CZ43798A3 - Fúzní proteiny, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje - Google Patents
Fúzní proteiny, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ43798A3 CZ43798A3 CZ98437A CZ43798A CZ43798A3 CZ 43798 A3 CZ43798 A3 CZ 43798A3 CZ 98437 A CZ98437 A CZ 98437A CZ 43798 A CZ43798 A CZ 43798A CZ 43798 A3 CZ43798 A3 CZ 43798A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fusion protein
- cells
- der
- antigen
- fcγrii
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 55
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 42
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 21
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 8
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 7
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 claims 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 claims 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 claims 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 claims 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 claims 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 claims 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 51
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 47
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 38
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 24
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 22
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 22
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 102100024360 Dual oxidase maturation factor 1 Human genes 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 11
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 9
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 4
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 4
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 4
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 3
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002133 (4-hydroxy-3-iodo-5-nitrophenyl)acetyl group Chemical group OC1=C(C=C(C=C1I)CC(=O)*)[N+](=O)[O-] 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 206010003402 Arthropod sting Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001672999 Escura Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 208000024711 extrinsic asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Fúzní proteiny, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká komplexů lidského IgG a antigenu/alergenu (nebo kombinace antigenů/alergenů)- Týká se fúzních proteinů obsahujících molekuly anti-CD32 a antigenu/alergenu (nebo kombinace antigenů/alergenů). Alergeny jsou v tomto textu definovány jako ancigeny, na které odpovídají atopičtí pacienti alergickými reakcemi. Antigeny, jak se používá v tomto textu, mohou být různého původu, např. alergeny ze životního prostředí (např. roztoči z domácího prachu, březový pyl, travní pyl, antigeny koček, antigeny švábů) nebo potravinové alergeny (např. kravské mléko, burské oříšky, garnáti, sója) nebo kombinace obou, nebo nerelevantni antigeny, jako je bovinni sérový albumin (BSA).
Dosavadní stav techniky
Alergie je nemoc, ve které protilátky IgE zprostředkovávají aktivaci efektorových buněk (mastocytů, bazofilů, eozinofilů), ale také zesilují prezentaci antigenu receptorům s nízkou a vysokou afinitou pro IgE (B buňky, monocyty, dendritické buňky). Tato činnost IgE může být odvrácena specifickými protilátkami IgG, které interagují s CD32 (FcyRII) jak na efektorových, tak na induktorových buňkách. Alergie může být tedy považována za nemoc s nerovnováhou mezi buňkami Thl a Th2. Úspěch protilátek IgG v působení proti IgE in vivo záleží na relativní koncentraci specifických IgE ke specifickým IgG, a také na izctypu IgG.
• ·
Všechny lidské izotypy mají pro CD32 může být překonána tvorbou alergenů netvoří komplexy s vazby s CD32.
aby umožnily stabilní
V současnosti molekulami
nízkou afinitu, kte alergenem, ale
IgG dostatečně jsou používány
Nejběžněj ší alergeny.
dva způsoby akriv „imunoterapie, která je odkázána na časté imunizace relativně vysokými koncentracemi antigenu. Tato technika je pouze průměrně účinná u menšiny alergických nemocí, jako je alergie na včelí bodnutí a v některých případech rýmy a konjunktivitidy a nedávno několik publikací ukázalo účinnost u astmatu a atopické dermatitidy. Pro podávání alergenů se klasicky používá subkutánní způsob, ale nedávno byl tento způsob srovnán s perorální aplikací a dokonce s lokální aplikací, výsledky jsou obecně pozitivní, ale ne vždy konzistentní. Novější přístup k imunoterapii, takzvaná technika dle Saint-Remyho (viz např. EP 0 178 085 a 0 287 361), používá autologní protilátky IgG soojené do komplexu s příslušnými antigeny in vitro. Tento přístuo umožňuje, že jsou aplikována malá množství alergenu s menšími vedlejšími účinky.
