JP2788979B2 - 新規抗体及びその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、枯草熱等のアレルギー
疾患の治療に有用な新規な抗体及びその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】非本態性喘息、枯草熱、特定の食品また
は薬品に対するアレルギー反応などの即時型過敏症は、
主に免疫クロブリンＥ（ＩｇＥ）が媒介している。Ｉｇ
Ｅ媒介アレルギー反応では、アレルゲンがマスト細胞及
び好塩基性白血球（好塩基球）の表面上のＩｇＥと結合
する。この結合により、ＩｇＥ分子の、従ってＩｇＥの
定常領域（ＦｃεＲ）に対する潜在的受容体の架橋が発
生し、そのためヒスタミン、アナフィラキシー症の遅反
応性物質及びセロトニン等の薬物メディエータの放出が
引き起こされる。これらのマスト細胞及び好塩基球産出
物の放出により、アレルギーの様々な病理的症状が発生
する。

【０００３】ＩｇＥ媒体過敏反応症にかかっている患者
は、症状の軽減のために抗ヒスタミン剤で治療すること
が多い。また、枯草熱の季節には、長引くアレルギー反
応を防止または軽減するために減感作療法が用いられ
る。これらの療法では、少量のアレルギー源を定期的に
注射することによって、十分には理解されていないがＩ
ｇＥ媒体反応を幾分軽減する特定の免疫反応を引き起こ
す。減感作療法は特定の患者には効果的であるが、それ
以外の患者にはあまり効果がない。

【０００４】ＩｇＥがマスト細胞及び好塩基球と結合す
ることを阻止することによってＩｇＥ媒体アレルギーを
治療できると言われている。例えば、ＩｇＥの定常領域
（Ｆｃε）の様々な領域を代表する合成ペプチドが、マ
スト細胞及び好塩基球上の受容体とＩｇＥが結合するの
を阻害する競合阻害物として開発されている。例えばス
タンワース（Stanworth ）Ｄ．Ｒ．のMolec.Immun.２
１：１１８３〜１１９０（１９８４）、スタンワース
Ｄ．Ｒ．及びバート（Burt）Ｄ．Ｓ．のMolec. Immun.
２３：１２３１〜１２３５（１９８６）、バートＤ．
Ｓ．他のMolec. Immun. ２４：３７９〜３８９（１９８
７）、ハーン（Hahn）の米国特許第４，６８３，２９２
号、及びハンバーガーの米国特許第４，１７１，２９９
号及び第４，１６１，５２２号を参照されたい。しか
し、恐らくはＩｇＥ全体に較べてこれらのペプチドはＦ
ｃεＲに対する親和性が極めて低いために、そのような
ペプチドはアレルギーの治療にあまり効果的ではなかっ
た。

【０００５】近年、ＩｇＥ上の様々な抗原及び機能的抗
原決定基の地図を作成するために単一クローン性抗体法
が用いられている。バニヤシュ（Baniyash）及びアッシ
ャー（Eur. J. Immunol.１４：７９９〜８０７（１９８
４））は、ＩｇＥに対して作られた幾つかのラット単一
クローン性抗体の中の３つがマウスＩｇＥのラット好塩
基性細胞との結合を阻害したと報告している。抗体はＩ
ｇＥと結合した好塩基球からのセロトニンの放出も誘発
するので、抗体は恐らく好塩基球上のＩｇＥに対する受
容体と結合する位置ではないがその付近である定常領域
上の部位に結合したのである。さらに最近では、同研究
者達は、ＩｇＥの好塩基性細胞との結合を阻害するが好
塩基球表面上のＩｇＥを認識しない単一クローン性抗体
を開発した。バニヤシュ他のMolec. Immunol. ２５：７
０５（１９８８）。シラガニアン及びその仲間は、ヒト
ＩｇＥに対して作られた約１０のマウス単一クローン性
抗体の中の２〜３が好塩基球上のＩｇＥと結合できない
ことを報告している（Fed.Proc.４０：９６５（１９８
１）、Fed. Proc.４６：１３４６（１９８７）を参照さ
れたい）。彼らはまた、これらの単一クローン性抗体の
一部がヒトＩｇＥの好塩基球との結合を阻害できると書
いている。これらの研究は、ＩｇＥ上の様々な抗原決定
基または機能的に関連したペプチドセグメントを明確に
するために単一クローン性抗体を使用することを提唱し
ている。

【０００６】最近では、ホィッタカー（Whitaker）が、
ＩｇＥイソタイプに特異な免疫毒素及びそれをアレルギ
ーの治療に利用することについて述べている。米国特許
第４，７１４，７５９号を参照されたい。免疫毒素は、
毒素と結合した抗ＩｇＥ抗体を有している。この治療で
意図されている薬理的機構は、ＩｇＥイソタイプに特異
な免疫毒素がＩｇＥ産出細胞を殺すことである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、枯草
熱等のアレルギー疾患の治療に有用な新規な抗体を提供
することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＩｇＥ分子上
の独特な抗原決定基と、これらの決定基の発見に基づい
たＩｇＥ媒体アレルギーの治療の試薬及び方法とに関し
ている。これらの抗原決定基はＩｇＥ産出性Ｂリンパ球
（Ｂ細胞）上に存在するが、好塩基球及びマスト細胞上
には存在しない。

【０００９】ＩｇＥはＩｇＥ産出性Ｂ細胞だけによって
産出されるが、それはこれらの細胞上に存在するだけで
なく、マスト細胞及び好塩基球上にも存在する。ＩｇＥ
は好塩基球及びマスト細胞の表面上のＦｃεＲに対する
親和性が非常に高く（結合定数Ｋａは１０⁹ 〜１０¹⁰リ
ットルモル^-1）、解離速度は非常に遅い（「オン」期間
の半減期は約２０時間である）。このため、ＩｇＥは実
質的に好塩基球及びマスト細胞の表面抗原である。

【００１０】本発明のＩｇＥ上の抗原決定基はＩｇＥ産
出性Ｂ細胞上に存在するが、好塩基球またはマスト細胞
上には存在せず、このため、この抗原決定基はＩｇＥ産
出性Ｂ細胞の独特な表面マーカーである。この抗原決定
基はｉｇｅ．ｂｌ．（ｂｌはＢリンパ球を表す）と呼ば
れる。Ｂ細胞上のＩｇＥは、膜脂質二重層に渡るように
して膜に固定された膜結合型であり、好塩基球及びマス
ト細胞上のＩｇＥは、ＦｃεＲ分子に結合することによ
って細胞表面上に固定された分泌型である。これらの２
種類のＩｇＥの全体構造は幾分異なっており、膜結合型
はエキストラセグメントを備えている。細胞表面との結
合の全体的特徴も、Ｂ細胞上のＩｇＥと好塩基球上のＩ
ｇＥとでは異なっている。あるクラスのｉｇｅ．ｂｌ．
抗原決定基は、ＩｇＥ分子の定常領域内のＦｃεＲの結
合部位またはその付近に位置している。これらの抗原決
定基はＦｃεＲとの結合によって目立たなくなる。別の
クラスのｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基は、免疫グロブリン
εＨ鎖の膜結合領域の細胞外セグメントの部分を包囲す
る抗原決定基である。一般的に、様々な膜結合免疫グロ
ブリンのこれらのセグメントはｍｂ／ｅｃと呼ばれる。
ＩｇＥのｍｂ／ｅｃセグメントはεｍｂ／ｅｃセグメン
トと呼ばれる。本発明は、εｍｂ／ｅｃセグメントの配
列決定に関するものである。

【００１１】ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基の識別により、
ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基と特異的に結合する試薬に基
づいたＩｇＥ媒介アレルギーの様々な形式の治療及び診
断を行うことができる。これらには非本態性気管支喘
息、アレルギー性鼻炎、枯草熱等のアレルギー性疾患並
びに植物及び薬品アレルギーが含まれる。ｉｇｅ．ｂ
ｌ．抗原決定基と特異的に結合する好適な試薬は単一ク
ローン性抗体及びそれのフラグメントである。しかし、
本発明の治療方法では、特異的に結合する試薬は、ｉｇ
ｅ．ｂｌ．抗原決定基と特異的に結合する（従って好塩
基球とは結合しないでＩｇＥ産出性Ｂ細胞と結合する）
ものであればどの分子でもよい。これらの試薬には、抗
ｉｇｅ．ｂｌ．抗体の抗原結合領域（可変または超可変
領域）と同一またはそれに類似した合成ペプチドが含ま
れる。以下の説明は主に抗ｉｇｅ．ｂｌ．抗体に焦点を
合わせているが、概念及び方法はここに記載する独特な
抗原決定基に特異なその他の分子にも同様に適用可能で
ある。

【００１２】ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基に特異な単一ク
ローン性抗体を用いてＩｇＥ産出性細胞を選択的に破壊
することができる。ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基はＩｇＥ
産出性Ｂ細胞上に存在するがマスト細胞または好塩基球
上に存在しないので、ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基に特異
な単一クローン性抗体はＢ細胞と結合するが、マスト細
胞または好塩基球とは結合しない。この結合の差異によ
り、ＩｇＥ産出性Ｂ細胞を狙って選択的に排除すること
ができる。遊離型または毒素結合型のいずれかの抗体を
用いて、Ｂ細胞を狙って選択的に排除することができ
る。単一クローン性抗体は、ＩｇＥに結合するＦｃεＲ
の結合部位またはその付近のｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基
に特異であるので、さらなる治療効果を持つことができ
る。抗体はＩｇＥと結合して免疫の複合体を形成するの
で、網内皮系による免疫系からのＩｇＥの排除が容易に
なる。

【００１３】本発明はさらに、ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定
基と反応する抗体のパロトープ（parotope）特異的、抗
イデオタイプ性抗体、及び抗原決定基（例えばＦｃεＲ
結合部位）をモデルとして形成されたペプチドに関し及
び、ＩｇＥ媒介アレルギー疾患の治療にこれらの抗イデ
オタイプ性抗体を使用すること及びこれらのペプチドを
使用することにも関している。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】１．免疫グロブリンＥの独特な抗原決定基 本発明は、ＩｇＥに特有に存在する抗原決定基（ｉｇ
ｅ．ｂｌ．）の発見に基づくものである。これらの抗原
決定基はＩｇＥ産出性Ｂリンパ球上に存在するが、マス
ト細胞及び好塩基球上には存在しない。あるクラスのｉ
ｇｅ．ｂｌ．抗原決定基はＦｃεＲの結合部位またはそ
の付近に位置している。これらの抗原決定基がＩｇＥ産
出性Ｂ細胞上のみに存在することによって、ＩｇＥが好
塩基球及びマスト細胞上のＦｃεＲと結合した時にはこ
の抗原決定基は目立たなくなる。ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決
定基は恐らく幾つかの抗原的に異なった部位からなり、
その各々は、ヒトＩｇＥ産出性Ｂ細胞と反応するが好塩
基球とは反応しない単一クローン性抗体、例えばＥ８−
５−３, Ｅ１１−４−７０, Ｅ１０１−１及びＥ１０−
１２−５５（以下を参照されたい）との反応性によって
区分けすることができる。

【００１６】別のクラスのｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基は
εｍｂ／ｅｃ抗原決定基である。これらの抗原決定基
は、免疫グロブリンの膜結合型上に存在するが、分泌型
には存在しない。Ｂ細胞は表面上に、免疫学的誘発時に
抗原の受容体として機能するＩｇＥなどの抗体分子を出
している。膜結合免疫グロブリンは、Ｂ細胞表面上に固
着できるようにするエキストラペプチド断片を備えてい
る点で、同じ細胞で合成される分泌性溶解免疫グロブリ
ンとは異なっている。アミノ酸配列が決定されている個
別種のＢ細胞上の１０の膜結合免疫グロブリンはすべ
て、免疫グロブリンを膜に固着させるエキストライソタ
イプ特異領域を備えている。これらのペプチド領域は４
１〜７２個のアミノ酸を並べた長さであり、細胞膜に対
する位置で３つのセグメントに分割することができる。
２５個の疎水性かつ非極性アミノ酸残基からなる中間セ
グメントは膜の脂質二重層内にあり、３〜２８個のアミ
ノ酸残基からなるＣ末端疎水性セグメントは細胞内にあ
り、１３〜２７個のアミノ酸残基を含有しているＮ末端
側のセグメントは酸性及び親水性が高く、細胞膜の外側
表面上にある。マウス及びラットＩｇＥの膜結合領域の
この部分には１９個のアミノ酸残基があり、その中の１
０個はＧｌｕまたはＡｓｐ残基である。細胞外セグメン
トの長さ及び親水性及び高い極性は、このセグメントが
抗体に露出して接触しやすいことを示している。

【００１７】ＩｇＥは体内の３種類の細胞、すなわちＩ
ｇＥ産出性Ｂ細胞、好塩基球及びマスト細胞の表面上に
だけ存在するので、これらのｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基
はｉｇｅ．ｂｌ．産出性Ｂ細胞の実質的に独特な細胞表
面マーカーである。これらの新しいマーカーにより、Ｉ
ｇＥ媒体アレルギー疾病の幾つかの形式の単一クローン
性抗体による療法が可能となる。

【００１８】２．ＩｇＥ産出性Ｂ細胞と結合するが好塩
基球とは結合しない単一クローン性抗体 ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基に特異な単一クローン性抗体
は、ＩｇＥ産出性Ｂ細胞の表面上のＩｇＥと結合する
が、好塩基球とは結合しない。ＩｇＥ産出性細胞タイプ
のこの結合の差異が、抗体に対する治療及び診断に利用
する根拠である。

【００１９】抗体が好塩基球と結合してヒスタミンの放
出を誘発しないことが極めて重要である。マスト細胞及
び好塩基球からのアレルギーの薬物メディエータの放出
を引き起こす最も強力な試薬の１つは抗ＩｇＥ抗体であ
る。従来の抗ＩｇＥ抗体はマスト細胞及び好塩基球の表
面上のＩｇＥと結合してアレルギーの薬物メディエータ
の放出を引き起こす。本発明の抗体はこれらの細胞上の
ＩｇＥと結合しないが、それは同族抗原決定基がマスク
されているためにこれらの細胞からのヒスタミンの放出
を誘発しないからである。

【００２０】３．ＩｇＥ産出性細胞の選択的排除による
ＩｇＥ媒介アレルギーの治療 Ａ．ＩｇＥ産出性細胞に特異的な抗体 ねずみ、ヒトまたはマウス／人キメラ抗体等のＩｇＥ産
出性Ｂ細胞に特異な抗体はＩｇＥ媒介アレルギーの治療
に幾つかの方法で用いることができる。このため、抗体
はＩｇＥ産出性Ｂ細胞を選択的に排除するために使用す
ることができる。抗体は、免疫機能を媒介する作働試薬
として、あるいは以下に記載するように作働物質を運ぶ
ための毒素または細胞毒剤のキャリヤ試薬として使用す
ることができる。

