JP2001519143A - 可溶性の一本鎖ｔ細胞レセプタータンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は十分に可溶性で且つ機能的な一本鎖Ｔ細胞レセプタータンパク質を特徴としている。１つの局面では、本発明は、一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有的に結合した免疫グロブリンＬ鎖定常部領域又はそのフラグメントを含んでいる可溶性融合タンパク質を特徴としており、そしてその際上記一本鎖Ｔ細胞レセプターはペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖と共有的に結合したＶ−α鎖を含んでいる。 【効果】 上記一本鎖Ｔ細胞レセプタータンパク質は、所望のＭＨＣ−ペプチド複合体を発現している細胞を検出するためにスクリーニングで使用することを含む多様な用途を有している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 １．発明の分野 本発明は可溶性の一本鎖Ｔ細胞レセプタータンパク質、並びにこのようなタン
パク質の製造方法及び使用方法に関する。これらのタンパク質は、所望のペプチ
ド−ＭＨＣ複合体を発現する細胞を検出するためのインビトロスクリーニングを
含む多様な適用に有用である。

【０００２】 ２．背景 Ｔ細胞の応答はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と結合する抗原によって調節され
る。ＴＣＲの１つのタイプは、免疫グロブリン可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域に
類似しているα及びβ鎖からなる膜結合ヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖は共有
的に結合したＶ−α及びＣ−α鎖を含んでおり、一方β鎖はＣ−β鎖と共有的に
結合したＶ−β鎖を含んでいる。上記のＶ−α及びＶ−β鎖は主要組織適合遺伝
子複合体（ＭＨＣ）（ヒトではＨＬＡ複合体として知られている）が関連するス
ーパー抗原又は抗原と結合し得るポケット又はクレフトを形成する。一般的には
、デービス（Ｄａｖｉｓ）のＡｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ ：５３７（１９８５年）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第
３版、ダブリュ．ポール（Ｗ．Ｐａｕｌ）編集、アールセン・プレス・エルティ
ディ．（Ｒｉｓｅｎ Ｐｒｅｓｓ ＬＴＤ．）、ニューヨーク（１９９３年）参
照。

【０００３】 ＴＣＲは免疫系の発達や機能において重要な役割を果たすと考えられている。
例えば、ＴＣＲは細胞殺害に介在し、Ｂ細胞増殖を高め、そして癌、アレルギー
、ウイルス感染及び自己免疫疾患を含む種々の疾患の進行や重篤度に影響を与え
ることが報告されている。従って、商業的、研究及び医療環境で使用するために
ＴＣＲの取得方法を開発することが非常に重要である。

【０００４】 一般的に言えば、ＴＣＲはかなりの量で単離することが困難であった。例えば
、１つの主要な障害は、ＴＣＲトランスメンブラン領域を有していない可溶性Ｔ
ＣＲを産生させることであった。更に詳細には、ＴＣＲα及びβ鎖がγ、δ、ε
及びζ鎖を含んでいるＣＤ３複合体中に組み込まれていない場合、このようなタ
ンパク質は典型的には分解されると報告されている。例えば、シン（Ｓｈｉｎ）
他（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１９０１参照。

【０００５】 トランスメンブラン領域を有していない可溶性ＴＣＲを産生させる試みはしば
しば細菌で行われてきた。しかしながら、細菌ＴＣＲ発現によって典型的には、
不溶性で且つ不適切に折り畳まれた分子を実証している封入体が形成される。多
くの場合において、これらの方法によって、困難なタンパク質の可溶化及びリフ
オールディング段階の後にＴＣＲを得ることができる。これらの段階は実質的に
ＴＣＲの収量を減少させ、そしてＴＣＲの安定性や機能性に好ましくない影響を
与える。

【０００６】 可溶性ＴＣＲを得る更なる試みでは、より一層可溶性のＴＣＲ分子の設計に焦
点が当てられている。例えば、ＴＣＲは種々のタンパク質及びポリペプチド配列
、例えばホスファチジルイノシトール結合配列及びＣＤ３鎖と融合させられてい
る。しばしば、この目的はタンパク質の折り畳みを助長するために特異的な細胞
隔室内にＴＣＲを発現させることであった。可溶性ＴＣＲを取得する試みにおい
て、細胞表面に発現されたＴＣＲ融合タンパク質を、慣用の方法で開裂される。
しかしながら、十分に可溶性で且つ機能的なＴＣＲは通常少量しか産生されない
。例えば、マツイ，ケイ．（Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．）他（１９９１年）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２５４、１７８８；エンゲル，アイ．（Ｅｎｇｅｌ，Ｉ．）他（１９９２年
）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１３１８；リン，エイ．ワイ．（Ｌｉｎ，Ａ．Ｙ．）
他（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９、６７７参照。

【０００７】 可溶性ＴＣＲを産生させる他の試みは、免疫グロブリン定常部領域と共有的に
結合したＴＣＲ Ｖ鎖を含むヘテロ二量体ＴＣＲ分子の合成を含んでいる。例え
ば、グレゴール，シー．（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，Ｃ．）他（１９９１年）ＰＮＡＳ
、８８、８０７７は、カッパ軽（Ｌ）鎖のＣ領域（Ｃκ）と結合したＣα，Ｖα
配列を含んでいるヘテロ二量体αβＴＣＲ鎖の分泌を報告している。この参照文
献はまたＶβＣβＣκ配列も開示していた。ウェバー，エス．（Ｗｅｂｅｒ，Ｓ
．）他（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ、３５６：７９３も参照。

【０００８】 ヘテロ二量体ＴＣＲの合成は或る場合には可溶性発現を高めることが報告され
ているが、これらの方法はかなりの欠点を有している。例えば、合成にはしばし
ば、特異化された細胞内へのＤＮＡのコ・トランスフェクションが必要であり、
そして多数のタンパク質鎖を正しく組み立てなければならない。これらの方法で
はしばしば、機能的なヘテロ二量体αβＴＣＲの収量が実質的に減少する。

【０００９】 意義深いことに、Ｃκ鎖はＴＣＲヘテロ二量体発現に悪い影響を与えることが
報告されている。例えば、或る場合には、Ｃκ鎖を置換するとＴＣＲヘテロ二量
体の結合価が改善され得ることが示唆されている。さらに、Ｃκ領域を含んでい
るキメラＶβ鎖は、プロセシングし、分泌しそして／又は折り畳むことが特に困
難であると開示されている。グレゴール他、上述；マリウッザ，アール．エイ．
（Ｍａｒｉｕｚｚａ，Ｒ．Ａ．）及びウインター，ジー．（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．
）、（１９８９年）２６４：７３１０；ガスコーニ，エヌ．アール．ジェイ．（
Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｎ．Ｒ．Ｊ．）他、ＰＮＡＳ（米国）（１９８７年）、８ ４ ：２９３６参照。

【００１０】 十分に可溶性で且つ機能的なＴＣＲを産生する更に他の試みには、ＴＣＲ Ｖ
領域を含んでいる一本鎖タンパク質（即ち、ｓｃ−ＴＣＲ）の構築が含まれてい
る。一般的に述ベると、ｓｃ−ＴＣＲは融合Ｖ−α及びＶ−β鎖を含んでいる。
ノボトニィ，ジェイ．（Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｊ．）他、ＰＮＡＳ（米国）８８、８
６４６（１９９１年）；スウ・フウ，ダブリュ．エフ．（Ｓｏｏ Ｈｏｏ Ｗ．
Ｆ．）他、ＰＮＡＳ（米国）８９、４７５９（１９９２年）；ヴィルフィング，
シー．（Ｗｕｌｆｉｎｇ，Ｃ．）及びプリュックツン，エイ．（Ｐｌｕｃｋｔｈ
ｕｎ Ａ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２、６５５（１９９４年）；クルッ
チ，アイ．（Ｋｕｒｕｃｚ，Ｉ．）他、ＰＮＡＳ（米国）９０、３８３０（１９
９３年）；ＰＣＴ ＷＯ ９６／１３５９３；ワード，イー．エス．（Ｗａｒｄ
，Ｅ．Ｓ．）他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４、８８５（１９９２年）；及び
シュルーター，シー．ジェイ．（Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．）他、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２５６、８５９（１９９６年）参照。

【００１１】 しかしながら、ｓｃ−ＴＣＲを産生するこれまでの方法ではしばしば、不溶性
で且つ不適切に折り畳まれた分子が得られた。例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ ９
６／１８１０５はｓｃ−ＴＣＲの発現方法を開示しており、そしてこれらの方法
には一般的に、不都合なタンパク質リフォールディング及び可溶化段階が必要で
ある。これらの方法では典型的には、許容できないほど少量のｓｃ−ＴＣＲが産
生される。ワード，イー．エス．他、上述及びシュルーター，シー．ジェイ．、
上述も参照。

【００１２】 ｓｃ−ＴＣＲの収量を改善する試みで、幾つかの戦略が開発されてきた。これ
らの戦略には細胞表面に対してタンパク質発現を標的化すること及び可溶化担体
タンパク質を使用することが含まれている。例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ ９６
／１８１０５及びＷＯ ９６／１３５９３参照。しかしながら、これらの方法で
産生されるｓｃ−ＴＣＲにはしばしば、それ程多くない量のタンパク質を得るた
めでさえ、時間のかかる操作が必要である。

【００１３】 免疫系分子のインビトロ及びインビボでの相互作用を研究することは非常に重
要である。それ故、かなりの量で容易に産生できる可溶性で且つ十分に機能的な
ＴＣＲ分子に対する大きな需要が存在する。例えば、ＴＣＲ Ｖ領域は、ＴＣＲ
機能を潜在的に調節し得る小さな分子（例えば、ＴＣＲアンタゴニスト又はアゴ
ニスト）に対する魅力的な標的を提供することが提案されている。かくして、可
溶性で且つ十分に機能的なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をかなりの量で産生する
好都合な方法を持つことが望ましいであろう。

【００１４】 発明の要約 本発明は可溶性の一本鎖Ｔ細胞レセプタータンパク質、例えば、免疫グロブリ
ン軽鎖定常部領域と共有的に結合した一本鎖Ｔ細胞レセプターを含んでいる融合
タンパク質に関する。一本鎖Ｔ細胞レセプターに対する免疫グロブリン軽鎖定常
部領域の融合は可溶性発現を予期されなかったほど促進することが見いだされた
。一本鎖Ｔ細胞レセプタータンパク質は、困難な可溶化、開裂又はリフォールデ
ィング段階を行うことなく、かなりの量で単離することができる。

【００１５】 本発明の一本鎖Ｔ細胞レセプター（即ち、ｓｃ−ＴＣＲ）タンパク質は十分に
機能的且つ可溶性である。１つの局面では、これらｓｃ−ＴＣＲタンパク質は免
疫グロブリン軽鎖定常部領域（即ち、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ）又は適当なＩｇ−Ｃ_Ｌフラグ
メントと融合し共有的に結合したＴＣＲ Ｖα及びＶβ鎖を含んでいる。もう１
つの局面では、上記ｓｃ−ＴＣＲはＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はフラグメントと融合しない
で提供される。本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は本明細書ではときには「
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質」、「可溶性融合タンパク質」又は同様な語句とし
て呼称されている。これら可溶性ｓｃ−ＴＣＲタンパク質の発現によって宿主細
胞内での不溶性体の形成が減少し、そしてそれによって精製の容易さが高められ
るだけでなく、タンパク質の安定性や収量が顕著に高められる。

【００１６】 これらｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は一般的に、一本鎖Ｖ鎖と共有的に結合し
たＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はその適当なフラグメントを含んでいる。上記Ｖ鎖は、Ｖ−α
鎖が一般的にペプチドリンカー配列を介してＶ−β鎖と融合しているＶα，β配
列を含んでいる。この融合産生物は更に、Ｖ−α又はＶ−β鎖を介してＩｇ−Ｃ
_Ｌ鎖又は適当なＩｇ−Ｃ_Ｌフラグメントと共有的に結合している。このＩｇ−Ｃ
_Ｌ鎖又はそのフラグメントは、例えば、本明細書で提供されているようなペプチ
ドリンカー配列によって、一本鎖Ｖ配列から間隔を置いて配置することができる
。

【００１７】 一般的に、上記Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖は既知の配列のκ又はλタイプの免疫グロブリン
Ｌ鎖定常部領域である。κタイプの免疫グロブリンＬ鎖定常部領域は本明細書で
はしばしば「Ｃκ鎖」として参照され、一方λタイプの免疫グロブリンＬ鎖定常
部領域はしばしば「Ｃλ鎖」と呼称される。例えば、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖は、以下で開
示されているようなＣκ鎖又はその適当なフラグメントであることができる。本
発明は十分に可溶性で且つ機能的な融合タンパク質並びにかなりの量のｓｃ−Ｔ
ＣＲ融合タンパク質又はこのようなタンパク質から誘導されるｓｃ−ＴＣＲを取
得する方法を提供する。

【００１８】 或る場合には、ｓｃ−ＴＣＲ分子はＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はそのフラグメントと融合
していなくても十分に機能的で且つ可溶性である。特に、本発明者は予期に反し
て、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はそのフラグメントと融合していない多数のｓｃ−ＴＣＲ分
子を発現させ得ることを見いだした。かくして、本発明は融合Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又は
フラグメントを有していないｓｃ−ＴＣＲ分子及びこれらｓｃ−ＴＣＲ分子の製
造方法を提供する。

【００１９】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は多数の顕著な利点を提供する。例えば、先
行技術の実務では一般的に、かなりの量のタンパク質が得られるまでにＴＣＲ−
関連タンパク質（例えば、ＴＣＲレセプター、ＴＣＲヘテロ二量体、ｓｃ−ＴＣ
Ｒ）を広範に操作しなければならなかった。対照的に、本発明のｓｃ−ＴＣＲタ
ンパク質はかなりの量で得ることができる。例えば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク
質はこれらｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の可溶性、収量及び機能性に好ましい影
響を与える融合Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又は適当なＩｇ−Ｃ_Ｌフラグメントを含んでいる。
かくして、ＴＣＲ及びｓｃ−ＴＣＲと例えば小分子（例えば、合成ペプチド、医
薬品等）及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用の分析は、本発明で提供され
る可溶性の融合タンパク質を使用することによって促進されよう。さらに、以下
で更に十分に記載するように、スーパー抗原又はＡＰＣと相互作用させるために
多種多様なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を提供することができる。

【００２０】 さらに、ｓｃ−ＴＣＲにＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又は適当なＩｇ−Ｃ_Ｌフラグメントを融
合することによって、以下で開示するような慣用の免疫学的方法で融合タンパク
質を検出しそして精製する好都合な手段が提供される。

【００２１】 なお一層の利点は、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードしている下記開示のＤＮ
Ａ構築物によって提供される。例えば、提供されるＤＮＡ構築物のなかには、カ
セットフォーマット中でｓｃ−ＴＣＲをコードしているＤＮＡセグメントを含ん
でいるものがあり、そしてこれは所望のｓｃ−ＴＣＲをコードしている別のセグ
メントと取り替えることができる。このＤＮＡ構築物は、多数のＴＣＲ Ｖαβ
配列と十分に適合性の融合Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はＩｇ−Ｃ_Ｌフラグメントをコードし
ていることができ、そして宿主細胞内で発現してかなりの量のタンパク質を提供
することができる。かくして、本発明は、研究、医療又は商業的な用途のために
十分に可溶性で且つ機能的なｓｃ−ＴＣＲタンパク質をかなりの量で産生する方
法を提供する。

【００２２】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質はインビトロ及びインビボで多数の用途を有
している。

【００２３】 例えば、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質をインビトロで使用して、ＴＣＲリ
ガンドのペプチドやＭＨＣ／ＨＬＡ分子成分のようなリガンドを検出しそして分
析することができる。これらｓｃ−ＴＣＲタンパク質はまた、病原性特性を有す
るＴ細胞の検出のような診断目的のために、提供されたようにして使用すること
もできる。これらｓｃ−ＴＣＲはさらに、機能、細胞及び分子アッセイで、そし
てＸ線結晶学、核磁気共鳴画像処理、コンピューターグラフィックディスプレィ
のようなコンピューター使用技術を含む構造分析で使用することができる。特に
重要なものは、小分子の同定に容易に適合させることができ、ＴＣＲとＭＨＣ複
合体間の相互作用を調節する既知の技術である。関係技術を使用して、ＴＣＲと
ＴＣＲ特異的抗体間の相互作用を潜在的に遮断する小分子をスクリーニングする
ことができる。インビトロでＴＣＲアンタゴニストを検出するように設計された
スクリーニングが特に意図されている。

【００２４】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質はまたインビボで重要な用途を有している。
例えば、本発明のタンパク質を使用して、免疫関連疾患又は疾病に関与している
ような病原性Ｔ細胞と競合させるか；又は哺乳動物、例えばヒトをＴＣＲ構造体
、例えばＴ細胞表面に生起しそして病原性機能若しくは他の有害な機能を行うか
又はこのような機能を他の分子に行わせる細胞外領域に対して免疫化することが
できる。特に、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を使用して、以下に記載するよ
うな既知の免疫学的方法に従って抗体を生じさせることができる。これらの方法
で産生した抗体は、例えば、所望の抗原を認識する特異的なＴ細胞を阻害するか
又はそれらの数を減少させることによってインビボで免疫応答を調節するように
設計された治療戦略で使用することができる。特に、病因論に関係のある制限さ
れたＴ細胞サブセット若しくは集団を標的化しそして消失させるか又は数を実質
的に減少させ得るように、ＴＣＲエピトープと特異的に結合するモノクローナル
抗体を選択することができる。以下で更に十分に記載するように、本発明のｓｃ
−ＴＣＲタンパク質又はこれらと結合する抗体は非修飾であることができるか又
は所望の場合、所望の分子、例えば医薬品、トキシン、酵素又は放射性物質と、
ときには結合したペプチドリンカー配列を介して、共有的に結合させることがで
きる。

【００２５】 さらに、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を使用して、所望のペプチド−ＭＨ
Ｃ複合体をインビトロで発現するＡＰＣをスクリーニングすることができる。更
に詳細には、所望のペプチド−ＭＨＣ複合体を含んでいる選択されたＡＰＣを取
得しそして拡張することは幾つかの状況で有用であった。

【００２６】 さらに、本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を使
用して、１９９７年３月７日に出願された係属中の米国特許出願番号０８／８１
３，７８１（この出願の開示は参照して本明細書に組み入れる）に記載されてい
る方法に従ってバクテリオファージディスプレィライブラリーを作成することが
できる。

【００２７】 さらに尚、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を使用してインビトロでペプチド
ライブラリーをスクリーニングし、ペプチド結合配列、例えば潜在的なスーパー
抗原を検出することができる。

【００２８】 本発明はまた、問題のｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードしている配列を含んで
いる核酸セグメント（ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）にも関係
している。例えば、本発明の核酸セグメントは、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又は適当なＩｇ−
Ｃ_Ｌフラグメントと共有的に結合している所望のｓｃ−ＴＣＲをコードしている
ことができる。ｓｃ−ＴＣＲをコードしている核酸は、公に利用可能なＴＣＲ及
びＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む多様な
供給源から得ることができる。本発明の核酸セグメントは、適当な真核又は原核
細胞発現系でｓｃ−ＴＣＲタンパク質を発現し得るＤＮＡベクターとして提供す
ることができる。上記セグメントは、所望の細胞発現系で本発明の可溶性ｓｃ−
ＴＣＲタンパク質の発現を行わせるためにプロモーター、リーダー、転写開始配
列及び最適のエンハンサー配列のような作用可能的に結合された転写エレメント
を含んでいることができる。或いは、上記ＤＮＡベクター自体が上記制御エレメ
ントのうちの幾つか又は全てを提供することができる。

【００２９】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードしている核酸セグメントはしばしば
、天然生起のＴＣＲ制御エレメントを除去するように構築される。しかしながら
、或る場合には、当該分野で知られているような免疫グロブリンプロモーター及
び／又はエンハンサーを有するｓｃ−ＴＣＲタンパク質を発現させることが望ま
しいと思われる。本発明の核酸セグメントによってコードされているＩｇ−Ｃ_Ｌ 鎖又は適当なＩｇ−Ｃ_Ｌフラグメントは、可溶性融合タンパク質がＲＮＡスプラ
イシングを行い得る細胞タイプ、典型的には哺乳動物細胞内で発現される場合に
はしばしば、イントロン及びエキソン配列を含んでいる。本発明のｓｃ−ＴＣＲ
融合タンパク質を原核細胞内で発現させることが望ましい場合には、イントロン
を除去しそしてサイズを実質的に小さくして発現を最大にすることができる。以
下で更に十分に記載するように、発現されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質が以下
に記載するアッセイで測定するとき十分に可溶性で且つ機能的であるという条件
で、多様なＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はその適当なフラグメントを所望のｓｃ−ＴＣＲ分子
と融合させることができる。

【００３０】 詳細には、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はそのフラグメント及びこれらを含んでいるベクタ
ーを有さないでｓｃ−ＴＣＲ分子をコードしている核酸セグメントが提供される
。

【００３１】 本明細書で開示した可溶性ｓｃ−ＴＣＲタンパク質を単離する方法が更に提供
される。これらの方法は一般的に、所望の核酸セグメント又はこのようなセグメ
ントを含んでいるベクターを、融合タンパク質を発現し得る細胞内に導入するこ
とを含んでいる。上記セグメント又はベクターを含んでいる宿主細胞は、細胞増
殖を支持し得る培地中で培養される。上記宿主細胞は、可溶性融合タンパク質を
可溶性形態で発現し得る真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞であることができる
。しかしながら、或る場合には、上記可溶性融合タンパク質を細菌内で発現させ
ることが望ましいと思われる。以下で更に詳細に説明するように、可溶性ｓｃ−
ＴＣＲタンパク質を発現する細菌細胞はスロー誘導条件下で培養することができ
る。スロー誘導条件は一般的に、必須栄養素を数時間に亘って培地から欠失させ
、そしてそれによってかなりの量のｓｃ−ＴＣＲタンパク質の可溶性発現を誘導
する細胞増殖条件を言う。それ故、このような場合には上記スロー誘導条件下で
の発現を最大にするように細菌発現ベクターを設計することが望ましい。真核又
は原核細胞内で発現された可溶性ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、所望の場合、精製
して実質的に純粋なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を製造することができる。

【００３２】 本発明は特に、融合Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はフラグメントを有していないｓｃ−ＴＣ
Ｒの単離方法を提供する。これらの方法は一般的に、上記ｓｃ−ＴＣＲをコード
しているＤＮＡセグメント又はこのようなセグメントを含んでいるベクターを哺
乳動物細胞中に導入し、適当な培地中で上記ｓｃ−ＴＣＲの発現を可能にする条
件下で上記哺乳動物細胞を培養し、そして上記哺乳動物細胞又は上記培地からｓ
ｃ−ＴＣＲを精製して上記ｓｃ−ＴＣＲレセプターを単離することを含んでいる
。

【００３３】 本発明はまた、本発明の可溶性ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードしている配列
を含んでいるベクター又は核酸セグメントを単離する方法も含んでいる。一般的
に、本発明の方法はベクター又は核酸セグメントを宿主細胞、好ましくは哺乳動
物細胞中に導入し、これらの細胞を培養し、そして融合タンパク質を宿主細胞か
ら精製して実質的に純粋な融合タンパク質を得ることを含んでいる。上記ベクタ
ー又は核酸セグメントはその後標準的な方法によって実質的に純粋な形態で単離
される。典型的には、上記ベクター又はセグメントはＤＮＡであろう。

【００３４】 或る場合には、本発明の可溶性ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は１個又はそれより多
くの（典型的には１個又は２個の）融合エフェクター又はタグを含んでいる。例
えば、或る場合には、上記タグを使用して、典型的には融合タンパク質を伴って
いるｓｃ−ＴＣＲタンパク質を天然生起細胞成分から精製するのを助長すること
ができる。他の場合には、上記タンパク質タグを使用して予め定められた化学的
又はタンパク質分解性開裂部位を上記可溶性タンパク質中に導入することができ
る。特に、所望の場合、ｓｃ−ＴＣＲ分子をＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はフラグメントから
開裂（即ち、分離）できるように、タグをコードしているセグメントをＤＮＡベ
クター中に、例えば可溶性融合タンパク質をコードしている配列とＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖
又はその適当なフラグメント間に導入することが意図されている。

【００３５】 細胞トキシン又は診断若しくは画像処理試験に適する検出可能的に標識された
原子若しくは化合物であるエフェクターを含んでいる可溶性ｓｃ−ＴＣＲ融合タ
ンパク質及び融合Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はフラグメントを有していないｓｃ−ＴＣＲ分
子が特に提供される。本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質及びｓｃ−ＴＣＲ分
子は、インビボでの細胞又は組織の検出及び／又は画像処理、並びにインビトロ
又はインビボでの細胞の損傷又は殺害を含む多様な適用で使用することができる
。一般的に、標的化細胞又は組織はｓｃ−ＴＣＲと選択的に結合し得る１つ又は
それより多くのリガンドを含んでいる。代表的な細胞には腫瘍細胞、例えばメラ
ノーマ細胞及びウイルス感染細胞（例えば、それぞれサイトメガロウイルス又は
エイズウイルスのような霊長類ＤＮＡ又はＲＮＡで感染した細胞）が含まれる。

【００３６】 哺乳動物のような動物における望ましくない免疫応答は、本発明に従って、代
替的戦略の１つ又は組合せによって減少させるか又は消失させることができる。
一般的に、本発明は、製薬的に許容可能な製剤中に有効量のｓｃ−ＴＣＲタンパ
ク質を提供することによって哺乳動物の免疫応答を減少させるか又は消失させる
治療方法を提供する。或いは、本発明の可溶性融合タンパク質のｓｃ−ＴＣＲ部
分を上記処置方法で使用することができる。一般的に、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパ
ク質又はｓｃ−ＴＣＲは、リガンド（例えば、抗原）に関して、１つ又はそれよ
り多くのＴＣＲ、特に病原性Ｔ細胞と会合したＴＣＲと競合し得るものであろう
。

