本发明还提供了治疗患有癌症的个体的方法，其包含：向所述个体施用有效量的Cbl-b抑制剂；和向所述个体施用有效量的附加治疗剂。此外，本发明提供了增加抗癌免疫应答的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的附加治疗剂。本发明还提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，其中所述个体已经接受或正在接受有效量的附加治疗剂。
在前述段落的方法的一些实施方案中，所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂以任一顺序相继施用。如本发明所用，术语“相继地”、“连续地”和“顺序地”是指在施用附加治疗剂之后施用Cbl-b抑制剂，或在施用所述Cbl-b抑制剂之后施用所述附加治疗剂。例如，相继施用可包括在诱导期(首发治疗)期间在不存在附加治疗剂的情况下施用Cbl-b抑制剂，随后是包含施用附加治疗剂的诱导后治疗期。所述方法可进一步包含维持阶段，包含施用所述Cbl-b抑制剂或所述附加治疗剂。或者，相继施用可包括在诱导期(首发治疗)期间在不存在Cbl-b抑制剂的情况下施用附加治疗剂，随后是包含施用所述Cbl-b抑制剂的诱导后治疗期。所述方法可进一步包含维持阶段，包含施用所述Cbl-b抑制剂或所述附加治疗剂。
在联合治疗方法的一些实施方案中，所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂同时施用。如本发明所用，术语“同时”、“并举”和“并行”是指在同一医生就诊期间或在同一治疗阶段期间施用Cbl-b抑制剂和附加治疗剂。譬如，可在诱导期、治疗期和维持期中的一个或多个期间施用所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂。然而，同时施用无需所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂一同存在于单一制剂或药物组合物中，或者无需所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂精确地在同一时间施用。
1.包含Cbl-b抑制剂和免疫检查点抑制剂的联合疗法
在本发明的联合治疗方法的一些实施方案中，所述附加治疗剂包含免疫检查点抑制剂。在本发明的用于治疗癌症的联合治疗方法的一些实施方案中，所述附加治疗剂包含免疫检查点抑制剂。术语“免疫检查点”是指阻止免疫细胞活化的信号通路，而术语“免疫检查点抑制剂”是指阻碍免疫检查点以解除对免疫细胞活化的制动的化合物。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂是至少一种抑制性检查点分子的拮抗剂。在一些实施方案，所述抑制性检查点分子是选自由以下组成的组：PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD125)、LAG3(CD223)、PVR(CD155)、PVRL2(CD112)、PVRL3(CD113)、TIGIT、TIM3(CD366)、和VISTA。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂是至少一种抑制性检查点分子的拮抗剂，所述至少一种抑制性检查点分子选自由PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)和CTLA-4(CD152)组成的组。
PD-1是指程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)。适用于本发明治疗方法、药物及用途的PD-1拮抗剂包括阻断在癌细胞或抗原呈递细胞上表达的PD-L1与在淋巴细胞(T细胞、B细胞和/或NK细胞)上表达的PD-1结合的任何化学化合物或生物分子。PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：对于PD-1有CD279、PDCD1、PD1和SLEB2；和对于程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)有CD274、PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4和B7-H。在治疗人类受试者的一些实施方案中，所述PD-1拮抗剂阻断人PD-L1与人PD-1的结合。成熟形式的人PD-1的氨基酸序列如NCBI基因座编号NP_005009中的残基21-288所示。成熟形式的人PD-L1的氨基酸序列如NCBI基因座编号NP_054862中的残基19-290所示。
CTLA-4是指细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4。适用于本发明治疗方法、药物和用途的CTLA-4拮抗剂包括阻断在淋巴细胞(T细胞、B细胞和/或NK细胞)上表达的CTLA-4与在抗原呈递细胞上表达的配体(CD80和/或CD86)的结合。CTLA-4的替代名称或同义词包括：CD152、CTLA4、ALPS5、CELIAC3、GRD4、GSE和IDDM12。在治疗人类受试者的一些实施方案中，CTLA-4拮抗剂阻断人CTLA-4与人配体的结合。成熟形式的人CTLA-4的氨基酸序列如NCBI基因座编号NP_005205中的残基36-223所示。
LAG3是指淋巴细胞活化基因3蛋白。适用于本发明治疗方法、药物和用途的LAG3拮抗剂包括阻断在淋巴细胞(T细胞、B细胞和/或NK细胞)上表达的LAG3与在抗原呈递细胞上表达的配体(MHC II类)结合的任何化学化合物或生物分子。LAG3亦称为CD223。在治疗人类受试者的一些实施方案中，LAG3拮抗剂阻断人LAG3与人配体的结合。成熟形式的人LAG3的氨基酸序列如NCBI基因座编号NP_002277中的残基23-525所示。
PVR是指脊髓灰质炎病毒受体。适用于本发明治疗方法、药物和用途的PVR拮抗剂包括阻断在癌细胞或抗原呈递细胞上表达的PVR与在淋巴细胞(T细胞、B细胞、和/或NK细胞)上表达的TIGIT结合的任何化学化合物或生物分子。PVR的替代名称或同义词包括CD155、PVS、HVED、NECL5、粘连蛋白(nectin)样蛋白5和TAGE4。在治疗人类受试者的一些实施方案中，PVR拮抗剂阻断人PVR与人TIGIT的结合。人PVR有多种同种型。人PVR的α同种型的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_006496中示出。人PVR的β同种型的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_001129240中示出。人PVR的γ同种型的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_001129241中示出。人PVR的δ同种型的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_001129242中示出。
PVRL2是指脊髓灰质炎病毒受体相关2。适用于本发明治疗方法、药物和用途的PVRL2拮抗剂包括阻断在癌细胞或抗原呈递细胞上表达的PVRL2与在淋巴细胞(T细胞、B细胞和/或NK细胞)上表达的TIGIT结合的任何化学化合物或生物分子。PVRL2的替代名称或同义词包括：CD112、NECTIN2、HVEB、疱疹病毒侵入介质B、PRR2和PVRR2。在治疗人类受试者的一些实施方案中，PVRL2拮抗剂阻断人PVRL2与人TIGIT的结合。人PVRL2的α同种型的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_002847中示出。人PVRL2的δ同种型的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_001036189中示出。
PVRL3是指脊髓灰质炎病毒受体相关3。适用于本发明治疗方法、药物和用途的PVRL3拮抗剂包括阻断在癌细胞或抗原呈递细胞上表达的PVRL3与在淋巴细胞(T细胞、B细胞和/或NK细胞)上表达的TIGIT结合的任何化学化合物或生物分子。PVRL3的替代名称或同义词包括：CD113、NECTIN3、PRR3和PVRR3。在治疗人类受试者的一些实施方案中，PVRL3拮抗剂阻断人PVRL3与人TIGIT的结合。人PVRL3同种型1的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_056295中示出。人PVRL3的同种型2的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_001230215中示出。人PVRL3的同种型3的氨基酸序列在NCBI基因座编号NP_001230217中示出。
TIGIT是指具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体。适用于本发明治疗方法、药物和用途的TIGIT拮抗剂包括阻断在淋巴细胞(T细胞、B细胞或NK细胞)上表达的TIGIT与在癌细胞或抗原呈递细胞上表达的配体(CD112、CD113和/或CD155)结合的任何化学化合物或生物分子。TIGIT的替代名称或同义词包括：VSIG9、含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白9、VSTM3、含V-set和跨膜结构域蛋白3、以及华盛顿大学细胞粘附分子(WUCAM)。在治疗人类受试者的一些实施方案中，TIGIT拮抗剂阻断人TIGIT与人配体的结合。成熟形式的人TIGIT的氨基酸序列如NCBI基因座编号：NP_776160中的残基22-244所示。
TIM3是指T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3(T-cell immunoglobulin andmucin-domain containing-3protein)。适用于本发明治疗方法、药物和用途的TIM3拮抗剂包括阻断在淋巴细胞(T细胞、B细胞或NK细胞)上表达的TIM3与在抗原呈递细胞上表达的配体(半乳凝素-9(galectin-9)磷脂酰丝氨酸)结合的任何化学化合物或生物分子。TIM3的替代名称或同义词包括：CD366、HAVCR2、甲型肝炎病毒细胞受体2(hepatitis A viruscellular receptor 2)、KIM3和SPTCL。在治疗人类受试者的一些实施方案中，TIM3拮抗剂阻断人TIM3与人配体的结合。成熟形式的人TIM3的氨基酸序列如NCBI基因座编号NP_116171中的残基22-301所示。
VISTA是指T细胞活化的V结构域Ig抑制因子。适用于本发明治疗方法、药物和用途的VISTA拮抗剂包括阻断在淋巴细胞(T细胞、B细胞和/或NK细胞)上表达的VISTA与在癌细胞或抗原呈递细胞上表达的配体结合的任何化学化合物或生物分子。VISTA的替代名称或同义词包括：VSIR、V-set免疫调节受体、PD-1H、B7H5、GI24、PP2135、SISP1和Dies1。在治疗人类受试者的一些实施方案中，VISTA拮抗剂阻断人VISTA与人配体的结合。成熟形式的人VISTA的氨基酸序列如NCBI基因座编号：NP_071436中的残基33-311所示。
免疫检查点抑制剂可以是生物分子。例如，免疫检查点抑制剂可包含抗体或其抗原结合片段。所述抗体或片段可以是单克隆抗体(mAb)，例如人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体，并且可包括人恒定区。在一些实施方案，所述人恒定区选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4恒定区组成的组，并且在某些实施方案，所述人恒定区是IgGl或IgG4恒定区。在一些实施方案，所述抗体或片段是双特异性抗体。在一些实施方案，所述抗原结合片段包含由Fab、Fab'-SH、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组中的一种。
在一些实施方案，所述至少一种抑制性检查点分子包含PD-1。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂选自由派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、及其生物仿制药组成的组。在一个实施方案，所述抗PD-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)(MK-3475，由默克(Merck&Co.)以
Figure BDA0003470586280000671
进行销售)。在一个实施方案，所述抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558或MDX-1106，由百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)以
Figure BDA0003470586280000672
进行销售)。在一个实施方案，所述抗PD-1抗体是西米普利单抗(cemiplimab)(REGN2810，Regeneron)。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、或西米普利单抗(cemiplimab)的变体。
在一些实施方案，所述至少一种抑制性检查点分子包含PD-L1。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂选自由阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、及其生物仿制药组成的组。在一个实施方案，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)(由基因泰克(Genentech，Inc.)以
Figure BDA0003470586280000673
进行销售)。在一个实施方案，所述抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗(avelumab)(由默克雪兰诺(EMD Serono,Inc.)和辉瑞(Pfizer,Inc.)以
Figure BDA0003470586280000674
进行销售)。在一个实施方案，所述抗PD-L1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736，由阿斯利康(AstraZeneca)以
Figure BDA0003470586280000675
进行销售)。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂是阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、或德瓦鲁单抗(durvalumab)的变体。
在一些实施方案，所述至少一种抑制性检查点分子包含CTLA-4。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂选自由易普利姆玛(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、及其生物仿制药组成的组。在一个实施方案，所述抗CTLA4抗体是易普利姆玛(ipilimumab)(MDX-010或BMS-734016，由百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)以
Figure BDA0003470586280000676
进行销售)。在一个实施方案，抗CTLA4抗体是曲美木单抗(tremelimumab)(ticilimumab，CP-675,206，由阿斯利康(AstraZeneca)开发)。在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂是易普利姆玛(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)的变体。
在一些实施方案，所述单克隆抗体是“变体”抗体，其包含与“参比”抗体中的重链和轻链序列相同的重链和轻链序列，除了在位于轻链CDR外部的位置处具有3、2或1个保守氨基酸置换和/或在位于重链CDR外部的位置处具有6、5、4、3、2或1个保守氨基酸置换(例如，变体位置均位于框架区或恒定区)。换言之，所述参比抗体和所述变体抗体均包含相同的CDR序列，但由于在其全长轻链和重链序列中分别在不超过3个或6个其他位置处具有保守氨基酸置换而彼此不同。变体抗体在以下特性方面与参比抗体基本相同：对所述抑制性检查点分子的结合亲和力以及阻断所述抑制性检查点分子与其配体结合的能力。
在其他实施方案，所述免疫检查点抑制剂可包含免疫粘附素，所述免疫粘附素包含融合至恒定区(例如，免疫球蛋白分子的Fc区)的其配体之一的抑制性检查点分子结合结构域。
如本发明所用，术语“生物仿制药”或“生物类似药”是指与美国联邦药物管理局(FDA)批准的参比产品相似但在安全性和有效性方面无临床意义差异的生物产品。譬如，生物仿制药产品与参比产品之间在临床非活性成分方面可能存在差异(例如，制剂辅料的差异、糖基化的细微差异等)。可通过药代动力学和药效学研究来评估具有临床意义的特征。在一些实施方案，所述生物仿制药产品是由FDA确定的可互换产品。
2.包含Cbl-b抑制剂和抗肿瘤剂的联合疗法
在本发明的联合治疗方法的一些实施方案中，所述附加治疗剂包含抗肿瘤剂。在本发明的用于治疗癌症的联合治疗方法的一些实施方案中，所述附加治疗剂包含抗肿瘤剂。如本发明所用，术语“抗肿瘤剂”和“抗肿瘤药物”是指根据世界卫生组织开发的解剖治疗化学分类系统(ATC)代码L01进行分类的治疗剂。在一些实施方案，所述抗肿瘤剂被归类为由细胞毒性抗生素(ATC代码L01D)、植物生物碱(ATC代码L01C)、抗代谢物(ATC代码L01B)、烷化剂(ATC代码L01A)及其他抗肿瘤剂(ATC代码L01X)组成的组中的一种。在一些实施方案，所述抗肿瘤剂是小分子药物(例如，癌症化疗剂)，而非生物分子。
细胞毒性抗生素是适用于本发明治疗方法、药物和用途的抗肿瘤剂。在一些实施方案，所述细胞毒性抗生素选自由以下组成的组：伊沙匹隆(ixabepilone)、丝裂霉素(mitomycin)、普卡霉素(plicamycin)、博来霉素(bleomycin)、匹杉琼(pixantrone)、氨柔比星(amrubicin)、戊柔比星(valrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、表柔比星(epirubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、和更生霉素(dactinomycin)。
植物生物碱是适用于本发明治疗方法、药物和用途的抗肿瘤剂。在一些实施方案，所述植物生物碱选自由以下组成的组：曲贝替定(trabectedin)、卡巴他赛(cabazitaxel)、聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex)、多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、地美可辛(demecolcine)、替尼泊苷(teniposide)、依托泊苷(etoposide)、长春福肽(vintafolide)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、和长春花碱(vinblastine)。
抗代谢物是适用于本发明治疗方法、药物和用途的抗肿瘤剂。在一些实施方案，所述抗代谢物是嘧啶类似物、嘌呤类似物或叶酸类似物。在一些实施方案，所述抗代谢物选自由以下组成的组：氟尿苷(floxuridine)、三氟尿苷(trifluridine)、替加氟(tegafur)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、地西他滨(decitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、卡莫氟(carmofur)、替加氟(tegafur)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、奈拉滨(nelarabine)、氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、普拉曲沙(pralatrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、和甲氨蝶呤(methotrexate)。
烷化剂是可用于本发明治疗方法、药物和用途的合适抗肿瘤剂。在一些实施方案，所述烷化剂选自由以下组成的组：达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、哌泊溴烷(pipobroman)、二溴甘露醇(mitobronitol)、依托格鲁(etoglucid)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、雷莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、福莫司汀(fotemustine)、链脲佐菌素(streptozocin)、司莫司汀(semustine)、洛莫司汀(lomustine)、卡莫司汀(carmustine)、卡波醌(carboquone)、三亚胺醌(triaziquone)、噻替哌(thiotepa)、甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)、白消安(busulfan)、苯达莫司汀(bendamustine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
在其他实施方案，所述抗肿瘤剂包含选自由以下组成的组的其他抗肿瘤剂：铂化合物(ATC代码L01XA)、甲基肼(ATC代码L01XB)、敏化剂(ATC代码L01XD)、蛋白激酶抑制剂(ATC代码L01XE)、及其他抗肿瘤剂(ATC代码L01XA)。
铂化合物是可用于本发明治疗方法、药物和用途的合适抗肿瘤剂。在一些实施方案，所述铂化合物选自由以下组成的组：顺铂、卡铂、奥沙利铂、沙铂、和聚铂(polyplatillen)。
3.包含Cbl-b抑制剂和放射疗法的联合疗法
本发明提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的放射疗法。本发明还提供了治疗患有癌症的个体的方法，其包含：向所述个体施用有效量的Cbl-b，以及向所述个体施用有效量的放射疗法。此外，本发明提供了增加抗癌免疫应答的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的放射疗法。本发明还提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，其中所述个体已经接受或正在接受有效量的放射疗法。
在一些实施方案，所述放射疗法是外射束放射疗法。在其他实施方案，所述放射疗法是内照射疗法。在一些实施方案，所述放射疗法是消融性放射疗法。
在一些实施方案，本发明的联合疗法方案包含施用Cbl-b抑制剂、放射疗法、以及免疫检查点抑制剂和抗肿瘤剂中的一者或两者。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用包含有效量的Cbl-b抑制剂和有效量的癌症疫苗的联合疗法。本发明还提供了与癌症疫苗联合使用以治疗癌症的包含Cbl-b抑制剂的药物，以及包含Cbl-b抑制剂和癌症疫苗两者的用于治疗癌症的药物。本发明进一步提供了使用Cbl-b抑制剂在与癌症疫苗联合施用时在制备治疗个体癌症的药物中的用途。本发明进一步提供了使用Cbl-b抑制剂和癌症疫苗在制备治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂是“小分子”。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用包含有效量的Cbl-b抑制剂和有效量的溶瘤病毒的联合疗法。本发明还提供了与溶瘤病毒联合使用以治疗癌症的包含Cbl-b抑制剂的药物，以及包含Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒两者的用于治疗癌症的药物。本发明进一步提供了使用Cbl-b抑制剂在与溶瘤病毒联合施用时在制备治疗个体癌症的药物中的用途。本发明进一步提供了使用Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒在制备治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂是“小分子”。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，所述癌症是血液学癌症，例如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在本发明的治疗方法、药物和用途的其他实施方案中，所述癌症是非血液学癌症，例如肉瘤、癌(carcinoma)或黑素瘤。
血液学癌症包括但不限于一种或多种白血病，例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性粒细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学疾病，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、滤泡性小细胞淋巴瘤或滤泡性大细胞淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、和“白血病前期”，其均是由于髓系血细胞的无效生成(或发育不良)而联合起来的各种血液学疾病。
非血液学癌症包括但不限于，神经母细胞瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、胃癌、脑癌、肺癌(例如，NSCLC)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、肾上腺癌、和头颈癌。
在一些案例中，施用活化阈值降低剂或共刺激需求降低剂，例如Cbl-b抑制剂，在治疗癌症中的有效性通过评估临床结果(例如，肿瘤尺寸或肿瘤数量减少、和/或存活率)来测定。在一些实施方案，“治疗癌症”包含根据所述实体瘤的疗效评价标准(RECIST 1.1版)评估患者对治疗方案的反应(参见，例如Eisenhauer et al.,Eur J Cancer,45:228-247,2009；和Nishino et al.,Am J Roentgenol,195:281-289,2010)。根据RECIST 1.1确定目的抗肿瘤反应的疗效评价标准包括：完全缓解(CR)；部分缓解(PR)；疾病进展(PD)；和疾病稳定(SD)。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用联合疗法，所述联合疗法包含有效量的降低免疫细胞(例如，T细胞、B细胞和/或NK细胞)活化阈值的药剂(活化阈值降低剂)、以及有效量的癌症疫苗。本发明还提供了与癌症疫苗联合使用以治疗癌症的包含活化阈值降低剂的药物，以及包含活化阈值降低剂和癌症疫苗两者的用于治疗癌症的药物。本发明进一步提供了使用活化阈值降低剂在与癌症疫苗联合施用时在制备治疗个体癌症的药物中的用途。本发明进一步提供了使用活化阈值降低剂和癌症疫苗在制备治疗癌症的药物中的用途。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用联合疗法，所述联合疗法包含有效量的降低免疫细胞(例如，T细胞、B细胞和/或NK细胞)活化阈值的药剂(活化阈值降低剂)、以及有效量的溶瘤病毒。本发明还提供了与溶瘤病毒联合使用以治疗癌症的包含活化阈值降低剂的药物，以及包含活化阈值降低剂和溶瘤病毒两者的用于治疗癌症的药物。本发明进一步提供了使用活化阈值降低剂在与溶瘤病毒联合施用时在制备治疗个体癌症的药物中的用途。本发明进一步提供了使用活化阈值降低剂和溶瘤病毒在制备治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案，降低活化阈值的药剂(活化阈值降低剂)是降低免疫细胞(例如，T细胞、B细胞和/或NK细胞)的共刺激需求(共刺激需求降低剂)的药剂。在一些实施方案，降低活化阈值的药剂(活化阈值降低剂)是促进肿瘤免疫监视的药剂。在一些实施方案，降低活化阈值的药剂(活化阈值降低剂)是Cbl-b抑制剂。在一些实施方案，降低共刺激需求的药剂是Cbl-b抑制剂。在一些实施方案，促进肿瘤免疫监视的药剂是Cbl-b抑制剂。
在一些实施方案，活化阈值降低剂，例如Cbl-b抑制剂，能够增加T细胞活化和/或T细胞增殖。在一些实施方案，活化阈值降低剂，例如Cbl-b抑制剂，能够降低T细胞耗竭、T细胞耐受性和/或T细胞失能。
在一些实施方案，活化阈值降低剂，例如Cbl-b抑制剂，能够增加所述活化的T细胞微环境中的T细胞或周围免疫细胞(例如，髓系细胞)的一种或多种细胞因子的生成。在一些实施方案，所述一种或多种细胞因子包括但不限于：IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-18、TNFα和GM-CSF。在一些实施方案，所述细胞因子是以下中的一种或多种：IL-2、IFN-γ、TNFα和GM-CSF。在一些实施方案，所述细胞因子是趋化因子。在一些实施方案，所述一种或多种趋化因子包括但不限于：IP-10、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、GROα、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1和MCP-3。细胞因子表达增加可通过ELISA进行测定。
在一些实施方案，活化阈值降低剂，例如Cbl-b抑制剂，能够增加一种或多种T细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种T细胞活化标志物包括但不限于：CD25、CD44、CD62L、CD69、CD152(CTLA4)、CD154、CD137和CD279。在一些实施方案，所述T细胞活化标志物是以下中的一种或多种：CD25、CD69和CTLA4。细胞表面标志物的表达增加可通过FACS进行测定。
用于通过实验测定增加的T-细胞活化、增加的T-细胞增殖、减少的T-细胞耗竭和/或降低的T-细胞耐受性的方法均是本领域公知的。在一些实施方案，测定T细胞活化的代表性方法可在本发明提供的生物学实施例9和/或生物学实施例13中获悉。在一些实施方案，测定增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭和/或降低的T细胞耐受性的代表性体外和体内方法均可在生物学实施例10和/或生物学实施例14中获悉。
在一些实施方案，活化阈值降低剂，例如Cbl-b抑制剂，能够增加B细胞活化。在一些实施方案，增加的B细胞活化包含增加一种或多种B细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种B细胞活化标志物包括但不限于：CD69、CD86和MHC II类(例如，HLA-DR)。在一些实施方案，所述B细胞活化标志物是CD69。细胞表面标志物的表达增加可通过FACS进行测定。在一些实施方案，增加的B细胞活化包含信号通路(例如，由ERK、JNK和Syk介导的那些)中蛋白质活化增加。可通过使用试剂(例如本领域可获得的抗磷酸化抗体)测定蛋白质上的磷酸化水平来检测蛋白质活化的增加。
在一些实施方案，活化阈值降低剂，例如Cbl-b抑制剂，能够增加NK细胞活化。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含一种或多种细胞因子的分泌。在一些实施方案，所述一种或多种细胞因子包括但不限于：IFN-γ、TNFα和MIP-1β。细胞因子表达增加可通过ELISA进行测定。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含增加一种或多种NK细胞活化标志物的细胞表面表达。在一些实施方案，所述一种或多种NK细胞活化标志物包括但不限于：CD69和CD107a。细胞表面标志物的表达增加可通过FACS进行测定。在一些实施方案，增加的NK细胞活化包含增加对靶细胞例如肿瘤细胞(包括原发肿瘤细胞)和细胞系衍生的肿瘤细胞(例如K562细胞系)的杀伤。
用于通过实验测定增加的B细胞活化和NK细胞活化的方法均是本领域公知的。在一些实施方案，测定B细胞活化的代表性方法可在生物学实施例10和/或生物学实施例14中获悉。在一些实施方案，测定NK细胞活化的代表性方法可在生物学实施例10和/或生物学实施例14中获悉。
免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)的活性调节可通过测定目的参数(例如，细胞因子分泌)的基线值来测定。譬如，T细胞活化，例如从与Cbl-b抑制剂接触的细胞的体外实验获得的样本中的T细胞活化，可在接触或施用所述Cbl-b抑制剂之前进行测定，以确定基线值。然后在接触或施用所述Cbl-b抑制剂之后获得T细胞活化的参考值。将参考值与基线值进行比较以确定由于接触或施用所述Cbl-b抑制剂或其组合物而引起的T细胞活化的量。譬如，在一些实施方案，与基线值相比，样本中的免疫细胞(例如，T细胞)活化增加至少0.1倍，其中在使所述免疫细胞(例如，T细胞)与Cbl-b抑制剂或其组合物接触之前获得基线值。在一些实施方案，免疫细胞(例如，T细胞)活化比基线值增加至少约0.1倍、约0.2倍、约0.3倍、约0.4倍、约0.5倍、约0.6倍、约0.7倍、约0.8倍、约0.9倍、约1倍、约2倍、约4倍、约6倍、约8倍、约10倍、约20倍、约30倍、但不超过约50倍。免疫细胞活化可通过测定活化的生物标志物例如细胞因子分泌增加、活化标志物(例如，细胞表面标志物)的细胞表面表达增加、或下游信号通路中蛋白质的磷酸化增加来评估。可针对被测试的参数和免疫细胞被处理的条件来确定指示免疫细胞活化的相对于基线值的倍数。譬如，为了测定T细胞活化，可从用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得基线值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。然后从用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得参考值，其中所述T细胞已经与Cbl-b抑制剂接触或与Cbl-b抑制剂接触。然后可通过获得的参考值来确定免疫细胞活化的阳性反应。可获得类似的参考值测定值并将其与用于评估T细胞活化、T细胞增殖、T细胞耗竭、T细胞耐受性、B细胞活化和/或NK细胞活化的基线值进行比较。可利用本领域众所周知的技术以及生物学实施例9、10、13和14中提供的技术获得这些参数的测定值。
如本发明所用，术语“基线”或“基线值”可指在施用本发明公开的治疗剂(例如，包含本发明所述的Cbl-b抑制剂的组合物)之前或在施用所述治疗剂开始时的测定值或表征。可将基线值与参考值进行比较以确定免疫细胞功能的增加或减少(例如，增加T细胞活化、增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭和/或降低T细胞耐受性)。如本发明所用，术语“参考”或“参考值”可指在施用本发明公开的治疗剂(例如，包含本发明所述的Cbl-b抑制剂的组合物)之后的测定值或表征。参考值可在实验时间进程、剂量方案或治疗周期期间或在实验时间进程、剂量方案或治疗周期完成时测定一次或多次。“参考值”可以是绝对值、相对值、具有上限和/或下限的值、值范围、平均值、中值、平均值、或与基线值相比的值。同理，“基线值”可以是绝对值、相对值、具有上限和/或下限的值、值范围、平均值、中值、平均值、或与参考值相比的值。参考值和/或基线值可得自一个样品(例如，从个体获得的一个样品)、两个不同的样品(例如，从两个不同的个体获得的样品)、或一组样品(例如，从一组两个、三个、四个、五个或更多个体中获得的样品)。
在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)的基线值的至少2.5倍。在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞获得的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)的基线值的至少1.3倍。在一些实施方案，可从单独用抗CD3抗体刺激的T细胞获得基线值，其中所述细胞不与Cbl-b抑制剂一同孵育。在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下单独用抗CD3抗体刺激的T细胞的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从单独用抗CD3抗体刺激的T细胞获得的细胞因子分泌(例如，IL-2分泌)的基线值的至少0.1倍。在一些实施方案，通过在含Cbl-b抑制剂的情况下单独用抗CD3抗体刺激的T细胞的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)测定的对T细胞活化的阳性反应是在不含Cbl-b抑制剂的情况下，从单独用抗CD3抗体刺激的T细胞获得的表面标志物表达(例如，CD25表面标志物染色)的基线值的至少0.6倍。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的癌症疫苗。本发明还提供了治疗患有癌症的个体的方法，其包含：向所述个体施用有效量的Cbl-b抑制剂；和向所述个体施用有效量的癌症疫苗。此外，本发明提供了增加抗癌免疫应答的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的癌症疫苗。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，其中所述个体已经接受或正在接受有效量的癌症疫苗。
此外，本发明提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。本发明还提供了治疗患有癌症的个体的方法，其包含：向所述个体施用有效量的Cbl-b抑制剂；和向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。此外，本发明提供了增加抗癌免疫应答的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，以及向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。本发明还提供了治疗癌症的方法，其包含：向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，其中所述个体已经接受或正在接受有效量的溶瘤病毒。
在前述段落所述方法的一些实施方案中，所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗以任一顺序相继施用。在某些实施方案，如本发明所用，术语“相继地”、“连续地”和“顺序地”是指在施用癌症疫苗之后施用Cbl-b抑制剂，或在施用所述Cbl-b抑制剂之后施用所述癌症疫苗。例如，相继施用可包括在诱导期(首发治疗)期间在不存在癌症疫苗的情况下施用Cbl-b抑制剂，随后是包含施用癌症疫苗和Cbl-b抑制剂两者的诱导后治疗期。所述方法可进一步包含维持阶段，包含施用所述Cbl-b抑制剂或施用进一步剂量的所述癌症疫苗。或者，相继施用可包括在诱导期(首发治疗)期间在不存在Cbl-b抑制剂的情况下施用癌症疫苗，随后是包含施用所述Cbl-b抑制剂的诱导后治疗期。所述方法可进一步包含维持阶段，包含施用所述Cbl-b抑制剂或进一步剂量的所述癌症疫苗。
在前述段落所述方法的一些实施方案中，所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒以任一顺序相继施用。在某些实施方案，如本发明所用，术语“相继地”、“连续地”和“顺序地”是指在施用溶瘤病毒之后施用Cbl-b抑制剂，或在施用所述Cbl-b抑制剂之后施用所述溶瘤病毒。例如，相继施用可包括在诱导期(首发治疗)期间在不存在溶瘤病毒的情况下施用Cbl-b抑制剂，随后是包含施用溶瘤病毒和Cbl-b抑制剂两者的诱导后治疗期。所述方法可进一步包含维持阶段，包含施用所述Cbl-b抑制剂或施用进一步剂量的所述溶瘤病毒。或者，相继施用可包括在诱导期(首发治疗)期间在不存在Cbl-b抑制剂的情况下施用溶瘤病毒，随后是包含施用所述Cbl-b抑制剂的诱导后治疗期。所述方法可进一步包含维持阶段，包含施用所述Cbl-b抑制剂或进一步剂量的所述溶瘤病毒。
在联合治疗方法的一些实施方案中，所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗同时施用。在某些实施方案，如本发明所用，术语“同时”、“并举”和“并行”是指在同一医生就诊期间或在同一治疗阶段期间施用Cbl-b抑制剂和癌症疫苗。譬如，可在诱导期、治疗期和维持期中的一个或多个期间施用所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗两者。然而，同时施用无需所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗一同存在于单一制剂或药物组合物中，或者无需所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗精确地在同一时间施用。
在联合治疗方法的一些实施方案中，所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒同时施用。在某些实施方案，如本发明所用，术语“同时”、“并举”和“并行”是指在同一医生就诊期间或在同一治疗阶段期间施用Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒。譬如，可在诱导期、治疗期和维持期中的一个或多个期间施用所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒两者。然而，同时施用无需所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒一同存在于单一制剂或药物组合物中，或者无需所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒精确地在同一时间施用。
在一些案例中，所述治疗包括多次施用Cbl-b抑制剂或其组合物，其中施用之间的间隔可以变化。在一些实施方案，Cbl-b抑制剂以固定剂量(例如，mg/成人或mg/儿童)施用于个体。在一些实施方案，Cbl-b抑制剂以基于个体体重的固定剂量(例如，mg/kg)施用于个体。
在一些实施方案，本发明公开的联合疗法的有效性可通过测定存在于分离自受治疗个体的样本中的免疫细胞的生物活性来评估。譬如，治疗后从所述个体分离的免疫细胞通过使用细胞毒性测定法测定其破坏靶细胞的能力可用于评估治疗效果。在一些实施方案，样本中存在的免疫细胞的生物活性可通过测定某些细胞因子(例如，IL-2和IFNγ)的表达和/或分泌来测定。
除非另有说明，否则本发明使用的术语“癌症疫苗”是指为了治疗癌症(和任选地预防所述癌症复发)而向患有癌症的个体施用的“治疗性癌症疫苗”。相比之下，“预防性癌症疫苗”(预防性癌症疫苗)是为了预防癌症或降低个体患癌症的风险而施用于未患癌症的个体。预防性癌症疫苗的实例是用于预防鳞状细胞癌的人乳头瘤病毒疫苗以及用于预防肝细胞癌的乙型肝炎病毒疫苗。癌症疫苗均是免疫原性组合物，其包含药学上可接受的辅料和至少一种肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
本发明使用的术语“溶瘤病毒”和“OV”是指感染并杀死癌细胞的病毒。癌细胞的死亡是直接细胞溶解和抗肿瘤免疫诱导的结果。在一些实施方案，“溶瘤病毒”是有复制能力的病毒，其在癌细胞中选择性地复制。在其他实施方案，“溶瘤病毒”是复制缺陷型病毒，其不会由于溶瘤病毒的遗传工程化或灭活(例如，紫外线照射或加热)而在癌细胞中复制。
在一些实施方案，肿瘤抗原包含许多相同类型癌症共有的“共有肿瘤抗原”。共有肿瘤抗原的非限制性实例是乳腺癌抗原HER2、前列腺癌抗原PAP和PSA、以及黑素瘤抗原MART-1和MAGE。在其他实施方案，所述肿瘤抗原包含作为肿瘤特异性DNA改变(例如，体细胞突变)的结果而产生的“新抗原”。因此，新抗原通常具有正常哺乳动物基因组中不存在的氨基酸序列(Schumacher and Schreiber,Science,348:69-74,2015)。新抗原的非限制性实例是BRAF V600E、KRAS G12D、KRAS G12V、PIK3CA H1047R和PIC3CA E545K。肿瘤特异性新抗原数据库(TSNAdb)现已免费提供(Wu et al.,Genomics Proteomics Bioinformatics 16:276-282,2018)。
多种技术适用于鉴定包含在癌症疫苗中的新抗原，作为包含活化阈值降低剂(例如，Cbl-b抑制剂)的联合疗法的一部分。譬如，新抗原可采用以下方法进行鉴定，包含从得自个体的肿瘤活检中分离DNA、对DNA进行测序、以及对序列进行计算分析，以鉴定一种或多种新抗原(Aldous and Dong,Bioorg Med Chem,26:2842-2849,2018)。在一些实施方案，所述计算分析涉及鉴定长度为8-11个氨基酸的肽，所述这些肽预计结合至少一种由肿瘤细胞表达的HLA等位基因并且包含至少一种错义突变(Wu et al.,Genomics ProteomicsBioinformatics 16:276-282,2018)。包含在癌症疫苗中的新抗原被认为有利于克服耐受性及降低自身免疫风险。
适用于本发明方法、药物和用途的癌症疫苗平台包括但不限于合成肽类、重组蛋白类、核酸类(DNA或mRNA)、微生物载体类、肿瘤细胞类和抗原呈递细胞类(参见，例如DeMaria and Bilusic,Hematol Oncol Cin North Am,33:199-214,2019；和Maeng andBerzofsky,F1000Research 2019,8(F1000Faculty Rev):654,2019)。
在一些实施方案，癌症疫苗的肿瘤抗原包含至少一种合成肽或重组蛋白。在一些实施方案，所述合成肽的长度为至少8个氨基酸，并且在某些实施方案，所述合成肽的长度小于80个氨基酸。在一些实施方案，所述肿瘤抗原包含多个合成肽，或所述肿瘤抗原包含合成肽或重组蛋白，所述合成肽或重组蛋白包含2个、3个或更多个表位的氨基酸序列。“表位”是抗原的一部分，其与抗体或B细胞受体结合，或由细胞(例如，肿瘤细胞或树突状细胞)表面的主要组织相容性复合体分子(MHC I类或II类)呈递以供T细胞受体结合。在一些实施方案，表位是由肿瘤抗原序列的相邻接氨基酸组成的“线性表位”(一级结构)。在一些实施方案，表位是由肿瘤抗原的非相邻接氨基酸组成的“构象表位”(三级结构)。在一些实施方案，肿瘤抗原包含重组蛋白，所述重组蛋白包含线性表位和构象表位两者。
在一些实施方案，所述肿瘤抗原由DNA或mRNA分子编码。在一些实施方案，所述肿瘤抗原由微生物载体的核酸编码，或者换言之，所述癌症疫苗包含微生物载体。在一些实施方案，所述微生物载体是活的、减毒的微生物载体。在一个实施方案，所述活的、减毒的微生物载体是