【００２１】標的細胞上の表面抗原に特異な抗体が媒介
できる様々な免疫機能の中に、抗体及び補体媒介細胞分
解と、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）とがある。抗体は
免疫調節機能も媒介する。あるＩｇＧサブクラスの抗
体、例えばマウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１及びＩｇ
Ｇ３は、ある定常領域受容体産出性食細胞リンパ球によ
って実施されるＡＤＣＣを媒介することができる。例え
ば、ヒトＴ細胞表面抗原に特異なマウスＩｇＧ２ａ単一
クローン性抗体であるＯＫＴ３（治療薬として市販する
ことを米国食品医薬品局によって認可された最初の単一
クローン性抗体）を患者に使用すると、血液中のＴ細胞
が急激に消失して（腎臓移植に対する）免疫抑制状態が
誘導される。ラッセルＰ．Ｓ．他のAnnu. Rev. Med. ３
５：６３−７９（１９８４）；ノーマンＤ．Ｊ．他の
「移植プロセス」（Transpl. Proc.）１７：３９−４１
（１９８５）。ＯＫＴ３を一患者に５ｍｇ／日の割合で
投与することにより、循環中のＴ細胞を完全になくすこ
とができる。本発明の抗体、特にマウスガンマ２ａ抗体
またはヒトガンマ−１またはガンマ−３鎖を産出するキ
メラ抗体を使用すれば、ＡＤＣＣ機構によってＩｇＥ産
出性Ｂ細胞をなくすことができる。抗体は、ＩｇＥ媒介
アレルギー疾患の患者にＩｇＥ産出性細胞をほとんど排
除し、従ってＩｇＥをほとんどなくすことができるだけ
の量を遊離抗体として投与する。例えば、一患者の投与
量を１〜５０ｍｇにすることができる。この処置は１回
または数回の注射で行うことができる。Ｂ細胞を排除す
るために必要な抗体の存在期間及び抗体の量は、ＩｇＥ
の好塩基球及びマスト細胞との結合を継続的に阻止する
ために必要なもの以下である。

【００２２】上記治療目的には、ヒト抗体が最適であ
る。しかし、ヒト抗体は大量に産出することが難しい。
その代わりとして、キメラ性すなわち「近ヒト」抗体が
好適である。キメラ抗体は、動物（例えばマウス）抗体
から誘導された可変または抗原結合（超可変または相補
性決定）領域と、ヒト抗体から誘導された残りの領域と
を有している。キメラ性（例えばネズミ／ヒト）抗体を
産出する方法を以下に説明する。キメラ性抗体は大量に
産出することができ、非ヒト抗体よりも人間での免疫性
が少ない。従って、これらは、特に長期に渡って繰り返
し投与する必要がある時、動物抗体よりも生体内投与に
適している。キメラ性抗体の抗体フラグメントも使用す
ることができる。

【００２３】本発明の抗体を用いた免疫療法は、従来の
減感作免疫療法と組み合わせて用いることができる。例
えば、アレルギー原の減感作を抗ｉｇｅ．ｂｌ．抗体ま
たは免疫毒素の投与と組み合わせて実施することにより
（次項Ｂを参照）、ＩｇＥ産出性細胞をほとんどなくす
ことができる。減感作の１つの大きな効果は、ＩｇＧが
アレルギー原／免疫原に対して誘発されることである。
ＩｇＥ産出性Ｂ細胞がほとんどなくなった時、ＩｇＧ反
応の誘発が最も効果的である。抗体と減感作療法の組合
せは魅力的な療法形式である。ＩｇＥ産出性Ｂ細胞は抗
ｉｇｅ．ｂｌ．抗体によって一時的に（２〜３週間また
は２〜３カ月）消失するが、最終的には再び発生する。
減感作療法はもっと長く持続する効果を持っている。 Ｂ．ｉｇｅ．ｂｌ．特異抗体とＡＤＣＣ促進因子とを組
み合わせた免疫療法

【００２４】多くの因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球
単核球−群体刺激因子）またはＭ−ＣＳＦ（単核球−群
体刺激因子）が、ＡＤＣＣを媒介するものを含めて白血
球の増殖を誘発することが知られている。試験管内実験
では、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦが、腫瘍細胞上に現
れた表面抗原に特異な単一クローン性抗体によって媒介
された腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性を増加させるとわ
かっている。アレルギー治療におけるｉｇｅ．ｂｌ．特
異単一クローン性抗体の治療効果は、ＡＤＣＣ活性を高
める因子の使用を組み合わせることによって増強できる
と考えられる。

【００２５】Ｃ．ＩｇＥ産出性細胞に特異な免疫毒素 ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基は、ＩｇＥ産出性Ｂ細胞を攻
撃する免疫毒素にとって非常に特異的な標的となる。抗
原決定基に特異な免疫毒素はＩｇＥ産出性Ｂ細胞と結合
するが、マスト細胞または好塩基球とは結合しない。こ
のようにして、ＩｇＥ産出性Ｂ細胞をＩｇＥ媒介アレル
ギーの患者内で選択的に減少させるか、なくすことがで
きる。ＩｇＥ産出性細胞の減少により、循環中のＩｇＥ
値が減少する結果、マスト細胞及び好塩基球と結合する
ことができるＩｇＥの量が減少する。免疫毒素は、マス
ト細胞または好塩基球を殺してこれらの細胞からの薬物
メディエータの放出を引き起こすことはない。ＩｇＥ産
出性リンパ球と選択的に結合する免疫毒素は、ｉｇｅ．
ｂｌ．抗原決定基に特異な結合剤と複合化した細胞溶解
または細胞素剤からなる。好適な特異的な結合剤は、抗
ｉｇｅ．ｂｌ．抗体またはそのフラグメント（例えばＦ
（ａｂ）’２、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはそれらの類似体ま
たは誘導体）である。細胞溶解剤は、リシン、シュード
モナス菌毒素、ジフテリア毒素、アメリカヤマゴボウ抗
ウイルスペプチド、トリコセシーン（trichothecene
）、放射性核種、及び膜分解酵素を含む入手可能な物
質のいずれかから選択できる。抗体と細胞毒素とは、化
学的または遺伝工学的技法によって複合させることがで
きる。

【００２６】免疫毒素は、患者内のＩｇＥ産出性リンパ
球を減少させるかなくすことができる量をＩｇＥ媒介ア
レルギーの患者に投与することにより、ＩｇＥ媒介アレ
ルギーの症状を防止するか軽減することができる。免疫
毒素は単独で使用したり、あるいは遊離抗ＩｇＥ抗体と
組み合わせて使用することもできる。

【００２７】４．好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＥと
結合しない単一クローン性抗体によるＩｇＥの除去 ある実施例では、本発明の単一クローン性抗ＩｇＥ抗体
が可溶性ＩｇＥのＦｃεＲ結合部位またはその付近に位
置しているｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基と結合する。それ
により、抗体がマスト細胞及び好塩基球に対するＩｇＥ
上の結合部位を塞ぎ、これも治療効果の一部を担う。こ
の効果的と思われるさらなる治療機構を達成するため、
ＦｃεＲがＩｇＥと結合する親和力よりも大きい親和力
で抗体が抗原決定基と特異的に結合しなければならな
い。このように特異性と親和性とを組み合わせることに
より、薬学的実現可能濃度でＩｇＥがＦｃεＲと結合す
ることを効果的に阻止できる。また、ＩｇＥ及び単一ク
ローン性抗体の免疫複合体は、網内皮系の細胞によって
急速に除去される。単一クローン性抗体を静脈注射する
と、恐らくは循環中のほとんどのＩｇＥ分子が免疫複合
体を形成して、急速に除去される。これらの機構によ
り、治療単一クローン性抗体が十分なレベルで存在して
いる限り、被治療患者の体内の遊離ＩｇＥの値が減少す
る。これらの様々な機構は、治療抗体の短期的効果に役
立つはずである。しかし、長期的な治療効果はこれらの
機構以外で達成されるのであろう。３日間の血清半減期
でＩｇＥが始動して急速に再生するので、ｉｇｅ．ｂ
ｌ．抗体に基づいた治療はＩｇＥ産出性Ｂ細胞をなくす
か減少させることが最も効果的であろう。親和性は親和
または結合定数でＫａで表すことができる。マスト細胞
及び好塩基球のＦｃεＲの予想Ｋａは１×１０⁹ 〜１×
１０¹⁰リットル／モルである。クルジッキ（Kulczycki
）Ａ．の「アレルギーにおける新しい流れII」（リン
グＪ．及びバーグＧ．編）ｐｐ．２５〜３２、ニューヨ
ーク、スプリング−バーラグ、（１９８６）。このよう
に、単一クローン性抗ＩｇＥ抗体は、それのＩｇＥに対
する親和定数がおよそ１×１０⁹ リットル／モルかそれ
以上である場合、ＦｃεＲと効果的に競合する。一般的
に、単一クローン性抗体のＫａは１×１０⁹ リットル／
モル以下である。その結果、抗体が上記抗原決定基に対
して適当な特異性を備え、上記機構によってＩｇＥ産出
性Ｂ細胞をなくすことができるとしても、薬学的実現可
能濃度でＩｇＥに対してＦｃεＲと効果的に競合できる
値のＫａでなければ、このさらなる治療効果を持つこと
ができない。

【００２８】好適な実施例では、本発明の単一クローン
性抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥに対するＫａは、ＩｇＥに対す
るＦｃεＲの親和性に匹敵するか、それ以上である。体
内のマスト細胞及び好塩基球はＩｇＥと結合し、ほとん
どではＦｃεＲの大部分がＩｇＥで飽和されている。Ｉ
ｇＥ分子の「オン」（受容体占有）期間の半減期は約２
０時間で非常に長い。クルジッキＡ．のJ. Exp. Med.
１４０：１９７６（１９７４）。ＩｇＥ分子がマスト細
胞または好塩基球から解離すると、患者に投与された親
和性が高い抗ｉｇｅ．ｂｌ．抗体がそれらとしっかり結
合して、それらがＦｃεＲと再結合することを阻止す
る。ＩｇＥ分子は「オン」期間が長く、好塩基球及びマ
スト細胞からゆっくり解離するから、治療効果が得られ
るのは、好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＥの大部分が
ＦｃεＲから解離して抗ＩｇＥ抗体と複合化されて除去
される処置後２〜３日してからである（またはそれ以上
に長くかかる）。これが達成されれば、好塩基球及びマ
スト細胞上のＦｃεＲ分子と結合したＩｇＥ分子の密度
は大幅に減少し、その結果、アレルゲンはヒスタミンを
誘発できるだけの数のＦｃεＲの架橋ができない。

【００２９】５．ＩｇＥ産出性細胞と特異的に結合する
抗体の診断的使用 ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基に対する抗体を使用して、混
合白血球集団内のＩｇＥ産出性リンパ球を識別して数え
ることができる。このためには、抗体は細胞表面抗原を
決定するための標準アッセイフォーマツトで使用でき
る。一般的に、テストしようとする白血球のサンプルに
抗体を、その抗体がサンプル中のＩｇＥ産出性細胞と結
合できる状態で接触させる。次に、抗体の結合について
細胞を調べる。これは従来の細胞着色方法で実施でき
る。例えば、蛍光色を付けた第２抗体を用いて、抗Ｉｇ
Ｅ抗体の結合を検出する。

【００３０】６．抗イデオタイプ性抗体及びＩｇＥに対
する活性免疫化 以上に記載したｉｇｅ．ｂｌ．特異性単一クローン性抗
体を用いて、ＩｇＥ媒介アレルギーを治療する別の方法
を提供するパロトープ特異性抗イデオタイプ性抗体を産
生することができる。ｉｇｅ．ｂｌ．特異性抗体のパロ
トープに対する抗体は、抗ＩｇＥ抗体が特異的である抗
原決定基と構造的に類似している、すなわちそれらはｉ
ｇｅ．ｂｌ．抗原決定基と類似している。これらの抗イ
デオタイプ性抗体を用いて、ｉｇｅ．ｂｌ．に対して能
動的に免疫を生じて、ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基に対す
る抗体の内因性形成を誘発する。この誘発された抗体が
ｉｇｅ．ｂｌ．特異性抗体の様々な治療効果を媒介する
のである。

【００３１】ＩｇＥは「自己分子（self-molecule ）」
であるから、それは一般的に免疫を生じない。しかし、
本発明のパロトープ特異性抗体を用いれば、ＩｇＥに対
する活性免疫化が可能になる。パロトープ特異性抗体
は、抗原決定基に対する免疫反応を人間に引き出すこと
ができる抗原、すなわちｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基と構
造的に類似している。

【００３２】パロトープ特異性抗イデオタイプ性抗体
は、ｉｇｅ．ｂｌ．抗体の形成を誘発できる免疫学的量
がＩｇＥ媒介アレルギーの患者に投与される。好ましく
は抗イデオタイプ性抗体をキメラ性抗体として投与す
る。それらは抗体フラグメント（性質はやはりキメラ性
でもよい）または類似体にしてもよい。

【００３３】７．マスト細胞及び好塩基球のＦｃεＲの
ブロックするペプチド 本発明はさらに、可溶性ＩｇＥ上のｉｇｅ．ｂｌ．抗原
決定基をモデルとしたペプチドを提供している。ペプチ
ドは、可溶性ＩｇＥのｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基のアミ
ノ酸配列と同一または同等のアミノ酸配列を有してい
る。例えば、ペプチドは、抗体Ｅ８−５−３、Ｅ１１−
４−７０、Ｅ１０１−１及びＥ１０−１２−５５または
以下に記載するその他の抗ｉｇｅ．ｂｌ．抗体によって
定義された抗原決定基に相当する配列にすることができ
る。ＦｃεＲの結合部位に対応するペプチドを用いて、
ＩｇＥのマスト細胞及び好塩基球との結合を阻止するこ
とができる。

【００３４】８．εｍｂ／ｅｃペプチド類似体及びεｍ
ｂ／ｅｃ抗原決定基に対する活性免疫化 ヒトεｍｂ／ｅｃペプチドは恐らく人間には免疫を生じ
ないが、同じ配列のペプチドおよびアミノ酸置換体は免
疫を生じて、本物のεｍｂ／ｅｃ抗原決定基と交差反応
する抗体を産生することができる。これらのεｍｂ／ｅ
ｃペプチド類似体をＩｇＥ媒介アレルギーの患者に投与
することができる。この活性免疫化によって産生された
抗体は、本説明に記載の抗体としての機能を果たすこと
ができる。

【００３５】９．Ｂ細胞膜結合免疫グロブリンのペプチ
ド片の固着 Ｂ細胞はその表面に抗体分子を出しており、これらが免
疫的誘発時に抗原の受容体として機能する。膜結合免疫
グロブリンは、細胞表面上に免疫グロブリン分子を固着
させるエキストラペプチド片を備えている点で、同じ細
胞で合成される分泌性免疫グロブリンと異なっている。