Mechanismus v pozadí obou terapií je nejasný. Zdá se, že při klasickém přístupu je prospěšné, jestliže léčba indukuje zvýšení specifických protilátek IgG, ačkoliv ne každé významné zvýšení specifických IgG je v korelaci s úspěšnou imunoterapii. Možnou příčinou je relativně nízká afinita protilátek IgG k CD32 na B buňkách, monocytech a mastocytech. Přístup Saint-Remyho vybírá pacientovy specifické protilátky IgG, které jsou následně míšeny s příslušnými antigeny in vitro. Tímto způsobem se zajistí, že alergen nemůže volně reagovat s buňkami nebo jinými protilátkovými izotypy na buňkách, jako je IgE na mastocytech. Kromě toho se pravděpodobně proti specifickým molekulám IgG získají antiidiotypové protilátky, které budou následně zabraňovat alergii, což nebylo dosud potvrzeno experimentálními výsledky.
Molekuly IgG jsou důležité v nasměrováni imunitní odpovědi od B buněk k monocytům. Proto by měl Saint-Remyho přístup fungovat, když se použije obecný alergen-soecifický IgG místo použití alergen-specifického IgG specifického pro dárce. Avšak problém Saint-Remyho přístupu leží v nízké afinitě lidských protilátek IgG pro své receptory Fcy na B buňkách, v kontrastu s IgE, který se snadno váže k téměř všem buňkám prezentujícím antigen, včetně B buněk, což vede k šíření aleraie a indukci buněk T’n2. Použiti komplexů bv mělo obejít problém nízké afinity kvůli zesílené aviditě komplexu ve srovnání se samotným,! molekulami IgG, avšak opět kombinace alergenu/IgG v komplexech je nevýhodná, protože přirozený počet epitopů alergenů pro vazbu lidských molekul IgG je méně než pět, což je příliš málo pro zesílení avidity komplexu pro receptory.
Podstata vynálezu
U předkládaného vynálezu jsou rizikové faktory klasické imunoterapie sníženy a obcházejí se problémy, na které se naráží při izolaci specifických molekul IgG, a nízká afinita těchto protilátek IgG pro CD32.
IgE navázaný na mastocyty a bazofily indukuje uvolňování histaminu, je-li obsazen antigenem. Kromě toho je IgE schopný zesílit prezentaci antigenu lidskými B buňkami (obrázek 1). Jinak v nepřítomnosti IgE B buňky špatně prezentuji antigen, kromě velmi malé části B buněk, která má specifický antigenní receptor. Vychytávání antigenu může nastat pinocytózou, což • · • · ale vyžaduje vysoké koncentrace antigenu a/nebo dlouhé inkubační časy.
Nd obrázku 2 je ukázáno, že pinocytóza alergenu po dobu delší než 5 dnů je schopna napodobit prezentaci antigenu zprostředkovávanou IgE, ale že prezentace antigenu zprostředkovaná IgG nevede ke stimulaci T buněk. Ve skutečnosti data naznačují, že vytvořením komplexu alergenu s IgG se zabrání prezentaci alergenu.
V další sérii pokusů byl studován vliv těchto komplexů IgG-alergen na prezentaci antigenu zprostředkovávanou IgE nebo na vychytávání alergenu pinocytózou. Na obrázku 3 je ukázáno, že komplexy IgG inhibují prezentaci antigenu zprostředkovávanou IgE způsobem závislým na dávce, a dále že je inhibována prezentace antigenu po pinocytóze. Tento účinek není antigen-specifický (komplexy IgG/BSA inhibují Der Pl-specifickou stimulaci), monomerické (ne v komplexu) IgG neinhibuje prezentaci antigenu.