【００３７】 本発明はまた、本発明で提供されるｓｃ−ＴＣＲタンパク質の特異的な結合親
和性を高める方法も提供する。例えば、係属中の米国特許出願番号０８／８１３
，７８１は、抗原に対して対応するＴＣＲ（即ち、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質
のＶαβ鎖を天然に含んでいるＴＣＲ）より約２〜１０倍大きい特異的結合親和
性を示すｓｃ−ＴＣＲ「ムテイン」の製造方法を開示している。これらの方法は
一般的に、１つ又はそれより多くの予め定められたアミノ酸突然変異を分子中に
導入して特異的結合を改善するように、ｓｃ−ＴＣＲ分子の標準的なオリゴヌク
レオチド指令プライマー突然変異誘発を使用することに係わっている。開示され
たｓｃ−ＴＣＲムテインは、例えば、望ましくない免疫応答に関与するＴ細胞の
抑制又は消失においてインビトロ及びインビボで特に有用である。上記の係属中
の米国特許出願に開示されている方法は、所望に応じて、本発明のｓｃ−ＴＣＲ
融合タンパク質及びｓｃ−ＴＣＲ分子の特異的な結合を改善するように容易に適
合させることができる。

【００３８】 さらに、本発明はＴＣＲと特異的に結合する抗体（ポリクローナル、モノクロ
ーナル又はキメラ）の製造方法を特徴としている。これらの方法は一般的に、免
疫原として実質的に精製されたｓｃ−ＴＣＲタンパク質の試料を使用することを
含んでいる。或る場合には、例えば、免疫学的に反応性のＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はフラ
グメントに対する免疫学的拒絶を最小限にするために、免疫原としてｓｃ−ＴＣ
Ｒ分子を使用することが好ましいであろう。代表的な抗体は慣用のハイブリドー
マ操作によって得られるモノクローナル抗体である。これらの抗体はまた、ｓｃ
−ＴＣＲの１つ又はそれより多くのエピトープを含んでいる免疫原性ペプチドか
ら産生させることもできる。このような抗体は、血液、血清又は組織標本のよう
な生物学的試料中の病原性Ｔ細胞の検出を含む多様な適用に有用である。上記で
言及したように、これらの抗体を使用して、特に標的化Ｔ細胞と抗原又はＭＨＣ
／ＨＬＡペプチド複合体間の相互作用を低下させることによってインビボ又はイ
ンビトロで標的化Ｔ細胞の活性を枯渇又は阻害することができる。或る状況では
、当該分野で周知の方法によって適当な細胞毒性的、抗代謝的又は検出可能な標
識を上記抗体に共有的に結合させることが有用であろう。

【００３９】 本発明はさらに、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質から調製されたｓｃ−ＴＣＲを
含んでいる有効量のｓｃ−ＴＣＲタンパク質又はｓｃ−ＴＣＲ分子を哺乳動物、
特にヒトのような霊長類に投与することによって、これら哺乳動物において免疫
応答を誘導する方法に関係している。本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を使
用して免疫応答を誘導する場合には、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ鎖又はフラグメントハプロタイ
プが使用中の宿主と適合性であることが好ましい。これらの免疫原を使用すると
、Ｔ細胞（即ち、標的化Ｔ細胞）表面に生起しそして病原性応答又は他の望まし
くない免疫応答に関与しているＴＣＲ抗原性構造体に対して哺乳動物を免疫化す
ることができる。このようなＴ細胞は慣用の方法で同定することができ、そして
所望の場合精製しそして増殖する能力についてアッセイすることができる。Ｔ細
胞を同定し、精製し、そしてアッセイする方法は以下に記載する。

【００４０】 所望の増殖応答を示すＴ細胞は、核酸を単離しそしてｓｃ−ＴＣＲ融合タンパ
ク質を産生させるために使用できる培養細胞系として確立することができる。問
題の標的ＴＣＲ抗原性構造は典型的にはクロノタイプエピトープ、Ｖ−α又はＶ
−βファミリー特異的エピトープ、配座エピトープ及び線状エピトープを含んで
いよう。上記ＴＣＲ抗原性構造体に対する免疫化は一般的にＴ細胞活性を阻害し
、そしてそれによってＴ細胞の病原性又は望ましくない効果を減少させるか又は
消失させる。哺乳動物は典型的には、標的化Ｔ細胞を宿主免疫系によって枯渇さ
せるか又は消失させるように、本発明のｓｃ−ＴＣＲ又はｓｃ−ＴＣＲ融合タン
パク質を免疫学的に有効な量（即ち、かなりの抗体力価をもたらし得る）でそし
て製薬的に許容可能な混合物中で投与することによって免疫化される。

【００４１】 ＴＣＲと特異的に結合し得る小分子を検出するためのアッセイが更に意図され
ている。一般的に、上記アッセイはインビトロスクリーニングであり、そしてそ
の際には本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は固形支持体（例えば、微量滴定プレ
ート）と結合されそしてｓｃ−ＴＣＲと問題の小分子間の特異的結合に有利な条
件下で当該小分子と共にインキュベートされる。例えば、問題のｓｃ−ＴＣＲ又
はｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を周知の選別タイプのスクリーニングで使用して
、ＴＣＲ Ｖ領域と特異的に結合する小分子を検出しそして単離することができ
る。或る場合には、Ｉｇ−Ｃ_Ｌ又は適当なＩｇ−Ｃ_Ｌフラグメントを上記固形支
持体に結合させ、そしてそれによって支持体とｓｃ−ＴＣＲ Ｖ領域間の干渉が
最小限になるように、ｓｃ−ＴＣＲ融合分子を使用することが好ましいであろう
。

【００４２】 スーパー抗原又はペプチド−ＭＨＣ複合体とＴＣＲ間の特異的結合を阻害し得
る小分子を検出するスクリーニングが特に意図されている。一般的に述べると、
上記スクリーニングは、本発明の可溶性融合タンパク質が特異的な結合複合体を
形成できる条件下で、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を小分子及びスーパー抗
原又はペプチド−ＭＨＣ複合体と共にインキュベートするインビトロアッセイに
係わっている。別個の対照反応において、本発明の可溶性融合タンパク質を、同
一のインキュベーション条件下で上記スーパー抗原又はペプチド−ＭＨＣ複合体
と共にインキュベートする。次に、スーパー抗原又はペプチド−ＭＨＣ複合体と
ｓｃ−ＴＣＲ間の特異的結合を阻害し得るリガンドを慣用のタンパク質結合アッ
セイ技術に従って選択する。

【００４３】 コンビナトリータイプの化学で産生したリガンドを検出するスクリーニングも
意図されている。例えば、１つのアッセイでは、問題のｓｃ−ＴＣＲ分子を固形
支持体と結合させ、そして既知の第１のリガンド、例えばスーパー抗原と混合し
、そして第２のリガンドシリーズを標準的なコンビナトリー化学で産生させる。
代表的な第２のリガンドシリーズは、典型的には１つの予め決定されたアミノ酸
が異なっているペプチドのプールである。次いで、上記第１のリガンドと上記ｓ
ｃ−ＴＣＲタンパク質間の特異的結合に有利な条件下でインキュベーション条件
を実施する。ｓｃ−ＴＣＲタンパク質と上記第１のリガンド間の相互作用を有効
に遮断する第２のリガンドシリーズ中のペプチドは、標準的な方法に従って検出
しそして単離することができる。このようなスクリーニングで検出されるリガン
ドは、治療用組成物中での使用並びにインビトロ及びインビボでのＡＰＣの検出
を含む多様な用途を有している。

【００４４】 本明細書で参照した文書は全て、これらを全体として本明細書に組み入れる。
以下の実施例は本発明を説明するものであって制限するものではない。

【００４５】 上述でまとめられるように、本発明者らは、十分に可溶性のおよび機能的なｓ
ｃ−ＴＣＲタンパク質を作製および使用することが可能であることを見出した。
例えば、Ｉｇ−ＣＬ鎖または適切なＩｇ−ＣＬフラグメントを共有結合的に連結
することによって、ｓｃ−ＴＣＲ分子の可溶性の発現を促進することが可能であ
る。一般に言及されるように、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、単鎖ペプチドリンカ
ー配列によって、Ｖ−β鎖に共有結合的に連結されるＶ−α鎖を含む。ｓｃ−Ｔ
ＣＲ融合タンパク質は、Ｖ−αまたはＶ−β鎖に融合される、Ｉｇ−ＣＬ鎖また
は適切な鎖フラグメントを含む。Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントの融合は、多
様な細胞において、十分に機能的なｓｃ−ＴＣＲの可溶性の発現を増強する。

【００４６】 一般に、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質の調製は、本明細書中で開示される
手順によって、および認識される組換えＤＮＡ技術によって、達成され得る。例
えば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素でのＤＮＡ切断、ＤＮＡのライゲーシ
ョン、細胞へのＤＮＡの挿入、細胞の培養、ならびに発現されるタンパク質の単
離および精製は、公知の技術である。概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版
、１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｈｏｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。ｓｃ−ＴＣＲ分子の一般
的な構造、ならびにこれを作製および使用する方法は、係属中の米国特許出願第
０８／８１３，７８１号において開示されている。

【００４７】 簡潔に述ベると、ｓｃ−ＴＣＲ分子は、適切なペプチドリンカー配列を介して
、共有結合的に連結されるＶ−α鎖およびＶ−β鎖を含む。例えば、Ｖ−α鎖は
、Ｖ−α鎖のＣ末端およびＶ−β鎖のＮ末端に融合される適切なペプチドリンカ
ー配列を介して、Ｖ−β鎖に共有結合的に連結され得る。ｓｃ−ＴＣＲのＶ−α
鎖およびＶ−β鎖は、一般的に、約２００〜４００アミノ酸長、好ましくは約３
００〜３５０アミノ酸長であり、ならびに天然に存在するＴＣＲのＶ−α鎖およ
びＶ−β鎖に、少なくとも９０％の同一性、および好ましくは１００％の同一性
である。用語「同一性」によって、Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖のアミノ酸が、対応
の天然に存在するＴＣＲ Ｖ−β鎖またはＶ−α鎖に１００％相同であることが
意味される。

【００４８】 ｓｃ−ＴＣＲ分子のＶ−α鎖はさらに、Ｖ−β鎖のＣ末端に融合される、Ｃ−
β鎖またはそのフラグメントを含み得る。さらに、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末
端およびペプチドリンカー配列のＮ末端に融合される、Ｃ−α鎖またはそのフラ
グメントを含み得る。一般に、Ｃ−β鎖フラグメントを含むこれらの融合タンパ
ク質において、フラグメントは、約５０〜１２６アミノ酸の長さを有し、および
通常、１２７位の最後のシステイン残基を含まない。Ｃ−α鎖を含むこれらの融
合タンパク質について、長さは、約１〜９０アミノ酸の間で変化し得る（すなわ
ち、Ｃ−α鎖は、最後のシステインまでであるが、最後のシステインは含まない
）。例えば、１つの実施態様において、融合タンパク質は、アミノ酸１〜７２か
ら開始して、約１〜７２アミノ酸の間のＣ−α鎖フラグメントを含む。別の実施
態様において、Ｃ−α鎖フラグメントは、最初のアミノ酸〜２２（ロイシン）か
ら開始して、約１〜２２アミノ酸の間である。Ｃ−α鎖フラグメントは、典型的
には、２個のシステイン残基を含むＣ_α９０改変体を除いて、任意のシステイン
残基を含まない。十分に可溶性のおよび機能的なタンパク質の発現を促進するた
めに、Ｉｇ−ＣＬまたは適切なＩｇ−ＣＬフラグメントが、ｓｃ−ＴＣＲ分子に
、例えば、Ｖ−β鎖またはＣ−βフラグメントのＣ末端に、共有結合的に連結さ
れる。典型的に好ましくないが、Ｉｇ−ＣＬまたはそのフラグメントを、Ｖ−α
鎖のＮ末端に共有結合的に連結することが可能である。大部分の場合において、
ＣαおよびＣβの鎖長の選択は、特定のＶ鎖、可溶性の融合分子の選択されるお
よび意図される使用を含むいくつかのパラメータによって、導かれる。

【００４９】 本発明のさらなるｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、例えば、２つのポリペプチドリ
ンカー配列を含み、ここでは、第１のペプチドリンカー配列は、Ｖ−α鎖のＣ末
端とＶ−β鎖のＮ末端との間で融合される。Ｖ−β鎖のＣ末端は、Ｃ−β鎖フラ
グメントのＮ末端に融合され得る。次いで、第２のペプチドリンカーは、Ｖ−β
鎖またはＣ−β鎖フラグメントのＣ末端に、および例えば、Ｉｇ−ＣＬ鎖もしく
はそのフラグメントまたはエフェクターもしくはタグ分子のＮ末端に、連結され
る。

【００５０】 他の説明的な実施態様において、ｓｃ−ＴＣＲは、Ｖ−β鎖またはそのＣ−β
鎖フラグメントのＣ末端、およびＶ−α鎖のＮ末端が、共有結合的に連結される
適切なペプチドリンカーを介して、Ｖ−α鎖にＶ−β鎖を連結することによって
、作製され得る。Ｉｇ−ＣＬ鎖またはそのフラグメントは、所望されるように、
分子のＣ末端またはＮ末端に共有結合的に連結され得るが、一般的にＣ末端での
連結が好ましい。

【００５１】 本発明に従うｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、１つ以上の融合されるタンパク質タ
グを含み得る。例えば、可溶性の融合タンパク質に関して、タンパク質タグは、
ｓｃ−ＴＣＲ Ｖ−β鎖（またはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端、およびＩｇ
−ＣＬ鎖またはそのフラグメントのＮ末端に融合され得る。従って、ｓｃ−ＴＣ
Ｒ融合タンパク質は、例えば、２つのタンパタ質タグを含み、ここでは第１のタ
ンパク質タグは、Ｖ−β鎖（またはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端、およびＩ
ｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントのＮ末端に融合され、ならびに第２のタンパク質
タグ（同じかたまたは異なる）は、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントのＣ末端に
融合され得る。あるいは、単一のタンパク質タグが、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグ
メントのＣ末端に融合され得る。

【００５２】 Ｖ−α鎖のＮ末端に融合される１つ以上のタンパク質タグを含む融合物のよう
な、他のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質が、意図される。

【００５３】 ｓｃ−ＴＣＲタンパク質のペプチドリンカー配列は、典型的に、ｓｃ−ＴＣＲ
分子が、天然に存在するＴＣＲＶ−α鎖およびＶ−β鎖の結合部位を模倣する結
合部位を形成するように、選択される。Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖は、誘導されて
いないＴ細胞に由来し得るが、大部分の場合において、Ｖ鎖は、病理学（例えば
、免疫関連性の異常または疾患）と関連されるものである。

【００５４】 より詳細には、Ｖα、β鎖を分けるペプチドリンカー配列は、所望の抗原のよ
うなリガンドを特異的に結合し得るポケット中に、Ｖ鎖を可変的に配置する。例
えば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質に結合するリガンドは、以下に記載されるア
ッセイによって決定されるように、Ｔ細胞活性を調整するために使用され得る。
このようなアッセイの例としては、ＴＣＲを発現するＴ細胞を培養する工程、Ｔ
ＣＲとリガンドとの間の結合を許容する条件下で、Ｔ細胞とｓｃ−ＴＣＲタンパ
ク質（またはそこから得られるｓｃ−ＴＣＲ）とを接触する工程、次いで、可溶
性の融合タンパク質が、Ｔ細胞の活性を調整し得るか否かを評価する工程の連続
的な工程を包含するインビトロアッセイが挙げられる。ｓｃ−ＴＣＲ分子へのＩ
ｇ−ＣＬ鎖またはＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントの融合は、例えば、ｓｃ−ＴＣＲの
可溶性の発現を促進し、そして水溶液（例えば、細胞培地）中でｓｃ−ＴＣＲ完
全性を維持することによって、ある設定におけるアッセイ性能を増加し得る。

【００５５】 上述で考察されるように、本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、例えば、
ｓｃ−ＴＣＲ分子のＣ末端に、共有結合的に連結されるＩｇ−ＣＬ鎖または適切
なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントを含む。１つの実施態様において、ｓｃ−ＴＣＲ融
合タンパク質は、融合される哺乳動物Ｉｇ−ＣＬ鎖、好ましくは、完全長のマウ
スまたはヒトのＩｇ−ＣＬ鎖（例えば、Ｃκ鎖）を含む。いくつかのＩｇ−ＣＬ
鎖の核酸およびタンパク質配列は、開示されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎ
ｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９９３）第３版、Ｅｄｉ．Ｗ．Ｐａｕｌ編
Ｒｓｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ
．ら（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌ
ｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈ
ｅａｌｔｈを参照のこと。

【００５６】 用語Ｉｇ−ＣＬ鎖はまた、１つ以上のアミノ酸の置換または付加により、開示
されるる完全長の配列から変化する免疫グロビン軽鎖定常部領域を含むことが意
味される。例えば、アミノ酸は、例えば、従来の組換え法によって、鎖の一方ま
たは両方の末端で、開示されるＩｇ−ＣＬ鎖配列に付加され得る。さらに、組換
え法は、所望される場合、鎖における所与のアミノ酸を置換するために使用され
得る。一般に、アミノ酸付加は、約１〜３０個の間の中性または親水性のアミノ
酸、好ましくは約１〜１０個の間のこのようなアミノ酸を含む。Ｉｇ−ＣＬ鎖に
おいて、別のアミノ酸を置換するアミノ酸は、保存的または非保存的なアミノ酸
置換である。従って、フェニルアラニンで置換されるＩｇ−ＣＬ鎖配列における
チロシンアミノ酸は、保存的なアミノ酸置換の例であり、一方、アラニンで置換
されるアルギニンは、非保存的なアミノ酸置換を示す。Ｉｇ−ＣＬ鎖フラグメン
トについて以下に指摘されるように、融合されたＩｇ−ＣＬ鎖を含むｓｃ−ＴＣ
Ｒ融合タンパク質は、十分に可溶性であり、および機能的である。

【００５７】 さらに、以下に具体的に開示される好ましいＩｇ−ＣＬ鎖配列へのアミノ酸置
換または付加は、本発明の範囲内である。

【００５８】 いくつかの例において、マウスまたはヒトのＣκ鎖フラグメントのような、Ｉ
ｇ−ＣＬ鎖フラグメントを使用することが有用である。例えば、融合タンパク質
の分子量を最小にすることが所望される場合、適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメント
がｓｃ−ＴＣＲ分子に融合され得る。句「適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメント」ま
たは関連の用語によって、所望のｓｃ−ＴＣＲ分子形態に融合される場合、以下
に規定されるように、十分に可溶性のおよび機能的なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク
質を形成するＩｇ−ＣＬフラグメントが意味される。所望のＩｇ−ＣＬ鎖フラグ
メント（ＣκおよびＣλ型の両方）は、標準的な組換え方法に従って、例えば、
マウスまたはヒトのＣκまたはＣλ鎖フラグメントＰＣＲ増幅、続いて、所望の
ｓｃ−ＴＣＲ分子をコードするＤＮＡセグメントまたはベクターへのＰＣＲ産物
のライゲーションによって、作製され得る。以下に記載されるように、ＰＣＲ産
物は、クローニングを容易にするために制限酵素切断部位を含むように操作され
得る。一般に、適切なマウスまたはヒトのＣκ鎖フラグメントは、約７０〜１５
０アミノ酸長の間、好ましくは約９０〜１２０アミノ酸長の間、およびより好ま
しくは、１００〜１１０アミノ酸長の間である。適切なマウスまたはヒトのＣκ
鎖のＤＮＡ配列の例は、以下に開示される。以下の実施例５、６、および７を参
照のこと。

【００５９】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、十分に機能的であり、および可溶性であ
る。用語「十分に機能的な」または類似の用語によって、融合タンパク質が、リ
ガンドに特異的に結合することが意味される。このような特異的な結合を検出す
るためのアッセイは、本明細書中に開示され、およびウェスタンブロッティング
のような標準的なイムノブロット技術を含む。

【００６０】 用語「十分に可溶性の」または類似の用語によって、融合タンパク質が、低い
Ｇ力の遠心分離下で、水性緩衝液（例えば、細胞培地）から容易に沈降されない
ことが意味される。さらに、アニオン性または低濃度の非イオン性の洗浄剤の存
在下または不在下で、約５〜３７℃を超える温度で、および中性のｐＨで、また
は中性のｐＨ近くで、融合タンパク質が水溶液中に残存する場合、ｓｃ−ＴＣＲ
融合タンパク質は可溶性である。これらの条件下、可溶性のタンパク質は、しば
しば、低い沈降価（例えば、約１０〜５０未満のスヴェードベリ単位）を有する
。典型的に、本明細書中で言及される水溶液は、典型的に約５〜９のｐＨ範囲内
に、ｐＨを、および約２ｍＭと５００ｍＭとの間に、イオン強度範囲を、確立す
るための、緩衝化化合物を有する。時折、プロテアーゼインヒビターまたは軽度
の非イオン性洗浄剤が添加され、そしてキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ））が、所望であれば、数ｍｇ／ｍｌに添加され得る。例示
的な水性緩衝液としては、標準的なリン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理
食塩水、または他の公知の緩衝液および細胞培地処方物が挙げられる。

【００６１】 上記のように、多くのｓｃ−ＴＣＲ分子が、融合されたＩｇ−ＣＬ鎖またはそ
のフラグメントを伴わないで哺乳動物細胞中で発現される場合、十分に機能的で
ありおよび可溶性であることが見出された。例えば、以下の図９Ｂにおいて図示
されるｐＮＡＧ３−ｍおよびｐ１４９−ｍベクターは、以下に詳述される哺乳動
物細胞において発現される場合、十分に機能的であり、および可溶性であるｓｃ
−ＴＣＲ分子をコードする。ｐＮＡＧ３−ｍによってコードされるｓｃ−ＴＣＲ
分子は、配列中で共有結合的に連結される：Ｖα鎖、Ｃα鎖、ペプチドリンカー
配列、Ｖβ鎖、およびＣβ鎖を含む。さらに、Ｃα鎖において、Ｃα鎖の全長ま
でのアミノ酸欠失を含むｓｃ−ＴＣＲ分子が、開示される。以下の図９Ａおよび
９Ｂ、ならびに図５において図示されるｐＫＣ６０ベクターを参照のこと。さら
に、係属中の米国特許出願第０８／８１３，７８１号は、配列中で共有結合的に
連結される：Ｖα鎖、Ｃα鎖フラグメント、ペプチドリンカー配列、およびＶβ
鎖を含むｓｃ−ＴＣＲ分子を作製する方法を開示する。従って、改変された（ま
たは欠失された）ＣαおよびＣβ鎖を含む多様なｓｃ−ＴＣＲ分子を、Ｉｇ−Ｃ
Ｌ鎖または適切なフラグメントを分子に融合することを伴わずに、作製すること
が可能である。ｓｃ−ＴＣＲ分子は、詳述される哺乳物細胞における可溶性の発
現について本明細書中で記載される方法に従って、試験され得る。

【００６２】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、通常、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ま
たはゲノムＤＮＡであり得る核酸セグメントによって、コードされる。典型的に
、核酸セグメントは、ＤＮＡセグメントであり得る。例えば、本発明に従うＤＮ
Ａセグメントは、典型的に、適切な細胞プロセシングシグナルを提供するための
、作動可能に連結されるリーダー配列を含む。一般に、リーダー配列は、ｓｃ−
ＴＣＲ分子をコードするＤＮＡ配列の５’末端に融合される。例えば、リーダー
配列は、Ｖ−α鎖、または、いくつかの実施態様において、Ｖ−β鎖をコードす
るＤＮＡ配列の５’末端に共有結合的に連結され得る。しかし、特異的なリーダ
配列が、特定のα鎖またはβ鎖に連結されるが、リーダー配列は、しばしば、融
合タンパク質のプロセシングに対する有害な影響を伴うことなく、組換え技術を
使用して交換され得る。従って、１つの実施態様において、Ｖ−α鎖の５’末端
は、適切なリーダー配列の３’末端に共有結合的に連結され得る。リーダー配列
は、しばしば、約１２〜２６アミノ酸残基長の間である。細菌発現ベクターへの
挿入について設計されるＤＮＡセグメントは、Ｐｅｌ Ｂ配列を含み得、一方、
哺乳動物細胞における発現について設計されるベクターへの挿入について、これ
らのＤＮＡセグメントは、Ｉｇ−ＣＬリーダー（例えば、哺乳動物Ｃκリーダー
配列）を含む。例示的なＣκリーダーは、以下に提供される。

【００６３】 用語「作動可能に連結される」によって、核酸セグメント、または所与のセグ
メントもしくは配列の上流（５’）または下流（３’）の配列に作動可能に（す
なわち、機能的に）連結される遺伝子配列が意味される。これらの近くの配列は
、しばしば、所望の細胞型における核酸セグメントまたは配列のプロセシングお
よび／または発現を、ポジティブに影響する。

【００６４】 本発明に従うＤＮＡベクターは、細菌発現のために使用され、およびプロモー
ター（例えば、ｔｒｐオペロンプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌ
ａｃプロモーター、ｌａｃｕｖｓ、またはＰｈｏＡプロモーター）を含み得る。
例示的なプロモーターは、約数時間（例えば、２〜１０時間）続く低誘導条件の
間に、強力な、調節性の発現を提供するｐｈｏＡのようなプロモーターである。
適切な培養条件下で、大部分の強力なプロモータは、全宿主細胞タンパク質の約
１０％までのおよび約１０％を上回るレベルで、可溶性の融合タンパク質を提供
し得る。

【００６５】 可溶性融合タンパク質の単鎖Ｖ領域は、大部分の任意のＴＣＲ Ｖ領域に由来
し得る。一般的に、適切なＶα、β鎖は、免疫学的な誘導後に遺伝子発現が増加
するＶα、β鎖である。ＴＣＲ Ｖ鎖発現の増加をアッセイするための方法は、
公知である（例えば、Ｈａｆｌｅｒ、Ｄ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７
：１３１３（１９８８）；Ｍａｎｔｇａｚｚａ，Ｒ．ら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ ３、４３１（１９９０）を参照のこと）。