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BCG，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的卡介苗(Bacillus ofCalmette and Guerin)(BCG)菌株的活培养物制剂，由Organon USA,Inc.(Roseland,NJ)销售。
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BCG经联邦药物管理局(FDA)批准可在用无菌盐水(例如，药学上可接受的辅料)重构后用于膀胱内使用，适用于膀胱原位癌的治疗和预防、以及经尿道切除术后原发或复发期Ta和/或T1乳头状肿瘤的预防。
在一些实施方案，所述微生物载体是重组微生物载体，例如重组病毒载体或重组细菌载体。适用于本发明联合疗法的重组病毒载体包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和疱疹病毒(Chulpanova et al.,Biomedicines,6:94,2018)。在一些实施方案，所述微生物载体是重组细菌载体。适用于本发明联合疗法的重组细菌载体包括但不限于梭菌(Clostridium)(诺维氏梭状芽胞杆菌(C.novyi))、李斯特菌(Listeria)(例如，单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes))、假单胞菌(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和沙门氏菌(Salmonella)(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))(Toussant et al.,Expert Rev Vaccines,12:1139-1154,2013)。
在一些实施方案，所述癌症疫苗包含已与肿瘤抗原(例如，合成肽或重组蛋白)接触的抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案，用编码肿瘤抗原的核酸转染所述APC。在一些实施方案，用编码细胞因子的核酸转染所述APC。在一些实施方案，所述APC包含树突状细胞或间充质干细胞。在一个实施方案，所述癌症疫苗是由Dendreon公司(Seattle,WA)销售的
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(普列威(sipuleucel-T))。
Figure BDA0003470586280000772
包含乳酸林格氏液(例如，药学上可接受的辅料)和外周血单核细胞(PBMC)，其已被PAP-GM-CSF融合蛋白激活，所述融合蛋白由连接至粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的前列腺酸性磷酸酶组成。
Figure BDA0003470586280000773
是联邦药物管理局(FDA)批准的静脉输液，用于治疗无症状或轻微症状的转移性前列腺癌。
在一些实施方案，所述癌症疫苗包含杀死的肿瘤细胞。在一些实施方案，所述癌症疫苗包含肿瘤细胞裂解物。在一些实施方案，所述癌症疫苗包含已与肿瘤细胞裂解物接触的APC。
适用于本发明方法、药物和用途的癌症疫苗的佐剂包括但不限于，经FDA批准的许可产品的佐剂。特别是，当前经FDA批准的许可产品的佐剂包括铝盐类、单磷酰脂质A、水包油乳液类(例如，水包角鲨烯乳液MF59或AS03)、皂苷类和CpG寡脱氧核苷酸类。
适用于本发明方法、药物和用途的溶瘤病毒包括但不限于，腺病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echovirus)、禽痘病毒(fowlpox virus)、单纯疱疹病毒、马拉巴病毒(maraba virus)、麻疹病毒、粘液瘤病毒、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内加谷病毒(SenecaValley virus)、塞姆利基森林病毒(Semiliki Forest virus)、痘苗病毒(vacciniavirus)、和水泡性口炎病毒(参见，例如Russell and Peng,Chin Clin Oncol,7:16,2018；和Sivanandam et al.,Molecular Therapy Oncolytics,13:93-106)。
在一些实施方案，所述溶瘤病毒未经遗传工程改造(非重组病毒)。在一些实施方案，所述非重组病毒是埃可病毒(例如，里格韦(Rigvir))、新城疫病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、或塞内加谷病毒。
在一些实施方案，所述溶瘤病毒是已经遗传工程改造以包括一个或多个基因缺失、一个或多个基因插入、或一个或多个基因缺失与一个或多个基因插入的重组病毒。在一些实施方案，所述重组病毒已经遗传工程改造以改变宿主细胞的特异性和/或肿瘤细胞的细胞毒性。在一些实施方案，所述重组溶瘤病毒已通过功能性缺失编码抑制宿主细胞应答(例如，抗病毒应答)的蛋白质的一种或多种病毒基因，和/或通过插入编码促进宿主细胞应答(例如，抗肿瘤应答)的蛋白质的一种或多种转基因，进行遗传工程改造(参见，例如Guoet al.,Frontiers in Immunology,8:Article 555,2017；和Lin et al.,OncologyLetters,15:4053-4060,2018)。在一些实施方案，所述重组病毒通过插入编码可检测标记(例如荧光蛋白)的转基因而进一步工程化。理想的抗肿瘤应答包括先天免疫应答和适应性免疫应答之一或两者。
在一些实施方案，所述重组溶瘤病毒是重组单纯疱疹病毒(HSV)，例如1型HSV。在一个实施方案，所述重组溶瘤病毒是
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亦称为talimogene laherparepvec或T-VEC，由安进公司(Amgen Inc.,Thousand Oaks,CA)销售。
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是重组HSV-1，其包括功能性缺失ICP34.5和ICP47基因，以及插入编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸。
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已获联邦药物管理局(FDA)批准，可通过病灶内注射(瘤内给药)对复发性黑素瘤患者的不可切除的皮肤、皮下以及淋巴结病灶进行局部治疗。此外，
Figure BDA0003470586280000784
已获欧洲药品管理局(EMA)批准，用于治疗患有区域性或远处转移性的成人不可切除黑素瘤(IIIB、IIIC或IVM1a期)。特别是，经EMA批准的产品将通过病灶内注射(瘤内给药)施用于可见、可触及或可通过超声引导检测到的皮肤、皮下和/或淋巴结病灶。
在一些实施方案，所述重组溶瘤病毒是重组腺病毒，例如血清5型腺病毒。在一个实施方案，所述重组腺病毒是Oncorine(H101)，先前称为Onyx-015。Oncorine是一种血清5型腺病毒，通过灭活(功能性缺失)病毒E1B-55k和病毒E3基因进行工程改造。Oncorine被中国国家食品药品监督管理局批准用于与化学疗法(抗肿瘤剂疗法)联合治疗头颈癌。
在一些实施方案，所述重组溶瘤病毒是重组痘病毒。在一些实施方案，所述痘病毒是痘苗病毒或禽痘病毒。在一些实施方案，所述痘苗病毒是经修饰的安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Ankara)。在一些实施方案，所述重组痘苗病毒已通过功能性缺失编码抑制宿主细胞应答(例如，抗病毒应答)的蛋白质的一种或多种病毒基因，和/或通过插入编码促进宿主细胞应答(例如，抗肿瘤应答)的蛋白质的一种或多种转基因，进行遗传工程改造(参见，例如Guo et al.,Journal of ImmunoTherapy of Cancer,7:6,2019)。在一个实施方案，所述重组痘苗病毒是Pexa-Vec，亦称为pexastimogene devacirepvec和JX-594，其是通过灭活(功能性缺失)病毒胸苷激酶基因并通过插入编码人GM-CSF和β-半乳糖苷酶的转基因而进行工程改造的痘苗病毒(Heo et al.,Nat Med,19:329-336,2013)。在另一实施方案，所述重组痘苗病毒包含功能性缺失病毒胸苷激酶和痘苗生长因子基因，以及插入编码趋化因子CXCL11的转基因(参见，例如Liu et al.,OncoImmunology,5:3,e1091554,2016；和Liu et al.,Nature Communications,8:14754,2017)。
本发明联合疗法的进一步实施方案包含至少一种附加治疗剂。在一些实施方案，所述至少一种附加治疗剂选自由免疫检查点抑制剂、化学疗法(抗肿瘤剂)、放射疗法、及其组合组成的组。
在一些实施方案，所述免疫检查点抑制剂是至少一种抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。在一些实施方案，所述至少一种抑制性免疫检查点分子选自由PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)和CTLA4(CD152)组成的组。所述免疫检查点抑制剂可以是治疗性生物产品。例如，所述免疫检查点抑制剂可包含抗体或其抗原结合片段。所述抗体或片段可以是单克隆抗体(mAb)、人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体，并且可包括人恒定区。在一些实施方案，所述人恒定区选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4恒定区组成的组，并且在某些实施方案，所述人恒定区是IgGl或IgG4恒定区。在一些实施方案，所述抗体或片段是双特异性抗体。在一些实施方案，所述抗原结合片段包含由Fab、Fab'-SH、F(ab')2、scFv和Fv片段组成的组中的一种。
在一些实施方案，所述化学疗法包含至少一种抗肿瘤剂(即，WHO ATC代码L01)。在一些实施方案，所述至少一种抗肿瘤剂选自由以下组成的组：细胞毒性抗生素、植物生物碱、抗代谢物、和烷化剂、其他抗肿瘤剂、及其组合。就化学疗法而言，所述抗肿瘤剂是“药物”，而非“治疗性生物产品”。
在一些实施方案，所述放射疗法是外射束放射疗法。在其他实施方案，所述放射疗法是内照射疗法。在一些实施方案，所述放射疗法是消融性放射疗法。
本发明使用的术语“生物仿制药”或“生物类似药”是指与联邦药物管理局(FDA)批准的参比产品相似但在安全性和有效性方面无临床意义差异的生物产品。例如，生物仿制药产品与参比产品之间在临床非活性成分方面可能存在差异(例如，制剂辅料的差异、糖基化的细微差异等)。可通过药代动力学和药效学研究来评估具有临床意义的特征。在一些实施方案，所述生物仿制药产品是由FDA确定的可互换产品。在一些实施方案，所述癌症疫苗是经FDA批准的产品的生物仿制药。
IV.组合物、制剂及给药途径
本发明包含本发明公开的任何化合物或其盐或其溶剂化物的药物组合物。因此，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-B抑制剂是本发明公开的式(I)、(I-a)、(I-A)-(I-J)、(II-A)-(II-H)、(II-A-1)-(II-H-1)、(III-A)-(III-H)、(III-A-1)-(III-H-1)、(IV-A)-(IV-J)、或(IV-C-1)-(IV-J-1)所示化合物、或其任何变体、或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或其互变异构体、或其立体异构体或立体异构体的混合物，以及药学上可接受的辅料，例如药学上可接受的媒剂或药学上可接受的载体。在一些实施方案，所述化合物是选自表1中化合物编号为1-58的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或其互变异构体、或其立体异构体或立体异构体的混合物。在一个案例中，所述药学上可接受的盐是酸加成盐，例如与无机酸或有机酸形成的盐。
本发明公开的化合物和组合物可以任何合适形式并通过任何合适的途径进行施用，以提供足够水平的所述化合物用于治疗疾病或病症。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂和/或所述附加治疗剂通过肠内给药进行施用。在一些实施方案，所述肠内给药是口服给药。在其他实施方案，所述Cbl-b抑制剂和/或所述附加治疗剂通过肠胃外给药进行施用。在一些实施方案，所述肠胃外给药是瘤内注射。在一些实施方案，所述肠胃外给药是通过选自由静脉内、腹腔内及皮下组成的组的途径。
合适的给药途径包括口服给药，肠内给药，肠胃外给药包括皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、胸骨内注射、腹腔内注射、病灶内注射、关节内注射、瘤内注射、或输注技术。所述化合物和组合物还可通过舌下给药、粘膜给药、经颊给药、皮下给药、脊椎给药、硬膜外给药、脑室给药、吸入(例如，作为雾化剂或喷雾剂)、经鼻给药、阴道给药、直肠给药、局部给药、或透皮给药，或通过缓释或延长释放机制进行给药。所述化合物和组合物可按需以含有常规药学上可接受的载体、辅料、佐剂和媒剂的单位剂量制剂形式进行给药。所述化合物和组合物可直接施用于特定的或受影响的器官或组织。所述化合物可以与药学上可接受的载体、辅料、佐剂和媒剂混合以形成适合于所需给药途径的组合物。在一些实施方案，所述化合物可与抗原和佐剂中的一者或两者混合。在一些实施方案，所述抗原是癌抗原。
在本发明公开的某些实施方案中，尤其是其中制剂用于注射或其他肠胃外给药的那些实施方案，包括本发明列出的途径，但亦包括本发明所述的任何其他给药途径(例如，口服、经肠、经胃等)，所述这些方法中使用的制剂配方和制剂均是无菌的。无菌药物制剂均根据本领域技术人员已知的药物级灭菌标准(美国药典第797、1072和1211章；加利福尼亚商业和职业法典4127.7；16加利福尼亚州规章和行政规则1751，21美国联邦法规211)进行混合或配制。“无菌”制剂是无菌的，或不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。药物制剂的灭菌方法的实例包括但不限于，经由无菌过滤膜的无菌过滤、暴露于辐射(例如γ辐射)、及热灭菌。
口服给药是有利的，因为其易于实施及患者依从性。如果患者吞咽困难，可通过饲管、饲喂注射器或胃造口术引入药物，以完成经肠给药。活性化合物及其他共同给药的药剂(若存在)，可在适合于经由饲管、饲喂注射器或胃造口术给药的制剂的任何其他药学上可接受的辅料中进行经肠给药。
亦可有利地使用静脉内给药，以尽可能快地将所述化合物或组合物递送至血流，避免从胃肠道吸收的需要。
可用于本发明用途的所述化合物和组合物可以固体形式，液体形式，气雾剂形式，或以片剂、丸剂、囊片、胶囊(例如，硬明胶胶囊或软弹性明胶胶囊)、粉剂混合物、颗粒剂、注射剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、结肠灌洗剂、乳剂、分散剂、食品预混剂、扁囊剂、糖锭剂、锭剂、胶剂、软膏剂、巴布剂(膏药)、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏剂、贴剂、气雾剂(例如，鼻喷雾剂或吸入器)、凝胶剂、混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、酏剂的形式，或以适合于所述给药途径的其他形式进行给药。所述化合物和组合物亦可以脂质体制剂进行给药。所述化合物亦可作为前药进行给药，其中所述前药在受治疗的受试者中经历转化为治疗有效形式。
此外，药物制剂可包含防腐剂类、增溶剂类、稳定剂类、再润湿剂类、乳化剂类、甜味剂类、染料类、调节剂类、和用于调节渗透压的盐类、缓冲剂类、包衣剂类、或抗氧化剂类。包含所述化合物的制剂还可包含具有有价值的治疗特性的其他物质。药物制剂可通过已知的药学方法制备得到。其他制剂和给药方法均是本领域已知的。合适的制剂可在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,21st ed.(2005)中获悉，其通过引用并入本发明。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液，可根据本领域已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如丙二醇溶液。可使用的可接受媒剂和溶剂是水、盐水、林格氏溶液、及等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。鉴于此，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯类。另外，可在可注射制剂的制备中使用脂肪酸类，例如油酸。
用于口服给药的固体剂型可包括胶囊剂类、片剂类、丸剂类、粉剂类和颗粒剂类。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖、滑石粉、或淀粉)混合。此类剂型还可包含除惰性稀释剂之外的附加辅料物质，例如，润滑剂类如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的案例中，剂型还可包含缓冲剂类。片剂和丸剂还可用肠溶衣进行制备。软壳凝胶胶囊可接受的辅料有，例如植物油类、蜡、脂肪类、半固体及液体多元醇类等。
用于口服给药的液体剂型可包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂，其中含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水。此类组合物还可包含附加试剂，例如润湿剂类、乳化剂类和悬浮剂类、环糊精类、以及甜味剂类、调味剂类和芳香剂类。或者，如果合适，所述化合物亦可以纯化合物形式进行给药。
所述化合物和组合物亦可以脂质体的形式进行给药。如本领域已知的，脂质体通常源自磷脂类或其他脂质类物质。脂质体由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可使用能够形成脂质体的任何生理学上可接受的及可代谢的脂质。除了本发明公开的化合物之外，脂质体形式的本发明组合物还可包含稳定剂类、防腐剂类、赋形剂类等。有用的脂质包括天然及合成的磷脂类和磷脂酰胆碱类(卵磷脂类)。形成脂质体的方法均是本领域已知的。参见，例如，Gregoriadis,G.Ed.,Liposome Technology,Third Edition:Liposome Technology:Liposome Preparation and Related Techniques,CRC Press,Boca Raton,Florida(2006)；和Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.W.,p.33et seq(1976)。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量可根据所述活性成分所施用的患者和特定的施用方式而变化。然而，应当理解，任何特定患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物；患者的年龄、体重、身体面积、体重指数(BMI)、一般健康状况、性别和饮食；所采用的给药时间和给药途径；排泄率；以及所使用的药物组合(如果有)。所述化合物可以单位剂量制剂进行给药。制备所选择的药物单位剂量并进行给药以在患者、受试者或个体中提供足够浓度的药物。
尽管用于本发明所述用途的化合物可作为唯一的活性药剂进行给药，但其亦可与一种或多种其他药剂联合使用。当附加活性剂同用于本发明所述用途的化合物联合使用时，所述附加活性剂通常可如Physicians'Desk Reference(PDR)第71版(2017)中所示的治疗量进行使用，此文献以引用方式并入本发明，或以本领域普通技术人员已知的此类治疗上有用的量进行使用，或如对每个患者凭经验确定的量进行使用。
亦可使用两种或更多种本发明公开的化合物和组合物的组合。所述两种或更多种化合物或组合物可在给药前不久混合在一起并一同给药。所述两种或更多种化合物或组合物可通过相同的给药途径或通过不同的给药途径同时给药。所述两种或更多种化合物或组合物可通过相同的给药途径或通过不同的给药途径相继给药。在一个实施方案，试剂盒形式可包含作为单独形式的化合物或组合物的两种或更多种化合物或组合物，具有用于以化合物或组合物的混合物给药、以单独的化合物或组合物同时给药、或以单独的化合物或组合物相继给药的印刷或电子说明书。当施用三种或更多种化合物或组合物时，其可作为化合物或组合物的混合物，作为同时给药的单独化合物或组合物，作为相继给药的单独化合物或组合物，作为其中两种或多种可同时给药、而其余在同时给药之前或之后相继给药、或以混合给药、同时给药和相继给药的任何其他可能的组合进行给药的单独的化合物或组合物进行给药。
一方面，本发明公开的化合物可以是经纯化形式，并且本发明公开了包含所述经纯化形式的化合物的组合物。本发明提供了包含本发明公开的化合物或其盐的组合物，例如基本上纯的化合物的组合物。在一些实施方案，包含本发明公开的化合物或其盐的组合物为基本上纯的形式。在一个变体中，“基本上纯”是指包含不超过35％杂质的组合物，其中所述杂质表示在所述组合物中施用的所述化合物(或多个化合物，如果使用化合物的组合)以外的化合物，或此化合物(或多个化合物，如果使用组合)的盐或溶剂化物。任何添加的媒剂、载体或辅料的重量不包括在此种计算中，并且所述添加的媒剂、载体或辅料不被视为杂质。譬如，选自表1所示化合物的基本纯的化合物的组合物是指包含不超过35％杂质的组合物，其中所述杂质表示除所述化合物或其盐或溶剂化物之外的化合物。在一个变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过25％杂质。在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过20％杂质。又在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过10％杂质。在进一步的变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过5％杂质。在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过3％杂质。又在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过1％杂质。在进一步的变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过0.5％杂质。在其他变体中，基本上纯的化合物的组合物是指所述组合物包含不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过3％、或不超过1％的杂质。杂质可以是与所需立体化学形式不同的立体化学形式的化合物。例如，基本上纯的(S)-化合物的组合物是指所述组合物包含不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过3％、或不超过1％的所述(R)形式化合物。或者，本发明使用的“对映异构体过量(ee)”是指描述包含例如单个立体中心的手性物质纯度的无量纲摩尔比。例如，对映异构体过量为零将表示外消旋体(例如，对映异构体的50:50混合物，或一种对映异构体相对于另一种对映异构体不过量)。作为进一步的实例，对映异构体过量为99将表示几乎立体纯的对映异构体化合物(即，一种对映异构体相对于另一种对映异构体大量过量)。对映异构体过量百分比，％ee＝([(R)-化合物]-[(S)-化合物])/([(R)-化合物]+[(S)-化合物])x 100，其中所述(R)-化合物>(S)-化合物；或％ee＝([(S)-化合物]-[(R)-化合物])/([(S)-化合物]+[(R)-化合物])x 100，其中所述(S)-化合物>(R)-化合物。此外，本发明使用的“非对映异构体过量(de)”是指描述包含多于一个立体中心的手性物质纯度的无量纲摩尔比。譬如，非对映异构体过量为零将表示非对映异构体的等摩尔混合物。作为进一步的实例，非对映异构体过量为99将表示几乎立体纯的非对映异构体化合物(即，一种非对映异构体相对于另一种非对映异构体大量过量)。非对映异构体过量可通过与ee类似的方法计算得到。正如技术人员所理解的，de通常报告为百分比de(％de)。％de可以与％ee类似的方式计算得到。
在一些案例中，本发明提供了包含细胞群的组合物，所述细胞群包含经修饰的免疫细胞，例如本发明所述的或通过本发明公开的方法生成的那些经修饰的免疫细胞。在一些实施方案，所述组合物包含细胞群，所述细胞群包含经修饰的免疫细胞，所述经修饰的免疫细胞已经与或与本发明所述的Cbl-b抑制剂或其组合物接触。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞已经与或与单独的抗CD3抗体接触。在一些实施方案，所述经修饰的免疫细胞已经与或与抗CD28抗体与抗CD3抗体的组合接触。本发明所提供的包含含有本发明所述的经修饰免疫细胞的细胞群的组合物可进一步包含药学上可接受的辅料。
在一些案例中，本发明还提供了包含细胞群的细胞培养组合物，所述细胞群包含本发明所述的免疫细胞和Cbl-b抑制剂。在一些实施方案，所述免疫细胞是人免疫细胞。在一些实施方案，所述免疫细胞是选自由以下组成的组的细胞：造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。在一些实施方案，所述细胞培养组合物进一步包含抗CD3抗体。在一些实施方案，所述细胞培养组合物进一步包含抗CD28抗体与抗CD3抗体的组合。培养包含免疫细胞的细胞组合物的方法均是本领域众所周知的并且涵盖在本发明中。
本发明所述的经修饰的免疫细胞或组合物，例如包含含有所述经修饰的免疫细胞的细胞群的组合物或药物组合物，可提供在适当容器中。适当容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，单室或双室注射器)、袋(例如，静脉输液袋)和管(例如，试管)。容器可由多种材料(例如，玻璃或塑料)形成。
在一些实施方案，包含含有本发明所述的经修饰的免疫细胞的细胞群的组合物(例如，细胞培养组合物)可提供在培养器皿中。本发明提供的培养器皿包括但不限于管(例如，试管)、皿(例如，组织培养皿)、袋、多孔板(例如，6孔组织培养板)和烧瓶(例如，细胞培养瓶)。
本发明还提供了用于本发明所述的任何用途的本发明所述的组合物。在一些实施方案，本发明所述的组合物用于制备治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的药物。在一些实施方案，本发明所述的组合物用于制备治疗癌症的药物。
本发明包括与癌症疫苗联合使用的本发明公开的任何化合物或其盐或溶剂化物的药物组合物。因此，本发明内容包括用于与癌症疫苗联合使用的包含Cbl-b抑制剂的药物组合物，其中所述Cbl-b抑制剂是国际专利申请WO 2019/148005的1-719(包括其“a”和“b”变体)的化合物，或式(I-A)、式(I)、式(II-A)、式(II)、式(III-A)、式(III)、或式(IV)中任一所示化合物，或其中披露的其任何变体，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或其互变异构体，或其立体异构体或立体异构体的混合物。
此外，本发明包括与溶瘤病毒联合使用的本发明公开的任何化合物或其盐或溶剂化物的药物组合物。因此，本发明内容包括用于与溶瘤病毒联合使用的包含Cbl-b抑制剂的药物组合物，其中所述Cbl-b抑制剂是国际专利申请WO 2019/148005的1-719(包括其“a”和“b”变体)的化合物，或式(I-A)、式(I)、式(II-A)、式(II)、式(III-A)、式(III)、或式(IV)中任一所示化合物，或其中披露的其任何变体，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或其互变异构体，或其立体异构体或立体异构体的混合物。所述组合物可进一步包含药学上可接受的辅料，例如药学上可接受的媒剂或药学上可接受的载体。在一些实施方案，所述药物组合物包含小分子Cbl-b抑制剂和癌症疫苗两者。在一些实施方案，所述化合物是选自表1中的化合物60和/或化合物56的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或其互变异构体，或其立体异构体或立体异构体的混合物。此外，在一些实施方案，所述药物组合物包含小分子Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒两者。在一些实施方案，所述化合物是选自表1中的化合物60和/或化合物56的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或其互变异构体，或其立体异构体或立体异构体的混合物。在一些实施方案，所述化合物是选自以下专利申请中公开的Cbl-b抑制剂的化合物：美国专利申请号62/849,722的化合物1-58或其中式(I)所示化合物；美国专利申请号62/880,437的化合物1-58或其中式(I)所示化合物；或其任何变体，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或其互变异构体，或其立体异构体或立体异构体的混合物。
一方面，所述药学上可接受的盐是酸加成盐，例如与无机酸或有机酸形成的盐。
本发明公开的化合物、疫苗和组合物均可以任何合适的形式和通过任何合适的途径进行施用，其将提供足够水平的化合物、疫苗或组合物，用于治疗疾病或病症。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂和/或所述癌症疫苗通过肠内给药进行施用。本发明公开的化合物、溶瘤病毒和组合物均可以任何合适的形式和通过任何合适的途径进行施用，其将提供足够水平的化合物、溶瘤病毒或组合物，用于治疗疾病或病症。在一些实施方案，所述Cbl-b抑制剂和/或所述溶瘤病毒通过肠内给药进行施用。在一些实施方案，所述肠内给药是口服给药。在其他实施方案，所述Cbl-b抑制剂和/或所述癌症疫苗通过肠胃外给药进行施用。在其他实施方案，所述Cbl-b抑制剂和/或所述溶瘤病毒通过肠胃外给药进行施用。在一些实施方案，所述肠胃外给药是瘤内注射。在一些实施方案，所述肠胃外给药是通过选自由静脉内、腹腔内及皮下组成的组的途径。
合适的给药途径包括口服给药，肠内给药，肠胃外给药包括皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、胸骨内注射、腹腔内注射、病灶内注射、关节内注射、瘤内注射、或输注技术。所述化合物、疫苗和组合物还可通过舌下给药、粘膜给药、经颊给药、皮下给药、脊椎给药、硬膜外给药、脑室给药、吸入(例如，作为雾化剂或喷雾剂)、经鼻给药、阴道给药、直肠给药、局部给药、或透皮给药，或通过缓释或延长释放机制进行给药。所述化合物、疫苗和组合物可按需以含有常规药学上可接受的载体、辅料、佐剂和媒剂的单位剂量制剂形式进行给药。所述化合物、疫苗和组合物可直接施用于特定的或受影响的器官或组织。所述化合物和/或疫苗可与药学上可接受的载体、辅料、佐剂和媒剂混合以形成适合于所需给药途径的组合物。所述化合物、溶瘤病毒和组合物也可通过舌下给药、粘膜给药、经颊给药、皮下给药、脊椎给药、硬膜外给药、脑室给药、吸入(例如，作为雾化剂或喷雾剂)、经鼻给药、阴道给药、直肠给药、局部给药、或透皮给药，或通过缓释或延长释放机制进行给药。所述化合物、溶瘤病毒和组合物可按需以含有常规药学上可接受的载体、辅料、佐剂和媒剂的单位剂量制剂形式进行给药。所述化合物、溶瘤病毒和组合物可直接施用于特定的或受影响的器官或组织。所述化合物和/或溶瘤病毒可与药学上可接受的载体、辅料、佐剂和媒剂混合以形成适合于所需给药途径的组合物。
在本发明公开的某些实施方案中，尤其是其中制剂用于注射或其他肠胃外给药的那些实施方案，包括本发明列出的途径，但也包括本发明所述的任何其他给药途径(例如口服、经肠、经胃等)，除了在某些癌症疫苗中存在微生物载体外，所述这些方法中使用的制剂配方和制剂均是无菌的。为了制备此类制剂，所述制剂配方或制剂的所有组分均在与微生物载体组合之前以无菌方式制备。在本发明公开的某些实施方案中，尤其是其中制剂用于注射或其他肠胃外给药的那些实施方案，包括本发明列出的途径，但也包括本发明所述的任何其他给药途径(例如口服、经肠、经胃等)，除了存在溶瘤病毒外，所述这些方法中使用的制剂配方和制剂均是无菌的。为了制备此类制剂，所述制剂配方或制剂的所有组分均在与溶瘤病毒组合之前以无菌方式制备。无菌药物制剂均根据本领域技术人员已知的药物级灭菌标准(美国药典第797、1072和1211章；加利福尼亚商业和职业法典4127.7；16加利福尼亚州规章和行政规则1751，21美国联邦法规211)进行混合或配制。“无菌”制剂是无菌的，或不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。药物制剂的灭菌方法的实例包括但不限于，经由无菌过滤膜的无菌过滤、暴露于辐射(例如γ辐射)、及热灭菌。
口服给药是有利的，因为其易于实施及患者依从性。如果患者吞咽困难，可通过饲管、饲喂注射器或胃造口术引入药物，以完成经肠给药。活性化合物、疫苗或组合物以及其他共同给药的药剂(若存在)，可在适合于经由饲管、饲喂注射器或胃造口术给药的制剂的任何其他药学上可接受的辅料中进行经肠给药。活性化合物、溶瘤病毒或组合物以及其他共同给药的药剂(若存在)，可在适合于经由饲管、饲喂注射器或胃造口术给药的制剂的任何其他药学上可接受的辅料中进行经肠给药。
亦可有利地使用静脉内给药，以尽可能快地将所述化合物、疫苗或组合物递送至血流，避免从胃肠道吸收的需要。亦可有利地使用静脉内给药，以尽可能快地将所述化合物、溶瘤病毒或组合物递送至血流，避免从胃肠道吸收的需要。
可用于本发明用途的所述化合物、疫苗和组合物可以固体形式，液体形式，气雾剂形式，或以片剂、丸剂、囊片、胶囊(例如，硬明胶胶囊或软弹性明胶胶囊)、粉剂混合物、颗粒剂、注射剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、结肠灌洗剂、乳剂、分散剂、食品预混剂、扁囊剂、糖锭剂、锭剂、胶剂、软膏剂、巴布剂(膏药)、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏剂、贴剂、气雾剂(例如，鼻喷雾剂或吸入器)、凝胶剂、混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、酏剂的形式，或以适合于所述给药途径的其他形式进行给药。所述化合物、疫苗和组合物亦可以脂质体制剂进行给药。可用于本发明的所述化合物、溶瘤病毒和组合物可以固体形式，液体形式，气雾剂形式，或以片剂、丸剂、囊片、胶囊(例如，硬明胶胶囊或软弹性明胶胶囊)、粉剂混合物、颗粒剂、注射剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、结肠灌洗剂、乳剂、分散剂、食品预混剂、扁囊剂、糖锭剂、锭剂、胶剂、软膏剂、巴布剂(膏药)、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏剂、贴剂、气雾剂(例如，鼻喷雾剂或吸入器)、凝胶剂、混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、酏剂的形式，或以适合于所述给药途径的其他形式进行给药。所述化合物、溶瘤病毒和组合物亦可以脂质体制剂进行给药。所述化合物亦可作为前药进行给药，其中所述前药在受治疗的受试者中经历转化为治疗有效形式。
此外，药物制剂可包含防腐剂类、增溶剂类、稳定剂类、再润湿剂类、乳化剂类、甜味剂类、染料类、调节剂类、和用于调节渗透压的盐类、缓冲剂类、包衣剂类、或抗氧化剂类。包含所述化合物、疫苗或组合物的制剂还可包含具有有价值的治疗特性的其他物质。包含所述化合物、溶瘤病毒或组合物的制剂还可包含具有有价值的治疗特性的其他物质。药物制剂可通过已知的药物方法制备得到。其他制剂和给药方法均是本领域已知的。合适的制剂可在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,21st ed.(2005)中获悉，其通过引用并入本发明。
可注射制剂，例如小分子Cbl-b抑制剂的无菌可注射水性或油质悬浮液，可根据本领域已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如丙二醇溶液。可使用的可接受媒剂和溶剂是水、盐水、林格氏溶液、及等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。鉴于此，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯类。另外，可在可注射制剂的制备中使用脂肪酸类，例如油酸。
用于口服给药的固体剂型可包括胶囊剂类、片剂类、丸剂类、粉剂类和颗粒剂类。在此类固体剂型中，所述活性化合物、疫苗或组合物可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖、滑石粉、或淀粉)混合。在此类固体剂型中，所述活性化合物、溶瘤病毒或组合物可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖、滑石粉、或淀粉)混合。此类剂型还可包含除惰性稀释剂之外的附加辅料物质，例如，润滑剂类如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的案例中，剂型还可包含缓冲剂类。片剂和丸剂还可用肠溶衣进行制备。软壳凝胶胶囊可接受的辅料有，例如植物油类、蜡、脂肪类、半固体及液体多元醇类等。
用于口服给药的液体剂型可包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂，其中含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水。此类组合物还可包含附加试剂，例如润湿剂类、乳化剂类和悬浮剂类、环糊精类、以及甜味剂类、调味剂类和芳香剂类。或者，如果合适，所述化合物亦可以纯化合物形式进行给药。
所述化合物、疫苗和组合物亦可以脂质体的形式进行给药。所述化合物、溶瘤病毒和组合物亦可以脂质体的形式进行给药。如本领域已知的，脂质体通常源自磷脂类或其他脂质类物质。脂质体由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可使用能够形成脂质体的任何生理学上可接受的及可代谢的脂质。除了本发明公开的化合物或疫苗之外，脂质体形式的本发明组合物还可包含稳定剂类、防腐剂类、赋形剂类等。除了本发明公开的化合物或溶瘤病毒之外，脂质体形式的本发明组合物还可包含稳定剂类、防腐剂类、赋形剂类等。有用的脂质包括天然及合成的磷脂类和磷脂酰胆碱类(卵磷脂类)。形成脂质体的方法均是本领域已知的。参见，例如，Gregoriadis,G.Ed.,Liposome Technology,ThirdEdition:Liposome Technology:Liposome Preparation and Related Techniques,CRCPress,Boca Raton,Florida(2006)；和Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,VolumeXIV,Academic Press,New York,N.W.,p.33et seq(1976)。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量可根据所述活性成分所施用的患者和特定的施用方式而变化。然而，应当理解，任何特定患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物或疫苗；患者的年龄、体重、身体面积、体重指数(BMI)、一般健康状况、性别和饮食；所采用的给药时间和给药途径；排泄率；以及所使用的药物组合(如果有)。所述化合物、疫苗和组合物可以单位剂量制剂进行给药。然而，应当理解，任何特定患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物或溶瘤病毒；患者的年龄、体重、身体面积、体重指数(BMI)、一般健康状况、性别和饮食；所采用的给药时间和给药途径；排泄率；以及所使用的药物组合(如果有)。所述化合物、溶瘤病毒和组合物可以单位剂量制剂进行给药。制备所选择的药物单位剂量并进行给药以在患者、受试者或个体中提供足够浓度的药物。
尽管用于本发明所述用途的化合物、疫苗和组合物可作为唯一的活性药剂进行给药，但其亦可与一种或多种其他药剂联合使用。当附加活性剂同用于本发明所述用途的化合物、疫苗或组合物联合使用时，所述附加活性剂通常可如Physicians'Desk Reference(PDR)第71版(2017)中所示的治疗量进行使用，此文献以引用方式并入本发明，或以本领域普通技术人员已知的此类治疗上有用的量进行使用，或如对每个患者凭经验确定的量进行使用。尽管用于本发明所述用途的化合物、溶瘤病毒和组合物可作为唯一的活性药剂进行给药，但其亦可与一种或多种其他药剂联合使用。当附加活性剂同用于本发明所述用途的化合物、溶瘤病毒或组合物联合使用时，所述附加活性剂通常可如Physicians'DeskReference(PDR)第71版(2017)中所示的治疗量进行使用，此文献以引用方式并入本发明，或以本领域普通技术人员已知的此类治疗上有用的量进行使用，或如对每个患者凭经验确定的量进行使用。
亦可使用两种或更多种本发明公开的化合物、疫苗和组合物的组合。所述两种或更多种化合物、疫苗或组合物可在给药前不久混合在一起并一同给药。所述两种或更多种化合物、疫苗或组合物可通过相同的给药途径或通过不同的给药途径同时给药。所述两种或更多种化合物、疫苗或组合物可通过相同的给药途径或通过不同的给药途径相继给药。在一个实施方案，试剂盒形式可包含作为单独形式的化合物、疫苗或组合物的两种或更多种化合物、疫苗或组合物，具有用于以化合物、疫苗或组合物的混合物给药、以单独的化合物、疫苗或组合物同时给药、或以单独的化合物、疫苗或组合物相继给药的印刷或电子说明书。当施用三种或更多种化合物、疫苗或组合物时，其可作为化合物、疫苗或组合物的混合物，作为同时给药的单独化合物、疫苗或组合物，作为相继给药的单独化合物、疫苗或组合物，作为其中两种或多种可同时给药、而其余在同时给药之前或之后相继给药、或以混合给药、同时给药和相继给药的任何其他可能的组合进行给药的单独的化合物、疫苗或组合物进行给药。
亦可使用两种或更多种本发明公开的化合物、溶瘤病毒和组合物的组合。所述两种或更多种化合物、溶瘤病毒或组合物可在给药前不久混合在一起并一同给药。所述两种或更多种化合物、溶瘤病毒或组合物可通过相同的给药途径或通过不同的给药途径同时给药。所述两种或更多种化合物、溶瘤病毒或组合物可通过相同的给药途径或通过不同的给药途径相继给药。在一个实施方案，试剂盒形式可包含作为单独形式的化合物、溶瘤病毒或组合物的两种或更多种化合物、溶瘤病毒或组合物，具有用于以化合物、溶瘤病毒或组合物的混合物给药、以单独的化合物、溶瘤病毒或组合物同时给药、或以单独的化合物、溶瘤病毒或组合物相继给药的印刷或电子说明书。当施用三种或更多种化合物、溶瘤病毒或组合物时，其可作为化合物、溶瘤病毒或组合物的混合物，作为同时给药的单独化合物、溶瘤病毒或组合物，作为相继给药的单独化合物、溶瘤病毒或组合物，作为其中两种或多种可同时给药、而其余在同时给药之前或之后相继给药、或以混合给药、同时给药和相继给药的任何其他可能的组合进行给药的单独的化合物、溶瘤病毒或组合物进行给药。
可用于本发明所述药物组合物和方法的本发明公开的化合物在一方面可以是经纯化形式，并且本发明公开了包含所述经纯化形式的化合物的组合物。本发明提供了包含本发明公开的化合物或其盐的组合物，例如基本上纯的化合物的组合物。在一些实施方案，包含本发明公开的化合物或其盐的组合物为基本上纯的形式。在一个变体中，“基本上纯”是指包含不超过35％杂质的组合物，其中所述杂质表示在所述组合物中施用的所述化合物(或多个化合物，如果使用化合物的组合)以外的化合物，或此化合物(或多个化合物，如果使用组合)的盐或溶剂化物。任何添加的媒剂、载体或辅料的重量不包括在此种计算中，并且所述添加的媒剂、载体或辅料不被视为杂质。譬如，选自表1所示化合物的基本纯的化合物的组合物是指包含不超过35％杂质的组合物，其中所述杂质表示除所述化合物或其盐或溶剂化物之外的化合物。在一个变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过25％杂质。在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过20％杂质。又在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过10％杂质。在进一步的变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过5％杂质。在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过3％杂质。又在另一变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过1％杂质。在进一步的变体中，本发明提供了基本上纯的化合物或其盐或溶剂化物的组合物，其中所述组合物包含不超过0.5％杂质。在其他变体中，基本上纯的化合物的组合物是指所述组合物包含不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过3％、或不超过1％的杂质。杂质可以是与所需立体化学形式不同的立体化学形式的化合物。例如，基本上纯的(S)-化合物的组合物是指所述组合物包含不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过3％、或不超过1％的所述(R)形式化合物。
或者，本发明使用的“对映异构体过量(ee)”是指描述包含例如单个立体中心的手性物质纯度的无量纲摩尔比。例如，对映异构体过量为零将表示外消旋体(例如，对映异构体的50:50混合物，或一种对映异构体相对于另一种对映异构体不过量)。作为进一步的实例，对映异构体过量为99将表示几乎立体纯的对映异构体化合物(即，一种对映异构体相对于另一种对映异构体大量过量)。对映异构体过量百分比，％ee＝([(R)-化合物]-[(S)-化合物])/([(R)-化合物]+[(S)-化合物])x 100，其中所述(R)-化合物>(S)-化合物；或％ee＝([(S)-化合物]-[(R)-化合物])/([(S)-化合物]+[(R)-化合物])x 100，其中所述(S)-化合物>(R)-化合物。此外，本发明使用的“非对映异构体过量(de)”是指描述包含多于一个立体中心的手性物质纯度的无量纲摩尔比。譬如，非对映异构体过量为零将表示非对映异构体的等摩尔混合物。作为进一步的实例，非对映异构体过量为99将表示几乎立体纯的非对映异构体化合物(即，一种非对映异构体相对于另一种非对映异构体大量过量)。非对映异构体过量可通过与ee类似的方法计算得到。正如技术人员所理解的，de通常报告为百分比de(％de)。％de可以与％ee类似的方式计算得到。