Toxicita komplexů IgG/alergen je vyloučena pokusem ukázáními na obrázku 4. Komplexy IgG3-Der PÍ (pre)inkubované s lidskými monocyty jsou schopny indukovat normální odpověď T buněk. Toto naznačuje, že komplexy IgG/alergen inhibují prezentaci alergenu B buňkami a současně stimulují monocyty a dendritické buňky. Podobně protilátky aCD32 nebo agregované IgG, kterými jsou povlečeny dna jamek, ve kterých se provádí stimulace, inhibují také prezentaci antigenu B buňkami (obrázek 5). Účinnost, se kterou molekuly zaměřené na CD32 inhibují prezentaci antigenu, je nejpravděpodobněji závislá na množství obsazení vazeb molekuly CD32. Avšak zaměření antigenu na CD32 na B buňkách, jako v přirozených komplexech IgG/antigen (obrázek 2) nebo jako ve fúznich proteinech aCD32/antigen podle tohoto vynálezu (obrázky 13a a 13b) , nevede k antigenové prezentaci antigenu z komplexu. Na druhé • · • · · ·
straně stejné komplexy zaměřené na monocyty indukují ckou odpověď T buněk (obrázky 4, 13a a 13b) .
fenomén může být vysvětlen přítomností CD32B na B také dendritické buňky exprimují
CD32A. Proto komplexy IgG/antigen, a také fúzní proteiny aCD32/a.ntigen, směrují imunitní odpověď k buňkám monocytových linií a linií dendritických buněk, které indukují T buněčné odpovědi převážně B buněk typu Thl, a další APC (antigen presenting cell - buňka prezentující antigen), které predominantně exprimují CD32B, nebudou prezentovat antigen v komplexu, proto tyto komplexy zabraňují (další) indukci Th2 buněčné odpovědi B buňkami. Interakce mezi komplexem a CD32 nezávisí na intenzivním obsazení (více než 2 molekuly CD32), za předpokladu, že vazba komplexu je dostatečně silná, aby umožnila stabilní interakci. Ve skutečnosti bylo ukázáno, že vazba velmi velkých komplexů, které indukují mnohonásobné obsazeni CD32 (napodobené povlakem agregovaného IgG) na monocytech vede k utlumení společných receptorů („coreceptor), jako je CD80, důležitých pro antigen-specifickou stimulaci T buněk (tabulka 1).
Nezávisle na prezentaci antigenu komplexy IgG/antigen nebo fúzní proteiny aCD32/antigen podle vynálezu také inhibují tvorbu Ig normálními lidskými B buňkami. Na obrázku 14 je ukázáno, že tonzilární B buňky stimulované aCD40 a IL-4 v přítomnosti protilátek aCD32 nebo agregovaných povlečených lidských IgG, které účinně interagují s CD32, nejsou již schopny tvořit déle protilátky. Ošetření fragmenty F(ab) aCD32 je stejně účinné jako použití kompletních protilátek (obrázek 15), což naznačuje, že pro inhibici tvorby Ig po stimulaci aCD40 a
IL-4 není nutné obsazení receptoru.
buňky, které jsou stimulovány antigenem přes svůj B buněčný receptor (BCR) potřebují společné obsazení BCR a CD32.
• · · · • ·
Utlumeni tvorby Ig je reverzibilní a závislé na čase. Když se přidají protilátky aCD32 k B buňkám 4 dny po stimulaci aCD40 a IL-4, není pozorována žádná inhibice tvorby Ig. Na obrázku 16 je ukázáno, že také antigen-specifická indukce tvorby protilátek je ošetřením B buněk aCD32 inhibována.
V přírodě molekuly IgG řídí odpověď B buněk interakci s CD32. Zejména účinky protilátek IgE, které mají obecně pozitivní účinek na (CD23 pozitivní) B buňky, může být neutralizován molekulami IgG. Toto předchází hyperreaktivnim imunitním reakcím na antigeny v organismu. U alergie, kde jsou protilátky IgE přítomné v nadbytku, přirozené protilátky IgG při kontrole imunitní odpovědi jasně selhaly. Je zajímavé, že u člověka jsou IgE a IgG regulovány stejnými interleukinem, jmenovitě IL-4. Avšak IgG4 má nejnižší afinitu ze všech podtříd lidských IgG pro CD32.
Předkládaný vynález se týká fúzních proteinů obsahuj ících
a) jeden nebe· více antigenů a
b) jednu nebo více skupin, jako jsou z molekul protilátek, které interagují s lidským, receptorem Fcy tt (FcyRII) (CD32), v tomto textu krátce nazývané „fúzní proteiny podle vynálezu”.
