KR19990036440A - 알러젠-ｘｃｄ３２융합 단백질 - Google Patents

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한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 항원 및 사람 Fcγ 수용체 II (FcγRII, CD32)와 상호작용하는 하나 이상의 부분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

알러젠-ＸＣＤ３２융합 단백질
본 발명은 사람 IgG와 항원/알러젠 (또는 항원/알러젠의 결합물)과의 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 항CD32 분자와 항원/알러젠 (또는 항원/알러젠의 결합물)과의 융합 단백질에 관한 것이다. 본 명세서에서 알러젠은 아토피성 환자가 알러지 반응을 나타내는 항원으로 정의된다. 본 명세서에 사용되는 것과 같은 항원은 다양한 기원의 것, 예를 들어 환경적 알러젠 (예를 들어 집먼지 진드기, 자작나무 화분, 잔디 화분, 고양이 항원, 바퀴벌레 항원), 또는 식품 알러젠 (예를 들어 우유, 땅콩, 새우, 대두), 또는 둘 모두의 배합물, 또는 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 관련성이 없는 항원일 수 있다.
알러지는 IgE 항체가 이펙터 (effector) 세포 (마스트 (mast) 세포, 호염기구, 호산구)의 활성화를 매개하는 동시에 IgE에 대한 저친화성 및 고친화성 수용체 (B 세포, 단핵구, 수상돌기 세포)를 통한 항원 제시를 또한 증강시키는 질환이다. IgE의 이러한 작용에 대해 이펙터 세포 및 유도 세포 모두에 존재하는 CD32 (FcγRII)와 상호작용하는 특이적인 IgG 항체가 반대로 작용할 수 있다. 따라서, 알러지는 Th1 세포 대 Th2 세포가 불균형인 질환으로 간주되어야 한다. 생체 내에서 IgG 항체의 IgE에 대한 반대작용의 성공 여부는 특정 IgE의 특정 IgG에 대한 상대농도 및 또한 IgG의 이소타입에 의존적이다. 사람의 모든 이소타입은 CD32에 대하여 저친화성을 갖는데, 이는 알러젠과의 복합체 형성으로 극복될 수 있지만, 많은 알러젠은 CD32와 안정하게 결합하게 하는 IgG 분자와의 복합체를 충분히 많이 형성하지 않는다.
오늘날 알러젠을 사용하는 두 가지 형태의 능동적 백신접종이 사용된다. 가장 일반적인 것은 비교적 고농도의 알러젠을 사용하여 상습적으로 면역화하는, 이른바 "면역 요법"이다. 이 기술은 벌침에 대한 알러지와 같은 소수의 알러지성 질환 및 비염과 결막염의 몇몇 경우에 단지 적당히 효과적이며 최근에 천식 및 아토피성 피부염에 효과적이라는 것이 일부에서 보고되었다. 고전적으로는 알러젠을 투여하기 위하여 피하 루트를 사용하지만, 최근에 경구 투여 또는 심지어 국부 투여와 이 루트를 비교했을 때 일반적으로 상기 루트에서의 결과가 양성이지만 항상 일관된 것은 아니었다. 더 최근의 면역 요법에 대한 접근 방법, 이른바 세인트-레미 (Saint-Remy) 기술 (유럽 특허 출원 제0 178 085호 및 제0 287 361호 참조)에서는 생체 외에서 관련 알러젠과 복합시킨 자가 IgG 항체를 사용한다. 이 접근 방법은 부작용이 더 적은 알러젠을 훨씬 소량으로 사용하게 한다.
둘 모두의 요법에서의 메카니즘은 명백하지 않다. 종래의 접근 방법에서 특정 IgG의 현저한 증가가 모두 면역 요법의 성공과 상호관계가 있는 것은 아니라 해도, 상기 요법이 특정 IgG 항체의 증가를 유도한다면 유익한 효과가 있는 것처럼 보인다. 이에 대한 가능한 이유는 B 세포, 단핵구 및 마스트 세포상의 CD32에 대하여 IgG 항체가 비교적 저친화성을 갖기 때문이다. 세인트-레미 접근 방법에서는 환자로부터 특정 IgG 항체를 선발한 후, 이를 생체 외에서 관련 알러젠과 혼합시킨다. 그들은 이런 방식으로 알러젠이 세포 또는 세포상의 다른 항체 이소타입, 예를 들어 마스트 세포상의 IgE와 자유롭게 반응할 수 없음을 확신하였다. 또한 실험 데이터로 확인되지는 않았지만 아마도 항이디오타입 항체는 특정 IgG 분자에 대하여 생성된 후 알러지를 예방할 것이다.
IgG 분자는 B 세포 외의 단핵구에 대한 면역 응답을 일으키는 데 중요하다. 따라서 세인트-레미 접근 방법은 제공자 특이적인 알러젠 특이 IgG 대신 일반적인 알러젠 특이 IgG를 사용할 때 작용하여야 한다. 그러나, B 세포를 포함한 거의 모든 항원 제시 세포에 쉽게 결합하여 알러지를 유포시키고 Th2 세포를 유도하는 IgE와는 반대로 사람 IgG 항체는 이 항체의 B 세포상의 Fcγ 수용체에 대하여 저친화성을 갖는다는 것이 세인트-레미 접근 방법의 문제점이다. 복합체를 사용하려면 단일 IgG 분자와 비교했을 때 상기 복합체의 친화성이 증강되어 저친화성 문제를 우회하여야 하지만, 다시 복합체 형태의 알러젠/IgG의 결합물은 바람직하지 못한데, 이는 사람 IgG 분자와 결합하는 알러젠의 에피토프 (epitope)의 본래 수가 다섯 개 미만으로 너무 적어 수용체에 대한 복합체의 친화성을 증강시킬 수 없기 때문이다.
본 발명에 의해 종래의 면역 요법에서의 위험 인자가 감소되며 특정 IgG 분자를 단리시킬 때 발생하는 문제점 및 CD32에 대한 상기 IgG 항체의 저친화성이 극복된다.
마스트 세포 및 호염기구에 결합된 IgE는 항원과 교차결합되었을 때 히스타민 방출을 유도한다. 또한 IgE는 사람 B 세포에 의한 항원 제시를 증강시킬 수 있다 (도 1). 그렇지 않은 IgE가 없는 경우 B 세포는 특정 항원 수용체를 갖는 매우 적은 수의 일부를 제외하고는 열등한 항원 제시 세포이다. 항원 흡수 (uptake)는 식작용 (pinocytosis)을 통하여 일어날 수 있지만 이는 고농도의 항원 및(또는) 장시간의 인큐베이션을 요한다.
5일에 걸친 알러젠의 식작용은 IgE 매개 항원 제시는 모방할 수 있지만 IgG 매개 항원 제시는 T 세포를 자극하지 않는다는 것이 도 2에 예시되어 있다. 사실상 이 데이터는 알러젠을 IgG와 복합시키면 알러젠의 제시가 방해된다는 것을 나타낸다.
IgE 매개 항원 제시 또는 식작용을 통한 알러젠 흡수에 대한 상기 IgG-알러젠 복합체의 영향이 다른 일련의 실험들에서 연구되었다. IgG 복합체는 IgE 매개 항원 제시를 분량에 의존적인 방식으로 억제하며 또한 식작용 후의 항원 제시를 억제한다는 것이 도 3에 예시되어 있다. 이러한 효과는 항원에 특이적인 것이 아니고 (IgG/BSA 복합체는 Der P1에 특이적인 자극을 억제함) 단량체 형태의 (비복합) IgG는 항원 제시를 억제하지 않는다.