本发明公开的化合物、疫苗或组合物可提供在适当容器中。本发明公开的化合物、溶瘤病毒或组合物可提供在适当容器中。适当容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，单室或双室注射器)、袋(例如，静脉输液袋)和管(例如，试管)。容器可由多种材料(例如，玻璃或塑料)形成。
V.制品或试剂盒
本发明还提供了包含本发明所述的任何化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物的制品。所述制品包括用于所述化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物的适当容器或包装材料。适当容器的实例包括但不限于瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管。对于细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物，适当容器可以是培养器皿，包括但不限于管、皿、袋、多孔板、或烧瓶。
本发明还提供了包含本发明所述的任何化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物的试剂盒。试剂盒可在适当容器或包装材料中包含化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物，所述适当容器或包装材料包括但不限于瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管。试剂盒可在培养器皿中包含细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物，所述培养器皿包括但不限于管、皿、袋、多孔板、或烧瓶。试剂盒可包含所述化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养物组合物，用于以单剂量形式或多剂量形式施用于个体。试剂盒可进一步包含用于根据本发明公开的任何方法向个体施用所述化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物的说明书或标签。试剂盒可进一步包含用于向个体施用所述化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物的设备，包括但不限于针头、注射器、导管、或静脉输液袋。试剂盒可进一步包含用于生成本发明公开的任何化合物、药物组合物、细胞、经修饰的免疫细胞、细胞群、细胞组合物、细胞培养物、或细胞培养组合物的说明书。
本发明还提供了包含本发明所述的任何化合物、疫苗或药物组合物的制品。所述制品包括用于所述化合物、疫苗或药物组合物的适当容器或包装材料。本发明还提供了包含本发明所述的任何化合物、溶瘤病毒或药物组合物的制品。所述制品包括用于所述化合物、溶瘤病毒或药物组合物的适当容器或包装材料。适当容器的实例包括但不限于瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管。
本发明还提供了包含本发明所述的任何化合物、疫苗或药物组合物的试剂盒。试剂盒可在适当容器或包装材料中包含所述化合物、疫苗或药物组合物，所述适当容器或包装材料包括但不限于瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管。试剂盒可包含用于以单剂量形式或多剂量形式施用于个体的所述化合物、疫苗或药物组合物。试剂盒可进一步包含用于根据本发明公开的任何方法向个体施用所述化合物、疫苗或药物组合物的说明书或标签。试剂盒可进一步包含用于向个体施用所述化合物、疫苗或药物组合物的设备，包括但不限于针头、注射器、导管、或静脉输液袋。试剂盒可进一步包含用于生成本发明公开的任何化合物、疫苗或药物组合物的说明书。
本发明还提供了包含本发明所述的任何化合物、溶瘤病毒或药物组合物的试剂盒。试剂盒可在适当容器或包装材料中包含所述化合物、溶瘤病毒或药物组合物，所述适当容器或包装材料包括但不限于瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管。试剂盒可包含用于以单剂量形式或多剂量形式施用于个体的所述化合物、溶瘤病毒或药物组合物。试剂盒可进一步包含用于根据本发明公开的任何方法向个体施用所述化合物、溶瘤病毒或药物组合物的说明书或标签。试剂盒可进一步包含用于向个体施用所述化合物、溶瘤病毒或药物组合物的设备，包括但不限于针头、注射器、导管、或静脉输液袋。试剂盒可进一步包含用于生成本发明公开的任何化合物、溶瘤病毒或药物组合物的说明书。
通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，其不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本发明中描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，本领域技术人员将根据其进行的各种修改/修饰或改变/变化均将包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
实施例
一般后处理程序1
水溶液用乙酸乙酯萃取2-3次。合并的有机萃取液经硫酸钠或无水硫酸镁干燥，或用盐水或饱和氯化铵水溶液洗，然后干燥，过滤，真空浓缩。
纯化程序
使用各种CHIRALPAK色谱柱例如CHIRALPAK AS-H、CHIRALPAK AD-H或CHIRALPAKIG，使用溶剂体系例如CO2/MeOH、CO2/EtOH、或CO2/(MeOH+乙腈)，进行制备级手性超临界流体色谱(SFC)。
使用各种CHIRALPAK色谱柱例如CHIRALPAK IA、CHIRALPAK IF Cellulose-SB、CHIRALPAK IF和CHIRALPAK IG，使用溶剂体系例如己烷/甲醇、己烷/乙醇、(己烷+二氯甲烷)/乙醇、MTBE/甲醇、MTBE/乙醇、和(己烷-8mmol/L NH3)/甲醇，流动相B：乙醇及己烷/IPA，进行制备级手性HPLC。
使用色谱柱例如SunFire Prep C18 OBD、XBridge Prep OBD C18和XBridgeShield RP18 OBD，使用溶剂体系例如(水-0.1％甲酸)/乙腈、(水-10mmol/L NH4HCO3)/乙腈、或(水-10mmol/L NH4HCO3)/乙腈，进行制备级HPLC。
色谱法A是指通过硅胶纯化，通常在预装柱中，用EtOAc的己烷或石油醚的混合溶液洗脱；色谱法B是指用MeOH的DCM混合溶液洗脱；色谱法C是指使用C18反相硅胶，用乙腈的水混合溶液洗脱；色谱法D是指用乙醇、EtOAc和己烷的混合溶液洗脱。表1中未绘制立体化学的化合物在生物学实施例中作为外消旋混合物或非对映异构体混合物进行测试。
实施例中使用的缩写词包括以下：HATU：1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；T3P：丙基磷酸环酐；Xantphos：4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基呫吨；NBS：N-溴代琥珀酰亚胺；BPO：过氧化苯甲酰；THF：四氢呋喃；EtOAc：乙酸乙酯；DCM：二氯甲烷；MeOH：甲醇；DCE：1,2-二氯乙烷；TEA：三乙胺；DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；和DMF：N,N-二甲基甲酰胺。
实施例A：2-(溴甲基)-5-甲酰基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0003470586280000911
步骤1：3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸的合成。向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(18.0g，60.8mmol)、草酸(11.5g，91.2mmol)、乙酸酐(9.3g，91.2mmol)和DIPEA(11.8g，91.2mmol)的DMF(200mL)脱气溶液中加入Pd(OAc)2(1.4g，6.1mmol)和XantPhos(1.8g，3.0mmol)。将混合物在氮气下于100℃下搅拌16小时。通过添加HCl(1M，300mL)至pH～3来淬灭反应，然后进行一般后处理程序1。残余物经色谱法C纯化以提供标题化合物(7.5g，47％)。
步骤2：4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸的合成。向4-甲基-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(8g，30.5mmol)和NBS(8.2g，46mmol)的CCl4(160mL)搅拌溶液中加入BPO(2.2g，9mmol)。将溶液在80℃下搅拌16小时。混合物浓缩。粗产物经色谱法B纯化以提供标题化合物(8.0g，77％)。MS(ESI)计算值(C11H8BrF3O4)[M-H]-,339.0；实测值,339.1。
步骤3：2-(溴甲基)-5-(羟甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯的合成。向4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)-苯甲酸(2.65g，7.77mmol)的THF(30mL)搅拌溶液中加入硼烷(19.4mL，19.4mmol，1MTHF溶液)。将溶液在室温下搅拌6小时。然后通过加入甲醇(10mL)淬灭反应。混合物浓缩。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(1.40g，84％)。
步骤4：2-(溴甲基)-5-甲酰基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯的合成。向2-(溴甲基)-5-(羟甲基)-3-(三氟甲基)-苯甲酸甲酯(7.1g，21.71mmol)的EtOAc(70mL)搅拌溶液中加入2-碘酰基苯甲酸(9.1g，32.5mmol)。反应在70℃下搅拌3小时。过滤除去固体，滤液真空浓缩。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(6.6g，94％)。
实施例B：(R)-6-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮的合成
Figure BDA0003470586280000921
向(3R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶盐酸盐(5.00g，29.1mmol)的DCM(300.00mL)搅拌溶液中加入TEA(24.2mL，175mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(37.1g，175mmol)。将悬浮液搅拌10分钟，然后冷却至0℃，然后加入2-(溴甲基)-5-甲酰基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(9.47g，29.1mmol)的20mL DCM溶液。混合物在室温下搅拌约12小时。反应用饱和氯化铵淬灭，然后使用DCM进行一般后处理程序1。除去溶剂后，将粗残余物溶于甲醇(100mL)，然后向所得溶液中加入氨(7N甲醇溶液，100mL)。混合物在室温下搅拌12小时。将粗产物浓缩，残余物经色谱法B纯化以提供标题化合物(7.10g，70.0％)。
实施例C：4-环丙基-1-氧代-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-甲醛
Figure BDA0003470586280000931
步骤1：3-氨基-6-氯-2-碘吡啶-4-羧酸的合成。在0～10℃下，向5-氨基-2-氯吡啶-4-羧酸(100.0g，579.47mmol)的DMF(1.4L)溶液中分批加入N-碘代琥珀酰亚胺(195.6g，869.21mmol)。搅拌30分钟后，将所得混合物加热至80℃并搅拌16小时。反应混合物通过加入水淬灭，然后进行一般后处理程序1，得到标题化合物(140.0g，粗品)，其无需纯化即可用于下一步骤。
步骤2：3-氨基-6-氯-2-碘吡啶-4-羧酸甲酯的合成。在0℃下，向3-氨基-6-氯-2-碘吡啶-4-羧酸(70.0g，234.80mmol)的甲醇(90.0mL)和DCM(900mL)混合物中滴加TMSCHN2(176mL，2M己烷溶液)。所得混合物在室温下搅拌16小时。反应毕，真空除去有机溶剂。粗残余物用15％乙酸乙酯的石油醚溶液研制。通过过滤收集固体，干燥，提供标题化合物(65.0g，粗品)，其不经纯化即可用于下一步骤。
步骤3：3-氨基-6-氯-2-环丙基吡啶-4-羧酸甲酯的合成。将3-氨基-6-氯-2-碘吡啶-4-羧酸甲酯(45.0g，144.23mmol)、环丙基硼酸(49.6g，576.92mmol)、K2CO3(59.7g，432.69mmol)和Pd(dppf)Cl2(10.5g，14.42mmol)的二氧六环(1.5L)脱气混合物在N2气氛下于100℃下搅拌16h。滤出固体，滤液真空浓缩。将粗残余物溶于乙酸乙酯和水，然后进行一般后处理程序1，然后粗产物经色谱法A纯化，得到标题化合物(22.1g，三步收率67％)。
步骤4：6-氯-2-环丙基-3-碘吡啶-4-羧酸甲酯的合成。在0℃和N2气氛下，向3-氨基-6-氯-2-环丙基吡啶-4-羧酸甲酯(25.0g，110.62mmol)的二氯甲烷(1.5L)混合物中依次滴加t-BuONO(17.0g，169.00mmol)和BF3·Et2O(19.0g，264.70mmol)。所得混合物在室温下搅拌2小时。反应混合物通过加入己烷淬灭。过滤收集固体，干燥，得到6-氯-2-环丙基-4-(甲氧基羰基)吡啶-3-重氮四氟硼酸盐(33.4g)，在50℃下，将其分批加至KI(34.1g，205.52mmol)的水(250.0mL)混合物中。将所得混合物于50℃下搅拌2小时。当反应毕，进行一般后处理程序1，所得残余物经色谱法A纯化，得到标题化合物(23.0g，两步收率62％)。
步骤5：6-氯-2-环丙基-3-甲基吡啶-4-羧酸甲酯的合成。将6-氯-2-环丙基-3-碘吡啶-4-羧酸甲酯(23.0g，68.05mmol)、甲基硼酸(16.3g，272.20mmol)、Pd(dppf)Cl2(4.9g，6.81mmol)和K2CO3(28.2g，204.15mmol)的二氧六环(500mL)脱气混合物在N2气氛下于90℃下搅拌16小时。滤出固体，滤液真空浓缩。将粗残余物溶于乙酸乙酯和水中，进行一般后处理程序1，然后粗残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(12.5g，83％)。
步骤6：3-(溴甲基)-6-氯-2-环丙基吡啶-4-羧酸甲酯的合成。将6-氯-2-环丙基-3-甲基吡啶-4-羧酸甲酯(12.5g，55.56mmol)、NBS(19.8g，111.11mmol)和BPO(4.0g，16.67mmol)的CCl4(150.0mL)混合物在N2气氛下于80℃下搅拌16小时。当反应毕，滤出固体，滤液真空浓缩。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(7.8g，50％)。
步骤7：6-氯-4-环丙基-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮的合成。将3-(溴甲基)-6-氯-2-环丙基吡啶-4-羧酸甲酯(7.8g，25.83mmol)的NH3(7M MeOH溶液，80.0mL)混合物在室温下于N2气氛下搅拌16小时。所得混合物过滤，收集固体并用甲醇洗，得到6-氯-4-环丙基-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮(5.0g，92.1％)。
步骤8：4-环丙基-6-乙烯基-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮的合成。将6-氯-4-环丙基-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮(4.3g，43.96mmol)、乙烯基三氟硼酸钾(11.8g，87.91mmol)、Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(3.6g，4.39mmol)和Cs2CO3(20.8g，131.88mmol)的THF/水(v/v，10/1，220.0mL)脱气混合物在N2气氛下于80℃下搅拌4小时。当反应毕，真空除去溶剂。将粗残余物用乙酸乙酯和水溶解，然后进行一般后处理程序1，所得残余物经色谱法B纯化，得到标题化合物(3.5g，87％)。
步骤9：4-环丙基-1-氧代-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-甲醛的合成。在0℃下，向4-环丙基-6-乙烯基-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮(3.5g，17.50mmol)和4-甲基吗啉N-氧化物(6.1g，52.50mmol)的四氢呋喃(50mL)和水(20mL)溶液中加入K2OSO4·2H2O(127.4mg，0.35mmol)。所得混合物在室温下搅拌16小时。反应混合物通过加入NaHSO3(10.2g)淬灭，在室温下搅拌10分钟。然后向混合物中加入水(300.0mL)，将混合物用乙酸乙酯萃取。收集水层以提供4-环丙基-6-(1,2-二羟乙基)-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮的粗溶液(350mL)。向装有硅胶(65.6g)的三颈烧瓶中滴加NaIO4(7.5g，35.00mmol)的水(32.8mL)溶液，同时剧烈搅拌。室温搅拌20分钟后，向所得混合物中加入4-环丙基-6-(1,2-二羟乙基)-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮的粗溶液(350.0mL水溶液)，同时剧烈搅拌。所得混合物在室温下搅拌4小时。当反应毕，滤出固体，滤液用DCM萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，真空浓缩。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(1.7g，两步收率48％)。
实施例D：(R)-4-环丙基-6-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮
Figure BDA0003470586280000941
将4-环丙基-1-氧代-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-甲醛(840mg，4.16mmol)、(R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶盐酸盐(783mg，4.57mmol)和TEA(636μL，4.56mmol)的DCM(17mL)混合物在室温下搅拌10分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(969mg，4.57mmol)。1.5小时后，加入另外的三乙酰氧基硼氢化钠(177mg)。将反应搅拌过夜，然后用碳酸氢钠水溶液淬灭，然后使用DCM进行一般后处理程序1。粗物料经色谱法B纯化，然后经色谱法C纯化，得到标题化合物(626mg，47％)。
实施例E：(S)-4-环丙基-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮
Figure BDA0003470586280000951
将4-环丙基-1-氧代-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-甲醛(1.0g，4.95mmol)、(3S)-3-甲基哌啶盐酸盐(804mg，5.93mmol)和TEA(0.69mL，4.56mmol)的DCE(34mL)溶液在室温下搅拌15分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.36g，6.43mmol)。将反应搅拌过夜，然后用碳酸氢钠水溶液淬灭，然后使用DCM进行一般后处理程序1。粗物料经色谱法B纯化以提供标题化合物(1.1g，77％)。
实施例F：(S)-4-环丙基-6-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮
Figure BDA0003470586280000952
将4-环丙基-1-氧代-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-甲醛(100mg，0.49mmol)、(3S)-3-(三氟甲基)哌啶盐酸盐(94mg，0.49mmol)和TEA(0.069mL，0.49mmol)的DCE(3.4mL)溶液在室温下搅拌15分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(136mg，0.64mmol)。将反应搅拌过夜，然后用碳酸氢钠水溶液淬灭，然后使用DCM进行一般后处理程序1。粗物料经色谱法B纯化以提供标题化合物(91mg，54％)。
实施例G：(1r,3r)-3-(3-氨基苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280000953
步骤1：2-(3-氰基环丁亚基)乙酸甲酯的合成。在0℃下，向NaH(20.2g，504mmol，60.0％纯度，1.20当量)的THF(2.50L)溶液中加入2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(84.3g，462mmol，66.9mL，1.10当量)的THF(250mL)溶液。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后向混合物中加入3-氧代环丁烷-1-甲腈(40.0g，420mmol，1.00当量)的THF(250mL)溶液。将混合物升温至25℃后，混合物在25℃下搅拌12小时。将两批反应混合物倒入饱和NH4Cl溶液(4.0L)中并用乙酸乙酯(4.00L X 2)萃取。合并的有机层用盐水(2.0L)洗，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(81.7g，64.2％收率)。
步骤2：2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸甲酯和2-((1s,3s)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸甲酯的合成。在25℃下，向2-(3-氰基环丁亚基)乙酸甲酯(96.0g，635mmol，1.00当量)的二氧六环(1.00L)溶液和KOH(1.50M，550.mL，1.30当量)的混合溶液中加入(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)硼酸(225g，952mmol，1.50当量)和[Rh(cod)Cl]2(15.7g，31.8mmol，0.05当量)。然后将混合物在25℃下搅拌12小时。将两批反应混合物倒入饱和NH4Cl溶液(2.00L)中并进行一般后处理程序1。残余物经色谱法A纯化，首先洗脱得到的是2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸甲酯(133g，27.4％收率)。第二个洗脱化合物经反相色谱法进一步纯化，得到异构体2-((1s,3s)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸甲酯(105g，293mmol，23.1％收率)。
步骤3：2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸的合成。在25℃下，向2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸甲酯(133g，347mmol，1.00当量)的THF(600mL)溶液中加入LiOH·H2O(18.2g，434mmol，1.25当量)以及MeOH(120mL)和H2O(240mL)。然后将混合物在25℃下搅拌12小时。将反应混合物在25℃下真空浓缩。然后用0.5N HCl将混合物调节至pH＝3～4以产生沉淀，过滤收集，真空干燥。将滤饼溶于乙酸乙酯(1.50L)，混合物干燥，过滤，浓缩，以提供标题化合物(110g，粗品)。
步骤4：(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((5-巯基-4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成。在25℃下，向2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸(78.0g，223mmol，1.00当量)和N-甲基肼碳硫酰胺(35.3g，335mmol，1.50当量)的DMF(350mL)和DIPEA(28.9g，223mmol，39.0mL，1.00当量)溶液中加入HATU(110g，291mmol，1.30当量)。然后将混合物在25℃下搅拌4小时。在25℃下，向混合物中加入NaOH(1.00M，470mL，2.10当量)。然后将混合物加热至50℃并于50℃下搅拌12小时。混合物冷却至25℃后，将反应混合物倒入饱和NH4Cl溶液(1.30L)中。将固体沉淀，过滤收集，滤饼真空干燥。将滤饼溶于乙酸乙酯(1.00L)，并将混合物干燥，过滤，浓缩，以提供标题化合物(100g，粗品)。
步骤5：(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成。在0℃下，向(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((5-巯基-4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(122g，277mmol，1.00当量)的DCM(1.00L)和乙酸(233g，3.89mol，222mL，14.0当量)溶液中加入H2O2(78.8g，694mmol，66.8mL，30.0％纯度，2.50当量)。然后将反应混合物在30℃下搅拌2小时。将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液(2.00L)中并用DCM(500mL X 3)萃取。合并的有机层用盐水(600mL)洗。然后有机层干燥，过滤，浓缩。残余物经色谱法B纯化以提供标题化合物(83.0g，78.9％收率)。
步骤6：(1r,3r)-3-(3-氨基苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。在25℃下，向(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(50.0g，132mmol，1.00当量)的DCM(500mL)溶液中加入TMSI(106g，528mmol，71.9mL，4.00当量)。然后将混合物在25℃下搅拌2小时。向反应混合物中加入水(300mL)。分离水相并用饱和Na2CO3溶液调节至pH＝7～8，然后用DCM:甲醇＝10:1(500mL X 5)萃取。合并的有机层干燥，过滤，浓缩。残余物经色谱法B纯化以提供标题化合物(10.5g，38.6mmol，29.2％收率)。
实施例H：(1r,3r)-3-(3-氨基苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280000971
步骤1：2-(3-氰基-3-甲基环丁亚基)乙酸甲酯的合成。反应类似于实施例G步骤1进行，使用1-甲基-3-氧代环丁烷-1-甲腈(2.5g，22.9mmol)，以生成标题化合物(3.5g，83％)。
步骤2：2-[(反式)-1-(3-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯基)-3-氰基-3-甲基环丁基]乙酸甲酯的合成。反应类似于实施例G步骤2进行，使用1-甲基-3-氧代环丁烷-1-甲腈(3.5g，21.2mmol)，以生成标题化合物(1.1g，15％)为第二个洗脱异构体。
步骤3：2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基-3-甲基环丁基)乙酸的合成。反应类似于实施例G步骤3进行，使用2-[(反式)-1-(3-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯基)-3-氰基-3-甲基环丁基]乙酸甲酯(1.1g，3.1mmol)。通过将混合物浓缩至干，然后加入水(50mL)并用1N HCl(3.8mL)酸化溶液以提供pH～5，对反应进行后处理，然后进行一般后处理程序1，得到标题化合物(1.05g，3.1mmol)。
步骤4：(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((5-巯基-4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-甲基环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成。反应类似于实施例G步骤4进行，使用2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基-3-甲基环丁基)乙酸(1.05g，3.1mmol)，以得到标题化合物(1.2g，91％)。
步骤5：(3-((1r,3r)-3-氰基-3-甲基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成。反应类似于实施例G步骤5进行，使用(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((5-巯基-4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-甲基环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(640mg，1.6mmol)，以生成标题化合物(440mg，75％)。
步骤6：(1r,3r)-3-(3-氨基苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。反应类似于实施例G步骤6进行，使用(3-((1r,3r)-3-氰基-3-甲基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(440mg，1.6mmol)，以生成标题化合物(290mg，89％)。
实施例I：(1r,3r)-3-(3-溴苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280000981
(1r,3r)-3-(3-溴苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈。向实施例G(100mg，0.37mmol)和CuBr2(167mg，0.75mmol)的乙腈(4.5mL)搅拌悬浮液中逐滴加入亚硝酸叔丁酯(67μL，0.56mmol)。将反应搅拌1小时，然后浓缩至一半体积，用NH4OH(～6M，15mL)淬灭，然后进行一般后处理程序1并通过色谱法B纯化以提供标题化合物(60％收率)。
实施例1：N-(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-2-环丙基-6-甲基嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003470586280000982
向实施例G(53mg，0.20mmol)、N-甲基吗啉(65μL，0.59mmol)和2-环丙基-6-甲基嘧啶-4-羧酸(35mg，0.20mmol)的乙腈(1.6mL)溶液中加入1-丙烷膦酸酐溶液(50％DMF溶液，0.14mL，0.25mmol)。将反应在室温下搅拌过夜，然后加入0.5N HCl水溶液(5mL)和水(5mL)。进行一般后处理程序1，保持水溶液的pH值为～7，合并的有机物干燥，过滤。经由色谱法B得到标题化合物(11mg，15％)。LCMS:C24H25N7O要求427.2,实测值428.4[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ9.90(s,1H),7.87(s,1H),7.80–7.70(m,2H),7.40(t,J＝2.0Hz,1H),7.29(t,J＝7.9Hz,1H),6.79(ddd,J＝7.7,1.9,1.0Hz,1H),3.29(s,2H),3.15–3.08(m,1H),2.97–2.84(m,4H),2.77(s,3H),2.53(s,3H),2.32(tt,J＝8.0,4.7Hz,1H),1.19(tt,J＝5.7,3.0Hz,2H),1.12(dt,J＝8.1,3.0Hz,2H)。
实施例2：N-(3-((1s,3s)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-2-环丙基-6-甲基嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003470586280000983
标题化合物通过进行实施例G步骤3-6的反应，然后使用来自实施例G步骤2的2-((1s,3s)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-氰基环丁基)乙酸甲酯从实施例1形成酰胺得到，在反相HPLC后得到标题化合物(20mg，55％)。LCMS:C24H25N7O要求427.2,实测值428.4[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ9.90(s,1H),8.71(s,1H),7.83(s,1H),7.78–7.67(m,1H),7.39(t,J＝7.9Hz,1H),7.29(t,J＝2.0Hz,1H),6.85(dt,J＝8.0,1.3Hz,1H),3.61(p,J＝8.9Hz,1H),3.48(s,2H),3.11–2.97(m,2H),2.90(s,3H),2.80(td,J＝9.4,2.6Hz,2H),2.61(s,3H),2.40(tt,J＝8.1,4.7Hz,1H),1.29(tt,J＝5.9,3.1Hz,2H),1.22(dt,J＝8.1,3.1Hz,2H)。
实施例3：(1r,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280000991
向含有实施例G(31mg，0.12mmol)的小瓶中装入乙腈(1.0mL)和2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(35mg，0.12mmol)。将硝酸银(26mg，0.15mmol)溶于水(0.5mL)中并逐滴加至混合物中，将反应在室温下搅拌过夜。加入固体碳酸氢盐以调节pH～8，然后加入盐水(1mL)。将反应过滤，滤液用DCM:异丙醇(9:1，3x15mL)萃取，合并的有机物干燥，过滤，然后进行反相HPLC纯化(10％至95％MeCN的水溶液，含0.1％TFA，梯度洗脱10分钟)，得到标题化合物(6.4mg，12％)。LCMS:C24H20F3N5O要求451.2,实测值452.3[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.13(s,1H),8.05(d,J＝7.6Hz,1H),7.95(d,J＝7.7Hz,1H),7.84(ddd,J＝8.1,2.2,0.9Hz,1H),7.73(t,J＝7.7Hz,1H),7.47(t,J＝2.1Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.92–6.86(m,1H),5.01(s,2H),3.41(s,2H),3.16–3.07(m,1H),2.96(d,J＝7.8Hz,4H),2.83(d,J＝13.4Hz,5H)。
实施例4：(1r,3r)-3-(3-(6-((5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280000992
步骤1：(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。环化反应类似于实施例3进行，使用实施例G(136mg，0.51mmol)和2-(溴甲基)-5-甲酰基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(166mg，0.51mmol)以得到粗制标题化合物(240mg，98％)，其无需纯化即可使用。
步骤2：(1r,3r)-3-(3-(6-((5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。将(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)、5-氮杂螺[2.4]庚烷盐酸盐(21mg，0.16mmol)和TEA(14.6μL，0.10mmol)的DCE(0.42mL)溶液搅拌15分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(33mg，0.16mmol)。将反应搅拌过夜，然后用碳酸氢钠水溶液淬灭，然后使用DCM进行一般后处理程序1。粗物料经色谱法B纯化，然后经色谱法C纯化，得到标题化合物(10mg，17％)。LCMS:C31H31F3N6O要求560.3,实测值561.4[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.94(s,1H),7.89(s,1H),7.88–7.83(m,1H),7.43(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(ddd,J＝7.7,1.8,0.9Hz,1H),4.98(d,J＝1.5Hz,2H),3.81(s,2H),3.34(s,2H),3.21–3.10(m,1H),3.04–2.90(m,4H),2.77(d,J＝9.0Hz,5H),2.52(s,2H),1.83(t,J＝6.9Hz,2H),0.55(d,J＝1.6Hz,4H)。
实施例5：(1r,3r)-3-(3-(6-((2-乙基-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001001
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(60mg，0.13mmol)和2-乙基-1,4-氧杂氮杂环庚烷(32mg，0.25mmol)，经色谱法C后得到标题化合物(29mg，39％)。LCMS:C32H35F3N6O2要求592.3,实测值593.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.97(s,1H),7.93–7.84(m,2H),7.44(t,J＝2.1Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.91–6.82(m,1H),4.99(s,2H),3.94–3.79(m,3H),3.79–3.67(m,1H),3.50(tdd,J＝7.7,5.0,2.4Hz,1H),3.34(s,2H),3.22–3.07(m,1H),3.03–2.91(m,4H),2.88–2.72(m,5H),2.64(ddd,J＝12.8,9.0,3.9Hz,1H),2.42(dd,J＝13.3,8.9Hz,1H),1.96–1.85(m,1H),1.86–1.76(m,1H),1.45–1.26(m,2H),0.86(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例6：(1r,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(((R)-2-甲基吗啉基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001011
还原胺化类似于实施例14步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和(2R)-2-甲基吗啉(22mg，0.22mmol)，在使用0.1％TFA添加剂进行色谱法C后得到标题化合物。将含有产物的级分浓缩，残余物溶于DCM，用碳酸氢钠水溶液洗。有机层干燥，浓缩，得到产物(15mg，36％)。LCMS:C30H31F5N6O2要求564.2,实测值565.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.01(s,1H),7.98–7.83(m,3H),7.43(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(ddd,J＝7.8,1.8,0.9Hz,1H),4.99(s,2H),3.81(ddd,J＝11.3,3.4,1.6Hz,1H),3.68(d,J＝1.8Hz,2H),3.61(ddt,J＝11.5,9.3,2.4Hz,2H),3.34(s,2H),3.21–3.08(m,1H),3.04–2.90(m,4H),2.73(dt,J＝11.2,2.0Hz,1H),2.66(dd,J＝11.2,2.1Hz,1H),1.87(dd,J＝11.3,9.8Hz,1H),1.09(d,J＝6.2Hz,3H)。
实施例7：(1r,3r)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(((R)-2-甲基吗啉基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001012
步骤1.(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。反应类似于实施例3进行，使用实施例H(234mg，0.83mmol)和2-(溴甲基)-5-甲酰基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(270mg，0.83mmol)，经由色谱法B后生成标题化合物(200mg，49％)。
步骤2.(1r,3r)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(((R)-2-甲基吗啉基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈的合成。还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(53mg，0.11mmol)和(2R)-2-甲基吗啉盐酸盐(22mg，0.16mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(19mg，31％)。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.02(d,J＝3.2Hz,1H),7.98–7.83(m,3H),7.51(q,J＝2.1Hz,1H),7.40(t,J＝8.1Hz,1H),6.98(d,J＝7.8Hz,1H),5.01(s,2H),3.88–3.76(m,1H),3.74–3.54(m,4H),3.20(d,J＝3.3Hz,2H),3.16–3.04(m,2H),2.88(dt,J＝11.6,2.7Hz,2H),2.81–2.70(m,4H),2.66(dt,J＝11.5,2.0Hz,1H),1.87(t,J＝10.6Hz,1H),1.66(d,J＝1.3Hz,3H),1.09(dd,J＝6.4,1.4Hz,3H)。
实施例8：N-(3-((1r,3r)-3-氰基-3-甲基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-2-环丙基-6-甲基嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003470586280001021
反应类似于实施例1进行，使用实施例H(47mg，0.17mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(45mg，61％)。LCMS:C25H27N7O要求441.2,实测值442.4[M+H]+。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.42(s,1H),8.18(s,1H),7.83(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.59(t,J＝1.9Hz,1H),7.30(t,J＝7.9Hz,1H),6.81(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),3.16(s,2H),3.01–2.89(m,2H),2.78(d,J＝18.0Hz,5H),2.52(s,3H),2.34(tt,J＝8.1,4.7Hz,1H),1.58(s,3H),1.21–1.01(m,4H)。
实施例9：(1S,3s)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(((R)-2-甲基吗啉基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001022
标题化合物通过类似于实施例H步骤3-6，使用从实施例H步骤2分离的第一个洗脱异构体合成得到。在步骤6之后，以类似于实施例1进行反应，并经由色谱法C后提供标题化合物(27mg，38％)。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.16(s,1H),8.00(s,1H),7.95(s,1H),7.88–7.80(m,1H),7.37–7.27(m,2H),6.68(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),5.09(s,2H),3.80–3.62(m,3H),3.62–3.46(m,2H),3.26–3.17(m,2H),2.75–2.55(m,8H),2.11(td,J＝11.4,3.4Hz,1H),1.81(t,J＝10.5Hz,1H),1.41(s,3H),1.04(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例10：(1S,3s)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(((R)-2-甲基吗啉基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001031
