JPWO2019151392A1 - 抗原特異的ｍｈｃ発現調節法 - Google Patents

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Abstract

抗原特異的MHC発現調節法を用いた自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、アレルギー性疾患の治療及び診断方法の提供。自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域、臓器移植の拒絶反応の原因となる特異的な抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域又はアレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、MHC分子の発現を調節することにより前記自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応又はアレルギー性疾患を抑制させるための、Ｔ細胞機能低下剤。

Description

本発明は、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、又はアレルギー性疾患の治療又は診断に関する。
自己免疫疾患は、免疫細胞の異常応答による疾患であり、MHC型と強い相関があることが報告されている。臓器移植においては、MHC型の一部を一致させることでその拒絶反応を防ぐという試みもなされている。このように、自己免疫疾患や臓器移植においては、MHCは重要な分子である。
MHC型は白血球の血液型として知られており、個人の目印となっている。MHCには、大別してクラスIとクラスIIがあり、MHC上に抗原ペプチドを提示して、MHC複合体を形成する。
免疫応答は、Ｔ細胞上にあるＴ細胞受容体（TCR）が、MHC複合体と結合して抗原ペプチド特異的に活性化することによって起こる。Ｔ細胞の作用にはＴ細胞受容体が重要な役割を果たしており、近年は、ある疾患に罹患している患者のＴ細胞受容体のＴ細胞受容体レパートリーを分析し、疾患特異的なＴ細胞受容体を同定する方法も開発されている。また、Ｔ細胞受容体の断片を有するタンパク質を利用する方法も報告されている。
Ｔ細胞の反応を調節するためには、Ｔ細胞自体の反応調節の方法も種々検討されているものの、Ｔ細胞の免疫応答がＴ細胞受容体とMHC複合体との結合からおこることを考えると、MHCの発現を特異的に調節することができればよい。従来技術は、MHC特異的抗体による発現調節が行われてきた。例えば、マウスMHCクラス I分子には、H-2K, D, Lがあり、それぞれの分子に対する抗体が作成されている。抗MHC抗体は、MHC分子の発現低下（ダウンモジュレーション）を誘導することは知られている（特許文献１）。しかし、抗原ペプチド特異性はないため副作用が大きいと推測される。
特開2017-128585号公報
本発明は、Ｔ細胞受容体（TCR)の認識機構を用いて、抗原ペプチド特異的にMHC（Major histocompatibility complex; 主要組織適合遺伝子複合体）の細胞表面の発現を調節することによる、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶又はアレルギー性疾患の治療又は診断方法の提供を目的とする。
MHC分子は抗原ペプチドを提示できるが、MHCに対する抗体は、MHCのみに結合して、抗原ペプチドとMHC分子を認識して結合するものはほとんどない。例外としてOVAペプチドとMHC複合体を認識する抗体があるものの、抗原ペプチドに応じたMHC複合体を認識する抗体の作製は、通常6か月程度の作製期間を要し簡単にはできない状況にある。したがって、抗原ペプチドに応じた細胞表面にあるMHCの発現調節を行う分子の作製が困難なことが問題であった。
そこで、Ｔ細胞受容体は抗原ペプチドとMHC複合体を認識することを利用して、Ｔ細胞受容体を抗体のように利用できないかと考えた。また、抗原ペプチドとMHC複合体をＴ細胞受容体キメラタンパク質によってダウンモジュレーションして細胞表面の発現を低下することができれば、多くの疾患に対する薬のリード化合物になりうると考えた。
従来、細胞表面分子の発現調節には、モノクローナル抗体が用いられてきた。例えば、マウスMHCクラスI分子には、H-2K, D, Lがあり、それぞれの分子に対する抗体が作製されている。MHC分子は抗原ペプチドを提示できるが、MHCに対する抗体は、抗原ペプチドとMHC分子を認識して結合するものはほとんどない。また、抗原ペプチドに応じたMHC複合体を認識する抗体の作製は困難な状況にある。したがって、抗原ペプチドに応じたMHCの発現調節を行う分子の作製は困難であった。
今回、T細胞受容体（TCR）解析技術により、抗原ペプチド特異的Ｔ細胞受容体をクローニングできるようになり（国際公開第WO2016/136716号）、その情報をもとにしたＴ細胞受容体キメラタンパク質を作製できるようになった。
このＴ細胞受容体キメラタンパク質は、抗原ペプチド特異的で、MHCとペプチド複合体に結合し、MHCのダウンモジュレーションを誘導し、発現を低下させる。
自己免疫疾患は、MHC型と疾患の相関が高く、ある特定のMHC型を発現していることが多い。そのため、抗原ペプチドとMHCの複合体のダウンモジュレーションを誘導し、発現を低下させるＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応に対する創薬として利用可能である。
このようにして、本発明者は、TCRキメラタンパク質を用いて、抗原ペプチド特異的なMHC複合体の細胞表面発現調節法を見出した。これにより、Ｔ細胞の反応を抑えるように変えることができ、自己免疫疾患の発症の抑制、臓器移植の拒絶反応の抑制、アレルギー性疾患の抑制につながると期待されている。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
[２] 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
[３] アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させるMHC分子複合体発現低下剤。
[４] Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[１]〜[３]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[５] Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、[１]〜[４]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[６] 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[１]〜[５]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[７] ２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、[１]〜[６]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[８] Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、[１]〜[７]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[９] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[１]〜[８]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[１０] 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
[１１] 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、臓器移植の拒絶を引き起こすＴ細胞の機能を低下させるための、Ｔ細胞機能低下剤。
[１２] アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、アレルギー性疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
[１３] Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[１０]〜[１２]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１４] Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、[１０]〜[１３]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１５] 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[１０]〜[１４]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１６] ２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、[１０]〜[１５]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１７] Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、[１０]〜[１６]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１８] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[１０]〜[１７]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１９] [１]及び[４]〜[９]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
[２０] [２]及び[４]〜[９]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
[２１] [３]〜[９]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
[２２] [１０]及び[１３]〜[１８]のいずれかのＴ細胞機能低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
[２３] [１１]及び[１３]〜[１８]のいずれかのＴ細胞機能低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
[２４] [１２]〜[１８]のいずれかのＴ細胞機能低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
[２５] 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体は自己免疫疾患に罹患していると判定する、自己免疫疾患検出方法。
[２６] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[２５]の自己免疫疾患検出方法。
[２７] 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む自己免疫疾患検出用試薬。
[２８] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[２７]の自己免疫疾患検出用試薬。
[２９] 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体において拒絶反応が生じていると判定する、臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応検出方法。
[３０] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[２９]の拒絶反応検出方法。
[３１] 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む拒絶反応検出用試薬。
[３２] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[３１]の拒絶反応検出用試薬。