IgG/알러젠 복합체의 독성은 도 4에 나타낸 실험에서 제외된다. 사람 단핵구로 (예비)인큐베이션시킨 IgG3-Der P1 복합체는 정상적인 T 세포 응답을 유도할 수 있다. 이는 IgG/알러젠 복합체가 B 세포에 의한 알러젠 제시를 억제하는 동시에 단핵구 및 수상돌기 세포를 자극함을 의미한다. 자극이 행해질 웰의 바닥에 코팅되어 있는 aCD32 항체 또는 집합 IgG도 또한 B 세포에 의한 항원 제시를 유사하게 억제한다 (도 5). CD32를 표적으로 하는 분자가 항원 제시를 억제하는 효율은 CD32 분자의 교차결합의 양에 가장 의존적인 것 같다. 그러나, 천연 IgG/항원 복합체로서 (도 2) 또는 본 발명에 따른 aCD32/항원 융합 단백질로서 (도 13a 및 13b) B 세포상의 CD32로 항원을 표적화하면 이들 복합체에서의 항원이 제시되지 않는다. 반면 단핵구로 표적화된 상기와 동일한 복합체는 항원 특이 T 세포 응답을 유도한다 (도 4, 13a 및 13b). 이러한 현상은 B 세포상에는 CD32B가 존재하는 반면 단핵구 및 또한 수상돌기 세포는 CD32A를 발현하는 것으로 설명될 수 있다. 따라서 IgG/항원 복합체 및 aCD32/항원 융합 단백질은 단핵구 및 수상돌기 세포 계통의 세포에 대한 면역 응답을 발생시키고 주로 Th1 형태의 B 세포의 T 세포 응답을 유도하며, CD32B를 우세하게 발현하는 다른 APC는 복합체의 항원을 제시하지 않을 것이고, 따라서 이들 복합체는 B 세포에 의한 Th2 세포 응답이 (더) 유도되는 것을 방지한다. 이 복합체의 결합이 안정한 상호작용을 가능하게 할 만큼 충분히 강하다면 상기 복합체와 CD32 사이의 상호작용은 많은 교차결합 (2 분자 이상의 CD32)에 의존적이지 않다. 사실상 코팅된 CD32가 단핵구상에 다중 교차결합을 유도하는 (코팅시킨 집합 IgG에 의해 모방됨), 매우 큰 복합체가 단핵구 상에 결합하는 것은 T 세포의 항원 특이 자극에 중요한 CD80과 같은 공수용체를 다운레귤레이션 (downregulation)시킨다는 것이 밝혀졌다 (표 1).
항원 제시와는 별도로, IgG/항원 복합체 또는 본 발명에 따른 aCD32/항원 융합 단백질은 정상적인 사람 B 세포에 의한 Ig 생성을 또한 억제한다. CD32와 효과적으로 상호작용하는 aCD32 항체 또는 코팅된 집합 사람 IgG의 존재 하에 aCD40 및 IL-4로 자극시킨 편도선 B 세포는 항체를 더 이상 생산할 수 없음이 도 14에 예시되어 있다. aCD32 F(ab) 단편으로 처리하는 것은 완전한 항체를 사용하는 것만큼 유효한데 (도 15) 이는 aCD40 및 IL-4로 자극시킨 후 Ig 생산을 억제하기 위해서 수용체를 교차결합시키는 것이 불필요함을 나타내는 것이다. B 세포 수용체 (BCR)를 통하여 항원에 의해 자극되는 B 세포는 BCR과 CD32의 공교차결합을 필요로 한다. Ig 생성의 다운레귤레이션은 가역적이며 시간에 의존적이다. aCD40에 더하여 IL-4로 자극한지 4일 후의 B 세포에 aCD32 항체를 첨가하면, Ig 생산이 억제되지 않는 것으로 나타난다. 또한 항체 생성이 항원 특이적으로 유도되는 것은 aCD32를 B 세포에 처리함으로써 억제된다는 것이 도 16에 예시되어 있다.
자연에서 IgG 분자는 CD32와의 상호작용을 통하여 B 세포의 응답을 조절한다. 특히 일반적으로 B 세포(CD23 양성)에 대하여 양성 효과를 갖는 IgE 항체의 효과에 대해 IgG 분자는 반대로 작용할 수 있다. 이는 유기체가 항원에 대하여 과민한 면역 반응을 나타내는 것을 방지한다. IgE 항체가 풍부하게 존재하는 알러지에서 천연 IgG 항체는 면역 응답을 조절하지 못하는 것이 명확하다. 흥미롭게도 사람에 있어서 IgE 및 IgG4는 동일한 인터루킨, 즉 IL-4에 의하여 조절된다. 그러나 IgG4는 모든 사람 IgG 아강 중에서 CD32에 대하여 가장 낮은 친화성을 갖는다.
본 발명은
a) 하나 이상의 항원 및
b) 사람 Fcγ 수용체 II (FcγRII, CD32)와 상호작용하는, 예를 들어 항체 분자의 하나 이상의 부분을 포함하는, 하기에서 "본 발명에 따른 융합 단백질"로 간단히 명명되는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 CD32에 대한 사람 IgG 분자의 저친화성에 기인하는 문제점을 극복한다. Kd<10－6인 aCD32 항체와 항원을 결합시킴으로써 항체 생산 없이 Th1/Th0 기억 유도로 귀결되는 면역계의 선택적 자극을 포함하여 천연 IgG 분자의 음성 효과 (B 세포) 및 양성 효과 모두를 수득한다. 이 효과는 무해하며 CD32를 발현하는 항원 제시 세포에 대한 면역 응답을 일으킴으로써 CD32A를 우세하게 발현하는 세포가 항원 제시를 매개하여 CD32A 발현 항원 제시 세포가 IL-12를 생산한 결과로서 Th1 세포를 유도 및 활성화시킨다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 다수의 교차결합이 없다. 바람직하게는 CD32의 결합 위치의 수는 제한되어 CD40, CD80 또는 CD86과 같은 자극성 공수용체의 다운레귤레이션을 피한다.
또한 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질의 IgE 특이 부분을 갖는 마스트 세포의 이펙터 기능을 녹아웃시킨다. 본 발명의 융합 단백질은
1) B 세포 매개 항원 제시를 잠재우고 (Th2 세포의 유도를 정지시킴),
2a) IgE 스위치 유도를 정지시키며,
2b) B 세포에서의 Ig 생산을 정지시키고,
3) 단핵구 및(또는) 수상돌기 세포와의 상호작용을 통하여 T 세포 구획을 자극하며 (Th1 세포의 자극),
4) 본 발명의 융합 단백질의 일부에 특이적인 IgE를 갖는 마스트 세포를 잠재우는 유일무이한 특성을 갖는다.
본 발명의 융합 단백질은 a) 하나 이상의 항원과 b) 사람 Fcγ 수용체 II와 상호작용하는, 예를 들어 항체로부터의 하나 이상의 부분을 포함한다.
Fcγ 수용체 II와 상호작용하는 융합 단백질의 부분은 예를 들어
1) 상기 수용체와의 상호작용이 여전히 가능할 만큼 긴, Fc 단편의 전체 또는 일부가 존재해야만 하는 완전한 또는 불완전한 (변형시킨) 사람 또는 사람화된 IgG 항체 부분,또는
2) B 세포, 마스트 세포, 단핵구 및 수상돌기 세포상에서 발현되는 것과 같은 FcγRII (CD32) 항원을 여전히 특이적으로 인지하고 상기 항원에 여전히 특이적으로 결합하는 사람 또는 사람화된 aCD32 항체 부분 또는 그의 일부, 예를 들어 Fab 단편,
예를 들어 천연 aCD32 또는 IgG 항체보다 더 큰 친화성으로 FcγRII (CD32)를 인지하는 사람 또는 사람화된 조작된 aCD32 또는 IgG 항체 부분, 또는 그의 일부 중 어느 하나일 수 있다.
항원은 융합 단백질에 존재하는 서열 상에 T 세포의 에피토프를 여전히 갖는 완전한 단백질 또는 그의 일부로부터 유래할 수 있다. 알러지 환자가 IgE를 매개로 하는 과민성 반응으로 응답하는 임의의 항원, 예를 들어 아토피성 피부염, 알러지성 천식, 알러지성 비염 및 알러지성 결막염의 알러젠을 사용할 수 있다. 가장 일반적인 환경적 알러젠으로는 집먼지 진드기, 자작나무 화분, 잔디 화분, 고양이, 바퀴벌레가 있다. 이들 알러젠 각각은 하나 이상의 "주요 알러젠" (예를 들어 집먼지 진드기의 경우 주요 알러젠은 Der P1이고, 자작나무 화분의 경우 주요 알러젠은 Bet V1임)을 갖는다. 그러나 완전한 항원은 불필요한데, 이는 융합 단백질이 정상적으로 T 세포 응답만을 유도하며 T 세포가 작은 펩티드 (8 내지 12개 아미노산 길이)에 응답하기 때문이다. 따라서 T 세포 에피토프를 선발하면 각 알러젠을 위한 융합 단백질에 상기 에피토프를 포함시킴으로써 복합체의 크기 및 분자량을 감소시킬 수 있다. 따라서 융합 단백질은 완전한 항원의 유전자로부터가 아니라 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 DNA 스트레치로부터 제조할 수 있다. 알러젠 사이에서 오버랩하는 교차 반응성 에피토프가 바람직하다. 융합 단백질은 CD32에 특이적으로 결합해야 하며 하나 이상의 항원/알러젠에 대한 하나 이상의, 예를 들어 두 개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하여야 한다. 정확하게 항원을 프로세싱하기 위하여 실제 T 세포 에피토프보다 약간 더 긴 DNA 스트레치를 융합 단백질의 제조시 포함시키는 것이 바람직하다.