【００６６】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、実質的に完全長のコード配列が容易に入手可
能である、Ｖα、β鎖を含み得る。細胞供給源から、完全長のＴＣＲ Ｖ鎖配列
を得るための方法は、周知である。あるいは、Ｖα、β鎖領域は、配列の少なく
とも一部分が公知である、公的に入手可能なＶα、β鎖をＰＣＲ増幅することに
よって得ることができる。例示的なＶβ遺伝子配列としては、Ｖβ８．１、Ｖβ
６．１、Ｖβ５．１、Ｖβ５．２、Ｖβ５．３、Ｖβ２．１、およびＶβ２．３
遺伝子配列が挙げられる。Ａｂｅら（１９９２）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：４０
６６；Ｗａｎｇら（１９９３）；ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：１８８；Ｌａｈｅｓ
ｍａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１２５；Ｋｏｔｚｉｎら（
１９９１）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：９１６１；Ｕｅｍａｔｓｕら（１９９１）
ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８５３４を参照のこと。また、さらなるＴＣＲ Ｖ鎖
配列について、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、前出およびＣｈｏｔｉａ，Ｃ．ら（１
９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：３７４５を参照のこと。

【００６７】 さらに、以下の実施例３は、多様なＶ−α鎖およびＶ−β鎖を増幅するＰＣＲ
についての、オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。また、適切なオリゴヌ
クレオチドプライマーのさらなる例について、以下の図７および８を参照のこと
。

【００６８】 生物学的な供給源からＴＣＲ Ｖ鎖を得ることが所望される場合、所望のＴＣ
Ｒは、ＴＣＲ Ｖ領域のエピトープを優先的に結合し、および好ましくは、ＴＣ
ＲＶ領域のエピトープに特異的であるＴＣＲ特異的抗体の使用を含む、従来の免
疫学的方法によって同定され得る。典型的に、表面発現は、蛍光顕微鏡、フロー
サイトメトリー、または免疫化学のような公知の技術を使用することによって検
出され得る。ＴＣＲ可変領域を特異的に結合する多くの抗体が、公知である。例
えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９０／０６７５８を参照のこと。

【００６９】 検出されるＴＣＲのＤＮＡまたはＲＮＡは、当該分野において周知のハイブリ
ダイゼーション方法を使用して、直接的に、または好ましくはＰＣＲ増幅後に、
種々のＴＣＲ遺伝子ファミリーについてのオリゴヌクレオチドプローブとの特異
的なハイブリダイゼーションによって、プローブされ得る。一般に、高いストリ
ンジェンシーの核酸ハイブリダイゼーション条件が行われる。本明細書中で使用
されるように、用語「高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション」は、
０．１×ＳＳＣ中、約６５℃の核酸インキュベーション条件を意味する。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。ＴＣＲ ＤＮＡ配列またはその所望の部分は
、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡから直接的に得られることができ、および所望
されるように適切なベクター中にサブクローン化され得る。

【００７０】 ＴＣＲ Ｖ領域ＤＮＡを得るための他の方法が、公知である。例えば、Ｖ領域
を含む所望のＴＣＲは、ＴＣＲ、または好ましくはＶ領域に対応するその部分を
配列決定することによって、同定され得る。ＤＮＡ配列は、例えば、当該分野に
おいて公知であるように適切な配列決定ベクターにＤＮＡをクローニングした後
に、またはＴＣＲの少なくとも部分のタンパク質配列を先ず決定し、そしてＤＮ
Ａ配列を決定することによって、決定され得る。上記の操作および当業者に公知
の他の操作は、単鎖Ｖαβ構築物が、所望のＩｇ−ＣＬ鎖または適切なＩｇ−Ｃ
Ｌフラグメントへの融合のために作製され得るように、所望のＴＣＲを首尾良く
同定するために、およびＴＣＲからＶ領域遺伝子を得るために、用いられ得る。

【００７１】 より具体的には、生物学的な供給源からＴＣＲ Ｖ領域ＤＮＡを得ることが所
望される場合、所望のＶ−αおよびＶ−β鎖をコードするＤＮＡセグメントは、
Ｔ細胞ハイブリドーマまたは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のような細胞から得ら
れ得る。Ｔ細胞（例えば、ＴＳ、ＴＣ、またはＴＨ細胞）は、インビボで得られ
得るか、またはＴ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマ（例えば、Ｄ１０ま
たはＢ１２細胞株）であり得る。例えば、以下の実施例１を参照のこと。ＣＴＬ
は、非誘導性であり得るか、またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ
）もしくは霊長類（例えば、ヒトもしくはチンパンジー）における病原性の免疫
系応答と関連され得る。例えば、ＣＴＬまたは他のＴ細胞は、ライム病、川崎病
、ライ病、ガン（すなわち、ＣＥＡのような腫瘍関連性の抗原に対する免疫応答
）、または自己免疫異常、特に、移植片拒絶と関連する異常、多発性硬化症、イ
ンスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、およびアレルギー；または感染性の
疾患、特に、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを含む感染性の疾患を被るか、これら
を有する疑いのある患者に由来し得る。特に目的のウイルスとしては、ヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、
肝炎、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、アデノウイルス、または
ポリオーマウイルスが挙げられる。ＣＴＬの例示的な供給源は、確立されたガン
腫および骨髄腫を伴う患者から単離される抗原特異的ＣＴＬおよびＴＩＬである
（例えば、Ｃｏｘ Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６４：７１６；Ｒｏ
ｓｅｎｓｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．らＮ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８８）３１９：
１６７６；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１８
０：３４７）；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．らＰＮＡＳ（１９９４）９１：６４５８
）。

【００７２】 細胞供給源からＶ−α鎖およびＶ−β鎖を得ることに関して、以前に記載され
るように、いくつかの代替の手順が、それらから単離した核酸を調製するために
使用され得る。より詳細には、Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖のＤＮＡを調製するため
に、所望のＴＣＲ結合特異性を実証するこれらの細胞からｍＲＮＡが単離される
。このような方法は、一般に、ｍＲＮＡから作製される第１鎖ｃＤＮＡ鋳型を使
用する適切なＰＣＲプロトコルの使用を含む。次いで、標準的な組換え技術が、
所望のαおよびβ鎖を作製するために用いられ得る。次いで、所望のＶ−α鎖お
よびＶ−β鎖をコードするＤＮＡセグメントは、所望される場合、適切なペプチ
ドリンカー配列およびタンパク質タグを含むように改変される。

【００７３】 一般に、ＰＣＲ方法における使用のためのＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマ
ーは、約１２〜５０のヌクレオチド長、好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド
長の間である。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、必要とされるように、
例えば、ライゲーション部位を導入するために、特異的な制限酵素切断部位をＰ
ＣＲ産物に付加するように制限部位を適切に含み得る。例示的なプライマーは、
以下の実施例および図面において提供される。生成されるＰＣＲ産物は、増幅さ
れたＶ−α鎖配列およびＶ−β鎖配列を含み、ならびに所望されるように、融合
タンパク質の至適な発現のために、リボソーム結合、リーダー、およびプロモー
ター配列を含むように改変され得る。

【００７４】 所望のｓｃ−ＴＣＲ分子をコードするＤＮＡセグメントは、以下に開示される
方法に従って、有意な量（グラム細胞当たり、ミリグラムの量）で作製され得る
。

【００７５】 以下に提供される可溶性の融合タンパク質を作製するために使用される特定の
ｓｃ−ＴＣＲは、哺乳動物に由来する、Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖を有するｓｃ−
ＴＣＲを含む。例としては、霊長類（特にヒトおよびチンパンジー）；げっ歯類
（例えば、免疫学的にナイーブなマウス（例えば、ヌードマウス）またはＨＬＡ
−Ａ２抗原複合体を発現し得るトランスジーンを含むマウス（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ
，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、（１９９１）１７５、１００２）が挙げられ
る。目的の特定のヒトは、任意の先述の病理学（例えば、自己免疫異常）を被る
ヒトを含む。異なる哺乳動物由来のＶ−αＤＮＡ配列およびＶ−βＤＮＡ配列を
含むキメラ構築物は、公知の方法に従って調製され、そしてまた、本発明の範囲
内である。

【００７６】 上記のように、ペプチドリンカー配列は、リガンド結合ポケットを形成するた
めに、融合タンパク質のＶ−α鎖およびＶ−β鎖を効果的に配置する。従って、
可溶性の融合タンパク質は、リガンド（例えば、超抗原）、またはＭＨＣ／ＨＬ
Ａペプチド複合体の状況においてペプチド抗原、または小分子を特異的に結合し
得る。特に、Ｔ細胞の表面において、天然に存在するＴＣＲと競合し得る可溶性
のおよび十分に機能的なｓｃ−ＴＣＲ融合分子を提供することは、本発明の目的
である。用語「競合する」によって、可溶性の融合タンパク質が、同じリガンド
についてのＴＣＲの特異的な結合親和性に等しいレベル、またはいくつかの例に
おいてこれを上回るレベルで、リガンドを結合し得ることが意味される。例えば
、以下に記載される方法に従って、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質（またはそれら
に由来するｓｃ−ＴＣＲ分子）は、天然に存在するＴＣＲにほぼ等しいか、また
は約２〜１０倍高い結合親和性を示し得る。

【００７７】 典型的に、所望のＩｇ−ＣＬ鎖または適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントの融合
は、融合されるＩｇ−ＣＬ鎖またはそのフラグメントを欠損するｓｃ−ＴＣＲ分
子に比較される場合、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の特異的な結合を、３０％を
超えて、好ましくは、１０％を超えて、およびより好ましくは５％を超えて減少
しない。例示的な結合アッセイが、本明細書中に開示され、ならびに以下に開示
される標準的なウェスタンブロッティングアッセイおよび表面プラスモン共鳴ア
ッセイを含む。

【００７８】 本発明の説明的な実施態様において、ポリペプチドリンカー配列は、約７〜２
０アミノ酸、より好ましくは約１０〜２０アミノ酸、なおより好ましくは約１２
〜２０アミノ酸を含む。リンカー配列は、典型的に、所望されるリガンド（例え
ば、ペプチド抗原）の特異的な結合を提供する配座にＶ−α鎖およびＶ−β鎖を
配置するように、融合タンパク質中に可変的に配置される。リンカーは、至適な
可動性を提供するために、好ましくは、小さな側鎖を有するアミノ酸（例えば、
グリシン、アラニン、およびセリン）を優先的に含む。好ましくは、リンカー配
列の約８０または９０パーセント以上は、グリシン残基、アラニン残基、または
セリン残基、特にグリシン残基およびセリン残基を含む。好ましくは、リンカー
配列は、可動性を阻害し得る任意のプロリン残基を含まない。リンカー配列は、
融合タンパク質のＶ−α鎖のＣ末端およびＶ−β鎖のＮ末端に適切に付着される
。以下の実施例１および２を参照のこと。

【００７９】 より具体的には、適切なリンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）４配列（すなわち、
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）４を含み、ＪＡ３０２（配列番号９
６）およびＪＡ３０１（配列番号９５）である。好ましくは、選択されるリンカ
ー配列は、ｓｃ−ＴＣＲのＶ−α鎖のＣ末端残基とＶ−β鎖の第１アミノ酸との
間で、共有結合的に連結される。しかし、以前に記載されるように、他のペプチ
ドリンカー配列の配座が可能であり、そのうちのいくつかは、Ｉｇ−ＣＬ鎖また
は適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメント（例えば、Ｃκ鎖フラグメント）への融合を
含む。いくつかのポリペプチドリンカー配列が、抗体の可変領域を結合する際に
使用するのに適切であるとして、開示されている（Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、２：９７−１０５（１９９１）を参照のこと）。あるいは、他の
適切なリンカー配列が、経験的に容易に同定され得る。例えば、リンカー配列を
含有する融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含むＤＮＡベクターが
、クローン化され、および発現され、そして融合分子は、分子が抗原を結合し得
るか否かを決定するために試験され得る。例示的なアッセイは、Ｈａｒｌｏｗお
よびＬａｎｅ、前出において開示されるアッセイのような、従来の抗原結合アッ
セイである。あるいは、リンカー配列を含有する発現される融合タンパク質は、
本明細書中で言及されるアッセイによって決定されるように、Ｔ細胞の活性を調
整する能力について試験され得る。以下の実施例８、１０、および１１を参照の
こと。リンカー配列の適切な大きさおよび配列はまた、融合タンパク質の予測さ
れる大きさおよび形状に基づく、従来のコンピューターモデリング技術によって
、決定され得る。例示的なペプチドリンカー配列は、Ｖα鎖とＶβ鎖との間のポ
リペプチドリンカー配列の末端で、適切な制限部位（例えば、ＸｈｏＩおよびＳ
ｐｅＩ）を含む配列である。

【００８０】 大部分の場合において、目的のｓｃ−ＴＣＲ分子をコードするＤＮＡセグメン
トは、適切なＤＮＡベクターに組換え的に操作される。例えば、所望のＶ鎖がＰ
ＣＲ増幅される実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常プラ
イマーの両方の末端で所望の制限酵素部位を有するように形成され、それによっ
て、ＤＮＡセグメントが、別の所望のＤＮＡセグメントで置換えられ得る。従っ
て、本発明の適切なＤＮＡベクターは、所望のｓｃ−ＴＣＲ分子が、ベクターに
容易に挿入され得るベクターである。可溶性の融合分子が作製される場合のよう
に、時折、Ｉｇ−ＣＬ鎖または適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントは、ベクターに
よってコードされ、およびライゲーションによってＤＮＡセグメントに融合され
る。他の場合において、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントは、ベクターへのライ
ゲーションの前にＤＮＡセグメントに融合される。

【００８１】 本明細書中で使用される用語「ベクター」は、宿主細胞に組込まれ得、目的の
核酸セグメント（例えば、上記のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をコードするセグ
メントまたは配列）の発現を生じる、目的の任意の核酸配列を意味する。ベクタ
ーとしては、例えば、直鎖状核酸セグメントまたは配列、プラスミド、コスミド
、ファージミド、および染色体外ＤＮＡが挙げられ得る。具体的には、ベクター
は、組換えＤＮＡであり得る。また、本明細書中で使用されるように用語「発現
」または「遺伝子発現」は、目的の核酸配列のタンパク質産物の生成に言及する
ことが意味され、ＤＮＡの転写およびＲＮＡの翻訳を含む。典型的に、本発明の
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、ベクター、好ま
しくはＤＮＡベクターに挿入されて、適切な宿主細胞中でＤＮＡセグメントを複
製する。

【００８２】 多くのストラテジーが、所望の細胞中で本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を発
現するために用いられ得る。例えば、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列は、公知の手段によって（例えば、予め決定された部位でベクターを制限
する酵素を使用し、続いて、ＤＮＡをベクターにライゲーションすることによっ
て）、ＤＮＡベクターに取込まれ得る。次いで、ＤＮＡ配列を含むベクターは、
ｓｃ−ＴＣＲタンパク質の可溶性の発現のために、適切な宿主に導入される。適
切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関連する因子に経験的に基づ
き得る。例えば、ベクターは、用いられる宿主細胞に適合性であるべきあり、お
よび用いられる宿主細胞についての正確なレプリコンを有するべきである。さら
に、ベクターは、発現されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を適応できなく
てはならない。好ましいベクターは、哺乳動物細胞において可溶性のタンパク質
を発現し得るベクター（例えば、Ｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐＣＤＮ
Ａ３）である。また、哺乳動物細胞において使用するための他の適切なベクター
については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照の
こと。典型的に、細菌における発現のために設計され、および可溶性の融合タン
パク質をコードするＤＮＡベクターは、完全長のＣλイントロンもＣκイントロ
ンも含まないが、これらの配列は、ＲＮＡスプライシングを行い得る哺乳動物細
胞中での発現のために設計されるベクター中に含まれ得る。

【００８３】 好ましいＤＮＡベクターは、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞において、可溶
性のｓｃ−ＴＣＲを発現するように設計される。ＤＮＡベクターは、所望される
場合、細菌宿主中での複製のためにフォーマットされ、それによって、適切な量
のＤＮＡベクターが得られ得る。例えば、ＤＮＡベクターは、一般に（ｉ）Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて機能的な複製起点；（ｉｉ）選択可能な抗生物質耐性遺伝子；
（ｉｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような強力なウイル
スプロモーター、および必要に応じてＣＭＶエンハンサーエレメント、（ｉｖ）
Ｉｇ−ＣＬリーダー配列、（ｖ）目的のｓｃ−ＴＣＲ分子、（ｖｉ）Ｉｇ−ＣＬ
エクソンに連結される完全長のＩｇ−ＣＬイントロン、（Ｖｉｉ）成長ホルモン
ポリアデニル化配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）ポリＡ配列、および
（ｖｉｉｉ）抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン）に連結され、および
ウイルスポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０ポリＡ配列）に融合される選択
可能な真核生物マーカー（例えば、強力なウイルスプロモーター（例えば、シミ
アンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター）をコードするＤＮＡを含み得る。
あるいは、ＤＮＡベクターは、（ｖｉ）のＩｇ−ＣＬエクソンに連結される完全
長のＩｇ−ＣＬイントロンを伴わずに、上述の（ｉ）〜（ｖ）、および（Ｖｉｉ
）〜（Ｖｉｉｉ）の全てを含み得る。例示的なＩｇ−ＣＬリーダー配列は、マウ
スκリーダーである。完全長Ｉｇ−ＣＬイントロンおよびエクソンの例は、完全
長のＣκ遺伝子である。哺乳動物細胞発現についての適切なＤＮＡベクターの例
は、図１０において図示される（ｐＳＵＮ２７ベクター）。以下の実施例５を参
照のこと。

【００８４】 所望の哺乳動物細胞に使用するための、本発明のＤＮＡベクターは、他の哺乳
動物細胞において可溶性の発現を至適化するための従来の技術に従って改変され
得る。例えば、上記のネオマイシン耐性遺伝子をコードする真核生物マーカーは
、ＴＫ−（ＴＫ欠陥）哺乳動物細胞においてｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現
を促進するために、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードするＤＮＡによっ
て置換えられ得る。ＤＮＡベクターは、当該分野において周知の他の方法におい
て改変され得る（例えば、プロモーターおよび抗生物質耐性遺伝子を交換する、
所望の哺乳動物細胞におけるｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現を至適化するた
めに、ＣＭＶプロモーターを、免疫グロビン、ＳＶ４０、アデノウイルス、また
はパピローマウイルスプロモーターから得られたプロモーターで置換える）。あ
るいは、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、所望されるように
、酵母または昆虫細胞における発現に適切な周知のベクターに挿入され得る。例
えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、ならびにＳｕｍｍｅｒおよびＳｍｉｔｈ、前出
を参照のこと。

【００８５】 適切な宿主細胞は、レトロウイルス移入、ウイルスもしくはバクテリオファー
ジ感染、カルシウム−、リポソーム−、もしくはポリブレン−媒介性のトランス
フェクション、微粒子銃移入、または当該分野において公知の他のこのような技
術を含む多様な方法によって形質転換され得る。

【００８６】 以前に記載されるように、いくつかの場合において、非哺乳動物細胞中で可溶
性の融合タンパク質を発現することが所望され得る。例えば、細菌において融合
タンパク質を発現するために適切な宿主細胞としては、容易に形質転換され、そ
して培養培地中で迅速な増殖を示し得る細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細
胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓなどが挙げ
られる。他の宿主細胞としては、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）お
よび昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞発現についての例示的な細胞は、Ｓｆ９細
胞のような、バキュロウイルスによって感染され得る細胞である。Ｓｕｍｍｅｒ
およびＳｍｉｔｈ（１９９８） Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏ
ｒ Ｂａｃｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．
１５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘａｓもまた参照のこと。

【００８７】 一般に、例えば、ベクターへの適切な細胞選択マーカー（例えば、抗生物質耐
性遺伝子またはＧ４１８）の取込みによって、安定に形質転換またはトランスフ
ェクトされた細胞株が選択される細胞培養条件が、用いられる。ｓｃ−ＴＣＲ融
合タンパク質を発現する細胞は、公知の手順（例えば、Ｖ−α鎖またはＶ−β鎖
を特異的に結合する市販のモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイ）
によって決定され得る。あるいは、可溶性融合タンパク質のＣκもしくはＣλ（
またはフラグメント）を特異的に結合するモノクローナル抗体が選択され得る。
モノクローナル抗体および適切なアッセイの例は、以下の実施例において提供さ
れる。

【００８８】 細菌において、所望される可溶性の融合タンパク質を複製および発現するため
に設計されるベクターは、例えば、（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的であり、
例えば、ｐＢＲ３２２、好ましくは周知のｐＵＣ１９ベクターに由来する複製起
点；（ｉｉ）選択的な抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリンおよび／また
はネオマイシン耐性遺伝子）；（ｉｉｉ）転写終結領域（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｔｒｐオペロンの終結領域；（ｉｖ）転写プロモーター（例えば、ｐｈｏＡ、
ｔａｃ、ｔａｃ−ｌａｃ、ｌａｃＺ、ｌａｃｕｖｓ、Ｔ７、またはＴ３プロモー
ター）；（ｖ）リーダー配列（例えば、ｐｅｌＢまたはｏｍｐＡリーダー）；（
ｖｉ）所望のＩｇ−ＣＬ鎖または適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメント（例えば、完
全長のマウスまたはヒトＣκエクソン）に融合されるｓｃ−ＴＣＲをコードする
ＤＮＡセグメント；ならびに（ｖｉｉ）転写ターミネーター（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのリボソームＲＮＡ遺伝子座からのＴ１Ｔ２配列）を含む。あるいは、ベク
ターは、ｓｃ−ＴＣＲが、融合されるＩｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントを伴わず
に提供されることを除いて、上述の（ｉ）〜（ｖｉｉ）を含み得る。

【００８９】 細菌発現のために設計されるＤＮＡベクターへの、特定の核酸配列の包含は、
ゆっくりとした誘導条件下、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の可溶性の発現を補助
し得る。例えば、以下に記載されるｐｈｏＡプロモーターおよびｐｅｌＢリーダ
ー配列は、ゆっくりとした誘導条件下でｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を発現する
ために使用され得る。以下の実施例６を参照のこと。強力な転写開始配列はまた
、転写効率を増強するために、構築物中に含まれ得る。哺乳動物細胞発現につい
て、好ましい開始配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）（
配列番号９７）である。

【００９０】 ＤＮＡベクターのリーダー配列は、宿主細胞膜に、または宿主細胞培地に、融
合タンパク質の発現を適切に指向し、および、しばしば、制限部位を含み、これ
によって、例えば目的のＶ−α鎖をコードするＤＮＡが、構築物に簡便に連結さ
れ得る。適切には、制限部位は、リーダー配列の３’末端に組込まれ、例えば、
約２〜１０コドン長の接合配列として、時折、本明細書中で言及され、およびＶ
−α鎖に連結され、それによってＶ−α鎖のコード領域は、典型的に、Ｖ−αコ
ード領域の第１のアミノ酸である。例えば、１つの制限部位は、ＳｆｉＩ部位で
あるが、他の切断部位が、Ｖ−α鎖コード領域の前に取込まれ得、ベクター構築
物へのＶ−α鎖の簡便な挿入を増大する。上述で考察されるように、第２の制限
部位と組み合わせたこのような制限部位の使用は、典型的に、Ｖ−α鎖の開始部
位に配置され、広範に多様なＶ−α鎖、またはＶ−α鎖、Ｃ−α鎖をコードする
配列の迅速で簡便な挿入を可能にする。好ましいリーダー配列は、強力な翻訳開
始部位を含み、および時折、それらのｍＲＮＡの３’末端で、ｃａｐ部位を含み
得る。上記のように、例示的なリーダー配列としては、細菌発現について、ｐｅ
ｌＢおよびＯｍｐＡ、ならびに哺乳動物発現について、Ｃκマウスκ鎖リーダー
配列が挙げられる。

【００９１】 ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、多様な手段によって、細菌において発現され得る
。例えば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターは、長期間
（約２〜８時間）にわたって、宿主細胞をゆっくりと誘導することによって、細
菌において発現され得る。例えば、実施例６において以下に記載されるように、
ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されるｐｈｏＡプロ
モーター（強力）を含むＤＮＡベクターが、作製され得る。次いで、宿主細胞は
、ＤＮＡベクターで形質転換され、そして宿主細胞培地中のリン酸は、数時間（
一般的に、約２〜１０時間、より好ましくは、約４〜６時間）にわたって、培地
から枯渇させられ得る。

【００９２】 本明細書中で提供されるＤＮＡベクターによってコードされるｓｃ−ＴＣＲタ
ンパク質は、いくつかの従来の技術によって精製され得る。例えば、以前に記載
されるように、可溶性の融合タンパク質は、化学的切断部位またはプロテアーゼ
切断部位を含有するタグを含む１つ以上のタンパク質タグ（同じまたは異なる）
を含み得る。特に、タンパク質タグは、生理学的なｐＨで電荷を保有するポリペ
プチド（例えば、６×Ｈｉｓ）であり得る。この実施態様において、適切な合成
マトリクスが、融合タンパク質を精製するために使用され得る。より詳細には、
合成マトリクスは、市販のセファロースマトリクス（例えば、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）または約ｐＨ６〜９で６×Ｈｉｓタグを結合し得る他のこのような適
切なマトリクスであり得る。他の適切なタグは、市販のモノクローナル抗体によ
って特異的に結合されるＥＥまたはｍｙｃエピトープを含む。一般に、抗体（例
えば、モノクローナル抗体）によって特異的に結合され得る広範に多様なエピト
ープは、タンパク質タグのように作用し得る。他の適切な合成マトリクスとして
は、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を特異的に結合し得る、結合される抗体を
有するマトリクスである。例示的なタンパク質タグとしては、エンテロキナーゼ
、第Ｘａ因子、ヘビ毒、またはトロンビン切断部位を有するタグが挙げられる。
例えば、公開されたＰＣＴ出願 Ｗ０９６／１３５９３を参照のこと。

【００９３】 発現されるｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、イムノアフィニティークロマトグラフ
ィー、免疫吸着、免疫沈降などを含む公知の方法によって、単離および精製され
得る。重要なことに、調節手順は、通常、融合タンパク質の有意な収量を得るた
めの長期の単離工程を必要としない。以下により十分に記載されるタンパク質精
製法に従って、大部分のｓｃ−ＴＣＲタンパク質の収量は、約５０〜１００グラ
ムの宿主細胞ペースト当たり、２〜２０ミリグラムの範囲である。

