JPH10509948A - Ｔ細胞受容体ペプチドに対するヒト抗体およびそれらの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＴ細胞受容体ペプチドまたはコンホメーション依存決定基に結合する抗体で富化されたヒト抗体調製物が開示される。また、ヒト血漿コーン画分から、組み換え型Tcrタンパク質またはTcr可変領域ペプチドのいずれかを使用するイムノアフィニティー精製により、そのような抗体調製物を作製する方法も開示される。ヒトまたは動物の抗体混合物からのTcr抗体の精製は、組み換え型ヒトＴ細胞受容体タンパク質を使用するイムノアフィニティー手順によって実施される。アフィニティー精製された抗体は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）を使用して、完全な膜結合型Tcrに結合することができ、マイトジェン刺激後のＴ細胞増殖を阻害し得る。アフィニティー精製されたヒトポリクローナル抗体は、モノクローナルＴ細胞株上のナチュラルキラー細胞の溶解作用を阻害し得る。この抗体調製物は、種々の自己免疫関連症候群の診断、モニタリング、および治療に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞受容体ペプチドに対するヒト抗体およびそれらの調製方法 本願は1994年11月16日に出願した米国出願第08/341,157号の一部継続出願であ る。 発明の背景 １． 発明の分野 本発明は、特定のＴリンパ球に結合し得る抗体で富化された抗体調製物に関す る。より詳細には、本発明は、ヒトＴ細胞受容体の可変領域ペプチドおよびコン ホメーション依存決定基に結合する抗体で富化されたヒト抗体調製物に関する。 本発明はさらに、そのような抗体調製物を作製する特定の方法に関する。これら の抗体調製物は、自己免疫疾患および移植片対宿主病（「GVHD」）のような、免 疫系の障害を診断することに対して有用である。それらはまた、これらの疾患の 処置において、潜在的な治療価値を有する。 ２． 背景技術の説明 Ｔリンパ球（本明細書中では、Ｔ細胞ともいう）は、細胞性免疫に関与してい る。Ｔ細胞は、古典的な自己免疫疾患およびGVHDを包含する自己免疫関連症候群 のような、種々の免疫系障害と深い関係で結びついている。近年、静脈内イムノ グロブリン（「IVIG」）の高用量投薬が、広範な種々の免疫系関連疾患に深遠な 影響を有していることが観察されている。これらの疾患として、非血液学的自己 免疫疾患ならびに免疫血液学的疾患および免疫病理学的特徴を有する他の疾患が 挙げられる。慢性自己免疫疾患および急性GVHDの両方を患う患者は、IVIG処置の 養生法に反応することが見出されている。臨床的進歩は、これらの調製物中に含 まれるある種の抗体に（少なくとも部分的には）起因している。 Ｔ細胞はその表面上に、その細胞の免疫学的特異性を担うＴ細胞受容体（「Tc r」）を有する。このTcrは、CD3複合体を形成するポリペプチドと会合している 。 このTcrは、主組織適合遺伝子複合体（「MHC」）の産物である分子と会合した処 理抗原を認識する。このTcrの抗原-結合部分に対するポリペチド鎖は、α、β、 δおよびγと呼ばれる４つの異なった遺伝子座によってコードされている。所与 のＴ細胞は、α/βまたはδ/γ受容体のいずれかを発現する。大多数の末梢Ｔ細 胞のTcrは、α/β遺伝子座のポリペプチド産物から構成されている。 Tcrをコードする遺伝子は、抗体をコードする遺伝子と類似している。これら は機能的VDJまたはVJ遺伝子を生成するために、Ｔ細胞の発生の間に、組み換え 型になる多数のＶ、Ｄ、およびＪセグメントからなる。この遺伝子は、TcrのＮ- 末端の可変（Ｖ）領域をコードする。ヒトゲノムは、約100個のVα遺伝子および 50個と100個との間のVβ遺伝子を含む。 川崎病および多発性硬化症（「MS」）は、Ｔ細胞が明らかに関わる自己免疫疾 患の２つの代表例である。例えば、急性川崎病の患者は、Vβ2およびVβ8.1遺伝 子の産物を有する循環するＴ細胞の顕著に増大したレベルを示し、それは特異的 なアップレギュレーション（up-regulation）を示すものである。IVIGを使用す ると、臨床上の顕著な改善およびＴ細胞サブセットの正常に近いレベルへの回復 がもたらされる。MSを患っている患者からの血清は、ミエリン塩基性タンパク質 と反応する上昇したレベルのＴ細胞を有することが見出され、そしてこれらのＴ 細胞は、Tcr Vβ遺伝子の全プールよりもむしろ、Tcr Vβ5.2および6.1遺伝子の 産物を発現する傾向にある。 