Fúzni proteiny podle vynálezu překonávají problémy způsobené nízkou afinitou lidských molekul IgG k CD32. Kombinací protilátky aCD32 mající Kd<10-6 s antigenem, jsou získány oba, jak negativní (B buňky), tak pozitivní účinky přirozených molekul IgG, včetně selektivní stimulace imunitního systému vedoucí k paměťové indukci Thl/ThO v nepřítomnosti tvorby protilátky. Účinek je neškodný a směruje imunitní odpověď k buňkám prezentujícím antigen, které exprimuji CD32, pomocí něhož buňky, které predominantně exprimuji CD32A, zprostředkovávají prezentaci antigenů • · * *
vedoucí k indukci a aktivaci buněk Thl jako výsledek IL-12 tvořeného buňkami prezentujícími antigen, které exprimují /> O Q m
Fúzní proteiny podle vynálezu výhodně postrádají intenzivní obsazováni receptoru. Počet vazebných míst pro CD32 je výhodně omezen tak, že se zabrání utlumení stimulačních společných recectorů, jako je CD40, CD80 nebo CD86.
Proteiny také vyřazují efektorovou funkci mastocytů, které nesou části fúzniho proteinu specifické pro IgE. Mají následující jedinečné vlastnosti:
1) utlumení prezentace antigenu zprostředkovávané B buňkami (zastavení indukce buněk Th2),
2a) zastavení ořeoinací indukce IgE,
2b) zastaveni tvorby Ig v B buňkách,
3) stimulace kompartmentu T buněk interakcí s monocyty a/nebo dendritickými buňkami (stimulace buněk Thl), a
4) utlumení mastocytů ne fúzniho proteinu.
Obsahují a) jeden nebo více skupin z protilátek, receptorem Fcy II.
Části fúzniho proteinu, Fcy II, mohou být bud’
1) kompletní nebo nekomp ;oucich IgE specifické pro části více antigenu a b) jednu nebo které interagují s lidským které interagují s receptory .etní (modifikované) lidské nebo humanizované skupiny protilátek IgG, pokud je interakce s těmito receptory stále možná, což předpokládá, že by měl být přítomný celý fragment Fc nebo jeho část, nebo
2) lidské nebo humanizované skupiny protilátek aCD32, nebo jejich části, např. fragmenty Fab, které stále specificky rozpoznávají a vážou se k antigenu FcyRII (CD32), • · · · • · • · jak je exprimován na B buňkách, mastocytech, monocytech a dendritických buňkách,
| např. man | ipulované lidské | nebo | humanizované | skupiny |
| protilátek | aCD32 nebo IgG, | nebo | jOjZcn čast-L, | které |
| ro zpo znava j | i FcyRII (CD32) s | vyšší | afinitou než | nativní |
| protilátky | aCD32 nebe· IgG. | |||
| Antige | Ί y m o 'n o u b'/ z k q τρ o | 1 θ r í q h | proteinů nebo | jej leh |
sekvencích v
antigen, na jako jsou u atopické astmatu,
β. 1 e i c '^é rýmy e eíeroicke kori juvkřivítíhy. Neíbežneiší alergeny životního prostředí jsou: roztoči domácího prachu, březový pyl, travní pyl, kočka, šváb. Každý z těchto alergenů má jeden nebo více „hlavních alergenů (např. pro roztoče z domácího prachu je hlavní alergen Der Pl, pro březový pyl je hlavní alergen Bet VI). Avšak nejsou nutné kompletní antigeny, protože fúzní protein normálně indukuje pouze T buněčné odpovědi a T buňky odpovídáj i na malé (8 až 12 aminokyselin dlouhé) peptidy. Proto ve fúzním proteinu pro každý alergen může být zahrnut výběr T buněčných epitopů, čímž se snižuje velikost a molekulová hmotnost komplexu. Tak fúzní proteiny mohou být tvořeny z jednoho nebo více úseků DNA. obsahujících T buněčný epitop, spíše než z genů kompletních antigenů. Preferuje se překrývání zkříženě reagujících epitopů mezi alergeny. Fúzní protein by se měl specificky vázat k CD32 a obsahovat jeden nebo více např. dva nebo více T buněčných epitopů pro jeden nebo více antigenů/alergenů. Aby se umožnilo správné zpracování antigenů, měly by být výhodně v přípravě fúznícn proteinů použity úseky DNA o něco delší než aktuální T buněčný epitop.