【００３６】幾つかの種類の１０の膜結合免疫グロブリ
ンのアミノ酸配列データが確認されている。イシダＮ．
他のEMBO J. １：１１１７（１９８２）、スティーン
（Steen ）Ｎ．Ｌ．他のJ. Mol. Biol. １７７：１９〜
３２（１９８４）、ロガーズ（Rogers）Ｊ．他のセル２
６：１９〜２７（１９８１）、ヤマワキ−カタオカＹ．
他のProc. Natl. Acad. Sci. MSA、７９：２００８〜２
０１２（１９８２）、カマロミイ（Kamaromy）Ｍ．他の
Nuc. Acids Res. 、１１：６７７５〜６７８５（１９８
３）、ロガーズＪ．他のセル２０：３０３〜３１２（１
９８０）、バーンスタイン（Bernstein ）Ｋ．Ｅ．のJ.
Immunol. １３２：４９０〜４９５（１９８０）、チェ
ン（Cheng ）Ｈ．他のNature２９６：４１０〜４１５
（１９８２）を参照されたい。これらの配列は細胞膜結
合ペプチド片のある共通の特徴を表している。第１表に
示すように、ペプチド固着片は、細胞膜に対するそれら
の位置に基づいて識別できる３つのセグメントを備えて
いる。これらのペプチド片は短く、４１〜７２のアミノ
酸残基を並べた長さであり、「膜結合ドメイン」と呼ば
れることも多いが、ペプチド全体が膜脂質二重層内にあ
るわけではない。事実、ペプチドの中央部分に位置して
いる２５のアミノ酸残基、疎水性が高い残基及びトレオ
ニン及びセリン残基だけが脂質二重層内にある。３〜２
８のアミノ酸残基からなるＣ末端親水性セグメントは膜
の細胞質側にある。免疫グロブリンＨ鎖の第３または第
４定常領域（ＣＨ₃ またはＣＨ₄ ）に接続しているＮ末
端側のセグメントは親水性が非常に高く、細胞膜の外表
面上にある。

【００３７】

【表１】

【００３８】免疫グロブリンの膜結合片の細胞外セグメ
ント（ｍｂ／ｅｃセグメント）の最短長さは１３のアミ
ノ酸残基（マウス及びラットμ鎖）の長さである。第２
表を参照されたい。すべての免疫グロブリンのｍｂ／ｅ
ｃセグメントは、ほとんどすべて酸性残基である帯電ア
ミノ酸残基を高い割合で含んでいる。帯電アミノ酸残基
及び極性親水性残基の割合から、アミノ酸組成物の中の
ｍｂ／ｅｃセグメントの比率が非常に高いことがわかる
（第３表）。これらのパラメータは、すべてのｍｂ／ｅ
ｃセグメントが露出して抗体と接触できる長さであるこ
とを示している。免疫グロブリンＨ鎖の進化の研究か
ら、ε及びγ鎖がその他の鎖よりも互いに関連性が強い
（新しい共通の祖先を持っている）ことがわかっている
（リン（Lin ）L.C.及びピュートナム（Putnam）F.W.,
Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1981）。また、マウス、
ラット、及びヒトなどの様々なほ乳類が進化する前にＨ
鎖は進化していた。このため、確認されている１０の様
々なｍｂ／ｅｃセグメントの中で、配列がまだ報告され
ていないヒトε．ｍｂ／ｅｃと最も関連性があるものは
ネズミまたはラットε．ｍｂ／ｅｃと最も関連性がある
ものはネズミまたはラットε．ｍｂ／ｅｃであろう。次
に最も関連性が強いものはγ鎖である。ネズミまたはラ
ットεｍｂ／ｅｃには１９のアミノ酸残基が含まれ、そ
の中に８のＧｌｕ及び２のＡｓｐが含まれている。これ
らのデータからも、ヒトεｍｂ／ｅｃが露出して抗体と
接触可能であることがわかる。

【００３９】

【表２】 第２表 膜結合免疫グロブリンに特有のペプチドセグメントの外側部分 （ｍｂ／ｅｃセグメント）のアミノ酸配列 ｍｂ／ｅｃセグメント ２６ ２１ １６ １１ ６ １ マウスＩｇＥ ELDI. QDLCI. EEVEG. EELEE ラットＩｇＥ ELDI. QDLCT. EEVEG. EELEE マウスＩｇＧ１ GLQ. LDETC. AEAQD. GELDG マウスＩｇＧ２ａ GLD. LDDVC. AEAQD. GELDG マウスＩｇＧ２ｂ GLD. LDDIC. AEAKD. GELDG マウスＩｇＧ３ ELE. LNGTC. AEAQD. GELDG マウスＩｇＭ EGE. VNAEE. EGFEN ラビットＩｇＭ EGE. VNAEE. EGFEN ヒトＩｇＤ YL. AMTPL. IPQSK. DENSD. DYTTF. DDVGS マウスＩｇＤ I. VNTIQ. HSCIM. DEQSD. SYMDL. EEENG

【００４０】

【表３】 第３表 膜結合免疫グロブリンに特有のペプチドセグメントの 外側部分（ｍｂ／ｅｃセグメント）の帯電アミノ酸残基 及び極性親水性アミノ酸残基の組成 ──────────────────────────────────── 合計 酸性 塩基 極性 合計親水性 親水性残基 残基 残基 残基 残基 の割合 ──────────────────────────────────── ＃アミノ酸残基 ％ マウスＩｇＥ １９ １０ ０ ２ １２ ６３ ラットＩｇＥ １９ １０ ０ ２ １２ ６３ マウスＩｇＧ１ １８ ６ ０ ４ １０ ５６ マウスＩｇＧ２ａ １８ ７ ０ ２ ９ ５０ マウスＩｇＧ２ｂ １８ ７ １ １ ９ ５０ マウスＩｇＧ３ １８ ６ ０ ４ １０ ５６ マウスＩｇＭ １３ ６ ０ ２ ８ ６１ ラビットＩｇＭ １３ ６ ０ １ ７ ５４ ヒトＩｇＤ ２７ ６ １ ８ １５ ５６ マウスＩｇＤ ２６ ７ ０．５ ９ １６．５ ６３ ──────────────────────────────────── 酸性残基： E(Glu), D(Asp) 塩基性残基： K(Lys), R(Arg), H(His); His は部分的に帯電している。 極性残基： S(Ser), T(Thr), C(Cys), Q(Gln), N(Asn)

【００４１】１０．ヒトＩｇＥのｍｂ／ｅｃセグメント
（ε．ｍｂ／ｅｃセグメント）のアミノ酸配列の決定 ヒトε．ｍｂ／ｅｃセグメントに対応したＤＮＡ配列の
決定には多くの十分に確立された方法を用いることがで
きる。１つの方法（第１図）では、始めに、表面上にＩ
ｇＥが出ているヒト骨髄腫細胞系のｍＲＮＡの準備をす
る。これにはＳＫ００７細胞を使用できる。ｍＲＮＡを
準備すれば、λファージまたはプラズミドを含むクロー
ンベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを形成するこ
とができる。ｃＤＮＡライブラリーを形成する好適な方
法として、インビトロゲン（Invitrogen）（米国カリフ
ォルニア州、サンディエゴ）が開発、市販しているｃＤ
ＮＡライブラリー構造システムキット−ライブラリアン
（Librarian ）Ｉを用いる。段階的な詳細指示マニュア
ルが、細胞からのRNA 分離、逆転写、第２ストランド合
成、リンカーライゲーション、ｃＤＮＡのアガロースゲ
ルサイジング、ｃＤＮＡを精製するための電気溶離、ベ
クターライゲーション、及び大腸菌の転換に対して準備
されている。このライブラリーに使用されるベクターは
ｐＣＤＭ８である。

【００４２】ε. ｍｂ／ｅｃセグメントを含んでいるク
ローンを求めてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
する際に、幾つかのプローブを使用することができる。
第２図に示すように、ライブラリーはεｍＲＮＡ（非膜
結合セグメント）の長さのほとんどの部分をカバーする
１．１ｋｂ長さのＵ２６６ ｃＤＮＡであるＤＮＡプロ
ーブでスクリーニングすることができる。分泌型及び膜
結合型の両方を含む陽性のクローンは、さらなるプロー
ブを用いて区別することができる。プローブｂは、膜結
合型のヒトε鎖においてＣＨ４ドメインの端部が切り取
られているという非常に有望な性質を利用して開発され
たものである。ＣＨ₄ ドメインおよび膜結合ドメインの
遺伝子セグメントが移動した時に切形が発生する。Ｃ末
端の喪失は、ＣＨ₄ ドメインを含む、免疫グロブリンの
ε及びμの膜結合型で発生する。ヒトε. ＣＨ₄ ドメイ
ンのヌクレオチド配列について発行されている情報か
ら、最も可能性のあるスプライシング供給部位は、終止
コドンＴＧＡのイントラコドン（intracodon）ＧＴ，７
１ｂｐ ５’である。イントラコドンではなく、スプラ
イシング供給部位である可能性が低い別のＧＴの方が末
端に近い（終止コドンまで２４ｂｐ ５’）。

【００４３】プローブｂに対する特異的位置が第２及び
第３図に示されている。プローブはε鎖遺伝子の分泌型
と反応するが、ε鎖遺伝子の膜結合型とは反応しない。

【００４４】プローブｃの構造は、以上のような配列の
すべての免疫グロブリン遺伝子において膜結合ドメイン
の膜内セグメント（ｍｂ／ｔｍセグメント）が非常にう
まく保存されているという発見に基づいている。このｍ
ｂ／ｔｍセグメント内にペプチドセグメント及びそれに
対応してコードしているＤＮＡがあり、これはすべての
免疫グロブリンにおいてほぼ同一である。第４表に示す
ように、８組のコンセンサスＤＮＡ配列をプローブｃと
して使用できる。第２図はプローブの位置を示してい
る。

【００４５】

【表４】 第４表 膜結合免疫グロブリンのペプチドセグメントの膜内部分 （ｍｂ／ｔｍセグメント）における保存領域 １ ２ ３ ４ ５ マウスＩｇＥ Leu.Phe.Leu.Leu.Ser. ラットＩｇＥ CTG.TTC.CTG.CTC.AG. マウスＩｇＧ１ CTG.TTC.CRG.CTC.AG. マウスＩｇＧ２ａ CTC.TTC.CTG.CTC.AG. マウスＩｇＧ２ｂ CTC.TTC.CTG.CTC.AG. マウスＩｇＧ３ CTC.TTC.CTG.CTC.AG. マウスＩｇＭ CTC.TTC.CTC.CTG.AG. ラビットＩｇＭ CTG.TTC.CTG.CTG.AG. ヒトＩｇＤ ＊ CTC.TTC.ATC.CTC.AC. マウスＩｇＤ ＊ CTC.TTC.CTG.CTC.AC. C G C コンセンサス配列 CT .TTC.CT .CT .AG （ブローブｃ） G C G ＊ヒト及びマウスＩｇＤ’は第５アミノ酸残基に Thr（ACXO）を有している。ヒ トＩｇＤはさらに第３アミノ酸残基に Ile（ATC ）を有している。これらはコン センサス配列によってカバーされない変異体である。

【００４６】最も可能性のあるスプライシング供給部位
ＧＴよりも上流側のセグメントを表すプローブｄは３６
ｂｐからなる（第２及び第３図）。このプローブは分泌
型及び膜結合型の両方のε鎖遺伝子と結合しなければな
らない。

【００４７】第５表は、４つのプローブでの分泌型また
は膜結合型のε遺伝子を含むクローンの反応性のパター
ンをまとめたものである。

【００４８】 第５表 プローブａ，ｂ，ｃ及びｄでのε遺伝子含有ｃＤＮＡクローンの反応 性 ε分泌型 ε膜結合型 プローブａ ＋ ＋ プローブｂ ＋ − プローブｃ − ＋ プローブｄ ＋ ＋

【００４９】膜結合ε鎖含有クローンに必要なライブラ
リーサイズは、ｍＲＮＡがどの程度に多いかによって決
まる。分泌型ＩｇＥが０．１％のＳＫ００７ポリＡ＋Ｒ
ＮＡを含有しているとすると、陽性のクローンを９９％
の確率で分離できるようにするためには、ライブラリー
サイズは約５，０００の独立組換えクローンでなければ
ならない。ＩｇＥ産出性ラットイムノサイトーマ（immu
nocytoma）ＩＲ２及びＩＲ１６２細胞では、ε鎖の膜結
合型に対するｍＲＮＡが分泌型の場合の２％以上である
ことがわかった。ε鎖の膜結合型／分泌型のこの割合が
ヒトＩｇＥ産出性ＳＫ００７細胞についても同じである
とすると、膜結合型ε鎖を分離するために必要なｃＤＮ
Ａライブラリーサイズは約２５０，０００である。好適
な方法では、それより多い１，０００，０００のクロー
ンがスクリーニングされる。

【００５０】ｃＤＮＡライブラリーを形成して細胞ｍＲ
ＮＡ種を表すクローンのスクリーニングを行う従来の方
法の変更例として、ｍＲＮＡを増幅してそれらの対応の
ＤＮＡを高い割合で産出するものがある。これによって
得られたＤＮＡをゲル電気泳動によって精製してから、
配列分析を行う。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
と呼ばれるこの方法は、２〜３年前に確立されたもので
あり、試薬及び装置を含む完全なシステムが市販されて
いる。１つの好適なシステムがパーキン・エルマー・シ
ータス（Perkin Elmer Cetus）（Norwalk, CT ）から提
供されている。試薬キットはジーンアンプ（GeneAmp ）
ＤＮＡ増幅試薬キットであり、装置はＤＮＡサーマルサ
イクラーである。

【００５１】この方法に使用される特殊な試薬の一部
は、ｃＤＮＡライブラリーのクローニングに使用されて
いるものと同じである。ε鎖の膜結合セグメントの配列
はいずれも確認されていないので、この方法ではε鎖の
分泌型及び膜結合型の両方を増幅する。２つのプライマ
ー、すなわちオリゴｄＴ（２５−３０−マーズ（mer
s））と第２及び第３図のプローブｄに対応するオリゴ
マーとが用いられている。プローブｄは最も可能性があ
るスプライシング供給部位に５’で位置決めされ、従っ
てεｍＲＮＡ及びＤＮＡの分泌型及び膜結合型の両方を
準備する。十分な増幅後、２つの集団のＤＮＡフラグメ
ントをゲル電気泳動によって分析する。ε鎖の分泌型は
プローブｂに対するそれの反応性で区別できる。次に、
精製されたＤＮＡに対してＤＮＡ配列決定を行う。

【００５２】ＰＣＲ増幅は、ポリＡ＋ＲＮＡプールには
うまく表されないｍＲＮＡに対するｃＤＮＡクローニン
グよりも効果的な方法に思われる。Ｕ２６６ε鎖ｃＤＮ
Ａを用いて、鋳型ＤＮＡとオリゴプライマーとの間に幾
つかの予備アニーリング状態を作り出すことができる。

【００５３】膜結合セグメントをコードする遺伝子を含
むＤＮＡのクローンを得る別の方法として、ヒトゲノム
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングがある。ヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリーは容易に入手可能である。好まし
い供給源は、ストラトジェン（Stratogene）（米国カリ
フォルニア州、ラ・ジョラ）によって提供されたヒトの
肺繊維芽細胞Ｗ１３８細胞を用いて形成されたライブラ
リーである。遺伝子はλベクター内にあり、挿入された
ＤＮＡの平均サイズは１５Ｋｂｐである。クローンの識
別は、Ｕ２６６ ｃＤＮＡクローンＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションによって可能となる。膜結合領域に対応
した遺伝子セグメントの位置は、膜内セグメントの相同
マウス遺伝子から作製されたプローブを用いて決定でき
る（第２図のプローブｃ及び第４表）。次に、膜結合セ
グメントの配列が決定される。