바람직하게는 aCD32 항체 코딩 유전자에 융합시키기 위하여 집먼지 진드기 주요 알러젠 I (Der P1) 또는 자작나무 화분 알러젠 (Bet V1)과 같은 주요 알러젠의 클로닝 유전자로부터 유래하는 짧은 DNA 서열을 사용한다. 상기와 같은 짧은 DNA 서열은 프로세싱 후 항원 제시 세포의 표면상에 나타나는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 유전자 코드를 포함하며 따라서 알러젠에 특이적으로 응답하는 T 세포에서의 면역 응답을 유도한다. Der P1의 경우 대부분의 T 세포 에피토프는 한문자로 나타낸 아미노산 코드 (서열 번호 1)에서 101 내지 143 위치에서의 서열에서 발견될 수 있다.
특히, 한 문자로 나타낸 아미노산 코드 (서열 번호 2)에서 101 내지 131 위치에서의 아미노산 서열은 다수의 HLA 클래스 II 분자에 결합하는 3개 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
예를 들어 aCD32와 항원(들) 사이의 융합은 단백질 수준 (화학적 융합) 또는 유전자 수준 (재조합 융합 단백질) 중의 어느 하나에서 달성될 수 있으며 본 발명은 상기에 정의된 융합 단백질의 제조 방법을 또한 포함한다. 상기 융합은 종래의 방식으로 수행되며, 바람직하게는 유전자 재조합 기술 또는 화학적 교차결합의 사용을 포함한다.
재조합 융합 단백질이 바람직하다.
공지되어 있는 방법, 예를 들어 aCD32 모노클로날 항체 (예를 들어 클론 IV.3)의 CH2 엑손 하향의 Fc 부위의 항원 결합 위치 및 부분을 포함하는 유전자 단편을 예를 들어 IV.3 cDNA로부터 PCR 증폭시키고 클로닝하는 방식으로 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조시킬 수 있다. 예를 들어 Der P1 유전자를 증폭시키기 위하여 PCR 증폭용 원천으로서 집먼지 진드기로부터 적당한 RNA를 정제한다. 알러젠 유전자를 단리시킨 H쇄 (heavy chain) 단편과 함께 p350과 같은 적당한 포유동물 발현 벡터 내로 라이게이션시킨다. 또한 예를 들어 IV.3의 상응하는 완전한 L쇄 (light chain) 유전자를 단리하여 p350과 유사한 특징을 갖는 p345와 같은 적당한 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝시킨다. 상기 재조합 플라스미드 모두를 예를 들어 COS 세포 내로 함께 트랜스펙션시켜 그 결과 생성되는 재조합 융합 단백질이 배양 배지 내로 방출되게 한다. 이 생성물은 바람직하게는 대량으로 쉽게 입수가능한, 항L쇄 항체 칼럼을 기초로 하는 면역친화 정제법으로 정제시킨다.
별법으로, 예를 들어 문헌 [De Kruif 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 3938-3942]에 기술되어 있는 것과 같이 적당한 파지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)로부터 유래된 CD32에 특이적인 단일쇄 항체 (scFv)를 사용하여 클로닝된 알러젠 유전자와의 재조합 융합 단백질을 제조할 수 있다 (도 6). 결합 파지로부터 DNA를 추출하며 VL 쇄 중의 하나에 탄력성 링커를 통하여 융합시킨 반합성 VHDJH 부위를 포함하는 DNA 단편을 단리시키고 클로닝한다. Der P1으로부터의 T 세포 에피토프 및 높은 (T 세포) 교차반응성에 이하여 선발된 다른 주요 알러젠을 코딩하는 한정된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 예를 들어 Der P1 유전자와의 융합을 성취하여 하나의 융합 단백질을 가능한한 많은 환자에 적용한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 scFv 항체 단편과 함께 적당한 포유동물 발현 벡터 내로 함께 라이게이션시킨다. 재조합 벡터, 예를 들어 플라스미드를 COS 세포 및(또는) CHO 세포와 같은 적당한 세포 내로 안정하게 트랜스펙션시키며 그 결과 생성되는 융합 단백질을 예를 들어 상기에 기술한 바와 같은 면역친화 크로마토그래피로 세포 상청액으로부터 정제한다.
생성된 유전자 작제물을 예를 들어 CHO 세포에서 발현시켜 특히 대량으로 생산할 수 있지만, 특히 T 세포 에피토프만을 사용할 때, 즉 글리코실화가 필요없을 때 유전자 재조합 기술에 의한 다른 생산 시스템도 또한 적합하다. 천연 항체의 단지 F(ab) 단편만을 포함하는 aCD32 항체는 예를 들어 사람 Ig 파지 디스플레이 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 그러나 항체 또는 항원/알러젠 둘 중 어느 하나를 코딩하는 유전 물질의 원천은 중요하지 않다.
문헌 [Calsson 등, Biochem. J. 173 (1978) 723-737; Cumber 등, Meth. Enzymol. 112 (1985) 207-224; 및 Peeters 등, J. Immunol. Meth. 120 (1989) 133-143]에 기술되어 있는 방법을 사용하여 예를 들어 Mc.a-CD32와 Der P1과의 융합 단백질의 경우 화학적 교차결합으로 공지된 방법에 의해 또한 제조시킬 수 있다.
간단히 말해서, Der P1 및 Mc.a-CD32를 각각 1/20 및 1/5 몰비의 SPDP를 사용하여 개별적으로 유도하여 2-피리딜디설파이드 잔기를 도입시킨다. SPDP 유도 Mc.a-CD32를 겔 크로마토그래피로 온화하게 환원시키고 (디설파이드기를 티올기로 환원시킴) 탈염시킨 후 1/1.6의 몰비로 SPDP 유도 Der P1과 함께 인큐베이션시킨다. 이어서 생성된 Der P1-Mc.a-CD32 생성물을 예를 들어 수퍼로스-12 (Superose-12)상에서의 겔 여과 및 예를 들어 에프피엘씨 모노-큐 (FPLC Mono-Q)상에서의 음이온 교환 크로마토그래피로 예를 들어 정제한다.
출발 물질은 공지되어 있거나 또는 공지되어 있는 방법으로 또는 공지되어 있는 방법과 유사하게 또는 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기술되어 있는 방법과 유사하게 제조시킬 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 알러지, 특히 식품 알러지의 예방 및(또는) 치료에 유용하다. 특정 알러젠에 대한 과민성 응답으로 고통받는 환자들은 하나 이상의 다른 알러젠에 대한 그와 같은 응답으로 또한 고통받는다는 것이 일반적이다. 본 발명의 방법에 따라 이들 알러젠 각각에 대한 항원을 포함하는 융합 단백질을 환자에게 투여함으로써 두가지 이상의 알러젠에 대하여 상기와 같은 환자의 과민성을 동시에 감소시킬 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 융합 단백질을 식품, 예를 들어 우유에 대한 알러지의 위험성이 있는 신생아에서의 알러지의 예방 및(또는) 치료, 또는 사용되는 특정 융합 단백질에 포함된 알러젠(들)에 대하여 알러지가 있는 환자에서의 만성 알러지의 예방 및(또는) 치료에 사용한다.