[３３] アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体はアレルギー性疾患に罹患していると判定する、アレルギー性疾患検出方法。
[３４] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[３３]のアレルギー性疾患検出方法。
[３５] アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含むアレルギー性疾患検出用試薬。
[３６] MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[３５]のアレルギー性疾患検出用試薬。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-015908号の開示内容を包含する。
Ｔ細胞受容体(TCR)キメラタンパク質は、抗原ペプチドとの複合体であるMHCクラスI分子又はクラスII分子に結合し、抗原提示細胞又は疾患の標的細胞の抗原を提示しているMHC分子のダウンモジュレーションを誘導し、発現を低下させる。ここで、MHC分子のダウンモジュレーションとは、MHC分子の発現を抑制的に調節して、発現を低下させることをいう。この結果、病原性Ｔ細胞の抗原提示細胞に対する反応性が変化し、Ｔ細胞の機能が低下する。Ｔ細胞の機能を低下させることにより、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応又はアレルギー性疾患を抑制し、治療することができる。
さらに、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は、MHC分子を発現している疾患標的細胞に結合することができるため、疾患標的細胞の検出に用いることもできる。
これまで、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が、抗原ペプチドとMHC複合体のダウンモジュレーションを誘導するという報告はない。Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は、遺伝子情報が得られて2週間程度で容易に作製できるものであり、従来のモノクローナル抗体の作製時間（抗原を免疫してからスクリーニング完了まで約6か月）に比べ、時間が大幅に短縮される。また、モノクローナル抗体の場合、エピトープの確認（認識部位の確認）が必要であるが、Ｔ細胞受容体は、MHCのリガンドであるため、認識部位の確認は、抗原ペプチドを変更するのみで、容易に確認できる。
さらに、同じMHCで異なった抗原ペプチドに対しても、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は容易に作製できる。
Ｔ細胞受容体キメラタンパク質（TCR-IgFc）の構造を示す図である。 Ｔ細胞受容体キメラタンパク質（TCR-IgFc）の遺伝子組換え技術による製造方法の概要を示す図である。 OVAに対するTCRレパートリー解析の実験方法を示す図である。 OVAペプチドを感作したマウスと、OT-1マウスのTCRを比較した図である。 OVA257ペプチドを認識するTCR-IgFcを示す図である。 MHCクラスI分子に結合したＴ細胞受容体キメラタンパク質の細胞内在化を示す図である。 MHC分子に結合したTCR-IgFc複合体の挙動を調べる実験方法を示す図である。 MHC分子に結合したTCR-IgFc複合体が細胞内に移動して、細胞表面のMHCを調節していることを示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルマウスの作製方法を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、TCR-IgFcの抗原ペプチド特異的結合を示す図である。 in vitro培養細胞において、TCR-IgFcが抗原ペプチド特異的結合を示す図である。 MHCクラスII分子に結合したTCR-IgFcの細胞内在化を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、TCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、病原性Ｔ細胞に対するTCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、病原性Ｔ細胞に対するTCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、反応するＴ細胞受容体α鎖のレパートリー解析した図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、反応するＴ細胞受容体β鎖のレパートリー解析した図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、TCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、TCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 金属アレルギーにおけるTCR-IgFcによる活性化Ｔ細胞の阻害実験の方法を示す図である。 金属アレルギーにおけるTCR-IgFcによる活性化Ｔ細胞の阻害効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するTCR-IgFcの治療実験の方法の概要を示すである。 実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するTCR-IgFcによる治療効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するTCR-IgFcによる治療において、17日目までの臨床スコア３以上に到達したマウスの比率を示す図である。 金属アレルギーに対するTCR-IgFcの治療実験の方法の概要を示すである。 金属アレルギーに対するTCR-IgFcによる治療効果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．Ｔ細胞受容体キメラタンパク質
（１）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の構造
本発明の方法においては、Ｔ細胞受容体(TCR：T cell receptor)の可変領域と免疫グロブリンのFc領域とを融合させたＴ細胞受容体キメラタンパク質を用いる。該Ｔ細胞受容体キメラタンパク質をＴ細胞受容体-イムノグロブリンキメラタンパク質やTCR-IgFc fusion proteinとも呼ぶ。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、Ｔ細胞受容体の可変領域（TCR V領域）とCDR3の全てとJ領域を、IgFc部分と結合させたキメラタンパク質である。また、Ｔ細胞受容体の可変領域（TCR V領域）とCDR3の全てとJ領域とＣ領域の一部を、IgFc部分と結合させたキメラタンパク質であってもよい。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質をTCR-IgFcと表すことができる。
Ｔ細胞受容体の可変領域としては、自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応やアレルギー性疾患に特異的な抗原を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いる。本発明のＴ細胞受容体の可変領域は、自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体、臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原(抗原ペプチド）とMHC分子の複合体又はアレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識する。その結果、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患の病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体、臓器移植拒絶反応の病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体、又はアレルギー性疾患の病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合し、病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる。その結果、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、Ｔ細胞がMHC分子が発現している細胞を認識できないようにすることにより、Ｔ細胞の機能を低下させることができる。本発明において、MHCは、古典的MHC（クラスIa、クラスII）に限ったものではなく、非古典的MHC、いわゆるクラスIb分子も含む。クラスIb分子は、例えば、T細胞との結合が認められるCD1、MR1、H2-M3、HLA-Gなども含む（生化学 第81巻 第3号、pp.189-199, 2009)。MHC分子複合体の発現の低下は、MHC遺伝子の発現低下とMHC分子の細胞表面における発現低下を含み、好ましくはMHC分子の細胞表面における発現低下である。
Ｔ細胞受容体はα鎖とβ鎖、又はγ鎖とδ鎖から構成される２量体であり、それぞれの鎖が可変領域と定常領域から構成される。可変領域は複数の遺伝子断片Ｖ(variable)領域（Ｖ遺伝子断片）、Ｄ(diversity)領域及びＪ（joining)領域（β鎖、δ鎖）、あるいはＶ領域及びＪ領域によりコードされ（α鎖、γ鎖）、遺伝子再構成を通して多数のレパートリーを有するようになる。さらに、可変領域にはCDR（complementarity determining region：相補性決定領域）と呼ばれる超可変領域が３つ存在し、これらの領域の体細胞突然変異によりさらに多数のレパートリーを有するようになる。特にCDR3領域は抗原特異性に関与しており、配列の変異が生じやすく配列の多様性が大きい。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質が有するＴ細胞受容体の可変領域は、α鎖又はβ鎖であり、α鎖とβ鎖の両方を融合した１本鎖であってもよい。また、２量体を構成するＴ細胞受容体キメラタンパク質において、一方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のα鎖の融合タンパク質であって、他方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のβ鎖の融合タンパク質であってもよい。あるいは、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が有するＴ細胞受容体の可変領域は、γ鎖又はδ鎖であり、γ鎖とδ鎖の両方を融合した１本鎖であってもよい。また、２量体を構成するＴ細胞キメラタンパク質において、一方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のγ鎖の融合タンパク質であり、他方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のδ鎖の融合タンパク質であってもよい。Ｔ細胞受容体の可変領域のα鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖は約200〜400個のアミノ酸からなる。本発明で用いるＴ細胞受容体の可変領域のα鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖は、例えば、天然に存在するＴ細胞受容体の可変領域のα鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＴ細胞受容体可変領域を含む。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、好ましくは２量体又は４量体等の多量体であり、２量体の可変領域として、α鎖-α鎖の組合せ、α鎖-β鎖の組合せ、β鎖-β鎖の組合せが挙げられる。４量体の可変領域として、α鎖-α鎖とβ鎖-β鎖の組合せが挙げられる。また、γ鎖-γ鎖の組合せ、γ鎖-δ鎖の組合せ、δ鎖‐δ鎖の組合せが挙げられる。４量体の可変領域として、γ鎖-γ鎖とδ鎖‐δ鎖の組合せが挙げられる。