标题化合物通过类似于实施例7，使用来自实施例H步骤2的第一个洗脱异构体合成得到。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.16(s,1H),8.00(s,1H),7.95(s,1H),7.88–7.80(m,1H),7.37–7.27(m,2H),6.68(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),5.09(s,2H),3.80–3.62(m,3H),3.62–3.46(m,2H),3.26–3.17(m,2H),2.75–2.55(m,8H),2.11(td,J＝11.4,3.4Hz,1H),1.81(t,J＝10.5Hz,1H),1.41(s,3H),1.04(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例11：(1R,3r)-3-(3-(6-(((R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001032
将实施例I(70mg，0.21mmol)、(R)-6-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(74mg，0.21mmol)、Cs2CO3(152mg，0.46mmol)、xantphos(25mg，0.04mmol)和Pd(OAc)2(4.7mg，0.02mmol)的二氧六环(0.72mL)混合物在120℃下加热1小时。将所得混合物直接浓缩到硅藻土上并采用色谱法C纯化以提供标题化合物(35mg，27％)。LCMS:C31H31F5N6O要求598.2,实测值599.4[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.99(s,1H),7.91(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.8,1.2Hz,1H),4.96(s,2H),3.71(s,2H),3.35–3.26(m,2H),3.20–3.07(m,1H),3.01–2.85(m,4H),2.83–2.64(m,5H),2.37(t,J＝11.4Hz,1H),2.14–1.97(m,4H),0.97(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例12：(1r,3r)-3-(3-(6-(((6,6-二氟双环[3.1.0]己烷-3-基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001033
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和6,6-二氟双环[3.1.0]己烷-3-胺盐酸盐(25mg，0.15mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物。LCMS:C31H29F5N6O要求596.2,实测值597.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.93(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.40(d,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝7.3Hz,1H),4.95(s,2H),3.93(s,2H),3.31(s,2H),3.21–3.07(m,2H),2.98–2.91(m,4H),2.75(s,3H),2.26(dd,J＝13.5,7.2Hz,2H),2.06–2.02(m,2H),1.90–1.79(m,3H)。
实施例13：(1r,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-((4-甲基氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001041
将(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)、4-甲基氮杂环庚烷(24mg，0.21mmol)和乙酸(6μL，0.10mmol)的DCE(0.71mL)混合物搅拌15分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(30mg，0.14mmol)。将反应搅拌过夜，然后用碳酸氢钠水溶液淬灭，然后使用DCM进行一般后处理程序1。粗物料经色谱法C纯化以提供标题化合物(29mg，47％)。LCMS:C32H35F3N6O要求576.3,实测值577.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.99(s,1H),7.93(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.8,1.2Hz,1H),4.95(s,2H),3.78(s,2H),3.31(s,2H),3.19–3.08(m,1H),2.97–2.90(m,4H),2.75(s,3H),2.71–2.53(m,5H),1.77–1.50(m,3H),1.40–1.29(m,2H),0.93(d,J＝6.6Hz,3H)。
实施例14：(1R,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(1-氧代-4-(三氟甲基)-6-(((S)-3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001042
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和(3S)-3-(三氟甲基)哌啶盐酸盐(21mg，0.11mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(19mg，41％)。LCMS:C31H30F6N6O要求616.2,实测值617.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.98(s,1H),7.90(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝7.9,1.8Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.88–6.82(m,1H),4.96(s,2H),3.71(s,2H),3.31(s,2H),3.17–3.09(m,1H),2.99–2.88(m,5H),2.82(d,J＝11.6Hz,1H),2.75(s,3H),2.47(t,J＝11.4Hz,1H),2.11–2.00(m,3H),1.75(d,J＝13.6Hz,1H),1.63–1.52(m,1H),1.32(qd,J＝12.5,4.3Hz,1H)。
实施例15：(1R,3r)-3-(3-(6-(((2R,6S)-2,6-二甲基吗啉基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001051
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(40mg，0.09mmol)和顺式-2,6-二甲基吗啉(20mg，0.17mmol)，经色谱法C后得到标题化合物(20mg，41％)。LCMS:C29H30F3N7O2要求565.2,实测值565.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.11(s,1H),8.05–7.93(m,3H),7.89(s,1H),7.74(s,1H),7.52(t,J＝7.9Hz,1H),7.21(dt,J＝7.7,1.2Hz,1H),5.04(s,2H),3.90(s,3H),3.68–3.58(m,4H),3.36(s,3H),2.69(dt,J＝10.5,1.9Hz,2H),1.76(t,J＝10.7Hz,2H),1.06(d,J＝6.2Hz,6H)。
实施例16：(1S,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(1-氧代-4-(三氟甲基)-6-(((S)-2-(三氟甲基)吗啉基)甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001052
还原胺化类似于实施例14步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(30mg，0.06mmol)和(2S)-3-(三氟甲基)吗啉盐酸盐(18mg，0.09mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(19mg，41％)。LCMS:C31H28F6N6O2要求618.2,实测值619.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.04(s,1H),7.95(s,1H),7.91–7.84(m,2H),7.43(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.89(d,J＝7.7Hz,1H),5.00(s,2H),4.17–4.06(m,1H),4.03–3.94(m,1H),3.78(s,2H),3.72(td,J＝11.4,2.5Hz,1H),3.34(s,2H),3.21–3.09(m,1H),3.05–2.88(m,5H),2.78(s,3H),2.72(d,J＝11.9Hz,1H),2.37–2.24(m,2H)。
实施例17：(1r,3r)-3-(3-(6-((4,4-二氟氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001061
还原胺化类似于实施例14步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(30mg，0.06mmol)和4,4-二氟氮杂环庚烷盐酸盐(16mg，0.09mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(23mg，58％)。LCMS:C31H31F5N6O要求598.2,实测值599.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.99(s,1H),7.93(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.41(s,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝7.8Hz,1H),4.96(s,2H),3.81(s,2H),3.31(s,2H),3.18–3.07(m,1H),2.99–2.89(m,4H),2.75(s,3H),2.71(t,J＝5.9Hz,2H),2.69–2.61(m,2H),2.24–2.14(m,3H),1.79–1.70(m,3H)。
实施例18：(1R,3r)-3-(3-(6-(((3S,5R)-3,5-二甲基哌啶-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001062
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(30mg，0.06mmol)和(3R,5S)-3,5-二甲基哌啶(10mg，0.09mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(18mg，50％)。LCMS:C32H35F3N6O要求576.3,实测值577.6[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.96(s,1H),7.90–7.81(m,3H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝8.0,1.1Hz,1H),4.96(s,2H),3.63(s,2H),3.31(s,2H),3.17–3.07(m,1H),3.02–2.89(m,4H),2.81–2.71(m,5H),1.75–1.59(m,3H),1.54(t,J＝10.8Hz,2H),0.83(d,J＝6.4Hz,6H),0.54(q,J＝11.8Hz,1H)。
实施例19：(1R,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001071
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和(3S)-3-甲基哌啶盐酸盐(25mg，0.18mmol)，经由色谱法后得到标题化合物(39mg，66％)。LCMS:C31H33F3N6O要求562.3,实测值563.6[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.96(s,1H),7.89(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),7.40(t,J＝2.1Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.8,1.4Hz,1H),4.95(s,2H),3.62(s,2H),3.31(s,2H),3.18–3.09(m,1H),3.00–2.89(m,4H),2.81–2.66(m,5H),1.73–1.46(m,6H),0.96–0.87(m,1H),0.84(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例20：(1R,3r)-3-(3-(6-((((S)-3,3-二氟环戊基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001072
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(150mg，0.30mmol)和(1S)-3,3-二氟环戊烷-1-胺盐酸盐(61mg，0.39mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(79mg，41％)。LCMS:C30H29F5N6O要求584.2,实测值585.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.92(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),7.40(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.8,1.2Hz,1H),4.95(s,2H),3.91(s,2H),3.35–3.24(m,3H),3.17–3.08(m,1H),2.99–2.89(m,4H),2.75(s,3H),2.43–2.30(m,1H),2.29–2.17(m,1H),2.10–1.96(m,4H),1.68–1.57(m,1H)。
实施例21：(1R,3r)-3-(3-(6-((((R)-3,3-二氟环戊基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001073
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(150mg，0.30mmol)和(1R)-3,3-二氟环戊烷-1-胺盐酸盐(61mg，0.39mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(70mg，37％)。LCMS:C30H29F5N6O要求584.2,实测值585.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.92(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),7.40(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.8,1.2Hz,1H),4.95(s,2H),3.91(s,2H),3.35–3.24(m,3H),3.17–3.08(m,1H),2.99–2.89(m,4H),2.75(s,3H),2.43–2.30(m,1H),2.29–2.17(m,1H),2.10–1.96(m,4H),1.68–1.57(m,1H)。
实施例22：(1r,3r)-3-(3-(6-(((3,3-二氟环丁基)(甲基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001081
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(30mg，0.06mmol)和3,3-二氟-N-甲基环丁烷-1-胺盐酸盐(15mg，0.09mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(17mg，47％)。LCMS:
C30H29F5N6O要求584.2,实测值585.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.98(s,1H),7.90(s,1H),7.89–7.81(m,2H),7.40(t,J＝2.1Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.86(d,J＝7.8Hz,1H),4.96(s,2H),3.59(s,2H),3.31(s,2H),3.18–3.08(m,1H),3.01–2.87(m,5H),2.79–2.68(m,5H),2.57–2.43(m,2H),2.04(s,3H)。
实施例23：(1r,3r)-3-(3-(6-(((1,1-二氟螺[2.3]己烷-5-基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001082
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和1,1-二氟螺[2.3]己烷-5-胺盐酸盐(25mg，0.15mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(6mg，13％)。LCMS:C31H29F5N6O要求596.2,实测值597.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.94(s,1H),7.90–7.81(m,2H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝8.1Hz,1H),4.95(s,2H),3.89(s,2H),3.46(dp,J＝74.4,7.2Hz,1H),3.31(s,2H),3.19–3.05(m,1H),3.00–2.87(m,5H),2.75(s,3H),2.45–2.37(m,1H),2.28–2.19(m,2H),1.26(dt,J＝22.2,8.4Hz,3H)。
实施例24：(1r,3r)-3-(3-(6-(((5,5-二甲基四氢呋喃-3-基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001091
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和5,5-二甲基氧杂环戊烷-3-胺(16mg，0.15mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(3mg，6％)。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.92(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),7.40(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝7.9Hz,1H),4.95(s,2H),3.94–3.84(m,3H),3.54(dd,J＝8.8,5.6Hz,1H),3.48–3.40(m,1H),3.31(s,2H),3.16–3.09(m,1H),2.98–2.92(m,4H),2.75(s,3H),2.50(s,1H),2.02(dd,J＝12.5,7.6Hz,1H),1.58(dd,J＝12.5,6.1Hz,1H),1.28(s,3H),1.15(s,3H)。
实施例25：(1r,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-((3-甲基氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001092
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和3-甲基氮杂环庚烷盐酸盐(47mg，0.31mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(27mg，42％)。LCMS:C32H35F3N6O要求576.3,实测值577.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.99(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.0,2.3Hz,2H),7.41(t,J＝2.1Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),4.95(s,2H),3.80(s,2H),3.31(s,2H),3.18–3.04(m,1H),3.00–2.89(m,4H),2.83–2.62(m,5H),2.62–2.53(m,1H),2.32(dd,J＝13.1,9.0Hz,1H),1.76–1.46(m,5H),1.34–1.24(m,1H),0.80(d,J＝6.7Hz,3H)。
实施例26：(1r,3r)-3-(3-(6-((3-氟-3-甲基氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001101
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和3-氟-3-甲基氮杂环庚烷(27mg，0.21mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(29mg，46％)。LCMS:C32H34F4N6O要求594.3,实测值595.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.01(s,1H),7.97(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.9,1.4Hz,1H),4.96(s,2H),3.91–3.81(m,2H),3.31(s,2H),3.17–3.08(m,1H),3.02–2.83(m,5H),2.80–2.60(m,6H),1.88–1.66(m,4H),1.65–1.54(m,1H),1.47–1.39(m,1H),1.22(d,J＝21.5Hz,3H)。
实施例27：(1r,3r)-3-(3-(6-((7,7-二氟-3-氮杂双环[4.1.0]庚烷-3-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001102
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和7,7-二氟-3-氮杂双环[4.1.0]庚烷盐酸盐(19mg，0.11mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(22mg，49％)。LCMS:C31H29F5N6O要求596.2,实测值597.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.96(s,1H),7.89(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.7,1.3Hz,1H),4.96(s,2H),3.69–3.55(m,2H),3.31(s,2H),3.18–3.07(m,1H),3.00–2.90(m,4H),2.80–2.71(m,4H),2.62(d,J＝12.0Hz,1H),2.34–2.25(m,1H),2.25–2.18(m,1H),2.01–1.95(m,1H),1.83–1.68(m,3H)。
实施例28：(1r,3r)-3-(3-(6-((7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001111
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和5,6,7,8-四氢-1,6-萘啶二盐酸盐(23mg，0.11mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(12mg，26％)。LCMS:C33H30F3N7O要求597.2,实测值598.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.35(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.04(s,1H),7.97(s,1H),7.87(s,1H),7.85(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.38–7.32(m,2H),7.09(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),6.85(d,J＝7.8Hz,1H),4.98(s,2H),3.88(s,2H),3.66(s,2H),3.31(s,2H),3.18–3.08(m,1H),3.01–2.83(m,8H),2.75(s,3H)。
实施例29：(1r,3r)-3-(3-(6-((1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001112
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(35mg，0.07mmol)和1,4-氧杂氮杂环庚烷盐酸盐(20mg，0.15mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(22mg，51％)。LCMS:C31H29F5N6O要求564.2,实测值565.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.93(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝7.8Hz,1H),4.96(s,2H),3.83(s,2H),3.76(t,J＝6.0Hz,2H),3.69–3.64(m,2H),3.31(s,2H),3.13(tt,J＝9.6,7.1Hz,1H),2.99–2.92(m,4H),2.75(s,3H),2.73–2.67(m,4H),1.89–1.85(m,2H)。
实施例30：(1r,3r)-3-(3-(6-((5-氧杂-8-氮杂螺[2.6]壬烷-8-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001121
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(62mg，0.13mmol)和5-氧杂-8-氮杂螺[2.6]壬烷(49mg，0.39mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(38mg，50％)。LCMS:C32H33F3N6O2要求590.3,实测值591.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.99(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(dt,J＝7.7,1.1Hz,1H),4.95(s,2H),3.82(s,2H),3.80–3.73(m,2H),3.52(s,2H),3.31(s,2H),3.13(tt,J＝9.4,6.9Hz,1H),3.01–2.88(m,4H),2.83–2.77(m,2H),2.75(s,3H),2.54(s,2H),0.44(d,J＝9.9Hz,4H)。
实施例31：(1r,3r)-3-(3-(6-(((3,3-二甲基环戊基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001122
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和3,3-二甲基环戊烷-1-胺盐酸盐(27mg，0.18mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(34mg，37％)。LCMS:C32H35F3N6O要求576.3,实测值577.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.01(s,1H),7.94(s,1H),7.91–7.84(m,2H),7.43(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),4.98(s,2H),3.91(s,2H),3.34(s,2H),3.24(p,J＝7.2Hz,1H),3.21–3.09(m,1H),3.03–2.90(m,4H),2.78(s,3H),2.02–1.99(m,1H),1.77(dd,J＝12.6,7.3Hz,1H),1.61–1.45(m,2H),1.45–1.35(m,1H),1.26(dd,J＝12.6,7.5Hz,1H),1.10(s,3H),0.99(s,3H)。
实施例32：(1r,3r)-3-(3-(6-(((3,3-二氟环戊基)(甲基)氨基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001131
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(75mg，0.16mmol)和3,3-二氟-N-甲基环戊烷-1-胺盐酸盐(47mg，0.27mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(34mg，37％)。LCMS:
C31H31F5N6O要求598.2,实测值599.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.92(s,1H),7.89(s,1H),7.87(ddd,J＝8.2,2.3,0.9Hz,1H),7.43(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),4.99(s,2H),3.71(dd,J＝17,14Hz,2H),3.34(s,2H),3.20–3.12(m,2H),3.02–2.92(m,4H),2.78(s,3H),2.48–2.35(m,1H),2.30–2.20(m,1H),2.15(s,3H),2.15–1.99(m,3H),1.87–1.75(m,1H)。
实施例33：(1r,3r)-3-(3-(6-((2-甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001132
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(75mg，0.16mmol)和2-甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷(36mg，0.31mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(55mg，58％)。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝7.9Hz,1H),4.96(s,2H),3.84–3.77(m,3H),3.77–3.68(m,2H),3.31(s,2H),3.16–3.08(m,1H),2.99–2.90(m,4H),2.83–2.73(m,5H),2.61(ddd,J＝12.9,8.8,4.3Hz,1H),2.39(dd,J＝13.4,8.9Hz,1H),1.82–1.75(m,2H),1.01(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例34：(1r,3r)-3-(3-(6-((2,7-二甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001141
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(100mg，0.21mmol)和2,7-二甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷(40mg，0.31mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(52mg，39％)。LCMS:C32H35F3N6O2要求592.3,实测值593.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.93(s,1H),7.86(s,1H),7.84(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(s,1H),7.34(t,J＝7.9Hz,1H),6.85(d,J＝7.7Hz,1H),4.96(s,2H),3.99–3.87(m,1H),3.83–3.71(m,3H),3.31(s,2H),3.13(p,J＝8.0Hz,1H),3.02–2.89(m,5H),2.80–2.60(m,7H),2.36(dd,J＝13.0,8.9Hz,1H),1.56(ddd,J＝14.0,11.3,6.3Hz,1H),1.10(d,J＝6.3Hz,3H),1.01(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例35：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001142
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和6-甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷(18mg，0.16mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(16mg，26％)。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.98(s,1H),7.89(s,1H),7.87(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.44(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(d,J＝7.8Hz,1H),4.99(s,2H),3.86(d,J＝4.4Hz,2H),3.82(dd,J＝11.9,5.1Hz,1H),3.75(ddd,J＝12.4,7.8,3.3Hz,1H),3.63(ddd,J＝12.4,5.5,3.4Hz,1H),3.39(dd,J＝12.0,8.4Hz,1H),3.34(s,2H),3.20–3.12(m,1H),3.03–2.93(m,4H),2.82–2.74(m,6H),2.68(ddd,J＝13.4,7.8,3.4Hz,1H),2.45(dd,J＝12.9,8.1Hz,1H),0.80(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例36：(1r,3r)-3-(3-(6-((7-甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001151
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和7-甲基-1,4-氧杂氮杂环庚烷(18mg，0.16mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(26mg，41％)。LCMS:C31H33F3N6O2要求578.3,实测值579.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.99(s,1H),7.92(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝7.9,2.2Hz,1H),7.40(t,J＝2.1Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝8.2Hz,1H),4.96(s,2H),3.93–3.85(m,1H),3.82–3.74(m,3H),3.60–3.52(m,1H),3.31(s,2H),3.17–3.08(m,1H),2.99–2.91(m,4H),2.81–2.58(m,8H),1.72–1.62(m,1H),1.11(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例37：(1r,3r)-3-(3-(6-((9-氧杂-3-氮杂双环[4.2.1]壬烷-3-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001152
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(62mg，0.13mmol)和9-氧杂-3-氮杂双环[4.2.1]壬烷(25mg，0.19mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(27mg，35％)。LCMS:C32H33F3N6O2要求590.3,实测值591.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.01(s,1H),7.97(s,1H),7.86(s,1H),7.84(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.42(t,J＝2.0Hz,1H),7.38–7.30(m,1H),6.85(d,J＝7.9Hz,1H),4.96(s,2H),4.39(t,J＝8.6Hz,1H),4.23(ddd,J＝7.5,5.1,2.6Hz,1H),3.76(s,2H),3.31(s,2H),3.18–3.08(m,1H),3.00–2.91(m,4H),2.75(s,3H),2.66(ddt,J＝13.1,6.1,2.3Hz,1H),2.57(dt,J＝12.1,1.9Hz,1H),2.50(ddd,J＝13.2,11.6,4.5Hz,1H),2.41(dd,J＝12.2,2.8Hz,1H),2.12–2.07(m,1H),1.93–1.82(m,4H),1.57–1.46(m,1H)。
实施例38：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001161
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(44mg，0.09mmol)和6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷盐酸盐(28mg，0.18mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(23mg，44％)。LCMS:
C32H33F3N6O2要求576.2,实测值577.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.98(s,1H),7.90(s,1H),7.87(s,1H),7.84(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.41(t,J＝2.0Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝7.6Hz,1H),4.95(s,2H),4.15(t,J＝4.9Hz,1H),4.01(d,J＝6.9Hz,1H),3.71(d,J＝8.5Hz,3H),3.31(s,2H),3.16–3.09(m,1H),3.01–2.89(m,4H),2.79(dd,J＝10.0,4.9Hz,2H),2.75(s,3H),2.40(q,J＝4.3Hz,1H),2.32(d,J＝10.5Hz,1H),2.11–2.06(m,2H),1.61(d,J＝10.9Hz,1H)。
实施例39：(1r,3r)-3-(3-(4-环丙基-6-(((3,3-二氟环戊基)氨基)甲基)-1-氧代-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001162
步骤1：4-环丙基-6-(((3,3-二氟环戊基)氨基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮的合成。标题化合物以类似于实施例E，使用4-环丙基-1-氧代-2H,3H-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-甲醛(50mg，0.25mmol)和3,3-二氟环戊烷-1-胺盐酸盐(39mg，0.25mmol)合成得到。然后进行一般后处理程序1和色谱法B，得到标题化合物(52mg，68％)。
步骤2：(1r,3r)-3-(3-(4-环丙基-6-(((3,3-二氟环戊基)氨基)甲基)-1-氧代-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。标题化合物类似于实施例11合成得到，使用4-环丙基-6-((((3,3-二氟环戊基)氨基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮(46mg，0.15mmol)和实施例I(50mg，0.15mmol)，然后经由色谱法C，得到标题化合物(15mg，16％)。LCMS:C31H33F2N7O要求557.3,实测值558.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.92–7.81(m,2H),7.47–7.39(m,2H),7.39–7.31(m,1H),6.87(d,J＝7.6Hz,1H),4.90(s,2H),3.84(s,2H),3.31(s,2H),3.29–3.23(m,1H),3.19–3.06(m,1H),3.02–2.89(m,5H),2.76(s,3H),2.40–2.26(m,1H),2.27–2.17(m,1H),2.06–1.96(m,2H)1.67–1.56(m,2H),1.21–1.11(m,2H),1.14–1.04(m,2H)。
实施例40：(1r,3r)-3-(3-(4-环丙基-6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-氧代-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001171
标题化合物类似于实施例11合成得到，使用(S)-4-环丙基-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮(实施例E，86mg，0.30mmol)和实施例I(100mg，0.30mmol)，然后经由色谱法C，得到标题化合物(38mg，21％)。LCMS:C32H37N7O要求535.3,实测值536.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.94–7.89(m,2H),7.53(s,1H),7.45(t,J＝2.0Hz,1H),7.38(t,J＝8.0Hz,1H),6.90(d,J＝7.8Hz,1H),4.94(s,2H),3.62(s,2H),3.34(s,2H),3.25–3.08(m,1H),3.08–2.90(m,5H),2.83–2.74(m,5H),1.76–1.52(m,6H),1.18–1.04(m,4H),0.97–0.88(m,1H),0.87(d,J＝6.2Hz,3H)。
实施例41：(1r,3r)-3-(3-(6-((2-(羟甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001172
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(40mg，0.08mmol)和1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-基甲醇盐酸盐(21mg，0.13mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(26mg，52％)。LCMS:C31H33F3N6O3要求594.3,实测值595.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.96(s,1H),7.91–7.84(m,2H),7.44(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dt,J＝7.6,1.1Hz,1H),4.99(s,2H),3.94–3.83(m,3H),3.79(ddd,J＝11.8,6.8,4.6Hz,1H),3.67(dtd,J＝8.4,5.8,2.4Hz,1H),3.42(ddd,J＝10.8,6.4,4.3Hz,1H),3.37–3.26(m,3H),3.16(dq,J＝9.7,7.0Hz,1H),3.05–2.91(m,5H),2.91–2.86(m,1H),2.86–2.71(m,5H),2.66(ddd,J＝12.5,8.6,3.6Hz,1H),2.47(dd,J＝13.4,8.5Hz,1H)。
实施例42：(1R,3r)-3-(3-(4-环丙基-6-(((R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-氧代-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001181