이들 징후에 대한 적당한 투여량은 물론 예를 들어 사용되는 특정 융합 단백질, 숙주, 투여 방법 및 목적하는 징후에 따라 다양하다. 그러나 일반적으로 1 내지 2년에 걸친 1 내지 3번의 백신 접종으로 만족스러운 결과가 수득된다는 것이 예시되어 있지만 필요하다면 추가로 백신을 반복 접종시킬 수 있다. 이와 같은 처리에 있어서 본 발명의 융합 단백질을 종래에 사용된 것과 유사한 투여량 및 투여 계획으로 투여할 수 있음이 예시되어 있다.
따라서 본 발명은 또한 식품 알러지를 포함하는 알러지의 예방 및(또는) 치료에 있어서 상기에 정의된 융합 단백질의 용도와, 그와 같은 처리를 필요로 하는 대상자에게 상기에 정의된 융합 단백질을 종래의 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 예방 또는 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 알러지의 치료 방법 및 약품, 특히 항알러지 약제로 사용하기 위한 상기에 정의된 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 종래의 제약학적으로 허용가능한 희석제 및 담체와, 임의로 다른 부형제와 함께 혼합시킬 수 있으며 비경구적으로, 정맥내 또는 장으로, 예를 들어 근육내 또는 피하로 투여시킬 수 있다. 물론 본 발명의 융합 단백질의 농도는 사용되는 화합물, 원하는 처리 및 제약학적 형태의 성질에 따라 다양하다.
따라서 본 발명은 상기에 정의된 융합 단백질을 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 함유하는 제약 조성물을 또한 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 융합 단백질을 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 혼합시키는 것을 포함하는 알러지에 대한 의약의 제조 방법과, 식품 알러지를 포함하는 알러지의 예방 및(또는) 치료용 의약의 제조에 있어서의 상기에 정의된 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서는 하기와 같은 약어가 사용된다.
aCD32: CD32에 대한 항체 (항CD32 항체)
Ag: 항원
APC: 항원 제시 세포
BCR: B 세포 수용체
Bet V1: 자작나무 화분의 주요 알러젠
BSA: 소 혈청 알부민
CNBR: 시아노브로마이드
Der P1: 집먼지 진드기 (더마토파고이데스 프테로니씨누스 (Dermatophagoides pteronyssinus))의 주요 알러젠
DPT: 집먼지 진드기의 항원
DTT: 디티오트레이톨
EBV: 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스
ELISA: 효소 결합 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay)
FACS: 형광 활성화 세포 소터 (flourescence-activated cell sorter)
FcγRII: 사람 Fcγ 수용체 II (=CD32)
도.: 도면 번호
FPLC: 패스트 프레셔 (fast pressure) 액체 크로마토그래피
GaM; 염소 항생쥐 항체
HAc; 아세트산
HLA: 사람 백혈구 항원
HPHT: 히드록시아파타이트
IC: 면역 복합체
Ig: 면역글로불린
IL-12: 인터루킨-12
LST: 림프구 자극 시험
min: 분
MR: 몰비
PBS: 인산염 완충 염수
PCR: 폴리머라제 체인 반응 (polymerase chain reaction)
p-NPP: p-니트로페닐포스페이트
sd: 표준 편차
SPDP: N-숙신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트
본 발명을 한정함이 없이 예시하는 하기 실시예에서 모든 온도는 섭씨 온도이다.
실시예: Der P1--모노클로날 항CD32 융합 단백질의 제조 및 정제
A) 방법:
2기능 커플링제인 SPDP를 사용하여 Der P1을 Mc.a-CD32에 공유결합으로 결합시킨다. 간단히 말해서, Der P1 및 Mc.a-CD32는 각각 1/20 및 1/5의 몰비로 SPDP로 개별적으로 유도화하여 2-피리딜디설파이드 잔기를 도입시킨다. SPDP 유도 Mc.a-CD32를 겔 크로마토그래피로 온화하게 환원시키고 (디설파이드기를 티올기로 환원시킴) 탈염시킨 후 1/1.6의 몰비로 SPDP 유도 Der P1과 함께 인큐베이션시킨다. 생성된 Der P1--Mc.a-CD32 결합물을 수퍼로스-12상에서의 겔 여과 및 에프피엘씨 모노-큐상에서의 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한다.
B) 재료:
a) SPDP: 분자량은 312.4이며, 디메틸포름아미드 중 25.61 mM의 원액 (8 mg/ml)으로 커플링 전에 즉시 제조한다.
b) Der P1: CNBR-세파로스 (Sepharose) 4B에 공유결합으로 커플링된 Mc.a-Der P1 (4Cl/B8/3F8) 상에서의 면역친화 크로마토그래피로 정제한다. 분자량은 28 kD이며, 등전점은 5.0이고 (PHAST-IEF), PBS로 무균 여과하며 희석시킨다.
c) 모노클로날 항CD32 (IV.3): 이소타입: 생쥐 IgG2b-κ 쇄이며, 분자량은 150 kD이고, 등전점은 6.2이며 (PHAST-IEF), 단백질-A 및 HPHT상에서 배양 배지 상청액으로부터 정제하고 PBS에 대하여 투석시킨다.
반응 혼합물 A:
1.2 ml의 Der P1 용액 (0.84 mg)에 23.4 ㎕의 SPDP 원액 (20배 과량의 몰)을 첨가하여 이 혼합물을 실온 (22℃)에서 45분 동안 2.5 ml 의 코니칼 리액티브 바이알 (conical reactive vial, 피어스 (Pierce)사)에서 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 PBS로 2.5 ml까지 충전시키고 50 ml의 PBS로 평형화시킨 9.1 ml의 파마시아 피디-10 (Pharmacia PD-10) 일회용 탈염화 칼럼 (세파덱스 지-25 (Sephadex G-25)) 상에서 탈염화시킴으로써 비결합 SPDP 및 유리된 N-히드록시숙신이미드를 제거한다. 적용후 2-피리딜디설파이드 활성화 Der P1을 포함하는 분획을 3.5 ml의 PBS로 용출시키고 모은다. 농도는 0.6 mg에 해당하는 약 0.17 mg/ml이다.
2-피리딜디설파이드로 치환된 정도의 평가
100 ㎕의 시료를 PBS로 150 ㎕까지 충전시키고 PBS에 희석시킨 50 ㎕의 150 mM DTT를 첨가한다. DTT 첨가 후 도입된 2-피리딜-디설파이드 잔기에 상응하는 유리되는 피리딘-2-티온의 농도는 343 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 측정될 수 있다 (몰 흡광 계수: 8080 M－1cm－1). 343 nm에서의 측정시 OD가 0.074 증가하면 (희석시 보정) 치환 정도는 Der P1의 몰 당 1.5 M의 2-피리딜디설파이드로서 계산된다.
반응 혼합물 B:
0.5 ml의 Mc.a-CD32 용액 (4.2 mg)에 5.5 ㎕의 SPDP 원액 (5배 과량의 몰)을 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 2.5 ml의 피어스 GF-5 일회용 탈염화 칼럼 (pH가 4.5인 10 ml의 0.1 M 아세트산 나트륨/HAc 완충제, 0.1 M NaCl로 평형시킴) 상에 적용한다. 탈염화시킨 분획을 적용 후 1.5 ml의 아세테이트 완충제 (pH 4.5)로 용출시켜 모으고 0.22 μm 밀렉스-지브이 (MILLEX-GV, 단백질 결합이 적음) 여과 유닛으로 여과시킨다.
SH기의 도입:
단백질 결합 2-피리딜디설파이드기를 DTT로 환원시킴으로써 단백질 결합 티올기로 전환시킨다. 교반 하에서 1.5 ml의 탈염화 시료를 1 ml의 62.5 mM DTT (아세테이트 완충제에 희석시킴)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨다 (DTT의 최종 농도는 25 mM임). 2-피리딜 디설파이드는 산성 pH에서 전자친화성이 증가하기 때문에 디설파이드가 결합하는 천연 단백질이 영향을 받지 않는 낮은 pH에서 여전히 환원시킬 수 있다.
343 nm에서 측정시 OD가 0.447 증가하면 치환 정도는 Mc.a-CD32의 몰 당 7 몰의 티올기로 계산된다.