ヒトTcrペプチドは、動物抗血清を産生するための免疫源として使用されてき た。Schluter,S.F.およびMarchalonis,J.J.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，83: 1872-76(1986)。ある種の免疫系障害の診断における使用およびそのような障害 の処置における治療に使用するための、ヒトTcrペプチド配列に対するヒト抗体 に対する要望が存在する。 発明の要旨 本発明は、Ｔ細胞受容体可変領域ペプチドおよびコンホメーション依存決定基 に結合する抗体で富化されたヒト抗体調製物を提供する。また、特定のTcrペプ チドまたはコンホメーション依存決定基を有するＴリンパ球の上昇と関わる、自 己免疫疾患または状態またはGVHDの診断や処置に対して、そのような抗体調製物 を使用する方法が開示される。 本発明はさらに、これらのTcr自己抗原性可変領域エピトープへの結合特異性 を有する抗体で富化された抗体調製物を作製する方法を提供する。１つの実施態 様において、該方法は抗原-抗体結合条件下で、（ｉ）ヒトTcrペプチド配列に結 合する抗体を含むコーンヒト血漿画分および（ii）Tcrペプチドが固定化された 固体支持体を一緒にする工程；固体支持体から未結合タンパク質を分離する工程 ；そして、抗体-抗原結合を破壊する条件下で、固体支持体から結合抗体を溶出 し、それによって、ヒトTcrペプチド配列に結合する抗体で富化された抗体調製 物を形成する工程を包含する。別の実施態様において、本方法は、抗原-抗体結 合条件下で、（ｉ）ヒトTcrペプチドまたはコンホメーション依存決定基に結合 する抗体を含む、ヒトまたは動物の抗体混合物、および（ii）組み換え型型ヒト Tcrタンパク質が固定化されている固体支持体を一緒にする工程；固体支持体か ら未結合タンパク質を分離する工程；そして、抗体-抗原結合を破壊する条件下 で、固体支持体から結合抗体を溶出し、それによって、ヒトTcrペプチドまたは コンホメーション依存決定基に結合する抗体で富化された抗体調製物を作成する 工程を包含する。 本発明の新規な抗体調製物は、自己免疫疾患やGVHDのような、ヒト免疫系障害 の経過を診断またはモニターすることにおいて有用性を有する。これらの抗体調 製物は、さらにヒト治療薬剤としての価値を有する。本明細書中で報告された研 究の結果として、IVIG調製物は、Ｔリンパ球の表面上のTcrタンパク質に結合す る自己抗体を含むために、免疫障害を処置するのに効果的であると信じられてい る。本発明の抗体調製物は、より強力かつ選択的な治療薬剤を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、抗体を含まない試薬で処置された、Jurkat細胞の蛍光標示式細胞分取 器（FACS）のスキャンである(ネガティブコントロール)。 図２は、ウサギ抗-scTcr抗血清で処置された、Jurkat細胞のFACSスキャンであ る(ポジティブコントロール)。 図３は、未精製IVIGで処置された、Jurkat細胞のFACSスキャンである。 図４は、固定化scTcrを使用したイムノアフィニティークロマトグラフィーに よって精製されたIVIGで処置された、Jurkat細胞のFACSスキャンである。 図５は、コーン画分I＋IIIとscTcrおよび種々のTcrペプチドとの反応性を示す ELISAの結果を示す。 図６は、慢性関節リウマチの患者由来の血清とscTcrとの反応性を示すELISAの 結果を示す。 図７は、SLEの患者由来の血清とscTcrとの反応性を示すELISAの結果を示す。 図８は、精製された抗β3抗体および市販の静脈内免疫グロブリン（IVIG）の 濃度増加による阻害効果(阻害パーセントとして示す)を比較する細胞増殖アッセ イの結果を示すグラフである。 図９は、TcRとの相互作用を介したＴ細胞活性の調節における、精製抗体の影 響を検討する実験についての実験計画の概観図である。 図10は、市販の静脈内免疫グロブリン（IVIG）から精製された抗TcR抗体によ る、腫瘍標的のリンパ球殺傷阻害を示すグラフである。 詳細な説明 本発明の新規な抗体調製物は、所望の反応性を有する抗体を含むヒト抗体混合 物から、好都合に調製される。健康なヒト、ならびに全身性エリテマトーデスや 慢性関節リウマチのような自己免疫疾患や状態、およびGVHDのような自己免疫関 連症候群を患うヒトは、Tcrタンパク質中に存在するペプチドおよびコンホメー ション依存決定基に対する自己抗体を含む。Marchalonisら、Proc. Natl. Acad. Sci.