【００９４】 一般に、本明細書中で開示されるｓｃ−ＴＣＲタンパク質を調製するために、
細胞抽出物または宿主細胞培養培地は遠心分離され、そして得られる上清は、ア
フィニティーもしくはイムノアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロ
テイン−Ａもしくはプロテイン−Ｇアフィニティークロマトグラフィー）、また
は発現されるｓｃ−ＴＣＲ融合分子を特異的に結合する抗体の使用を包含するプ
ロトコルによって、精製される。このような抗体の例としては、ｓｃ−ＴＣＲの
Ｖ−α鎖またはＶ−β鎖を特異的に結合し得る市販のモノクローナル抗体である
。このような抗体の例としては、Ｐｈａｒｍａｇｅｎから得ることができる、Ｈ
５７、ＭＲ５−２、およびＦ２３．１が挙げられる。あるいは、ｓｃ−ＴＣＲタ
ンパク質における免疫グロビン鎖を特異的に結合する市販の抗イディオタイプ抗
体が、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を精製するために使用され得る。このような
抗体の使用の例は、以下の実施例５において提供される。モノクローナル抗体を
使用するタンパク質のアフィニティー精製は、一般に知られ、および開示されて
いる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと。

【００９５】 上記のように、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、可溶性の、および十分に
機能的な形態において提供される。従って、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、培養培
地に安定に分泌され、そして目的のリガンド（例えば、ペプチド抗原または合成
小分子）を特異的に結合し得る。より詳細には、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、一
般に、洗浄剤などのようなカオトロピックな薬剤の実質的なまたは完全な不在下
、生理学的な条件下で安定である。従って、本発明の可溶性タンパク質は、一般
に、ＴＣＲ膜貫通領域において見出されるアミノ酸のような疎水性アミノ酸が豊
富な領域を含まない。しかし、いくつかの場合において、その適切な部分が含ま
れ得るが、但し、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、十分に可溶性を保持する。すなわ
ち、融合タンパク質の発現は、適切な宿主細胞において封入体の有意な量の形成
を導かない。封入体は、顕微鏡または従来の生化学的な技術（例えば、遠心分離
沈降）によって容易に検出可能である。

【００９６】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、上述で考察されるように、および以下の
実施例のように、調製され得る。一般に、所望のＶ−α鎖およびＶ−β鎖をコー
ドするＤＮＡは、Ｔ細胞、Ｔ細胞ハイブリドーマ株、または以前に記載されるよ
うに、公的に入手可能なＶ−α鎖およびＶ−β鎖配列のような適切な供給源から
得ることができる。ＤＮＡは、ＰＣＲ、クローニング、または他の適切な手段に
よって増幅され得る。例えば、所望のＶ−α鎖をコードするＤＮＡは、適切なベ
クターにクローン化され、続いて、所望のＶ−β鎖および適切な単鎖リンカー配
列をコードするＤＮＡがクローン化されて、所望のｓｃ−ＴＣＲを生成する。以
前に開示されるように、いくつかの場合において、ｓｃ−ＴＣＲは、Ｃ−αおよ
び／またはＣ−β鎖フラグメントをコードするＤＮＡを含む。可溶性のｓｃ−Ｔ
ＣＲ融合タンパク質について、ｓｃ−ＴＣＲ分子構築物はさらに、Ｉｇ−ＣＬ鎖
またはフラグメント（例えば、マウスまたはヒトのＣκ鎖または適切なＣκ鎖フ
ラグメント）に融合される。以前に記載されるように、Ｃκ鎖をコードするＤＮ
Ａは、ＰＣＲ増幅され、そしてｓｃ−ＴＣＲをコードするＤＮＡに連結され得る
。あるいは、Ｃκ鎖は、Ｎｅａｒら、下部によって開示されるＤＮＡベクターの
ようなＤＮＡベクターに含まれ得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメ
ントは、次いで、ＤＮＡベクターに導入される。次いで、ＤＮＡベクターは、宿
主細胞中で発現され、そして融合タンパク質は、採集され、所望される場合、精
製される。

【００９７】 本発明の説明的なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、一般に、配列中で共有結合
的に連結される：プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／単鎖リンカー配列／
Ｖ−β鎖／Ｃκ鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／単鎖リンカー配列
／Ｖ−β鎖、Ｃ−β鎖フラグメント／Ｃκ鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ
−α鎖、Ｃ−α鎖／単鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖／Ｃκ鎖；またはプロモーター
／リーダー配列／Ｖ−α鎖、Ｃ−α鎖フラグメント／単鎖リンカー配列／Ｖ−β
鎖、Ｃ−β鎖フラグメント／Ｃκ鎖を含むＤＮＡセグメントによってコードされ
る。例示的なｓｃ−ＴＣＲ分子は、Ｃκ鎖が、ＤＮＡセグメントによってコード
されない以外は、上記のようである。ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードするＤＮ
Ａベクターは、融合タンパク質の可溶性の発現のために、本明細書中で開示され
る特異的な発現系を含む所望の細胞に導入される。

【００９８】 本明細書中で提供されるｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、共有結合的に連結される
多様なエフェクターまたはタグを含むように、標準的な方法によって改変され得
る。適切なエフェクターまたはタグとしては、所望の生物学的、化学的、または
物理学的特性を与えるものが挙げられる。より具体的には、エフェクター分子は
、植物または細菌起源の細胞毒素（例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シガ毒素
、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス内毒素（ＰＥ）、
ヨウシュヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質、またはゲロニン）であり得る。こ
のような毒素の生理学的に活性なフラグメントは、当該分野において周知であり
、および例えば、ＤＴ Ａ鎖およびリシンＡ鎖が挙げられる。さらに、毒素は、
細胞表面で活性な因子（例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼ
Ｃ）であり得る。さらに、エフェクター分子は、化学療法剤（例えば、ビンデシ
ン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、
ブレオマイシン、またはシスプラチン）であり得る。さらに、エフェクター分子
は、診断および画像化研究に適切な検出可能に標識された分子（例えば、放射核
（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、またはビ
スマス−２１２））であり得る。エフェクターおよびタグを含むタンパク質の作
製および使用に関する開示について、例えば、Ｍｏｓｋａｕｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６４、１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ら Ｃｅｌ
ｌ ４７、６４１、１９８６；Ｐａｓｔａｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｏ
ｘｉｎｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ、Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、３３１（１９９２）；「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ
Ｔｏｘｉｎｓ」ＯｌｓｎｅｓおよびＰｈｉｌ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２５
、３５５（１９８２）；公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ ９４／２９３５０号；公
開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０４６８９号；および米国特許第５，６２０，
９３９号を参照のこと。

【００９９】 ｓｃ−ＴＣＲ融合分子、および本明細書中で開示される融合されるＩｇ−ＣＬ
鎖（またはフラグメント）を伴わないｓｃ−ＴＣＲ分子を使用する診断および画
像化研究を行うためのさらなる方法および材料に関する開示について、Ａ．Ｋ．
Ａｂｂａｓ、下部、および以下の考察をさらに参照のこと。

【０１００】 共有結合的に連結されるエフェクター分子を含む可溶性のｓｃ−ＴＣＲタンパ
ク質は、いくつかの重要な使用を有する。例えば、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、
ｓｃ−ＴＣＲを特異的に結合し得るある細胞に、エフェクター分子を送達するた
めに用いられ得る。従って、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、リガンドを含有する細
胞を選択的に障害または殺傷する手段を提供する。ｓｃ−ＴＣＲタンパク質によ
って障害または殺傷され得る細胞または組識の例としては、ｓｃ−ＴＣＲによっ
て特異的に結合され得る１つ以上のリガンドを発現する、腫瘍、およびウイルス
に感染された細胞が挙げられる。障害または殺傷されやすい細胞または組識は、
本明細書中に開示される方法によって容易にアッセイされ得る。

【０１０１】 エフェクター分子に融合されるｓｃ−ＴＣＲタンパク質の特定の例は、以下の
ようである：ｓｃ−ＴＣＲ（例えば、以下の実施例６および７において以下に開
示されるｐ１４９ｓｃ−ＴＣＲ）は、図９Ｂにおいて図示されるｐＮＡＧ１また
はｐＮＡＧ３ベクターで、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることによって生
成され得る。ｓｃ−ＴＣＲ ｐ１４９タンパク質は、ヒトＨＬＡ抗原；ＨＬＡ−
２．１の情況において、ヒト野生型ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質からプロ
セスされるペプチドフラグメントを認識する。ｓｃ−ＴＣＲ ｐ１４９およびそ
のペプチドリガンドは、Ｔｈｅｏｂａｌｄ，Ｍ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（
１９９５）、９２：１１９９３において記載されている。ペプチド配列は、ＳＴ
ＰＰＰＧＴＲＶ（配列番号１４６）である、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３
の発現は、悪性細胞においてアップレギュレートされる。全腫瘍の５０％が、表
面において増加されたレベルのｐ５３を発現することが示されている（Ｈｏｌｌ
ｉｓｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５３：４９）。それ
ゆえ、このエピトープに特異的なｓｃ−ＴＣＲ分子は、毒素で標識され、次いで
、ｐ５３ペプチドフラグメントのＨＬＡ−２．１リガンドを発現する悪性細胞に
送達され得る。この標的特異的免疫療法は、悪性細胞のみを殺傷するのに効果的
であり得る。インビトロで細胞傷害性を測定するための方法は周知であり、およ
び以下に記載されるような従来の生存性アッセイを含む。エフェクターに連結さ
れるｐ１４９ｓｃ−ＴＣＲを含むｓｃ−ＴＣＲ分子は、他の重要な使用を有する
。例えば、ｓｃ−ＴＣＲ分子は、ｐ１４９ペプチドを発現するヒト乳ガン細胞を
選択的に殺傷するために使用され得る。インビトロ研究が行われ得、ここではト
キシンが標識されたｐ１４９分子が、乳ガン細胞を殺傷する能力が、Ｅｕ３＋放
出細胞傷害性アッセイ（Ｂｏｕｍａ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９２）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．３５：８５）を使用する非放射性の細胞傷害アッセイを使用して評価さ
れる。融合されるエフェクター分子を含むｓｃ−ＴＣＲ分子は、インビボで容易
に試験され得る。例えば、インビトロ研究は、ｐ１４９／ＨＬＡ．Ａ２１を発現
する乳ガン細胞を、ＨＬＡ／Ａ２トランスジェニックマウスに移植することによ
って、行われ得る。（Ｔｈｅｏｂａｌｄら（１９９５）前出）。トキシン標識さ
れたｓｃ−ＴＣＲ ｐ１４９分子は、予め決定された投薬量で、マウスに注射さ
れ、および腫瘍の大きさに対する効果が、ｓｃ−ＴＣＲ分子の効力を示すために
測定され得る。さらに、寿命の延長が、新規な抗腫瘍療法の効果を評価するため
の第２の基準として使用され得る。

【０１０２】 他の適切なエフェクターまたはタグ分子が公知である。例えば、１つのタグは
、生理学的なｐＨで電荷を保有するポリペプチド（例えば、６×ＨＩＳ）である
。この例において、ｓｃ−ＴＣＲ分子または可溶性のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク
質は、市販のメタローセファロースマトリクス（例えば、約ｐＨ６〜９で６×Ｈ
ＩＳを特異的に結合し得るＮｉ−セファロース）によって精製され得る。ＥＥエ
ピトープおよびｍｙｃエピトープは、適切なタンパク質タグのさらなる例であり
、このエピトープは、１つ以上の市販のモノクローナル抗体によって特異的に結
合され得る。

【０１０３】 本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の分子量は、多くの因子（完全長のＣκ
鎖もしくはＣλ鎖、またはその適切なフラグメントが、選択されるか否か、また
は１つ以上のタンパク質タグが用いられるか否かを含む）に依存して変化する。
一般に、可溶性の融合タンパク質は、約４５ｋＤＡを超える分子量を有し、Ｖ−
α鎖およびＶ−β鎖は、そこで、約２０ｋＤＡを超える、より典型的には約２１
〜約２６ｋＤａの間の分子量を有する。典型的に、本発明の融合タンパク質は、
約５０〜約７５ｋＤａの分子量を有する。上記の分子量の全ては、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル電気泳動のような従来の分子分類実験によって決定される。概して、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前出、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出；Ａｕｓｕｂｅｌ
ら、前出を参照のこと。

【０１０４】 いくつかの設定において、本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質を多価にすること
、例えば、ｓｃ−ＴＣＲの結合価を増加することは、有用であり得る。簡潔に述
べると、多価ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、例えば、標準的なビオチン−ストレプ
トアビジン標識化技術を使用することによって、またはラテックスビーズのよう
な適切な固体支持体に結合することによって、１個と４個との間のタンパク質（
同じかまたは異なる）をともに共有結合的に連結することによって、作製される
。化学的に架橋されるタンパク質（例えば、デンドリマーに架橋される）はまた
、適切な多価種である。例えば、タンパク質は、化学的に反応性の側鎖を有する
アミノ酸残基（例えば、ＣｙｓまたはＨｉｓ）をコードする配列を含むことによ
って、改変され得る。化学的に反応性の側鎖を有するこのようなアミノ酸は、融
合タンパク質中の多様な位置に、好ましくは、ｓｃ−ＴＣＲの抗原結合領域に対
して遠位に配置され得る。例えば、可溶性タンパク質のＣ−β鎖フラグメントの
Ｃ末端は、タンパク質精製タグ、またはこのような反応性のアミノ酸を含む他の
融合されるタンパク質に共有結合的に連結され得る。多価分子を生じるために、
適切なデンドリマー粒子に２つ以上の融合タンパク質を化学的に連結するように
、適切な側鎖が含まれ得る。デンドリマーは、それらの表面に多くの異なる官能
基の任意の１つを有し得る合成化学ポリマーである（Ｄ．Ｔｏｍａｌｉａ、Ａｌ
ｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）２６：９１：１０１（１９９３））。本発明
に従う使用のための例示的なデンドリマーは、例えば、Ｅ９スターバスト（ｓｔ
ａｒｂｕｒｓｔ）ポリアミンデンドリマーおよびＥ９コムバスト（ｃｏｍｂｕｓ
ｔ）ポリアミンデンドリマー（これは、システイン残基を連結し得る）を含む。

【０１０５】 また、本発明の可溶性タンパク質、および融合タンパク質を含む細胞の活性を
高めるための他の成長因子、特にＴ細胞同時刺激因子（例えば、Ｂ−７遺伝子フ
ァミリーの因子（例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２））をコードするＤＮＡベク
ターを構築することが所望され得る。

【０１０６】 本発明の可溶性タンパク質は、超抗原を検出および特徴づけするために使用さ
れ得る。例えば、本発明の方法は、以下のようにＴ細胞の特徴付けられていない
エピトープをマッピングするために使用され得る：ランダムなペプチドまたは選
択されたペプチドのいずれかのライブラリーをコードする配列が、ペプチドライ
ブラリー中に提供され得る。次いで、ライブラリーは、本発明の可溶性のｓｃ−
ＴＣＲタンパク質、好ましくは検出可能に標識された融合タンパク質（例えば、
放射性原子または発光分子で標識される）を用いてスクリーニングされる。融合
タンパク質によって特異的に結合されるペプチドは、融合分子から放出され、次
いで増幅される。ペプチドの配列解析は、融合タンパク質によって結合される配
列を同定する。さらに、クローン化されたペプチド配列は、融合タンパク質のＶ
−α鎖およびＶ−β鎖に対応するＴＣＲを発現するＴ細胞への結合について試験
され得る。いくつかのランダムなペプチドライブラリーの任意の１つが、適切に
用いられ得る。例えば、Ｊ．Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９
：３８６；Ｊ．Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：４０４；
Ｓ．Ｃｗｉｒｌａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、（１９９０）；８７：６３７８；Ｊ
．Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６：１００７；Ｒｈ
ｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５７：４８８５；およ
びＤ．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．、（１９９１）１４７
：２６６３を参照のこと。

【０１０７】 非常に有用な単鎖のクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体（し
ばしば、ｓｃＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ複合体として言及される）が、公
開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号および同第ＰＣＴ／ＵＳ
９７／０１６１７号、ならびに係属中の米国特許出願番号第０８／３８２，４５
４号（１９９５年２月１日に出願された）において開示される。公開されたＰＣ
Ｔ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６
１７号、および係属中の米国特許出願番号第０８／３８２，４５４号はまた、本
明細書中に開示されるｓｃ−ＴＣＲタンパク質の機能を試験するために、容易に
適応され得る、非常に有用なインビトロおよびインビボＴ細胞結合アッセイを開
示する。この公開されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、同
第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および係属中の米国特許出願番号第０８／
３８２，４５４号の開示は、それぞれ、本明細書中に参考として援用される。

【０１０８】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質が、Ｔ細胞の活性を調整する（すなわち、増
殖のようなＴ細胞活性を減少または排除する）能力は、この公開されたＰＣＴ出
願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７
号、および係属中の米国特許出願番号第０８／３８２，４５４号において開示さ
れるアッセイ、およびアッセイを行うための材料に従って、容易に決定され得る
。

【０１０９】 より具体的には、この公開されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８
１６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および係属中の米国特許出願番
号第０８／３８２，４５４号において開示されるように、インビトロアッセイは
、分子がＴ細胞活性を調整し得るか否かを決定するために行われ得る。このよう
なアッセイは、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質の機能性を決定するために改変され得る
。一般に、例示的なアッセイは、以下の連続的な工程１〜４によって、以下のよ
うに行われる。Ｔ細胞は、アッセイされ得る、およびＴ細胞活性化、または活性
化後のＴ細胞活性の調整を示すマーカーを適切に発現する。従って、先行の出願
において開示されるように、活性化の際にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を
発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０が、用いられ得る。ＩＬ−
２濃度は、特定のｓｃ−ＴＣＲ融合分子が、Ｔ細胞ハイブリドーマの活性を調整
し得るか否か（例えば、ＩＬ−２生成を減少するか否か）を決定するために測定
され得る。このような適切なアッセイの一般的な例は、以下の連続的な工程によ
って行われる：

【０１１０】 １．本発明のｓｃ−ＴＣＲに対応するＴＣＲを含むＴ細胞ハイブリドーマまた
はＴ細胞が得られる。 ２．次いで、Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞は、増殖を許容する条件下で
培養される。 ３．次いで、増殖するＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞は、１つ以上のｓｃ
−ＴＣＲ融合タンパク質と接触される。 ４．Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞は、ＴＣＲを特異的に結合し、そして
Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を活性化し得るリガンドと接触される。例示
的なリガンドとしては、超抗原のような抗原、上述で開示されるような提示ペプ
チドを保有するｓｃ−ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ複合体、または適切なＡＰＣ
が挙げられる。 ５．Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞は、活性化に必要なシグナルを提供す
るために、適切な同時刺激因子と接触される。Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細
胞は、続いて、マーカーについてアッセイされ、例えば、ＩＬ−２生成が測定さ
れる。ＩＬ−２生成の減少（例えば、２４時間後のＩＬ−２生成の４０％以上の
減少）は、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質がリガンドを結合し、従って、Ｔ細胞の
活性を調整し得ることを示す。

【０１１１】 この公開されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、同第ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９７／０１６１７号、および係属中の米国特許出願番号第０８／３８２
，４５４号において以前に開示されるように、アッセイにおいて用いられるＴ細
胞は、通常、増殖に適切な条件下でインキュベートされる。例えば、ＤＯ１１．
１０ Ｔ細胞ハイブリドーマは、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ス
トレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、および５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタ
ノールを補充されたＲＰＭＩ １６４０）中、約３７℃、および５％ＣＯ_２で、
適切にインキュベートされる。融合タンパク質の連続希釈物が、典型的に１０^{− ８} 〜１０^−５Ｍの範囲の濃度において、Ｔ細胞培養培地に添加され得る。Ｔ細胞
活性化シグナルは、適切な抗原で負荷された抗原提示細胞によって、好ましくは
提供される。わずかに最大下のＴ細胞活性化を与える抗原用量およびＡＰＣの数
の使用は、融合タンパク質でのＴ細胞応答の阻害を検出するために好ましい。ｓ
ｃ−ＴＣＲ融合タンパク質との接触後のＩＬ−２の生成の減少は、融合タンパク
質が、Ｔ細胞の活性を調整することを示す。

【０１１２】 この公開されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、同第ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９７／０１６１７号、および係属中の米国特許出願番号第０８／３８２
，４５４号において以前に開示されるように、ＩＬ−２のような発現されるタン
パク質の測定ではなく、Ｔ細胞活性化の調整は、当該分野において認識されるよ
うな放射性標識化技術によって測定されるように、抗原依存性のＴ細胞増殖の変
化によって適切に決定され得る。例えば、検出可能に標識される（例えば、トリ
チル化される）ヌクレオチドが、アッセイ培養培地に導入され得る。ＤＮＡへの
このような標識化ヌクレオチドの取込みは、Ｔ細胞増殖の測定として作用する。
このアッセイは、増殖のために抗原提示を必要としないＴ細胞（例えば、Ｔ細胞
ハイブリドーマ）に適切でない。これは、哺乳動物から単離された形質転換され
ていないＴ細胞についての、Ｔ細胞活性化の調節の測定に、適切である。融合タ
ンパク質との接触後のＴ細胞増殖のレベルの減少は、分子が、Ｔ細胞の活性を調
整すること、および免疫応答を抑制し得ることを示す。インビトロでのＴ細胞増
殖アッセイは、インビボでのＴ細胞コロニー拡張の抗原特異的変化に対する融合
タンパク質の効果を、測定するために好ましい。ＩＬ−２生成またはＴ細胞増殖
の測定は、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質がＴ細胞活性化を改変し得るか否か決定
するために、用いられ得る。例えば、融合タンパク質による接触後の、ＡＰＣで
刺激されるＴ細胞のＩＬ−２生成の減少は、融合分子が、Ｔ細胞の活性を調整し
、そしてＴ細胞媒介性の免疫応答を抑制し得ることを示す。

【０１１３】 一般に、アッセイに適切なＴ細胞が、形質転換されたＴ細胞株（例えば、Ｔ細
胞ハイブリドーマ、または哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒト）もしくは
げっ歯類（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）から単離されたＴ細胞）
によって、提供される。他の適切なＴ細胞としては：１）公的に入手可能である
か、または公知の方法によって調製され得るＴ細胞ハイブリドーマ、２）Ｔヘル
パー細胞、および３）Ｔ細胞傷害性細胞（好ましくは、細胞傷害性ＣＤ８＋細胞
）が、挙げられる。Ｔ細胞は、公知の方法によって哺乳動物から単離され得る。
例えば、Ｒ．Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８３）
１５８：３０３を参照のこと。

【０１１４】 インビボアッセイはまた、Ｔ細胞の活性を調製する可溶性の融合タンパク質の
能力（Ｔ細胞発生を阻害または不活性化する能力を含む）を決定するために、適
切に用いられ得る。例えば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、免疫グロブリンク
ラススイッチング（すなわち、ＩｇＭからＩｇＧ）を阻害する能力についてアッ
セイされ得る。例えば、Ｐ．Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２
５７：７９２−７９５を参照のこと。

【０１１５】 インビボ診断画像化およびＨＬＡタイピングを含む可溶性のｓｃ−ＴＣＲタン
パク質を使用する診断方法がまた提供される（例えば、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓ、Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３２８
頁（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９９１）を参照のこと）。インビボ画
像化適用について、融合タンパク質は、放射性標識（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ
、９９Ｔｃ）、またはｓｃ−ＴＣＲの結合について公知の手順によってスキャン
される哺乳動物および被験体に投与され得る他の検出可能なタグを含む。このよ
うな哺乳動物の分析は、多くの異常（例えば、免疫系異常に付随するＡＰＣの非
所望の発現を含む）の診断および処置を補助し得る。

【０１１６】 アッセイはまた、自己免疫異常の処置のための、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質（ま
たは可溶性の融合タンパク質から得られるｓｃ−ＴＣＲ）の使用を評価するため
に用いられ得る。例えば、この公開されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／
０９８１６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および係属中の米国特許
出願番号第０８／３８２，４５４号において開示されるように、実験的アレルギ
ー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、マウスにおける自己免疫病であり、および多発性硬
化症の認識されるモデルである。１つの例示的なアッセイにおいて、マウス系統
は、ＥＡＥを発症するように処置され、次いで、適切なｓｃ−ＴＣＲタンパク質
（または可溶性の融合タンパク質から得られるｓｃ−ＴＣＲ）が、投与され得る
。次いで、動物は、ＥＡＥ発症が、融合タンパク質またはｓｃ−ＴＣＲの投与後
に阻害または防止されるか否かを決定するために評価され得る。

【０１１７】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質が、免疫応答を誘導する能力（以前に開示さ
れるような標的される異常に対するワクチン化を含む）は、インビボアッセイに
よって容易に決定され得る。例えば、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質（または可溶性の
融合タンパク質から得られるｓｃ−ＴＣＲ）は、マウスのような哺乳動物に投与
され、哺乳動物から得られる血液サンプルが、最初の投与時に、およびその後、
周期的に（例えば、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質の投与後２、５、８週間で）数回、
得られる。血清は、血液サンプルから回収され、そして免疫化によって惹起され
る抗体の存在についてアッセイされる。抗体濃度は、標準的な免疫学的技術に従
って決定され得る。

【０１１８】 本発明はまた、哺乳動物、特にヒトのような霊長類の細胞内でタンパク質を発
現するために、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列を投与する方法
を提供する。好ましくは、融合タンパク質のコード領域を保有するＤＮＡは、Ｃ
ＭＶプロモーターのような適切なプロモーターの制御下で適切に、公知の方法に
従って、被験体の骨格筋に直接的に注射される。プラスミドＤＮＡの投与、投与
された被験体の細胞によるＤＮＡの取込み、およびタンパク質の発現のための方
法が、報告されている（例えば、Ｊ．Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３
）２５９：１７４５−１７４９）。可溶性の融合タンパク質について、コードさ
れるＩｇ−ＣＬ鎖またはそのフラグメントが、用いられる宿主と免疫学的に適合
性であることが好ましい。

【０１１９】 本発明のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、多くの治療学的適用を有する。例えば、
ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、哺乳動物における免疫応答を減少または排除するた
めに、例えば、ガン、感染性疾患、アレルギー、もしくは自己免疫異常（例えば
、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチなど）を被るか、
またはこれらにかかりやすいヒトのような哺乳動物を処置するために、投与され
得る。投与は、融合タンパク質をコードするＤＮＡの直接的な投与のような、任
意の適切な手段を介して行われ得る。また、処置のために適切であるのは、非所
望の免疫応答を被るかまたは被りやすい被験体（例えば、心臓、肝臓、皮膚、ま
たは他の器官の移植のような移植外科手術を受ける患者）である。移植片拒絶を
含む状況において、処置プロトコルは、外科手術手順の進行において、適切に開
始され得る。