Ｔ細胞受容体の可変領域はMHCに結合するものであれば、いずれのＴ細胞由来のものでもよく、ヘルパーＴ細胞(CD4陽性T細胞）、キラーＴ細胞(CD8陽性T細胞）由来のものでもよく、制御性Ｔ細胞（regulatory T cell、Treg)由来のものでもよく、Th17細胞、NKT細胞、エフェクターＴ細胞、γδT細胞由来のものでもよい。これらのいずれのＴ細胞由来のＴ細胞受容体もMHC分子を認識し結合するので、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質の構成分子として用いることができる。
本発明において、「免疫グロブリンのFc領域」とは、免疫グロブリンのFcフラグメント、すなわち、天然の免疫グロブリンのCH2及びCH3定常ドメインをいう。免疫グロブリンのFc領域はヒト由来のものを用いることが好ましいが、マウス免疫グロブリン等非ヒト動物の免疫グロブリンを用いることもできる。免疫グロブリンは好ましくはIgGである。ヒトIgGのサブクラスにはIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4があり、マウス免疫グロブリンにはIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3がある。ヒトIgGでは、IgG1及びIgG3のFc領域がFc受容体に強く結合するため、IgG1及びIgG3が好ましく、その中でもIgG1が好ましい。マウスIgGでは、IgG2aのFc領域はNK細胞のFc受容体（FcR)に結合しやすいため、IgG2aが好ましい。前記免疫グロブリンのFc領域には、天然の突然変異体、人工変異体、及びトランケートされた形態のいずれも含まれる。例えば、天然に存在する免疫グロブリンのFc領域と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するFc領域を含む。
Ｔ細胞受容体キメラタンパク質において、Ｔ細胞受容体の可変領域の間と免疫グロブリンのFc領域の間、あるいはＴ細胞受容体の可変領域のα鎖とβ鎖の両方を有する場合のα鎖とβ鎖の間には、リンカーが含まれていてもよく、２つのタンパク質がリンカーを介してタンデムに結合していればよい。リンカーは、特定の長さのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり、アミノ酸数は限定されないが、１〜３０個、好ましくは３〜２５個、さらに好ましくは５〜２０個である。アミノ酸の種類は限定されず、側鎖が小さく反応性が大きくないアミノ酸や連結したときにαへリックス構造をとるアミノ酸が好ましい。このようなアミノ酸として、グリシン（G）、セリン（S）、アラニン（A）、トレオニン（T）、アスパラギン酸（D）、リシン（K）、グルタミン酸（E）、ロイシン（L）、メチオニン（M）等が挙げられる。
（２）Ｔ細胞受容体（TCR）の特定方法
自己免疫疾患におけるＴ細胞受容体を特定する場合、Ｔ細胞受容体の可変領域としては、特定の自己免疫疾患に発現する、自己抗原を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなＴ細胞受容体の可変領域としては、例えば、特定の自己免疫疾患患者由来のＴ細胞受容体の可変領域を用いることができる。本発明で治療対象となる自己免疫疾患として、自己免疫性糖尿病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、セリアック病、クローン病及び潰瘍性結腸のような炎症性腸疾患、乾癬、I型真性糖尿病、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、ギラン-バレー症候群、自己免疫ブドウ膜炎症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫血小板減少症、グレーブス病、自己免疫卵巣炎、自己免疫精巣炎、一時的関節炎、抗リン脂質症候群、ウェグナー肉芽腫症、ベーチェット病、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、剛直性脊椎炎、シェーグレン症候群、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、乾癬性関節炎、骨関節炎、ステロイド耐性喘息、慢性閉塞性肺病、円形脱毛症、及びアテローム性動脈硬化症等が挙げられる。
自己免疫疾患患者ごとに適切な治療を行うためには、自己免疫疾患患者からリンパ球を採取し、リンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定し、その自己免疫疾患患者に高頻度で認められるＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、Ｔ細胞受容体はその自己免疫疾患患者の自己抗原の特定のエピトープを認識する。このような、特定のエピトープに特異的なＴ細胞受容体をコードするDNAは、自己免疫疾患患者のＴ細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。Ｔ細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、自己免疫疾患患者のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析することができる。自己免疫疾患患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその自己免疫疾患に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体であると判断することができる。
次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体を自己免疫疾患に特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンを自己免疫疾患特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択する。
臓器移植の拒絶反応でドナーを標的細胞としている場合にＴ細胞受容体を特定する際には、Ｔ細胞受容体の可変領域としては、ドナー由来の移植組織抗原を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなＴ細胞受容体の可変領域としては、例えば、ドナー由来の標的細胞を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いることができる。患者ごとに適切な臓器移植の拒絶治療を行うためには、臓器移植患者（レシピエント）からリンパ球を採取し、リンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定し、その臓器移植患者（レシピエント）に高頻度で認められるＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、Ｔ細胞受容体はそのドナー由来の移植組織抗原の特定のエピトープを認識する。このような、ドナー由来の移植組織抗原の特定のエピトープに特異的なＴ細胞受容体をコードするDNAは、臓器移植患者（レシピエント）のＴ細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。Ｔ細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、臓器移植患者（レシピエント）のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析することができる。臓器移植患者（レシピエント）において出現頻度が高いＴ細胞受容体を臓器移植の拒絶反応に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体であると判断することができる。
また、ドナー由来の標的細胞と臓器移植患者（レシピエント）のリンパ球を混合培養した後、リンパ球を採取しリンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定することで、臓器移植の拒絶反応にかかわるＴ細胞受容体を同定することもできる。より簡便な方法として、あらかじめ増殖しないようにX線照射したドナーのリンパ球と臓器移植患者（レシピエント）のリンパ球を混合培養する方法（Mixed Lymphocyte Reaction）により、反応したT細胞を解析することで臓器移植の拒絶反応にかかわる臓器移植患者（レシピエント）のＴ細胞受容体を同定することができる。
次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体を感染症に特異的なＴ細胞受容体すなわち病原体の抗原に特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンを病原体の抗原特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択する。なお、本発明において、「臓器移植の拒絶反応」の臓器移植は組織移植も含む。
アレルギー性疾患患者におけるＴ細胞受容体を特定する場合、Ｔ細胞受容体の可変領域としては、特定のアレルギー性疾患に発現する、アレルギー抗原（アレルゲン）を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなＴ細胞受容体の可変領域としては、例えば、特定のアレルギー性疾患患者由来のＴ細胞受容体の可変領域を用いることができる。本発明で治療対象となるアレルギー性疾患として、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、気管支喘息、小児喘息、薬物アレルギー、蕁麻疹、金属アレルギー、接触過敏症等が挙げられる。
アレルギー性疾患患者ごとに適切な治療を行うためには、アレルギー性疾患患者からリンパ球を採取し、リンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定し、そのアレルギー性疾患患者に高頻度で認められるＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、Ｔ細胞受容体はそのアレルギー性疾患患者のアレルギー抗原の特定のエピトープを認識する。このような、特定のエピトープに特異的なＴ細胞受容体をコードするDNAは、アレルギー性疾患患者のＴ細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。Ｔ細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、アレルギー性疾患患者のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析することができる。アレルギー性疾患患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその自己免疫疾患に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体であると判断することができる。
次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体をアレルギー性疾患に特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンをアレルギー性疾患特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択する。
Ｔ細胞受容体のレパートリー解析は、例えば、IMGT/V-Questツール（http://www.imgt.org/）を利用して行うことができる。また、国際公開第WO2016/136716号に記載の方法で行うことができる。
上記の方法では、Ｔ細胞受容体のレパートリー解析により、自己免疫疾患特異的Ｔ細胞受容体、臓器移植のドナー抗原特異的Ｔ細胞受容体又はアレルギー疾患特異的Ｔ細胞受容体の配列を決定した後に、再度Ｔ細胞受容体の全長遺伝子をクローニングし、ライブラリーを作製し、その中から自己免疫疾患特異的抗原、臓器移植のドナー抗原又はアレルギー抗原（アレルゲン）の認識に関与するＴ細胞受容体の配列を有するクローンを選択する。