，89:3325-3329（1992）およびMarchalonisら、Gerontology，39:65-79（1 993）を参照のこと。従って、健康な個体または自己免疫疾患を患っている個体 由来のプールされた血清が、本発明の抗体調製物のための供給源として使用され 得る。商業的に入手可能な血漿製品または画分がまた、これらの抗体調製物のた めの供給源として好都合に使用され得る。例えば、免疫血清グロブリン製品およ VIG調製物、およびSandoz Pharmaceuticalsから入手可能な、Sandoglobulinが週 発物質として使用され得る。種々のコーン血漿画分（Cohnら、J. Am. Chem. Soc . ，68:459（1946））は、Tcrペプチド配列に対する自己抗体を含むことが見出さ れた。現在廃棄されているコーン画分IおよびIII、ならびにコーン画分IIは、本 発明の抗体調製物の生産のための出発物質として使用され得る。 この新規な抗体調製物は、固定化されたTcrペプチドまたは組み換え型型ヒトT crタンパク質を使用したイムノアフィニティー精製によって便利に得られる。後 者は、ペプチドとコンホメーション依存決定基の両方によって抗体に結合する能 力のために好まれ得る。Tcrペプチドは、周知の従来法を使用して、アガロース ビーズのような従来の固体支持体に、それらを結合することによって固定化され る。Marchalonisら、1992、前掲参照。このTcr抗原結合領域の配列に対応する種 々のペプチドは、イムノアフィニティー精製手順において使用され得る。これら のペプチドは、好ましくは、Vαおよび／またはVβ遺伝子によってコードされる が、Ｖδおよび／またはＶγ遺伝子によってもまたコードされ得る。選択された Tcrペプチドは、IgGおよびIgM自己抗体の産生によって明白なように、自己抗原 性であることが見出されたTcrの領域を示す。Marchalonisら、1992、前掲。組み 換え型Tcrタンパク質は、これらの配列を含む。Lakeら、Biochem ．Biophys．Res ．Comm. ，201(301): 1502-109（1994）。 抗体精製用に使用されたTcrペプチドは、従来のペプチド合成技術を用いて化 学的に合成され得る。組み換え型ヒトTcrタンパク質は、種々の組み換えDNA手順 、例えば、市販されているＴ細胞株由来、あるいは正常な血液または自己免疫疾 患を患う患者由来の血液を培養して得たＴ細胞から得られたメッセンジャーRNA を使用するcDNAクローニング技術によって作成され得る。Vα、Vβ、Ｖδおよび Ｖγ座由来の遺伝子が、配列決定された（Toyonaga，B．およびMak，T.W.，Ann ．Rev．Immunol. ，5，585-620(1987)）、これらの配列は、cDNAクローンを増幅 および同定するためのPCRプライマーおよびプローブを設計するために利用され 得る。 上記したように、特定の自己免疫疾患が、特異的Tcr遺伝子の産物を保有する 循環するＴ細胞のレベルの上昇に関連している。本明細書中で用いられたように 、Tcrタンパク質、ペプチド、またはコンホメーション依存決定基は、そのコン ホ メーション依存決定基を保有するＴ細胞が、その障害や状態を有する患者におい て上昇した場合に、特定の免疫系障害や状態に関連していると言われる。従って 、Vβ2およびVβ8.1遺伝子の産物を保有するＴ細胞は、これらのＴ細胞がその疾 患を有する患者において上昇するため、川崎病に関連していると言われる。同様 に、Vβ5.2およびVβ6.1遺伝子産物を保有するＴ細胞は、MSと関連している。免 疫系障害に関連したTcr可変領域の分析は、急速なペースで進歩している。 特定の疾患に関与したTcr可変領域遺伝子の同定に際して、これらの配列を含 むタンパク質が、発表された配列情報を用いるcDNAクローニング手順によって生 産され得る。所望のTcrペプチドやコンホメーション依存決定基に結合する抗体 で富化された抗体調製物は、次いで、本明細書中に記述されたイムノアフィニテ ィー手順によって調製され得る。 １つの局面において、本発明の方法は、IVIG由来、ならびにコーン画分Ｉおよ びIII由来、ならびにコーン画分II由来の抗体をイムノアフィニティー精製する ために、組み換え型単鎖Tcrタンパク質（scTcr）を使用する。このscTcrの構築 は、JurkatＴ細胞株の完全なVαおよびVβ領域に基礎とした。