【０１２０】 多くの異なるアプローチが、本発明に従って、哺乳動物の免疫応答を減少また
は排除するために用いられ得る。例えば、非所望の免疫応答を減少するための１
つの処置方法が、病原性Ｔ細胞と、超抗原またはペプチド−ＭＨＣ複合体との間
の相互作用を減少または排除するための、有効量の所望のｓｃ−ＴＣＲ融合物の
投与のために提供される。従って、Ｔ細胞媒介性の免疫応答（例えば、Ｔ細胞増
殖、分化、活性化）またはＢリンパ球刺激は、選択的に制御され得る。好ましく
は、融合タンパク質は、抗原に対して、非所望の免疫応答を媒介する病原性Ｔ細
胞と少なくとも同じか、または好ましくは増加される特異的な結合親和性を示す
。この局面において特に好ましいのは、以前に記載されるｓｃ−ＴＣＲ融合タン
パク質のムテインであり、これは、リガンドに対する、増加された特異的な結合
親和性を実証する。融合されるＩｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントは、標準的な免
疫学的アッセイによって標的細胞に結合する融合タンパク質を同定するために、
使用され得る。

【０１２１】 ｓｃ−ＴＣＲタンパク質、適切なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質に由来するｓｃ
−ＴＣＲ、または本明細書中に開示される方法に従って調製される抗体の投与は
、注射（例えば、腹腔内または静脈内の注射）によって哺乳動物に投与され得る
。融合タンパク質、治療学的適用において使用される最小の分子は、好ましくは
、哺乳動物細胞または他の適切な細胞から生成され、そして発熱物質が本質的に
または完全にないように、使用の前に精製される。所与の治療学的適用のための
至適な用量は、従来の手段によって決定でき、および一般に、多くの因子（投与
の経路、患者の体重、全体的な健常度、性別、および当業者によって認識される
他のこのような因子を含む）に依存して変化する。

【０１２２】 投与は、単回用量、または日間隔もしくは週間隔で分けられる連続の用量にお
いて行われ得る。本明細書中で使用される用語「単回用量」は、唯一の用量であ
り、およびまた、持続性の放出用量であり得る。被験体は、哺乳動物（例えば、
ヒト、またはウシのような家畜ならびにイヌおよびネコのようなペット）であり
得、およびｓｃ−ＴＣＲ、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質、または抗体を含む薬学
的組成物としての処置を含む。本発明のこのような薬学的組成物は、当該分野に
おいて公知の手順に従って調製および使用される。例えば、治療学的に有効な量
の融合タンパク質を含む処方物が、１用量または多用量の容器（例えば、密封さ
れたアンプルおよびバイアル）中に提示され、そして使用の直前に滅菌液体キャ
リアの添加（例えば、水注入）のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）
状態において保存され得る。リポソーム処方物はまた、多くの適用について好ま
しくあり得る。非経口投与のための他の処方物はまた、適切であり、および水性
および非水性の滅菌注入溶液（これは抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、意図されるレ
シピエントの血液との等張性を処方物に与える溶質を含み得る）；ならびに水性
および非水性の滅菌懸濁液（これは、懸濁化剤および肥厚化剤を含み得る）であ
り得る。

【０１２３】 Ｔ細胞応答を減少または排除する工程を包含する本発明の方法はまた、Ｔ細胞
媒介性の異常のより効果的な処置を提供するために、公知の免疫抑制剤、抗ウイ
ルス剤、抗ガン剤、または抗炎症剤と組み合わせて、使用され得る。例えば、融
合タンパク質は、自己免疫異常およびアレルギーの処置のために、従来の免疫抑
制薬物（例えば、シクロスポリン）または抗炎症剤（例えば、コルチコステロイ
ドおよび非ステロイド薬物）と組み合わせて使用され得る。

【０１２４】 以前に記載されるように、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質（または、所望のｓｃ−Ｔ
ＣＲ融合タンパク質に由来するｓｃ−ＴＣＲ分子）は、当該分野において一般に
公知の技術によって、抗体を生成するために使用でき、および、典型的に、融合
タンパク質の精製されたサンプルとして作製される。抗体を惹起するために選択
されるｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、免疫グロビン鎖に対する免疫学的反応を
減少するために、以前に記載されるように、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントか
ら切断され得る。このように得られるｓｃ−ＴＣＲは、免疫原として使用される
。抗体はまた、目的のｓｃ−ＴＣＲの１つ以上のエピトープを含む免疫原性ペプ
チドから作製され得る。

【０１２５】 より詳細には、抗体は、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質の精製されたサンプル、上述
で考察されるように所望のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質または免疫原性ペプチド
から分離されたｓｃ−ＴＣＲ分子で、単独でまたは適切なキャリアと複合体化し
て、哺乳動物を免疫化することによって、調製され得る。好ましくは、ｓｃ−Ｔ
ＣＲ分子は、免疫原として使用される。適切な哺乳動物としては、典型的な実験
室動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ピッグ、ラット、および
マウス）が挙げられる。ラットおよびマウス、特にマウスが、モノクローナル抗
体を得るために好ましい。抗原は、任意の多くの適切な経路（例えば、皮下、腹
腔内、静脈内、筋肉内、または皮下注射）によって、哺乳動物に投与され得る。
至適な免疫化の間隔、免疫化の用量などは、比較的広範な範囲内で変化し、およ
び本明細書の開示に基づいて経験的に決定され得る。典型的な手順としては、多
くの週にわたる数回の抗原の注射を包含する。抗体は、標準的な技術によって、
免疫された動物の血清から回収され、そしてｓｃ−ＴＣＲに特異的な抗体を見出
すためにスクリーニングされる。特に興味深いのは、Ｖ−α鎖またはＶ−β鎖、
特にそこにある超可変領域を特異的に結合する抗体であり、直鎖状のまたは立体
配置的なエピトープを認識する抗体を包含する。モノクローナル抗体は、抗体を
生成する細胞において生成でき、およびそれらの細胞は、ハイブリドーマ細胞を
形成するための標準的な融合技術を使用することによって、モノクローナル抗体
を生成するために使用される。Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ
、２５６：４５６を参照のこと。典型的に、これは、不死化細胞株（例えば、骨
髄腫細胞）と抗体産生細胞とを融合して、ハイブリッド細胞を生成することを包
含する。あるいは、モノクローナル抗体は、Ｈｕｓｅら（１９８９）、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５６：１２７５の方法によって、細胞から生成され得る。

【０１２６】 約２〜７ヵ月間の期間にわたって行われる、精製されたｓｃ−ＴＣＲ複合体を
含む組成物でのマウスの腹腔内免疫化のために、１つの適切なプロトコルが提供
される。次いで、脾臓細胞は、免疫されたマウスから取出され得る。免疫された
マウスからの血清は、脾臓細胞の切り出しの前に、ｓｃ−ＴＣＲに特異的な抗体
の力価についてアッセイされる。次いで、切り出されたマウスの脾臓細胞は、ヒ
ポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏（ＨＧＲＰＴ−
）またはチミジンキナーゼ欠乏（ＴＫ−）のようなマーカーを有する、適切な同
種遺伝子型または異種遺伝子型（好ましくは同種遺伝子型）のリンパ様細胞株に
、融合される。好ましくは、リンパ様細胞株として骨髄腫細胞が用いられる。骨
髄腫細胞および脾臓細胞は、例えば、約１：４の骨髄腫細胞：脾臓細胞の比率で
、ともに混合される。細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によって融
合され得る。Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、前出を参照のこと。従って、
クローン化されたハイブリドーマは、培養培地（例えば、ＰＲＭＩ−１６４０）
中で増殖される。Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｅら（１９６７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９：５４９を
参照のこと。融合手順後に増殖されたハイブリドーマは、精製されたｓｃ−ＴＣ
Ｒに特異的に結合する抗体の分泌について、例えば、放射性イムノアッセイまた
は酵素イムノアッセイによってスクリーニングされる。ＥＬＩＳＡは、従来の方
法に従って抗体を含有する血清をスクリーニングするために使用され得る。この
ようなスクリーニングの際にポジティブな結果を示すハイブリドーマは、拡張さ
れ、そして限界希釈法によってクローン化され得る。溶液中および生物学的サン
プル中のｓｃ−ＴＣＲに結合し得る抗体を選択するために、さらなるスクリーニ
ングが、好ましくは行われる。単離された抗体はさらに、アフィニティークロマ
トグラフィーを含む任意の適切な免疫学的技術によって、精製され得る。

【０１２７】 いくつかの適用について、ｓｃ−ＴＣＲを特異的に結合するキメラ抗体誘導体
（例えば、非ヒト動物の可変領域とヒトの定常部領域とを合わせた抗体分子）を
生成し、それによって、ヒト被験体において、対応する非キメラ抗体よりも免疫
原性が低い抗体にすることが所望され得る。多様なタイプのこのようなキメラ抗
体が、調製され、例えば、ヒト可変領域キメラ（ここでは、可変領域の部分、特
に抗体結合領域の保存された領域が、ヒト起源であり、超可変領域のみが非ヒト
起源である）を生成することによって調製され得る。Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２；Ｏｉら（１９８６）、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４；Ｔｅｎｇら（１９８３）ＰＮＡＳ、Ｕ．Ｓ
．Ａ．、８０：７３０８；Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ、４：７２７９；Ｏｌｓｓｏｎら（１９８２）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．、９：３における、ヒト化キメラ抗体およびこれを生成する方法の考察
をまた参照のこと。

【０１２８】 上記のように、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、所望のリガンドに対する特異的な
結合を改善するために、従来の変異誘発技術に従って、容易に改変され得る。例
えば、所望のｓｃ−ＴＣＲは、以前に記載されるようにペプチドリンカー配列に
よって連結される適切なＶ−α鎖およびＶ−β鎖をコードするＤＮＡセグメント
を単離することによって、作製され得る。ＤＮＡは、所望される場合、Ｉｇ−Ｃ
Ｌ鎖に連結され、次いで、所望のＶ−α鎖またはＶ−β鎖内の部位特異的変異誘
発のような変異誘発に供され得る。例示的な変異誘発法としては、アラニンスキ
ャニング変異誘発が挙げられる（例えば、Ｎｉｓｂｅｔ，Ｉ．Ｔ．ら（１９８５
）Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．２、２３；Ｈｉｎｅｓ，Ｊ．Ｃ．、Ｇｅｎｅ
（１９８０）１１、２０７；また、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の特異的な結合親和性を調整することが所望される
場合、選択される変異は、典型的に、ｓｃ−ＴＣＲの相補性決定領域（すなわち
、ＣＤＲ、時折、超可変領域として言及される）の結合親和性を影響するアミノ
酸の置換である。より具体的には、アミノ酸置換は、本明細書中で使用されるよ
うに、ｓｃ−ＴＣＲ中で、別のアミノ酸をあるアミノ酸で置換することを意味す
る、保存的または非保存的な置換である。いくつかの場合において、置換は、実
質的に類似の化学的特性を有する別のアミノ酸でのアミノ酸の置換からなる（保
存的）。他の場合において、置換は、実質的に異なる化学的特性を有する別のア
ミノ酸でのアミノ酸の置換からなる（非保存的）。従って、フェニルアラニン残
基でのｓｃ−ＴＣＲ中のチロシン残基は、保存的アミノ酸置換を示し、一方、プ
ロリン残基でのアラニン残基の置換は、非保存的置換を示す。変異誘発は、ｓｃ
−ＴＣＲのＶ−α鎖およびＶ−β鎖を分けるペプチドリンカー配列の長さおよび
アミノ酸組成の変化を提供することが、当業者によって理解される。さらに、変
異誘発は、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントに指向され、所望のようにその長さ
またはアミノ酸組成が変化される。しかし、大部分の場合において、変異誘発は
、Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖に標的され、そして融合タンパク質のＶ−α鎖または
Ｖ−β鎖において、平均で、１つのアミノ酸変異置換が提供される。変異誘発の
程度は、変異誘発されたＶ−α鎖またはＶ−β鎖のＤＮＡを配列決定することに
よって、簡便にアッセイされ得る。

【０１２９】 好ましくは、Ｖ−α鎖またはＶ−β鎖の変異誘発は、リガンドに対するｓｃ−
ＴＣＲ融合タンパク質の特異的な結合を増加し、天然に存在するＴＣＲよりも少
なくとも約２倍高いレベルにする。

【０１３０】 あまり好ましくない方法であるが、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、周知の化
学変異誘発技術によって、所望のように、改変され得る。 本発明はまた、リガンドとＴ細胞レセプターとの間の特異的な結合を阻害し得
る分子を検出するための方法を特徴とする。方法は、Ｔ細胞レセプターを特異的
に結合し得るリガンドの存在下で、単鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質をイン
キュベートする工程、リガンドおよび目的の分子の存在下で単鎖Ｔ細胞レセプタ
ー融合タンパク質をインキュベートする工程；ならびに分子の不在下および存在
下での、リガントと単鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質との間の相互作用を評
価する工程を包含し、ここで、分子の不在下の場合よりも低い、分子の存在下で
の融合タンパク質とリガンドとの間の相互作用は、分子が、リガンドとＴ細胞レ
セプターとの間の特異的な結合を阻害し得るという指標である。方法は、所望さ
れる場合、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の代わりにｓｃ−ＴＣＲ分子を用いて、
行われ得る。

【０１３１】 本明細書中で使用される用語抗体は、一般に、全免疫グロブリン、および可溶
性の融合タンパク質のｓｃ−ＴＣＲ分子を結合する免疫学的に活性なフラグメン
トをいう。免疫グロビンおよびその免疫学的に活性なそのフラグメントは、抗体
結合部位（すなわち、融合タンパク質を特異的に結合し得るペプチド）を含む。
例示的な抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ｖ）、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）２フラグメント、「免疫グロブリンのジスルフィド結合を還元するこ
とによって得られる「半分子」、単鎖免疫グロブリン、または他の適切な抗原結
合フラグメントが挙げられる（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２４２；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８５：５８７
９；Ｗｅｂｂｅｒら（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：２４９を
参照のこと）。抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントは、動物（例えば
、マウスおよびラットのようなげっ歯類）のものであり得るか、またはキメラ形
態であり得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）ＰＮＡＳ、８１：６８
５１；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１。

【０１３２】 用語「特異的に結合する」または類似の用語によって、別の分子を結合し、そ
れによって特異的な結合対を形成する、本明細書中に開示される分子が意味され
る。しかし、分子は、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ
、移動度シフトアッセイ、酵素−イムノアッセイ、競合アッセイ、飽和アッセイ
、または当該分野において公知の他のタンパク質結合アッセイによって決定され
るように、他の分子を認識せず、これに結合しない。概して、例えば、分子間の
特異的な結合を検出するための方法の例について、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、およびそれらに
引用される参考文献を参照のこと。

【０１３３】 実質的に純粋な可溶性の融合タンパク質または核酸は、少なくとも約９０〜９
５％純粋であり、および好ましくは、薬学的な使用について少なくとも９８％〜
９９％以上純粋である。いったん、部分的にまたは実質的な純度に精製されると
、可溶性の融合タンパク質は、治療学的に（体外を含む）使用され得るか、また
は本明細書中に記載されるようにインビトロもしくはインビボアッセイを開発ま
たは行う際に、使用され得る。

【０１３４】 本明細書中で言及される全ての書類は、それらの全体が参考として本明細書中
に援用される。

【０１３５】 以下の制限されない実施態様は、本発明の説明である。

【０１３６】 実施例１ 可溶性ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の構築 マウスＤＯ１１．１０細胞のＴＣＲのＤＮＡ配列が報告されている（Ｋａｐｐ
ｌｅｒ，Ｊ．等、ＰＮＡＳ（１９９４）９１ ８４６２）。ＴＣＲは、Ｉ−Ａ^ｄ ＭＨＣクラスＩＩ分子という状況にあるアミノ酸３２３−３３９におよぶニワト
リオボアルブミンペプチド（すなわちＯＶＡ）を認識および結合する。ＴＣＲを
コード化しているＤＮＡは全般的に、ＫａｐｐｌｅｒおよびＭａｒｒａｃｋ、前
出、に開示された方法の方針に沿って調製された。

【０１３７】 要約すれば、１ｘ１０^６個のＤＯ１１．１０細胞からのｍＲＮＡを、オリゴ−
ｄＴをコートした磁気ビーズを用い、製造業者（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））の指
示にしたがって単離した。ＴＣＲα鎖のｃＤＮＡは、ＤＯ１１．１０のｍＲＮＡ
に加えてＣ−αに特異な「後ろ向き」プライマーであるＫＣ１１３（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．６）を含んでいる混合物をインキュベートすることにより作成した。
続いて、ｃＤＮＡを形成させるべく、標準的な量のヌクレオチドおよび逆転写酵
素を添加した。β鎖のｃＤＮＡは、ＫＣ１１３プライマーの代りに「後ろ向き」
プライマーＫＣ１１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）を用いること以外は同様の方
法で作成された。アルファ鎖ｃＤＮＡは鋳型として、６５０ｂｐの５’ＸｈｏＩ
−３’ＸｍａＩα鎖フラグメントを増幅するべく、プライマーＫＣ１１２（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．５）およびＫＣ１１３と共にＰＣＲ反応に使用した。７５０ｂ
ｐ鎖フラグメントを、５’および３’末端に各々ＳｆｉＩおよびＳｐｅＩ部位を
含んでいるプライマーＫＣ１１１およびＫＣ１１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
を用いてＰＣＲ増幅した。

【０１３８】 ｓｃＴＣＲは、ＤＯ１１．１０ＴＣＲからの、共有結合により結合されたＶ−
α鎖およびＶ−β鎖を含むべく構築された。ある場合には、Ｖ−α鎖はさらにＣ −β鎖フラグメントおよびＣ−β鎖フラグメント を含んでいた（第５図参照）。
一般的にＣα鎖フラグメントは、長さが約９アミノ酸の間であるが、さらに長い
Ｃ−α鎖が以下の実施例４に開示されている。Ｃ−β鎖は典型的には、完全長の
Ｃ−β鎖の１２７番目のアミノ酸残基であるシステイン残基の直前の１２６番目
のアミノ酸残基で切り取られている。このシステイン残基を含むことがｓｃ−Ｔ
ＣＲ発現に対して有害性であることが発見された。

【０１３９】 実施例２ 大腸菌におけるｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を発現させるためのベク
ター バクテリオファージ外皮タンパク質（遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩ）に
融合されたｓｃ−ＴＣＲ分子をコード化しているＤＮＡセグメントを含んでいる
ＤＮＡベクターの構築は、前記米国係属出願第０８／８１３，７８１号に記載さ
れている。簡単に言えば、可溶性融合タンパク質をコード化している本発明のＤ
ＮＡベクターを構築するべく、前記来国係属出願の選択されたＤＮＡベクターを
修飾した。実施例４ないし７参照のこと。

【０１４０】 Ａ． ＤＮＡベクターｐＪＲＳ１４９ ｐＪＲＳ１４９ＤＮＡベクターは、ｐＢｌｕＳｃｒｉｐｔＴＭ（インヴィトロ
ジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））バックボーンを含むファージミドである Ｂ． ＤＮＡベクターｐＫＣ１２ バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩをコード化しているＤＮＡを第１図に説明し
たｐＫＣ１２ベクターにクローン化した。 Ｃ． ＤＮＡベクターｐＫＣ１４およびｐＫＣ１５ バクテリオファージ遺伝子ＶＩＩＩＤＮＡ配列を、プライマーＯＰＲ１５６（
「前向き」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８）およびＯＰＲ１５７（「後ろ向き」ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．５９）と共に、鋳型としてのｆｄ ｔｅｔバクテリオファージ
（ＡＴＣＣ受け入れ番号Ｎｏ．３７０００）からＰＣＲ増幅した。遺伝子ＶＩＩ
ＩのＰＣＲ産物を、次いでＸｍａｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてベクターｐ
ＬＬ００１にクローン化し、ベクターｐＫＣ１４とした。ｐＬＬ００１プラスミ
ドはＰＵＣ−１９ＤＮＡに由来し、ポリリンカー領域にＸｍａｌおよびＥｃｏＲ
Ｉ部位を含んでいた。この部位は遺伝子ＶＩＩＩセグメントのサブクローニング
に便利であった。さらに、ｐＬＬ００１ベクターをシャトルベクターとして用い
て、遺伝子ＩＩＩＤＮＡをクローン化した。ベクターｐＫＣ１５は、９６ｂｐの
ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、第１図に示したｐＪＲＳ１４９ベクター
にクローン化することにより、ｐＫＣ１４から由来したものである。ＮｃｏＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントは多重のクローニング部位（たとえば、ＳｆｉＩ、Ｎｃ
ｏＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、およびＸｍａＩ）、ｐｅｌＢリーダー、ｐｈｏＡプ
ロモーター、および遺伝子ＩＩＩ遺伝子をもつ合成ポリリンカーを含む。ベクタ
ーｐＫＣ１５は、ｐＪＲＳ１４９バックボーンに由来する第二のｐｅｌＢａリー
ダーを有し、二つのシストロンをもつオペロンの支配下にされるべく遺伝子クロ
ーニングされる。 Ｄ． ＤＮＡベクターｐＫＣ１６およびｐＫＣ１８ ｐＫＣ１６からのＸｈｏＩ−ＸｍａＩフラグメントをクローニングするために
、アルファ鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いて、プライマーＫＣ１１３（ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ．６）（「前向き」）およびＫＣ１１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）（「
後ろ向き」）を用いてＴＣＲのＶ−αおよびＣ−α遺伝子を増幅した。Ｖ−β，
Ｃ−β遺伝子フラグメントを、鋳型としてのβ鎖ｃＤＮＡと、プライマーＫＣ１
１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）（「前向き」）およびＫＣ１１１（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．４）（「後ろ向き」）と共にＰＣＲを用いて増幅し、ベクターｐＫＣ
１５にクローン化してｐＫＣ１８とした。 Ｅ． ＤＮＡベクターｐＫＣ２７、ｐＫＣ４２、およびｐＫＣ４４ （Ｇ４Ｓ）４ポリペプチドリンカーを作成するべく、プライマーＪＡ３０１（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５）およびＪＡ３０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９６）を
アニールすることにより、ベクターｐＫＣ２７を構築した。続いてこのリンカー
をＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＫＣ１５ベクターにクローン化した
。次にＶ−α１３．１およびＶ−β，Ｃ−β領域を各々ｐＫＣ２７ＤＮＡにクロ
ーン化した。要約すれば、Ｖ−α１３．１遺伝子フラグメントを、鋳型としての
ベクターｐＫＣ１６ＤＮＡと共に、プライマーＫＣ１１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：７）（「前向き」）およびＫＣ１２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）（「後ろ
向き」）を用いたＰＣＲ増幅により産生した。Ｖ−α１３．１遺伝子を、Ｓｔｉ
Ｉ−ＳｐｅＩフラグメントとしてｐＫＣ４２にクローン化した。ＸｈｏＩおよび
ＸｍａＩによりｐＫＣ１８を消化した後、Ｖ−β８．２、およびＣ−β鎖ＤＮＡ
をゲル精製した。このフラグメントをｐＫＣ４２にクローン化してｐＫＣ４４ベ
クターとした。全般的にｐＫＣ４４ベクターは、ｐｈｏＡプロモーターの転写支
配の下に、ｓｃ−ＴＣＲ／遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質としてｓｃ−ＴＣＲを含
んでいた。 Ｆ． ｐＫＣ１２、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ＤＮＡベクタ
ー ベクターｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ベクターの、ｐＫＣ１２
からの構築を第３図に概説し、以下に記述する。 ｐＫＣ１２ベクターを修飾して、実施例１からのｓｃ−ＴＣＲをコード化して
いるＤＮＡがｌａｃＺプロモーターの転写支配下に発現されるようにした。要約
すれば、ベクターｐＫＣ４５を産生するべく、ｐＫＣ１２ベクターを、アニール
したプライマーＫＣ１３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）（「前向き」）および
ＫＣ１３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）（「後ろ向き」）をｐＫＣ１２にクロ
ーン化することにより修飾した。この修飾により、ＳｆｉＩおよびＥｃｏＲＩ部
位をすでに含んでいたｐＫＣ１２のポリリンカー領域にＸｍａＩ部位が添加され
た。さらに、ｐＫＣ４５はＥＥ−ｔａｇの５’末端に付着した遺伝子ＩＩＩをコ
ード化しているＤＮＡ配列およびアンバー停止コドンを含んでいた。

【０１４１】 アンバー停止コドンは、ＸＬＩ−ｂｌｕｅなどのｌａｃＩｑアンバーサプレッ
サーの宿主において、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現のレベルを約１５ない
し２０％に減じた。ｓｃ−ＴＣＲ／遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質をコード化して
いるＤＮＡをクローン化するためには、ｐＫＣ４４ＤＮＡをＳｆｉＩおよびＸｍ
ａＩを用いて切断した。次いでｓｃ−ＴＣＲフラグメントをゲル精製し、ｐＫＣ
４５にクローン化してｐＫＣ４６とした。ｐＫＣ４６のｓｃ−ＴＣＲインサート
は第３図に示されており、ＥＥ−ｔａｇおよび遺伝子ＩＩＩ外皮タンパク質と融
合している。

【０１４２】 ｓｃ−ＴＣＲ／遺伝子ＶＩＩＩ融合タンパク質は、ｐＫＣ４４とｐＫＣ４６と
をＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化することにより、ｌａｃＺプロモータ
ーの転写支配下に置かれた。消化されたｐＫＣ４４ＤＮＡから遺伝子ＶＩＩＩＤ
ＮＡ配列を単離し、ゲル精製したベクターＤＮＡ ｐＫＣ４６に、ＳｆｉＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントとしてクローン化し、ベクターｐＫＣ５１とした。次いで
、ベクターｐＫＣ５１中のｓｃ−ＴＣＲインサートを、遺伝子ＶＩＩＩ外皮タン
パク質に融合させた。ベクターｐＫＣ４６と異なり、ｐＫＣ５１ベクターはＥＥ
−ｔａｇまたはアンバー停止コドンを含んでいない。