自己免疫疾患患者、臓器移植患者（レシピエント）又はアレルギー性疾患患者のＴ細胞受容体の網羅的解析は、採血後、１〜２週間で行うことができる。その後、Ｔ細胞受容体をクローニングし、キメラタンパク質を製造すればよく、最短で、採血から３〜５週間程度で特定の自己免疫疾患患者、臓器移植患者（レシピエント）又はアレルギー性疾患患者に適した個別化（カスタムメイド）治療を可能にするＴ細胞受容体キメラタンパク質を得ることができる。この際、Ｔ細胞受容体も免疫グロブリンのFc領域も患者のものを用いてもよく、いずれも自己のもの由来のＴ細胞受容体キメラタンパク質を用いることになるため、免疫反応による副作用を抑えることができる。
さらに、以下の具体的な方法でＴ細胞受容体を特定することができる。
自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者におけるTCR頻度についてそれぞれの検体の頻度を合算、平均を求めた後、頻度順に並べ上位１０程度を抽出する（合算シングル解析）。健常人末梢血のTCR頻度を頻度順にならべ上位１０程度の頻度を抽出する。V領域に着目して、患者組織で抽出したTCRの中で健常人末梢血から抽出したものと重複するものを除外し、特定TCRとする。本方法は、Ｔ細胞受容体α鎖可変領域のみならず、β鎖可変領域の特定にも利用できる。
すなわち、この方法は、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のＴ細胞受容体α鎖可変領域のレパートリー及び健常人の末梢血中のリンパ球のＴ細胞受容体α鎖のレパートリーを同定し、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のリンパ球における存在量が健常人の末梢血中のリンパ球における存在量の、例えば２倍以上であるＴ細胞受容体α鎖可変領域を自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的Ｔ細胞受容体α鎖可変領域とする、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的Ｔ細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法である。また、複数の自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のリンパ球の混合物と複数の健常人の末梢血中のリンパ球の混合物を用いて、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のリンパ球における存在量が健常人の末梢血中のリンパ球における存在量の２倍以上であるＴ細胞受容体α鎖可変領域を自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的ヒト共通Ｔ細胞受容体α鎖可変領域と決定する、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的Ｔ細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法である。
（３）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の製造
一度に複数の患者について、Ｔ細胞受容体の網羅的解析を行えば、多数のＴ細胞受容体のレパートリーを取得することができ、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードする多数のDNAのライブラリーを作製しておくことができる。その後に治療を必要とする自己免疫疾患患者、臓器移植拒絶反応がある患者又はアレルギー性疾患患者に対して、Ｔ細胞受容体の解析を行い、その患者が有するＴ細胞受容体あるいは配列が近似しているＴ細胞受容体が前記のライブラリーに存在する場合は、そのDNAを用いてＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造すればよい。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、Ｔ細胞受容体のα鎖可変領域及び／又はβ鎖可変領域と免疫グロブリンのFc領域が融合し、必要に応じてリンカーペプチドを含む融合タンパク質を１つ有する単量体も、２つ有する２量体も含む。好ましくは、図１に示す２量体が好ましい。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、ジスルフィド結合により２量体を形成し得る。２量体の２つのＴ細胞受容体の可変領域の一方がα鎖で他方がβ鎖であってもよい。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、公知の融合タンパク質を作製する方法、例えば化学合成法、遺伝子組み換え技術による方法で作製することができるが、遺伝子組換え技術による方法で作製することが好ましい。遺伝子組換え技術による方法の概要を図２に示す。遺伝子組換え技術により本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質を作製する場合には、Ｔ細胞受容体のα鎖可変領域及び／又はβ鎖可変領域と免疫グロブリンのFc領域、さらに必要に応じてリンカーペプチドコードするDNAをインフレームで連結し、融合タンパク質をコードするDNAを発現ベクターに導入し組換えベクターを作製し、さらに、該組換えベクターを動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌等の宿主に導入し発現させればよい。
ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能ないかなるベクターも用いることができる。ベクターは、プロモーター、複製開始点、選択マーカーを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
作製したＴ細胞受容体キメラタンパク質は、必要に応じて、当該技術分野の当業者にとって周知の単離及び精製手段により、単離及び精製することができる。例えば、単離及び精製方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、透析、沈殿分画法、電気泳動等が挙げられる。これらの方法を適宜組み合わせて、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質を単離及び精製することができる。
また、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は無細胞翻訳系（セルフリーシステム）で発現させることもできる。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、当業者にとって公知の化学修飾がされていてもよい。例えば、化学修飾には、ポリエチレングリコール（PEG）化、グリコシル化、アセチル化、アミド化等が挙げられる。
本発明は、自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者から採取したＴ細胞から自己免疫疾患特異的抗原又はアレルギー疾患特異的抗原を認識する自己免疫疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体又はアレルギー疾患特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。また、本発明は自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者から採取したＴ細胞を用いて自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者の有するＴ細胞受容体のレパートリーを解析し、自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその自己免疫疾患又はアレルギー疾患に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体としてクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。
さらに、本発明は臓器移植の拒絶に特異的な抗原及びMHC複合体を認識する特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。また、本発明は、臓器移植の患者のＴ細胞受容体のレパートリーを解析し、臓器移植患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその臓器移植の拒絶に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体としてクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。
本発明は、自己免疫疾患特異的抗原又はアレルギー性疾患特異的抗原を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞のMHCとの複合体を包含する。また、本発明は、in vitroで自己免疫疾患特異的抗原又はアレルギー性疾患特異的抗原を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞を接触させることによりＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞の複合体を作製する方法を包含する。
さらに、本発明は、臓器移植の拒絶に特異的な抗原を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質とMHC分子の複合体を包含する。また、本発明は、in vitroで臓器移植の拒絶に特異的な抗原及びMHC複合体を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞を接触させることによりＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞の複合体を作製する方法を包含する。
２．Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の利用
（１）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の細胞への取り込み、及び細胞表面のMHC複合体の発現の低下
Ｔ細胞受容体キメラタンパク質により、MHC複合体の細胞表面上の発現をダウンモジュレーションし、低下させることができる。また、MHC複合体へ結合したＴ細胞受容体キメラタンパク質を細胞内へ導入させることができる。
本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、細胞におけるMHC複合体の発現低下剤を包含する。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は疾患の標的細胞上の抗原又は抗原ペプチドを提示している抗原若しくは抗原ペプチドとMHC分子の複合体の発現を低下させることにより、抗原又は抗原ペプチド特異的にそのMHC複合体を認識し標的とする病原性Ｔ細胞の反応性を調節し、その結果、該病原性Ｔ細胞の機能を低下させる。ここで、「抗原又は抗原ペプチド特異的にMHC分子の複合体の発現を低下させる」とは、特定の抗原とMHC分子の複合体のみの発現を特異的に低下させることをいう。本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、MHC分子複合体発現低下剤、及びＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞機能低下剤も包含する。MHC分子複合体発現低下剤をMHC分子複合体調節剤ともいう。調節を変調ともいう。ここで、病原性Ｔ細胞とは、自己免疫疾患やアレルギー性疾患の免疫反応に関与し、疾患を引き起こすＴ細胞、あるいは、臓器移植において、臓器移植の拒絶反応を引き起こすＴ細胞をいう。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、抗原ペプチド特異的に病原性Ｔ細胞と競合し阻害し、Ｔ細胞の機能を低下させることができる。また、MHC分子は、MHCクラスI分子もMHCクラスII分子も、非古典的MHC分子も含む。自己免疫疾患及びアレルギー疾患には、MHCクラスII分子が関与することが多く、臓器移植の拒絶反応には、MHCクラスI分子が関与することが多い。