标题化合物类似于实施例11合成得到，使用(R)-4-环丙基-6-((4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶-1-酮(实施例D，80mg，0.25mmol)和实施例I(82mg，0.25mmol)，然后经由色谱法C得到标题化合物(40mg，26％)。LCMS:C32H35F2N7O要求571.3,实测值572.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.95–7.87(m,2H),7.55(s,1H),7.46(t,J＝2.0Hz,1H),7.38(t,J＝8.0Hz,1H),6.91(d,J＝8.3Hz,1H),4.94(s,2H),3.72(s,2H),3.34(s,2H),3.23–3.11(m,1H),3.03–2.91(m,5H),2.79(d,J＝10.6Hz,6H),2.48–2.37(m,1H),2.10–2.01(m,3H),1.20–1.05(m,4H),1.00(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例43：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-乙基-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001182
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(80mg，0.17mmol)和6-乙基-1,4-氧杂氮杂环庚烷(43mg，0.33mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(52mg，49％)。LCMS:C32H35F3N6O2要求576.2,实测值577.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.99(s,1H),7.89(s,1H),7.89–7.83(m,1H),7.44(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),4.99(s,2H),3.85(q,J＝5.8Hz,3H),3.73(ddd,J＝12.4,7.6,3.0Hz,1H),3.63(ddd,J＝12.4,5.8,3.3Hz,1H),3.45(dd,J＝12.0,8.3Hz,1H),3.34(s,2H),3.20–3.11(m,1H),3.02–2.92(m,4H),2.83–2.71(m,5H),2.66(ddd,J＝13.4,7.6,3.3Hz,1H),2.49(dd,J＝13.0,7.7Hz,1H),1.89–1.87(m,1H),1.27–1.11(m,2H),0.79(t,J＝7.5Hz,3H)。
实施例44：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-(羟甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001191
步骤1：1,4-氧杂氮杂环庚烷-6-基甲醇三氟乙酸盐的合成。向6-(羟甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-羧酸叔丁酯(200mg)的DCM(4mL)溶液中加入1mL TFA。将反应在室温下搅拌16小时，然后浓缩并直接用于下一步骤。
步骤2：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-(羟甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈。还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(40mg，0.08mmol)和1,4-氧杂氮杂环庚烷-6-基甲醇三氟乙酸盐(41mg，0.17mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(9.7mg，19％)。LCMS:C31H33F3N6O3要求594.3,实测值595.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.04(s,1H),7.97(s,1H),7.89(s,1H),7.89–7.85(m,1H),7.44(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dt,J＝7.7,1.3Hz,1H),4.99(s,2H),3.91–3.83(m,3H),3.72(ddd,J＝12.5,7.3,3.1Hz,1H),3.65(ddd,J＝12.4,5.8,3.2Hz,1H),3.59(dd,J＝12.1,7.5Hz,1H),3.40(dd,J＝10.6,6.4Hz,1H),3.34(s,3H),3.21–3.11(m,1H),3.00–2.89(m,4H),2.83(dd,J＝13.1,4.6Hz,1H),2.80–2.63(m,6H),2.58(dd,J＝13.0,7.5Hz,1H)。
实施例45：(1r,3r)-3-(3-(6-((3-(甲氧基甲基)氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001192
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(80mg，0.17mmol)和3-(甲氧基甲基)氮杂环庚烷(44mg，0.31mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(35mg，34％)。LCMS:C33H37F3N6O2要求606.3,实测值607.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.02(s,1H),7.96(s,1H),7.92–7.82(m,2H),7.44(d,J＝2.2Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(d,J＝7.9Hz,1H),4.98(s,2H),3.82(s,2H),3.34(s,2H),3.24–3.03(m,6H),3.03–2.89(m,4H),2.84–2.60(m,7H),2.48(dd,J＝13.2,7.9Hz,1H),1.79–1.69(m,3H),1.65–1.55(m,2H),1.38–1.25(m,1H)。
实施例46：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-(甲氧基甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001201
步骤1：6-(甲氧基甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-羧酸叔丁酯的合成。在0℃下，向6-(羟甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-羧酸叔丁酯(270mg，1.17mmol)的DMF(4.3mL)溶液中加入氢化钠(60％石油分散溶液，56mg，1.4mmol)。所得混合物在室温下搅拌10分钟，然后加入碘甲烷(0.11mL，1.75mmol)。将反应搅拌过夜，然后用水淬灭，之后进行一般后处理程序1。所得物料使用色谱法A纯化，得到标题化合物(0.188g，66％)。
步骤2：6-(甲氧基甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷三氟乙酸盐的合成。向6-(甲氧基甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-羧酸叔丁酯(0.185mg，0.75mmol)的DCM(3.6mL)溶液中加入三氟乙酸(0.9mL)，反应在室温下搅拌16小时。此后，将反应浓缩，所得物料无需纯化即可使用。
步骤3：(1r,3r)-3-(3-(6-((6-(甲氧基甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈的合成。还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(75mg，0.16mmol)和6-(甲氧基甲基)-1,4-氧杂氮杂环庚烷三氟乙酸盐(67mg，0.26mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(45mg，46％)。LCMS:C32H35F3N6O3要求608.3,实测值609.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.98(s,1H),7.89(s,1H),7.87(ddd,J＝8.1,2.3,0.9Hz,1H),7.44(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dt,J＝8.0,1.1Hz,1H),4.99(s,2H),3.89–3.80(m,3H),3.71(ddd,J＝12.5,7.2,3.1Hz,1H),3.65(ddd,J＝12.4,5.9,3.4Hz,1H),3.54(dd,J＝12.1,7.5Hz,1H),3.34(s,2H),3.23–3.11(m,6H),3.03–2.91(m,4H),2.81–2.71(m,5H),2.67(ddd,J＝13.4,7.3,3.4Hz,1H),2.56(dd,J＝13.0,7.3Hz,1H),2.27–2.18(m,1H)。
实施例47：(1r,3r)-3-(3-(6-((4,4-二氟六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001211
还原胺化类似于实施例13进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(75mg，0.16mmol)和顺式-4,4-二氟-八氢环戊并[c]吡咯(46mg，0.31mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(61mg，61％)。LCMS:C32H31F5N6O要求610.2,实测值611.5[M+H]+。1HNMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.00(s,1H),7.93(s,1H),7.89(s,1H),7.89–7.82(m,1H),7.45(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.87(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),4.99(s,2H),3.80(d,J＝13.8Hz,1H),3.71(d,J＝13.8Hz,1H),3.34(s,2H),3.23–3.13(m,1H),3.03–2.86(m,6H),2.86–2.68(m,6H),2.63(d,J＝9.1Hz,1H),2.55(dd,J＝9.1,7.1Hz,1H),2.42–2.33(m,1H),2.32–2.21(m,1H),1.62(ddd,J＝12.3,7.2,3.2Hz,1H)。
实施例48：(1r,3r)-3-(3-(6-((3-(羟甲基)氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001212
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(60mg，0.13mmol)和氮杂环庚烷-3-基甲醇盐酸盐(31mg，0.19mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(19mg，24％)。LCMS:C32H35F3N6O2要求592.3,实测值593.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.97(s,1H),7.92–7.83(m,2H),7.44(t,J＝2.1Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.92–6.86(m,1H),4.99(s,2H),3.84(s,2H),3.42–3.30(m,3H),3.25(dd,J＝10.5,7.2Hz,1H),3.22–3.10(m,1H),3.03–2.94(m,4H),2.89–2.73(m,5H),2.73–2.60(m,2H),2.51(dd,J＝13.1,7.9Hz,1H),1.78–1.71(m,4H),1.65–1.55(m,2H),1.41–1.28(m,1H)。
实施例49：(1r,3r)-3-(3-(4-环丙基-1-氧代-6-(((S)-3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001221
标题化合物类似于实施例11合成得到，使用实施例F(112mg，0.33mmol)和实施例I(110mg，0.33mmol)，然后经由制备型HPLC。然后减压除去溶剂，使化合物通过安捷伦(Agilent)PL-HCO3柱来中和，以提供标题化合物(19mg，10％)。LCMS:C32H34F3N7O要求589.3,实测值590.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ7.93–7.87(m,2H),7.53(s,1H),7.45(t,J＝2.0Hz,1H),7.38(t,J＝8.0Hz,1H),6.94–6.87(m,1H),4.94(s,2H),3.72(s,2H),3.34(s,2H),3.22–3.11(m,1H),3.11–3.03(m,1H),3.03–2.92(m,4H),2.87(d,J＝11.6Hz,1H),2.79(s,3H),2.55–2.43(m,1H),2.13–2.04(m,4H),1.80–1.73(m,1H),1.65–1.54(m,1H),1.32(qd,J＝12.4,4.3Hz,1H),1.19–1.06(m,4H)。
实施例50：(1r,3r)-3-(3-(6-((3,3-二氟氮杂环庚烷-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001222
还原胺化类似于实施例4步骤2进行，使用(1r,3r)-3-(3-(6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-1-甲基-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(50mg，0.10mmol)和3,3-二氟氮杂环庚烷盐酸盐(31mg，0.18mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(23mg，35％)。LCMS:C31H31F5N6O要求598.2,实测值599.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.03(s,1H),7.98(s,1H),7.89(s,1H),7.88–7.84(m,1H),7.44(t,J＝2.0Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(d,J＝7.9Hz,1H),4.99(s,2H),3.94(s,2H),3.34(s,2H),3.15(dt,J＝9.6,6.9Hz,1H),3.07(t,J＝14.0Hz,2H),3.02–2.92(m,4H),2.83–2.72(m,5H),2.23–2.08(m,2H),1.79–1.65(m,4H)。
实施例51：[(1r,3r)-3-[3-(6-{[(3R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-氧代-4-(三氟甲基)-3H-异吲哚-2-基)苯基]-3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]乙腈
Figure BDA0003470586280001231
步骤1：2-[3-(氰基甲基)环丁亚基]乙酸甲酯的合成。反应类似于实施例G步骤1进行，使用2-(3-氧代环丁基)乙腈(2.0g，18.3mmol)，以生成标题化合物(2.8g，92％)。
步骤2：顺式-2-[(1r,3r)-1-{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯基}-3-(氰基甲基)环丁基]乙酸甲酯的合成。反应类似于实施例G步骤2进行，使用2-[3-(氰基甲基)环丁亚基]乙酸甲酯(2.8g，18.3mmol)，以生成标题化合物(2.1g，35％)，为来自色谱法A的第一个洗脱异构体。
步骤3：2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-(氰基甲基)环丁基)乙酸的合成。反应类似于实施例G步骤3进行，使用顺式-2-[(1r,3r)-1-{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯基}-3-(氰基甲基)环丁基]乙酸甲酯(2.1g，5.86mmol)。通过将整个混合物浓缩至干，然后加入水(50mL)，将溶液用1N HCl(3.8mL)酸化得到pH～5，对反应进行后处理，然后进行一般后处理程序1，得到标题化合物(2.05g，99％)。
步骤4：N-{3-[(1r,3r)-3-(氰基甲基)-1-[(4-甲基-5-硫基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]苯基}氨基甲酸叔丁酯的合成。反应类似于实施例G步骤4进行，使用2-((1r,3r)-1-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-3-(氰基甲基)环丁基)乙酸(2.05g，5.8mmol)，得到标题化合物(0.5g，20％)。
步骤5：N-{3-[(1r,3r)-3-(氰基甲基)-1-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]苯基}氨基甲酸叔丁酯的合成。反应类似于实施例G步骤5进行，使用N-{3-[(1r,3r)-3-(氰基甲基)-1-[(4-甲基-5-硫基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]苯基}氨基甲酸叔丁酯(560mg，1.35mmol)，以生成标题化合物(100mg，19％)。
步骤6：2-((1r,3r)-3-(3-氨基苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)乙腈的合成。反应类似于实施例G步骤6进行，使用N-{3-[(1r,3r)-3-(氰基甲基)-1-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]苯基}氨基甲酸叔丁酯(100mg，0.26mmol)，以生成标题化合物(80mg，99％)。
步骤7：2-[(1r,3r)-3-{3-[6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)-3H-异吲哚-2-基]苯基}-3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]乙腈的合成。反应类似于实施例3进行，使用2-((1r,3r)-3-(3-氨基苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)乙腈(80mg，0.83mmol)和2-(溴甲基)-5-甲酰基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(101mg，0.31mmol)，经由色谱法B后生成标题化合物(60mg，43％)。
步骤8：[(1r,3r)-3-[3-(6-{[(3R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-氧代-4-(三氟甲基)-3H-异吲哚-2-基)苯基]-3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]乙腈的合成。还原胺化类似于实施例13进行，使用2-[(1r,3r)-3-{3-[6-甲酰基-1-氧代-4-(三氟甲基)-3H-异吲哚-2-基]苯基}-3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]环丁基]乙腈(20mg，0.04mmol)和(R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶盐酸盐(8.7mg，0.05mmol)，经由色谱法C后得到标题化合物(41mg，15％)。LCMS:C32H33F5N6O要求612.3,实测值613.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.01(s,1H),7.93(s,1H),7.91–7.79(m,2H),7.33(t,J＝7.9Hz,1H),7.25(t,J＝2.0Hz,1H),6.73(dt,J＝7.9,1.2Hz,1H),4.97(s,2H),3.74(s,2H),3.24(d,J＝4.0Hz,2H),3.00–2.86(m,3H),2.86–2.73(m,2H),2.69(s,3H),2.58(d,J＝5.7Hz,2H),2.48–2.29(m,1H),2.25–2.18(m,4H),2.15–2.10(m,2H),1.00(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例52：((1S,3s)-3-(3-(6-(((R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)乙腈
Figure BDA0003470586280001241
标题化合物以类似于实施例51步骤3-8，使用来自实施例51步骤2的第二个洗脱异构体合成得到。LCMS:C32H33F5N6O要求612.3,实测值613.5[M+H]+。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.02(s,1H),7.94(s,1H),7.91–7.82(m,2H),7.59(t,J＝2.0Hz,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝7.3Hz,1H),5.02(s,2H),3.74(s,2H),3.17(s,2H),2.85–2.74(m,7H),2.69(d,J＝6.1Hz,1H),2.61(s,2H),2.52–2.31(m,3H),2.17–2.11(m,4H),1.00(d,J＝6.2Hz,3H)。
实施例53:4-((5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基)甲基)-N-(3-((1r,3r)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-6-环丙基吡啶甲酰胺
Figure BDA0003470586280001242
步骤1：6-氯-4-甲基吡啶甲酸乙酯的合成。向6-氯-4-甲基吡啶-2-羧酸(50.0g，58.48mmol)的EtOH(300.0mL)溶液中滴加H2SO4(4.00mL)。将所得混合物在70℃下搅拌16小时，然后真空浓缩。将残余物溶于EtOAc，依次用NaHCO3(饱和水溶液)和水洗。合并的有机相干燥，过滤，浓缩，得到标题化合物(53.1g，粗品)，其无需纯化即可用于下一步骤。MS(ESI)计算值(C9H10ClNO2)[M+H]+,200.0,实测值,200.0。
步骤2：6-环丙基-4-甲基吡啶甲酸乙酯的合成。将6-氯-4-甲基吡啶-2-羧酸乙酯(30.0g，0.15mol)、环丙基硼酸(25.0g，0.29mol)、四(三苯基膦)钯(17.0g，14.71mmol)和碳酸钾(62.0g，0.45mmol)的二氧六环(450mL)脱气溶液在N2下于100℃下搅拌2小时。反应混合物通过加入水淬灭并用EtOAc萃取。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(20.1g，64.8％)。MS(ESI)计算值(C12H15NO2)[M+H]+,206.1,实测值,206.0。
步骤3：6-环丙基-4-甲酰基吡啶-2-羧酸乙酯的合成。向6-环丙基-4-甲基吡啶-2-羧酸乙酯(14.0g，68.21mmol)和Ac2O(31.5g)的HOAc(120mL)混合物中加入SeO2(10.5g，94.81mmol)。所得混合物在120℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温，过滤。滤液真空浓缩。粗残余物经色谱法C纯化以提供标题化合物(9.8g，46.2％)。MS(ESI)计算值(C12H13NO3)[M+H]+,220.1,实测值,220.0。
步骤4：4-{5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基甲基}-6-环丙基吡啶-2-羧酸乙酯的合成。将6-环丙基-4-甲酰基吡啶-2-羧酸乙酯(360mg，1.64mmol)、5-氮杂螺[2.4]庚烷盐酸盐(440mg，3.3mmol)、三乙胺(460μL，3.3mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(529mg，2.5mmol)和DCM(3.0mL)的混合物在密封小瓶中于40–50℃下加热，直至LCMS指示醛已消耗。混合物用MeOH和EtOAc稀释，浓缩至硅藻土上，经色谱法D纯化，得到标题化合物(255mg，52％)。
步骤5：4-((5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基)甲基)-6-环丙基吡啶甲酸锂的合成。将4-{5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基甲基}-6-环丙基吡啶-2-羧酸乙酯(250mg，0.84mmol)、LiOH·H2O(35mg，0.84mmol)、THF(2mL)和水(1mL)的混合物剧烈搅拌直至反应完成。减压除去THF，得到标题化合物。
步骤6：实施例53。在室温下，将1-丙烷膦酸酐(0.81mL，0.14mmol)加至4-((5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-基)甲基)-6-环丙基吡啶甲酸锂(31mg，0.11mmol)、实施例G(30mg，0.11mmol)和4-甲基吗啉(64μL,0.6mmol)的DMF(0.5mL)溶液中。将溶液在45-50℃下加热直至反应完成。混合物用水和乙腈稀释，浓缩至硅藻土上，经色谱法C纯化，得到标题化合物(27mg，47％)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.11(s,1H),8.18(s,1H),7.83(d,J＝1.4Hz,1H),7.73(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),7.49(t,J＝2.0Hz,1H),7.43(d,J＝1.4Hz,1H),7.27(t,J＝7.9Hz,1H),6.75–6.65(m,1H),3.67(s,2H),3.29–3.18(m,3H),2.86(td,J＝10.5,9.1,7.3Hz,4H),2.80(s,3H),2.68(t,J＝6.8Hz,2H),2.25(tt,J＝8.1,4.9Hz,1H),1.77(t,J＝6.8Hz,2H),1.14(dt,J＝5.9,3.1Hz,2H),1.04(dt,J＝8.3,3.2Hz,2H),0.51(dt,J＝8.1,1.9Hz,4H)。LCMS:C31H35N7O要求:521,实测值:m/z 522[M+H]+。
实施例54：N-(3-((1r,3R)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-6-环丙基-4-(((3S,5R)-3,5-二甲基哌啶-1-基)甲基)吡啶甲酰胺的合成
Figure BDA0003470586280001261
根据实施例53的方法，在步骤4中使用(3R,5S)-3,5-二甲基哌啶制备得到标题化合物：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.18(s,1H),7.82(s,1H),7.72(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.50(t,J＝1.9Hz,1H),7.41(s,1H),7.26(t,J＝7.9Hz,1H),6.71(d,J＝7.5Hz,1H),3.52(s,2H),3.28(s,2H),3.27–3.20(m,1H),2.91–2.82(m,4H),2.80(s,3H),2.75–2.68(m,2H),2.24(tt,J＝8.3,4.8Hz,1H),1.72–1.59(m,2H),1.49(t,J＝10.8Hz,2H),1.14(dt,J＝6.0,3.2Hz,2H),1.04(dt,J＝8.2,3.3Hz,2H),0.80(d,J＝6.4Hz,6H),0.50(q,J＝11.9Hz,1H)；LCMS:C32H39N7O要求:537,实测值:m/z 538[M+H]+。
实施例55：N-(3-((1r,3S)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-6-环丙基-4-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)吡啶甲酰胺的合成
Figure BDA0003470586280001262
根据实施例53的方法，在步骤4中使用(3S)-3-甲基哌啶盐酸盐制备得到标题化合物：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.18(s,1H),7.82(s,1H),7.72(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),7.50(d,J＝2.1Hz,1H),7.40(s,1H),7.26(t,J＝7.9Hz,1H),6.70(d,J＝7.6Hz,1H),3.51(s,2H),3.28(s,2H),3.26–3.18(m,1H),2.91–2.82(m,4H),2.80(s,3H),2.69(t,J＝10.8Hz,2H),2.24(tt,J＝8.4,4.9Hz,1H),1.95–1.85(m,1H),1.71–1.55(m,4H),1.55–1.43(m,1H),1.14(dt,J＝5.8,3.1Hz,2H),1.04(dt,J＝8.2,3.2Hz,2H),0.86(d,J＝10.6Hz,1H),0.82(d,J＝5.2Hz,3H)；LCMS:C31H37N7O要求:523,实测值:m/z 524[M+H]+。
实施例56：N-(3-((1r,3R)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-6-环丙基-4-(((R)-2-甲基吗啉基)甲基)吡啶甲酰胺
Figure BDA0003470586280001271
根据实施例53的方法，在步骤4中使用((2R)-2-甲基吗啉制备得到标题化合物：1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.18(s,1H),7.84(d,J＝1.4Hz,1H),7.72(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.50(t,J＝1.9Hz,1H),7.43(d,J＝1.4Hz,1H),7.27(t,J＝7.9Hz,1H),6.74–6.68(m,1H),3.74(ddd,J＝11.4,3.2,1.5Hz,1H),3.59–3.48(m,4H),3.28(s,2H),3.27–3.19(m,1H),2.91–2.81(m,4H),2.80(s,3H),2.67(dt,J＝11.0,2.0Hz,1H),2.63–2.58(m,1H),2.24(tt,J＝8.4,4.8Hz,1H),2.08(td,J＝11.2,3.2Hz,1H),1.78(t,J＝10.5Hz,1H),1.14(dt,J＝5.9,3.1Hz,2H),1.04(t,J＝5.8Hz,5H)；LCMS:C30H35N7O2要求:525,实测值:m/z 526[M+H]+。
实施例57：N-(3-((1r,3R)-3-氰基-1-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁基)苯基)-2-环丙基-6-(((R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基)甲基)嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0003470586280001272
步骤1：2-环丙基-6-甲基嘧啶-4-羧酸乙酯的合成。向2,4-二氧代戊酸乙酯(10.0g，63.29mmol)和环丙烷甲脒(6.9g，57.5mmol)的DMF(200mL)溶液中加入pTsOH·H2O(1.1g，5.8mmol)。将溶液在100℃下搅拌72小时。将混合物冷却至室温并用水稀释，然后进行一般后处理程序1。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(4.8g，40％)。
步骤2：6-(溴甲基)-2-环丙基嘧啶-4-羧酸乙酯的合成。向2-环丙基-6-甲基嘧啶-4-羧酸乙酯(5.0g，24.2mmol)的HOAc(50mL)溶液中加入Br2(3.86g，24.2mmol)。将溶液在80℃下搅拌1小时。真空除去溶剂。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(2.0g，30％)。
步骤3：2-环丙基-6-{[(3R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基]甲基}嘧啶-4-羧酸乙酯的合成。将6-(溴甲基)-2-环丙基嘧啶-4-羧酸乙酯(50mg，0.18mmol)、4,4-二氟-3-甲基哌啶盐酸盐(30mg，0.18mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.061mL，0.36mmol)和乙腈的溶液在室温下保持5小时。将混合物浓缩以提供标题化合物。
步骤4：2-环丙基-6-{[(3R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基]甲基}嘧啶-4-羧酸锂的合成。将2-环丙基-6-{[(3R)-4,4-二氟-3-甲基哌啶-1-基]甲基}嘧啶-4-羧酸乙酯(61mg，0.18mmol)、LiOH·H2O(15mg，0.36mmol)、THF(0.5mL)和水(0.25mL)的混合物剧烈搅拌直至反应完成。减压除去THF，得到标题化合物。
步骤5：实施例57：标题化合物根据实施例53步骤6的方法制备得到：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.43(s,1H),8.18(s,1H),7.87(s,1H),7.78(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),7.56(d,J＝2.0Hz,1H),7.28(t,J＝7.9Hz,1H),3.76–3.65(m,2H),3.28(s,2H),3.27–3.20(m,1H),2.90–2.82(m,4H),2.81(s,3H),2.78–2.72(m,2H),2.44–2.31(m,3H),2.19–2.08(m,2H),2.04(td,J＝11.2,4.1Hz,1H),2.00–1.91(m,1H),1.17(dt,J＝5.4,2.8Hz,2H),1.13(dq,J＝8.4,3.1,2.3Hz,2H),0.95(d,J＝5.9Hz,3H)；LCMS:C30H34F2N7O2要求:560,实测值:m/z 561[M+H]+。
实施例58：(1R,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(2-((R)-2-甲基吗啉基)丙烷-2-基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈
Figure BDA0003470586280001281
步骤1：5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯的合成。向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(15g，73.34mmol)的乙酸(100mL)混合物中加入HNO3(46g)和Br2(12.8g，80.10mmol)。然后在约30分钟内将AgNO3(16.1g，2.5M水溶液)添加至上述混合物中。混合物在室温下搅拌16小时后，用水稀释混合物。进行一般后处理程序1。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(14.0g，70％)。
步骤2：5-溴-2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯的合成。将5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(14.0g，47.1mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(16.8g，94.4mmol)和过氧化苯甲酰(BPO)(2.3g，8.9mmol)的CCl4(150mL)混合物在80℃下搅拌5小时。然后滤出固体。滤液浓缩。残余物经快速柱色谱法用0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液纯化以提供标题化合物(11.2g，63％)。
步骤3：6-溴-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮的合成。向5-溴-2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(11.2g，29.79mmol)的四氢呋喃(50mL)搅拌溶液中加入NH3(7M甲醇溶液，50mL)。将混合物在室温下搅拌16小时。混合物浓缩。残余物用水稀释。进行一般后处理程序1。使用标准快速色谱纯化方法得到标题化合物(8.1g，53％)。MS(ESI)计算值(C9H5BrF3NO)[M+H]+,280.0；实测值,280.1。
步骤4：6-乙酰基-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮的合成。将6-溴-4-(三氟甲基)-2,3-二氢异吲哚-1-酮(9.6g，34mmol)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(18.6g，51.6mmol)和Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(2.8g，3.4mmol)的二氧六环(100.0mL)混合物在氮气气氛下于100℃下搅拌16小时。减压除去溶剂。所得混合物用水稀释并进行一般后处理程序1。过滤后，滤液真空浓缩。然后向粗残余物中加入HCl(1N，100.0mL)和THF(200.0mL)。将所得混合物在氮气气氛下于60℃下搅拌1小时。真空除去有机溶剂，然后进行一般后处理程序1。残余物经色谱法A纯化以提供6-乙酰基-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(4.2g，50％)。MS(ESI)计算值(C11H8F3NO2)[M+H]+,244.1；实测值,244.0。
步骤5：2-[(2R)-2-甲基吗啉-4-基]-2-[3-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢异吲哚-5-基]丙腈的合成。将6-乙酰基-4-(三氟甲基)-2,3-二氢异吲哚-1-酮(650.0mg，2.67mmol)、(2R)-2-甲基吗啉(270.4mg，2.67mmol)和Ti(OEt)4(1.2g，5.4mmol)的THF(20.0mL)溶液在室温下搅拌3小时。将三甲基氰硅烷(397.8mg，4.01mmol)加至上述混合物中并于氮气气氛下在60℃下搅拌16小时。进行一般后处理程序1。残余物经反相快速柱色谱法用5～50％乙腈水溶液纯化，得到2-[(2R)-2-甲基吗啉-4-基]-2-[3-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢异吲哚-5-基]丙腈(550.0mg，58％)。MS(ESI)计算值(C17H18F3N3O2)[M+H]+,354.1；实测值,354.0。
步骤6：(R)-6-(2-(2-甲基吗啉基)丙烷-2-基)-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮的合成。在-60℃下，向2-[(2R)-2-甲基吗啉-4-基]-2-[3-氧代-7-(三氟甲基)-1,2-二氢异吲哚-5-基]丙腈(550.0mg，1.55mmol)的THF(20.0mL)脱气溶液中滴加甲基溴化镁(31.0mL，3MTHF溶液)。将反应混合物升温至室温并在氮气气氛下搅拌2小时。在0℃下，反应混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭并进行一般后处理程序1。残余物经反相快速柱色谱法用5～50％乙腈水溶液纯化，得到(R)-6-(2-(2-甲基吗啉基)丙烷-2-基)-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(135.3mg，33％)。MS(ESI)计算值(C17H21F3N2O2)[M+H]+,343.2；实测值,343.2。
步骤7：(1R,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(2-((R)-2-甲基吗啉基)丙烷-2-基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈的合成。标题化合物类似于实施例11合成得到，使用(R)-6-(2-(2-甲基吗啉基)丙烷-2-基)-4-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(53.1mg，0.16mmol)和(1r,3r)-3-(3-溴苯基)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)环丁烷-1-甲腈(52.1mg，0.16mmol)得到(1R,3r)-3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-3-(3-(6-(2-((R)-2-甲基吗啉基)丙烷-2-基)-1-氧代-4-(三氟甲基)异吲哚啉-2-基)苯基)环丁烷-1-甲腈为三氟乙酸盐形式(13.3mg，12％)。MS(ESI)计算值(C32H35F3N6O2)[M+H]+,593.3；实测值,593.7。1H NMR(500MHz,MeCN-d3)δ8.13(d,J＝3.9Hz,2H),7.84(s,1H),7.81(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.39(d,J＝2.0Hz,1H),7.31(t,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝7.8Hz,1H),4.93(s,2H),3.74(dt,J＝11.0,2.4Hz,1H),3.64–3.46(m,2H),3.29(s,2H),3.10(ddd,J＝16.3,9.3,7.0Hz,1H),2.97–2.83(m,4H),2.72(s,3H),2.52(ddt,J＝33.2,11.4,2.2Hz,2H),2.28(td,J＝11.2,3.1Hz,1H),1.92(p,J＝2.5Hz,1H),1.38–1.32(m,6H),1.00(d,J＝6.2Hz,3H)。
实施例59：(R)-6-环丙基-5-(17-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-5λ4,6λ4-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮杂硼杂苯-3-基)-15-氧代-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十七烷基)-N-(3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)吡啶甲酰胺
Figure BDA0003470586280001301
步骤1：6-环丙基-5-(羟甲基)吡啶-2-羧酸甲酯的合成。将6-氯-5-(羟甲基)吡啶-2-羧酸甲酯(Gangadasu,B.et al.,Tetrahedron 2006,62,8398-8403)(1.0g，5.0mmol)、环丙基三氟硼酸钾(2.1g，14.1mmol)、Pd(dppf)Cl2(770mg，1.05mmol)和K3PO4(3.8g，18.1mmol)的甲苯(40mL)和水(4mL)混合溶液在氮气下加热至100℃保持16小时。将混合物冷却至室温，然后过滤。滤液真空蒸发。残余物经色谱法A纯化以提供标题化合物(834.0mg，81％)。LCMS:C11H13NO3要求207.2,实测值207.9[M+H]+。
步骤2：6-环丙基-5-(羟甲基)吡啶-2-羧酸的合成。将6-环丙基-5-(羟甲基)吡啶-2-羧酸甲酯(170.0mg，0.82mmol)和LiOH(45.0mg，1.88mmol)的THF(6mL)和水(2mL)混合物在室温下搅拌3小时。混合物用HCl(1N)调节pH值至～5。混合物真空蒸发，得到标题化合物(200.0mg，粗品)，其无需纯化即可使用。MS(ESI)计算值(C10H11NO3)[M+H]+,194.1,实测值,193.9。
步骤3：6-环丙基-5-(羟甲基)-N-[3-[(2R)-1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基]苯基]吡啶-2-甲酰胺的合成。向6-环丙基-5-(羟甲基)吡啶-2-羧酸(200.0mg，粗品)的DMF(3mL)混合物中加入DIEA(1mL，6.05mmol)、3-[(2R)-1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基]苯胺(173.6mg，0.80mmol)和HATU(883.0mg，2.32mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。混合物经色谱法C纯化，然后经制备型HPLC纯化，得到标题化合物(31.6mg，10％)。MS(ESI)计算值(C22H25N5O2)[M+H]+,392.2,实测值,392.2。
步骤4：(R)-6-环丙基-5-甲酰基-N-(3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)吡啶甲酰胺的合成。在0℃下，向(R)-6-环丙基-5-(羟甲基)-N-(3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)吡啶甲酰胺(3.1g，7.9mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入戴斯-马丁试剂(Dess-Martin reagent，4.0g，9.5mmol)。将混合物在0℃下搅拌1小时，然后通过加入饱和NaHCO3水溶液淬灭。水相用EtOAc萃取。合并有机层，用盐水洗，干燥，过滤。滤液浓缩。残余物经色谱法B纯化以提供标题化合物(1.8g，58％)。MS(ESI)计算值(C22H23N5O2)[M+H]+,390.2；实测值390.2。