【０１４３】 実施例３ 融合タンパク質をコード化しているＤＮＡの、ＤＮＡベクターｐＥＮ
２へのクローニング 実施例１で製造された可溶性ｓｃ−ＴＣＲの発現は、第４図に説明したｐＥＮ
２ベクターにサブクローニングすることにより亢進された。ｐＥＮ２ベクターは
ｐｈｏＡプロモーター、遺伝子１０リボゾーム結合部位、および修飾されたｐｅ
ｌＢリーダーを含む。ｐＥＮ２ベクターバックグラウンドにおけるｓｃ−ＴＣＲ
インサート、ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６７は第５図に図説されており、以下のよ
うに記述される。

【０１４４】 Ａ． ＤＮＡベクターｐＫＣ６０の構築 ｐＫＣ６０ベクターは、１２０４ｂｐのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを
ｐＥＮ２に導入することにより作成された。ＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント
は、Ｖ−αおよびＶ−β、およびＣ−β領域からなる。このフラグメントは、ｐ
ＫＣ５１ＤＮＡを鋳型として増幅することと、プライマーＫＣ１１４（「前向き
」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびＪＷＴＣＲ２０８（「後ろ向き」ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７５）を用いることにより作成された。ＪＷＴＣＲ２０９プライマー
は、ＥＥ−ｔａｇおよびＣ−（領域の３’ＸｍａＩ部位を含んでいた。ＸｍａＩ
部位の添加は、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩの遺伝子のクローニングを促
進した。ｐＫＣ６０ベクターは、上記のｓｃ−ＴＣＲ ＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントをｐＥＮ２ベクターにクローニングすることにより作成された。 Ｂ． ＤＮＡベクターｐＫＣ６１の構築 ｓｃ−ＴＣＲの切断された変形物を作成するべく、ベクターｐＫＣ４６のＶ−
α、Ｖ−β配列を、プライマーＫＣ１１５（「前向き」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
）およびＪＷＴＣＲ２０９（「後ろ向き」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）を用いて
ＰＣＲ増幅した。結果として得られたＰＣＲ増幅産物をベクターｐＫＣ６０にサ
ブクローン化し、ベクターｐＫＣ６１とした。ｐＫＣ６１ベクターは、ＥＥ−ｔ
ａｇ配列の３’末端に６ＸＨｉｓタグを添加することによりさらに修飾された。 Ｃ． ｐＫＣ６２およびｐＫＣ６４ＤＮＡベクター バクテエリオファージ遺伝子ＩＩＩをコード化しているＤＮＡを、プライマー
ＴＣＲ２１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６Ｆ）および２１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６
４）と共に、ｐＫＣ４６ベクターＤＮＡを鋳型として用いて増幅し、ｐＫＣ６０
にクローン化してベクターｐＫＣ６４とした。遺伝子ＶＩＩＩの遺伝子を、プラ
イマーＴＣＲ２１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）および２１３（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７０）と共に、鋳型としてベクターｐＫＣ５１ＤＮＡを用いて増幅し、
次いでｐＫＣ６０にクローン化してｐＫＣ６２とした。 Ｄ． ＤＮＡベクターｐＫＣ６３およびｐＫＣ６５の構築 遺伝子ＩＩＩ（ｐＫＣ６５）および遺伝子ＶＩＩＩ（ｐＫＣ６３）の融合タン
パク質を、注目される遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅の後に、ベクターバック
ボーンであるｐＫＣ６１にクローン化する。ゆえに、ｐＫＣ６５およびｐＫＣ６
３は両者ともプライマー配列にコード化された６ｘＨｉｓ尾部を含むこととなる
。 Ｅ． ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ＤＮＡベクターの構築 ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターは、Ｖ−αとＣ−α鎖フラグメントの
最初の８アミノ酸とを含んでいるＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、ｐＫＣ５
１ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫＣ１１４（前向き ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
）およびＪＷＴＣＲ２１７−（（後ろ向き ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）を用い
て増幅することにより作成された。ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターを作成
するためには、ＫＣ１１４およびＪＷＴＣＲ２１７−（プライマーを、ＴＣＲＤ
ＮＡをＰＣＲ増幅するべく用い、その後増幅されたＤＮＡを、あらかじめＳｆｉ
ＩおよびＳｐｅＩを用いて消化したｐＫＣ６２またはｐＫＣ６０にサブクローン
化した。これらのベクターは、各々Ｃ−α領域のＮ−末端からの８アミノ酸残基
を含む。当該ベクターを、以下に述べるＴＣＲライブラリーの構築に使用した。
ベクターｐＫＣ６６は遺伝子ＶＩＩＩの遺伝子を含む。

【０１４５】 米国同時係属出願第０８／８１３，７８１，号にに開示されたように、ＤＮＡ
ベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）はブタ
ペスト条約にしたがってメリーランド州、ロックビル、１２３０１パークローン
・ドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄
託された。当該ＤＮＡベクターは１９９７年２月２６日にＡＴＣＣに寄託され、
受け入れ番号９７８９５（ｐＳＵＮ１８）および９７８９６（ｐＳＵＮ１９）を
付与された。ＤＮＡベクターｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、ｐｈｏＡプロモー
ター、修飾されたｐｅｌＢ配列、遺伝子１０リボソーム結合部位、およびバクテ
リオファージ遺伝子ＶＩＩＩプロモーターを含む。ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（
ｐＳＵＮ１８）は、ｌａｃＺプロモーター、ＥＥｔａｇ、およびバクテリオフア
ージ遺伝子ＩＩＩタンパク質を含む。これらのＤＮＡベクターは、標準的な方法
にしたがって大腸菌または他の適当な宿主細胞において伝播されることが可能で
ある。

【０１４６】 ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９
）は、種々のＶα、Ｖβ−Ｃβ、およびポリペプチドリンカー配列を含むべく設
計されている。両ＤＮＡベクターのＶα鎖は、ＳＦｉＩおよびＳｐｅＩによる制
限消化により除去されることが可能である。Ｖβ−Ｃβ鎖はＸｈｏＩ−ＸｍａＩ
を用いた制限消化により除去することができる。さらに、ＤＮＡベクターはＳｐ
ｅＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化によりペプチドリンカー配列の交換を可能
にする。

【０１４７】 実施例４ ベクターｐＫＣ２４、ｐＫＣ７３、ｐＫＣ７４、ｐＫＣ７５の構築 ＤＮＡベクターは、実施例１においてマウスＩｇＧカッパ鎖とのタンパク質融
合物として作られたＤ０１１．１１ｓｃ−ＴＣＲを発現するべく、以下のように
構築された。

【０１４８】 マウスＩｇＧカッパ鎖に融合物されたＤ０１１．１１ｓｃ−ＴＣＲをコード化
しているＤＮＡセグメントを含んでいるＤＮＡベクターを調製するため、ｐＫＣ
１６のＶａＣα鎖を、プライマーＫＣ１１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）および
ＫＣ１１７（ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ１０）を用いたＰＣＲにより再増幅し、５’Ｓ
ｆｉＩ−３’ＳｐｅＩフラグメントを生じた。このＤＮＡをｐＫＣ１５にクロー
ン化し、配列した。正しいフラグメントを制限消化し、５’ＳｆｉＩ−３’Ｓｐ
ｅＩで消化したｐＫＣ１５ＤＮＡ内に連結し、ｐＫＣ２４ベクターとした。ｐＫ
Ｃ１５およびｐＫＣ１６構築物の由来は、上記の実施例２Ｃおよび２Ｄに述べら
れている。

【０１４９】 次いでｐＫＣ２４ＤＮＡを鋳型として、プライマーＫＣ１１４（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．７）とＫＣ１６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３１）、ＫＣ１１４とＫＣ１
６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３２）、およびＫＣ１１４とＫＣ１６７（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１３３）を用いたＰＣＲに使用し、異なる長さのＣα鎖が添加さ
れたＶ−α鎖を産生した。ＤＮＡ配列決定用にはこれらのＰＣＲ産物を、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ イージー・ベクター・システム（Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅ
ｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化した。正しいフラグメントを
制限消化し、発現ベクターｐＫＣ６０にクローン化した。これら三つのすべての
フラグメントにおいて、Ｃα鎖フラグメントはシステイン残基で終わっていた。
この「最後」のシステインはセリン残基に変えられたが、内部のシステインは突
然変異されなかった。最終的な構築物ｐＫＣ７３はＣ−α鎖の２２アミノ酸を、
ｐＫＣ２４は７２アミノ酸を、またｐＫＣ７５は９０アミノ酸（すなわち完全な
Ｃ−α鎖）を有する。ｐＫＣ７３、ｐＫＣ７４、およびｐＫＣ７５ＤＮＡベクタ
ーのインサートは、第９Ａ図に概略説明されている。

【０１５０】 Ｖ−β Ｃ−β鎖は、プライマーＪＷＴＣＲ２２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６
０）およびＪＷＴＣＲ２０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５）を用い、５’Ｓｆｉ
Ｉ−３’ＸｍａＩフラグメントとしてＰＣＲ増幅された。それは配列され、（鎖
のみのネガティブコントロール）として発現ベクターにクローン化した。

【０１５１】 実施例５ 可溶性Ｄ０１１．１０ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の哺乳類細胞にお
ける構築および発現 有意な量の可溶性ｓｃ−ＴＣＲを産生することが非常に望ましい。可溶性タン
パク質の発現のレベルを亢進するため、ｓｃ−ＴＣＲ構築物を哺乳類細胞の発現
系にクローン化した。

【０１５２】 上記の実施例３Ａ、Ｅに記述したように調製された大腸菌ＤＮＡ構築物ｐＫＣ
６０およびｐＫＣ６７を、プライマーＫＣ１６９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４３
）およびＫＣ１７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４４）を用いたＰＣＲにより再増
幅して５’−Ａｇｅｌ−３’ＢｓｔＢＩｓｃ−ＴＣＲ−ＩｇＧカッパ鎖（Ｃκ）
融合遺伝子とした。ＴＣＲ−ＩｇＣκ発現ベクターの構築は以下のとおりである
：ベクターのバックボーンはプラスミドｐＣＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））であった。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ
で切断し、「Ｌ鎖ポリリンカー」ＤＮＡフラグメントを挿入して出発「Ｌ鎖ベク
ター」とした。このリンカーは制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＣｌａＩ、
ＰｍｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｇｅＩ、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＸｈｏＩを含
んでおり、プラスミドｐＣＤＮＡ．ＬＣＰＬを生じるためのその後の工程を容易
にした。Ｌ鎖リーダー、抗ＣＫＭＢカッパＬ鎖ゲノムフラグメント、および３’
ＵＴＲを含んでいるＳｍａＩ／ＢｃｌＩＤＮＡフラグメントをｐＣＤＮＡ３．Ｌ
ＣＰＬのＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。このフラグメント内の
マウスカッパイントロン、エクソン、および３’ＵＴＲはＲｉｃｈｒｄ Ｎｅａ
ｒ博士より受領したｐＮｅｏ／２６−ＩＯＶＬに由来する（Ｎｅａｒ，Ｒ．等（
１９９０）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：９０１−９０９）。次いでＮｒｕ
Ｉ（２０９ｂｐ）、ＭｌｕＩ（２２９ｂｐ）、およびＢｓｔＢＩ（２９６２ｂｐ
）を除去するべく、またＮｈｅＩ（１２２９ｂｐ）およびＢａｍＨＩ（１２１４
ｂｐ）部位を挿入するべく、突然変異誘発を行ない、ｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＬＣ
ＰＬ．ＬＣＶＫを生じた。

【０１５３】 次にこのベクターを、可変部のＬ鎖ＣＫＭＢのＶκをベクターから除去するべ
くさらに修飾した。 このことは、プラスミドｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＬＣＰＬ．ＬＣＶＫをＥｃｏＲＶ
／ＸｈｏＩで消化することと、ＥｃｏＲＶ、ＡｇｅＩ、ＢｓｔＢＩ、およびＸｈ
ｏＩ部位を含んでいるリンカーオリゴヌクレオチドフラグメントを挿入すること
により行なわれ、ｐＳＵＮ９を生じた。

【０１５４】 Ｄ０１１．１０ｓｃ−ＴＣＲを、プライマーセットＫＣ１６９前向き（５’ｇ
ＡｇｇＴｇ ＡＣＣ ｇｇＴ ｇＡｇ Ｃａｇ ＴＡＣ ｇ ＴＴＴ ｇＴＣ
ＴｇＣ Ｔｃｇ ｇＣＣ ＣＣＡ ｇ−３）およびＫＣ１７０後ろ向き（５’ｇ
Ｔｇ ｇＡｇ ＴＴＣ ｇＡＡ Ａａｇ ＴｇＴ ＡＣＴ ＴＡＣ ｇ ＴＴＴ
ｇＴＣ ＴｇＣ Ｔｃｇ ｇＣＣ ＣＣＡ ｇ−３）を用いたＰＣＲ増幅の後
、ＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩフラグメントとしてｐＳＵＮ６ベクターにクローン化し
、ｐＳＵＮ２７ベクター（ｐＫＣ６０−Ｍ）を構築し、さらにこのベクターをｓ
ｃ−ＴＣＲ−κ定常部の融合タンパク質として発現させた。

【０１５５】 ｐＳｕｎ２７鋳型ＤＮＡもまた、プライマーＫＣ１６９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１４３）およびＫＣ２０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４５）を用いたＰＣＲに
より増幅することができ、ＩｇＧカッパ融合のない５’ＡｇｅＩ−３’ＢｓｔＢ
Ｉｓｃ−ＴＣＲを生じた。ｐＫＣ７３、ｐＫＣ７４、およびｐＫＣ７５ＤＮＡも
またいずれかのプライマーペアを用いてＰＣＲ増幅することができ、安定な哺乳
類の発現ベクターに連結するためのｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−ＴＣＲ−ＩｇＧ
Ｃκ融合フラグメントを生じた。

【０１５６】 例として、Ｄ０１１．１０ｓｃ−ＴＣＲ−ＩｇＧ Ｃκ融合フラグメントは、
ＤＮＡ配列決定のためｐＧＥＭ−Ｔ イージー・ベクター・システム（プロメガ
）にクローン化された。正しいフラグメントを制限消化し、哺乳類の発現ベクタ
ーにクローン化した。結果として得られた哺乳類の発現ベクターは、ＣＭＶプロ
モーター、ネオマイシン抵抗性遺伝子、マウスＩｇＧカッパリーダーペプチド、
マウスカッパイントロン、およびマウスカッパ定常部領域エクソン配列を含む。
結果として得られたベクターを、ｐＫＣ６０−Ｍ（ｐＳＵＮ２７）およびｐＫＣ
６７−Ｍと名付けた。これらのベクターのｓｃ−ＴＣＲインサートは、第９Ａ図
に図解されている。このベクターは第１０図に図解されている。

【０１５７】 ＣＨＯ細胞は、冷却したＰＢＳを用いて洗浄することによりトランスフェクシ
ョン用に調製した。細胞をＰＢＳに懸濁し、ＰｖｕＩで直鎖化した１０〜４０μ
ｇのｐＫＣ６０ＫＭと混合した。氷上での１０分間の後、２５０ボルト、９６０
μＦｄの１パルスを加えるべくセットされたジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕ
ｌｓｒ）（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））用いて細胞を電気穿孔した。パルス
した細胞を氷上に置き、１０％ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ
グルタミン、５０００単位／ｍｌのペニシリン、５０００ｕｇ／ｍｌのストレプ
トマイシン）を加えた。細胞を希釈し、９６穴プレートにプレーティングした。
１０％ＣＯ_２を用いて３７℃にて一晩インキュベートした後、およびその後３〜
７日ごとに、ネオマイシン選択培地（ＩＭＤＭ、０．７７ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８
）を細胞に与えた。細胞とＰＢＳのみを用い、ネガティブコントロールとして「
模擬」トランスフェクションを行なった。

【０１５８】 トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を、可溶性ｓｃ−ＴＣＲ
−ＩｇＧ Ｃκ分子の発現について、抗イディオタイプ、Ｄ１１．１０ ＴＣＲ
ｍＡｂ、ＫＪ−１を用いてＥＬＴＳＡ分析の方式でスクリーニングした。ｓｃ−
ＴＣＲについての先に公表された報告は、機能性ＴＣＲと抗イディオタイプｍＡ
ｂに対する結合との間の強い相関関係、すなわち抗イディオタイプｍＡｂによっ
て認識されるｓｃ−ＴＣＲがＭＨＣと結合しているペプチドを基本的に認識する
ことができること、を証明した。Ｒｅｌｔｅｒ，Ｙ．等、（１９９５）Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ２，２８２−２８７参照。トランスフェクタントをスクリーニングする
ため、重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２中のＫＪ−１を用いて、９６穴プレ
ートを一晩受動的にコートした。分析当日に、プレートを３〜５％の無脂粉乳（
ＮＦＤＭ）を用いて最低１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、トランスフェク
タントからの上清をプレートに加えた。インキュベーションおよび洗浄の後、ビ
オチニル化した抗ＣβｍＡｂ Ｈ５７−５９７（ＡＴＴＣ受け入れ番号Ｎｏ．Ｈ
Ｂ−２１８）を３０分間にわたってプレートに添加し、続いて洗浄およびストレ パビジン （ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰと共にインキュベートした。陽性
のウェルをＴＭＢ基質の添加により同定し、１Ｎ硫酸を用いて失活させ、４５０
ｎｍの吸収を読み取った。大腸菌において産生された精製されたｓｃ−ＴＣＲを
標準試料とした。

【０１５９】 複数のポジティブなトランスフェクタントが同定されたが、最も希釈されたプ
レートからのクローンのみを選択して増殖用とした。元の９６ウェルからの継代
に先立ち、４つのクローンをＥＬＩＳＡにより再検査した。この最初の定量的ス
クリーニングを基準とすると、クローンは可溶性のＤＯ１１．１０ｓｃ−ＴＣＲ
−ＩｇＧ Ｃκを２００〜４００ｎｇ／ｍｌの範囲で産生している。このデータ
は、可溶性ｓｃ−ＴＣＲ−ＩｇＧ Ｃκ融合タンパク質が正しく折りたたまれた
ＶαおよびＶβペアを有することを強く示唆している。

【０１６０】 ｐＳＵＮ２７ベクターはブタペスト条約にしたがって前文に開示した住所のＡ
ＴＣＣに寄託された。当該ＤＮＡベクターは１９９７年９月１７日にＡＴＣＣに
寄託され、受け入れ番号２０９２７６を与えられた。ｐＳＵＮ２７ベクターはＣ
ＭＶプロモーター、マウスＬ鎖リーダー配列、コザックのコンセンサス配列、お
よびマウスＣκ遺伝子イントロン、およびエクソン配列を含む。第１０図および
Ｎｅａｒ等、前出参照。

【０１６１】 ｐＳＵＮ２７ベクターは種々のｓｃ−ＴＣＲ分子に対し、マウスＣκ鎖への融
合を可能にするべく設計されている。たとえば、所望のｓｃ−ＴＣＲ分子をｐＳ
ＵＮ２７ベクターに挿入するためには、このベクターのポリリンカー配列は制限
酵素ＡｇｅＩおよびＢＳＴＢＩを用いて消化され、かつＡｇｅＩおよびＢＳＴＢ
ＩまたはＣｌａＩにより消化されたｓｃ−ＴＣＲ分子に連結されることが可能で
ある。さらに、ｐＳＵＮ９ベクターは、いくつかのＩｇ−Ｃ_Ｌ鎖または他のＩｇ
−Ｃ_Ｌ鎖のフラグメントを収容することができる。たとえば、ヒトＣκ鎖を含ん
でいる可溶性融合タンパク質を構築するためには、ｐＳＵＮ９ベクターはＢＳＴ
ＢＩとＸｈｏＩとを用いて消化される。ヒトカッパフラグメントはベクターｐＤ
ＲＨＫからＥｃｏＮＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化により得られ、ｐＳＵＮ
９ベクターのＢＳＴＢＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化される。

【０１６２】 ｐＤＲＨＫベクターはブタペスト条約にしたがい、前文に明記した住所のＡＴ
ＣＣに寄託された。当該ＤＮＡベクターは、１９９７年９月１７日にＡＴＣＣに
寄託され、受け入れ番号２０９２７４を付与された。ｐＤＲＨＫベクターは哺乳
類の発現ベクターであり、ＣＭＶプロモーター、マウスＩｇＣカッパリーダー鎖
ペプチド、クローニング領域、マウスカッパイントロン、およびヒトカッパ定常
部ドメインのエクソン配列を含む。

【０１６３】 第１２図はＣＨＯ細胞によって産生された単鎖のＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）−
カッパ融合物のウェスタン法を示す。親和性による精製の前に採取された上清（
レーン２）および貫流した分画（レーン３）。５μｌｍの試料を２倍のＳＤＳ分
解緩衝駅と１：１の割合に混合し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で変性および非還
元条件の下に流した。タンパク質は二段階の検出システムを用いて検出された。
第一に、ビオチンで標識したＨ５７ｍＡｂを１：５０００の希釈にて用いてプロ
ーブし、次いでストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：２５０
０）と共にインキュベートした。データはＣＨＯ細胞によるｓｃ−ＴＣＲカッパ
融合物の発現を示しており、培養上清からｓｃ−ＴＣＲカッパ融合物を効果的に
除去するべく、ＣＮＢｒで活性化されたセファロースビーズに結合したＨ５７ｍ
Ａｂを使用することができることを示唆している。

【０１６４】 第１３図は精製したｓｃ−ＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）−カッパ鎖融合物のウェ
スタン法を示す。ｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物（第１２図参照）を含んでいる培
養上清３００ｍｌを、Ｈ５７ｍＡｂアフィニティーカラムに通した。続いて標準
的なアフィニテシークロマトグラフィーの手順を行ない、ｓｃ−ＴＣＲ−カッパ
融合物を０．１ＭグリシンｐＨ３．０においてカラムから溶出した。レーン１は
大腸菌で産生されたｓｃ−ＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）を表しており（ポジティブ
コントロール）、約５０キロダルトン（ｋＤ）のところに移動する。レーン２〜
４は精製されたｓｃ−ＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）−カッパ融合物の希釈を表して
おり、最も濃いもの（レーン２）から最もうすいもの（レーン４）に進んでいく
。膜は第１２図に述べたものと基本的に同じ方法でプローブした。

【０１６５】 第１４図は精製されたたｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物のクーマシーブリリアン
トブルー染色を示す。精製は二つの抗体のアフィニティーカラムを用いて行なっ
た。第一の工程として、ｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物を含んでいる培養上清をＫ
Ｊ−１抗体カラムに通した。ＫＪ−１は抗クロノタイプｍＡｂであり、ＤＯ１１
．１０ＴＣＲの正確に対合したＶａＶｂ鎖を認識する。レーン１（最も濃い）な
いしレーン３（最もうすい）は、精製されたｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物のアリ
コートを表している。精製されたｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物を含んでいる分画
をＫＪ−１カラムからプールした後、次に試料をＨ５７ｍＡｂカラムに通した。
レーン５および６は正しい大きさのタンパク質分子の濃縮を例示している。試料
は変性および非還元条件下に１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、終了後にゲルをク
ーマシーブリリアントブルーで染色した。

【０１６６】 ３ドメインｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物および４ドメインｓｃ−ＴＣＲ−カッ
パ融合物の一過性発現の研究を行なった。ＣＯＳ細胞を、３ドメインｓｃ−ＴＣ
ＲのｐＫＣ６０−Ｍ（ｐＳＵＮ２７）か、または４ドメインｓｃ−ＴＣＲのｐＫ
Ｃ７５−Ｍ、のいずれかのプラスミドにより一過性にトランスフェクトした。４
８時間後、１ｍｌの培養上清を０．５μｇのｍＡｂ Ｆ２３．１（抗Ｖｂ８．２
）と共に一晩インキュベートした。翌日、ｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物とＦ２３
．１との間に形成された免疫複合体を、ヤギ抗マウスでコートした磁気ビーズ（
ダイナル（Ｄｙｎａｌ））を用いて沈殿させた。多数回洗浄の後、ビーズを１０
ｕｌの１倍のＳＤＳ分解緩衝液に懸濁し沸騰させた。変性および非還元条件下で
の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動およびタンパク質の移動の後、ｓｃ−Ｔ
ＣＲ−カッパ融合分子用のナイロン膜のプロービングを、ビオチン標識したＨ５
７ｍＡｂおよびストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体とを用いて行なった。結果は
第１５図に描かれている。レーン１は、模擬トランスフェクトされたＣＨＯ細胞
からの上清とインキュベートしたネガティブコントロールのＦ２３．１であり；
レーン２はｐＳＵＮ２７（３ドメインｓｃ−ＴＣＲ、Ｖα−ＶβＣβ−カッパ融
合物からなる）；レーン４および５は、二つの異なるｐＫＣ７５−Ｍ分離株（４
ドメインｓｃ−ＴＣＲで、さらにＣαフラグメントを含む）を表す。有意に、４
ドメイン−ｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物は３ドメインｓｃ−ＴＣＲよりもたとえ
より良くはなくても同程度には発現されており、またｐＳＵＮ２７ｓｃ−ＴＣＲ
−カッパ融合物とは異なり、ｐＫＣ７５−Ｍ融合物はホモダイマーならびにモノ
マーの両者として明らかに等しい割合で存在する。

【０１６７】 第１６図は、一過性に発現されたｓｃ−ＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）−カッパ融
合物の変異体のＥＬＴＳＡを示す。ｓｃ−ＴＣＲ融合物の分析はサンドウィッチ
型ＥＬＩＳＡを用いて行ない、その中でＫＪ−１抗クローン型ｍＡｂは捕捉用に
用いられ、ビオチン標識Ｈ５７ｍＡｂおよびストレパビシン−ＨＲＰは、結合し
たｓｃ−ＴＣＲ−カッパ融合物の検出に用いられた。

【０１６８】 第１７図は哺乳類細胞によるｓｃ−ＴＣＲ（ｐ−１４９）−カッパ融合タンパ
ク質の発現を示す。Ｖα２．３に特異的なｍＡｂでウェルをコートし、結合した
ｓｃ−ＴＣＲ融合物をｍＡｂ抗Ｖβ１１またはｍＡｂＨ５７のいずれかを用いて
検出した。