該MHC複合体の発現低下剤の有効成分として用いるＴ細胞受容体キメラタンパク質は、好ましくは２量体又は４量体等の多量体である。多量体の方が、クラスタリング効率がよく、MHC複合体の発現低下の効果及びＴ細胞機能低下の効果が高い。
Ｔ細胞受容体は、MHC複合体と結合してＴ細胞に信号を伝えて機能を発揮する。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は細胞表面のMHC複合体と結合して、その後該細胞内に取り込まれることでMHC複合体の細胞表面の発現を低下させる。細胞表面のMHC複合体に結合したＴ細胞受容体キメラタンパク質は、１〜１０時間後、好ましくは４〜８時間後、さらに好ましくは６時間後に細胞内に取り込まれる。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質が結合するMHC複合体はクラスI分子に限定せず、クラスII分子でもよい。マウスではH-2K,D,L, I-A, I-Eであり、ヒトでは、HLA-A,B,C,DR, DQ,DM,Eである。あるいは、非古典的MHC分子でもよい。非古典的MHC分子としてクラスIb分子が挙げられ、CD1、MR1、H2-M3、HLA-Gなどを含む（生化学 第81巻 第3号、pp.189-199, 2009)。また、標的細胞は、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、アレルギー性疾患に限定したものではなく、正常細胞を含むあらゆる細胞を対象とする。
本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を用いて、抗原提示細胞、ならびに病原性Ｔ細胞の標的となる細胞のMHCの発現を低下させて、該Ｔ細胞の機能を低下させる方法であり、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含むＴ細胞の機能低下剤として用い得る医薬組成物である。該医薬組成物は、自己免疫疾患治療、臓器移植の拒絶反応治療若しくは抑制、又はアレルギー性疾患治療若しくはアレルギー抑制に用いることができる。すなわち、本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患治療剤、臓器移植の拒絶反応治療若しくは抑制剤、又はアレルギー疾患の治療剤若しくはアレルギー抑制剤を包含する。
本発明の医薬組成物の剤形は限定されず、用法に応じ種々の剤型のものが使用される。例えば、経口剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤等が挙げられる。また、非経口剤としては、注射剤、吸入粉末剤、吸入液剤、点眼剤、液剤、ローション剤、スプレー剤、点鼻剤、点滴剤、軟膏剤、坐剤、貼付剤等を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、その剤型に応じ、製剤学的に公知の手法により調製することができる。例えば、医薬品添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物が挙げられる。前記医薬品添加物には、生理食塩水、注射用水等も含まれる。
本発明の医薬組成物は、用法に応じ種々の投与方法が用いられる。例えば、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与等が挙げられる。
本発明の医薬組成物を自己免疫疾患治療、臓器移植の拒絶反応治療又はアレルギー性疾患治療に用いる場合、その有効成分である本発明のタンパク質の投与量は、患者の年齢、性別、体重、疾患の程度、剤型、投与経路等により、適宜決定される。例えば、成人に対して経口投与により投与する場合、0.1μg/kg 〜1000mg/kg／日の範囲で定めればよい。１日投与量を、１回、２回又は３回に分けて投与してもよい。また、成人に対して非経口投与で投与する場合、0.01μg/kg 〜1000mg/kg／日範囲で定めることもできる。非経口投与の1日投与量は、剤型に応じて、好ましくは0.1μg/kg 〜10μg/kg／日、1μg/kg 〜100μg/kg／日、又は10μg/kg 〜1000μg/kg／日の範囲とすればよい。
本発明は、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、標的細胞のMHC複合体と結合して、MHC複合体のダウンモジュレーションを誘導して発現を低下させる方法を包含する。また、本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を、標的細胞上のMHC複合体と結合させ、標的細胞内に取り込ませる方法を包含する。
（２）自己免疫疾患の原因となる自己抗原、臓器移植の拒絶反応のドナー標的細胞又はアレルギー抗原（アレルゲン）の検出
さらに、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞のMHC分子と自己抗原の複合体、臓器移植の拒絶反応の原因となる、ドナー由来の標的細胞のMHC分子とドナー特異的抗原の複合体、あるいは、アレルギー性疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞のMHC分子とアレルギー抗原（アレルゲン）との複合体に結合するため、被験体中のこれら標的細胞の検出に利用することができる。自己免疫疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞が検出された場合、被験体は自己免疫疾患に罹患していると判定することができる。また、臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー由来の標的細胞が検出された場合、被験体において臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応が生じていると判定することができる。さらに、アレルギー性疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞が検出された場合、被験体はアレルギー性疾患に罹患していると判定することができる。被験体が自己免疫疾患に罹患しているとの判定を自己免疫疾患の検出といい、被験体において臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応が生じているとの判定を拒絶反応の検出といい、被験体がアレルギー性疾患に罹患しているとの判定をアレルギー性疾患の検出という。また、自己免疫疾患の原因となる自己抗原や臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー特異的抗原やアレルギー性疾患の原因となるアレルギー抗原（アレルゲン）の検出を行うことができる。
Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を自己免疫疾患の標的細胞、臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー由来の標的細胞又はアレルギー性疾患の標的細胞の検出に用いる場合、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を蛍光色素、消光色素、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ（ALP)や西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)などの酵素等で標識して用いればよい。標識物質による標識は、公知のタンパク質の標識方法で行うことができ、ビオチン-アビジン（ストレプトアビジン）系を利用して標識してもよい。
検出は、FACSやフローサイトメーターを用いて行うこともできるし、免疫細胞化学の手法により行うこともできる。フローサイトメーターとしては、例えば、FACSCanto II(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いればよい。免疫細胞化学の手法による測定は、採取した自己免疫疾患の標的細胞、臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー由来の標的細胞又はアレルギー性疾患の標的細胞をスライドガラス上に固定して行えばよい。免疫細胞化学において、染色は顕微鏡や肉眼で判断することもできるし、適当な光学的測定装置を用いてもよい。
被験体の血液や組織等の生体試料から細胞を採取し、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質と接触させ、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質に結合する細胞が存在した場合、該細胞は自己免疫疾患の原因となる標的細胞であると判定され、自己免疫疾患の原因となる自己抗原を発現していると判定される。また、被験体の生体試料中にドナー由来の標的細胞が検出されたとき、被験体は臓器移植の拒絶反応が起こっていると判断することができる。さらに、被験体の血液や組織等の生体試料から細胞を採取し、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質と接触させ、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質に結合する細胞が存在した場合、該細胞はアレルギー性疾患の原因となる標的細胞であると判定され、アレルギー性疾患の原因となるアレルギー抗原（アレルゲン）を発現していると判定される。Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を用いた検出により、自己免疫疾患診断、臓器移植の拒絶反応診断又はアレルギー性疾患診断のための補助的データを得ることができる。
本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を含む自己免疫疾患検出用試薬、臓器移植の拒絶反応検出用試薬又はアレルギー性疾患検出用試薬を含み、該Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は好ましくは標識されている。
自己免疫疾患やアレルギー性疾患に罹患していると判断した患者に対しては、本発明のＴ細胞機能低下剤を用いて治療すればよい。また、抗炎症療法など対症療法と併用して治療することもできる。臓器移植の拒絶反応が起こっていると判断した患者に対しては、本発明のＴ細胞機能低下剤を用いて治療すればよい。また、免疫抑制剤を投与して治療することもできる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
[実施例１]
１．Ｔ細胞受容体（TCR）レパートリー解析
OVAペプチド（257-264:SIINFEKL）に完全フロイントアジュバント（CFA）を等量混和してエマルジョンを作成し、Day0及びDay7にC57BL/6マウス皮下に接種（感作）した。接種（感作）スケジュールを図３に示す。Day15に、所属リンパ節及び脾臓中のリンパ球を採取した。マウスは２匹ずつ用いた。対照として、OVAペプチド（257-264）特異的TCRを遺伝子導入したマウスOT-1から、脾臓中のリンパ球を採取した。
上記サンプルから通法にて、total RNAを抽出、cDNA libraryを作成した。「遺伝子特異的非バイアス増幅法」を用いて、アダプターを付与しPCRを行ってTCR鎖の遺伝子増幅を行い、これを解析サンプルとした。
遺伝子非バイアス増幅法とは、cDNA libraryにアダプターを付与した後、2重鎖アダプターのアンチセンス鎖（あるいはセンス鎖）を酵素にて消化する。残ったアダプター部分の塩基配列を基にしたプライマー及びTCR特異的プライマーを用いて、アダプターライゲーションPCR法を行うことで非特異的なプライマー結合を抑制し、遺伝子特異的な増幅が可能となる。遺伝子非バイアス増幅法については、国際公開第WO2016/136716号に記載されている。
具体的には以下の方法で行う。
(i) ２本鎖cDNAの両端に以下の[１]〜[３]のいずれかの２本鎖アダプターDNAをライゲーションする工程；
(ii) ２本鎖アダプターDNAをライゲーションした遺伝子をウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG)で処理し、さらに加熱処理することによりアダプターDNAのアンチセンス鎖を分解する工程；
(iii) ２本鎖アダプターDNAのアンチセンス鎖の一部又は全部の配列からなるフォワードプライマー及び標的遺伝子に特異的にアニーリングするリバースプライマーを用いてPCR増幅を行う工程。