このJurkat細胞株 とは、ヒトモノクローナルCD4⁺、ヘルパーα/β⁺白血病Ｔ細胞株であり、それは 、受託番号 ATCC 152-T1B のもとに、American Type Culture Collection，Rock ville，Maryland，USAから入手し得る。このscTcr分子は、リンカーペプチドに よって連結されたVαおよびVβ遺伝子産物を含む。cDNAクローニング技術を使用 したJurkatＴ細胞株由来のscTcrの構築は、本明細書中で参考として援用した、L akeら、1994、前掲に記載されている。Lakeらの刊行物は、プラスミドPET21dで 形質転換された、E.coli BL21(DE3)株由来のscTcrペプチドの発現について記載 している。 組み換え型ヒトTcrタンパク質もまた、ヒトTcrまたはコンホメーション依存決 定基に結合する抗体で富化された動物抗血清を調製するために使用され得る。動 物抗血清は、動物を、Tcrペプチド、組み換え型ヒトTcrタンパク質、またはヒト Ｔ細胞で、免疫することによって調製され得る。このようにして産生された動物 抗体調製物は、診断薬剤としての有用性を有する。 本発明の新規な精製抗体は、任意のアイソタイプの抗体であり得、そして、コ ーン画分IおよびIIIから精製されたものは、主としてIgGまたはIgMアイソタイプ のいずれかである。 本発明の抗体調製物は、自己免疫疾患およびGVHDを含む、免疫系障害または状 態の経過を診断またはモニターするために使用され得る。この新規な抗体調製物 は、それらがヒト被験体から得たＴリンパ球に結合する程度を測定することによ って、診断に使用される。種々の免疫化学的検出技術が、その抗体およびＴリン パ球の相互作用を検出するために使用され得る。例えば、ELISAおよび蛍光標示 式細胞分取器（「FACS」）を使用するフローサイトメトリー、ならびに他の従来 の免疫化学的手順が、抗体-Ｔ細胞相互作用の検出に使用され得る。 免疫系の障害や状態の診断に対するそれらの有用性に加えて、本発明の抗体調 製物は潜在的な治療価値を有する。上記したように、市販の入手可能な免疫血清 グロブリン調製物が、自己免疫疾患およびGVHDを処置するために使用され得るこ とが公知である。本発明に従い、これらの免疫グロブリン調製物が、Tcrペプチ ド配列およびコンホメーション依存決定基に対する抗体を含むことが示されてい る。本発明の抗体調製物は、Tcrペプチドおよびコンホメーション依存決定基に 対する抗体で、未処理のIVIG中のレベルの約1,000倍まで強化されている。GVHD および自己免疫疾患の処置に使用されるIVIGの用量は、100mg〜5g IVIG/kg体重 の範囲である。インビトロおよびインビボの研究(マウスモデル)に基づくと、ア フィニティー精製された抗体の有効治療用量は、約0.1mg〜約100mg/kg体重の範 囲内である。このような用量が、任意の適切な方法により投与され得、静脈内投 与が好ましい。これらの抗体調製物は、これらの疾患の処置において、現在入手 可能なIVIG調製物を超えて、多数の利点を有すると期待される。これらの利点は 、本発明の抗体調製物の高い潜在的能力、およびより大きな選択性から生じる。 したがって、より低用量そしてそれゆえ、患者へのタンパク質のより低い負荷を 実現することが可能である。 本発明は、さらに下記実施例にて説明されるが、これらに限定されるものでは ない。 実施例 Ｉ コーン画分IおよびIIIからの抗体の精製 コーン画分IおよびIIIは、Hyland Division of Baxter Healthcare Internati onal，Duarte，California，U.S.A．から入手した。この血漿画分を遠心分離し 、透析し、次いで0.45μmのフィルターを通して、不溶性セライトおよび微粒子 を除去した。得られた溶液を、本質的にはMarchalonis ら、1992、前掲に記載さ れるよう、イムノアフィニティー精製に供した。イムノアフィニティーカラムは 下記のようにして調製した： BL21(DE3)E.coli細胞をNovagenから購入した。組み換え型scTcr遺伝子を含む 、PET21dプラスミドを、このE.coliから組み換え型scTcrタンパク質を生産する ように、BL21(DE3)E.coliを形質転換した。該組み換え型タンパク質(1.1ミリグ ラム)を10mlの0.1M炭酸ナトリウム(pH8.0)に溶解し、そして0.75gの活性化CHセ ファロース-4B(Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ，U.S.A.)とともに 、室温にて２時間、インキュベートした。