【００５４】１０Ａ．ヒトε鎖のペプチドを固着させる
膜をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列 ヒト膜結合ε鎖のペプチドを固着させる膜に対してコー
ドしているセグメントを包含するゲノムＤＮＡのヌクレ
オチド配列が確認されており、それを膜のペプチド固着
部分の推定アミノ酸配列と共に以下に示す。エクソンの
指定は、ドナー及びアクセプターを接合するためのヌク
レオチドを識別し、またマウス膜結合ε鎖及び他のクラ
スの免疫グロブリンの公表の相同配列と比較することに
よって行われた。

【００５５】 ......CGCTGCCACTGTGGAGCCGGGAGGGCCTGACTGGCCAG スプライスアクセプタ GTCCCCCAGAG. CTG. GAC. GTG. TGC. GTG. GAG. GAG. GCC. GAG. Glu. Leu. Asp. Val. Cys. Val. Glu. Glu. Ala. Glu. GGC. GAG. GCG. CCG. TGG. ACG. TGG. ACC. GGC. CTC. TGC. ATC. Gly. Glu. Ala. Pro. Trp. Thr. Trp. Thr. Gly. Leu. Cys. Ile. 膜エクソンＩ TTC. GCC. GCA. CTC. TTC. CTG. CTC. AGC. GTG. AGC. TAC. AGC. Phe. Ala. Ala. Leu. Phe. Leu. Leu. Ser. Val. Ser. Tyr. Ser. スプライスドナー GCC. GCC. CTC. ACG. CTC. CTC. ATG. GTGGGCACCCACCTCCAGG Ala. Ala. Leu. Thr. Leu. Leu. Met. GGCCCAGCCAGGGCAGGGGGTTGGGCAGAGCAGCAGAGCCCCTGACC イントロン スプライスアクセプタ CACGCCCTCCCCTCAGGTG. CAG. CGG. TTC. CTC. TCA. GCC. ACG. Val. Gln. Arg. Phe. Leu. Ser. Ala. Thr. CGG. CAG. GGG. AGG. CCC. CAG. ACC. TCC. CTC. GAC. TAC. ACC. Arg. Gln. Gly. Arg. Pro. Gln. Thr. Ser. Leu. Asp. Tyr. Thr. 膜エクソンII AAC. GTC. CTC. CAG. CCC. CAC. GCC. TAG. GCCGCGGGCACTCAC Asn. Val. Leu. Gln. Pro. His. Ala.終わり GCTCCACCAGGCCCAGCTACCC.....

【００５６】ヒトε. ｍｂ／ｅｃペプチドは膜エクソン
Ｉによってコードされた最初の１４のアミノ酸として識
別される。これは、膜内領域である一続きの約２５の疎
水性アミノ酸よりも上位である。ε. ｍｂ／ｅｃの２つ
の予想構造を以下に示す。 ヒトε. ｍｂ／ｅｃペプチドの予想構造 構造 Ｉ SH ..... Glu.Leu.Asp.Val.Cys.Val.Glu.Glu.Ala.Glu.Gly.Glu.Ala.Pro..... 構造 II ..... Glu.Leu.Asp.Val.Cys.Val.Glu.Glu.Ala.Glu.Gly.Glu.Ala.Pro..... S S ..... Glu.Leu.Asp.Val.Cys.Val.Glu.Glu.Ala.Glu.Gly.Glu.Ala.Pro.....

【００５７】以下にさらに詳細に説明するように、ε.
ｍｂ／ｅｃペプチドを用いて、膜結合免疫グロブリンＥ
と特異的に反応する抗体を産生することができる。この
ために、ペプチドを標準的タンパク質合成法で化学的に
合成する。ペプチドを合成する好適な方法は、エフモッ
ク（Fmoc）化学を応用したＲａＭＰシステム（デュポ
ン、ウイルミントン、ＤＥ）である。あるいは、タンパ
ク質は、ペプチドをコードしているオリゴジオキシヌク
レオチドを用いて生合成することもできる。ヌクレオチ
ド配列は、上記膜エクソンＩの５’部分として与えられ
ている。

【００５８】免疫原として、タンパク質を上記の一価ま
たは二価の構造体のいずれかで使用できる。ヒトε. ｍ
ｂ／ｅｃセグメント及び連結した４つのアミノ酸をＣＨ
₄ ドメインに有しているペプチドも使用することができ
る。また、免疫学的にほぼ等価である変性ペプチドを使
用することもできる。例えば、上記のペプチドアミノ酸
配列は、ペプチドの免疫学的性質を本質的に減じないア
ミノ酸の１つまたは複数を欠失、挿入または代用するこ
とによって変更することができる。上記のアミノ酸配列
または等価配列がポリマーの繰り返し単位である場合、
ペプチドをポリマーとして使用することもできる。

【００５９】１１．本発明の単一クローン性抗体の産出 単一クローン性抗ＩｇＥ及び抗イデオイプ抗体は連続的
な（不死化した）安定した抗体産出性株化細胞によって
産出される。好適な抗体産出性株化細胞はハイブリドー
マ株化細胞及び骨髄腫株化細胞である。しかし、原則的
には、抗体のＬ鎖及びＨ鎖の抗体可変領域をコードして
いるように機能的に組換えされた遺伝子を含んでそれら
を表現できるものであればどの様な細胞でもよい。好ま
しくは、株化細胞は鎖を組み合わせて機能的抗体または
抗体フラグメントにできるものとする。このため、本来
的に免疫グロブリンを産出するリンパ様細胞が最もよく
用いられる。前述したものに加えて、適当なリンパ様細
胞としてウィルスまたは腫瘍遺伝子的に転換されたリン
パ様細胞などがある。

【００６０】本発明のｉｇｅ．ｂｌ．特異性抗体を産出
するハイブリドーマ細胞は、ケーラー（Kohler）及びミ
ルスタイン（Milstein）のNature２５６：４９８（１９
７５）の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術、ま
たは別の融合剤を用いた同様な方法によって形成するこ
とができる。簡単に説明すると、この方法は次の通りで
ある。ｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基の潜在的成分として識
別されているヒトＩｇＥまたはヒトＩｇＥのペプチドセ
グメント（分泌型または膜結合型）で動物を免疫化する
ことによって単一クローン性抗ＩｇＥ抗体を産出する。
ペプチドは、合成されてからキーホールリンペット（Ke
yhole Limpet）へモシアニンなどのキャリヤタンパク質
と結合されて、免疫原として使用される。次に、リンパ
様細胞（例えば脾臓リンパ球）を免疫動物から得て、不
死化細胞（例えば骨髄腫または異形骨髄腫）と融合する
ことにより、ハイブリッド細胞を作り出す。ハイブリッ
ド細胞のスクリーニングによって、所望の抗ＩｇＥ抗体
を産出するものを識別する。

【００６１】ヒト抗体を分泌するヒトハイブリドーマ
は、ケーラー及びミルスタインの技法によって作り出す
ことができる。ヒト抗体は人の治療に特に好ましいが、
一般的に長期に渡ってヒト単一クローン性抗体を産出で
きる安定したヒト−ヒトハイブリドーマの産生は難し
い。げっ歯類、特にマウスでのハイブリドーマの産生は
十分に確立された方法である。安定したネズミハイブリ
ドーマは所定の特徴の抗原の無限的供給源となる。しか
し、ネズミ抗体は、免疫原性が非常に強く、それ自身が
受容体に不都合なアレルギー反応を誘発するので、人の
治療に使用できる範囲が限られている。本発明の好適な
実施例では、抗ＩｇＥ及び抗イデオイプ抗体がげっ歯類
で作られて、以下に詳細に説明する確立された技法によ
ってキメラ性げっ歯類／ヒト抗体に変換される。前述し
たように、これらの「近ヒト」キメラ性抗体は、特に繰
り返し投与が必要な場合、生体投与に好適である。可溶
性ＩｇＥ上のｉｇｅ．ｂｌ．抗原決定基に特異な抗体の
産出のため、免疫化のためのヒトＩｇＥをヒト血清から
精製する。あるいは、ヒトＩｇＥはＩｇＥ産出性株化細
胞（例えば株化細胞Ｕ２６６, ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ
８０３３）を培養することによって作り出すこともでき
る。ヒトＩｇＥは親和性クロマトグラフィーによって精
製できる。ヒトＩｇＥに特異なマウス単一クローン性抗
体を適当なマトリックス（臭化シアン−活性化セファロ
ーズ（Sepharose ）４Ｂなど）と結合させることによっ
て、ＩｇＥ特異性免疫吸着剤にすることができる。準備
したＩｇＥを、ＩｇＥを選択的に吸着する免疫吸着剤と
接触させる。その後、吸着されたＩｇＥは免疫吸着剤か
らほぼ純粋な状態で溶離することができる。

【００６２】好適な実施例では、ＩｇＥ特異性抗体を産
出するリンパ球を高い頻度で作り出すため、動物を活性
免疫プロトコルで免疫化する。免疫化した動物から脾臓
細胞を取り出して、不死化した細胞、好ましくは免疫グ
ロブリンを分泌する能力を失った骨髄腫細胞と融合させ
る。この方法において、多くの適当な骨髄腫株化細胞が
知られている。例えばネズミ骨髄腫ＮＳ−１がある。脾
臓細胞と融合パートナーとの融合は、確立された方法に
よってポリエチレングリコールの存在下で行われる。電
気融合の技法も使用できる。これによって得られたハイ
ブリッド細胞はクローン的に培養されてから、抗ＩｇＥ
抗体の産出性についてスクリーニングが行われる。

【００６３】ＩｇＥ産出性Ｂ細胞上に存在するが好塩基
球上は存在しない抗原決定基に特異であって、ＦｃεＲ
がＩｇＥと結合しないようにできるだけのＩｇＥに対す
る親和力を有している抗体を産出するハイブリドーマは
以下のようにして選択できる。ハイブリドーマは、最初
にヒトＩｇＥと反応する抗体の産出性についてのスクリ
ーニングが行われる。これは、固相に吸着された精製ヒ
トＩｇＥを用いた酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）によっ
て実施できる。

【００６４】一般的に親和性が高い抗体を得る１つの方
法は次の通りである。ＥＬＩＳＡのための固相をごく僅
かなヒトＩｇＥで被覆する。例えば、固相として標準的
なマイクロウェルプレートを使用した場合、ウェル毎に
0.1 μｌ／ｍｌのＩｇＥ溶液を約５０μｌ使用する。ア
ッセイ時において酵素活性（光学密度レベル）が比較的
高いハイブリッドを選択する。培養物の上澄みには量の
多い抗体か親和力が比較的高い抗体のいずれか、または
その両方が含まれている。

【００６５】次に、好塩基球−結合ＩｇＥと反応しない
抗体の分泌についてハイブリドーマのスクリーニングを
実施する。好適な方法は、好塩基球によるヒスタミンの
放出を誘発する能力がないことについて抗体をスクリー
ニングすることである。そのようなヒスタミン放出アッ
セイに対する好塩基球の供給源は、好塩基球がヒスタミ
ン放出の誘発に対して非常に敏感であることが知られて
いるドナーから取った白血球である。恐らくは感度が低
い別の方法として、免疫蛍光着色法がある。好塩基性白
血球は血液から分離できる。分離されたばかりの好塩基
球は表面にＩｇＥを有している。好塩基球−結合ＩｇＥ
と結合しない単一クローン性抗体は、好塩基球ＦｃεＲ
が占めている部位またはその付近にある（従って単一ク
ローン性抗体が接触できない）抗原決定基に特異であ
る。

【００６６】パロトープ特異性抗イデオタイプ抗体を産
出するハイブリドーマは、動物を抗ＩｇＥ抗体で免疫化
し、免疫化抗ＩｇＥ抗体のパロトープと結合する抗体の
スクリーニングを行うことによって形成できる。免疫化
により、イデオタイプを含む抗ＩｇＥ抗体上のアレルギ
ー決定基に対する抗体が産出される。抗イデオタイプ抗
体はまず、抗ＩｇＥ抗体と結合するが他のマウス抗体と
は結合しないことによってスクリーニングが行われる。
パロトープ特異性であるものについては、免疫化に使用
された抗ＩｇＥ単一クローン性抗体に対するヒトＩｇＥ
の結合力と競合する抗体の能力に基づいてスクリーニン
グが行われる。Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ及びＦｖなどの
抗体フラグメントは酵素消化の標準的方法によって形成
できる。また、Ｆａｂ及びＦｖ類似体を表す合成ペプチ
ドは遺伝子工学技術によって形成できる。例えば、ベタ
ーＭ．他の（１９８８）Science ２４：１０４１；ハス
トンＪ．Ｓ．他の（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci.
USA８５：５８７９〜５８８３を参照されたい。

【００６７】キメラ性抗ＩｇＥ抗体は、個々のキメラ性
Ｈ及びＬ免疫グロブリン鎖からなる。キメラ性Ｈ鎖は、
げっ歯類（一般的にネズミ）のＨ鎖の可変領域または超
可変領域と、ヒトＨ鎖の不変領域とを有している連続ポ
リペプチドである。キメラ性Ｌ鎖は、げっ歯類のＬ鎖の
可変領域または超可変領域と、ヒトＬ鎖の不変領域とを
有している連続ポリペプチドである。キメラ性抗体は一
価、二価または多価でもよい。一価の抗体は、キメラ性
Ｌ鎖と（ジスルフィド架橋によって）結合したキメラ性
Ｈ鎖からなる二量体（ＨＬ）である。二価の免疫グロブ
リンは、２つの結合した二量体からなる四量体（Ｈ２Ｌ
２）である。多価の抗体は、例えば凝集したＨ鎖不変領
域（例えばμ形の不変領域）を用いることによって形成
される。

【００６８】キメラ性抗体の可変領域は本発明の抗Ｉｇ
Ｅ抗体から引き出される。Ｈ鎖定領域は５つのイソタイ
プ、すなわちアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、
またはミュウの何れかから選択できる。様々なサブクラ
ス（例えばＩｇＥサブクラス）のＨ鎖を用いることがで
きる。各クラス及びサブクラスのＨ鎖はそれぞれの作動
物質機能を備えており、従って所望のＨ鎖不変領域を選
択することによって、所望の作動物質機能を備えたキメ
ラ性抗体を形成することができる。Ｌ鎖定領域はカッパ
またはラムダ鎖にすることができる。

【００６９】一般的に、キメラ性抗体は、キメラ性抗体
のＬ及びＨ鎖成分の各々をコードしているＤＮＡ構造を
作成することによって製造される。この構造は、ネズミ
可変領域の少なくとも機能部分（例えば接合セグメント
で機能的に組換えられた可変領域）をコードしている第
１ＤＮＡセグメントと、これに連結してヒト不変領域の
少なくとも一部分をコードしている第２ＤＮＡセグメン
トとを有する融合遺伝子を有している。各融合遺伝子は
表現ベクターに組み込むか、それに挿入する。次に、遺
伝子生成物を表現できる受容細胞を遺伝子に感染させ
る。感染した受容細胞を培養して、表現された抗体を回
収する。げっ歯類Ｌ及びＨ鎖の可変領域をコードしてい
る遺伝子は、抗ＩｇＥ抗体を産出するハイブリドーマ細
胞から得られる。例えば、ネズミ抗ＩｇＥ抗体を産出す
るネズミハイブリドーマ株化細胞は可変領域遺伝子の供
給源となる。