步骤5.(R)-5-(13-氨基-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷基)-6-环丙基-N-(3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)吡啶甲酰胺的合成。将三乙酰氧基硼氢化钠(0.05g，0.23mmol)加至含有N-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.15mmol)、(R)-6-环丙基-5-甲酰基-N-(3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)吡啶甲酰胺(60mg，0.15mmol)的DCM(1.00mL)溶液中。混合物在室温下搅拌3小时。浓缩后，粗反应混合物经反相制备型HPLC(Waters 5mM CSH C18柱，50x50mm)纯化，用含0.1％TFA的乙腈水溶液洗脱。合并所需级分，浓缩，得到(R)-(1-(2-环丙基-6-((3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)氨基甲酰基)吡啶-3-基)-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯，其在室温下用DCM/TFA 1:1溶液处理。1小时后，将反应浓缩，得到标题化合物(51mg)；LCMS:C30H43N7O4要求m/z＝565,实测值566[M+H]+。
步骤6.(R)-6-环丙基-5-(17-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-5l4,6l4-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮杂硼杂苯-3-基)-15-氧代-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十七烷基)-N-(3-(1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基)苯基)吡啶甲酰胺的合成。将三乙胺(0.01mL，6.08mg，0.06mmol)加至含有HATU(17mg，0.05mmol)和3-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-5λ4,6λ4-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮杂硼杂苯-3-基)丙酸(9mg，0.03mmol)的DMF溶液(1mL)中。在室温下搅拌5分钟后，加入5-(13-氨基-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1-基)-6-环丙基-N-{3-[(2R)-1-(4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)丙烷-2-基]苯基}吡啶-2-甲酰胺(17mg，0.03mmol)，所得溶液在室温下搅拌4小时。粗反应混合物经反相制备型HPLC纯化，用含0.1％TFA的乙腈水溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR(500MHz,MeOH-d4)δ8.00(s,2H),7.67(t,J＝2.0Hz,1H),7.55–7.45(m,1H),7.38(s,1H),7.33(t,J＝7.9Hz,1H),7.05(d,J＝7.7Hz,1H),6.97(d,J＝4.0Hz,1H),4.57(s,2H),3.82(dd,J＝5.7,4.2Hz,2H),3.68(hd,J＝3.9,2.6Hz,4H),3.65–3.62(m,3H),3.61(s,3H),3.60–3.56(m,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,3H),3.39(q,J＝6.2,5.6Hz,3H),3.34(s,4H),3.18(t,J＝7.8Hz,3H),2.59(t,J＝7.7Hz,2H),2.47(s,3H),2.35(tt,J＝8.3,4.7Hz,1H),2.24(s,3H),1.46(d,J＝6.7Hz,3H),1.37–1.28(m,2H),1.19(dt,J＝8.2,3.3Hz,3H)；LCMS:C44H56BF2N9O5要求m/z＝840,实测值841[M+H]+。
生物学实施例
以下缩写适用：ACT(过继细胞疗法)；AUC(曲线下面积)；Cmpd(化合物)；CP(细胞增殖)；E/T(效应器：靶细胞比率)；ID(身份证明)；MFI(平均荧光强度)；mpk(毫克每千克)；PBMC(外周血单核细胞)；TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)；DPBS(杜氏(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水)；和Ub(泛素)。
生物学实施例1:候选抑制剂对Cbl-b抑制作用的评价
对候选化合物结合并抑制Cbl-b(一种E3泛素蛋白连接酶)的能力进行评估，这由其置换与Cbl-b结合的荧光团标记的探针(实施例59)的能力来证明。
物料和方法
Cbl-b置换试验(Cbl-b抑制试验)
在候选化合物存在下，通过监测Cbl-b与荧光团标记的探针的相互作用来测定候选化合物置换已知抑制剂从而抑制Cbl-b活性的能力。在其N端含有Avitag的Cbl-b(UniProt编号Q13191；SEQ ID NO：1)的截短变体与BirA生物素连接酶共表达，并使用标准方案进行纯化(参见Dou et al.,Nature Structural and Molecular Biology 8:982-987,2013；Avidity LLC)。
Cbl-b氨基酸残基36-427：
PKQAAADRRTVEKTWKLMDKVVRLCQNPKLQLKNSPPYILDILPDTYQHLRLILSKYDDNQKLAQLSENEYFKIYIDSLMKKSKRAIRLFKEGKERMYEEQSQDRRNLTKLSLIFSHMLAEIKAIFPNGQFQGDNFRITKADAAEFWRKFFGDKTIVPWKVFRQCLHEVHQISSGLEAMALKSTIDLTCNDYISVFEFDIFTRLFQPWGSILRNWNFLAVTHPGYMAFLTYDEVKARLQKYSTKPGSYIFRLSCTRLGQWAIGYVTGDGNILQTIPHNKPLFQALIDGSREGFYLYPDGRSYNPDLTGLCEPTPHDHIKVTQEQYELYCEMGSTFQLCKICAENDKDVKIEPCGHLMCTSCLTAWQESDGQGCPFCRCEIKGTEPIIVDPFD(SEQ ID NO：1)
合成荧光标记的抑制剂探针并用BODIPY FL进行标记(实施例59)。通过在候选化合物的1％DMSO(最终浓度)溶液存在下，在含有20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.01％Triton X-100、0.01％BSA和0.5mM TCEP的测定缓冲液中，预孵育0.5nM Cbl-b或0.125nMCbl-b(最终浓度，分别表示为“高”和“低”)1小时，在室温下于384孔板中以10μL反应体积进行Cbl-b置换测定试验。在候选化合物存在下孵育后，将板在由150nM荧光标记的抑制剂探针和2nM链霉亲和素-铽(Cisbio)(最终浓度)组成的近似EC40结合饱和度存在下再孵育1小时。在孵育1小时后，使用Envision读板器(Perkin Elmer)在520/620nM处读取所述板的TR-FRET信号。TR-FRET信号的存在表明探针未被候选化合物从Cbl-b置换。FRET信号的缺失表明探针被候选化合物从Cbl-b置换。
对于IC50，化合物按如下A至E进行分级：A表示<1nM；B表示1nM≤IC50<2nM；C表示2nM≤IC50<5nM；D表示5nM≤IC50<20nM；E表示20nM≤IC50。
表2.受试化合物对Cbl-b的抑制作用
Figure BDA0003470586280001321
Figure BDA0003470586280001331
空白单元格表示数据未提供。
生物学实施例2：Cbl-b抑制剂对T细胞活化的评价
通过基因敲除cbl-b基因导致T细胞和小鼠中Cbl-b功能丧失使得T细胞活化及T细胞对失能的抗性的CD28共刺激需求的丧失(参见Bachmaier et al.,Nature,403:211-216,2000；和Jeon et al.,Immunity,21:167-177,2004)。对本发明所述的Cbl-b抑制剂活化T细胞的能力进行评估。
物料和方法
原代人总T细胞活化的纯化及评价
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PMBC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。细胞在37℃、5％CO2下静置过夜。将Cbl抑制剂加至每孔1x105个细胞中，将板在37℃下于5％CO2中以所指定浓度(表3)孵育1小时，最终DMSO浓度<0.1％。对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体(抗CD3/抗CD28)刺激的样品，受试的Cbl-b抑制剂浓度为1μM和0.3μM。对于用单独的抗CD3抗体(抗CD3)刺激的样品，受试的Cbl-b抑制剂浓度为3μM和1μM。与Cbl-b抑制剂孵育后，用板结合单独的抗CD3抗体(OKT3)或板结合抗CD3抗体(OKT3)与可溶性抗CD28抗体(28.2)(Life Technologies)来刺激原代人总T细胞。为制备具有板结合抗CD3抗体(OKT3)的平板，将96孔圆底组织培养板用100μL抗CD3抗体(OKT3)以10μg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中于37℃、5％CO2条件下包被4小时。将板用PBS清洗一次，然后将含有或不含可溶性抗CD28抗体(28.2)的细胞以5μg/mL的终浓度加至每个孔中。刺激细胞48小时，然后收获无细胞上清液并使细胞群染色以通过流式细胞术评估表面标志物。按照制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems，Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)分析上清液的细胞因子分泌，包括IL-2的分泌。细胞用抗CD25抗体(BD Biosciences)染色以评估表面活化标志物的水平。
结果
读数报告为相对于基线的倍数变化。本研究的基线是从用抗CD3抗体及用可溶性抗CD28抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育(表3)。对于用抗CD3/抗CD28刺激的T细胞，IL-2分泌相对于基线大于2.5倍和CD25表面染色相对于基线大于1.3倍的变化被认为是显著的，并认为是阳性反应(表3)。对于用单独的抗CD3刺激的T细胞，IL-2分泌相对于基线大于0.1倍和CD25表面染色相对于基线大于0.6倍的变化被认为是显著的，并认为是阳性反应(表3)。化合物根据其读数按以下方式分级：
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的IL-2分泌，分级为：C表示≤15倍，B表示15–20倍，和A表示>20倍；
对于用抗CD3抗体刺激的IL-2分泌，分级为：C表示<0.40倍，B表示0.40–0.85倍，和A表示>0.85倍；
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的CD25染色，分级为：C表示≤1.24倍，B表示1.24–1.39倍，和A表示>1.39倍；和
对于用抗CD3抗体刺激的CD25染色，分级为：C表示≤1.00倍，B表示1.00–1.15倍，和A表示>1.15倍。
表3.通过IL-2分泌和CD25表面染色评估的T细胞活化，作为用抗CD3、或抗CD3与抗CD28刺激的结果
Figure BDA0003470586280001341
Figure BDA0003470586280001351
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结论
Cbl-b抑制剂提高了在用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞中的IL-2分泌。表面活化标志物CD25在用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞中的表达增加。所述这些结果表明所鉴定的Cbl-b抑制剂具有活化T细胞的能力，并且此种活化无需与抗CD28抗体共刺激。
生物学实施例3：Cbl-b抑制剂免疫调节作用的评价
从筛选试验中鉴定出的Cbl-b抑制剂证明能够在体外活化总人T细胞，这可通过提高的IL-2分泌和CD25表面活化标志物的表达来证明。进行了进一步的体外研究以评估T细胞的额外细胞因子分泌和T细胞表面活化标志物的表达。评估了对与本发明所述的Cbl-b抑制剂接触的T细胞的额外免疫调节作用，例如Cbl-b抑制剂增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭和降低T细胞失能的能力。还评估了Cbl-b抑制剂(如本发明所述的那些)在体内活化T细胞的能力。评估了Cbl-b抑制剂的其他免疫调节作用，例如Cbl-b抑制剂活化B细胞和NK细胞的能力。
原代人总T细胞活化的纯化及评价
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PMBC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。为了测定细胞增殖，在通过使用单独的抗CD3抗体或使用抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合进行刺激以活化之前，按照制造商的方案用Cell Trace Violet(Invitrogen)标记细胞。Cbl-b抑制剂以多个浓度(例如，10μM、1.11μM或0.123μM)添加至每孔1x105个细胞中，最终DMSO浓度<0.1％。将板在37℃下于5％CO2中孵育1小时。与Cbl-b抑制剂孵育后，用板结合单独的抗CD3抗体(OKT3)或板结合抗CD3抗体(OKT3)与可溶性抗CD28抗体(28.2)(Life Technologies)来刺激原代人总T细胞。为制备具有板结合抗CD3抗体(OKT3)的平板，将96孔圆底组织培养板用100μL抗CD3抗体(OKT3)以10μg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中于37℃、5％CO2条件下包被4小时。将板用PBS清洗，然后将含有或不含可溶性抗CD28抗体(28.2)的细胞以5μg/mL的终浓度加至每个孔中。刺激细胞48小时，然后收获无细胞上清液并使细胞群染色以通过流式细胞术评估表面标志物。按照制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems，Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)分析上清液的细胞因子分泌(例如，GM-CSF、IFNγ和TNFα)。细胞用抗CD69抗体(BD Biosciences)染色以评估表面活化标志物的水平。通过流式细胞术测定增殖，并使用FlowJo v7.6.5或v10分析数据。读数报告为相对于基线的倍数变化。在一些实施方案，基线是从用单独的抗CD3抗体刺激的总人T细胞而获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。在一些实施方案，基线是从用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的总人T细胞而获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。
亦在同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的背景下评估了Cbl-b抑制剂对原代人T细胞的影响。同种异体未成熟树突状细胞在以下条件下生成。外周血单核细胞(PBMC)通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GE Healthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。根据制造商的方案(StemcellTechnologies目录#17858)，使用商业试剂盒进行阳性选择从PMBC中分离单核细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD14+细胞。将单核细胞与30ng/mL重组人GM-CSF和20ng/mL重组人IL-4一同培养7天，以生成未成熟的树突状细胞。单核细胞和T细胞均是从外周血中新鲜分离得到，或是从冷冻原液解冻得到。分离人T细胞，用CFSE标记，并与上述抑制剂一同孵育。将Cbl-b抑制剂加至1x105T细胞中，与每孔2x103个同种异体未成熟树突状细胞在多个浓度(例如，10μM或1.11μM)下共培养，最终DMSO浓度<0.1％，并在37℃下于5％CO2中孵育5天。T细胞的增殖通过流式细胞术进行评估。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高T细胞分泌细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和TNFα)和/或表明T细胞活化的T细胞上细胞表面标志物(例如CD69)的表面表达的能力。亦对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高T细胞增殖的能力。测试了Cbl-b抑制剂在共刺激存在的情况下及条件不适宜启动的情况下对T细胞活化的影响。
T细胞耗竭的人T细胞体外模型
T细胞耗竭的特征是细胞具有较差的效应器反应和持续水平的抑制性受体表达，导致T细胞功能障碍以应对慢性感染和癌症。T细胞耗竭的体外模型包括同种异体模型和自体模型。在自体模型中，髓系细胞和SEB(葡萄球菌肠毒素B，Millipore)用于刺激经抗CD3刺激的T细胞。外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案，使用Stemcell Technologies EasySep人单核细胞富集试剂盒(无CD16耗竭)(目录号#19058)进行阴性选择，使用商业试剂盒分离单核细胞。分离的单核细胞在含有50ng/mL重组人M-CSF(R&D System或Peprotech)的完全培养基(例如，不含添加剂的RPMI 1640，10％HI FBS，1X谷氨酰胺和1Xβ-巯基乙醇)中培养。将细胞以每孔2x106个细胞(第0天)进行接种并培养5天，并在第2天用新鲜培养基和细胞因子饲喂。在第5天，加入100ng/mL的IFNγ，将细胞孵育过夜。按照制造商的方案，使用阴性选择(采用StemcellTechnologies EasySep人T细胞分离试剂盒(目录#17951))，采用商业试剂盒从PBMC中分离来自同一供体的原代人T细胞。通过流式细胞术检测CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD19、CD14、CD56和CD3(BD Biosciences)的表面标志物来确证纯度。3x106个细胞/mL T细胞用10μg/mL的板结合抗CD3抗体(克隆UCHT-1)刺激5天。这与髓系细胞生成同时进行。在第6天，每孔添加2.5x104个T细胞，每孔添加12.5x103个髓系细胞，并将SEB抗原(0.1μg/mL)添加至圆底96孔板的孔中。将试验试剂(例如，Cbl-b抑制剂化合物)或对照(例如，检查点中和抗体，诸如抗PD1抗体)以指定浓度(例如，10μM)添加至孔中。将细胞培养3天，此时收集无细胞上清液并通过ELISA(R&D Systems、Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)评估分泌的细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和IL-2)。T细胞针对包括检查点抑制剂(例如，CTLA4)在内的一组表面标志物进行染色，并通过流式细胞术对Cbl-b抑制剂的作用进行评估。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高耗竭的T细胞在髓系细胞存在下分泌细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和IL-2)的能力，这表明T细胞耗竭减少。亦测试了Cbl-b抑制剂对耗竭的T细胞活化后检查点调节剂表达水平的影响。
T细胞失能的人T细胞体外模型
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PBMC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。细胞用固定化抗CD3抗体(OKT3)和可溶性抗CD28抗体(28.2)活化两天，然后将其清洗并在无刺激情况下静置3天。然后用离子霉素(Sigma)将其处理18-24小时以诱导失能。在两次清洗以从样品中去除离子霉素后，将Cbl-b抑制剂化合物以指定浓度(例如，10μM、1.11μM和0.37μM)添加至细胞中并孵育1小时。然后用抗CD3抗体和抗CD28抗体再次攻击细胞24小时，此时收集无细胞上清液，并按照制造商的方案通过ELISA(R&DSystems或Peprotech)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)来评估细胞因子(例如，IFNγ)。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高失能T细胞分泌细胞因子(例如，IFNγ)的能力，这表明T细胞耐受性降低。
Cbl-b抑制剂的体内活性
测定Cbl-b抑制剂药效学特征的方法是通过对具有C57BL/6或BALB/c等的有效免疫系统(competent immune system)的小鼠品系给药Cbl-b抑制剂来进行。将Cbl-b抑制剂溶于合适制剂中，并通过各种途径之一(例如，静脉内(IV)、腹腔内(IP)、皮下(SC)或口服(PO))，以合适的剂量水平和频率(例如，每日两次BID或每日三次TID)进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。在施用Cbl-b抑制剂后，T细胞及间接其他免疫细胞(例如，经由细胞因子生成)通过例如IV或IP等途径施用规定量(例如，每只动物2μg或10μg)的抗CD3抗体或其抗原结合片段的PBS溶液进行体内刺激(参见Hirsh et al.,J.Immunol.,1989；Ferran et al.,Eur.J.Immunol.,1990)。其他研究对照组包括仅用媒剂制剂(即，不含Cbl-b抑制剂和抗CD3抗体的制剂)、仅含有Cbl-b抑制剂的制剂、仅含有抗CD3抗体的制剂、仅PBS、或这些药剂的组合治疗的小鼠组别。然后通过分析血浆细胞因子水平和/或免疫细胞(例如T细胞)上活化标志物的表达来评估免疫活化水平。在规定的时间点(例如，8小时或24小时)收集血液或淋巴器官(例如，脾脏)。使用本领域已知的标准方法处理血液样品以收集血浆，用于测定细胞因子水平。所测定的细胞因子包括IL-2、IFNγ和TNFα。使用标准方法对额外的血液样品和淋巴组织进行处理，以用于免疫细胞(例如，T细胞)的流式细胞术分析，从而确定细胞类型特异性标志物及活化标志物(例如，CD25和/或CD69)的表达。通过比较适当组之间血浆中细胞因子的相对浓度或免疫细胞上活化标志物的表达水平(例如，用Cbl-b抑制剂和2μg抗CD3抗体处理的小鼠与用媒剂和2μg抗CD3抗体处理的小鼠之间的对比)，评估了Cbl-b抑制剂给药对免疫刺激的增强作用。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高血液中细胞因子(例如，IL-2、IFNγ和TNFα)水平的能力，所述血液得自用抗CD3抗体刺激的经治疗小鼠，这表明免疫应答被调节。还对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高分离自用抗CD3抗体刺激的经治疗小鼠的T细胞上细胞表面标志物(例如，CD25和/或CD69)表达的能力，这表明免疫应答被调节。
B细胞活化测定试验
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Stemcell Technologies目录#17954)，使用商业试剂盒进行阴性选择，从PBMC中分离人原代B细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD20+细胞。将原代人B细胞以每孔0.7-1x105个接种在含Cbl-b抑制剂的96孔板中，所述Cbl-b抑制剂的剂量范围为10μM至1nM，并于37℃、5％CO2下孵育，最终DMSO浓度<0.5％。将细胞在37℃、5％CO2下用抗IgM刺激20小时。使用抗CD69抗体(BD Biosciences)通过FACS监测成熟CD20+IgD+B细胞上的表面活化标志物。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高B细胞上细胞表面标志物(例如，CD69)的表面表达的能力，这表明B细胞活化。
原代人NK细胞的纯化及活化
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-092-657或StemcellTechnologies目录#17955)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PBMC中分离总人原代NK细胞，以通过流式细胞术评估生成>92％的CD56+、CD3细胞。将细胞与IL-2(60ng/mL)在37℃、5％CO2下培养过夜。在刺激前1小时加入Cbl-b抑制剂，并于37℃、5％CO2下以特定浓度(例如，10μM、1μM或0.1μM)孵育，最终DMSO浓度<0.1％。将NK细胞与靶细胞共培养，所述这些靶细胞被设计成具有可通过流式细胞术测定的红核(K562 NucRed)。K562 NucRed细胞是通过用IncuCyte NucLight Red慢病毒试剂(目录#4476)转导K562细胞而产生，并选择5天。使用标准组织培养技术来分离和扩增克隆群，并通过在NK细胞杀伤测定试验中与野生型K562细胞进行比较来验证单个克隆。将细胞以指定比例(例如，5:1、1:1或1:5)的NK(效应细胞)与K562 NucRed(靶细胞)混合6小时。收集无细胞上清液，并按照制造商的方案通过ELISA或Luminex多重试剂盒来分析细胞因子分泌(例如，TNFα、IFNγ或MIP1β)。使用R&D SystemsELISA试剂盒(目录#DY285)来评估IFNγ分泌，使用R&D Systems ELISA试剂盒(目录#DY210)来评估TNFα分泌，和使用R&D Systems ELISA试剂盒(目录#DY271)来评估MIP1β分泌。
生物学实施例4：Cbl-b抑制剂与免疫检查点抑制剂联合用于治疗癌症的评价
肿瘤微环境利用T细胞抑制途径作为逃避抗肿瘤免疫应答的机制。使用免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制剂等，对某些肿瘤类型产生了显著有效且持久的应答(Marshall and Djamgoz,Front Oncol,8:315,2018)。然而，对免疫检查点抑制剂单药治疗的应答并不普遍，因此仅使一小部分癌症患者受益(Lv et al.,Journal forImmunoTherapy of Cancer,7:159,2019)。本实施例描述了用于治疗癌症的包括免疫检查点抑制剂和Cbl-b抑制剂的联合疗法的评价。
简言之，联合疗法在可使同基因肿瘤生长的具有有效免疫系统的小鼠品系(例如，C57BL/6或BALB/c)中进行测试。皮下注射同基因鼠类肿瘤细胞：BALB/c小鼠中的CT26结肠癌细胞；C57BL/6小鼠中的TC-1肺癌细胞；或C57BL/6小鼠中的MC-38结肠癌细胞。使肿瘤生长至100-200mm3，此时将动物随机分组并开始治疗。或者，在肿瘤细胞植入后1-3天内在预防性环境中进行给药治疗。将Cbl-b抑制剂溶于合适的制剂中，并以合适的剂量水平和频率给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。Cbl-b抑制剂制剂通过口服(PO)或肠胃外(例如，IV、IP、SC、或在每个肿瘤的1至3个注射部位进行瘤内给药)进行给药。每3天(例如，第1、4和7天)通过IP注射施用所述免疫检查点抑制剂制剂。除了接受联合疗法的小鼠试验组之外，所述研究还包括接受单独的媒剂制剂、单独的Cbl-b抑制剂制剂或单独的免疫检查点抑制剂的小鼠对照组。
通过测定肿瘤生长并比较试验组小鼠与对照组小鼠的肿瘤生长来评估应答水平。通过收集肿瘤以分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来评估免疫活化水平。使用标准方法对TIL和淋巴组织进行处理以用于流式细胞术分析，来确定细胞谱系、细胞类型特异性标志物的表达、以及活化标志物(例如，颗粒酶B、PD-1、TIM3和LAG3)的表达。通过比较试验组小鼠和研究组小鼠肿瘤中免疫细胞群的相对百分比、以及免疫细胞上活化标志物的相对表达水平，来评估联合疗法对抗肿瘤免疫应答的增强作用。
生物学实施例5：Cbl-b抑制剂与抗肿瘤剂联合用于治疗癌症的评价
据报道，化学疗法对肿瘤浸润淋巴细胞具有积极的免疫作用(Lazzari et al.,Ther Adv Med Oncol,10:1-12,2018)，调节性免疫细胞和效应免疫细胞的平衡影响预后。此外，预期化学疗法通过增加肿瘤抗原呈递来增加肿瘤内T细胞库。本实施例描述了用于治疗癌症的包括抗肿瘤剂和Cbl-b抑制剂的联合疗法的评价。
简言之，联合疗法在可使同基因肿瘤生长的具有有效免疫系统的小鼠品系(例如，C57BL/6或BALB/c)中进行测试。皮下注射同基因鼠类肿瘤细胞：BALB/c小鼠中的CT26结肠癌细胞；或C57BL/6小鼠中的TC-1肺癌细胞。使肿瘤生长至约120mm3，此时将动物随机分组并开始治疗。将Cbl-b抑制剂溶于合适的制剂中，并以合适的剂量水平和频率进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。Cbl-b抑制剂制剂通过口服(PO)或肠胃外(例如，IV、IP、SC、或在每个肿瘤的1至3个注射部位进行瘤内给药)进行给药。每3或4天通过IP注射施用所述抗肿瘤剂(例如，吉西他滨和/或奥沙利铂)。除了接受联合疗法的小鼠试验组之外，所述研究还包括接受单独的媒剂制剂、单独的Cbl-b抑制剂制剂或单独的抗肿瘤剂的小鼠对照组。
通过测定肿瘤生长并比较试验组小鼠与对照组小鼠的肿瘤生长来评估应答水平。通过收集肿瘤以分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来评估免疫活化水平。使用标准方法对TIL和淋巴组织进行处理以用于流式细胞术分析，来确定细胞谱系、细胞类型特异性标志物的表达、以及活化标志物(例如，颗粒酶B、PD-1、TIM3和LAG3)的表达。通过比较试验组小鼠和研究组小鼠肿瘤中免疫细胞群的相对百分比、以及免疫细胞上活化标志物的相对表达水平，来评估联合疗法对抗肿瘤免疫应答的增强作用。
生物学实施例6：Cbl-b抑制剂联合放射疗法用于治疗癌症的评价
针对局部肿瘤的消融性放射疗法限制了对正常组织的损伤，并能够通过增加肿瘤抗原的存在来提高T细胞受体库的多样性(Lee et al.,Blood,114:589-595,2009)。据报道，在一个部位进行放射治疗可使未接受照射的远处部位肿瘤消退(Ngwa et al.,Nat RevCancer,18:313-322,2018)。局部治疗的全身效应被称为“远隔效应(abscopal effect)”，在放射疗法的背景下，其被认为涉及免疫系统。本实施例描述了用于治疗癌症的包括放射疗法和Cbl-b抑制剂的联合疗法的评价。
简言之，联合疗法在其中可使同基因肿瘤生长的具有有效免疫系统的小鼠品系(例如，C57BL/6或BALB/c)中进行测试。皮下注射同基因鼠类肿瘤细胞：BALB/c小鼠中的CT26结肠癌细胞；或C57BL/6小鼠中的B16-F10黑素瘤细胞。使肿瘤生长至约80mm3，此时将动物随机分组并开始治疗。在一些研究中，肿瘤细胞被植入两侧，仅治疗其中一个肿瘤以评估远隔效应。将Cbl-b抑制剂溶于合适的制剂中，并以合适的剂量水平和频率进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。Cbl-b抑制剂制剂通过口服(PO)或肠胃外(例如，IV、IP、SC、或在每个肿瘤的1至3个注射部位进行瘤内给药)进行给药。使用基于X射线的聚焦束辐照器以20格雷(grays)的剂量进行一次放射疗法。除了接受联合疗法的小鼠试验组之外，所述研究还包括接受单独的媒剂制剂、单独的Cbl-b抑制剂制剂或单独的放射疗法的小鼠对照组。
通过测定肿瘤生长并比较试验组小鼠与对照组小鼠的肿瘤生长来评估应答水平。通过收集肿瘤以分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来评估免疫活化水平。使用标准方法对TIL和淋巴组织进行处理以用于流式细胞术分析，来确定细胞谱系、细胞类型特异性标志物的表达、以及活化标志物(例如，颗粒酶B、PD-1、TIM3和LAG3)的表达。通过比较试验组小鼠和研究组小鼠肿瘤中免疫细胞群的相对百分比、以及免疫细胞上活化标志物的相对表达水平，来评估联合疗法对抗肿瘤免疫应答的增强作用。
生物学实施例7：Cbl-B抑制剂与过继细胞疗法联合用于治疗癌症的评价
采用自体肿瘤特异性T细胞的过继细胞疗法(ACT)利用T细胞的自然功能来特异性识别和消除靶细胞(Hinrichs and Rosenberg,Immunol Rev,257:56-71,2014)。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的特异性是由于其能够识别肿瘤相关抗原，包括源自突变基因产物的新抗原。本实施例描述了在离体扩增TIL以采用ACT治疗癌症之前，使用Cbl-b抑制剂对体内淋巴调节程序进行的评估。
使用可在其中使同基因肿瘤生长的具有有效免疫系统的小鼠品系(例如，C57BL/6或BALB/c)。皮下或静脉注射同基因鼠类肿瘤细胞：BALB/c小鼠中的4T1乳腺癌细胞；BALB/c小鼠中的RENCA肾癌细胞；C57BL/6小鼠中的B16-F10黑素瘤细胞；C57BL/6小鼠中的3LL肺癌细胞；或C57BL/6小鼠中的MC-38结肠癌细胞。使肿瘤生长至约50-600mm3，此时将动物随机分组并开始治疗。将Cbl-b抑制剂溶于合适的制剂中，并以合适的剂量水平和频率进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。Cbl-b抑制剂制剂通过口服(PO)或肠胃外(例如，IV、IP、SC、或在每个肿瘤的1至3个注射部位进行瘤内给药)进行给药。除了在肿瘤收获前接受Cbl-b抑制剂的试验组小鼠之外，对照组小鼠还接受单独的媒剂制剂或在肿瘤收获前不进行治疗。从原发肿瘤或从具有转移瘤的组织(例如，肺)中收获肿瘤组织。将组织切碎并在含或不含一种或多种外源性T细胞生长因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)的培养基中在适合TIL扩增的条件下进行培养。在含或不含Cbl-b抑制剂的情况下进行TIL扩增。通过测定记忆、效应器和干性标志物(例如，CD95、TCF7、CD62L、CD44等)的表达，采用流式细胞术分析来评估经扩增的TIL的表型。在TIL成功扩增后，在含或不含Cbl-b抑制剂的情况下向荷瘤小鼠输注TIL，以评估淋巴调节和/或随后的体内治疗对TIL植入和抗肿瘤免疫应答的影响。
通过肿瘤测定来评估ACT的抗肿瘤功效，以确定TIL对肿瘤生长的抑制水平。
生物学实施例8：候选抑制剂对Cbl-b抑制作用的评价
对候选化合物结合并抑制Cbl-b(一种E3泛素蛋白连接酶)的能力进行评估，这可通过其置换与Cbl-b结合的荧光团标记探针的能力来证明。
物料和方法
Cbl-b置换试验(Cbl-b抑制试验)
在候选化合物存在下，通过监测Cbl-b与荧光团标记的探针的相互作用来测定候选化合物置换已知抑制剂从而抑制Cbl-b活性的能力。包含残基36-427和N端Avitag的Cbl-b截短变体(UniProt编号Q13191)与BirA生物素连接酶共表达，并使用标准方案进行纯化(参见Dou et al.,Nature Structural and Molecular Biology 8:982-987,2013；Avidity LLC)。
合成荧光标记的抑制剂探针并用BODIPY FL进行标记。通过在候选化合物的1％DMSO(最终浓度)溶液存在下，在含有20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.01％Triton X-100、0.01％BSA和0.5mM TCEP的测定缓冲液中，预孵育0.5nM Cbl-b或0.125nM Cbl-b(最终浓度，分别表示为“高”和“低”)1小时，在室温下于384孔板中以10μL反应体积进行Cbl-b置换测定。在候选化合物存在下孵育后，将板在由150nM荧光标记的抑制剂探针和2nM链霉亲和素-铽(Cisbio)(最终浓度)组成的近似EC40结合饱和度存在下再孵育1小时。在孵育1小时后，使用Envision读板器(Perkin Elmer)在520/620nM处读取所述板的TR-FRET信号。TR-FRET信号的存在表明探针未被候选化合物从Cbl-b置换。FRET信号的缺失表明探针被候选化合物从Cbl-b置换。
结果
使用标准方法分析Cbl-b活性测定试验的结果数据，以确定受试化合物的IC50值。在表4中，化合物的IC50分级如下：A表示<1nM；B表示1nM-5nM；和C表示>5nM。
表4.受试化合物对Cbl-b的抑制作用
Figure BDA0003470586280001431
Figure BDA0003470586280001441
空白单元格表示数据未提供。
生物学实施例9：Cbl-b抑制剂对T细胞活化的评价
对Cbl-b抑制剂活化T细胞的能力进行评估。
物料和方法
原代人总T细胞活化的纯化及评价
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PMBC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。细胞在37℃、5％CO2下静置过夜。将Cbl抑制剂加至每孔1x105个细胞中，将板在37℃下于5％CO2中以所指定浓度(表5)孵育1小时，最终DMSO浓度<0.1％。对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体(抗CD3/抗CD28)刺激的样品，受试的Cbl-b抑制剂浓度为1μM和0.3μM。对于用单独的抗CD3抗体(抗CD3)刺激的样品，受试的Cbl-b抑制剂浓度为3μM和1μM。与Cbl-b抑制剂孵育后，用板结合单独的抗CD3抗体(OKT3)或板结合抗CD3抗体(OKT3)与可溶性抗CD28抗体(28.2)(Life Technologies)来刺激原代人总T细胞。为制备具有板结合抗CD3抗体(OKT3)的平板，将96孔圆底组织培养板用100μL抗CD3抗体(OKT3)以10μg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中于37℃、5％CO2下包被4小时。将板用PBS清洗一次，然后将含有或不含可溶性抗CD28抗体(28.2)的细胞以5μg/mL的终浓度加至每个孔中。刺激细胞48小时，然后收获无细胞上清液并使细胞群染色以通过流式细胞术评估表面标志物。按照制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems，Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)分析上清液的细胞因子分泌，包括IL-2的分泌。细胞用抗CD25抗体(BD Biosciences)染色以评估表面活化标志物的水平。
结果
读数报告为相对于基线的倍数变化。本研究的基线是从用抗CD3抗体及用可溶性抗CD28抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育(表5)。对于用抗CD3/抗CD28刺激的T细胞，IL-2分泌相对于基线大于2.5倍和CD25表面染色相对于基线大于1.3倍的变化被认为是显著的，并认为是阳性反应。对于用单独的抗CD3刺激的T细胞，IL-2分泌相对于基线大于0.1倍和CD25表面染色相对于基线大于0.6倍的变化被认为是显著的，并认为是阳性反应。
化合物根据其读数按以下方式分级：
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的IL-2分泌，分级为：C表示<10倍，B表示10–15倍，和A表示>15倍；
对于用抗CD3抗体刺激的IL-2分泌，分级为：C表示≤0.33倍，B表示0.34–0.66倍，和A表示>0.66倍；
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的CD25染色，分级为：C表示≤1.24倍，B表示1.25–1.39倍，和A表示>1.39倍；和
对于用抗CD3抗体刺激的CD25染色，分级为：C表示≤1.04倍，B表示1.05–1.14倍，和A表示>1.14倍。
表5.通过IL-2分泌和CD25表面染色评估的T细胞活化，作为用抗CD3、或抗CD3与抗CD28刺激的结果
Figure BDA0003470586280001451
Cbl-b抑制剂提高了使用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞的IL-2分泌。当用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激时，T细胞表面上CD25活化标志物的表达增加。这些结果表明所鉴定的Cbl-b抑制剂具有活化T细胞的能力，并且此种活化无需与抗CD28抗体共刺激。
生物学实施例10：Cbl-b抑制剂的免疫调节作用评价
由筛选试验鉴定出的Cbl-b抑制剂表现出在体外活化总人T细胞的能力，这可通过提高的IL-2分泌和CD25表面活化标志物的表达来证明。
进行了进一步的体外研究以评估T细胞的额外细胞因子分泌和T细胞表面活化标志物的表达。评估了对与本发明所述的Cbl-b抑制剂接触的T细胞的额外免疫调节作用，例如Cbl-b抑制剂增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭和降低T细胞失能的能力。还评估了Cbl-b抑制剂(如本发明所述的那些)在体内活化T细胞的能力。评估了Cbl-b抑制剂的其他免疫调节作用，例如Cbl-b抑制剂活化B细胞和NK细胞的能力。
原代人总T细胞活化的纯化及评价
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PMBC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。为了测定细胞增殖，在通过使用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合进行刺激以活化之前，按照制造商的方案用Cell Trace Violet(Invitrogen)标记细胞。Cbl-b抑制剂以多个浓度(例如，10μM、1.11μM或0.123μM)添加至每孔1x105个细胞中，最终DMSO浓度<0.1％。将板在37℃下于5％CO2中孵育1小时。与Cbl-b抑制剂孵育后，用板结合单独的抗CD3抗体(OKT3)或板结合抗CD3抗体(OKT3)与可溶性抗CD28抗体(28.2)(Life Technologies)来刺激原代人总T细胞。为制备具有板结合抗CD3抗体(OKT3)的平板，将96孔圆底组织培养板用100μL抗CD3抗体(OKT3)以10μg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中于37℃、5％CO2下包被4小时。将板用PBS清洗一次，然后将含有或不含可溶性抗CD28抗体(28.2)的细胞以5μg/mL的终浓度加至每个孔中。刺激细胞48小时，然后收获无细胞上清液并使细胞群染色以通过流式细胞术评估表面标志物。按照制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems，Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)分析上清液的细胞因子分泌(例如，GM-CSF、IFNγ和TNFα)。细胞用抗CD69抗体(BD Biosciences)染色以评估表面活化标志物的水平。通过流式细胞术测定增殖，并使用FlowJo v7.6.5或v10分析数据。读数报告为相对于基线的倍数变化。在一些实施方案，基线是从用单独的抗CD3抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。在一些实施方案，基线是从用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。
亦在同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的背景下评估了Cbl-b抑制剂对原代人T细胞的影响。同种异体未成熟树突状细胞在以下条件下生成。外周血单核细胞(PBMC)通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GE Healthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。根据制造商的方案(StemCells目录#17858)，使用商业试剂盒采用阳性选择从PMBC中分离单核细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD14+细胞。将单核细胞与30ng/mL重组人GM-CSF和20ng/mL重组人IL-4一同培养7天，以生成未成熟的树突状细胞。单核细胞和T细胞均是从外周血新鲜分离得到，或是从冷冻原液解冻得到。分离人T细胞，用CFSE标记，并与上述抑制剂一同孵育。将Cbl-b抑制剂加至1x105T细胞中，与每孔2x103个同种异体未成熟树突状细胞在多个浓度(例如，10μM或1.11μM)下共培养，最终DMSO浓度<0.1％，并在37℃下于5％CO2中孵育5天。T细胞的增殖通过流式细胞术进行评估。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高T细胞分泌细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和TNFα)和/或表明T细胞活化的T细胞上细胞表面标志物(例如，CD69)的表面表达的能力。亦对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高T细胞增殖的能力。测试了Cbl-b抑制剂在共刺激存在的情况下及条件不适宜启动的情况下对T细胞活化的影响。