次いで、このセファロースを40mlのリ ン酸緩衝化生理食塩水(50mM NaCl/150mMリン酸ナトリウム、pH8.0)で洗浄し、40 mMの1Mエタノールアミン(pH8.0)で1時間処理して、未反応の部位をブロックし、 100mlのTBSで洗浄しそして10cm×1cmのカラムに充填した。 非特異的(Sticky)抗体を除去するために、全試料をまず、オボアルブミンを固 定化したCHセファロースを充填したカラムに、1.2ml/分以下の流速でアプライし た。オボアルブミンカラムは、予めTBSで平衡化した。オボアルブミンカラムか らの溶出物を、直接イムノアフィニティーカラム(これも予めTBSで平衡化した) にアプライした。10ベッド容量のTBSで洗浄後、結合抗体を150mMグリシン−塩酸 、pH2.0で溶出し、2mlの画分で分取し、そして直ちに、3M-トリス-NaOHを使用し て、pH9.0に中和した。 実施例 II フローサイトメトリー ATCCから入手したJurkat細胞を、抗Tcr抗体の細胞表面結合を証明するために 使用した。5%胎児ウシ血清を補充したRPMI 1640培地で、37℃、95%空気−5%炭酸 ガス雰囲気中で、細胞を培養した。細胞を対数増殖期に収穫し、そして遠心によ って培養上清から分離した。細胞(1×10⁶個)をリン酸緩衝化生理食塩水（「PB are Internationalから入手可能なIVIG調製物から得た、10μg/mlのアフィニテ ィー精製抗体、0.5mlと一緒にした。この抗体は実施例Iの手順によって精製され た。等しい数の細胞を、scTcrで免疫されたウサギ由来の血清の1:2000希釈の血 清、0.5mlで処理した(ポジティブコントロール)。緩衝液（抗体なし）でのみ処 理した細胞をネガティブコントロールとして使用した。 一次抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（「FITC」）を結合した1:50 00希釈のヤギ（Fab'）₂抗ヒトIgG（2°抗体)と、氷上で1時間、インキュベショ ンすることにより検出した。細胞をPBSで洗浄して、2°抗体を除き、Becton Dic kinson FACスキャンフローサイトメーターで分析した。 その結果を図１〜４に示す。図１はネガティブコントロールに対する機器から のアウトプットを表し、4.39％ポジティブの反応性を示す。図２はポジティブコ ントロールを表し、95.44％ポジティブの反応性を示す。図３および４は、それ ぞれ未精製IVIGおよびイムノアフィニティー精製されたIVIGを示す。未精製抗体 混合物は、3.43％ポジティブの反応性を有し、精製抗体調製物は、91.47％ポジ ティブの反応性を有していた。 実施例 III コーン画分IおよびIII中のアフィニティー精製抗体と、上記の種々のヒトTcr ペプチドおよび組み換え型Jurkat scTcrとの反応性を、以下のよう、ELISAによ って分析した：ヘキサデカペプチド抗原β3、β8、およびβ17は、それぞれ、YT 35(JurkatＴ細胞ミエローマ細胞株)β鎖の、第1の相補性決定領域、第３のフレ ームワーク部、および定常領域に対応する。ペプチド抗原またはこのscTcrを0.2 M炭酸緩衝液、pH9.6に溶解した。これらの溶液(100μg/ml)をマイクロタイター プレートのウェル中に添加し、37℃で一夜、乾燥した。ウェルを0.005％Tween20 を含むリン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4（PBST）および1％ゼラチン(w/v)でブロ ックした。コーン画分I＋IIIをこの抗原と１時間反応させ、次いでPBSTで４回洗 浄した。ヒトIgMまたはIgGに対するペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体を、抗-IgM に対しては1:1000、そして抗-IgGに対しては2:4000の希釈で、発色試薬として使 用した。結合物インキュベーションはまた、1時間であった。PBSTでの５回の洗 浄の後、0.1Mクエン酸緩衝液、pH4.0および0.01%過酸化水素（v/v）中の0.03%基 質（2,2-アジノ-ビス-(3-エチルベンズチオアゾリン-6-スルホン酸)を添加した 。室温で60分間インキュベーシヨン後、Titertek Multiscan(Flow Labs)を用い て、405nmの発色強度を測定した。その結果を図５に示す。免疫反応性は、β3ペ プチドが最も大きく、次いで、scTcr、β8およびβ17の順に大きかった。β3お よびβ8ペプチドは、scTcrに含まれていたが、β17は含まれていなかった。 