【００７０】不変領域遺伝子は、標準的クローニング技
法によってヒト抗体産出性細胞から得られる。あるい
は、２クラスのＬ鎖及び５クラスのＨ鎖を表す遺伝子が
クローン化されたのであるから、ヒト起源の不変領域は
これらのクローンから容易に入手できる。

【００７１】好ましくは、Ｌ及びＨキメラ性鎖をコード
している融合遺伝子は、受容細胞を同時感染させるため
に使用される表現ベクターに組み込む。遺伝子構造に適
したベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＥＭＢＬ及びｐＵ
Ｃ型のプラズミドが含まれる。各ベクターには２つの選
択可能な遺伝子、すなわちバクテリア系で選択するもの
と、真核細胞系で選択されるものとを含み、各ベクター
は別々の一対の遺伝子を有している。これらのベクター
により、バクテリア系で融合遺伝子の産出及び増幅がで
き、その後に真核細胞の同時感染及び同時感染した細胞
の選択が行われる。バクテリア系として選択できる遺伝
子の例は、アンピシリン（ampicillin）耐性を与える遺
伝子及びクロラムフェニコール耐性と結合する遺伝子で
ある。真核細胞として選択できる遺伝子にはｇｐｔ及び
ｎｅｏなどがある。

【００７２】好適な受容株化細胞は骨髄腫細胞である。
骨髄腫細胞は、感染した抗体遺伝子によってコードされ
た免疫グロブリンの合成、組合せ及び分泌を行うことが
できる。さらに、それらには免疫グロブリンのグリコシ
レーション（glycosylation）を行う機構がある。特に
好適な受容細胞は、Ｉｇ非産出性骨髄腫細胞ＳＰ２／０
である。シュルマン（Shulman ）他のNature２７６：２
６９（１９７８）を参照されたい。この細胞は、感染し
た免疫グロブリン遺伝子でコードされた免疫グロブリン
だけを産出する。骨髄腫細胞は、培養で、または分泌さ
れた免疫グロブリンを腹水から得ることができるマウス
の腹膜内で成長させることができる。Ｂリンパ球などの
その他のリンパ様細胞やハイブリドーマ細胞も、適当な
受容細胞として機能する。

【００７３】リンパ様細胞は幾つかの方法で免疫グロブ
リンをコードしている遺伝子を含有するベクターに感染
させることができる。これらには、エレクトロポレーシ
ョン（electroporation ）、原形質融合、及びリン酸カ
ルシウム沈降法が含まれる。このようにして得られた感
染細胞は、キメラ性抗体を産出する連続した安定株化細
胞となる。

【００７４】キメラ性抗体は、様々な連続還流装置、中
空繊維装置、静止維持培養装置などの大型組織培養装置
でも大量に産出できる。

【００７５】近ヒト抗体または抗体フラグメントも、適
当な抗ＩｇＥ特異性を与えることができるように超可変
（相補性決定）領域をコードしているヒト抗体の遺伝子
配列を操作することによって製造できる。例えば、ロバ
ートＳ．他のNature３２８：７３１〜７３３（１９８
７）；ベターＭ．他の（１９８８）Science ２４０：１
０４１を参照されたい。

【００７６】１２．抗体をｍｂ／ｅｃセグメントに発展 ε. ｍｂ／ｅｃペプチドを動物の免疫化に用いて、多ク
ローン性及び単一クローン性抗体を作成することができ
る。それらはまた、特異な単一クローン性抗体のスクリ
ーニングまたは特異な多クローン性抗体の特徴付けに利
用される。それらは、単一クローン性及び多クローン性
抗体の精製にも用いられる。

【００７７】ε. ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な単一クロ
ーン性抗体を作成する工程において、ε. ｍｂ／ｅｃペ
プチドを免疫化及び抗体識別の両方に使用する必要はな
い。例えば、骨髄腫細胞と融合する免疫脾臓細胞を作成
するためにマウスを免疫化する際、免疫原は、ＩｇＥ産
出性骨髄腫細胞例えばＳＫ００７細胞の細胞膜から分離
された膜結合型ＩｇＥでよい。免疫原はＩｇＥ産出性骨
髄腫細胞でもよい。

【００７８】免疫原に合成ε. ｍｂ／ｅｃペプチドを使
用するためには、ペプチドをタンパク質キャリヤと共役
させればさらに効果的である。好適なタンパク質キャリ
ヤはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であ
る。ペプチドセグメントにＬｙｓ残基がない場合、ある
いはＬｙｓ残基がセグメントの中央部にある場合、Ｃ末
端にＬｙｓ残基を付け加えることが望ましい。Ｎ末端は
すでにα−アミノグループがあるので、修飾された合成
ペプチドは結合用に２つのアミノグループを持つことに
なる。

【００７９】ペプチドの多数の分子をキャリヤタンパク
質の個々の分子に結合させることができる。ＫＬＨの場
合、ペプチド／ＫＬＨに対する好適な分子比は１０であ
る。結合方法は十分に確立されている。グルタルアルデ
ヒド、ビス（bis ）（スルフォスクシンイミジル）スベ
リン酸、またはジスルフォスクシイミジル酒石酸（ロッ
クフォードＩＬのピアス・ケミカル社のカタログ＃２１
５７９、２０５９１）などの架橋剤が使用されている。
好適な架橋剤は後者である。

【００８０】ＫＬＨ複合体などの免疫原を使用してウサ
ギ、ヤギ、ラットまたはマウスを免疫化することによっ
て、ε. ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な多クローン性抗体
を作成することができる。免疫マウス及びラットの脾臓
またはリンパ節から取り出したリンパ球も、ε. ｍｂ／
ｅｃペプチドに特異な単一クローン性抗体を分泌するハ
イブリドーマの作成に利用できる。単一クローン性抗体
の作成に好適なプロトコルは、マウスの免疫脾臓細胞を
非分泌型マウス骨髄腫細胞、例えばＮＳ−１またはＳＰ
２／０細胞とポリエチレングリコールを用いて融合する
ものである。マウスの最適な免疫化には、ペプチド−Ｋ
ＬＨ複合体５０μｇを完全フロイントアジュバンドに入
れ、各マウスに皮下注射して開始する。２週間後及び４
週間後に、同量の抗原を不完全フロイントアジュバント
に入れて皮下注射する。約６週間後に、４回目の抗原注
射を腹膜内に生理食塩水を用いて行なう。最後の注射か
ら４日後にマウスを殺し、脾臓を取り出して、骨髄腫細
胞と融合させる単細胞懸濁液を作成する。ＩｇＥ産出性
ヒト骨髄腫細胞、例えばＳＫ００７細胞の細胞膜から分
離した精製天然ヒト膜結合型ＩｇＥ（付属膜固着ドメイ
ンを備えている）で免疫化する場合にも同様なプロトコ
ルを使用できる。ヒトＩｇＥ産出性細胞を免疫原として
使用した場合、１×１０⁷ の細胞を２週間間隔で腹腔内
注射した。

【００８１】クローニング及びハイブリドーマ培養に関
するポリエチレングリコールを用いた融合方法及びその
他の様々な方法は、第１１項に説明されている。

【００８２】単一クローン性抗体に対するハイブリドー
マのスクリーニングまたはε．ｍｂ／ｅｃペプチドと反
応する多クローン性抗体の識別は、固相抗原として合成
ε．ｍｂ／ｅｃペプチドを使用して酵素連結型免疫溶媒
アッセイ（ＥＬｌＳＡ）で実施できる。別の固相抗原と
して、免疫原に使用したものとは異なるウシ血清アルブ
ミンなどの異なったキャリヤタンパク質とε．ｍｂ／ｅ
ｃペプチドとの複合体がある。以上のようにして得られ
たモノクローナル抗体の性質を下記第６表に示す。な
お、第６表に示された可溶性ｌｇＥ並びに各種細胞との
反応性は、後述の実施例において詳述する方法により調
べた。第６表に示される性質を有するモノクローナル抗
体は、より詳細には、次のようにして得られた。すなわ
ち、ヒトｌｇＥの膜結合領域ペプチド（Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｐ ＶａｌＣｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｇｌｕ ＧｌｙＧｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ）（ε．
ｍｂ／ｅｃペプチド）のＣ末端にＬｙｓを付加したペプ
チドを化学合成した。このペプチドをキーホールリンペ
ットヘモシアニン（ＫＬＨ、シグマ社製）又はオバルブ
ミン（シグマ社製）に結合した。この結合は、１ｍｇ／
ｍｌのペプチドと１ｍｇ／ｍｌのＫＬＨ又はオバルブミ
ンとを、０．０４％グルタルアルデヒド（シグマ社製）
の存在下、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中で４
℃で１６時間反応させ、ＰＢＳに対して透析することに
より、ペプチドとＫＬＨ又はオバルブミンとを架橋する
ことにより行った。この条件で、９０％を超えるペプチ
ドが架橋された。

【００８３】上記のようにして作製したε．ｍｂ／ｅｃ
−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロインドのアジュバント
と共に４回皮下又は腹腔内投与し、次いでマイトマイシ
ンＣ（シグマ社製）処理（２０ｍｇ／ｍｌで２０時間）
ＳＥ４４マウスミエローマ細胞（細胞表面上にヒトｌｇ
Ｅを表す）と共に２回腹腔内投与した。ポリエチレング
リコール（フィッシャー社製Ｃａｒｂｏｗａｘ）を用い
て脾細胞をＳｐ２／０細胞と融合した。増殖するハイブ
リドーマの上清とε．ｍｂ／ｅｃ−オバルブミンとの反
応性をＥＬｌＳＡにより調べた。陽性のウェルについ
て、細胞表面上のｌｇＥとの結合能力を間接免疫蛍光フ
ローサイトメトリー分析により調べた。これらの分析に
おいて陽性の抗体を分泌していたハイブリドーマを限界
希釈法によりサブクローニングした。培養上清中の抗体
をプロテインＡ（レプリゲン社製）親和性クロマトグラ
フィーにより精製した。

【００８４】得られた抗体について、下記実施例に詳述
する方法により、可溶性ＩｇＥ及び第６表に示す細胞と
の反応性を調べた結果、第６表に示す結果が得られた。

【００８５】 第６表 ε. ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な抗体の、別のＩｇＥ含有標的との 反応性 反応性 アッセイ 合成ε. ｍｂ／ｅｃペプチド ＋ ＥＬＩＳＡ 可溶性ＩｇＥ − ＥＬＩＳＡ 好塩基球及びマスト細胞 − 免疫蛍光着色 ヒスタミン放出 ＳＫ００７骨髄腫細胞 ＋ 免疫蛍光着色 ＩｇＥ産出性Ｂ細胞 ＋ 免疫蛍光着色

【００８６】１３．動物モデルでの実験 物質及び方法を動物モデルシステムで実験する。最も関
連性のあるシステムの中の２つは次のものである。

【００８７】Ａ．喘息／アカゲザルモデル 本発明によるヒトε. ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な単一
クローン性抗体及びそれらの関連物質は、様々なＩｇＥ
媒介アレルギーの患者の治療に使用するものである（後
述の第６項を参照されたい）。これらのアレルギーの
中、非本態性喘息は重症のアレルギーである。喘息を研
究するための実験用モデルシステムがアカゲザルについ
て確立されている。

【００８８】線虫類、回虫病（Ascaris summ）に感染さ
せたアカゲザルの一部は、回虫病の抽出液に対して敏感
になる。これらの敏感なサルに回虫病抗原を含んだスプ
レーをかけると、それらは喘息に似た呼吸障害を引き起
こす。パターソンＲ．，Ｊ．Clini. Invest.５７：５８
６〜５９３（１９７６）。

【００８９】本発明の様々な物質を喘息／アカゲザルモ
デルシステムで実験できる。回虫病に敏感なサルに対し
て実験的治療すなわち制御治療を施して、以下の項目の
決定を行うための測定をする。 （ａ）回虫病刺激に対する喘息症状が軽減するか。 （ｂ）循環中のＩｇＥが減少するか。 （ｃ）循環内のＩｇＥ産出性Ｂ細胞が減少するか。 （ｄ）好塩基球上のＩｇＥ密度が減少するか。

【００９０】Ｂ．マウスモデルシステム マウスが本来的にアレルギー症状を引き起こすことは知
られていない。しかし、ＩｇＥ産出性Ｂ細胞及びＩｇＥ
の減少に関する目的治療の薬学的機構の説明には、マウ
スは優れたモデルになる。

【００９１】マウスのε. ｍｂ／ｅｃセグメントはすで
に配列がわかっている。イシダＮ．他のEMBO J. １：１
１１７〜１１２３（１９８２）。１９のアミノ酸残基ペ
プチドは Glu-Leu-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-Cys-Ile-Glu-Glu-Val-Gl
u-Gly-Glu-Glu-Leu-Glu-Glu である。

【００９２】ペプチドは、Ｃ末端に余分にＬｅｕ−Ｌｙ
ｓ残基を有するものを含めて、幾つかの形態に合成され
る。

【００９３】ペプチド及びそのＫＬＨ複合体を、ウサギ
及びヤギを免疫化するための抗原として使用する。抗血
清を集める。抗原特異性抗体を、ペプチドと（追加のＬ
ｅｕ−Ｌｙｓと）、またはウシ血清アルブミンに連結し
たペプチドと複合化したセファローズ４Ｂのカラムを用
いて精製する。正常なマウスに精製抗体またはそれらの
関連物質を静脈注射または腹膜内注射して、以下の項目
について調べる。 （ａ）循環中の総ＩｇＥが減少するか。 （ｂ）ＩｇＥ産出性Ｂ細胞の数が減少するか。 （ｃ）好塩基球上のＩｇＥの密度が減少するか。 （ｄ）ε. ｍｂ／ｅｃペプチドに特異なＩｇＭ及びＩｇ
Ｇが異なった効果を引き起こすか。この項目は、ＩｇＥ
−産出性Ｂ細胞の減少時の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣ
Ｃ）の効果を示すためのものである。ＩｇＭではなくＩ
ｇＧがＡＤＣＣを媒介することがわかっている。 本発明を以下の実験によってさらに説明する。

【００９４】実験Ｉ：ハイブリドーマ及び単一クローン
性抗体の調製 ａ）ヒトＩｇＥの調製 ヒトＩｇＥは市販の供給源から入手して、融合及びハイ
ブリッドのスクリーニングのための免疫脾臓細胞を得ら
れるようにマウスを免疫化するために精製した。ＩｇＥ
は、様々な単一クローン性抗ＩｇＥ抗体に特性を与える
ためにも利用される。２種類のヒトＩｇＥを使用した。
一方はヒト血清から精製された多クローン性ＩｇＥであ
って、これはベントレックス（Ventrex ）（米国メーン
州、ポートランド）から入手した。このヒトＩｇＥは、
ヒトＩｇＥに特異なウサギＩｇＧとを結合したセファロ
ーズ４Ｂのカラムを用いて親和性クロマトグラフィーに
よって血清から精製した。混在しているヒトアルブミン
及びトランスフェリン（transferrin ）をアルブミン及
びトランスフェリンに特異な抗体と結合した親和性カラ
ムによって除去した。単一クローン性ヒトＩｇＥも、Ｉ
ｇＥ産出性Ｕ２６６細胞系の培養物の上澄みから産出さ
れた。ＩｇＥは、ヒトＩｇＥに特異な単一クローン性抗
体と結合したセファローズ４Ｂカラム上で親和性により
精製した。この単一クローン性抗体ＩｇＧは、タンパク
質Ａ結合カラムによって特異性ハイブリドーマを産出す
るマウスの腹水から精製された。