» ·
Pro fúze s genem kódujícím protilátku aCD32 jsou výhodně použity krátké sekvence DNA, pocházející z klonovaných genů hlavních alergenů, jako je hlavní alergen I roztoče domácího prachu (Der Pí), nebo alergen březového pylu (Bet VI). Tyto krátké sekvence DNA obsahují genetický kód pro jeden nebo více T buněčných epitopů, zpracování objeví na které se po povrchu
a proto indukují imunitní odpověď v odpovídajících alergen-specifických T buňkách. Pro Der PÍ může být většina T buněčných epitopů nalezena v sekvenci v pozicích 101 až 143 v aminokyselinovém jednopísmenném kódu (sekvence s identifikačním číslem 1)
Q S C RR P N.AQ R FGIS N Y C QIY P P N ΑΝ KIR E AL AQ P Q R Y C R Η Y WT
101 110
120 130
140
Zejména aminokyselinová sekvence v pozicích 101 až 131 v aminokyselinovém jednopísmenném kódu (sekvence s identifikačním číslem 2):
QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREAL
101 110 120 130 obsahuje alespoň tři T buněčné epitopy, které se váží k několika molekulám HLA třídy II.
Fúze např. aCD32 a antigenu(ů) může být provedena buď na proteinové úrovni (chemická fúze) nebo genové úrovni (rekombinantní fúzní protein) a vynález také zahrnuje způsob tvoření fúzních proteinů, jak jsou definovány výše. To se provádí obvyklým způsobem a výhodně obsahuje použití techniky rekombinantních genů nebo chemické zesítění.
Preferují se rekombinantní fúzní proteiny.
Příprava používající techniku rekombinantních genů může být provedena známými metodami, např. následujícím způsobem: genový segment obsahující místo vázající antigen a části oblasti Fc orientované po směru (translace) k exonu CH2 monoklonální protilátky aCD32 (např. klon IV.3) je
amplifikován metodou polymerázcvé řetězové reakce (PCR; z např. cDNA IV.3 a klonován. Jako zdroj pro amplifikaci metodou PCR je purifikována příslušná RNA, např. pro amplifikace genu Der P1 z roztočů domácího prachu. Alergenový gen se liguje společně s izolovaným segmentem těžkého řetězce do příslušného savčího expresního vektoru, jako je o350. Kromě toho je izolován kompletní gen odpovídajícího lehkého řetězce z např. iv.3 a klonuje se do příslušného savčího expresního vektoru, jako je p345, který má charakteristické vlastnosti podobné p350. Oba rekombinantní plazmidy jsou použity pro společnou transfekci v např. buňkácn COS, aby se umožnilo uvolnění výsledného rekombinantního fúzniho proteinu do kultivačního média. Purifikace produktu se výhodně provádí imunoafinitní purifikací založenou na kolonách s protilátkou proti lehkému řetězci, které jsou snadno dostupné ve velkých množstvích.
Alternativně může být použita protilátka jednoduchého řetězce specifická pro CD32 (scFv) pocházející z příslušné fágové expoziční knihovny např. jak popsáno De Kruifem a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 3938-3942, pro vytvoření rekombinantního fúzního proteinu s geny klonovaných alergenů (obrázek 6) . Z fágů se extrahuje fragment DNA. a izoluje a klonuje se fragment DNA. obsahující semisyntetickou oblast VHDJH fúzovanou s jedním z řetězců VL přes flexibilní spojku (fragment scFv). Fúze s např. genem Der PÍ se provádějí za použiti definovaných syntetických oligonukleotidů kódujících T buněčné epitopy z Der PÍ a dalších hlavních alergenů vybraných pomocí svého vysokého (T buněčného) potenciálu zkříženě reagovat tak, aby se pokrylo co nejvíce pacientů jedním fúzním proteinem. Tyto oligonukleotidy jsou společně ligovány s protilátkovým fragmentem scFv do příslušného savčího expresního vektoru.