実施例 IV 慢性関節リウマチ（「RA」）の患者４名および全身性エリテマトーデス（「SL E」）の患者８名から得た血清中の抗体との反応性を、実質的に実施例IIIに記載 の手順を使用してELISAによって分析した。それらの結果を図６および７にそれ ぞれ示す。組み換え型scTcrとの有意な反応性が、これらの患者の血清中に観察 された。 実施例 Ｖ ヒトTcrタンパク質、ペプチド、またはコンホメーション依存決定基に結合す る抗体を、実施例Ｉと同様に、しかし市販の静脈内免疫グロブリン（IVIG、Gam 定領域に対応するペプチドβ3が、CHセファロースに固定化されているカラムク ロマトグラフィーを使用して、アフィニティー精製した。溶出の後、この抗体を 直ちにNaOH-グリシンで中和した。次いで、この抗体を植物性赤血球凝集素（PHA ）で刺激したＴ細胞増殖の阻害に使用した。このＴ細胞増殖アッセイは、標準的 なアッセイであり、本質的にはCurrent Protocols in Immunology（Coligan，J. E.ら、19940 Series Ed．Richard Coico）第I巻,7.10節（John Wiley and Sons ，Inc.）に従い、以下のようにして実施した。連続した抗体希釈物を、37℃で、 96穴のマイクロタイタープレート中、10⁵細胞/ウェルの濃度で、正常な末梢血リ ンパ球（PBL）とともに、30分間プレインキュベートした。5μgのPHAをPBL-抗体 混合物へ添加し、細胞を37℃で、72時間、培養した。採取の16時間前に、各ウェ ルに1マイクロキュリーのトリチウム化チミジンを添加した。72時間のインキュ ベーション終了時に、セルハーベスターで細胞核を集め、液体シンチレーション カウンターで計数した。抗Tcr抗体による阻害パーセントを次の式によって計算 した： １−〔（試料−バックグラウンド）／（増殖最大値−バックグラウンド）〕× 100％ その結果を図8に示す。未処理のIVIGは、定義した実験条件下では、2500μg/m lまでは非特異的バックグランド阻害のみを示したけれども、アフィニティー精 製された抗体−誘導阻害は、抗体濃度が3.1〜25.0μg/mlまで増加するに従い、8 7%まで、確実に増加した。これらのデータは、Ｔ細胞活性とともに抗体が、市販 のIVIGから特異的に精製され得ることを示す。 実施例 VI Ｔ細胞活性の調節における、アフィニティー精製された抗体の可能な効果を、 C57/BLマウスを使った 「原理の証明(proof of Principle)」モデルで、Tcrとの 相互作用を通して検討した。この実験の概要を図９に示す。充分に発達した、随 伴性腫瘍免疫のスポンジモデルを使用した。随伴性腫瘍免疫(concomitant tumor immunity)の概念は、Gorelik，E，Adv．Cancer Res．39:71(1983)において、概 説されており、使用したゼラチンスポンジモデルの全詳細は、Akporiaye，E.T. ら、Cancer Res．58:1153(1988)およびAkporiaye，E．T.およびK．Muthulakshmi ，Cancer Immunol．Immunother．29:199(1989)に記載されている。このモデルで は、一次的なEMT6乳癌を有する動物に、前移植されたセラチンスポンジを通して 、二次的な腫瘍移植片をチャレンジする。随伴性腫瘍免疫が現れている間、二次 的な腫瘍は拒絶され、そしてエフェクター細胞がスポンジから回収され、そして それらの腫瘍破壊活性が、インビトロで検討された。これらの細胞毒性腫瘍拒絶 Ｔ細胞（TRL）は、優先的にVβ1およびVβ8のTcrを発現する。この実験の目的 は、単離されたTRLの腫瘍破壊活性をインビトロで調節するために、IVIGからア フィニティー精製された、抗Vβ1および抗Vβ8抗体の効果を試験することであっ た。 C57/BLマウスに、Balb/cマウス乳房由来のEMT6腫瘍細胞を０目に注入した。８ 日目に、このマウスに、ゼラチンスポンジを外科的に移植しそして治癒のために 切開を行った。10日目に、新鮮なEMT6細胞をゼラチンスポンジに注入した。17日 目に、このスポンジを除去し、ゼラチン分解酵素で消化し、腫瘍細胞を拒絶する ために浸潤したTRLを回収した。 ヒトTcrタンパク質、ペプチド、またはコンホメーション依存決定基に結合す る抗体を、ペプチドを固定化したCHセファロースを有するカラムクロマトグラフ ドは、Balb/cマウスVβ1(EQHLGHNAMY)およびVβ8(NQTNNHNNMY)Tcr鎖のCDR1領域 に対応していた。