【００９５】多クローン性及び単一クローン性ヒトＩｇ
Ｅを、還元状態及び非還元状態下でＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析した。いずれの場合
も、はっきりしたＩｇＥ分子（非還元状態下）とＨ及び
Ｌ鎖（還元状態下）とが観察され、他の混在タンパク質
は小集団が僅かに存在するだけであった。Ｕ２６６株化
細胞は血清外の規定媒介物内で成長したのであるから、
単一クローン性ヒトＩｇＥ内に混在しているタンパク質
の識別については幾つかの手がかりがある。

【００９６】ｂ）免疫化の手順 １．手順 最初の段階で生後６〜８週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウス
を用いて、骨髄腫細胞と融合させてハイブリッドを形成
するための免疫脾臓細胞を形成できるように免疫化し
た。ベントレックスによって供給された血清から精製さ
れた多クローン性ヒトＩｇＥを免疫原として使用した。
これの原理は、Ｕ２６６株化細胞によって産出された単
一クローン性ＩｇＥは一定の未知の異形を産出するであ
ろうということに基づいている。また、Ｕ２６６ Ｉｇ
Ｅのイデオタイプに対抗する単一クローン性抗体の発生
を我々は望んでおらず、単一クローン性抗体に対抗する
抗イデオタイプ反応を誘発する可能性の方がはるかに高
いであろう。Ｕ２６６産出ＩｇＥで免疫化したマウスで
３つの融合実験をした後、我々は多クローン性ヒト血清
産出ＩｇＥで免疫化したマウスとの融合に切り換えた。

【００９７】免疫化するため、各マウスにヒトＩｇＥを
毎回５０μｇ注射した。１度目の免疫化は完全なフロイ
ントアジュバンド中で行った。マウスのリンパ節が集ま
っている部位、例えば肢と胴の交差部分の下側に皮下注
射した。１カ月後及び２カ月後にマウスの同じ部位にＩ
ｇＥ５０μｇを皮下に追加免疫注射した。追加免疫注射
液は、１度目の注射とほぼ同様にして調製されたが、補
助免疫注射液の場合には不完全フロイントアジュバンド
中で乳化が行われた。

【００９８】少なくともさらに１カ月後、各マウスにＰ
ＢＳ内で５０μｇのＩｇＥで最後の（４度目の）皮下注
射で免疫を更新した。各マウスは、各肢と胴との交差部
に皮下または腹膜内に注射した。最後の注射から３日後
にマウスを殺して脾臓を取り出した。次に、その脾臓細
胞を以下の手順で骨髄腫細胞と融合した。

【００９９】ｃ）融合 脾臓細胞と骨髄腫細胞とを５：１の割合で含有する懸濁
液を調製した。選択した骨髄腫細胞はＮＳ−１であっ
た。ＮＳ−１細胞は、約１７時間毎に増倍するように調
節した。それらは対数期の時に融合に使用した。ＮＳ−
１細胞は、ウシの胎児の血清（ＦＣＳ）５％、ペニシリ
ン１００ユニット／ｍｌ及びストレプトマイシン１００
μｇ／ｍｌを含有しているデルベッコ（Dulbecco）のMo
dified Eagle's培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌ中に６×１０
⁴ 細胞／ｍｌの濃度で細菌プレート（１００ｍｍ）内で
継代培養した。培地は３日毎に換えた。あるいは、細胞
を同じ培地１０ｍｌ中で１．５×１０⁵ 細胞／ｍｌで継
代培養し、培地を２日毎に換えた。

【０１００】脾臓細胞は、脾臓を細菌プレート（１００
ｍｍ）に載せて、脾臓の両端部にカルシウム、マグネシ
ウムを含まないＰＢＳ（ＣＭＦ−ＰＢＳ）２０ｍｌを注
入することによって脾臓細胞を単離させて準備した。次
に、脾臓細胞を５０ｍｌの遠心分離管へ移した。脾臓細
胞を２００ｇで５分間遠心分離してから、０．８３％Ｎ
Ｈ₄ Ｃｌ（０．１５５Ｍ）５ｍｌ中で室温で１０分間懸
濁することにより、赤血球を溶解した。ＣＭＦ−ＰＢＳ
５ｍｌを管に加えて、溶解を中止させた。次に、細胞
をＣＭＦ−ＰＢＳ １０ｍｌ内で小粒状にして再び懸濁
させた。細胞懸濁液４０μｌをZap-oglobinTM ３滴と共
に生理食塩水１０ｍｌに添加することにより、リンパ球
の濃度を測定した。リンパ球の数をヘマシトメータ（he
macytometer ）で数えて、細胞濃度を決定した。ＮＳ−
１細胞を細菌プレート（１００ｍｍ）から５０ｍｌの遠
心分離管へ移した。細胞濃度を測定した。次に、ＮＳ−
１細胞をＣＭＦ−ＰＢＳ １０ｍｌ内で懸濁して、５０
ｍｌの遠心管内の脾臓細胞と１：５の割合で混合した。
一般的に、１つの免疫脾臓から２〜５×１０⁸ の細胞が
得られ、各融合実験に２つの脾臓を用いる。細胞を回転
させ、ＣＭＦ−ＰＢＳ １０ｍｌで一度洗浄した。上澄
みをガラスパスツールピペットでできる限り多く吸引し
た。管を軽く叩いて、細胞小粒を分離した。細胞を準備
する前に、融合混合物を次のようにして調製した。ポリ
エチレングリコール１４５０（コダック）５ｇをＣＭＦ
−ＰＢＳ ５ｍｌ及びＤＭＳＯ ０．５ｍｌと混合し
た。この混合物を５６℃まで加熱し、最終ｐＨが７．０
になるまで滴定してから、０．２２μｍの孔のフィルタ
ーで濾過することによって殺菌した。そのうち１．０ｍ
ｌを低温管（Cryotube）に加えて、これらを−７０℃で
保存した。使用する融合混合物の調製のため、低温管内
の分注物の１つを３７℃に加熱して溶かした。別に、Ｄ
ＭＥＭ（血清無し）１．０ｍｌを入れた管を３７℃に加
熱した。ポリエチレングリコール融合混合物の分注物
１．０ｍｌを細胞懸濁液に添加して、その懸濁液を十分
に混合した。ポリエチレングリコール融合混合物を添加
してから４５秒後、余熱したＤＭＥＭ（血清無し）２．
０ｍｌを混ぜながら滴下した。それから、余熱したＤＭ
ＥＭ（血清無し）の残りの８ｍｌを添加した。細胞を室
温で１０分間保持した。ＦＢＳ ２．０ｍｌを懸濁液に
添加して、その懸濁液を十分に混ぜた。ＦＢＳとＣＭＦ
−ＰＢＳとを組み合わせることにより、細胞が試験管壁
に付着しないようにすることができる。次に、懸濁液を
４００ｇで４分間遠心分離した。細胞は、回転させた
後、ＦＢＳ ５％、ペニシリン１００ユニット／ｍｌ、
ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を補充した
変性媒体約１２０ｍｌ内で懸濁した。細胞懸濁液の濃度
は、懸濁液２００マイクロリットル当りの脾臓細胞が
３．３×１０⁵ になるように調節した。次に、懸濁液の
うち２００マイクロリッターを９６ウェルマイクロタイ
タープレートの各ウェルに分配した。各融合に対してそ
のようなプレートを２０〜３０枚用意した後、プレート
を定温器に移して、５％のＣＯ₂ 内で３７℃に保持し
た。細胞をプレートで７日間成長させてから、増殖培地
を取り出し、新しい培地を加えた。それから４日後、酵
素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）をウェル内の抗体に対して実
施して、ヒトＩｇＥと結合しているものを測定した。

【０１０１】２．結果 上記の免疫プロトコルを用いたマウスでの４つの融合実
験を実施した。これらの融合のため、融合細胞の９６ウ
ェルからなるプレートをそれぞれ７、１５、３６および
１５用意した。ウェルの９８％以上で細胞が成長し、１
つのウェルでは平均して３〜５のクローンのハイブリッ
ドがあった。このため、４つの融合で約７，０００のウ
ェルを作り、およそ２１，０００〜３５，０００クロー
ンを得た。

【０１０２】ｄ）ＥＬＩＳＡの手順 １．手順 融合ウェルから得られた非常に大量のハイブリッドの中
心的なスクリーニングの手順は、固相抗原としてヒトＩ
ｇＥを用いたＥＬＩＳＡであった。ヒト血清（ベントレ
ックス）から精製した多クローン性ＩｇＥを抗原として
使用した。我々のスクリーニング手順の中の１つの重要
で決定的な方法は、各融合実験から得られた１，０００
〜４，０００のウェルから全体的に親和性が高い抗体を
スクリーニングすることであった。これには、各ウェル
をごく少量のヒトＩｇＥで、すなわち０．１μｇ／ｍｌ
のＩｇＥ ５０μｌで被覆した。すべてのＩｇＥが固相
と結合したとすると、各ウェル内は僅かに５ｎｇとな
る。このように少量であるから、混在しているタンパク
質に特異なハイブリッドをスクリーニングする可能性も
非常に小さくなる。別の非常に重要な方法は、外径の数
値が大きいウェルだけを選択して、さらなる特徴付け及
びクローニングを行うものであった。手順として、０．
１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＥ ５０μｌを９６ウェルのイ
ミュンロン（Immunlon）Ｉプレートのウェルに添加し
た。プレートに蓋をして、１８時間４℃で温置して、タ
ンパク質をプレートに結合させた。次に、プレートの液
体内容物を取り除き、０．１Ｍ ＮＨ₄ Ｃｌ ２００μ
ｌを各ウェルに添加して、プレートの残留結合部位を飽
和させた。ＮＨ₄ Ｃｌ溶液を室温で３０分間ウェル内に
保持した。次に、ＮＨ₄ Ｃｌ溶液を取り除いてから、ウ
ェルをＰＢＳ及び０．０５％のツイーン（Tween ）２０
で３度洗浄した。後述の抗体懸濁液を添加するまで、Ｐ
ＢＳ／０．０５％ツイーン２０溶液の一部をウェルに保
持した。９６ウェルプレートの各ウェルから得た細胞融
合物上澄み５０μｌをイミュロンＩプレートの各ウェル
に添加して、１時間温置した。温置後、そのプレートを
ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で３度洗浄して、未結
合抗体を取り除いた。９６ウェルプレートの各ウェルか
ら得た細胞融合物上澄み５０μｌをイミュロンＩプレー
トの各ウェルに添加して、１時間温置した。温置後、そ
のプレートをＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で３度洗
浄して、未結合抗体を取り除いた。細胞融合物上澄みに
は、９６ウェルプレート内の様々なハイブリドーマによ
って産出された抗体が含まれているであろう。ヒトＩｇ
Ｅに特異な抗体はそれと結合するであろう。次に、固相
と結合した抗体の量を、基質として３，３’、５，５’
−テトラメチルベンジジンを用いたワサビダイコンのペ
ルオキシダーゼ（peroxidase）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ
を用いたルーチン手順によって測定した。

【０１０３】２．結果 スクリーニングを行った全部で約７，０００のウェルの
中、約４，０００のウェル（約６０％）がＥＬＩＳＡで
プラスであった。これらのプラスのウェルのほとんど
は、ヒトＩｇＥに対する単一クローン性抗体を産出する
ハイブリッドを含んでいるのであろう。ＥＬＩＳＡでプ
ラスのこれらの約４，０００のウェルの中、外径の数値
が最も大きい５３のウェルを選択して、クローニング及
びさらなる特徴付けを行った。これらの５３の単一クロ
ーン性抗体を、様々な希釈度のヒト血清で被覆したプレ
ートのウェルを用いてＥＬＩＳＡで検査した。これらは
すべてＥＬＩＳＡでマイナスであり、それらがヒトアル
ブミン、ＩｇＥ、ＩｇＭ、トランスフェリンまたは、マ
ウスに対する免疫原として、また一次スクリーニングの
ＥＬＩＳＡでの抗原として使用したＩｇＥ調製物に混在
しているその他の主要な血清タンパクと反応しないこと
を暗示している。

【０１０４】ｄ）単細胞のクローニング ＥＬＩＳＡで外径の数値が最も大きい５３のウェルの各
々から得た細胞懸濁液を２４ウェルのプレートのウェル
内に広げて、１ｍｌ当りの細胞が３０、５０及び１００
になるように細胞懸濁液を希釈した。細胞懸濁液（平均
してそれぞれ３、５及び１０の細胞を含んでいる）０．
１ｍｌを９６ウェルプレートのウェルに入れた。これら
のウェルはヒストンで被覆しておいた。細胞が成長して
コロニーになった後、細胞を顕微鏡で調べた。各コロニ
ーの細胞は動き回らず、コロニーを形成した。ＥＬＩＳ
Ａで最も強い反応を示す単細胞クローンを選択して、広
げて培養した。

【０１０５】ｅ）単一クローン性抗体の産出及び精製 所望の単一クローン性抗体を多量に産出するため、以下
の手順を実施した。２４ウェルプレートのウェル内で成
長した、ＥＬＩＳＡで大きい外径数値を示したクローン
の一部をさらに１００ｍｍ組織培養プレート内で広げ
た。所定の単細胞クローンの増殖培養物を清潔に取り扱
われたマウスの腹腔に、１匹当り５百万細胞の割合で別
々に注射した。７日後、各マウスの腹水を集めて冷凍し
た。腹水内の単一クローン性抗体を以下のようにして精
製した。冷凍腹水を溶かして、ナイロン布で濾過して粘
性物を取り除いた。十分なフェニールメチルスルフォニ
ルフルオライドを腹水に添加して、最終濃度を０．１ｍ
Ｍにした。１．２Ｍアセテートバッファ（ｐＨ４．０）
０．０５ｍｌを腹水１ｍｌ毎に添加した。アセテートバ
ッファの最終濃度は６０ｍＭであった。ｐＨは４．５に
調節した。処理した腹水１ｍｌ当りにカプリル酸（Ｍ
Ｗ：１４４．２１、密度：０．９１ｇ／ｍｌ）２５μｌ
を激しく撹拌しながら滴下した。懸濁液を室温に保ち、
さらに３０分間撹拌し続けた。次に、懸濁液を１５，０
００ｇで１０分間遠心分離して沈殿物を取り除いた。Ｉ
ｇＥを含む上澄みにその上澄みの体積の１／１０の量の
１Ｍヘペスバッファ（ｐＨ８．０）を添加して、上澄み
を中和した。次に、ＩｇＥを５０％の（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄
で沈澱させた。次に、沈殿物をヘペスバッファに溶解
した。この溶液を一夜中ヘペスバッファで透析すること
により、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ をＩｇＥから取り除いた。
ヘペスバッファは透析中に２度交換した。透析後、ヘペ
スバッファは精製溶解ＩｇＥを含有している。この精製
ＩｇＥをある特徴付けアッセイに使用した。一部の単一
クローン性抗体は複式カラムクロマトグラフィ法によっ
て腹水または培養液から精製した。まず、ＮａＣｌを
０．０１Ｍから０．１５Ｍまで段階的に増加させながら
０．０５Ｍトリス（Tris）ｐＨ８．０を用いて、抗体を
ＤＥ−５２陰イオン交換樹脂（英国メードストンのホワ
ットマン（Whatman ））上でクロマトグラフィ分離し
た。抗体含有フラクションは酵素免疫アッセイで識別
し、アミコン濾過（米国マサチューセッツ州、ダンバー
ズのアミコン、ＹＭ１０膜）で濃縮し、さらに０．０１
から０．３Ｍまでのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）の段
階グラジエントを利用してヒドロキシルアパタイトカラ
ム（米国カリフォルニア州リッチモンドのリオラド（Ri
oRad）；バイオゲル（ＨＴ）で精製した。純度は等電集
束（isoelectric focusing）（１３）及びファーマシア
ＰＨＡＳＴ装置（米国ニュージャージー州ピスカットウ
ェイのファーマシア）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価
し、濃度はＯＤ２８０ｎｍ（１．５＝１ｍｇ／ｍｌ）で
測定した。