Rekombinantní vektor, např. plazmid, je trvale transfekován do příslušných buněk jako jsou COS a/nebo CHO a výsledný fúzni protein je purifikován z buněčného supernatantu např. imunoafinitni chromatografii, jak popsáno výše.
Výsledný rekombinantní gen může být exprimován např. v buňkách CHO, zejména pro produkci ve větším množství, avšak jsou také vhodné jiné systémy pro jeho tvorbu technikou rekombinantních genů, zejména když jsou použity pouze T buněčné epitopy, tj . není zde potřeba glykosylace. Protilátky aCD32 mohou být získány např. z fágové expoziční knihovny pro lidský Ig, která obsahuje pouze fragmenty F(ab> přirozené protilátky. Avšak zdroj genetického materiálu, který kóduje není kritický.
známými metodami, např.
Der Pl, použitím metod zesítěním pro fúzni popsaných může být také prováděna autory: Calsson a kol., (Biochem. J. , 173, 1978, 723-737) , Cumber a kol., (Meth.
Immunol.
Ve stručnosti, Der Pl a Mc.a-CD32 jsou
SPDP v molárních poměrech 1/20 a odděleně derivatizovány s
1/5 pro
2-pyridyldisulfidu. Po mírné redukci a chromatografii je Mc.a-CD32 derivatizovaný SPDP (jehož disulfidové skupiny jsou redukovány na skupiny) inkubován s Der Pl derivátizovaným SPDP v poměru 1/1,6. Výsledný produkt Der Pl-Mc.a-CD32 purifikován, např. aniontovou výměnnou
Výchozí látky vložení reziduí vysolení gelovou thiolové molárnim je poté produkt gelovou filtrací na např. Superose-12 a chromatografii na FPLC Mono-Q.
jsou bud’ známy nebo mohou být připraveny podle známých postupů nebo analogicky ke známým postupům nebo analogicky, jak je v tomto textu popsáno, např. v příkladech.
• · • ·
Fúzni proteiny podle vynálezu jsou použitelné pro prevenci a/nebo léčbu alergii, zejména potravinových alergii. Pro pacienty, kteří trpí anafylaktickou reakcí na konkrétní alergen, není neobvyklé, že mají takovou reakci také na jeden nebo více dalších alergenů. Způsobem předkládaného vynálezu je možné snížit citlivost takového pacienta, pokud jde o dva nebo více alergenů současně, podáváním fúzního proteinu zahrnujícího antigeny proti každému z těchto alergenů. Výhodně budou fúzni proteiny podle vynálezu použity pco prevenci a/nebo léčbu alergie u novorozenců, kteří jsou v riziku potravinové alergie např. na mléko, nebe u stanovených alergií pacientů s alergii proti alergenům, které jsou obsaženy v konkrétním použitém fúzním proteinu.
Pro tyto indikace bude příslušné dávkování ovšem kolísat v závislosti na například konkrétním použitém fúzním proteinu, hostiteli, způsobu aplikace a zamýšlené indikaci. Avšak všeobecně uspokojivé výsledky jsou dosaženy s jednou až třemi vakcinacemi v průběhu jednoho až dvou let, ale je-li nezbytné, mohou být provedeny opakované další vakcinace. Udává se, že pro tyto léčby mohou být podávány fúzni proteiny vynálezu v dávkách a aplikačních režimech, které jsou podobné obvykle používaným.
Vynález se proto také týká použití fúzního proteinu, jak je definován výše, v prevenci a/nebo léčbě alergií, včetně potravinových alergií, a způsobu léčby alergií, který obsahuje podávání pacientovi potřebujícímu takovou léčbu profylakticky nebo léčebně účinné množství fúzního proteinu, jak je definován výše, spolu s alespoň jedním obvyklým farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem, a také fúzni proteiny, jak jsou definovány výše, pro použití jako farmaceutický, zejména antialergický přípravek.