この精製手順は、実施例１の記載に従った。アフィニティー精 製された抗体の最終調製物をPBSで十分に透析した。 別々な精製工程において、各ペプチドを使用して調製されたアフィニティー精 製抗体およびカラムを通り抜けたIVIGをインビトロクロム放出アッセイで評価し た。クロム放出アッセイは、以下の改変を伴い、本質的には、Akporiaye，E.T. およびK．Muthulakshni，Cancer Immunol．Immunother．29:199(1989)の記載に 従って実施した。先に得られた50μlのTRL（1.5×10⁵細胞/ウエル）を、96穴の ウェル培養プレートの適当なウェルに添加した。次いで、50μlのアリコート（3 0μg抗体/ウエル）を添加し、このプレートを37℃で８時間インキュベートした 。細胞溶解の程度を、ガンマカウンターを使用して、上清中に放出されたクロム の量を測定することにより決定した。 図10は、抗Vβ1および抗Vβ8が、非依存的にＴ細胞活性をそれぞれ、80％およ び50%阻害することを示す。一緒に添加すると、それらは90%に近い阻害をもたら した。コントロールであるカラムフロースルーは、阻害を示さなかった。これら のデータは、特異的な反応性を有する抗体が、Ｔ細胞受容体の反応性と調節を介 して、細胞毒性Ｔ細胞の溶解活性を阻害し得るすることを示した。さらに、これ らのデータは、原理の証明として、ある種の自己免疫障害の処置における究極的 臨床効果についての仮説が有効であることを明らかに示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/564 33/564 Ｂ Ｚ (72)発明者 ランドスパージャー， ウィリアム ジェ イ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92667, オレンジ，エヌ． ハート ストリート 967 (72)発明者 マーチャロニス， ジョン ジェイ. アメリカ合衆国 アリゾナ 85718， ツ ーソン， エヌ．カミノ オーツロ 5061 (72)発明者 レーク， ダグラス エフ. アメリカ合衆国 アリゾナ 85719， ツ ーソン， イー．シルバー 1406

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 組み換え型ヒトTcrタンパク質に結合する抗体で富化されるヒト抗体調製 物。 ２． Vα遺伝子によってコードされた組み換え型ヒトTcrタンパク質に結合する 抗体、またはVβ遺伝子によってコードされた組み換え型ヒトTcrタンパク質に結 合する抗体で富化される、請求項１に記載のヒト抗体調製物。 ３． Ｖδ遺伝子によってコードされた組み換え型ヒトTcrタンパク質に結合す る抗体、またはVγ遺伝子によってコードされた組み換え型ヒトTcrタンパク質に 結合する抗体で富化される、請求項１に記載のヒト抗体調製物。 ４． 自己免疫疾患または状態と関連するTcrペプチドまたはコンホメーション 依存決定基に対する抗体で強化される、請求項１に記載のヒト抗体調製物。 ５． 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、川崎病、 または慢性関節リウマチである、請求項４に記載のヒト抗体調製物。 ６． 移植片対宿主病（GVHD）と関連する、Tcrペプチドまたはコンホメーショ ン依存決定基に対する抗体で富化される、請求項１に記載の抗体調製物。 ７． JurkatＴ細胞株、ATCC番号152-TIBのVαおよびVβペプチド配列に結合す る抗体で富化される、請求項１に記載の抗体調製物。 ８． ヒトＴ細胞のVαおよびVβ遺伝子配列に由来する単鎖Tcrタンパク質に結 合する抗体で富化される、請求項１に記載の抗体調製物。 ９． ヒトTcrペプチド配列に結合する抗体で富化される抗体調製物を作成する 方法であって、以下 （ａ）抗体−抗原結合条件下で、（ｉ）ヒトTcrペプチドまたはコンホメーシ ョン依存決定基に結合する抗体を含有するヒト血漿コーン画分、および（ii）Tc rペプチドが固定化された固体支持体を一緒にする工程； （ｂ）該固体支持体から非結合タンパク質を分離する工程； （ｃ）抗体−抗原結合を破壊する条件下で、固体支持体から結合抗体を溶出し 、それによって、ヒトTcrペプチド配列またはコンホメーション依存決定基に結 合する抗体で富化された抗体調製物を形成する工程、 を包含する、方法。 １０． 工程（ａ）において使用するヒト血漿コーン画分が、コーン画分Ｉまた はIIIである、請求項９に記載の方法。 １１． 