【０１０６】実験ＩＩ：本発明の単一クローン性抗体の
特徴付け ａ）免疫蛍光アッセイ及びラジオバインディングアッセ
イを用いた好塩基球との結合 ＩｇＥ反応型単一クローン性抗体が末消血液から分離さ
れた好塩基球と結合するかどうかを調べる研究が行われ
た。この二次スクリーニングから、治療価値のある抗体
を選択した。それらの抗体は、好塩基球及びマスト細胞
と結合して、薬学的メディエータを放出するものでなけ
ればならない。好塩基球は白血球中に非常に低い割合
（０．５〜２％）を占めるだけであるから、まず免疫蛍
光着色アッセイを使用することを選択した。濃縮好塩基
球でも、免疫蛍光着色またはビオチン−アビジン酵素免
疫着色法を用いた単細胞レベルでの細胞の検査は、細胞
集団全体を検査するラジオバインディングまたはＥＬＩ
ＳＡよりも正確な測定を行うことができるであろうと考
えた。

【０１０７】１．好塩基球の分離 好塩基球はＰ．ラウプラサッド（Raghuprasad ）のJ. I
mmunol、１２９：２１２８〜２１３３（１９８２）に記
載されている手順によってパーコル（Percoll）上で密
度遠心分離を利用して正常で健康な固体の末梢血液から
高濃度に濃縮した。簡単に説明すると、９０％パーコル
溶液９０ｍｌに１０×ハンクス（Hanks）均衡塩水８．
９６ｍｌ、１ＮＨＣｌ ０．４５ｍｌ及び１０×ヘペス
バッファ（ｐＨ７．６）１ｍｌを混合してパーコル保存
溶液を調製した。パーコルの必要密度は次式（８）を用
いて準備した：パーコル密度（ｇ／ｍｌ）＝（パーコル
保存溶液の％×０．００１１８６）＋１．００４１ 但し、０．００１１８６は定数、１．００４１は生理媒
体の密度である。パーコルの密度は温度変化するため、
実験日の前日に調製して一夜室温に保持した。正常なド
ナーから新しく得られたヘパリン処理済みの血液を培養
基ＲＰＭ１−１６４０で１：１に希釈してから、フィコ
ル／ハイパークカシオン（Ficoll/Hypaque cusion ）上
で遠心分離した（密度＝１．０７０ｇ／ｍｌ）。接合部
の単核細胞は別の用途のために取り除き、赤血球小粒の
上部の上の白みがかった層を回収した。これらの顆粒細
胞を洗浄して培養基内で再び懸濁してから、注意深く層
状にした１．０７２及び１．０７８ｇ／ｍｌの２つのパ
ーコルグラジエントで１５分間遠心分離した。パーコル
層の接合部及び培養基／パーコル上層の接合部の下側に
集まった細胞を採集した。これらの細胞は、個々のドナ
ーに応じて２〜１０％の好塩基球を含んでいた。 ２．アッセイの手順 ５×１０⁶ 細胞／ｍｌの濃度の濃縮好塩基球懸濁液５０
μｌを特定の抗体を入れた各１．５ｍｌマイクロフュー
ジ管に加えた。次に、ヒトＩｇＥを抗原としたＥＬＩＳ
Ａで外径数値が最も大きかったハイブリドーマクローン
から取った上澄み５０μｌを各管に添加した。一部のク
ローンでアッセイを繰り返し実施した。精製された抗体
が得られたら、２０、５及び１μｇ／ｍｌを使用した。
腹水が得られたら、１：５０の希釈度で使用した。細胞
及び抗体を入れた管を次に室温で３０分間インキュベー
ションした。インキュベーション後、管を回転させて、
上澄みを取り出し、ウシの胎児の血清２％とアジ化ナト
リウム０．１％を含有するＲＰＭＩ１６４０の混合液で
細胞を２度洗浄した。次に、管を軽く叩いて細胞小粒を
分離させた。フルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧの標識を付けた抗体
１０μｌを各試験管に１：２００の希釈度で添加した。
この標識抗体は、好塩基球上のＩｇＥに付着していた単
一クローン性抗体と結合し、これらの単一クローン性抗
体を識別する手段となる。管を再び室温で３０分間定温
保持した。管を遠心分離して、細胞を上記媒体で洗浄し
た。次に、細胞をＰＢＳ ５０μｌ内で再び懸濁して、
個別のスライドに載せ、カバーグラスを被せた。細胞を
蛍光顕微鏡で観察した。抗体で細胞に着色した時、各視
野内の細胞の一部が明るく着色されていることを観察で
きた。確実に着色された細胞の割合は実験によって異な
り、約２〜１０％である。

【０１０８】３．ラジオバインディングアッセイ これに使用される段階の多くは、免疫蛍光着色法のもの
に類似している。濃縮した好塩基球を含む白血球フラク
ションを、非特異性結合を阻止する阻止剤として機能す
る正常なヤギ血清１％の存在下でマウス単一クローン性
抗体及び ¹²⁵Ｉヤギ抗マウスＩｇＧ約１０，０００ｃｐ
ｍと共に温置した。３０分後、温置混合物を円錐型プラ
スチック遠心分離管内のウシ血清（１００％）の上に載
せた。細胞を小粒状に遠心分離した後、上層と血清を取
り除いた。管を逆さにして残留液を排水した。次に、細
胞小粒を含んでいる円錐の先端部を鋭利な剃刀の刃で切
り取った。次に、これらの先端部を管に入れて、シンチ
レーションカウンターで ¹²⁵Ｉを数えた。負の制御単一
クローン性抗体とヒトＩｇＥ特異性単一クローン性抗体
との間で結合 ¹²⁵Ｉの量を比較することによって、結合
の正負を決定した。

【０１０９】４．結果 最初は、免疫蛍光アッセイを用いて幾つかの実験を行っ
た。もっと最近では、ビオチン標識第２抗体（ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ）及びペロキシダーゼー結合アビジンを用い
た同様な手順による試験が繰り返された。２つのアッセ
イから得られた結果から、バックグラウンド着色が抗体
毎に異なることがわかった。その結果から、これらのア
ッセイの感度がヒスタミン放出アッセイ（次項）ほどに
よくないこともわかった。これらのアッセイで感度が比
較的低くなる主な理由は、選択された２〜３のドナーか
らの白血球内の好塩基球の割合がすべて非常に低いこと
であった。これらの免疫結合実験では、好塩基球の割合
が非常に高い個体が好適である。好塩基球の割合が高い
白血球で始めれば、これらの実験に適した好塩基球濃縮
フラクションを作成することができる。

【０１１０】ｂ）白血球からのヒスタミン放出の誘発 ヒトＩｇＥに特異な単一クローン性抗体が好塩基球上に
結合したＩｇＥと結合すると、ＩｇＥが架橋して、下に
あるＦｃεＲが凝集してヒスタミン及びその他の薬学的
メディエータの放出を引き起こす。様々なヒトＩｇＥ特
異性単一クローン性抗体を、洗浄したヒト末梢血液の白
血球からのヒスタミン放出を誘発する能力について調べ
た。

【０１１１】１．手順 使用した方法は、シラガニアン及びフックによって詳細
に説明されている方法と同じであった。イン・ビトロ・
アッセイで、誘発要因の温置時に培地内へ放出された白
血球集団内のヒスタミン総量の割合を計量した。培地内
のヒスタミンすなわち細胞溶解因子の測定は、ｎ−ブタ
ノールでヒスタミンを抽出してそれを高ｐＨにてカップ
リング化合物であるｏ−フタルアルデヒドと反応させる
ことにより、蛍光物を生成し、それをフルオロメータで
測定する自動機器で実施した。ヒスタミン放出誘発実験
を実施して、被験抗体及び標準抗体と共にインキュベー
ションした後、白血球から培地を集めて、ヒスタミン総
量を測定するための細胞溶解因子を調製した。洗浄した
白血球からのヒスタミン放出の試験手順を簡単に説明す
ると、シラガニアンＲ．Ｐ．及びフックＷ．Ａ．の「臨
床化学のマニュアル」ローズＮ．Ｒ．及びフリードマン
Ｈ．編、第２版ｐｐ２０８〜３２１（米国ワシントン
Ｄ．Ｃ．のアメリカン・ソサイエティ・オブ・マイクロ
バイオロジー）に記載されている手順を実質的に採用し
た。血液は正常な提供者から静脈注射器で引き出した。
５０ｍｌの円錐管内で、それぞれ１０ｍｌの血液を０．
１Ｍ ＥＤＴＡ １ｍｌ及びデキストランデキストロー
ス溶液２．５ｍｌと混合した。（ここに述べる溶液及び
試薬はすべて上記シラガニアンに詳細に記載されてい
る。）赤血球層と血しょう層との間にはっきりした接合
部ができるまで、混合物を室温で６０〜９０分間保持し
た。血しょう−赤血球−血小板層を取り除いてから、４
℃で８分間１，１００ｒｐｍで回転させた。血小板を含
んでいる上澄みを取り除いて、低温ＰＩＰＥＳ Ａ−Ｅ
ＤＴＡの溶液２〜３ｍｌを加えて、細胞を再び懸濁し
た。さらに、低温ＰＩＰＥＳ Ａ−ＥＤＡＴＡ ４０ｍ
ｌを加えて、細胞を回転させた。上澄みを取り除いてか
ら、細胞を２０ｍｌのＰＩＰＥＳ Ａ内で再び懸濁し
た。次に、細胞を４×１０⁶ ／ｍｌの細胞密度でＰＩＰ
ＥＳ ＡＣＭ内で再び回転させて懸濁した。洗浄白血球
０．３ｍｌを入れた管及びハイブリドーマの培地０．３
ｍｌを入れた管を３７℃に６分間加熱した。これらの管
を混合して、１０分毎に撹拌しながら３７℃でインキュ
ベーションした。６０分経過した時点で、細胞を回転さ
せて、上澄みを保存した。ヒスタミン含有総量に対し
て、洗浄白血球０．３ｍｌを６％過塩素酸と混合した。

【０１１２】２．結果 我々が入手できる血液ドナー間でヒスタミン放出性に信
頼性が無いことを認めたので、日常的にヒスタミン放出
アッセイを実施している外部研究所にヒスタミンアッセ
イを委託した。ジョーンズ・ホプキンズ大学の臨床化学
科のＤｒ．ドナルド・マッグラシャン（MacGlashan）研
究所が、我々のヒトＩｇＥ−特異性単一クローン性抗体
のほとんどについて好塩基球からのヒスタミン放出を誘
発できる能力を確認した。ヒスタミン放出を誘発しなか
った単一クローン性抗体に関する重要な結果について、
国立健康協会のＤｒ．ルーベン・シラガニアン研究所で
確認した。これらの両研究所は、多数の血液ドナーのス
クリーニングによって高ヒスタミン放出体の安定集団を
作成した。Ｄｒ．マッグラシャンによって実施された高
放出体を少なくとも４つ含む７つのドナーからの白血球
を用いた広範な研究の結果を第Ｉ表にまとめた。抗体
は、腹水または精製抗体（１〜５ｍｇ／ｍｌ）から１０
０倍、１０，０００倍または１，０００，０００倍に希
釈した。ヒスタミン放出データは、１つの代表的「超放
出体」からのものである。その結果から、４１の単一ク
ローン性抗体の中、１２がヒスタミン放出を誘発しない
ことがわかった。

【０１１３】 第Ｉ表（その１） ＩｇＥ産出性細胞との反応性、及びヒトＩｇＥに特異なマウス単一クローン性 抗体の好塩基球によるヒスタミン放出を誘発する能力 ──────────────────────────────────── 単一クローン性抗体 ＳＫ００７細胞 ヒスタミン放出 との結合 抗体希釈 フローサイトメトリー 1/10² 1/10⁴ 1/10 ⁶ （総放出に対する％） グループ１ E101-1（γ_1a, κ) ＋ ０ ０ ０ E8-5-3（γ_1b, κ) ＋ ０ ０ ０ E10-21-15 （γ₁,κ) ＋ ０ ０ ０ E10-8-120 （γ₁,κ) ＋ ０ ０ ０ E10-12-55 （γ_1a, κ) ＋ ０ ０ ０ E11-4-70（γ_1b) ＋ ０ ０ ０ グループ２ E10-55-31 （γ₁,κ) − ０ ０ ０ E8-13-1 （γ₁,κ) − ０ ０ ０ E8-32-9 （γ₁,κ) − ０ ０ ０ E357-4（γ₁,κ) − ０ ０ ０ E8-37-4 （γ₁,κ) − ０ ０ ０ E8-1-17 （γ₁,κ) − ０ ０ ０

【０１１４】 第Ｉ表（その２） ──────────────────────────────────── 単一クローン性抗体 ＳＫ００７細胞 ヒスタミン放出 との結合 抗体希釈 フローサイトメトリー 1/10² 1/10⁴ 1/10 ⁶ （総放出に対する％） グループ３ E69-2 （γ₁,κ) ＋ 44 13 0 E10-100-9 （γ_1a, κ) ＋ 68 45 0 E10-41-16 （γ_1a） ＋ 95 91 91 E10-95-3 （γ_1b, κ) ＋ 65 68 3 E10-68-10 （γ₁,κ) ＋ 56 42 2 E10-10-3（γ₁,κ) ＋ 85 78 2 E10-5-83（γ₁,κ) ＋ 82 80 6 E10-24-28 （γ_1b, κ) ＋ 79 89 5 E10-27-5（γ_1b, κ) ＋ 68 90 9 E10-22-84 （γ₂,κ) ＋ 77 84 15 E10-74-28 （γ₁,κ) ＋ 60 65 3 E10-1-88（γ₁,κ) ＋ 72 55 2 E10-3-14-25 （γ₁,κ) ＋ 68 58 3 E10-7-19（γ₁,κ) ＋ 38 26 6 E10-18-3（γ₁,κ) ＋ 33 26 0 E10-40-62 （γ_1b, κ) ＋ 37 24 9 E10-19-12 （γ₁,κ) ＋ 28 37 36