상기 반응 혼합물을 파마시아 PD-10 칼럼 (50 ml의 PBS로 평형화시킴)상에 적용하고 그 후 3.5 ml의 PBS로 탈염화 분획을 용출시켜 모은다. 이 시료를 센트리플러스-10 (CENTRIPLUS-10, YM10 막) 농축 유닛을 사용하여 0.6 ml 이하로 농축시킨다. 농도는 1.86 mg에 해당하는 약 3.1 mg/ml이다.
c) 커플링 방법
3.3 ml (0.56 mg)의 Der P1 (피리딘-디설파이드로 활성화시킴) 및 0.6 ml (1.86 mg)의 Mc.a-CD32 (SH 활성화)를 혼합시키고 실온 (22℃)에서 2시간, 그리고 4℃에서 15시간 동안 5 ml의 피어스 리액티브 바이알에서 교반시킨다. 반응 혼합물에서 Der P1/Mc.a-CD32의 몰비는 1.6/1이다. 유리되는 피리딘-2-티온의 증가에 기인하는 343 nm에서의 OD의 증가를 측정함으로써 커플링 반응을 모니터한다.
시간 OD (343 nm)
출발 0.1112
15분 0.1257
30분 0.1342
45분 0.1412
60분 0.1470
75분 0.1519
120분 0.1590
D) 결합물의 정제
수퍼로스-12:
반응 혼합물 (3.9 ml)을 0.22 μm 밀렉스-지브이 여과 유닛으로 여과시키고 센트리플러스-10 농축 유닛을 사용하여 0.5 ml 이하로 농축시킨다. 결합물의 최종 농도는 1.9 mg에 해당하는 3.7 mg/ml이다.
이 시료를 PBS로 평형화시킨 파마시아사의 수퍼로스-12 (HR 10/30) 칼럼 (베드 부피 24 ml; 유속 0.2 ml/분; 분획 당 부피 0.4 ml; 기록기 차트 속력 1.5 mm/분; 압력 0.3 MPa; 주사 파장 280 nm) 상에 적용한다. 용출 프로파일에 따라 고분자량의 용출 분획을 3개의 풀로 나눈다.
1.2 ml의 풀 A: 분획# 21 내지 23
1.2 ml의 풀 B: 분획# 24 내지 26
1.2 ml의 풀 C: 분획# 29 내지 31
이 풀을 무균 여과시키고 (0.22 μm 밀렉스-지브이) 4℃에서 무균 상태 하에 보관한다. 전체 단백질 농도는 풀 A의 경우 약 100 μg/ml, 풀 B의 경우 약 200 μg/ml, 풀 C의 경우 약 390 μg/ml이다.
에프피엘씨 모노-큐:
1 ml의 풀 C (390 μg)는 20 mM의 에탄올아민/HCl, 0.01% NaN3완충제 (pH 9.0)에 대하여 투석시키고 에프피엘씨-모노 큐 (HR5/5) 음이온 교환기 (출발 완충제 A: 20 mM 에탄올아민/HCl, 0.01% NaN3(pH 9.0); 한정 (limiting) 완충제 B: A ＋ 0.5 M NaCl (pH 9.0); 유속: 1 ml/분; 분획 당 부피 1 ml; 기록기 차트 속력 5 mm/분; 압력 1.2 MPa; 주사 파장 280 nm) 상에서의 이온 교환 크로마토그래피로 정제시킨다. 적용 후, 선형 구배 프로그램을 30분 동안 작동시킨다 (50 내지 1260 μS/cm의 전도성). 관련 피크가 분획# 8에서 용출된다 (340 μS/cm에서). 단백질 농도는 약 45 μg/ml이다 (280 nm에서의 OD, E1%14.0). 이 시료를 PBS에 대하여 투석시키고 무균 여과시킨다. 최종적으로 정제된 물질의 단백질 농도는 20 μg/ml이다 (280 nm에서의 OD).
E) 분석 측정법
a) 전체 단백질 농도
바이오 라드 (BIO-RAD) 단백질 분석 키트 I을 사용하여 (표준물: 소 IgG) 브래드포드 (Bradford) 방법에 따라 전체 단백질 농도를 측정한다.
b) ELISA에 의한 Der P1, Mc.a-CD32 및 Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 측정:
고체상 ELISA를 PVC 마이크로역가 플레이트에서 수행한다. pH가 9.6인 코팅용 완충제 (0.1 M NaHCO3/Na2CO3, 0.01% NaN30.05% 트윈-20 (Tween-20)을 함유하는 PBS)를 세척액으로 사용하며 세척액 중 2% 송아지 태아 혈청을 시료, 바이오틴 결합물 및 효소 결합물의 희석제로서 사용한다. 기질은 1 M 디에탄올아민/HCl 완충제 (pH가 9.8)에 희석시킨 1 mg/ml의 p-NPP이다. 종결액은 2 M NaOH이다. 모든 인큐베이션 단계는 다습한 챔버에서 행해진다. 시료 프로세싱 및 405 nm 에서의 OD 기록용 장치는 베크만 바이오메크-1000 래버러토리 워크스테이션 (Beckman Biomek-1000 laboratory workstation)이다.
양 측정: 베크만 이뮤노피트 (Immunofit); 곡선 보정: 4개 매개변수의 논리학.
b)1) Der P1의 측정 (도 7):
10 μg/ml의 Mc.a-Der P1(5H8)를 웰 당 100 ㎕ 넣고 4℃에서 철야로 웰을 코팅시킨다. 세척시킨 후 웰 당
a) 표준물로서 250 내지 0.49 ng/ml의 Der P1 (커플링을 위한 출발 물질)
b) 4000 내지 7.81 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 A
c) 4000 내지 7.81 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 B
d) 4000 내지 7.81 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 C
시료 100 ㎕를 첨가한다.
37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고 세척시킨 후, 1/500으로 희석시킨 Mc.a-Der P1(4Cl/B8/3F8)-바이오틴 결합물을 웰 당 100 ㎕로 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 1/1000으로 희석시킨 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 결합물을 웰 당 50 ㎕로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후 웰 당 100 ㎕의 기질을 첨가하며 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨 후 종결시킨다. 표준 곡선으로부터 양을 측정한 결과는 하기와 같다.
수퍼로스-12 풀 A 16.1 μg/ml
수퍼로스-12 풀 B 54.9 μg/ml
수퍼로스-12 풀 C 135 μg/ml
b)2) Mc.a-CD32 (생쥐 IgG2b)의 측정 (도 8):
5 μg/ml의 염소 Pc.a-생쥐 IgG2b(서턴 (Southern))를 웰 당 100 ㎕ 넣고 4℃에서 철야로 웰을 코팅시킨다. 세척시킨 후 웰 당
a) 표준물로서 1000 내지 1.96 ng/ml의 Mc.a-CD32 (커플링을 위한 출발 물질)
b) 8000 내지 15.63 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 A
c) 8000 내지 15.63 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 B
d) 8000 내지 15.63 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 C
시료 100 ㎕를 첨가한다.
37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고 세척시킨 후 1/1000으로 희석시킨 염소 Pc.a-생쥐 IgG2b-알칼린 포스파타제 결합물 (서턴)을 웰 당 50 ㎕ 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후 웰 당 100 ㎕의 기질을 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후 종결시킨다. 표준 곡선으로부터 양을 측정한 결과는 하기와 같다.
수퍼로스-12 풀 A 17.7 μg/ml
수퍼로스-12 풀 B 58.8 μg/ml
수퍼로스-12 풀 C 190 μg/ml
ELISA로 결합물에서의 Der P1/Mc.a-CD32의 몰비를 측정한 결과는 하기와 같다.
수퍼로스-12 풀 A 4.9/1
수퍼로스-12 풀 B 5.0/1
수퍼로스-12 풀 C 3.8/1
b)3) Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 검출:
b)3)1) Mc.a-Der P1 (생쥐 IgG2a)의 코팅 (도 9):
10 μg/ml의 Mc.a-Der P1(5H8)을 웰 당 100 ㎕ 넣고 4℃에서 철야로 웰을 코팅시킨다. 세척시킨 후 웰 당
a) 4000 내지 7.81 ng/ml의 Der P1 (커플링을 위한 출발 물질)
b) 4000 내지 7.81 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 A
c) 4000 내지 7.81 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 B
d) 4000 내지 7.81 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 C
시료 100 ㎕를 첨가한다.