·«·· • »
Fúzní proteiny podle vynálezu mohou být míšeny s obvyklými farmaceuticky přijatelnými ředidly a nosiči a s dalšími excipienty dle volby a podávány parenterálně, intravenózně nebo enterálně, např. intramuskulárně nebo subkutánně. Koncentrace fúzního proteinu ovšem kolísají v závislosti na použité sloučenině, na požadované léčbě a na povaze farmaceutické formy.
Vynález tedy také zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující fúzní protein, jak je definován výše, společně s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
Dále se týká způsobu přípravy léčiva proti alergiím, který obsahuje smísení fúzního proteinu, jak je definován výše, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem, a použití fúzního proteinu, jak je definován výše, pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčbu alergií, včetně potravinových alergií.
V tomto textu jsou použity následující zkratky:
| áCD32 | protilátka k CD32 (protilátka anti-CD32) |
| Ag | antigen |
| APC | buňka prezentující antigen |
| BCR | B buněčný receptor |
| Bet VI | hlavní alergen březového pylu |
| BSA | bovinní sérový albumin |
| CNBR | cyanobromid |
| Der PÍ | hlavní alergen roztoče z domácího prachu (Dermatophagoides pteronyssinus) |
| DPT | antigen roztoče z domácího prachu |
| DTT | dithiotreitol |
| EBV | virus Epstein-Barrové |
• · ·
| ELISA | imunotest s enzymatickou detekcí |
| FACS | fluorescenční třídič buněk |
FcyRII lidský receptor Fcy II (= CD32
| FPLC | rychlá tlaková kapalinová chromatografie |
| GaM HAc | kozí protimyší protilátka kyselina octová |
| HLA | lidský leukocytární antigen |
| HPHT | hydroxyapatit |
| ±C | imunokomplex |
| ig | imunoglobulin |
| IL-12 | interleukin-12 |
| T C? rn J_jO -L | stimulační test lymfocytů |
| min | minuty |
| MR | molárni poměr |
| PBS | fyziologický roztok pufrovaný fosfátem |
| PCR | polymerázová řetězová reakce |
| p-NPP | p-nitrofenylfosfát |
| sd | směrodatná odchylka |
| SPDP | N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionát |
Popis obrázků
Obrázek 1: Vazba komplexů Der P1-(3)NIP k CD23 ve vztahu k prezentaci antigenu:
Panel A = fluorescence, panel B = proliferace.
EBV B buňky byly pulsně modulovány předformovanými IC (imunokomplexy), které se skládají z IgE v konstantní koncentraci (17,5 gg/ml, ·5,0 pg/ml,B2,5 gg/ml) a z Der Pl- (3)NIP v proměnlivých koncentracích.
V panelu A je ukázána vazba předformovaných IC k B buňkám. IC s totožnými MR jsou spojeny čarou a aktuální MR (0,1, 0,25, 0,5, 1, 7) je udán arabskými číslicemi u čáry.
• · · · · e · • » osy Y.
Vazba IgE dosáhla stabilní hladiny v ug/ml. Vazba IgE v nepřítomnosti Der v dolní části pravé
V panelu 3 je antigenu ozářenými EBVbyly pulsně modulovány týmiž IC. V tomto čáry koncer ukazují komplexy se zdůraznilo, tvořené totožnými emi IgE, nebyla ovlivněna MR imunokomplexů IC aby že prezentace antigenu
-r 1
0,96) . Také monomerické komplexy
Der P1-(3)NIP v každé čáře) byly účinně prezentovány T buňkám. Nebyla pozorována žádná stimulace T buněk jakoukoliv
IgE.
z triplikátu jamek).