この方法では、フォワードプライマーのみによる伸長反応は起こらず、リバースプライマーによる伸長反応が起こり、アダプターのセンス鎖の相補鎖が形成された後に、該相補鎖にフォワードプライマーがアニーリングし伸長反応が起こり、リバースプライマーによる伸長及びフォワードプライマーによる伸長がこの順序で一方向に起こることにより、標的遺伝子を一方向にバイアスをかけずにPCR法により増幅させることができる。
[１] 以下の特徴を有する非バイアス遺伝子増幅に用いる２本鎖アダプターDNA：
(a) センス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングしており、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基長は同じであるか、又はセンス鎖が長い；
(b) センス鎖の塩基長は15〜40bpである；
(c) アンチセンス鎖に複数のウラシルを含み、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG)でアダプターを処理することにより、ウラシルが除去され、その後加熱処理することによりアンチセンス鎖が分解される；
(d) アダプターDNAの少なくとも１端は平滑末端の形態を有する；
(e) 一方の末端で増幅しようとする標的遺伝子に結合する；及び
(f) センス鎖の一部又は全部が遺伝子増幅に用いるフォワードプライマーの配列である。
[２] アンチセンス鎖に含まれるウラシルの数がアンチセンス鎖の塩基数の10〜25％であり、５〜10塩基ごとにウラシルが存在する、[１]記載の２本鎖アダプターDNA。
[３] アンチセンス鎖の5'末端にリン酸基が結合しており、3'末端にアミノ基が結合している、[１]又は[２]の２本鎖アダプターDNA。
次世代シークエンサーは、illumina MiSeqを用い、メーカーのプロトコールに従って、サンプルを解析した。
その結果のＴ細胞受容体(TCR)を図４に示す。
OVAペプチド（SIINFEKL）（配列番号１）に対するＴ細胞受容体は、感作したマウス及びOT-1マウスともにα鎖のV領域、J領域は類似しているもののCDR3領域に違いがみられた。OT-1マウスのTCRは、
V領域：TRAV14-1-01 J領域：TRAJ33-01 CDR3（アミノ酸配列）：AASDNYQLI（配列番号２）
OVAペプチド（SIINFEKL）（配列番号１）感作マウスN1のＴ細胞受容体は、
V領域：TRAV14-1-01 J領域：TRAJ33-01 CDR3（アミノ酸配列）：AASPVDSNYQLI（配列番号３）
OVAペプチド（SIINFEKL）（配列番号１）感作マウスN2のTCRは、
V領域：TRAV14D-1-01 J領域：TRAJ33-01 CDR3（アミノ酸配列）：AAGSNYQLI（配列番号４）であった。
そこで、OVAペプチド（257-264）感作マウスN1のＴ細胞受容体を任意に選び、以下の実験に供した。
２．Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の作製
１）Ｔ細胞受容体の遺伝子クローニングと発現プラスミド構築
V領域：TRAV14-1-01 J領域：TRAJ33-01 CDR3（アミノ酸配列）：AASPVDSNYQLI（配列番号３）のＴ細胞受容体を、EL4移植15日後の脾臓サンプルcDNA libraryから、以下のPCRプライマーを用いてTCRα鎖のＬ領域からＣ領域の一部まで含む領域をクローニングした。
Primer配列：
TO1771（Ｖ領域sense鎖、EcoRI siteを付与）:GAG AAT TCG CAG CAG CAG GTG AGA CAA AG（配列番号５）
TO1881（Ｃ領域を一部含むAntisense鎖、Bgl II siteを付与）:GAT AGA TCT TTC TGG GTT CTG GAT GTC TGG CTT TAT AAT TAG（配列番号６）
市販のpFUSE-mIgG2A-Fcプラスミド（invivogen社）のEco RI、Bgl II部位に、 cDNAを挿入して、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質プラスミドを構築した（TP352と命名）。
図２にＴ細胞受容体キメラタンパク質の作製法の概要を示す。
２）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質（TCR-IgFc fusion protein）の産生及び精製
Ｔ細胞受容体キメラタンパク質プラスミドをHEK293細胞に遺伝子導入した後、ultralow IgG-FCS(その後の精製過程でウシIgGが混入することを避けるため)存在培地中で、４日培養した。培養上清を回収し、Hi Trap protein Gカラム（GEヘルスケア・ジャパン社）を用いてメーカーのプロトコールに従って、精製を行った。
このＴ細胞受容体キメラタンパク質は、TCR V領域とCDR3とＪ領域とＣ領域の一部を、IgFc部分と結合させたキメラタンパク質である。
３．OVAペプチド(SIINFEKL)特異的TCR-IgFcの結合（図５）
マウス胸腺腫細胞EL4は、H-2Kbを発現している腫瘍細胞である。EL4にOVAペプチド(SIINFEKL)を50 μg/ml添加し、37℃1時間培養した。その後、OVA感作マウスN1から同定したTRAV14-1-01-CDR3 (AASPVDSNYQLI)-TRAJ33-01とmIgG2a Fcキメラタンパク質 (TRAV14 N1-IgFc)又はOT-1マウス由来TCRα鎖とmIgG2a Fcキメラタンパク質(TRAV14-1-01-CDR3(AASDNYQLI)-TRAJ33-01-IgFc(TRAV14-Fc)をビオチン化した後に2.5 μg/ml添加し、4℃1時間静置した。細胞を洗浄後、ストレプトアビジン-PEを加え標識して4℃, 20分間静置した後にフローサイトメーターにより検出した。
OT-1α-IgFc では、OVAペプチドの存在の有無で違いが認められなかったが、TRAV14 N1-Fc においては、OVAペプチド存在下でOVA N1-IgFc（TRAV14 N1-IgFc)の結合性が37.3％から62.7％に増加した。この結果から、TRAV14 N1-IgFcは、抗原ペプチド特異的にMHCクラスI複合体と結合することが明らかとなった。図の数値は、TCR-IgFcが結合している細胞の割合（％）を示したものである。
４．TCR-IgFcによる抗原ペプチド依存的なMHCクラスI細胞内在化の誘導（図６）
マウス胸腺腫細胞EL4にOVAペプチド(SIINFEKL) 50μg/mlを添加し、37℃で1時間培養した。その後、OVAペプチド特異的TCRキメラタンパク質TRAV14 N1-Fc(TRAV14-1-01-CDR3(AASPVDSNYQLI)-TRAJ33-01-IgFc) 2.5μg/mlを添加し、37℃でさらに2時間培養した。細胞を2％% FCS/PBSで洗浄後、BD社Fix/Perm buffer 100μlを加え、4℃で30分間静置し、細胞の固定と透過化を行った。その後、ビオチン化した抗H-2KbDb抗体、さらにストレプトアビジン-Dyelight488による標識を行った。観察はTCP SP8 (Leica)で行い（図６A,B）、画像解析はImage J Plot Profileにより行った(図６C,D)。OVA N1-IgFc の添加によりMHCクラスIの細胞内局在が誘導されることが分かった。
５．MHC分子に結合したTCRキメラタンパク質複合体の挙動（図７、図８）
マウス胸腺腫細胞EL4を回収し、2×105 cellsを5％FCS/RPMIに懸濁する。EL4細胞のMHC クラスIに結合することが判明しているTCRキメラタンパク質TCR-IgFc(mTRAV8-Fc)を用いて、ビオチン化したTCR-IｇFc(bio-mTRAV8Ig)を細胞懸濁液に2.5μg/ml添加し、37℃ ６時間静置した。細胞を2％FCS/PBSで2回洗浄後、ストレプトアビジン(SA)-Phycoerythrin (PE)及びFITC-抗MHCクラスI (H-2KbDb)抗体をそれぞれ2.5μg/ml 添加し、4℃20分静置し染色した。細胞を３回洗浄後、フローサイトメーターにより、TCR-Fc（mTRAV8-Fc）、MHCクラスI抗体の結合性を検討した。対照群は、ビオチン化TCR-IgFc（io-mTRAV8 Fc)）添加後、4℃ 1時間静置した後にSA-PE, FITC-抗MHCクラスI (H-2KbDb)抗体を加えた。図７は実験方法を示した図である。
図８Aで示すように、0hでは、MHC クラスIにTCR-IgFc(mTRAV8-Fc)が結合して細胞表面上に存在している（19.6％）が、6hでは、mTRAV8-Fcが結合したMHC複合体が細胞内に移動したと考えられ細胞表面上にはほとんど検出されなかった（2.16％）。また、0hではMHC クラスI の発現が非常に高かったが（図８B、ヒストグラム破線）、6hでは、mTRAV8-Fcが結合したMHCクラスIの細胞内移動により、細胞表面上に発現しているMHCクラスIの発現の低下、すなわち、発現調節が認められた。図８Aの数値は、陽性細胞の割合（％）を示し、図８Bの数値は、Mean Fluorescence Intensity (MFI)を示している。図８Cは、MHCクラスIの細胞内移動により、細胞表面上に発現しているMHCクラスIの発現のMFIを示したグラフである。これらの結果から、MHC クラスIにTCR-Fcが結合することにより、細胞表面上に発現しているMHCクラスIの発現の低下がおこることが明らかとなった。
６．Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE：実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデル作製（図９）
6-8週齢メスC57BL/6マウスに5mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra)の死菌を含有する完全フロイントアジュバント(CFA)に懸濁した50μgのmyelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55ペプチド(MOG: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)（配列番号７）(ANASPEC社)を皮下投与し、同日及び２日後に百日咳毒素(BD Difco)400ngを腹腔内投与することで感作した（Stromenes IM et al., Nat protoc; 1: 1810-9, 2006)。EAEの発症は麻痺の程度を指標とする臨床スコアにて評価した (0: 無症状、1:尾の緊張消失、 2:片側下肢の麻痺、3:両側下肢の麻痺、 4:自力歩行不可、5:致死)。図９に実験方法を示す。
７．EAEにおいて亢進しているＴ細胞受容体をもとにしたキメラタンパク質作製
EAEにおいて亢進していることが報告されているＴ細胞受容体(TCR)α鎖(TRAV9-2D-2+ CDR3(VYFCALRSYNFG(配列番号１０）)（Vα3.2Jα18）、β鎖TRBV16-04+CDR3(CASSLDCGANP（配列番号１１）)+TRBJ1-1-01) (Vβ11DJβ1.1 ) (Battelli E et al., J Exp Med 197: 1073-1081, 2003)に対するＴ細胞受容体キメラタンパク質を作製した。pFUSE-mIgG2A-Fcプラスミド（invivogen社）にTCRα鎖（Vα3.2Jα18:以下TRAV9D-2）、またはTCR β鎖(Vβ11DJβ1.1: 以下 TRBV16-04)の配列をそれぞれライゲーションしてVα3.2Jα18-IgFcプラスミド（TP359）、およびβ11DJβ1.1-IgFcプラスミド（TP360）を作製した。HEK293細胞にプラスミドDNAをトランスフェクションした。翌日にUltralow IgGを含むDMEMへ培地交換し5日間培養した。培養上清を回収した後に、Protein G sepharose (GE Healthcare)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりタンパク精製した。SDS-PAGE法での電気泳動によりＴ細胞受容体キメラタンパク質分画を確認した。
Ｔ細胞受容体をもとにしたＴ細胞受容体キメラタンパク質（TRAV9D-2-Fcfusion protein、TRBV16-04-Fc fusion protein）を作製したので、そのタンパク質を市販のビオチン化キット（Dojindo biotin labeling kit; 和光純薬株式会社）を用いてビオチン化した。