【０１６９】 第１８図はＣＯＳ細胞におけるｓｃＴＣＲｐ１４９およびｓｃＴＣＲｐ１４９
カッパ融合タンパク質の一過性の発現を示す。ｓｃＴＣＲの設計は、カッパ定常
ドメインを含むか含まないＶα−Ｃ_α８．２−Ｖβ／Ｃβであった。発現された
タンパク質はサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡを用いて検出されたが、その中で細胞
はα−Ｖα_２．１ｍＡｂでコートされ、リセプターはα−Ｖ_{β１１．０}ビオチン
標識ｍＡｂおよびストレオタビシン（ｓｔｒｅｏｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰとの
結合により結合体として検出された。

【０１７０】 実施例６ 大腸菌における可溶性ｐ−１４９ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の構築
および発現 Ｔ細胞クローンであるｐ−１４９は、ＨＬＡ−Ａ２．１．により制限されるＨ
ｕ野性型ｐ５３のペプチド（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ）を認識する。Ｔｈｅｏｂａｌ
ｄ等、（１９９５）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９２，１１９９３−１１９９７参照。Ｔ
細胞受容体遺伝子を、あらかじめ可溶性ＴＣＲおよび機能性受容体分子を産生す
ることが示された３ドメイン単鎖型にクローン化した。要約すれば、Ｔ細胞クロ
ーンからｍＲＮＡを単離し、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いてｃＤＮＡを作
成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫＣ１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１３４）およびＫＣ１７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３６）を用いたポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いて５’ＳｆｉＩ−３’ＳｐｅＩ Ｖ（鎖フラグメ
ントとし、再度プライマーＫＣ１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４）およびＫＣ
１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３７）を用いて同様なＶ（Ｃ鎖の７アミノ酸が
含まれているフラグメントを産生した。次いで同様のｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型と
して、プライマーＫＣ１７２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３５）およびＫＣ１７６
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３８）と共に用いて５’ＸｈｏＩ−３’ＸｍａＩ Ｖ
βＣβ鎖フラグメントを生成した。Ｃβ鎖を、完全長のＣβ鎖のアミノ酸１２７
のシステイン残基の直前で切り取った。

【０１７１】 αおよびβ鎖フラグメントをＤＮＡ配列決定用のｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ Ｖｅ
ｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍにクローン化した。正確なフラグメントを制限消化し、
発現ベクターｐＫＣ６０またはｐＫＣ６７にクローン化してＶα−（Ｇ_４Ｓ）_４ −ＶβＣβｓｃ−ＴＣＲ分子とした。

【０１７２】 単鎖分子をコード化している先の遺伝子フラグメントを脱落させるべく、また
ｐ−１４９αおよびβ鎖フラグメントとの連結を可能にするべく、ｐＫＣ６０お
よびｐＫＣ６７ベクターを適当な制限酵素を用いて消化した。この新しいベクタ
ーをｐＮＡＧ１およびｐＮＡＧ２と名付けた。ｐＮＡＧ１およびｐＮＡＧ２ベク
ターのＤＮＡ挿入を第９Ｂ図に例示する。

【０１７３】 ＶβＣβ遺伝子を含んでいるＤＮＡフラグメントを、プライマーＫＣ１９９（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３９）およびＫＣ１７６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３８
）を用いて、５’ＳｆｉＩ−３’ＸｍａＩフラグメントとしてＰＣＲ増幅した。
これを配列し、β鎖のみのネガティブコントロールとして発現ベクターにクロー
ン化した。

【０１７４】 Ｋ９１大腸菌細胞をｓｃ−ＴＣＲ構築物ｐＮＡＧ１を用いてトランスフォーム
した。トランスフォームした細胞を、タンパク質の誘導を妨げるべく高リン培養
液中で一晩生育させ、次いでリン酸欠乏培地にて洗浄および再懸濁してｓｃ−Ｔ
ＣＲタンパク質が発現されるようにした。要約すれば、シェーカーフラスコ内で
一晩生育させた後、細胞をリン酸欠乏培地にて数回洗浄した。ｓｃ−ＴＣＲ融合
タンパク質の発現は、洗浄した細胞をリン酸欠乏培地に再懸濁することにより開
始された。約４時間の誘導の後、細胞を回収した。典型的には４時間の誘導時間
は、たとえばウェスタン分析法により測定されるような、適切なレベルの可溶性
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を生じた。ｐｈｏＡプロモーターの支配下における
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のより高い生産量（たとえば約１０から４００ｍｇ
までの間）は、３および１０リットルの発酵槽か、またはバイオリアクターのよ
うな他の大量調製用の容器にて増殖させることにより取得することが可能である
。

【０１７５】 ゆっくりした誘導条件下では、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現が融合タン
パク質の可溶性の発現を促進することが発見された。

【０１７６】 実施例７ 哺乳類細胞における可溶性ｐ−１４９ ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質
の構築および発現 大腸菌ＤＮＡの構築物ｐＮＡＧ１およびｐＮＡＧ２を鋳型ＤＮＡとし、プライ
マーＫＣ２０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４０）およびＫＣ２０４（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．１４１）と共にＰＣＲに用いて、５’ＡｇｅＩ−３’ＣｌａＩ ｓｃ
−ＴＣＲ−カッパ鎖融合フラグメントを生成した。同様の鋳型ＤＮＡは、プライ
マーＫＣ２０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４０）およびＫＣ２０５（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．１４２）を用いたＰＣＲにより増幅され、カッパ鎖のない発現用の５
’ＡｇｅＩ−３’ＣｌａＩｓｃ−ＴＣＲを生成することが可能である。

【０１７７】 当該ＤＮＡを用いて哺乳類細胞をトランスフェクトし、ｓｃ−ＴＣＲタンパク
質の発現についてＥＬＩＳＡ分析によりスクリーニングした。

【０１７８】 実施例８ ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質株の産生 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の可溶性の発現を最大にするためには、特定の大
腸菌株を選択することが望ましい。たとえば、いくつかの周知の大腸菌株を、ｓ
ｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現能について分析することができる（たとえば、
ＸＬ１−Ｂ、ＭＭ２９４、ＴＢ１、ＵＴ５６００、およびＫ９１Ｋａｎ）。要約
すれば、宿主細胞をたとえばｐＫＣ６０、ｐＫＣ７３、ｐＫＣ７４、またはｐＫ
Ｃ７５を用いてトランスフォームし、コード化されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク
質の発現に有利な条件下に生育させることができる。次いでトランスフォームさ
れた株をリン酸培養液中での３０℃における生育に適合させる。ｓｃ−ＴＣＲ融
合タンパク質の誘導は、リン酸を欠く培地中での生育により行なわれる。ｓｃ−
ＴＣＲ発現のレベルは、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を特異的に認識する抗体を
用いてプローブされたウェスタン法を含むいくつかの常法により測定することが
できる。

【０１７９】 要約すれば、トランスフォームした細胞の５ＯＤ／ｍｌの細胞懸濁物５ｕｌを
１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加することによりウェスタン法を行ない、標
準的なウェスタン法の技術にしたがってブロットに移した。ｓｃ−ＴＣＲはたと
えば、カリフォルニア州サンディエゴの、サンディエゴ大学Ｇｅｒｎｏｔｏ Ｗ
ａｌｔｅｒ研究室から認可された抗ＥＥｔａｇ抗体を用いたブロットのプロービ
ングにより検出される。別法として、他のＥＥｔａｇ抗体およびＥＥｔａｇを用
いてもよい（たとえばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から取得したもの）
。抗体の結合に続き、ヤギ抗マウスＨＲＰ標識結合体（ジャクソン・ラボラトリ
ーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））が添加された。

【０１８０】 米国係属出願第０８／８１３，７８１号では、大腸菌Ｋ９１ＫＡＮ株がｓｃ−
ＴＣＲ分子を含む融合タンパク質の発現、特にｐＫＣ６０ベクターに好都合であ
ることを発見した。Ｋ９１ＫＡＮ株は、有意な量の本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タ
ンパク質を産生してもよい。

【０１８１】 実施例９ ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の精製 本文に開示されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、もし所望であれば、形質転
換された細胞から常法にしたがった免疫親和性クロマトグラフィーにより精製す
ることができる。バクテリオファージ外皮タンパク質を含んでいるｓｃ−ＴＣＲ
融合タンパク質の精製の概要は、米国係属出願第０８／８１３，７８１号に開示
されている。

【０１８２】 要約すれば、一つの適切な精製の概要は以下のようになる。クロマトグラフ用
カラムは、プロテインＡでコートしたセファロースビースのｍｌ当り約５ｍｇの
ハムスター抗マウスαβＴＣＲ抗体Ｈ５７−５９７（ＡＴＴＣ受け入れ番号ＨＢ
−２１８）に結合することができる。大腸菌溶解産物は、１００ｍｌの可溶化緩
衝液（０．０５Ｍトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、および５ｍＭＥＤ
ＴＡ中の発酵槽由来の細胞ペースト５０ｇを可溶化することにより調製される。
再懸濁した細胞を、フレンチプルスに２回通すことにより溶解する。不溶性物質
を１０，０００ｇにて２０分間遠心することによって除去する。上清を保持し、
０．２ｍｌ／分の流速で抗体カラムにかける。続いてカラムを、カラムの２０倍
量のＰＢＳを用いて洗浄し、結合したｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を０．１Ｍグ
リシンｐＨ３．０で溶出し、１ｍｌの分画を０．０５ｍｌの２Ｍトリス、ｐＨ８
．０を含んでいる試験管に集める。ｓｃ−ＴＣＲを含んでいる分画をプールし、
４リットルのＰＢＳに対して一晩透析する。翌日、精製されたタンパク質をセン
トリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ろ過装置（分子量１００を削除）を用いて５な
いし１０倍に濃縮する。

【０１８３】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＲゲルでの電気泳動とそ
れに続くクーマシーブリリアントブルー染色等のいくつかの既知の方法により純
度を評価することができる。タンパク質の完全性は、上記の実施例５に開示した
方法によるか、または抗体Ｈ５７−５９７を用いることにより測定することがで
きる。別法として、操作可能に結合されたＥＥｔａｇを含んでいるＤＮＡベクタ
ー用に、ＥＥｔａｇ抗体をプローブとして使用することができる。ＥＥ抗体は９
アミノ酸の直鎖エピトープを認識する。抗Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）ＥＥＥＥＹＭ
ＰＭＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９８）。

【０１８４】 実施例１０ ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の特徴づけ 米国係属出願第０８／８１３，７８１号に開示された以下の分析法を用いて本
発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を特徴づけることができる。

【０１８５】 Ａ． 分子量 ＤＯ１１．１０融合タンパク質について実施例５で言及したように、他のｓｃ
−ＴＣＲ融合タンパク質の分子量は通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動とそれ
に続く銀染色またはクーマシーブリリアントブルー等の染色により測定すること
ができる。米国出願第０８／８１３，７８１号はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用
いたｓｃ−ＴＣＲ分子の分子量測定の実例を与えている。一般に、ほとんどのｓ
ｃ−ＴＣＲタンパク質の分子量は４０ないし６０Ｋｄといった範囲内にあること
が期待され、好ましくは４５ないし５８Ｋｄである。 Ｂ． 抗体の競合 抗αβＴＣＲｍＡＢのパネルを用い、本文において開示された、特にマウスカ
ッパ鎖を含んでいるｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を特徴づけることができる。た
とえば、ハムスターｍＡｂ Ｈ５７−５９７は、Ｃ−β領域上のエピトープを認
識することができる。競合試験は、単鎖の可変鎖上に相接して位置するエピトー
プに結合する選択された抗体間の競合作用を分析するべくおこなうことが可能で
ある。たとえば、ＭＲ５−２およびＨ５７−５９７抗体を用いて、適当なＶα、
Ｖβ領域を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎ）ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質上の
エピトープをマップすることができる。米国係属出願第０８／８１３，７８１号
に開示されたように、ＭＲ５−２およびＨ５７−５９７抗体は、相接して位置す
るエピトープを認識することが発見された。他の抗体を用いて、９アミノ酸のＥ
Ｅ配列等のタグを特異的に認識するものを含め、可溶性の融合タンパク質のｓｃ
−ＴＣＲ部分をさらに特徴づけることができる。 Ｃ．高次構造の折りたたみ 種々の抗イディオタイプｍＡｂを用いて本文に開示したｓｃ−ＴＣＲ融合タン
パク質におけるＶα、β領域の正確な折りたたみを検査することができる。たと
えば、米国出願第０８／８１３，７８１号に開示されたように、ｐＫＣ６０ＤＮ
Ａベクターによってコード化された融合タンパク質は、抗Ｖ−β８．２抗体（Ｍ
Ｒ５−２およびＦ２３．１）の結合により、また抗イディオタイプｍＡｂ ＫＪ
１（ＫａｐｐｌｅｒおよびＭａｒｒａｃｋ両博士からの御懇切なる寄贈）を用い
て立証されるように、正確に折りたたまれていた。要約すれば、ｓｃ−ＴＣＲ融
合タンパク質を抗Ｖ−β８．２抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした後、
翌日にヤギ抗マウスでコートした磁気ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））との結
合を行なう。この材料を室温（ＲＴ）にてさらに１時間インキュベートする。免
疫複合体を標準的な手順にしたがって沈殿させた。非特異的に結合したタンパク
質を除去するべく、０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌを用いてビーズを多
数回洗浄した。４回洗浄した後、 ＳＤＳを含んでいる、β−２メルカプトエタ
ノールを含むか含まない分解緩衝液５０ｕｌ中に磁気ビーズを再懸濁し、３分間
沸騰させた。磁気ビーズを除去し、溶液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に装填し、
１２０ボルトにて１時間流した。試料は電気泳動され、この試料についてウェス
タン法を、抗ＴＣＲ抗体ＨＲＰ標識（フアルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
より取得されたＨ５７）または抗ＥＥタグ抗体を用いてブロットをプロービング
することにより行なった。 上記の実施例５は、Ｄ０１１．１０ｓｃ−ＴＣＲタンパク質融合物の正しい折
りたたみを検査するべく用いられた特異的な抗イディオタイプ抗体を開示してい
る。 Ｄ． 表面プラズモン共鳴（バイオコア（ＢｉｏＣｏｒｅ）） 表面プラズモン共鳴を用いて本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を特徴づけ
ることができる。たとえば、米国係属出願第０８／８１３，７８１号に開示した
ように、ｐＫＣ５１にコード化されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を、表面プラ
ズモン共鳴を用いて特徴づけることができる。融合タンパク質は、全般的に製造
業者の指示（ファルマシア）にしたがい、ＭＲ５−２またはＨ５７抗体のいずれ
かによりコートされたバイオセンサーチップ上のｓｃ−ＴＣＲ分子の第１の捕捉
による通常のサンドウィッチ型分析法において検出された。一般的に、もしｓｃ
−ＴＣＲ融合タンパク質を捕捉するために抗体の一つを用いたのであれば、他の
抗体はサンドウィッチ型複合体を形成するべく用いられた。データは、二つの抗
体が可変鎖の異なる領域を認識し、かつｓｃ−ＴＣＲへの結合に関して競合する
ことを示した。

【０１８６】 超抗原（すなわちＳＡｇ）は、ＭＨＣ型の表示とは無関係にいくつかのＶ−β
鎖と結合することができる。ＴＣＲとＳＡｇの間の相互作用は、Ｖ−β鎖の超可
変４（ＨＶ４）領域内で起こる。ＳＡｇのＨＶ４領域との相互作用は構造依存性
であるため、表面プラズモン共鳴を用いてｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質がチップ
にコートされたＳＡｇと結合するかどうかを決定することができる。ＳＡｇはＴ
ＣＲ Ｖ−β８．２に結合することが知られている。表面プラズモン共鳴を用い
て報告された最も高い親和性は５ｘ１０^−５モルであると信じられており、それ
ゆえＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチドの相互作用に匹敵する相互作用を作ることが可能
となる。

【０１８７】 超抗原に結合する単鎖可変領域を含んでいるｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を構
築することは本発明の範囲内にある。たとえば、米国係属出願第０８／８１３，
７８１号に開示したように、ＳＥＣ３（トキシン・テクノロジー（ＴｏｘｉｎＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、フロリダ州タンパ）として知られている連鎖球菌のＳＡ
ｇは、Ｖ−β８．２領域を含んでいるｓｃ−ＴＣＲ分子と結合する。開示された
ように、標準的なアミンのカップリング化学を用い、超抗原をチップに結合させ
た。精製された融合タンパク質は、約２ｕＭないし１６ｕＭの濃度範囲において
、２ｕｌ／分の流速でチップ上を通過した。対照として、融合タンパク質のブラ
ンクチップへの非特異的な結合を、ＳＥＣ３でコートされたチップへの特異的な
結合を測定する実験と平行して行なった。結合データは、二つのチップの間のｓ
ｃ−ＴＣＲ結合の差異を比較することにより集められた。データはｓｃ−ＴＣＲ
分子とチップ上のＳＥＣ３ＳＡｇとの間に特異的な相互作用があったことを示し
た。これらのデータは、ｓｃ−ＴＣＲが構造上正しいＶ−β８．２領域を含んで
いたことを示している。

【０１８８】 米国係属出願第０８／８１３，７８１号は、ＰＫＣ６０ベクターによって産生
された融合タンパク質がバイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）によって測定されたよう
に、ＳＥＣ３超抗原と結合することを開示した。関連するバイオコアの実験は、
正確な折りたたみを測定するべく、超抗原と結合することが可能な本発明のｓｃ
−ＴＣＲ融合タンパク質について行なうことができる。

【０１８９】 実施例１１ ＯＶＡ特異Ｔ細胞ハイブリドーマの結合分析における融合タンパク
質の活性 ｓｃ−ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を含んでいるＭＨＣ複合体の機能性を検
査するための分析は、前記のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６およ
びＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７、ならびに前記の米国係属出願、出願番号０８
／３８２，４５４に開示されている。また特に、公表されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／
ＵＳ９７／０１６１７は、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞分析法、かかる分析に用い
るための細胞（たとえば、Ｄ０１１．１０）、共有結合により結合したか、また
は非共有結合により結合した提示ペプチド（たとえば、ＯＶＡまたはＨＳＶのｇ
Ｄ１２ペプチド）を運んでいるｓｃ−ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を開示して
いる。

【０１９０】 先に開示された分析法は、本文に開示されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の機
能性を測定するために特に適している。一般的に言って、ｓｃ−ＴＣＲ融合タン
パク質の機能ならびに生物活性を測定するために用いることのできる分析法は、
細胞を基盤とする競合阻害分析法である。たとえば上記の実施例１および２で産
生された可溶性融合タンパク質は、ＤＯ１１．１０細胞を、超抗原またはＭＨＣ
分子という状況にある抗原に携わることから阻止するべく用いることができる。
先に開示された方法にしたがってＩＬ−２産生を測定することにより、この相互
作用を検出することができる。

【０１９１】 Ａ） Ｔ細胞ハイブリドーマの細胞分析法 Ｔ細胞ハイブリドーマの分析法は、公表されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９
５／０９８１６、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７、および米国係属出願、出願番
号０８／３８２，４５４に開示されている。当該分析法は、本発明のｓｃ−ＴＣ
Ｒ融合タンパク質の機能性を検査するべく容易に改造される。

【０１９２】 要約すれば、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞系は、１７アミノ酸の
ＯＶＡペプチドフラグメント（アミノ酸３２３〜３３９）に特異的な細胞表面の
Ｔ細胞受容体を発現する。ＯＶＡペプチドは、マウスクラスＩＩＭＨＣ分子Ｉ−
Ａｄを発現しているＡＰＣ（抗原提示細胞）によりＤＯ１１．１０細胞に提示さ
れる。当該ペプチドが適切なＡＰＣにより提示されると、ＤＯ１１．１０細胞は
ＩＬ−２を産生することによって応答するが、それを次にＴ細胞活性化の物差し
として用いることができる。代表的なＴ細胞ハイブリドーマの細胞分析法を以下
に要約して記述する：

【０１９３】 ｓｃ−ＩＡ^ｄ／ＯＶＡ複合体をｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質と共にＤＰＢＳ（
Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋イオンがない）に希釈し、９６穴プレートに受動的にコ
ートする。好ましくはｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡペプチドは共有結合により結合した
提示ペチドを含む。室温にて一晩インキュベートした後、ウェルをＭｇ^２＋およ
びＣａ^２＋イオンがないＤＰＢＳで２回洗浄してよい。約１ｘ１０^５個のＤＯ１
１．１０細胞を０．５μｇのＭＨＣ／ペプチド分子でコートしたウェルの存在ま
たは非存在下に３７℃において４または７時間インキュベートする。関連実験に
おいては、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をＤＯ１１．１０細胞と一緒に加えても
よい。

【０１９４】 ＤＯ１１．１０細胞に由来するｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質（上記の実施例１
および２参照）の特異性を証明するべく、第２のＴ細胞ハイブリドーマ細胞を用
いることができるが（ｇＤ）、これもまたＩＡｄに制限されるがＨＳＶペプチド
は認識する。ｇＤ Ｔ細胞ハイブリドーマは、公表されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９７／０１６１７に開示されている。この分析法を用いて、ｓｃ−ＴＣＲ融合
タンパク質が、ＤＯ１１．１０ハイブリドーマ細胞によるＩＬ−２産生を阻害す
ることができ、またｇＤ Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生に対しては
、もしあるとしてもほんの少ししか阻害効果を持たないこと、を証明することが
できる。培養は、９６穴平底マイクロタイタープレートにおいて、完全な培地（
１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを添加
したＲＰＭＩ １６４０）中で行なわれた。４または７時間のインキュベーショ
ンの後、培養上清をＩＬ−２サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の存
在について分析した。

【０１９５】 適切なＩＬ−２の検出用プロトコールは、前記の公表されたＰＣＴ出願番号Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７、ならびに前記米
国係属出願、出願番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に開示
されている。適切なＩＬ−２サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡプロトコールは、基本
的にはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎにより記述されたように行なわれたものである。要
約すば、ウェルを５０μｌの２μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＬ−２抗体でコー
トする。４℃にて一晩のインキュベーションの後、抗体は受動的な拡散によりプ
ラスチックに結合する。プルートをＰＢＳ／０．５％ツイーン２０にて２回洗浄
し、次いで１００μｌの細胞培養上清を各ウェルに加え、室温で４時間インキュ
ベートする。次に、ビオチニル化したラット抗マウスＩＬ−２抗体である第２抗
体の添加に先立ち、プレートをＰＢＳ／ツイーン中にて６回洗浄する。この抗体
をＲＴにて１時間インキュベートし、次にプレートをＰＢＳ／ツイーンにて６回
洗浄する。最後に、２５ｕｇ／ｍｌのストレパビジン−ペルオキシダーゼ１００
μｌを各ウェルに添加し、ＲＴにて３０分間インキュベートする。ＰＢＳ／ツイ
ーンにて８回洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ基質を添加し、シグナルをＯＤ４０
５ｎｍにおいて読み取る。産生されたＩＬ−２の濃度を、ＩＬ−２の標準曲線に
対してプロットすることにより定量する。

【０１９６】 ＤＯ１１．１０およびｇＤ１２細胞の活性化のためのＩ−Ａ^ｄ／ペプチド分子
の最適濃度は、最大をわずかに下回る応答を提供するものである。ゆえに、実験
は０．５μｇのＩ−Ａ^ｄ／ペプチドでコートされたウェルと、４または７時間の
インキュベーションとを用いて行なってよい。

【０１９７】 一般的に、本発明の可溶性ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、約１０^−９から１
０^−４Ｍの濃度範囲にわたり、ＤＯ１１．１０細胞におけるＩＬ−２産生の阻止
能を検査することが可能である。検査は、可溶性ｓｃ−ＴＣＲとプレートにコー
トされた可溶性Ｉ−Ａ^ｄ／ペプチド分子とが、約１０：１ないし１：１のモル比
において行なうことができる。必要に応じ濃度を調整してもよい。最適な場合に
は、可溶性ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質とのプレインキュベーションの後の、ｇ
Ｄ１２のＩＬ−２産生に比較したＤＯ１１．１０のＩＬ−２産生の減少が、可溶
性ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質がＴＣＲに特異的な方式で免疫応答を抑制するこ
とが可能であることを示すこととなる。

【０１９８】 ＴＣＲはＭＨＣ／ペプチドについて低い結合の親和性を有するため、ｓｃ−Ｔ
ＣＲ融合タンパク質を阻害分析法に用いてＩＬ−２産生の減少を観察することは
常に可能というわけではないだろう。しかしながら相互作用の結合力は、以下に
記述するように多価のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を作成することにより亢進す
ることが可能である。ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の結合力を亢進すること（お
よびそれらの解離を妨害することにより）、より少ないＴＣＲがＭＨＣ／ペプチ
ド複合体に結合する機会を持つことになるであろう。

【０１９９】 実施例１２ 多価の融合タンパク質の調製 多価の分子の作成にはいくつかの周知の方法を利用することができる。多価の
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を標準的
な方法にしたがってビオチニル化することと、それに続きストレパビジンの添加
後に分子を架橋することにより産生することができる。ビオチン−ストレプトア
ビジン結合は、多価のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質、典型的には４量体型を産生
する。

【０２００】 本発明の多価のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質はまた、周知の方法にしたがって
融合タンパク質をラテックスビーズ（ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｉｎｃ．）ペンシルベニア州、ワーリントン）に共有結合することによって
も作成される（たとえば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｓ．Ｌ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（
１９９５）１５４，７５３参照）。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質はア
ミン基またはジスルフィド基を介してビーズに直接結合することができる。ｓｃ
−ＴＣＲの変性は、ストレパビジンまたはｓｃ−ＴＣＲを特異的に結合する抗体
のいずれかによりラテックスビーズをコーティングすることにより最少化するこ
とができる。たとえば、ＥＥ−ｔａｇ抗体は、上記のようにｓｃ−ＴＣＲがＥＥ
−ｔａｇを含む場合に、ラテックスビーズをコートするべく用いることができる
。

【０２０１】 実施例１３ インヴィトロでの抗原刺激されたＴ細胞の増殖に対するｓｃ−ＴＣ
Ｒ融合タンパク質の影響 本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、抗原刺激されたＴ細胞の増殖の抑制
能について調べることが可能である。