37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고 세척시킨 후 1/1000으로 희석시킨 염소 Pc.a-생쥐 IgG2b-알칼린 포스파타제 결합물 (서턴)을 웰 당 50 ㎕ 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후 웰 당 100 ㎕의 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후 종결시킨다. 정제된 각각의 수퍼로스 12 분획 풀에서의 Mc.a-CD32 분배로 Mc.a-Der P1 결합 Der P1-Mc.a-CD32 결합물을 검출한다.
b)3)2) Pc.a-생쥐 IgG2b의 코팅 (도 10)
5 μg/ml의 염소 Pc.a-생쥐 IgG2b (서턴)를 웰 당 100 ㎕ 넣고 4℃에서 철야로 웰을 코팅시킨다. 세척시킨 후 웰 당
a) 1000 내지 1.95 ng/ml의 Der P1 (커플링을 위한 출발 물질)
b) 8000 내지 15.63 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 A
c) 8000 내지 15.63 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 B
d) 8000 내지 15.63 ng/ml의 수퍼로스-12 풀 C
시료 100 ㎕를 첨가한다.
37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고 세척시킨 후, 1/500으로 희석시킨 Mc.a-Der P1(4Cl/B8/3F8)-바이오틴 결합물 (생쥐 IgG1)을 웰 당 100 ㎕로 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 1/1000으로 희석시킨 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 결합물을 웰 당 50 ㎕로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후 웰 당 100 ㎕의 기질을 첨가하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨 후 종결시킨다. 수퍼로스-12로 정제된 각각의 분획 풀에서 Der P1 분배로부터 Pc.a-생쥐 IgG2b 결합 Der P1--Mc.a-CD32 결합물을 검출한다.
c) 구배 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 분자량 측정:
수퍼로스-12로 정제된 분획 풀에서의 Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 분자량은 고분자량의 표준 천연 단백질과 비교하여 분리 범위가 1000 kD 내지 150 kD인 4 내지 15% 구배의 네이티브 파스트 겔 (키트, 파마시아사)을 사용하여 측정한다.
실버 염색법 (실버 염색 키트, 파마시아사)으로 검출한다 (도 11).
측정 결과는 하기와 같다.
수퍼로스-12 풀 A 분자량 700 kD에서 밴드 검출
수퍼로스-12 풀 B 분자량 460 kD, 330 kD에서 밴드 검출
수퍼로스-12 풀 C 분자량 330 kD, 170 kD에서 밴드 검출
최종적으로 에프피엘씨-모노 큐로 정제한 Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 분자량은 330 kD으로 추정된다 (도 12).
F) 시험 결과:
a) CD32 Der P1 융합 단백질을 사용한 T 세포 클론 CFTS4:3.1의 항원 특이 자극:
표준 LST를 사용하여 정제 Der P1과 화학적으로 결합된 상기 aCD32 (메다렉스 클론 IV.3)를 상이한 농도로 사용하여 Der P1 특이 T 세포 클론 CFTS4:3.1을 자극한다. 첫 번째 실험 세트에서 화학적으로 융합시킨 제조물로부터의, 700 kD의 단일 밴드를 포함하는 풀 A (aCD32 2 분자와 Der P1 10 분자를 융합시킨 것) 및 460 kD와 330 kD에서의 두 개의 밴드로 구성된 풀 B (각각 aCD32 1 분자와 Der P1 10분자를 융합시킨 것과 aCD32 1 분자와 Der P1 5 분자를 융합시킨 것)를 사용한다.
두 번째 실험 세트에서 대략 330 kD의 단일 밴드로 구성된 풀 C로부터의 정제 단백질 (aCD32 1분자와 Der P1 5분자를 융합시킨 것)을 사용한다. 도 13a 및 13b에 나타냈듯이 단핵구 및 B 세포를 다양한 분획물과 함께 실온에서 1시간 동안 예비인큐베이션시킨다. 대조 시험으로서 완전한 배양 기간 동안 T 세포에 더하여 항원 제시 세포에 100 μg/ml의 DPT를 첨가한다. B 세포는 DPT로 CFTS4:3.1을 자극시킬 수 있지만 풀 A, 풀 B 또는 풀 C로 CFTS4:3.1을 자극시킬 수는 없는 반면, 단핵구는 DPT 및 풀 A, 풀 B와 풀 C로 CFTS4:3.1을 자극시킬 수 있다. 이는 상기에 언급된 천연 IgG 알러젠 복합체에서의 이전의 발견을 확실하게 한다. 또한 이는 단핵구에 의한 항원 자극에 있어서 CD32 교차결합이 필요하지 않음을 나타내는 것인데, 이는 모든 분획물이 T 세포를 동등하게 잘 자극하기 때문이다.
b) IgE 합성의 억제:
정제된 사람 편도선 B 세포를 예시된 농도로 첨가시킨 구매가능한 aCD32 항체의 존재 하에 그리고 상기 항체 없이 IL-4와 함께 자극시킨다 (도 14). 9일 후 배양물의 상청액에서 IgE 및 IgG1의 함량에 대하여 시험한다. 모든 aCD32 항체는 IgE 및 IgG1 생성을 분량에 의존적인 방식으로 억제한다. 심지어 메다렉스 클론 IV.3으로부터의 Fab 단편도 IgE 합성을 억제할 수 있음이 도 15에 예시되어 있다. 이는 BCR을 통하여 활성화되지 않는 B 세포는 CD32와의 단량체적 상호작용에 의해 그의 항체 생산이 차단될 수 있음을 나타낸다. 항원 특이적인 방식으로 자극되는 B 세포에 있어서 CD32와 BCR 사이에서의 공교차결합이 필요하다. 이는 예를 들어 IgE 및 CD32를 통하여 B 세포가 항원 (예를 들어 Der P1)을 흡수하고 그 후 자극된 Der P1 특이 Th2 세포가 B 세포에 의한 IgE 생산을 야기하는 알러지에 있어서, 이들 B 세포는 B 세포 표면상의 CD32와의 상호작용으로 셧 다운 (shut down) 될 수 있음을 의미한다. 사실, 심지어 동일 계통의 B 세포와 T 세포 상호작용에 있어서조차 aCD32 항체는 항체 합성을 차단한다 (도 16).
자극 % CD80 % CD40 % HLA-DR
0일 (신선하게 단리시킴) 1 26 99
IFN-γ로 1일 31 82 99
IFN-γ ＋ 집합 IgG로 1일 13 61 99
IFN-γ ＋ 집합 IgG ＋ aCD32로 1일 32 82 99
정상적인 수여체로부터 현탁분리하여 제조한 단핵구 (91%의 CD14 양성)를 5 μg/ml의 집합 사람 IgG (4℃에서 철야로 웰에 코팅시킴) 및(또는) 10 μg/ml의 모노클로날 생쥐 항사람 aCD32 (메다렉스 IV.3)의 존재 하에 또는 없이 100 U/ml의 IFNγ와 함께 24시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 FACS 분석을 위하여 예시된 표지물로 염색시킨다. 집합 사람 IgG에 의해 단핵구 상에서 Fcγ 수용체가 심하게 교차결합됨으로써 IFN-γ에 의해 유도되는 CD80 및 CD40의 업 레귤레이션이 억제될 수 있다. aCD32와 예비인큐베이션시키면 집합 사람 IgG에 의한 상기 억제가 방지되는데, 이는
1) 집합 사람 IgG에 의한 상기 억제가 CD32를 통해서 매개되고,
2) 단순히 CD32에 결합하는 것이 공수용체의 다운레귤레이션을 야기하지는 않는다는 것을 나타낸다.
HLA-DR 발현은 상기 처리에 의해 영향을 받지 않는다.
도 1: 항원 제시와 관련한 Der-P1-(3)NIP 복합체의 CD23에 대한 결합:
패널 A=형광; 패널 B=증식.
일정 농도의 IgE (▲: 7.5 μg/ml; ●: 5.0 μg/ml; ■: 2.5 μg/ml) 및 다양한 농도의 Der-P1-(3)NIP로 구성된 예비형성시킨 IC로 EBV B 세포를 펄스 (pulse)하였다.
예비형성시킨 IC의 B 세포에 대한 결합이 패널 A에 예시되어 있다. 동일 MR의 IC는 선으로 연결되어 있으며 실제 MR (0.1, 0.25, 0.5, 1, 7)은 선 옆에 아라비아 숫자로 예시되어 있다. 약 0.2 μg/ml의 Der P1 농도에서 IgE 결합이 정체상태에 이르렀다. Der P1-(3)NIP가 없을 경우의 IgE 결합이 오른쪽 Y 축의 하단에 점선 박스로 예시되어 있다.