８．抗原ペプチド特異的Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の結合（図１０、図１１）
TCRβ-IgFcキメラタンパク質（TRBV16-04-Fcキメラタンパク質）が、MOGペプチド特異的か否かを調べるため、C57BL/6マウスから脾臓細胞を採取した。脾臓細胞3×105個に対し、20μg/ml MOGペプチド又はOVAペプチドを添加し、4℃で1時間培養した後、2％FBS入りPBSで細胞を洗浄した。その後、Fc受容体を阻害するためFc blockとして2.4G2抗体で前処理し、TCRβ-IgFcキメラタンパク質（TRBV16-04-Fcキメラタンパク質）2.5μg/mlを添加して4℃で1時間培養した。2％FBS入りのPBSで細胞を洗浄した。Dye Light, Alexa 488 (BioLegend, Clone M5/114.15.2)を加え標識した。FACS CantoII (BD Biosciences )及びFlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析した。
図１０で示すように、MOGペプチドの添加で、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質の結合の増加が認められた。数値は、陽性細胞の割合（％）を示している。
さらに、培養細胞株であるRAW264.7細胞を用いて、同様の実験を試みた。RAW264.7細胞を3×105個に対し、20μg/ml MOGペプチド又はOVAペプチドを添加し、4℃で1時間培養した後、2％FBS入りPBSで細胞を洗浄した。その後、Fc受容体を阻害するためFc blockとして2.4G2抗体で前処理し、TRBV16-04-Fc2.5μg/mlを添加して4℃で1時間培養した。細胞を洗浄後、ストレプトアビジン-PEを加え標識して4℃, 20分間静置した後にFACS CantoII (BD Biosciences )及びFlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析した。図１１で示すように、OVAペプチドに対しては、TCRβ-IgFcキメラタンパク質（TRBV16-04-Fc キメラタンパク質）はほとんど結合を認めなかったが、MOGペプチドに対しては、TRBV16-04-Fc キメラタンパク質（TRBV16-04-Fcキメラタンパク質）の結合の増加が認められた。数値は陽性細胞の割合（％）を示している。
９．MHCクラス２分子の細胞内移動（図１２）
RAW264.7細胞3×105個に対し、20μg/mlのMOGペプチドを添加して1時間培養した。細胞を洗浄した後、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質2.5μg/mlを加え、1時間結合させた。細胞を洗浄後、抗I-A/I-E抗体(BioLegend, Clone M5/114.15.2)で1時間染色し、MHCクラスIIを標識した。一群はそのまま観察し（0hr）、もう一群は、37℃で1時間培養した後（37℃ 1hr）、共焦点顕微鏡(Leica TCS SP8)で観察した。画像解析はImage J Plot Profileにより行った(図１２C)。図１２Aは、実験方法の模式図、Bは共焦点顕微鏡による観察写真、Cは共焦点顕微鏡写真について定量的画像解析を行った結果を示している。
TRBV16-04-Fcキメラタンパク質の添加によりMHC クラスIIが細胞内へ移動することが分かり、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質はMHC クラスIIの発現を調節することが示された。
１０．EAEモデルにおけるＴ細胞受容体キメラタンパク質による病原性T細胞に対する阻害効果（図１３、図１４、図１５）
EAEモデル15日目の脾臓及び鼠径リンパ節を採取し、2×105 cellsをMOG 20μg/ml及びＴ細胞受容体キメラタンパク質（TRBV16-04-Fc キメラタンパク質、TRAV9D-2-Fcキメラタンパク質）5ug/mlを添加した群及び添加しない群を作製して48時間培養した。さらに、PMA 50 ng/ml及びイオノマイシン500 ng/mlを培地中に加え4.5時間培養した。その後、抗CD4抗体(BioLegend; Clone GK1.5)にて細胞表面標識を行った後に、30分間permeabilization buffer 100μl中で懸濁し細胞膜透過処置とした。抗IFN-γ抗体 (BioLegend; Clone XMG1.2)、抗IL-17抗体 (BioLegend; Clone B114205)にて細胞内染色を行った。FACS Canto II (BD Biosciences )及びFlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析した。図１３Aは実験方法の模式図、図１３Bは、IFN-γ陽性CD4+ T細胞の割合を示している。図１３Bにおいて、TRAV9D-2-Fcキメラタンパク質（Vα3.2Jα18-IgFcキメラタンパク質）では阻害効果を認めなかったが、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質（Vβ11DJβ1.1-IgFc キメラタンパク質）を添加することでIFN-γ陽性CD4+ T細胞の割合が減少しており、阻害効果を認めた。
MOG 20μg/ml及びFc融合タンパク投与下に2日間培養後の細胞をPMA及びイオノマイシンにて再刺激した後に、フローサイトメトリーにより解析したところ、脾臓及び鼠径リンパ節いずれもTRAV9D-2-Fcでは阻害効果を認めなかったが、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質投与群が非投与群と比較して少なかった(図１４A、B)。また、CD4+ T細胞の割合も著明に減少していた(図１４C、D)。MOG 0, 2, 20μg/ml及びＴ細胞受容体キメラタンパク質2.5μg/ml存在下に2日間培養した細胞を、PMA及びイオノマイシンにて刺激した後に、フローサイトメトリーにより解析した。生細胞と思われる集団の割合がTRBV16-04-FcT投与群で減少しており(図１５A)、CD4+ Ｔ細胞の割合が減少していた(図１５B)。
これらの結果は、TRBV16-04-Fcは、病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず、MHCの発現を調節して、病原性Ｔ細胞の活性化、細胞増殖の抑制を誘導すると考えられた。
１１．移植拒絶モデルであるリンパ球混合培養（MLR）を用いたＴ細胞受容体（TCR）レパートリー解析（図１６、図１７）
リンパ球混合培養は以下の方法で行った。8週齢雌のBalb/cマウス (H-2KdDd)から脾臓を摘出して単核球に分離後、溶血を行った。これを5％FCS/RPMIに懸濁した後に、X線照射(20 Gy)を行い、本実験におけるStimulator cellとした。次に8週齢雌のC57BL/6マウス(H-2KbDb)脾臓から同様に細胞懸濁液を調製し、Responder cellとした。10％FCS入りRPMI1640完全培地で7日間、37℃で培養した。培養後、細胞を回収して上記の方法にてＴ細胞レパートリー解析を行った。コントロールには、C57BL/6マウス(H-2KbDb)脾臓から調整した細胞を用いた。上記の方法でＴ細胞受容体レパートリー解析を行った。
図１６は、リンパ球混合培養におけるＴ細胞受容体レパートリー解析、α鎖の結果であり、図１７は、β鎖の結果である。図で示すようにα鎖、β鎖それぞれ複数のMLRで反応するTCRを特定することができた。その中で任意のTCRをクローニングした。このクローニングしたTCRは以下のとおりである。TCRα鎖：TRAV 7D-4-1 CDR3 AARLTGNTGKLI TRAJ 37-01（配列番号８：以下 TRAV7D-4-1)及びTCRβ鎖：TRBV31-01 CDR3 AWRDWGNYAEQF TRBJ 2-1-01（配列番号９: 以下 TRBV31-01）。これらクローニングしたTCRを用いて、上記の方法により、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を作製した。
１２．in vitro MLRにおけるresponder T cell の活性化・増殖に対するTCR-Fcの効果（図１８、図１９）
8週齢雌のBalb/cマウス (H-2KdDd)から脾臓を摘出し、通法により細胞懸濁液を調製した。これを5％FCS/RPMIに懸濁した後に、X線照射 (20 Gy)を行い、本実験におけるStimulator cell (S)とした。次に8週齢雌のC57BL/6マウス(H-2KbDb)脾臓から同様に細胞懸濁液を調製し、Responder cell (R)とした。細胞増殖の検討のために一部の細胞は、CFSE (5μM)によりラベルを行った。
Responder cell (R)は1×106 cells /50μl (in 10％ FCS / RPMI)に調製し、R:S比が 1 :1 , 5 :1, 10: 1となるように96-well U底プレートにSを50μlに調整して播種した。また、in vitro MLRにより同定したTCRα(TRAV 7D-4-1 CDR3 AARLTGNTGKLI TRAJ 37-01)及びβ鎖(TRBV31-01 CDR3 AWRDWGNYAEQF TRBJ 2-1-01)をそれぞれpFuse mIgG2a vector (invivogen:以下それぞれTRAV7D-4-1-Fc, TRBV31-01-Fc)に組換え、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を作製した。Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を含む培養上清100μlを in vitro MLRに添加してその反応を観察した。Responder cell (R)の活性化は培養72時間後にH-2Kd-CD8a+CD62Llowを、細胞増殖はCD8a+CFSElow細胞として、フローサイトメトリー法により検討した。
図１８に示すように、Ｔ細胞受容体α鎖キメラタンパク質及びＴ細胞受容体β鎖キメラタンパク質を加えた群のどちらにおいても、H-2Kd-CD8a+CD62Llow細胞集団の割合が減少していた。図の数値は当該分画の細胞の割合（％）を示している。このH-2Kd-CD8a+CD62Llow細胞は、活性化細胞でありこの割合の減少は、TRAV7D-4-1-Fc, TRBV31-01-Fcの両方とも、MLRの活性化を阻害することを意味している。
図１９では、TRAV7D-4-1-Fc, TRBV31-01-Fcを加えた群のどちらにおいても、CD8a+CFSElow細胞の細胞増殖が減少していた。図の数値は当該分画の細胞の割合（％）を示している。すなわち、Ｔ細胞受容体α鎖キメラタンパク質及びＴ細胞受容体β鎖キメラタンパク質の両方とも、MLRにおける活性化細胞の細胞増殖を阻害することを示している。
MLRは、臓器移植拒絶反応のin vitro簡易実験系であり、ドナーMHCに対するＴ細胞が臓器移植拒絶反応の主たる病原性Ｔ細胞と考えられている。したがって、Ｔ細胞受容体α鎖キメラタンパク質及びＴ細胞受容体β鎖キメラタンパク質は、ドナーMHCに結合して病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず、ドナーMHCの発現を調節することで、病原性Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害するものと考えられた。
１３．金属アレルギーにおけるTCR-IgFc による活性化Ｔ細胞の阻害効果（図２０、図２１）
金属アレルギーマウスモデルを用いて、図２０に示すようにマウスのパラジウム感作とin vitroでの再刺激を行った。Day 0, Day 7に10 mM PdCl2と10μg/ml LPSの混合溶液を両鼠径部に125μlずつ皮下投与して感作を行った。2回目感作の7日後に、脾臓を採取し、1×106個の細胞を 0, 100 μMのPdCl2で16時間再刺激を行った。一部のウェルにはパラジウムアレルギーにおいて同定したTCRα鎖(TRAV8-1-01-CDR3(ATLYSGGSNAKLT)-TRAJ42-01)とmIgG2aFc領域とのキメラタンパク質を0, 10μg/ml添加した。その後、細胞内染色によりIFN-γをフローサイトメトリーにより測定した。