T细胞耗竭的人T细胞体外模型
T细胞耗竭的特征是细胞具有较差的效应反应和持续水平的抑制性受体表达，导致T细胞功能障碍以应对慢性感染和癌症。T细胞耗竭的体外模型包括同种异体模型和自体模型。在自体模型中，髓系细胞和SEB(葡萄球菌肠毒素B，Millipore)用于刺激经抗CD3刺激的T细胞。外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案，使用StemCells EasySep人单核细胞富集试剂盒(无CD16耗竭)(目录#19058)进行阴性选择，使用商业试剂盒分离单核细胞。分离的单核细胞在含有50ng/mL重组人M-CSF(R&D System或Peprotech)的完全培养基(例如，不含添加剂的RPMI 1640，10％HI FBS，1X谷氨酰胺和1Xβ-巯基乙醇)中培养。将细胞以每孔2x106个细胞(第0天)进行接种并培养5天，并在第2天用新鲜培养基和细胞因子饲喂。在第5天，加入100ng/mL的IFNγ，将细胞孵育过夜。按照制造商的方案，使用阴性选择(采用Stemcell TechnologiesEasySep人T细胞分离试剂盒(目录#17951))，采用商业试剂盒从PBMC中分离来自同一供体的原代人T细胞。通过流式细胞术检测CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD19、CD14、CD56和CD3(BDBiosciences)的表面标志物来确证纯度。3x106个细胞/mL T细胞用10μg/mL的板结合抗CD3抗体(克隆UCHT-1)刺激5天。这与髓系细胞生成同时进行。在第6天，每孔添加2.5x104个T细胞，每孔添加12.5x103个髓系细胞，并将SEB抗原(0.1μg/mL)添加至圆底96孔板的孔中。将测试试剂(例如，Cbl-b抑制剂化合物)或对照(例如，检查点中和抗体，如抗PD1抗体)以指定浓度(例如，10μM)添加至孔中。将细胞培养3天，此时收集无细胞上清液并通过ELISA(R&DSystems、Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta LifeTechnologies)评估分泌的细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和IL-2)。T细胞针对包括检查点抑制剂(例如，CTLA4)在内的一组表面标志物进行染色，并通过流式细胞术对Cbl-b抑制剂的作用进行评估。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高耗竭的T细胞在髓系细胞存在下分泌细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和IL-2)的能力，这表明T细胞耗竭减少。亦测试了Cbl-b抑制剂对耗竭的T细胞活化后检查点调节剂表达水平的影响。
T细胞失能的人T细胞体外模型
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PBMC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。细胞用固定化抗CD3抗体(OKT3)和可溶性抗CD28抗体(28.2)活化两天，然后将其清洗并在无刺激情况下静置3天。然后用离子霉素(Sigma)将其处理18-24小时以诱导失能。在两次清洗以从样品中去除离子霉素后，将Cbl-b抑制剂化合物以指定浓度(例如，10μM、1.11μM和0.37μM)添加至细胞中并孵育1小时。然后用抗CD3抗体和抗CD28抗体再次攻击细胞24小时，此时收集无细胞上清液，并按照制造商的方案通过ELISA(R&DSystems或Peprotech)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)来评估细胞因子(例如，IFNγ)。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高失能T细胞分泌细胞因子(例如，IFNγ)的能力，这表明T细胞耐受性降低。
Cbl-b抑制剂的体内活性
测定Cbl-b抑制剂药效学特征的方法是通过对具有C57BL/6或BALB/c等的有效免疫系统(competent immune system)的小鼠品系给药Cbl-b抑制剂来进行。将Cbl-b抑制剂溶于合适制剂中，并通过各种途径之一(例如，静脉内(IV)、腹腔内(IP)、皮下(SC)或口服(PO))，以合适的剂量水平和频率(例如，每日两次BID或每日三次TID)进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。在施用Cbl-b抑制剂后，T细胞及间接其他免疫细胞(例如，经由细胞因子生成)通过例如IV或IP等途径施用规定量(例如，每只动物2μg或10μg)的抗CD3抗体或其抗原结合片段的PBS溶液进行体内刺激(参见Hirsh et al.,J.Immunol.,1989；Ferran et al.,Eur.J.Immunol.,1990)。其他研究对照组包括仅用媒剂制剂(即不含Cbl-b抑制剂和抗CD3抗体的制剂)、仅含有Cbl-b抑制剂的制剂、仅含有抗CD3抗体的制剂、仅PBS、或这些药剂的组合治疗的小鼠组别。然后通过分析血浆细胞因子水平和/或免疫细胞(例如，T细胞)上活化标志物的表达来评估免疫活化水平。在规定的时间点(例如，8小时或24小时)收集血液或淋巴器官(例如，脾脏)。使用本领域已知的标准方法处理血液样品以收集血浆，用于测定细胞因子水平。所测定的细胞因子包括IL-2、IFNγ和TNFα。使用标准方法对额外的血液样品和淋巴组织进行处理，以用于免疫细胞(例如，T细胞)的流式细胞术分析，从而确定细胞类型特异性标志物及活化标志物(例如CD25和/或CD69)的表达。通过比较适当组之间血浆中细胞因子的相对浓度或免疫细胞上活化标志物的表达水平(例如，用Cbl-b抑制剂和2μg抗CD3抗体处理的小鼠与用媒剂和2μg抗CD3抗体处理的小鼠之间的对比)，评估了Cbl-b抑制剂给药对免疫刺激的增强作用。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高血液中细胞因子(例如，IL-2、IFNγ和TNFα)水平的能力，所述血液得自用抗CD3抗体刺激的经治疗小鼠，这表明免疫应答被调节。还对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高分离自用抗CD3抗体刺激的经治疗小鼠的T细胞上细胞表面标志物(例如，CD25和/或CD69)表达的能力，这表明免疫应答被调节。
B细胞活化测定试验
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Stemcell Technologies目录#17954)，使用商业试剂盒进行阴性选择，从PBMC中分离人原代B细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD20+细胞。将原代人B细胞以每孔0.7-1x105个接种在含Cbl-b抑制剂的96孔板中，所述Cbl-b抑制剂的剂量范围为10μM至1nM，并于37℃、5％CO2下孵育，最终DMSO浓度<0.5％。将细胞在37℃、5％CO2下用抗IgM刺激20小时。使用抗CD69抗体(BD Biosciences)通过FACS监测成熟CD20+IgD+B细胞上的表面活化标志物。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高B细胞上细胞表面标志物(例如，CD69)的表面表达的能力，这表明B细胞活化。
原代人NK细胞的纯化及活化
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-092-657或StemcellTechnologies目录#17955)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PBMC中分离总人原代NK细胞，以通过流式细胞术评估生成>92％的CD56+、CD3细胞。将细胞与IL-2(60ng/mL)在37℃、5％CO2下培养过夜。在刺激前1小时加入Cbl-b抑制剂，并在37℃、5％CO2下以特定浓度(例如，10μM、1μM或0.1μM)孵育，最终DMSO浓度<0.1％。将NK细胞与靶细胞共培养，所述这些靶细胞被设计成具有可通过流式细胞术测定的红核(K562 NucRed)。K562 NucRed细胞是通过用IncuCyte NucLight Red慢病毒试剂(目录#4476)转导K562细胞而产生，并选择5天。使用标准组织培养技术来分离和扩增克隆群，并通过在NK细胞杀伤测定试验中与野生型K562细胞进行比较来验证单个克隆。将细胞以指定比例(例如，5:1、1:1或1:5)的NK(效应细胞)与K562 NucRed(靶细胞)混合6小时。收集无细胞上清液，并按照制造商的方案通过ELISA或Luminex多重试剂盒来分析细胞因子分泌(例如，TNFα、IFNγ或MIP1β)。使用R&D SystemsELISA试剂盒(目录#DY285)来评估IFNγ分泌，使用R&D Systems ELISA试剂盒(目录#DY210)来评估TNFα分泌，和使用R&D Systems ELISA试剂盒(目录#DY271)来评估MIP1β分泌。
生物学实施例11：Cbl-b抑制剂与癌症疫苗联合用于治疗癌症的评价
本实施例描述了用于治疗小鼠癌症的包括癌症疫苗和Cbl-b抑制剂的联合疗法的评估。
物料和方法
简言之，联合疗法在携带同基因TC-1细胞肿瘤的C57BL/6小鼠中进行测试。TC-1细胞源自原代鼠类肺细胞，所述细胞已转染人乳头瘤病毒株16(HPV16)早期蛋白6和7(E6和E7)以及经活化的人c-Ha-ras致癌基因(Lin et al.,Cancer Research,56:21-26,1996)。将2.5x104(第一项研究)或5.0x104(第二项研究)TC-1细胞(得自约翰霍普金斯大学(JohnsHopkins University))皮下注射至每只小鼠的中胁腹。使肿瘤生长至50-100mm3，此时将动物随机分组并开始治疗(第0天)。
HPV16 E7癌症疫苗(Shrimali et al.,Cancer Immunol Res,5:755-766,2017)包含100μg具有E7残基49-57的CTL表位(RAHYNIVTF，表示为SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的合成肽，与20μg具有称为PADRE的Th表位(aK-Cha-VAAWTLKAAa，表示为SEQ ID NO：3，其中“a”为D丙氨酸，和“Cha”为L-环己基丙氨酸)的氨基酸序列的合成肽以及20μg由BrenntagBiosector A/S销售的
Figure BDA0003470586280001501
佐剂(其中含有经纯化的皂树(quillaja)皂苷类)混合。在第2天和第9天(＝TC-1注射后第16天和第23天)皮下(SC)施用HPV16 E7疫苗或杜氏(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。将Cbl-b抑制剂溶于合适制剂中，并以合适的剂量水平和频率进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。在初始研究中，将在合适媒剂中的Cbl-b抑制剂(化合物编号60)、或所述媒剂从第0天(＝TC-1注射后第14天)开始以180mg/kg的剂量每天两次(BID)进行口服(PO)给药。在进一步的研究中，Cbl-b抑制剂制剂通过口服(PO)或肠胃外(例如，IV、IP、SC、或在每个肿瘤的1至3个注射部位进行瘤内给药)进行给药。除了接受联合疗法(Cbl-b抑制剂制剂+HPV16 E7疫苗)的小鼠试验组外，所述研究还包括接受以下治疗的小鼠对照组：媒剂制剂+DPBS、Cbl-b抑制剂制剂+DPBS、或媒剂制剂+HPV16 E7疫苗。
从第0天(注射TC-1后第14天)开始，每周记录两次肿瘤尺寸，并持续贯穿整个给药持续时间，直至第33天和第42天之间(＝TC-1注射后第47天和第56天之间)达到人道终点。通过比较试验小鼠与对照小鼠(每组10只小鼠)的肿瘤生长来评估应答水平。此外，在试验小鼠和对照小鼠(每组6只小鼠)第10天(＝TC-1注射后第24天)时，通过收集肿瘤以分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来评估免疫活化水平。使用标准方法对TIL进行处理以用于流式细胞术分析，从而确定抗原特异性、细胞类型特异性标志物的表达、以及活化标志物(例如，颗粒酶B、CD25、CD69、PD-1和LAG3)的表达。在进一步的实验中，还收集并处理了PBMC和/或脾细胞。通过比较试验组小鼠和研究组小鼠中总的或E7特异性(肿瘤抗原特异性)CD8+T细胞的相对百分比、以及免疫细胞上活化标志物的相对表达水平，评估了联合疗法对抗肿瘤免疫应答的增强作用。
结果
如表6所示，Cbl-b抑制与肿瘤肽疫苗接种联合促进了肿瘤肽特异性CD8+T细胞的肿瘤浸润。此外，包括Cbl-b抑制剂和肿瘤肽疫苗的联合疗法使得经肿瘤肽特异性(E7+)及其他(E7-)活化的CD8+T细胞在肿瘤中的水平均升高。此外，包括Cbl-b抑制剂和肿瘤肽疫苗的联合疗法比各自的单药疗法(0/10部分应答者对单独的Cbl-b抑制剂有应答，3/10部分应答者对单独的肿瘤肽疫苗有应答)产生更多的部分应答者(6/10小鼠)。在本实验中，部分应答者定义为其肿瘤尺寸(肿瘤体积)相对于未接受Cbl-b抑制剂或肿瘤肽疫苗的对照组小鼠的肿瘤尺寸显著减小。
表6.HPV16 E7疫苗和Cbl-b抑制剂接受者的TIL中CD8+T细胞的平均增加^
TIL概况 HPV16 E7疫苗+化合物编号60
％E7阳性T细胞 33.7
％颗粒酶阳性(E7+T细胞) 7.86
％PD1阳性(E7+T细胞) 14.97
％LAG3阳性(E7+T细胞) 13.49
％颗粒酶阳性(E7-T细胞) 4.12
％PD1阳性(E7-T细胞) 20.23
％LAG3阳性(E7-细胞) 0.96
^百分比增加是相对于在不含Cbl-b抑制剂的情况下HPV16 E7疫苗接受者的TIL中的CD8+T细胞。生物学实施例12：候选抑制剂对Cbl-b抑制作用的评价
对候选化合物结合并抑制Cbl-b(一种E3泛素蛋白连接酶)的能力进行评估，这可通过其置换与Cbl-b结合的荧光团标记的探针的能力来证明。
物料与方法
Cbl-b置换试验(Cbl-b抑制试验)
在候选化合物存在下，通过监测Cbl-b与荧光团标记的探针的相互作用来测定候选化合物置换已知抑制剂从而抑制Cbl-b活性的能力。包含残基36-427和N端Avitag的Cbl-b截短变体(UniProt编号Q13191)与BirA生物素连接酶共表达，并使用标准方案进行纯化(参见Dou et al.,Nature Structural and Molecular Biology 8:982-987,2013；Avidity LLC)。
合成荧光标记的抑制剂探针并用BODIPY FL进行标记。通过在候选化合物的1％DMSO(最终浓度)溶液存在下，在含有20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.01％Triton X-100、0.01％BSA和0.5mM TCEP的测定缓冲液中，预孵育0.5nM Cbl-b或0.125nM Cbl-b(最终浓度，分别表示为“高”和“低”)1小时，在室温下于384孔板中以10μL反应体积进行Cbl-b置换试验。在候选化合物存在下孵育后，将板在由150nM荧光标记的抑制剂探针和2nM链霉亲和素-铽(Cisbio)(最终浓度)组成的近似EC40结合饱和度存在下再孵育1小时。在孵育1小时后，使用Envision读板器(Perkin Elmer)在520/620nM处读取所述板的TR-FRET信号。TR-FRET信号的存在表明探针未被候选化合物从Cbl-b置换。FRET信号的缺失表明探针被候选化合物从Cbl-b置换。
结果
使用标准方法分析Cbl-b活性测定试验的结果数据，以确定受试化合物的IC50值。在表7中，化合物的IC50分级如下：A表示<1nM；和B表示1nM-5nM；以及C表示>5nM。
表7.受试化合物对Cbl-b的抑制作用
化合物编号 Cbl-b IC<sub>50</sub>(高) Cbl-b IC<sub>50</sub>(低)
1 B
4 B
11 B
19 A
20 A
21 A
56 A
60 C
空白单元格表示数据未提供。
生物学实施例13：Cbl-b抑制剂对T细胞活化的评价
对Cbl-b抑制剂活化T细胞的能力进行评估。
物料和方法
原代人总T细胞活化的纯化及评价
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PMBC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。细胞在37℃、5％CO2下静置过夜。将Cbl抑制剂加至每孔1x105个细胞中，将板在37℃下于5％CO2中以所指定浓度(表8)孵育1小时，最终DMSO浓度<0.1％。对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体(抗CD3/抗CD28)刺激的样品，受试的Cbl-b抑制剂浓度为1μM和0.3μM。对于用单独的抗CD3抗体(抗CD3)刺激的样品，受试的Cbl-b抑制剂浓度为3μM和1μM。与Cbl-b抑制剂孵育后，用板结合单独的抗CD3抗体(OKT3)或板结合抗CD3抗体(OKT3)与可溶性抗CD28抗体(28.2)(Life Technologies)来刺激原代人总T细胞。为制备具有板结合抗CD3抗体(OKT3)的平板，将96孔圆底组织培养板用100μL抗CD3抗体(OKT3)以10μg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中于37℃、5％CO2条件下包被4小时。将板用PBS清洗一次，然后将含有或不含可溶性抗CD28抗体(28.2)的细胞以5μg/mL的终浓度加至每个孔中。刺激细胞48小时，然后收获无细胞上清液并使细胞群染色以通过流式细胞术评估表面标志物。按照制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems，Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)分析上清液的细胞因子分泌，包括IL-2的分泌。细胞用抗CD25抗体(BD Biosciences)染色以评估表面活化标志物的水平。
结果
读数报告为相对于基线的倍数变化。本研究的基线是从用抗CD3抗体及用可溶性抗CD28抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育(表8)。对于用抗CD3/抗CD28刺激的T细胞，IL-2分泌相对于基线大于2.5倍和CD25表面染色相对于基线大于1.3倍的变化被认为是显著的，并认为是阳性反应。对于用单独的抗CD3刺激的T细胞，IL-2分泌相对于基线大于0.1倍和CD25表面染色相对于基线大于0.6倍的变化被认为是显著的，并认为是阳性反应。
化合物根据其读数按以下方式分级：
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的IL-2分泌，分级为：C表示≤10倍，B表示11–15倍，和A表示>15倍；
对于用抗CD3抗体刺激的IL-2分泌，分级为：C表示≤0.33倍，B表示0.34–0.66倍，和A表示>0.66倍；
对于用抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激的CD25染色，分级为：C表示≤1.24倍，B表示1.25–1.39倍，和A表示>1.39倍；和
对于用抗CD3抗体刺激的CD25染色，分级为：C表示≤1.04倍，B表示1.05–1.14倍，和A表示>1.14倍。
表8.通过IL-2分泌和CD25表面染色评估的T细胞活化，作为用抗CD3、或抗CD3与抗CD28刺激的结果
Figure BDA0003470586280001541
Cbl-b抑制剂提高了使用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激的T细胞的IL-2分泌。当用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合刺激时，T细胞表面上CD25活化标志物的表达增加。这些结果表明所鉴定的Cbl-b抑制剂具有活化T细胞的能力，并且此种活化无需与抗CD28抗体共刺激。
生物学实施例14：Cbl-b抑制剂的免疫调节作用评价
从筛选试验中鉴定出的Cbl-b抑制剂表现出在体外活化总人T细胞的能力，这可通过提高的IL-2分泌和CD25表面活化标志物的表达来证明。
进行了进一步的体外研究以评估T细胞的额外细胞因子分泌和T细胞表面活化标志物的表达。评估了对与本发明所述的Cbl-b抑制剂接触的T细胞的额外免疫调节作用，例如Cbl-b抑制剂增加T细胞增殖、减少T细胞耗竭和降低T细胞失能的能力。还评估了Cbl-b抑制剂(如本发明所述的那些)在体内活化T细胞的能力。评估了Cbl-b抑制剂的其他免疫调节作用，例如Cbl-b抑制剂活化B细胞和NK细胞的能力。
原代人总T细胞活化的纯化及评价
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PMBC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。为了测定细胞增殖，在通过使用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合进行刺激以活化之前，按照制造商的方案用Cell Trace Violet(Invitrogen)标记细胞。Cbl-b抑制剂以多个浓度(例如，10μM、1.11μM或0.123μM)添加至每孔1x105个细胞中，最终DMSO浓度<0.1％。将板在37℃下于5％CO2中孵育1小时。与Cbl-b抑制剂孵育后，用板结合单独的抗CD3抗体(OKT3)或板结合抗CD3抗体(OKT3)与可溶性抗CD28抗体(28.2)(Life Technologies)来刺激原代人总T细胞。为制备具有板结合抗CD3抗体(OKT3)的平板，将96孔圆底组织培养板用100μL抗CD3抗体(OKT3)以10μg/mL的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中于37℃、5％CO2下包被4小时。将板用PBS清洗，然后将含有或不含可溶性抗CD28抗体(28.2)的细胞以5μg/mL的终浓度加至每个孔中。刺激细胞48小时，然后收获无细胞上清液并使细胞群染色以通过流式细胞术评估表面标志物。按照制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems，Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(ProcartaLife Technologies)分析上清液的细胞因子分泌(例如，GM-CSF、IFNγ和TNFα)。细胞用抗CD69抗体(BD Biosciences)染色以评估表面活化标志物的水平。通过流式细胞术测定增殖，并使用FlowJo v7.6.5或v10分析数据。读数报告为相对于基线的倍数变化。在一些实施方案，基线是从用单独的抗CD3抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。在一些实施方案，基线是从用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的总人T细胞获得的测定值，其中所述细胞未与Cbl-b抑制剂一同孵育。
亦在同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的背景下评估了Cbl-b抑制剂对原代人T细胞的影响。同种异体未成熟树突状细胞在以下条件下生成。外周血单核细胞(PBMC)通过以下方式获得：1)通过使用Ficoll-PaqueTM(GE Healthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。根据制造商的方案(StemcellTechnologies目录#17858)，使用商业试剂盒采用阳性选择从PMBC中分离单核细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD14+细胞。将单核细胞与30ng/mL重组人GM-CSF和20ng/mL重组人IL-4一同培养7天，以生成未成熟的树突状细胞。单核细胞和T细胞均是从外周血新鲜分离得到，或是从冷冻原液解冻得到。分离人T细胞，用CFSE标记，并与上述抑制剂一同孵育。将Cbl-b抑制剂加至1x105T细胞中，与每孔2x103个同种异体未成熟树突状细胞在多个浓度(例如，10μM或1.11μM)下共培养，最终DMSO浓度<0.1％，并在37℃下于5％CO2中孵育5天。T细胞的增殖通过流式细胞术进行评估。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高T细胞分泌细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和TNFα)和/或表明T细胞活化的T细胞上细胞表面标志物(例如CD69)的表面表达的能力。亦对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高T细胞增殖的能力。测试了Cbl-b抑制剂在共刺激存在的情况下及条件不适宜启动的情况下对T细胞活化的影响。
T细胞耗竭的人T细胞体外模型
T细胞耗竭的特征是细胞具有较差的效应反应和持续水平的抑制性受体表达，导致T细胞功能障碍以应对慢性感染和癌症。T细胞耗竭的体外模型包括同种异体模型和自体模型。在自体模型中，髓系细胞和SEB(葡萄球菌肠毒素B，Millipore)用于刺激经抗CD3刺激的T细胞。外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案，使用StemCells EasySep人单核细胞富集试剂盒(无CD16耗竭)(目录#19058)进行阴性选择，使用商业试剂盒分离单核细胞。分离的单核细胞在含有50ng/mL重组人M-CSF(R&D System或Peprotech)的完全培养基(例如，不含添加剂的RPMI 1640，10％HI FBS，1X谷氨酰胺和1Xβ-巯基乙醇)中培养。将细胞以每孔2x106个细胞(第0天)进行接种并培养5天，并在第2天用新鲜培养基和细胞因子饲喂。在第5天，加入100ng/mL的IFNγ，将细胞孵育过夜。按照制造商的方案，使用阴性选择(采用Stemcell TechnologiesEasySep人T细胞分离试剂盒(目录#17951))，采用商业试剂盒从PBMC中分离来自同一供体的原代人T细胞。通过流式细胞术检测CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD19、CD14、CD56和CD3(BDBiosciences)的表面标志物来确证纯度。将3x106个细胞/mL T细胞用10μg/mL的板结合抗CD3抗体(克隆UCHT-1)刺激5天。这与髓系细胞生成同时进行。在第6天，每孔添加2.5x104个T细胞，每孔添加12.5x103个髓系细胞，并将SEB抗原(0.1μg/mL)添加至圆底96孔板的孔中。将测试试剂(例如，Cbl-b抑制剂化合物)或对照(例如，检查点中和抗体，如抗PD1抗体)以指定浓度(例如，10μM)添加至孔中。将细胞培养3天，此时收集无细胞上清液并通过ELISA(R&DSystems、Peprotech或Life Technologies)或Luminex多重试剂盒(Procarta LifeTechnologies)评估分泌的细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和IL-2)。T细胞针对包括检查点抑制剂(例如，CTLA4)在内的一组表面标志物进行染色，并通过流式细胞术对Cbl-b抑制剂的作用进行评估。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高耗竭的T细胞在髓系细胞存在下分泌细胞因子(例如，GM-CSF、IFNγ和IL-2)的能力，这表明T细胞耗竭减少。亦测试了Cbl-b抑制剂对耗竭的T细胞活化后检查点调节剂表达水平的影响。
T细胞失能的人T细胞体外模型
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-096-535(即，将针对表面标志物CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a的抗体混合物与PBMC一同孵育，然后使磁珠通过样品以去除表达这些表面标志物的细胞)或Stemcell Technologies目录#17951)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PBMC中分离出总人原代T细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD3+细胞。细胞用固定化抗CD3抗体(OKT3)和可溶性抗CD28抗体(28.2)活化两天，然后将其清洗并在无刺激情况下静置3天。然后用离子霉素(Sigma)将其处理18-24小时以诱导失能。在两次清洗以从样品中去除离子霉素后，将Cbl-b抑制剂化合物以指定浓度(例如，10μM、1.11μM和0.37μM)添加至细胞中并孵育1小时。然后用抗CD3抗体和抗CD28抗体再次攻击细胞24小时，此时收集无细胞上清液，并按照制造商的方案通过ELISA(R&DSystems或Peprotech)或Luminex多重试剂盒(Procarta Life Technologies)来评估细胞因子(例如，IFNγ)。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高失能T细胞分泌细胞因子(例如，IFNγ)的能力，这表明T细胞耐受性降低。
Cbl-b抑制剂的体内活性
测定Cbl-b抑制剂药效学特征的方法是通过对具有例如C57BL/6或BALB/c等的有效免疫系统(competent immune system)的小鼠品系给药Cbl-b抑制剂来进行。将Cbl-b抑制剂溶于合适制剂中，并通过各种途径之一(例如，静脉内(IV)、腹腔内(IP)、皮下(SC)或口服(PO))，以合适的剂量水平和频率(例如，每日两次BID或每日三次TID)进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。在施用Cbl-b抑制剂后，T细胞及间接其他免疫细胞(例如，经由细胞因子生成)通过例如IV或IP等途径施用规定量(例如，每只动物2μg或10μg)的抗CD3抗体或其抗原结合片段的PBS溶液进行体内刺激(参见Hirsh et al.,J.Immunol.,1989；Ferran et al.,Eur.J.Immunol.,1990)。其他研究对照组包括仅用媒剂制剂(即，不含Cbl-b抑制剂和抗CD3抗体的制剂)、仅含有Cbl-b抑制剂的制剂、仅含有抗CD3抗体的制剂、仅PBS、或这些药剂的组合治疗的小鼠组别。然后通过分析血浆细胞因子水平和/或免疫细胞(例如，T细胞)上活化标志物的表达来评估免疫活化水平。在规定的时间点(例如，8小时或24小时)收集血液或淋巴器官(例如，脾脏)。使用本领域已知的标准方法处理血液样品以收集血浆，用于测定细胞因子水平。所测定的细胞因子包括IL-2、IFNγ和TNFα。使用标准方法对额外的血液样品和淋巴组织进行处理，以用于免疫细胞(例如，T细胞)的流式细胞术分析，从而确定细胞类型特异性标志物及活化标志物(例如CD25和/或CD69)的表达。通过比较适当组之间血浆中细胞因子的相对浓度或免疫细胞上活化标志物的表达水平(例如，用Cbl-b抑制剂和2μg抗CD3抗体处理的小鼠与用媒剂和2μg抗CD3抗体处理的小鼠之间的对比)，评估了Cbl-b抑制剂给药对免疫刺激的增强作用。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高血液中细胞因子(例如，IL-2、IFNγ和TNFα)水平的能力，所述血液得自用抗CD3抗体刺激的经治疗小鼠，这表明免疫应答被调节。还对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高分离自用抗CD3抗体刺激的经治疗小鼠的T细胞上细胞表面标志物(例如，CD25和/或CD69)表达的能力，这表明免疫应答被调节。
B细胞活化测定试验
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Stemcell Technologies目录#17954)，使用商业试剂盒进行阴性选择，从PBMC中分离人原代B细胞，以通过流式细胞术评估生成>95％的CD20+细胞。将原代人B细胞以每孔0.7-1x105个接种在含Cbl-b抑制剂的96孔板中，所述Cbl-b抑制剂的剂量范围为10μM至1nM，并于37℃、5％CO2下孵育，最终DMSO浓度<0.5％。将细胞在37℃、5％CO2下用抗IgM刺激20小时。使用抗CD69抗体(BD Biosciences)通过FACS监测成熟CD20+IgD+B细胞上的表面活化标志物。
对Cbl-b抑制剂进行测试，以确定其诱导或提高B细胞上细胞表面标志物(例如，CD69)的表面表达的能力，这表明B细胞活化。
原代人NK细胞的纯化及活化
外周血单核细胞(PBMC)可通过以下方式获得：1)使用Ficoll-PaqueTM(GEHealthcare)从健康人类供体的血沉棕黄层分离外周血造血细胞；或2)直接来自LeukoPak的捐赠。按照制造商的方案(Miltenyi Biotec目录#130-092-657或StemcellTechnologies目录#17955)，使用商业试剂盒进行阴性选择从PBMC中分离总人原代NK细胞，以通过流式细胞术评估生成>92％的CD56+、CD3细胞。将细胞与IL-2(60ng/mL)在37℃、5％CO2下培养过夜。在刺激前1小时加入Cbl-b抑制剂，并在37℃、5％CO2下以特定浓度(例如，10μM、1μM或0.1μM)孵育，最终DMSO浓度<0.1％。将NK细胞与靶细胞共培养，所述这些靶细胞被设计成具有可通过流式细胞术测定的红核(K562 NucRed)。K562 NucRed细胞是通过用IncuCyte NucLight Red慢病毒试剂(目录#4476)转导K562细胞而产生，并选择5天。使用标准组织培养技术来分离和扩增克隆群，并通过在NK细胞杀伤测定试验中与野生型K562细胞进行比较来验证单个克隆。将细胞以指定比例(例如，5:1、1:1或1:5)的NK(效应细胞)与K562 NucRed(靶细胞)混合6小时。收集无细胞上清液，并按照制造商的方案通过ELISA或Luminex多重试剂盒来分析细胞因子分泌(例如，TNFα、IFNγ或MIP1β)。使用R&D SystemsELISA试剂盒(目录#DY285)来评估IFNγ分泌，使用R&D Systems ELISA试剂盒(目录#DY210)来评估TNFα分泌，和使用R&D Systems ELISA试剂盒(目录#DY271)来评估MIP1β分泌。
生物学实施例15：Cbl-b抑制剂与溶瘤病毒联合用于治疗癌症的评价
溶瘤病毒优先感染并杀死癌细胞并刺激宿主抗肿瘤免疫应答。本实施例描述了用于治疗小鼠癌症的包括溶瘤病毒和Cbl-b抑制剂的联合疗法的评价。
物料和方法
简言之，联合疗法在携带同基因MC-38细胞肿瘤的C57BL/6小鼠中进行测试。MC-38细胞源自鼠类腺癌，其已通过皮下注射二甲基肼进行诱导(Cameron et al.,J Exp Med,171:249-263,1990)。MC-38细胞进行皮下或腹腔内注射。使肿瘤生长约5-7天，此时将动物随机分组并开始治疗。
溶瘤病毒，例如痘苗病毒，以约108-109个鼠疫形成单位的剂量进行腹腔内给药(Puhlmann et al.,Cancer Gene Therapy,7:66-73,2000)。将Cbl-b抑制剂溶于合适制剂中，并以合适的剂量水平和频率进行给药，如先前药代动力学和耐受性研究所述。在初始研究中，将于合适媒剂中的Cbl-b抑制剂、或单独的所述媒剂从第0天(＝MC-38注射后第5-7天)开始以180mg/kg的剂量每天两次(BID)进行口服(PO)给药。在进一步的研究中，Cbl-b抑制剂制剂通过口服(PO)或肠胃外(例如，IV、IP、SC、或在每个肿瘤的1至3个注射部位进行瘤内给药)进行给药。除了接受联合疗法(Cbl-b抑制剂制剂+溶瘤病毒)的小鼠试验组外，所述研究还包括接受以下治疗的小鼠对照组：媒剂制剂+DPBS、Cbl-b抑制剂制剂+DPBS、或媒剂制剂+溶瘤病毒。
通过测定肿瘤生长并比较试验小鼠与对照小鼠的肿瘤生长来评估应答水平。此外，通过收集肿瘤以分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来评估免疫活化水平。在进一步的实验中，还收集了PBMC或脾细胞。使用标准方法对TIL及任选地其他淋巴细胞样本进行处理以用于流式细胞术分析，从而确定抗原特异性、细胞类型特异性标志物的表达、以及活化标志物(例如，颗粒酶B、CD25、CD69、PD-1和LAG3)的表达。通过比较试验组小鼠和研究组小鼠肿瘤中免疫细胞群的相对百分比、以及免疫细胞上活化标志物的相对表达水平，来评估联合疗法对抗肿瘤免疫应答的增强作用。
在此通过识别引用所参照的所有出版物、专利、专利申请及公布的专利申请的公开内容均通过引用其全文并入本发明。
尽管为了清楚理解的目的，已通过举例说明和实施例的方式对前述公开的各个方面进行了一些详细描述，但对于本领域技术人员而言，显而易见的是可实施某些改变或变化及修改或修饰。因此，本说明书及实施例不应被解释为限制本发明的范围。

Claims (257)

1.式(I)所示化合物：
Figure FDA0003470586270000011
或其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐，
其中
Figure FDA0003470586270000012
是
Figure FDA0003470586270000013
Z1是CH或N；
Z2是CH或N；
R1是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
R2是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C3-C6环烷基；
R3是-CF3或环丙基；
R4是-CF3或环丙基；
X是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或
Figure FDA0003470586270000014
R5是H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN；
R6是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基，其中R6的每个基团任选地被1至5个R7基团取代；
或R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1至2个选自由N和O组成的组的额外杂原子，和其中的每一个杂环基或杂芳基任选地被1至5个R8基团取代；
各R7分别独立地为卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、或C1-C6烷基-CN；
各R8分别独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-OH、-CN、C1-C6烷基-CN、-(C1-C6亚烷基)-O-(C1-C6烷基)、羟基、或卤素，
或连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C6环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基；
各R9分别独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、或C1-C6烷基-OH；和
n是0或1。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中
Figure FDA0003470586270000021
是
Figure FDA0003470586270000022
3.根据权利要求2所述的化合物，其中Z1是CH。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中
Figure FDA0003470586270000023
是
Figure FDA0003470586270000024
5.根据权利要求2所述的化合物，其中Z1是N。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中
Figure FDA0003470586270000025
是
Figure FDA0003470586270000026
7.根据权利要求1所述的化合物，其中
Figure FDA0003470586270000027
是
Figure FDA0003470586270000028
8.根据权利要求7所述的化合物，其中Z2是CH。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中
Figure FDA0003470586270000029
是
Figure FDA00034705862700000210
10.根据权利要求7所述的化合物，其中Z2是N。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中
Figure FDA0003470586270000031
是
Figure FDA0003470586270000032
Figure FDA0003470586270000033
12.根据权利要求1-11任一项所述的化合物，R1是H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中R1是H、-CH3、或-CF3。
14.根据权利要求1-13任一项所述的化合物，其中R2是H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、或C3-C4环烷基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中R2是H、-CH3、-CF3、-CHF2、-CH2F、或环丙基。
16.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中n是0。
17.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中n是1。
18.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中X是H。
19.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中X是C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中X是-CH3或-CF3。
21.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中X是
Figure FDA0003470586270000034
22.根据权利要求21所述的化合物，其中R5是H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中R5是H、-CH3、-CF3、-CH2CN、或-CH2OH。
24.根据权利要求21-23任一项所述的化合物，其中R6是单环C3-C6环烷基、稠合双环C4-C8环烷基、桥接双环C4-C8环烷基、螺双环C5-C8环烷基、或5至6个原子组成的杂环基，其中R6的每个基团任选地被1至5个R7基团取代。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中R6选自由以下组成的组：
Figure FDA0003470586270000041
26.根据权利要求24或25所述的化合物，其中各R7，当存在时，分别独立地为卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基-OH、或C1-C3烷基-CN。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中各R7，当存在时，分别独立地为F、-CH3、-CF3、-CH2OH、或-CH2CN。
28.根据权利要求21所述的化合物，其中R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成5至10个原子组成的单环、稠合双环或桥接杂环基，或5至10个原子组成的单环或双环杂芳基，其中的每一个杂环基或杂芳基任选地包含1至2个选自由N和O组成的组的额外杂原子，和其中的每一个杂环基或杂芳基任选地被1至5个R8基团取代。
29.根据权利要求28所述的化合物，其中R5和R6同与之连接的所述氮原子一起形成选自由以下组成的组的基团部分：
Figure FDA0003470586270000042
30.根据权利要求28或29所述的化合物，其中，
各R8，当存在时，分别独立地为C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷基-OH、-CN、C1-C3烷基-CN、-(C1-C3亚烷基)-O-(C1-C3烷基)、羟基、或卤素，或
连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺C3-C4环烷基或螺5至6个原子组成的杂环基。
31.根据权利要求30所述的化合物，其中，
各R8，当存在时，分别独立地为-CH3、-CH2CH3、-CF3、-CH2OH、-CN、-CH2CN、-CH2-O-CH3、羟基、或F，或
连接至同一碳原子上的两个R8基团同与之连接的所述碳原子一起形成螺环丙基。
32.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中各R9分别独立地为H、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、或C1-C3烷基-OH。
33.根据权利要求32所述的化合物，其中各R9分别独立地为H、-CH3、-CF3、或-CH2OH。
34.根据权利要求1所述的化合物，其选自表1中的化合物。
35.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的化合物、以及药学上可接受的辅料。
36.调节免疫细胞活性的方法，所述方法包含使所述免疫细胞与有效量的Cbl-b抑制剂接触以调节所述免疫细胞活性，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述免疫细胞包含T细胞、B细胞、或自然杀伤(NK)细胞。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述免疫细胞已经分离自或分离自哺乳动物受试者的血样。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)已经分离自或分离自患有癌症的哺乳动物受试者的肿瘤。