【０２０２】 たとえば、前記の公表されたＰＣＴ出願番号ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ／
ＵＳ９７／０１６１７、および米国係属出願、出願番号０８／３８２，４５４に
開示された代表的な方法においては、Ｔ細胞はまずマウス等の哺乳類から単離さ
れる。たとえば、ＯＶＡで初回抗原刺激を受けたＴ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス
（ＭＨＣクラスＩＩ：Ｉ−Ａｄ）から、完全フロイントアジュバント中の５０μ
ｇのＯＶＡ３２３−３３９−ＫＬＨを用いて尾の基部の皮下に免疫化することに
よって取得することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出参照）。たと
えば、２回の免疫化が７日間隔で行なわれ、２回目の注射の１週間後にマウスを
犠牲にして鼠径部の寄生的なリンパ節を切除し、分散させて単細胞懸濁液とした
。続いて単細胞懸濁液は、ナイロンウールおよびセファデックスＧ１０カラム上
でのインキュベーションにより、抗原提示細胞が除去されることが可能である。
精製されたＴ細胞の集団は、クリック（Ｃｌｉｃｋ）の培地のみか、またはクリ
ックの培地に溶解されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質と共にさらにインキュベー
トすることができる。

【０２０３】 ＢＡＬＢ／ｃマウスからの活性化されたＢ細胞を、通常のＢ細胞増殖分析法に
おいて、ＡＰＣとして使用することができる。たとえばＢ細胞は、脾臓細胞を５
０μｌ／ｍｌのＬＰＳ（すなわちリポサッカライド）と共に４８ないし７２時間
培養することにより調製することができ、その時点で活性化された細胞をフィコ
ール／ハイパック（ファルマシア）上での密度勾配遠心法により単離することが
できる。活性化されたＢ細胞を次いでＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを用いて３
時間にわたってパルスし、多数回洗浄し、パラホルムアルデヒドを用いて固定し
てＢ細胞の増殖を阻害し、さらに、精製されたＴ細胞のみかまたはＴ細胞プラス
可溶性ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質に添加した。全般的には、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８０）Ｂ
．Ｂ．ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳ．Ｍ．Ｈｉｉｇｉ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ会社
、サンフランシスコ、参照のこと。

【０２０４】 上記の実施例１〜２において調製されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を、ＡＰ
Ｃに対するＴ細胞の結合を阻害するべく添加することが可能である。

【０２０５】 標準的なＢ細胞の増殖分析法は、９６穴丸底マイクロタイタープレートにおい
て、３７℃、５％ＣＯ２下に３〜５日間にわたり行なうことができる。ウェルは
、培養終了の前の４時間にわたり、ＷＳＴ−１（ベーリンガー・マンハイム）試
薬を用いてパルスすることができる。次いで、培養物の光学密度を記録する。ｓ
ｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の存在下におけるペプチド反応性のＴ細胞の増殖の度
合は、免疫化に続いてマウスに起こったＴＨ細胞の応答（すなわちクローン増殖
）を暗示するものであろう。

【０２０６】 実施例１４ インヴィヴォでの抗原刺激されたＴ細胞の増殖に対するｓｃ−ＴＣ
Ｒ融合タンパク質の影響 本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を、前記の公表されたＰＣＴ出願番号Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、ならびに前記米国係属出願、出願番号０８／３８
２，４５４および０８／５９６，３８７において先に開示された方法にしたがっ
て、インヴィヴォでのＴ細胞クローンの増殖の阻害についてさらに検査すること
ができる。

【０２０７】 たとえば、三つの検査群を以下のように組み立てることが可能である：１５Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスをＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する免疫反応を誘導する
べく、フロイントの完全アジュバント中の約１０ないし１００ｕｇのＯＶＡ３２
３−３３９−ＫＬＨ結合体を用いて腹腔内（ＩＰ）に注射することができる。Ｏ
ＶＡ−ＫＬＨによる免疫化の１日前、および２日後に、マウスのうち５匹に、Ｐ
ＢＳ中の約１０ないし１００μｇの、Ｄ０１１．１０細胞由来のｓｃ−ＴＣＲ融
合タンパク質（実施例１および２）をＩＰに注射することができる。ｓｃ−ＴＣ
Ｒ融合タンパク質はＩ−Ａｄ／ＯＶＡ ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、抗原特
異Ｔ細胞に対し、ＴＣＲ分子による任務を減ずるかまたは除去することとなる。
残りの１０匹のマウスは対照として用いてよい。たとえば、５匹のマウスはＰＢ
Ｓを、さらに他の５匹はｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を受けてもよい。リンパ節
を切除し、分散して単細胞懸濁液とする。懸濁液は、ナイロンウールおよびセフ
ァデックスＧ１０カラム上でのインキュベーションにより抗原提示細胞を枯渇さ
せることができる。

【０２０８】 結果として得られた精製されたＴ細胞の集団を、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチ
ドを用いてパルスしたＡＰＣと共にインキュベートすることができる。ＢＡＬＢ
／ｃマウスからの活性化されたＢ細胞を、増殖分析法におけるＡＰＣとして用い
ることが可能である。Ｂ細胞は、マウス脾臓細胞を５０μｇ／ｍｌのＬＰＳと共
に４８ないし７２時間培養し、その時点で活性化された細胞をリンホプレプ（Ｌ
ｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）上での密度勾配遠心法によって単離することにより調製す
ることができる。次いで活性化されたＢ細胞をＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを
用いて３時間にわたってパルスし、多数回洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定
してＢ細胞の増殖を阻害しさらに、精製されたＴ細胞に添加することができる。

【０２０９】 Ｔ細胞の増殖分析法は、９６穴丸底マイクロタイタープレートにおいて３７℃
、５％ＣＯ_２下に３〜５日間行なうことができる。培養終了の４時間前にＷＳＴ
−１試薬を用いてウェルをパルスすることができ、次いで異なる吸収能が読み取
られる。この分析法におけるペプチド反応性Ｔ細胞の増殖の程度は、Ｔｈ細胞の
応答（すなわちクローンの増殖）が免疫化に続いてマウスに起きていることを暗
示するものであろう。ＯＶＡ−ＫＬＨまたはＨＳＶ−ＫＬＨによる免疫化と共に
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を同時注射することにより、ＨＳＶ反応性Ｔ細胞系
の増殖に影響することなく、ＯＶＡ反応性Ｔ細胞系のクローン増殖およびそれに
続くインヴィトロでの増殖の量を制限することが期待される。

【０２１０】 実施例１５ マウス自己免疫疾患の抑制 実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症の動物モデルとなる
べく一般に認識されているマウスの自己免疫疾患である。二つのタンパク質ミエ
リン塩基性タンパク質（ＭＢＰアミノ酸９１−１０３）およびプロテオリポプロ
テイン（ＰＬＰアミノ酸１３９−１５１）の脳炎誘発性領域が同定された。全般
的にはＭａｒｔｉｎ，Ｒ．等（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
０：１５３参照のこと。

【０２１１】 ＳＪＬマウス株においては、ＥＡＥは脳炎誘発性ペプチドまたはＭＢＰ反応性
Ｔ細胞の養子移入により、次に続く免疫化を発生させるべく誘導されることが可
能である。可溶性の抗ＭＢＰ９１−１０３または抗ＰＬＰ１３９−１５１Ｔ細胞
受容体を用いた処理がＴ細胞の活性化の後のＥＡＥの発生を予防するかどうかを
決定するため、ＳＪＬマウスにインヴィヴォで、ＭＢＰ９１−１０３またはＰＬ
Ｐ１３９−１５１反応性Ｔ細胞の芽細胞を注射することが可能である。かかるマ
ウスにおけるＴ細胞の増殖を検出するための適切な分析法は、前記の公表された
ＰＣＴ出願番号ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７ならびに
前記米国係属出願、出願番号０８／３８２，４５４に開示されている。

【０２１２】 前記の公表されたＰＣＴ出願番号ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ．ＵＳ９７／
０１６１７、ならびに前記米国係属出願、出願番号０８／３８２，４５４にさら
に開示されているように、ＳＪＬマウスにおいてフロイントの完全アジュバント
中の約４００μｇのＭＢＰ９１−１０３を用いて背中に免疫化することによりＥ
ＡＥを誘導することができる。１０ないし１４日後に、局所的に空になっている
リンパ節の細胞を上記のようにして回収し、２４穴プレートにおいて、１．５ｍ
ｌのＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ウシ胎児血清／１％ペニシリン／ストレプ
トマイシン／５０μｇ／ｍｌのＭＢＰ中において、ウェルあたり６ｘ１０^６細胞
の濃度にて培養した。インヴィトロの刺激から４日後、ＭＢＰ９１−１０３反応
性のＴ細胞をフィコール／ハイパック密度勾配（ファルマシア）により回収し、
ＰＢＳにて２回洗浄し、１．３ｘ１０^７細胞を各々のマウスに注射することがで
きる。

【０２１３】 脳炎誘発性のＭＢＰ９１−１０３反応性のＴ細胞を受けたマウスはさらに、０
、３、および７日に、ＭＢＰ９１−１０３に特異的なＶαβ鎖を含んでいるｓｃ
−ＴＣＲ融合タンパク質１００μｇ、ＰＬＰ１３９−１５１に特異的なｓｃ−Ｔ
ＣＲ融合タンパク質Ｖαβ鎖１００μｇ（ネガティブな対照）、または生理食塩
水（見かけの対照）をｉ．ｖ．に注射されることが可能である（全用量３００μ
ｇ）。ＭＢＰ９１−１０３＋ＩＡｓに反応性のｓｃ−ＴＣＲ分子がマウスにおい
てＥＡＥの発生を阻害することを確認するべく、臨床および組織学的な評価を行
うことができる。

【０２１４】 前記の公表されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９７／０１６１７、ならびに前記米国係属出願、出願番号０８／３８２，４５
４にさらに開示されているように、ＳＪＬマウスにおいてＰＬＰペプチド１３９
−１５１を用いてＥＡＥを誘導するべく、ＰＢＳに溶解したＰＬＰペプチド１３
９−１５１を用い、結核菌Ｈ３７Ｒａを４ｍｇ／ｍｌにて１：１の割合で含んで
いる完全フロイントアジュバントと混合してマウスを免疫化することができる。
したがってマウスは、１５２ｕｇのペプチドジュバント混合物を用いて注射され
てよい。同日および４８時間後に、すべての動物に４００ｎｇの百日咳毒素を与
えることができる。次いで、ＥＡＥの養子移入を前文に記したようにして行なう
。

【０２１５】 前文に述べた方法にしたがって（実施例１参照）、ＴＣＲＤＮＡを正常および
ＥＡＥ疾患のＳＪＬマウスから取得することができる。次いでＴＣＲＤＮＡを用
いて、マウスカッパ鎖またはその適当なフラグメントを含んでいる本発明のｓｃ
−ＴＣＲ融合タンパク質を構築するべく、適切なＤＮＡベクターに連結すること
が可能なｓｃ−ＴＣＲを構築することができる。それゆえＰＬＰまたはＭＢＰに
反応性のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質が発現されることが可能であり、もし所望
であれば上記の実施例にしたがって精製してもよい。ｓｃ−ＴＣＲは次にＥＡＥ
の発生を予防する能力について検査されてもよい。

【０２１６】 本発明をその好ましい態様に関連して述べてきた。しかしながら当業者にはこ
の開示を検討するにあたり、変更ならびに改良がこの発明の精神ならびに範囲内
で行なわれることが理解されよう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＪＲＳ１４９ベクターを示す図である。

【図２】 ＫＣ１２．２ベクター（１Ｂ）を示す図である。

【図３】 種々のＤＮＡベクターの構築を概説するフローチャートである。

【図４】 ｐＫＣ１２．２ベクターからのｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）、お
よびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクターの構築を概説するフローチャートである。

【図５】 ＰＥＮ２ ＤＮＡベクターを説明する図である。

【図６】 ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６７ ＤＮＡベクターの挿入物を示す図である。

【図７】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号１〜１６）

【図８】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号１７〜３０）

【図９】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号３１〜４５）

【図１０】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号４６〜６３）

【図１１】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号６４〜７９）

【図１２】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号８０〜９５））

【図１３】 以下に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌ
クレオチドプライマーを示す表である。（配列番号９６〜１００）

【図１４】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のＶ−β鎖を構築するために使用されたＤＮＡオ
リゴヌクレオチドプライマーを示す表である（配列番号１０１〜１１５）。

【図１５】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のＶ−β鎖を構築するために使用されたＤＮＡオ
リゴヌクレオチドプライマーを示す表である（配列番号１１６〜１３０）。

【図１６】 （９Ａ）ｐＫＣ６０−ｍ、ｐＫＣ６７−ｍ、ＰＫＣ７３−Ｍ、ｐＫＣ７４−ｍ
、ｐＫＣ７５−ｍ、および（９Ｂ）ｐＮＡＧ−１−ｍおよびｐＮＡＧ３−ｍの挿
入を示す図である。

【図１７】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を含む哺乳動物ＤＮＡ発現ベクターを示す図であ
る。ｓｃ−ＴＣＲ（”ｓｃ−ＴＣＲ改変体”）をコードするＤＮＡ挿入物は、マ
ウスκイントロンおよびマウスκエクソンに融合される。

【図１８】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌクレ
オチドプライマーを示す表である（配列番号７、１０、６０、７５、１３１〜１
４１）。

【図１９】 ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を構築するために使用されたＤＮＡオリゴヌクレ
オチドプライマーを示す表である（配列番号１４１〜１４５）。

【図２０】 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生されるｓｃ−ＴＣＲ
（Ｄ０１１．１０）κ融合タンパク質を示す、ウェスタンブロットである。

【図２１】 精製されたｓｃ−ＴＣＲ（Ｄ０１１．１０）κ融合タンパク質のウェスタンブ
ロットである。

【図２２】 精製されたｓｃ−ＴＣＲκ融合タンパク質の染色を示す、クマシーブリリアン
トブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。

【図２３】 ３個のドメインのｓｃ−ＴＣＲκ融合タンパク質および４個のドメインのｓｃ
−ＴＣＲκ融合タンパク質の一過性の発現を示す、ウェスタンブロットである。

【図２４】 ｓｃ−ＴＣＲ（Ｄ０１１．１０）κ融合タンパク質改変体の一過性の発現を示
す、ＥＬＩＳＡアッセイのグラフである。

【図２５】 ｓｃ−ＴＣＲ（ｐ−１４９）κ融合タンパク質の哺乳動物細胞発現を示す、サ
ンドイッチＥＬＩＳＡアッセイのグラフである。

【図２６】 ｐ１４９ｓｃ−ＴＣＲおよびＰ１４９ ｓｃ−ＴＣＲκ融合タンパク質の一過
性の哺乳動物細胞発現を示す、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイのグラフである
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒン・シー・ウォン アメリカ合衆国 フロリダ州 33332 フ ォート・ラウダーデイル 2966号

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有的に結合した免疫グロブリン
   軽鎖定常部領域又はそのフラグメントを含んでいる可溶性融合タンパク質であっ
   て、当該一本鎖Ｔ細胞レセプターはＶ−α鎖とＶ−β鎖とがペプチドリンカー配
   列によって共有的に結合しているものである可溶性融合タンパク質。
2. 【請求項２】 Ｖ−α鎖のＣ末端が上記ペプチドリンカー配列によってＶ−
   β鎖のＮ末端と共有的に結合している請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
3. 【請求項３】 Ｖ−β鎖のＣ末端が上記ペプチドリンカー配列によってＶ−
   α鎖のＮ末端と共有的に結合している請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
4. 【請求項４】 Ｖ−β鎖のＣ末端と免疫グロブリンの軽鎖定常部領域又はそ
   のフラグメントのＮ末端の間にＣ−β鎖又はそのフラグメントが更に共有的に結
   合している請求項２に記載の可溶性融合タンパク質。
5. 【請求項５】 Ｖ−α鎖のＣ末端とペプチドリンカー配列のＮ末端の間にＣ
   −α鎖又はそのフラグメントが更に共有的に結合している請求項２に記載の可溶
   性融合タンパク質。
6. 【請求項６】 Ｖ−α鎖のＣ末端とペプチドリンカー配列のＮ末端の間にＣ
   −α鎖又はそのフラグメントが更に共有的に結合している請求項４に記載の可溶
   性融合タンパク質。
7. 【請求項７】 Ｃ−α鎖フラグメントが約５から９０のアミノ酸長の間であ
   る請求項６に記載の可溶性融合タンパク質。
8. 【請求項８】 Ｃ−β鎖フラグメントが約５０から１２６のアミノ酸長の間
   である請求項６に記載の可溶性融合タンパク質。
9. 【請求項９】 ペプチドリンカー配列が約２から２５のアミノ酸長の間であ
   る請求項６に記載の可溶性融合タンパク質。
10. 【請求項１０】 免疫グロブリンの軽鎖定常部領域がＣκ鎖又はＣκ鎖のフ
    ラグメントである請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。
11. 【請求項１１】 Ｃκ鎖フラグメントが約９０から１１０のアミノ酸長の間
    である請求項１０に記載の可溶性融合タンパク質。
12. 【請求項１２】 共有的に結合している：１）Ｖ−α鎖、２）ペプチドリン
    カー配列、３）Ｖ−β鎖、４）Ｃ−β鎖のフラグメント、及び５）Ｃκ鎖、Ｃλ
    鎖又はこれらのフラグメントのうちの１つを配列中に含んでいる可溶性融合タン
    パク質。
13. 【請求項１３】 Ｖ−α鎖とペプチドリンカー配列の間にＣ−α鎖又はその
    フラグメントが更に共有的に結合してなる請求項１２に記載の可溶性融合タンパ
    ク質。
14. 【請求項１４】 可溶性融合タンパク質に少なくとも１個のタンパク質タグ
    が更に共有的に結合してなる請求項１２に記載の可溶性融合タンパク質。
15. 【請求項１５】 Ｃ−β鎖フラグメントとＣκ鎖、Ｃλ鎖又はこれらのフラ
    グメントの間にタンパク質タグが更に共有的に結合してなる請求項１４に記載の
    可溶性融合タンパク質。
16. 【請求項１６】 タンパク質タグを開裂し得る試薬に請求項１５に記載の可
    溶性融合タンパク質を接触させることによって産生される一本鎖Ｔ細胞レセプタ
    ー。
17. 【請求項１７】 Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖が細胞毒性Ｔ細胞上に存在するＴ細
    胞レセプターＶ鎖と少なくとも９０％の相同性を有している請求項１に記載の可
    溶性融合タンパク質。
18. 【請求項１８】 一本鎖Ｔ細胞レセプターＶ領域がヒト型化されている請求
    項１６に記載の一本鎖Ｔ細胞レセプター。
19. 【請求項１９】 一本鎖Ｔ細胞レセプターＣ領域がヒト型化されている請求
    項１８に記載の一本鎖Ｔ細胞レセプター。
20. 【請求項２０】 １）Ｖ−α鎖、２）Ｃ−α鎖又はそのフラグメント、３）
    ペプチドリンカー配列、４）Ｖ−β鎖、及び５）Ｃ−β鎖又はそのフラグメント
    が共有的に結合してなる一本鎖Ｔ細胞レセプター。
21. 【請求項２１】 エフェクター分子が更に共有的に結合してなる請求項１２
    に記載の可溶性融合タンパク質。
22. 【請求項２２】 エフェクター分子が細胞トキシン又は診断若しくはイメー
    ジングに適している検出可能な標識化された分子である請求項２１に記載の可溶
    性融合タンパク質。
23. 【請求項２３】 Ｖ−α鎖がペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖に共有
    的に結合してなる一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードしている第一の配列、 Ｃκ鎖、Ｃλ鎖又はこれらのフラグメントをコードしている第二の配列が更に
    前記第一の配列に共有的に結合しており、さらに第一の配列と作動可能に結合し
    たプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列を含んでなるＤＮＡセグメ
    ント。
24. 【請求項２４】 第一の配列によってコードされている一本鎖Ｔ細胞レセプ
    ターが、ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖のＮ末端にＶ−β鎖のＣ末端が
    共有的に結合してなる請求項２３に記載のＤＮＡセグメント。
25. 【請求項２５】 第一の配列によってコードされている一本鎖Ｔ細胞レセプ
    ターが、ペプチドリンカー配列によってＶ−α鎖のＮ末端にＶ−β鎖のＣ末端が
    共有的に結合してなる請求項２３に記載のＤＮＡセグメント。
26. 【請求項２６】 第一の配列によってコードされている一本鎖Ｔ細胞レセプ
    ターが、Ｖ−β鎖のＣ末端と上記第二の配列によってコードされているＣκ鎖、
    Ｃλ鎖又はこれらのフラグメントのＮ末端の間で共有的に結合したＣ−β鎖フラ
    グメントを更に含んでいる請求項２３に記載のＤＮＡセグメント。
27. 【請求項２７】 第一の配列によってコードされている一本鎖Ｔ細胞レセプ
    ターが、Ｖ−α鎖のＣ末端とペプチドリンカー配列のＮ末端の間で共有的に結合
    したＣ−α鎖フラグメントを更に含んでいる請求項２３に記載のＤＮＡセグメン
    ト。
28. 【請求項２８】 可溶性融合タンパク質をコードしている配列を含んでいる
    ＤＮＡセグメントであって、当該タンパク質配列は、１）Ｖ−α鎖、２）ペプチ
    ドリンカー配列、３）Ｖ−β鎖、４）Ｃ−β鎖フラグメント、及び５）Ｃκ鎖、
    Ｃλ鎖又はこれらのフラグメントのうちの１つが共有的に結合したものからなる
    ＤＮＡセグメント。
29. 【請求項２９】 Ｖ−α鎖とペプチドリンカー配列の間にＣ−α鎖フラグメ
    ントをコードしている配列を更に含んでなる請求項２８に記載のＤＮＡセグメン
    ト。
30. 【請求項３０】 リーダー配列、翻訳開始シグナル及びプロモーターをコー
    ドしている配列を更に含んでいる請求項２８に記載のＤＮＡセグメント。
31. 【請求項３１】 １つ又はそれより多くのタンパク質タグをコードしている
    配列を更に含んでいる請求項３０に記載のＤＮＡセグメント。
32. 【請求項３２】 プロモーターがｐｈｏＡでありそしてリーダーが大腸菌由
    来のｐｅｌＢでありそして遺伝子１０配列由来のリボソーム結合部位を更に含ん
    でなる請求項３０に記載のＤＮＡセグメント。
33. 【請求項３３】 プロモーターがサイトメガロウイルスエンハンサーエレメ
    ントに作動可能に結合しているサイトメガロウイルスプロモーターであり、そし
    て上記リーダーがマウスカッパー鎖リーダーである請求項３０に記載のＤＮＡセ
    グメント。
34. 【請求項３４】 請求項２０又は２８に記載のＤＮＡセグメントを含んでな
    るＤＮＡベクター。
35. 【請求項３５】 可溶性融合タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡベク
    ターを宿主細胞へ導入し、 当該融合タンパク質が発現しうる条件下で宿主細胞を培養培地中で培養し；そ
    して 宿主細胞又は培地から当該融合タンパク質を精製して可溶性融合タンパク質を
    分離することからなる、 免疫グロブリン軽鎖定常部領域又はそのフラグメントが一本鎖Ｔ細胞レセプタ
    ーに共有的に結合している可溶性融合タンパク質を分離する方法。
36. 【請求項３６】 更に、可溶性融合タンパク質と特異的に結合し得る抗体と
    、宿主細胞又は培養培地の抽出物を接触させることからなる請求項３５に記載の
    方法。
37. 【請求項３７】 一本鎖Ｔ細胞レセプターが免疫グロブリン軽鎖定常部領域
    又はそのフラグメントに共有的に結合している可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター融
    合タンパク質をコードする配列を含んでいるＤＮＡベクターを宿主細胞中へ導入
    し、 当該可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質が発現しうる条件下で培地
    中で宿主細胞を培養し、 宿主細胞又は培地から当該一本鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質を精製し、 当該一本鎖Ｔ細胞レセプターから融合免疫グロブリン軽鎖定常部領域又はそれ
    らのフラグメントを分け、当該可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターを分離することか
    らなる可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターを分離する方法。
38. 【請求項３８】 一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードする配列を含んでいるＤ
    ＮＡベクターを哺乳動物細胞中に導入し、 一本鎖Ｔ細胞レセプターが発現しうる条件下で培地中で哺乳動物細胞を培養し
    、 一本鎖Ｔ細胞レセプターを当該哺乳動物細胞又は培地から精製して一本鎖Ｔ細
    胞レセプターを分離する方法。
39. 【請求項３９】 融合免疫グロブリン軽鎖定常部領域又はそのフラグメント
    を含んでいる一本鎖Ｔ細胞レセプターの有効量を哺乳動物に投与することからな
    る、病原性Ｔ細胞表面におけるＴ細胞レセプターエピトープに対する哺乳動物を
    免疫化しうる免疫応答を誘導する方法。
40. 【請求項４０】 融合免疫グロブリン軽鎖定常部領域又はそのフラグメント
    を含んでいる一本鎖Ｔ細胞レセプターの有効量を哺乳動物に投与することからな
    る哺乳動物のＴ細胞活性化を阻害する方法。
41. 【請求項４１】 融合免疫グロブリン軽鎖定常部領域又はそのフラグメント
    を含んでいる一本鎖Ｔ細胞レセプターの有効量を哺乳動物に投与することからな
    るＴ細胞レセプターと特異的に結合し得る抗体を調製する方法。
42. 【請求項４２】 請求項４１に記載の方法により調製される抗体。
43. 【請求項４３】 １）Ｖ−α鎖、２）ペプチドリンカー配列、３）Ｖ−β鎖
    、４）Ｃκ鎖、Ｃλ鎖又はこれらのフラグメントのうちの１つ、及び５）エフェ
    クター分子が共有的に結合してなる可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク
    質を準備し、 一本鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質に特異的に結合し得るリガンドを含ん
    でいる細胞に前記可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質を接触させ、 当該一本鎖Ｔ細胞レセプター融合タンパク質で細胞を殺傷することからなる
    一本鎖Ｔ細胞レセプターと特異的に結合し得るリガンドを含んでいる細胞を殺傷
    する方法。
44. 【請求項４４】 細胞が腫瘍細胞又はウイルス感染細胞である請求項４３に
    記載の方法。