【０１１５】ｃ）単一クローン性抗体のＩｇＥ産出性骨
髄腫細胞との結合 （免疫グロブリン分泌型プラズマ細胞から得た腫瘍細胞
である）一部の骨髄腫細胞は、その表面上に表出してい
る免疫グロブリンが他のＢ細胞の表面上のものに較べて
低レベルであることが知られている。ＩｇＥ分子は２つ
の異なった機構で好塩基球（またはマスト細胞）及びＢ
細胞と結合する。ＩｇＥは、好塩基球及びマスト細胞上
のＦｃεＲ分子とＩｇＥの定常領域断片上の特定の部位
との相互作用によって好塩基球及びマスト細胞と結合す
る。ＩｇＥはＢ細胞またはプラズマ細胞によって合成さ
れてから細胞表面へ運ばれ、エキストラ不変Ｈ鎖セグメ
ントによって表面上に保持される。この固着セグメント
は膜結合型免疫グロブリンだけに発見され、分泌型の免
疫グロブリンには見つからない。好塩基球上のＩｇＥと
Ｂ細胞上のＩｇＥとでは単一クローン性抗体との結合に
差異があることが、アレルギーの治療に抗体を用いる基
本的根拠である。ＩｇＥ産出性Ｂ細胞及びプラズマ細胞
は単核白血球フラクション内で非常に少なく、また膜結
合型ＩｇＥ分子の全体的輪郭及び構造特徴がプラズマ細
胞、Ｂ細胞またはＩｇＥ分泌型骨髄腫細胞間で最もよく
似ているので、単一クローン性抗体のＩｇＥ骨髄種ＳＫ
００７（アメリカンタイプカルチャーコレクションか
ら）細胞との結合について研究することにした。単一ク
ローン性抗体と正常なＩｇＥ産出性Ｂ細胞及びプラズマ
細胞との相互作用についても調べた。

【０１１６】１．手順 表面結合型ヒトＩｇＥラムダ、ＩｇＭラムダ及びＩｇＧ
１カッパをそれぞれ表出しているヒトＳＫＯ−００７、
ＣＣＬ−１５６及びＣＣＬ−１５９細胞を、５％のウシ
の胎児の血清、ＧＩＢＣＯから得たグルタミン２ｍＭ及
び１％の抗生物質−抗菌溶液を補充したＲＰＭＩ培地１
６４０内に維持した。健康なドナーから静脈注射で得た
末梢血液の単核細胞をフィコルーパーク（米国ニュージ
ャージー州、ピスカッタウェイのファーマシア）密度勾
配遠心分離によって調製した。細胞表面との単一クロー
ン性抗体の結合は２種類のアッセイ、すなわち抗体を生
きた細胞に結合させてから間接的蛍光フローサイトメト
リー分析を行うアッセイと、細胞をマイクロタイタープ
レートに付着させた状態での酵素連結抗体アッセイとを
用いて評価した。抗体と生きた細胞との結合は、３００
ｘｇで５分間遠心分離して細胞を小粒状にし、細胞から
維持培地をＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄し、細胞をＰＢＳ−Ｂ
内で２０×１０⁶ で再び懸濁して実施された。細胞懸濁
液５０μｌをＰＢＳ−Ｂ内で定濃度の２倍（１〜１０μ
ｇ／ｍｌ）の抗体５０μｌと混合して、氷の上に保持し
た。３０分間インキュベーションした後、氷で冷却した
ＰＢＳ−Ｂ ２ｍｌを各管に加えて、５℃で５分間３０
０ｘｇで遠心分離をして細胞を集めた。上澄みを静かに
移動して、細胞小粒を渦流で再び懸濁させ、細胞をさら
なるＰＢＳ−Ｂ ２ｍｌで一度洗浄した。遠心分離で細
胞を集めてから、ＰＢＳ−Ｂ内で１：２０に希釈した親
和性による精製ヤギＦ（ａｂ’）２抗−マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer M
annheim ）、ロット５２９３４、コード６０５２９）２
０μｌを各管に加えた。これらの管を氷上に２０分間イ
ンキュベーションした後、上記のようにＰＢＳ−Ｂで洗
浄した。最後に、細胞小粒を、ＰＢＳに入れた１％パラ
ホルムアルデヒド（米国ペンシルバニア州、ウォリント
ンのポリサイエンス社）０．５ｍｌ内で再び懸濁した。
シトロジー・テクノロジー社（米国テキサス州、ヒュー
ストン）の４８８ｎｍ、０．６Ｗで進む５Ｗアルゴンレ
ーザを備えたＥＰＩＣＳプロファイル（米国フロリダ
州、ハイアリーアのコールター）を用いて細胞を分析し
た。蛍光強さは、前方光散乱と垂直方向光散乱とを組合
せたものでゲート制御した後に組み込み式対数増幅器で
集めて、これによって生存細胞を判別した。ケネット
Ｒ．Ｈ．の「単一クローン性抗体」（ニューヨークのプ
リナムプレス発行（１９８０）、編集ケネットＲ．Ｈ．
他）ｐ．３７６に記載されている方法に従ってグルタル
アルデヒド固定細胞にＭＡｂｓを結合させることによっ
て細胞結合型酵素−連結抗体アッセイを実施した。ポリ
Ｌ−リシン（１００μｌ／ウェル、ＰＢＳ内に１０μｇ
／ｍｌ）を平底のマイクロタイタープレート（米国カリ
フォルニア州、オックスナードのベクトン・ディッキン
ソン・ラブウェアのファルコン＃３０７２）に加えた。
この溶液を３０分後に２２℃でウェルから取り除き、カ
ルシウム及びマグネシウム遊離ダルベッコ（Dulbecco）
変性ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）内に２．５×１０⁶ 細胞／ｍ
ｌで存在する細胞５０μｌを各ウェルに加えた。５分間
３００ｘｇで遠心分離して細胞をウェルの底部に沈降さ
せてから、氷温のＰＢＳ内に０．２５％に希釈したグル
タルアルデヒド５０μｌを加えることによって細胞を２
２℃で１０分間固定した。ＰＢＳ（２００μｌ／ウェ
ル）内での０．１Ｍグリシン−０．１％ＢＳＡ、続いて
ブロット（１ｇ／ｌのチメロサールを加えたＰＢＳ内で
の５％脱脂粉乳（米国カリフォルニア州、ロサンゼルス
のカーネーション）の連続インキュベーションによっ
て、非特異的結合部位をブロックした。プレートを緩や
かに揺らしながらブロッキング溶液を取り除いた。細胞
をブロット内の５０μｌ／ウェルの制御または試験単一
クローン性抗体に１時間３７℃で接触させた。プレート
を揺らし、トランスター９６ピペット装置（米国マサチ
ューセッツ州、ケンブリッジのコスター）を用いて２０
０μｌ／ウェルのＰＢＳで６度洗浄して未結合抗体を取
り除いた。続いて、細胞を０．５μｇ／ｍｌのビオチン
標識親和性精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国メリーランド
州、ゲイテルスバーグのＫＰＬ）と共にブロット内で３
７℃で１時間インキュベーションした。すべてのウェル
を上記のようにして洗浄してから、ワサビダイコンペロ
キシダーゼーストレプトアビジンを０．５μｇ／ｍｌの
割合でブロットに３７℃で１時間加えた。上記のように
して洗浄して未結合複合体を取り除き、ＴＭＢ基体１０
０μｌを加えた。プレートを暗所に２２℃で３０分間保
持してから、５０μｌ／ウェルの４ＮＨ₂ ＳＯ₄ を加え
て反応を中止させた。バイオテックマイクロタイタープ
レートリーダを用いて４５０ｎｍの光学密度を測定し
た。

【０１１７】２．結果 フローサイトメトリー分析で試験した４１の単一クロー
ン性抗体の中の３５がＳＫ００７細胞を着色することが
わかった。好塩基球からのヒスタミン放出を誘発する２
９の単一クローン性抗体はすべて着色した。ヒスタミン
放出を誘発しなかった１２の単一クローン性抗体の中の
６がＳＫ００７細胞を着色し、６は着色しなかった（第
Ｉ表）。酵素免疫着色の結果は、フローサイトメトリー
アッセイの結果と同じであった。このため、分析を行っ
た単一クローン性抗体群の中の６が、好塩基球と結合し
てヒスタミン放出を引き起こすことがなく、またＩｇＥ
産出性Ｂ細胞と結合する基準に適合する。前述したよう
に、シラガニアン及びそのグループは、ＩｇＥが好塩基
球と結合することを阻止するヒトＩｇＥに対する２つの
マウス単一クローン性抗体（Ｅ１４Ｃ５ＩＢ１及びＥ１
１ＡＣ３ＩＩＣ）を開発した（Fed. Proc.４６：１３４
６；１９８７）。我々はシラガニアン博士からこれらの
２つの抗体を入手して、それらがＳＫ００７細胞と結合
し、好塩基球からのヒスタミン放出を誘発しないことを
確認した。

【０１１８】ｄ）ヒトＩｇＥとの結合親和力の決定 １．原理及び手順 イムノアッセイの感度が、測定する物質に対する抗体の
親和力によって決まることはよく知られている。２つの
単一クローン性抗体（固相吸着剤としての抗体とトレー
サとしての抗体）を用いた固相サンドウィッチイムノア
ッセイの場合、２つの単一クローン性抗体の抗原に対す
る両方の親和力が重要である。各抗体アッセイを実施す
る際の抗体の親和力の影響及び抗体の親和力を計算する
際のイムノアッセイの使用が系統的に研究されている。
ニムノ他のJ. Immunol. Met.７２：１１７〜１８７（１
９８４）及びミューラーのJ. Immunol. Met.３４：３４
５〜３５２（１９８０）。抗原に対する単一クローン性
抗体の親和力を決定するため、イムノアッセイの固相、
例えば９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートのマイクロタイ
ターウェルに抗原を塗布する。固相上の同じ抗原に対す
る基準単一クローン性抗体の親和力に対比したある単一
クローン性抗体の親和力は、２つの単一クローン性抗体
をイムノアッセイで比較して決定できる。基準単一クロ
ーン性抗体の親和力すなわち会合定数は一定の別の方法
又は同一の方法で決定しておく。親和力を測定しようと
する単一クローン性抗体の外径の数値を基準単一クロー
ン性抗体の数値と比較することによって、その単一クロ
ーン性抗体の親和力が基準単一クローン性抗体よりも大
きいか小さいかがわかる。基準単一クローン性抗体を入
手できない場合、別の抗原に特異な基準単一クローン性
抗体に対して分析を行う。同じ分子量の抗原を固相に塗
布し、その他のアッセイ状態及びパラメータをすべて同
じにすることにより、２つの単一クローン性抗体の相対
親和力を外径の数値から決定することができる。ＳＫ０
０７細胞と結合し、好塩基球からのヒスタミン放出を誘
発しない幾つかのヒトＩｇＥ−特異性単一クローン性抗
体の親和力を決定する際に、ヒトＩｇＥに対する様々な
単一クローン性抗体の結合力を、親和力が１×１０¹¹リ
ットル／モルであることが確認されているヒトβ−ＨＣ
Ｇに対する単一クローン性抗体の結合力と比較した。我
々のアッセイでは、０．１μｇ／ｍｌのβ−ＨＣＧまた
はヒトＩｇＥ ５０μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェル
に塗布してから、抗ＨＣＧ単一クローン性抗体及び固相
上の各抗原に対する様々な単一クローン性抗体を滴定し
た。この手順は、実験ＩのＥＬＩＳＡの手順で説明した
ものと実質的に同じであった。ワサビダイコンペロキシ
ダーゼー結合ヤギ抗マウスＩｇＧ及び酵素基質を用い
て、滴定曲線を決定した。単一クローン性抗体の親和力
は ¹²⁵Ｉ標識ヒトＩｇＥによっても決定できる。抗体の
溶液と既知の濃度の ¹²⁵ＩＩｇＥの溶液とを混合して、
均衡状態になるまで十分な時間（２４時間）結合させ
る。次に、ヤギ抗マウスＩｇＧと結合化した過剰セファ
ローズ４Ｂを用いた親和性吸着によって免疫複合物を迅
速に取り除く。遊離 ¹²⁵ＩＩｇＥを迅速に洗い流す。遊
離 ¹²⁵ＩＩｇＥと結合 ¹²⁵ＩＩｇＥとの比率から単一ク
ローン性抗体の会合定数Ｋａを計算する。この方法は、
親和力が高い抗体に特に適している。

【０１１９】２．結果 好塩基球からのヒスタミン放出を誘発せず、ＳＫ００７
細胞と結合する６つの単一クローン性抗体は、会合定数
がＫａが３×１０⁸ 〜５×１０⁹ リットル／モルである
ことが確認された。 均等物 日常的実験以外にも上記の本発明の特定の実施例の様々
な均等物を使用できることは当業者には明かであろう。
そのような均等物は本発明の範囲に入る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＩｇＥのｍｂ／ｅｃセグメント（ε. ｍ
ｂ／ｅｃ）を決定する方法を説明する図である。

【図２】 ｃＤＮＡライブラリからε. ｍｂ／ｅｃを含
有しているクローンを選別するために使用されるＤＮＡ
プローブを示す図である。

【図３】 ヒトＥ鎖のＣＨ４ドメインのＣ末端と、プロ
ーブｂ及びｄの位置を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 サン，ビル・ナイ・チャウ アメリカ合衆国 77005 テキサス，ヒ ューストン，ノッチンガム・ブールバー ド 3103 (72)発明者 サン，セシリー・ルー・ユン アメリカ合衆国 77005 テキサス，ヒ ューストン，ノッチンガム・ブールバー ド 3103

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｂ細胞の膜に結合したｌｇＥに特異的に
   結合するが、可溶性ｌｇＥには結合しない抗体又はその
   抗原結合性断片。
2. 【請求項２】 ｌｇＥ鎖の膜結合領域の細胞外部分に特
   異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片。
3. 【請求項３】 前記ｌｇＥはヒトｌｇＥである請求項１
   又は２記載の抗体又はその抗原結合性断片。
4. 【請求項４】 前記抗体はモノクローナル抗体である請
   求項１ないし３記載の抗体又はその抗原結合性断片。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか１項に記載
   の抗体又はその抗原結合性断片と、細胞溶解性又は細胞
   障害性物質が結合して成る免疫毒素。
6. 【請求項６】 前記細胞溶解性又は細胞障害性物質は、
   リシン、プソイドモナス毒素、ジフテリア毒素、アメリ
   カヤマゴボウの抗ウイルス性ペプチド、トリコセシン、
   放射性核種又は膜溶解性酵素である請求項５記載の免疫
   毒素。
7. 【請求項７】 白血球試料と、請求項１ないし４のいず
   れか１項記載の抗体又はその抗原結合性断片とを接触さ
   せ、該抗体又はその抗原結合性断片したｌｇＥ担持細胞
   を検出することから成る、ｌｇＥ担持細胞の検出方法。