40.根据权利要求36-39任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含T细胞，和其中调节所述T细胞活性包含增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭(exhaustion)、及降低的T细胞耐受性中的一种或多种。
41.根据权利要求40所述的方法，其中增加的T细胞活化包含增加细胞因子的生成。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞因子包含选自由IL-2、IFN-γ、TNFα和GM-CSF组成的组中的一种或多种。
43.根据权利要求40或41所述的方法，其中增加的T细胞活化包含增加一种或多种T细胞活化标志物的细胞表面表达。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述T细胞活化标志物包含选自由CD25、CD69和CTLA4组成的组中的一种或多种。
45.根据权利要求40-44任一项所述的方法，其中所述T细胞已经与或与单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触。
46.根据权利要求40-44任一项所述的方法，其进一步包含用单独的IL-2或IL-2与抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的组合来培养所述免疫细胞。
47.根据权利要求36-39任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含NK细胞，和其中调节NK细胞活性包含增加的NK细胞活化。
48.根据权利要求47所述的方法，其中增加的NK细胞活化包含增加细胞因子的生成。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞因子包含选自由IFN-γ、TNFα和MIP1β组成的组中的一种或多种。
50.根据权利要求36-49任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含B细胞，和其中调节B细胞活性包含增加的B细胞活化，任选地其中增加的B细胞活化包含增加CD69的表达。
51.根据权利要求36-50任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是人免疫细胞。
52.根据权利要求36-51任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含重组嵌合受体。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述重组嵌合受体是嵌合抗原受体。
54.生成经修饰的免疫细胞的方法，其包含在有效量的Cbl-b抑制剂存在下培养包含免疫细胞的细胞群以调节所述免疫细胞活性，从而生成所述经修饰的免疫细胞，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其进一步包含用单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合来培养所述免疫细胞。
56.根据权利要求54所述的方法，其进一步包含用单独的IL-2或IL-2与抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的组合来培养所述免疫细胞。
57.根据权利要求54-56任一项所述的方法，其进一步包含回收所述经修饰的免疫细胞。
58.根据权利要求54-57任一项所述的方法，其中所述免疫细胞已经分离自或分离自哺乳动物受试者的血样，或所述免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)已经分离自或分离自患有癌症的哺乳动物受试者的肿瘤。
59.根据权利要求54-57任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是选自由以下组成的组的细胞：造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、和NK细胞。
60.根据权利要求54-57任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞是选自由以下组成的组的细胞：造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞、和NK细胞。
61.根据权利要求54-60任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
62.根据权利要求54-61任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是人免疫细胞。
63.根据权利要求54-62任一项所述的方法，其中所述免疫细胞或经修饰的免疫细胞包含重组嵌合受体。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述重组嵌合受体是嵌合抗原受体。
65.经修饰的免疫细胞，其通过权利要求54-64中任一项所述的方法生成。
66.经修饰的免疫细胞，其包含Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
67.分离的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞已经与或与Cbl-b抑制剂接触，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
68.根据权利要求66或67所述的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞已经分离自或分离自哺乳动物受试者的血样，或所述免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)已经分离自或分离自患有癌症的哺乳动物受试者的肿瘤。
69.根据权利要求67或68所述的经修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是在所述免疫细胞与所述Cbl-b抑制剂接触之前从患有癌症的哺乳动物受试者的肿瘤分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
70.根据权利要求67-69任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是T细胞，和其中所述T细胞表现出增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭、及降低的T细胞耐受性中的一种或多种。
71.根据权利要求70所述的经修饰的免疫细胞，其中增加的T细胞活化包含增加细胞因子的生成。
72.根据权利要求71所述的经修饰的免疫细胞，其中所述细胞因子包含选自由IL-2、IFN-γ、TNFα和GM-CSF组成的组中的一种或多种。
73.根据权利要求70-72任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中增加的T细胞活化包含增加一种或多种T细胞活化标志物的细胞表面表达。
74.根据权利要求73所述的经修饰的免疫细胞，其中所述T细胞活化标志物包含选自由CD25、CD69和CTLA4组成的组中的一种或多种。
75.根据权利要求70-74任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述T细胞已经与或与单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合接触。
76.根据权利要求70-74任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述T细胞已经与或与单独的IL-2或IL-2与抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的组合接触。
77.根据权利要求67-69任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是NK细胞，和其中所述NK细胞表现出增加的NK细胞活化。
78.根据权利要求77所述的经修饰的免疫细胞，其中增加的NK细胞活化包含增加细胞因子的生成。
79.根据权利要求78所述的经修饰的免疫细胞，其中所述细胞因子包含选自由IFN-γ、TNFα和MIP1β组成的组中的一种或多种。
80.根据权利要求67-69任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是B细胞，和其中所述B细胞表现出增加的B细胞活化，任选地其中增加的B细胞活化包含增加CD69的表达。
81.根据权利要求67-80任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是人免疫细胞。
82.根据权利要求67-81任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含重组嵌合受体。
83.根据权利要求82所述的经修饰的免疫细胞，其中所述重组嵌合受体是嵌合抗原受体。
84.组合物，其包含细胞群，所述细胞群包含权利要求65-83中任一项所述的经修饰的免疫细胞。
85.根据权利要求84所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的辅料。
86.根据权利要求84所述的组合物，其中所述组合物是在培养器皿中。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述培养器皿是管、皿、袋、多孔板、或烧瓶。
88.根据权利要求84或85所述的组合物，其中所述组合物是在适当容器中。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述适当容器是瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管。
90.调节所述免疫应答的方法，所述方法包含向有需要的个体施用有效量的权利要求65-83任一项所述的经修饰的免疫细胞或有效量的权利要求84-89任一项所述的组合物。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述个体患有癌症。
92.治疗对Cbl-b活性抑制有应答的癌症的方法，所述方法包含向患有对Cbl-b活性抑制有应答的所述癌症的个体施用有效量的权利要求65-83任一项所述的经修饰的免疫细胞或有效量的权利要求84-89任一项所述的组合物。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述血液学癌症是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。
95.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述癌症是非血液学癌症。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述非血液学癌症是肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
97.抑制异常细胞增殖的方法，所述方法包含向有需要的个体施用有效量的权利要求65-83任一项所述的经修饰的免疫细胞或有效量的权利要求84-89任一项所述的组合物。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述异常细胞增殖是增生或癌细胞增殖。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述癌细胞来自血液学癌症。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述血液学癌症是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。
101.根据权利要求98所述的方法，其中所述癌细胞来自非血液学癌症。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述非血液学癌症是肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
103.调节所述免疫应答的方法，所述方法包含向个体施用有效量的Cbl-b抑制剂以调节所述个体的所述免疫应答，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
104.抑制Cbl-b活性的方法，所述方法包含向个体施用有效量的Cbl-b抑制剂以抑制所述个体的Cbl-b活性，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
105.治疗对Cbl-b活性抑制有应答的癌症的方法，所述方法包含向个体施用有效量的Cbl-b抑制剂以治疗对Cbl-b活性抑制有应答的所述癌症，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症，任选地其中所述血液学癌症是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述癌症是非血液学癌症，任选地其中所述非血液学癌症是肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
108.根据权利要求103-107任一项所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂通过肠内给药进行施用，任选地其中所述肠内给药是口服给药。
109.根据权利要求103-107任一项所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂通过肠胃外给药进行施用，任选地其中所述肠胃外给药是瘤内给药。
110.根据权利要求105-109任一项所述的方法，其进一步包含向所述个体施用有效量的权利要求65-83任一项所述的经修饰的免疫细胞或有效量的权利要求84-89任一项所述的组合物以治疗所述癌症。
111.抑制异常细胞增殖的方法，所述方法包含向个体施用有效量的Cbl-b抑制剂以抑制所述个体的异常细胞增殖，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述异常细胞增殖是增生或癌细胞增殖。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述癌细胞来自血液学癌症，任选地其中所述血液学癌症是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。
114.根据权利要求112所述的方法，其中所述癌细胞来自非血液学癌症，任选地其中所述非血液学癌症是肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
115.根据权利要求111-114任一项所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂通过肠内给药进行施用，任选地其中所述肠内给药是口服给药。
116.根据权利要求111-114任一项所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂通过肠胃外给药进行施用，任选地其中所述肠胃外给药是瘤内注射，或所述肠胃外给药是通过选自由静脉内、腹腔内及皮下组成的组的途径。
117.根据权利要求103-116任一项所述的方法，其中所述个体在施用所述Cbl-b抑制剂之后具有增加的T细胞活化、增加的T细胞增殖、减少的T细胞耗竭、及降低的T细胞耐受性中的一种或多种。
118.根据权利要求117所述的方法，其中增加的T细胞活化包含增加细胞因子的生成。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述细胞因子包含选自由IL-2、IFN-γ、TNFα和GM-CSF组成的组中的一种或多种。
120.根据权利要求117-119任一项所述的方法，其中增加的T细胞活化包含增加一种或多种T细胞活化标志物的细胞表面表达。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述T细胞活化标志物包含选自由CD25、CD69和CTLA4组成的组中的一种或多种。
122.根据权利要求103-121任一项所述的方法，其中所述个体在施用所述Cbl-b抑制剂之后具有增加的NK细胞活化。
123.根据权利要求122所述的方法，其中增加的NK细胞活化包含增加细胞因子的生成。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述细胞因子包含选自由IFN-γ、TNFα和MIP1β组成的组中的一种或多种。
125.根据权利要求103-124任一项所述的方法，其中所述个体在施用所述Cbl-b抑制剂之后具有增加的B细胞活化，任选地其中增加的B细胞活化包含增加CD69的表达。
126.细胞培养组合物，其包含细胞群，所述细胞群包含免疫细胞和Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
127.根据权利要求126所述的细胞培养组合物，其中所述免疫细胞是选自由以下组成的组的细胞：造血细胞、多能干细胞、髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、T细胞、B细胞及NK细胞。
128.根据权利要求126或127所述的细胞培养组合物，其进一步包含单独的抗CD3抗体或抗CD3抗体与抗CD28抗体的组合。
129.根据权利要求126-128任一项所述的细胞培养组合物，其中所述免疫细胞是包含重组嵌合受体的工程化免疫细胞。
130.根据权利要求129所述的细胞培养组合物，其中所述重组嵌合受体是嵌合抗原受体。
131.药物组合物，其包含Cbl-b抑制剂以及佐剂和抗原中的一者或两者，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
132.根据权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原是癌抗原。
133.制品，其包含权利要求65-83任一项所述的经修饰的免疫细胞、权利要求84-89任一项所述的组合物、权利要求126-130任一项所述的细胞培养组合物、或权利要求35所述的药物组合物。
134.根据权利要求133所述的制品，其中所述经修饰的免疫细胞或细胞培养组合物是在管、皿、袋、多孔板、或烧瓶中。
135.根据权利要求133所述的制品，其中所述经修饰的免疫细胞或药物组合物是在瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管中。
136.试剂盒，其包含权利要求65-83任一项所述的经修饰的免疫细胞或权利要求84-89任一项所述的组合物。
137.根据权利要求136所述的试剂盒，其中所述经修饰的免疫细胞是在管、皿、袋、多孔板、或烧瓶中。
138.根据权利要求136所述的试剂盒，其中所述经修饰的免疫细胞是在瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋、或管中。
139.根据权利要求136-138任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求90-102任一项所述的方法向个体施用所述经修饰的免疫细胞或组合物的说明书。
140.试剂盒，其包含权利要求35所述的药物组合物。
141.根据权利要求140所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求103-105任一项所述的方法向个体施用所述药物组合物的说明书。
142.试剂盒，其包含权利要求126-130任一项所述的细胞培养组合物。
143.根据权利要求142所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求54-64任一项所述的方法生成经修饰的免疫细胞的说明书。
144.治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的方法，所述方法包含向有需要的个体施用Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
145.使用Cbl-b抑制剂在制备治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
146.使用Cbl-b抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
147.Cbl-b抑制剂，其用于治疗或预防与Cbl-b活性相关的疾病或病症，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
148.Cbl-b抑制剂，其用于治疗癌症，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
149.治疗癌症的方法，所述方法包含：
向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物，和
向所述个体施用有效量的附加治疗剂。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂以任一顺序相继施用。
151.根据权利要求149所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂和所述附加治疗剂同时施用。
152.根据权利要求149-151任一项所述的方法，其中所述附加治疗剂包含免疫检查点抑制剂。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的至少一种抑制性检查点分子的拮抗剂：PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD125)、LAG3(CD223)、PVR(CD155)、PVRL2(CD112)、PVRL3(CD113)、TIGIT、TIM3(CD366)、和VISTA。
154.根据权利要求152所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的至少一种抑制性检查点分子的拮抗剂：PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、和CTLA-4(CD152)。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述至少一种抑制性检查点分子包含PD-1，任选地其中所述免疫检查点抑制剂是选自由派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、及其生物仿制药组成的组。
156.根据权利要求154所述的方法，其中所述至少一种抑制性检查点分子包含PD-L1，任选地其中所述免疫检查点抑制剂是选自由阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、及其生物仿制药组成的组。
157.根据权利要求154所述的方法，其中所述至少一种抑制性检查点分子包含CTLA-4，任选地其中所述免疫检查点抑制剂是选自由易普利姆玛(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、及其生物仿制药组成的组。
158.根据权利要求152-154任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗体或其抗原结合片段，任选地其中所述抗体或片段是人的或人源化的。
159.根据权利要求149-158任一项所述的方法，其中所述附加治疗剂包含抗肿瘤剂。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述抗肿瘤剂归类为由细胞毒性抗生素、植物生物碱、抗代谢物、烷化剂、及其他抗肿瘤剂组成的组中的一种。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含细胞毒性抗生素，任选地其中所述细胞毒性抗生素选自由以下组成的组：伊沙匹隆(ixabepilone)、丝裂霉素(mitomycin)、普卡霉素(plicamycin)、博来霉素(bleomycin)、匹杉琼(pixantrone)、氨柔比星(amrubicin)、戊柔比星(valrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、表柔比星(epirubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、和更生霉素(dactinomycin)。
162.根据权利要求160所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含植物生物碱，任选地其中所述植物生物碱选自由以下组成的组：曲贝替定(trabectedin)、卡巴他赛(cabazitaxel)、聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex)、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、地美可辛(demecolcine)、替尼泊苷(teniposide)、依托泊苷(etoposide)、长春福肽(vintafolide)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、和长春花碱(vinblastine)。
163.根据权利要求160所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含抗代谢物，任选地其中所述抗代谢物是嘧啶类似物、嘌呤类似物、或叶酸类似物，任选地其中所述抗代谢物选自由以下组成的组：氟尿苷(floxuridine)、三氟尿苷(trifluridine)、替加氟(tegafur)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、地西他滨(decitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、卡莫氟(carmofur)、替加氟(tegafur)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、奈拉滨(nelarabine)、氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、普拉曲沙(pralatrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、和甲氨蝶呤(methotrexate)。
164.根据权利要求160所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含烷化剂，任选地其中所述烷化剂选自由以下组成的组：达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、哌泊溴烷(pipobroman)、二溴甘露醇(mitobronitol)、依托格鲁(etoglucid)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)、雷莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、福莫司汀(fotemustine)、链脲佐菌素(streptozocin)、司莫司汀(semustine)、洛莫司汀(lomustine)、卡莫司汀(carmustine)、卡波醌(carboquone)、三亚胺醌(triaziquone)、噻替哌(thiotepa)、甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)、白消安(busulfan)、苯达莫司汀(bendamustine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
165.根据权利要求160所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含选自由铂化合物、蛋白激酶抑制剂、及其他药剂组成的组的其他抗肿瘤剂。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含铂化合物，任选地其中所述铂化合物选自由以下组成的组：顺铂、卡铂、奥沙利铂、沙铂、和聚铂(polyplatillen)。
167.根据权利要求165所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含蛋白激酶抑制剂。
168.根据权利要求165所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包含其他药剂。
169.根据权利要求149-168任一项所述的方法，其进一步包含向所述个体施用有效量的放射疗法。
170.治疗癌症的方法，所述方法包含：
向患有癌症的个体施用有效量的Cbl-b抑制剂，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物，和
向所述个体施用有效量的放射疗法。
171.根据权利要求169或170所述的方法，其中所述放射疗法是外射束放射疗法。
172.根据权利要求169或170所述的方法，其中所述放射疗法是内照射疗法。
173.根据权利要求149-172任一项所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂通过肠内给药进行施用，任选地其中所述肠内给药是口服给药。
174.根据权利要求149-172任一项所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂通过肠胃外给药进行施用，任选地其中所述肠胃外给药是瘤内注射，或所述肠胃外给药是通过选自由静脉内、腹腔内及皮下组成的组的途径。
175.根据权利要求149-174任一项所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述血液学癌症是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。
177.根据权利要求149-174任一项所述的方法，其中所述癌症是非血液学癌症。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述非血液学癌症是癌(carcinoma)、肉瘤、或黑素瘤。
179.生成经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，所述方法包含：
(a)获得包含TIL的生物样品，所述TIL来自根据权利要求149-178任一项所述的方法进行治疗的所述个体，和
(b)在包含至少一种T细胞生长因子的细胞培养基中培养所述TIL，以生成经扩增的TIL群体。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述至少一种T细胞生长因子包含IL-2。
181.根据权利要求179或180所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含抗CD3抗体、或抗CD3抗体与抗CD28抗体两者。
182.根据权利要求179-181任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含所述Cbl-b抑制剂。
183.根据权利要求179-182任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含经辐照的饲养细胞(feeder cells)。
184.根据权利要求149-183任一项所述的方法，其中所述个体是人患者。
185.组合物，其包含通过权利要求179-184任一项所述的方法生成的所述经扩增的TIL群体、以及生理学上可接受的缓冲液。
186.治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的所述个体施用有效量的权利要求185所述的组合物。
187.根据权利要求186所述的方法，其进一步包含继续向所述个体施用有效量的所述Cbl-b抑制剂。
188.生成经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，所述方法包含：
(a)获得包含TIL的生物样品，所述TIL来自已经接受或正接受有效量的Cbl-b抑制剂的患有癌症的个体，其中所述Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物；和
(b)在包含至少一种T细胞生长因子的细胞培养基中培养所述TIL，以生成经扩增的TIL群体。
189.根据权利要求188所述的方法，其中所述至少一种T细胞生长因子包含IL-2。
190.根据权利要求188或189所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含抗CD3抗体、或抗CD3抗体与抗CD28抗体两者。
191.根据权利要求188-190任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含所述Cbl-b抑制剂。
192.根据权利要求188-191任一项所述的方法，其中所述癌症是非血液学癌症，任选地其中所述非血液学癌症是肉瘤、癌(carcinoma)、或黑素瘤。
193.根据权利要求188-192任一项所述的方法，其中所述个体是人患者。
194.组合物，其包含通过权利要求188-193任一项所述的方法生成的所述经扩增的TIL群体、以及生理学上可接受的缓冲液。
195.治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的所述个体施用有效量的权利要求194所述的组合物。
196.根据权利要求195所述的方法，其进一步包含继续施用有效量的所述Cbl-b抑制剂。
197.免疫的方法，所述方法包含：
向有需要的个体施用有效量的小分子Cbl-b抑制剂，和
向所述个体施用有效量的疫苗。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述免疫是治疗癌症的方法，其包含：
向患有癌症的个体施用有效量的小分子Cbl-b抑制剂，和
向所述个体施用有效量的治疗性癌症疫苗。
199.根据权利要求198所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗相继施用。
200.根据权利要求198所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂和所述癌症疫苗同时施用。
201.根据权利要求198-200任一项所述的方法，其中所述癌症疫苗是包含至少一种肿瘤抗原以及药学上可接受的辅料的免疫原性组合物。
202.根据权利要求201所述的方法，其中所述至少一种肿瘤抗原包含至少一种合成肽或重组蛋白。
203.根据权利要求201或202所述的方法，其中所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。
204.根据权利要求203所述的方法，其中所述佐剂包含选自由以下组成的组的一种或多种成分：铝盐类、角鲨烯和皂苷类。
205.根据权利要求201或202所述的方法，其中所述免疫原性组合物进一步包含抗原呈递细胞(APC)，任选地其中所述APC是树突状细胞，任选地其中所述癌症疫苗是普列威(PROVENGE)。
206.根据权利要求198-201任一项所述的方法，其中所述癌症疫苗包含微生物载体，任选地其中所述微生物载体是TICE-BCG。
207.根据权利要求206所述的方法，其中所述微生物载体是重组病毒载体或重组细菌载体。
208.根据权利要求198-201任一项所述的方法，其中所述癌症疫苗包含杀死的癌细胞或癌细胞裂解物。
209.治疗癌症的方法，所述方法包含：
向患有癌症的个体施用有效量的小分子Cbl-b抑制剂，和
向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。
210.根据权利要求209所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒相继施用。
211.根据权利要求209所述的方法，其中所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒同时施用。
212.根据权利要求209-211任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是选自由以下组成的组的病毒：腺病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echovirus)、禽痘病毒(fowlpox virus)、单纯疱疹病毒、马拉巴病毒(maraba virus)、麻疹病毒、粘液瘤病毒、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)、塞姆利基森林病毒(Semiliki Forest virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、和水泡性口炎病毒。
213.根据权利要求209-212任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是重组病毒，所述重组病毒包含至少一种病毒基因的功能性缺失和至少一种转基因的插入中的一者或两者。
214.根据权利要求213所述的方法，其中所述重组病毒包含至少一种病毒基因的功能性缺失和至少一种转基因的插入。
215.根据权利要求213或214所述的方法，其中所述转基因编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
216.根据权利要求209-213任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是转基因血清5型腺病毒。
217.根据权利要求209-215任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是转基因单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，任选地其中所述转基因HSV-1是talimogene laherparepvec。
218.根据权利要求209-215任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是转基因痘苗病毒，任选地其中所述转基因痘苗病毒是pexastimogene devacirepvec。
219.根据权利要求209-213任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是非重组溶瘤病毒，任选地其中所述非重组溶瘤病毒是选自由以下组成的组的病毒：埃可病毒(echovirus)、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、细小病毒、呼肠孤病毒、和塞内加谷病毒(SenecaValley virus)。
220.根据权利要求198-219任一项所述的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
221.根据权利要求220所述的方法，其中所述血液学癌症是淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。
222.根据权利要求220所述的方法，其中所述癌症是非血液学癌症。
223.根据权利要求222所述的方法，其中所述非血液学癌症是癌(carcinoma)、肉瘤、或黑素瘤。
224.根据权利要求197-223任一项所述的方法，其中所述小分子Cbl-b抑制剂是权利要求1-34中任一项所述的化合物。
225.根据权利要求197-224任一项所述的方法，其中所述小分子Cbl-b抑制剂是选自表1中化合物的化合物，或其互变异构体、其立体异构体、或其药学上可接受的盐。
226.治疗癌症的方法，所述方法包含：
向患有癌症的个体施用有效量的能够降低免疫细胞活化阈值的药剂，和
向所述个体施用有效量的治疗性癌症疫苗；或向所述个体施用有效量的溶瘤病毒。
227.根据权利要求226所述的方法，其中所述药剂还能够降低免疫细胞的共刺激需求。
228.根据权利要求226或227所述的方法，其中所述药剂还能够促进肿瘤免疫监视。
229.根据权利要求226-228任一项所述的方法，其中所述药剂是小分子Cbl-b抑制剂。
230.药物组合物，其包含癌症疫苗和小分子Cbl-b抑制剂，任选地其中所述组合物进一步包含药学上可接受的辅料。
231.治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)小分子Cbl-b抑制剂；
(b)治疗性癌症疫苗；
(c)施用有效量的所述Cbl-b抑制剂和所述治疗性癌症疫苗以治疗个体癌症的说明书。
232.治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)药物组合物，其包含小分子Cbl-b抑制剂和治疗性癌症疫苗；和
(b)施用有效量的包含所述Cbl-b抑制剂和所述治疗性癌症疫苗的所述药物组合物以治疗个体癌症的说明书。
233.根据权利要求226-232任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述癌症疫苗是包含至少一种肿瘤抗原以及药学上可接受的辅料的免疫原性组合物。
234.根据权利要求233所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述至少一种肿瘤抗原包含至少一种合成肽或重组蛋白。
235.根据权利要求233或234所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。
236.根据权利要求235所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述佐剂包含选自由以下组成的组的一种或多种成分：铝盐类、角鲨烯和皂苷类。
237.根据权利要求233或234所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述免疫原性组合物进一步包含抗原呈递细胞(APC)，任选地其中所述APC是树突状细胞，任选地其中所述癌症疫苗是普列威(PROVENGE)。
238.根据权利要求233所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述癌症疫苗包含微生物载体，任选地其中所述微生物载体是TICE-BCG。
239.根据权利要求238所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述微生物载体是重组病毒载体或重组细菌载体。
240.根据权利要求226-233任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述癌症疫苗包含杀死的癌细胞或癌细胞裂解物。
241.药物组合物，其包含溶瘤病毒和小分子Cbl-b抑制剂，任选地其中所述组合物进一步包含药学上可接受的辅料。
242.治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)小分子Cbl-b抑制剂；
(b)溶瘤病毒；
(c)施用有效量的所述Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒以治疗个体癌症的说明书。
243.治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)药物组合物，其包含小分子Cbl-b抑制剂和溶瘤病毒；和
(b)施用有效量的包含所述小分子Cbl-b抑制剂和所述溶瘤病毒的所述药物组合物以治疗个体癌症的说明书。
244.根据权利要求226-229或241-243任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述溶瘤病毒是选自由以下组成的组的病毒：腺病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echovirus)、禽痘病毒(fowlpox virus)、单纯疱疹病毒、马拉巴病毒(maraba virus)、麻疹病毒、粘液瘤病毒、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)、塞姆利基森林病毒(Semiliki Forest virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、和水泡性口炎病毒。
245.根据权利要求226-229或241-243任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述溶瘤病毒是重组病毒，所述重组病毒包含至少一种病毒基因的功能性缺失和至少一种转基因的插入中的一者或两者。
246.根据权利要求245所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述重组病毒包含至少一种病毒基因的功能性缺失和至少一种转基因的插入。
247.根据权利要求245或246所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述转基因编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
248.根据权利要求226-229或241-245任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述溶瘤病毒是转基因血清5型腺病毒。
249.根据权利要求226-229或241-247任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述溶瘤病毒是转基因单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，任选地其中所述转基因HSV-1是talimogenelaherparepvec。
250.根据权利要求226-229或241-247任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述溶瘤病毒是转基因痘苗病毒，任选地其中所述转基因痘苗病毒是pexastimogenedevacirepvec。
251.根据权利要求226-229或241-247任一项所述的方法、组合物、或试剂盒，其中所述溶瘤病毒是非重组溶瘤病毒，任选地其中所述非重组溶瘤病毒是选自由以下组成的组的病毒：埃可病毒(echovirus)、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、细小病毒、呼肠孤病毒、和塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)。
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