図２１において、CD8T細胞は、100μMのPdCl2添加により細胞の増加が認められるが、TCRα鎖キメラタンパク質を加えることで、細胞の増加は抑制された。このことは、金属アレルギーにおける病原性T細胞の活性化・増殖をＴ細胞キメラタンパク質が抑制できることを意味している。金属アレルギーは、金属アレルギー物質がMHCで抗原提示されるため起こると考えられている。Ｔ細胞キメラタンパク質は、病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず、MHCの発現を調節することで、病原性Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害するものと考えられた。
[実施例２]
１．EAE治療実験
（１）可溶型TCRの構築及びタンパク質精製
すでに報告されているMOG反応性TCR(:2D2 TCR) (TRAV9-2D-2+ CDR3(VYFCALRSYNFG(配列番号１０）)+TRAJ23, TRBV16-04+CDR3(CASSLDCGANP（配列番号１１）)+TRBJ1-1-01) を、それぞれヒトIgG Hole /pcDNA3.4, ヒトIgG Knob / pcDNA3.4にHiFi Assemblyにより組換えた。これら２つのプラスミドをExpi293Fにリポフェクションにより導入し、knob-into-holeにより、TCRα-TCRβの可溶型ヘテロ二量体を産生させた。37℃ 8% CO2, 125 rpmで7日間培養し、培養上清をProtein G Sepharose(GE Healthcare)カラムを用いて、TCR-Fc融合タンパク質(2D2 TCRαβ-Fc)を精製した。
（２）Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE：実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデル作製及びEAE治療実験
6-8週齢メスC57BL/6Jに5mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra)の死菌を含有する完全フロイントアジュバント (CFA)に懸濁した200μgのmyelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55ペプチド(MOG: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)（配列番号７）(ANASPEC社)を10日前および0日目に皮下投与し、MOGペプチド皮下投与同日および2日後に百日咳毒素(BD Difco)200ngを腹腔内投与することで免疫した。Fc融合タンパク質は、MOGペプチド投与4時間前に皮下投与した。対照(cont)として、PBSを投与した。発症は麻痺の程度を指標とする臨床スコアにて評価した (0: 無症状、1:尾の緊張消失、2:片側下肢の麻痺、3:両側下肢の麻痺、 4:自力歩行不可、5:致死)。
図２２に実験方法の概要を示す。
結果を図２３に示す。図２３に示すように、Fc融合タンパク質（TCR-Fc 2D2 TCRαβ-Fc)を投与した場合に、症状の進行を抑制することができた。
さらに、17日目までの臨床スコア３以上に到達したマウスの比率の結果を図２４に示す。17日目までの臨床スコア3以上に到達したマウスは、Fcタンパク非投与群(w/o Fc-protein)では66.7% (6/9)であったのに対して、TCR-Fc（2D2 TCRαβ-Fc） 10μg x2投与群は33.3% (1/3)、TCR-Fc（2D2 TCRαβ-Fc） 25μg x2投与群は0% (0/3)であった。この結果から、TCR-Fcの投与により、スコア３以上は有意に減少していることが明らかになった。すなわち、2D2 TCRαβ-Fcの投与によりEAEの症状の重篤化が抑制された。以上のことから2D2 TCRαβ-Fcは、EAEの症状の進行を抑制するのみならず、EAEの重篤化の抑制に効果があることが示された。
２．金属アレルギー治療実験
（１）可溶型TCR-Fcの構築及びタンパク質精製
C57BL/6マウスへのパラジウムアレルギー誘導により、上昇が認められたTCRα (TRAV7-2-02+ CDR3 (AATSSGSWQLI(配列番号１２）) + TRAJ22-01)をpFuse mIgG2a ベクター(invivogen)に組換え、mIgG2aとの融合タンパク質のプラスミドを構築した(mTRAV7-Fc/pFuse)。本プラスミドをExpi293F 細胞(Thermo Fisher Sciences)にリポフェクションにより導入した。その後、37℃ 8% CO2, 125 rpmで7日間培養し、培養上清をProtein G Sepharose(GE Healthcare)カラムを用いて、Fc融合タンパク質を精製した。
（２）金属アレルギーモデルマウスの作製及び可溶型TCR-Fc投与による治療実験
0日め、7日めに野生型C57BL/6マウスに10 mM PdCl2, 10 μg/ml LPSに調製した混合液を、両鼠径部に125μlずつ皮下投与し、感作を行った。その7日後、PdCl2 10 mMを後肢footpadに25μl皮下投与し、アレルギーを惹起した。24時間毎に足蹠厚を測定した。可溶型TCRは感作および惹起の1時間前にmTRAV7-Fc, mIgGFc (対照（cont))をそれぞれ10 mM、陽性対照として抗ヒスタミン薬の１つであるオロパダジン（OLP)を1 mg/Kg腹腔内投与した。
図２５に実験方法の概要を示す。
結果を図２６に示す。図２６に示すように、TCR-Fc融合タンパク質（TRAV7-Fc)を投与した場合に、足蹠厚の肥大は陽性対照と同程度に抑制された。したがって、TCR-Fcは、金属アレルギーにおいて、既存薬である抗ヒスタミン薬と同程度の効果があることが示された。
本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応やアレルギー性疾患の治療や検出に用いることができる。
配列番号１〜４、７〜１２ 合成
配列番号５、６ プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (36)

  1. 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
  2. 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
  3. アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させるMHC分子複合体発現低下剤。
  4. Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  5. Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、あるいはγ鎖及び／又はδ鎖である請求項１〜４のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  6. 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  7. ２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  8. Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  9. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  10. 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
  11. 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、臓器移植の拒絶を引き起こすＴ細胞の機能を低下させるための、Ｔ細胞機能低下剤。
  12. アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、アレルギー性疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
  13. Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  14. Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、あるいはγ鎖及び／又はδ鎖である請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  15. 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  16. ２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  17. Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  18. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  19. 請求項１及び４〜９のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
  20. 請求項２及び４〜９のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
  21. 請求項３〜９のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
  22. 請求項１０及び１３〜１８のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
  23. 請求項１１及び１３〜１８のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
  24. 請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
  25. 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体は自己免疫疾患に罹患していると判定する、自己免疫疾患検出方法。
  26. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項２５記載の自己免疫疾患検出方法。
  27. 自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む自己免疫疾患検出用試薬。
  28. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項２７記載の自己免疫疾患検出用試薬。
  29. 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体において拒絶反応が生じていると判定する、臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応検出方法。
  30. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項２９記載の拒絶反応検出方法。
  31. 臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む拒絶反応検出用試薬。
  32. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項３１記載の拒絶反応検出用試薬。
  33. アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体はアレルギー性疾患に罹患していると判定する、アレルギー性疾患検出方法。
  34. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項３３記載のアレルギー性疾患検出方法。
  35. アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含むアレルギー性疾患検出用試薬。
  36. MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項３５記載のアレルギー性疾患検出用試薬。
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