동일한 IC로 펄스한 조사 EBV-B 세포에 의한 항원 제시가 패널 B에 예시되어 있다. 상기에서 연결선들은 항원 제시가 IC의 MR에 의해 영향을 받지 않았음을 강조하기 위하여 동일한 IgE 농도로 제조된 복합체를 나타낸다 (상관 계수=0.96). 또한 단량체적 복합체 (각 선의 가장 고농도의 Der P1-(3)NIP)는 효과적으로 T 세포에 제시되었다. IgE 분자 없이는 Der P1-(3)NIP의 모든 사용된 농도에서 T 세포의 자극이 나타나지 않았다 (평행선 무늬의 지역). 5일째의3H-티미딘 혼입으로 데이터를 나타낸다 (세 개의 웰의 평균 ± sd).
도 2: 펄스시키지 않은 B 세포와의 항원 제시의 비교:
전체 자극 기간 동안 배양 배지에 남아있는 유리 Der P1-(2)NIP는 분량에 의존적으로 T 세포의 자극을 유도하였다. 항원 제시 세포로서 자가조직 EBV B 세포 (조사된 것)를 사용하였다. 유리 Der P1-(2)NIP와 비교했을 때 복합체에 존재하는 IgE는 항원 제시를 현저하게 증강시키지 않았지만, IC에 존재하는 IgG1 및 IgG3은 둘 모두 T 세포에 대한 Der P1-(2)NIP의 항원 제시를 방해하였다. 5일째의3H-티미딘 혼입으로 결과를 나타낸다 (세 개의 웰의 평균 ± sd).
도 3: IgG-Der P1-(3)NIP 복합체에 의한 항원 제시의 억제:
IgG3이 존재하지 않을 경우, IgE-Der P1-(3)NIP 복합체를 사용할 때 T 세포 자극이 우수한 것으로 나타난다. 동일 비율 (1:1)의 IgG3-Der P1-(3)NIP 복합체를 적정해 보면 IgE 매개 항원 제시가 분량에 의존적으로 억제됨이 나타난다. 이런 효과를 얻기 위하여 상기 IgG3 복합체는 T 세포 자극시 배양 배지에 존재되어야 할 필요가 있다. B 세포를 IgG3 복합체와 예비인큐베이션시키거나 또는 IgG3 복합체로 "펄싱"하는 것은 B 세포상의 CD32에 대한 IgG3의 저친화성 때문에 성공적이지 못하다. IgE가 없을 경우의 항원 제시 및 IgG3-BSA-(3)NIP 복합체에서도 또한 유사한 억제가 나타난다.
도 4: 신선한 사람 단핵구에 의한 IgG3 매개 항원 제시:
관련이 없는 집합 사람 IgG 없이 또는 그의 존재 하에 얼음 위에서 1시간 동안 예비형성시킨 IgG3-Der P1-(3)NIP 복합체 (1:1 비율)로 사람 단핵구를 펄스시킨다. 이어서 펄스시킨 단핵구를 세척하고 Der P1에 특이적인 HLA-DP 매치 T 세포 클론과 혼합시키고, 5일 후3H-티미딘 혼입으로서 증식을 측정한다. 사람 단핵구에 의해 제시되는 IgG3 복합체는 집합 IgG에 의해 차단될 수 있는 알러젠 특이 T 세포 응답을 유도하는데 이는 단핵구와의 IgG3 상호작용의 특이성을 나타내는 것이다. 세 개의 웰의 평균 ± sd로서 데이터를 나타낸다.
도 5: DPT 특이 T 세포 증식; 항원 제시에 대한 aCD32 또는 집합 사람 IgG의 영향:
250 μg/ml의 DPT의 존재하에 (폐쇄 막대) 또는 DPT 없이 (개봉 막대) 사람 EBV B 세포를 철야로 펄스시킨다. 조사 후 B 세포를 Der P1 특이 T 세포 클론으로부터의 T 세포와 혼합시키고 이 세포를 5일 동안 증식시킨다. GaM에 의해 교차결합된 상이한 농도의 aCD32 항체의 존재 하에서 분량에 의존적인 증식 억제가 관찰된다. 배양 웰에 aCD32 또는 비특이적 집합 사람 IgG가 코팅되어 있는 경우 동일한 효과가 관찰된다.
도 6: 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 aCD32 scFv (Fab) 단편(들) 사이의 재조합 융합 단백질의 실시예:
문헌 [De Kruif 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 3938-3942]에 기술되어 있는 바와 같이 Fab 단편을 파지 디스플레이 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 그러나 사람 CD32와 효과적으로 상호작용하는 임의의 분자 (또는 분자의 일부)가 aCD32 Fab 단편을 대체할 수 있다. 알러젠은 알러지를 야기하는 임의의 단백질 또는 단백질들의 배합물일 수 있다. 또한 알러젠(들)은 T 세포 에피토프를 포함하는 알러젠(들)의 단편으로 대체될 수 있다. 재조합 단백질은 글리코실화 및 다른 번역후 변형에 독립적인, 입수가능한 임의의 발현 시스템에서 생성시킬 수 있다. 또한 그와 같은 융합 단백질은 류머티즘성 관절염, 이식편 대 숙주 질환 (graft versus host disease) 또는 자가항체가 역할을 하는 임의의 다른 질병과 같은, 원하지 않는 Ig 분자의 (과)생성을 그 특징으로 하는 질환에 사용될 수 있다. 상기와 같은 경우에 있어서 알러젠을 두 부분의 aCD32를 결합시키는 단순한 비한정 링커로 대체시킬 수 있으나 상기 질환을 야기하는 "자가항원"으로 알러젠을 대체시킬 때 최상의 결과가 수득된다.
도 7: 샌드위치 (Sandwich)-ELISA를 사용한 수퍼로스-12로 정제한 Der P1--Mc.a-CD32 결합물 분획 풀 중의 Der P1의 측정:
도 8: 샌드위치-ELISA를 사용한 수퍼로스-12로 정제한 Der P1--Mc.a-CD32 결합물 분획 풀 중의 Mc.a-CD32의 측정:
도 9: 샌드위치-ELISA를 사용한 수퍼로스-12로 정제한 분획 풀 중의 Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 검출:
코팅: Mc.a-Der P1.
도 10: 샌드위치-ELISA를 사용한 수퍼로스-12로 정제한 분획 풀 중의 Der P1--Mc.a-CD32 결합물의 검출:
코팅: Pc.a-생쥐 IgG2b.
도 11: 풀 A, 풀 B 및 풀 C 분획의 실버 염색:
1 레인: 350 ng의 Der P1
2 레인: 50 ng의 Mc.a-CD32
3 레인: 500 ng의 고분자량 표지물
4 레인: 500 ng의 수퍼로스-12의 출발 물질
5 레인: 100 ng의 수퍼로스-12 풀 A
6 레인: 100 ng의 수퍼로스-12 풀 B
7 레인: 200 ng의 수퍼로스-12 풀 C
8 레인: 250 ng의 고분자량 표지물
고분자량의 표지물은
669 kD: 갑상선 글로불린
440 kD: 페리틴
232 kD: 카탈라제
140 kD: 락테이트 데히드로제나제
67 kD: 소 혈청 알부민이다.
도 12: 풀 C로부터의 정제 융합 단백질의 실버 염색:
1 레인: 250 ng의 고분자량 표지물
2 레인: 45 ng의 에프피엘씨 모노-큐로 정제시킨 물질.
도 13a 및 13b: Ag 특이 T 세포 증식:
도 13a: APC-Mo 250495 및 CFB4:2
도 13b: 정제된 단량체 CD32/Der P1의 영향
표준 LST를 사용하여 정제 Der P1이 화학적으로 결합된 aCD32 (메다렉스 클론 IV.3)를 상이한 농도로 사용하여 Der P1 특이 T 세포 클론 CFTS4:3.1을 자극하였다 [Van Reijsen, F.C. 등, (1992) J. Alleregy Clin. Immunol. 90 184 참조]. 첫 번째 실험 세트에서 화학적으로 융합시킨 제조물로부터의 700 kD의 단일 밴드 (aCD32 2 분자가 Der P1 10분자와 융합된 것)를 포함하는 풀 A 및 460 kD과 330 kD의 두 밴드 (각각 aCD32 1 분자가 Der P1 10 분자 및 5분자와 융합된 것)로 구성된 풀 B를 사용하였다 (도 13a).