工程（ａ）において使用するヒト血漿コーン画分が、コーン画分Ｉおよ びIIIである、請求項９に記載の方法。 １２． 工程（ａ）において使用するヒト血漿コーン画分が、コーン画分IIであ る、請求項９に記載の方法。 １３． ヒトTcrペプチドまたはコンホメーション依存決定基に結合する抗体で 富化される抗体調製物を作成する方法であって、以下 （ａ）抗体−抗原結合条件下で、（ｉ）ヒトTcrペプチドまたはコンホメーシ ョン依存決定基に結合する抗体を含む抗体混合物および（ii）組み換え型ヒトTc rタンパク質が固定化された固体支持体を一緒にする工程； （ｂ）該固体支持体から非結合タンパク質を分離する工程； （ｃ）抗体−抗原結合を破壊する条件下で、固体支持体から結合抗体を溶出し 、それによって、ヒトTcrペプチドまたはコンホメーション依存決定基に結合す る抗体で富化される抗体調製物を形成する工程、 を包含する、方法。 １４． 工程（ａ）において使用する抗体混合物がヒト抗体混合物である、請求 項１３に記載の方法。 １５． 工程（ａ）において使用する抗体混合物が動物抗体混合物である、請求 項１３に記載の方法。 １６． 前記抗体混合物がヒト血漿コーン画分である、請求項１４に記載の方法 。 １７． 前記抗体混合物がヒトコーン画分ＩおよびIIIである、請求項１６に記 載の方法。 １８． 前記抗体混合物がコーン画分IIである、請求項１６に記載の方法。 １９． 工程（ａ）において使用する抗体混合物がヒトIVIG調製物である、請求 項１４に記載の方法。 ２０． 抗体（ａ）において使用する固定化された組み換え型ヒトTcrタンパク 質が、Vα、Vβ、Vδ、またはVγ遺伝子の領域によってコードされたタンパク質 である、請求項１３に記載の方法。 ２１． 組み換え型ヒトTcrタンパク質が、ヒトＴ細胞のVαおよびVβ遺伝子配 列に由来する単鎖Tcrタンパク質である、請求項２０に記載の方法。 ２２． 自己免疫疾患または状態またはGVHDを有するヒトを診断する方法であっ て、以下 （ａ）該自己免疫疾患または状態またはGVHDを有するヒトにおいて上昇したTc rペプチドまたはコンホメーション依存決定基を同定する工程； （ｂ）該ヒト由来のＴリンパ球と、該Tcrペプチドまたはコンホメーション依 存決定基に結合する抗体で富化されるヒト抗体調製物とを一緒にする工程； （ｃ）該抗体調製物中の抗体が該Ｔリンパ球に結合する程度を測定する工程、 を包含する、工程。 ２３． 自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、川崎病、ま たは慢性関節リウマチである、請求項２２に記載の方法。 ２４． Tcrタンパク質またはコンホメーション依存決定基が、VαまたはVδ遺 伝子の領域によってコードされる、請求項２２に記載の方法。 ２５． Tcrペプチドまたはコンホメーション依存決定基が、Vβまたはγ遺伝子 の領域によってコードされる、請求項２２に記載の方法。 ２６． 工程（ｃ）が、ELISA手順の手段によって行われる、請求項２２に記載 の方法。 ２７． 工程（ｃ）が、蛍光フローサイトメトリーによって行われる請求項２２ に記載の方法。 ２８． 自己免疫疾患または状態または移植片対宿主病を患う患者を処置する方 法であって、該自己免疫疾患またはGVHDを有する患者中で上昇したレベルの循環 Ｔ細胞に存在する、Tcrペプチドまたはコンホメーション依存決定基に結合する 抗体で富化される、ヒト抗体調製物を患者に投与する工程を包含し、ここで該調 製物が、該ペプチドまたはコンホメーション依存決定基に結合するのに充分な量 の抗体を含む、方法。 ２９． 前記抗体が約0.1〜約100mg体重の用量範囲で投与される、請求項２８に 記載の方法。 ３０． 前記抗体調製物が、Vα遺伝子によってコードされた組み換え型ヒトTcr タンパク質に結合する抗体、またはVβ遺伝子によってコードされた組み換え型 ヒトTcrタンパク質に結合する抗体で富化される、請求項２８に記載の方法。 ３１． 前記抗体調製物が、Vδ遺伝子によってコードされた組み換え型ヒトTcr タンパク質に結合する抗体、またはVγ遺伝子によってコードされた組み換え型 ヒトTcrタンパク質に結合する抗体で富化される、請求項２８に記載の方法。 ３２． 前記疾患が自己免疫疾患である、請求項２８に記載の方法。 ３３． 前記自己免疫疾患が、川崎病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、また は全身性エリテマトーデスを包含する、請求項３０に記載の方法。 ３４． 前記疾患がGVHDである、請求項２８に記載の方法。