두 번째 실험 세트에서 대략 330 kD의 단일 밴드 (1 분자의 aCD32가 5 분자의 Der P1과 융합된 것)로 구성된 풀 C로부터의 정제 단백질 (CP230595)을 사용하였다 (도 13b).
이 도면에 나타낸 바와 같이 실온에서 1시간 동안 단핵구 및 B 세포를 다양한 분획물과 함께 예비인큐베이션시켰다. 대조 자극으로서 완전한 배양 기간 동안 T 세포에 더하여 항원 제시 세포에 100 μg/ml의 DPT를 첨가하였다. Van Reijsen 등의 상기 문헌에 기술된 바와 같이 5일 후에3H-티미딘 혼입으로 T 세포 자극을 측정하였다 (네개의 웰의 평균 ± sd). B 세포는 CFTS4:3.1을 DPT로 자극할 수 있지만 풀 A, 풀 B 또는 풀 C로 자극할 수 없는 반면, 단핵구는 CFTS4:3.1을 DPT 및 풀 A, 풀 B와, 풀 C로 자극할 수 있었다. 이는 천연 IgG 알러젠 복합체에서의 이전의 발견과 일치한다 [Bheekha Escura, R. 등, Immunology (1995) 86 343 참조]. 또한 이는 단핵구에 의한 항원 자극에 있어서 2 분자 이상의 CD32의 교차결합이 필요하지 않음을 나타내는데, 이는 모든 분획물이 T 세포를 자극함에 있어서 동등하게 효과적이었기 때문이다.
도 14: IgE 및 IgG1 각각의 합성의 억제:
문헌 [Armerding, D. 등, Immunobiology 188 (1993) 259-273]에 기술되어 있는 바와 같이 예시된 농도로 첨가된 구매가능한 aCD32 항체의 존재 하에 또는 상기 항체 없이 aCD40 및 IL-4로 정제된 사람 편도선 B 세포를 자극시켰다. 9일 후 이 배양물의 상청액을 Armerding, D. 등의 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 IgE 및 IgG1 함량에 대하여 시험하였다. 3개의 모아진 분획물의 9개의 레플리케이트 (replicate)에서의 항체 생성으로서 결과를 나타낸다 (평균 ± sd). 모든 aCD32 항체는 IgE 및 IgG1 생성을 분량에 의존적인 방식으로 억제하였다. IgM 및 IgA의 억제는 유사하였다.
도 15: IgE 합성의 억제:
정제된 사람 편도선 B 세포를 Armerding, D. 등의 상기 문헌에 기술된 바와 같이 구매가능한, 예시된 농도로 첨가된 aCD32 항체 (메다렉스 IV.3) 또는 그의 Fab 단편의 존재하에 그리고 상기 물질 없이 aCD40 및 IL-4로 자극시켰다. 9일 후에 이 배양물의 상청액을 Armerding, D. 등의 상기 문헌에 기술된 바와 같이 IgE 및 IgG1 함량에 대하여 시험하였다. 3개의 모아진 분획물의 9개의 레플리케이트)에서의 항체 생성으로서 결과를 나타낸다 (평균 ± sd). 메다렉스 클론 IV.3의 완전한 단편 및 Fab 단편 모두는 IgE 합성 (IgG1, IgM 및 IgA)을 억제할 수 있었다.
도 16: DPT 특이 IgE 유도; aCD32의 영향:
250 μg/ml의 DPT의 존재하에 (폐쇄 막대) 또는 DPT 없이 (개봉 막대) 철야로 사람 편도선 B 세포를 펄스시킨다. 조사 후 B 세포를 Der P1 특이 T 세포 클론 (CFTS4:3.1)으로부터의 T 세포와 혼합시키고 이 세포를 9일 동안 증식시켜 항체를 생산하게 한다. 9일 후 Armerding, D. 등의 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 배양물의 상청액을 IgE 및 IgG1의 함량에 대하여 시험하였다. 3개의 모아진 분획물의 9개의 레플리케이트에서의 항체 생성으로서 결과를 나타낸다 (평균 ± sd). 상이한 농도의 aCD32 항체의 존재하에서 분량에 의존적으로 IgE 생성이 억제됨이 관찰된다. 이는 심지어 동일 계통의 B 세포 T 세포 상호작용에 있어서 aCD32 항체가 항체 합성을 차단시킴을 나타낸다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인:
(A) 이름: 산도스 엘티디.
(B) 거리: 리히트스트라쎄 35
(C) 도시: 바젤
(E) 국가: 스위스
(F) 우편번호: 체하-4002
(G) 전화번호: 61-324 5269
(H) 텔레팩스: 61-322 7532
(A) 이름: 무데, 기어트 씨.
(B) 거리: 루치카가쎄 88-104/하우스 39
(C) 도시: 비엔나
(E) 국가: 오스트리아
(F) 우편번호: 아-1230
(ii) 발명의 명칭 : 융합 단백질
(iii) 서열수 : 2
(iv) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 퍼텐트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25 (EPO)
(vi) 현재 출원 데이터:
출원 번호: 국제 특허 출원 공개 제WO PCT/EP 96/····
(vii) 종래 출원 데이터
(A) 출원 번호: 영국 특허 제9516760.7호
(B) 출원일: 1995년 8월 16일
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A) 길이: 43 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 공지되어 있지 않음
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티-센스: 없음
(v) 단편 유형: 본질적
(vi) 원천:
(A) 유기체: 더마토파고이데스 프테로니씨누스
(xi) 서열 설명: 서열 번호 1:
(2) 서열번호 2에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A) 길이: 31 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 공지되어 있지 않음
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티-센스: 없음
(v) 단편 유형: 본질적
(vi) 원천:
(A) 유기체: 더마토파고이데스 프테로니씨누스
(xi) 서열 설명: 서열 번호 2:

Claims (13)

  1. a) 하나 이상의 항원 및
    b) 사람 Fcγ 수용체 II (FcγRII, CD32)와 상호작용하는 하나 이상의 부분을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 항원이 아토피성 피부염, 알러지성 천식, 알러지성 비염 또는 알러지성 결막염의 알러젠인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 완전한 항원의 유전자가 아니라 하나 이상의 T 세포 에피토프 포함 DNA 스트레치로부터 제조되는 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, FcγRII와 상호작용하는 부분이 사람 또는 사람화 aCD32 항체, 또는 여전히 FcγRII (CD32) 항원을 특이적으로 인지하고 상기 항원에 결합하는 이 항체의 일부인 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, FcγRII와 상호작용하는 부분(들)이 사람 또는 사람화 IgG 항체, 또는 여전히 FcγRII (CD32) 항원과 상호작용하는 이 항체의 일부인 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, FcγRII와 상호작용하는 부분(들)이 천연 aCD32 또는 IgG 항체보다 더 고친화적으로 FcγRII (CD32)를 인지하는 조작된 사람 또는 사람화 aCD32 또는 IgG 항체, 또는 이 항체의 일부인 융합 단백질.
  7. 제1항에 따른 융합 단백질을 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 함유하는 제약 조성물.
  8. 유전자 재조합 기술 또는 화학적 교차결합의 사용을 포함하는 제1항에 따른 융합 단백질의 제조 방법.
  9. 알러지 (식품 알러지를 포함함)의 예방 및(또는) 치료에 있어서 제1항에 따른 융합 단백질의 용도.
  10. 알러지 (식품 알러지를 포함함)의 예방 및(또는) 치료용 의약의 제조를 위한 제1항에 따른 융합 단백질의 용도.
  11. 약품으로 사용하기 위한 제1항에 따른 융합 단백질.
  12. 알러지의 치료가 필요한 환자에 제1항에 따른 융합 단백질을 하나 이상의 종래의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 예방 또는 치료적 유효량으로 투여함을 포함하는 알러지의 치료 방법.
  13. 제1항에 따른 융합 단백질을 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 혼합시킴을 포함하는 알러지에 대한 의약의 제조 방법.
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