Obrázek 2: Srovnáni prezentace antigenu B buňkami, které nebyly pulsně modulovány:
Volný Der P1-(2)NIP ponechaný v kultivačním médiu během celého stimulačního období indukoval stimulaci T buněk závislou na dávce. Autologní (ozářené) EBV-B buňky byly použity jako buňky prezentující antigen. IgE přítomný v komplexech nezvýšil významně prezentaci antigenu, ale oba IgGl a IgG3 přítomné v IC zabránily antigenové prezentaci Der P1-(2)NIP T buňkám, jak srovnáno s volným Der P1-(2)NIP. Výsledky jsou předloženy jako inkorporace 3H-thymidinu 5. den (průměr ± sd z triplikátu jamek).
Obrázek 3: Inhibice prezentace antigenu komplexy IgG-Der P1-(3)NIP:
V nepřítomnosti IgG3 je nalezena dobrá T buněčná stimulace, když jsou použity komplexy IgE-Der P1-(3)NIP. Titrace předformovaných komplexů IgG3-Der P1-(3)NIP ve • β · * stejném (1:1) poměru vede k inhibici prezentace antigenu zprostředkovávané IgE, která je závislá na dávce. Aby měly tento účinek, je potřebné, aby byly komplexy IgG3 přítomné v kultivačním médiu v době T buněčné stimulace. Preinkubace nebo· „impulsové modulováni B buněk komplexy IgG3 není úspěšné v důsledku nízké afinity IgG3 pro CD32 na B buňkách. Podobná inhibice se pozoruje u prezentace antigenu v nepřítomnosti IgE, a také s komplexy IgG3-BSA-(3)NIP.
Obrázek 4: prezentace antigenu čerstvými lidskými monocyty zprostředkovaná IgG3:
Lidské monocyty jsou pulsně modulovány předformovanými komplexy IgG3-Der Pl-(3)NIP (poměr 1:1) 1 hodinu na ledu v nepřítomnosti nebo přítomnosti nerelevantního agregovaného lidského IgG. Modulované monocyty jsou následně promyty a s klony T buněk souhlasnými v HLA-DP a specifickými a po 5 dnech se měří proliferace jako inkorporace prezentované lidskými T buněčnou odpověď, což ukazuje ukázána jako smiseny pro Der Pl, 3H-thymidinu. Komplexy IgG3 indukují alergen-specifickou být blokována agregovaným interakce IgG3 s monocyty. z triplikátu jamek.
igG,
Data jsou monocyty která může speciíitu průměr ± sd
Obrázek 5: DPT-specifická nebo agregovaného lidského
Lidské EBV B buňky bez (bílé sloupce) B buňky smíseny ? buněčného klonu proliferace:
IgG na prezentaci antigenu: j sou
T buněčná vliv aCD32 sloupce) nebo ozářeni jsou specifického pulsně modulovány s (černé 250 pg/ml DPT přes noc.
s T buňkami z Der
Po
Plánů a buňky se nechají 5 přítomnosti různých koncentrací protilátek GaM se pozoruje inhibice proliferace závislá λ účinek se pozoruje, když jsou kultivační
V nebo nespecifickým agregovaným lidským
IgG.
pocházejícími z • · • * • ·
fágové expoziční fágové expoziční
Sci. USA, j ak je popsáno De
Kruifem a kol.,
Proč. Nati. Acad.
3942. Avšak fragment aCD32 Fab může molekulou (nebo částí molekuly), interaguj e s lidskou kombinace proteinů, která způsobí obsahují T buněčné epitopy. Rekombinantní protein může být jakémkoliv dostupném expresním systému, na glykosylaci a dalších post-translačnich fúzní proteiny mohou být také použity u nemocí, které jsou charakterizovány (nadměrnou) tvorbou
Ig, jako revmatoidní artritida, akákoliv další nemoc, ve které hrají roli autoprotilátky.
nahrazeny jednoduchou nedefinovanou spojkou, aby se zkombinovaly dvě skupiny dosáhne oři nahrazení aCD32, avšak nejlepších výsledků se alergenu „autoantigenem, který způsobuje nemoc.
PÍ ve frakčních skupinách konjugátu
Der Pl--Mc.a-CD32 purifikovaného v Superose-12 testem ELISA
Obrázek 8: Stanovení Mc.a-CD32 ve frakčních skupinách konjugátu Der Pl--Mc.a-CD32 purifikovaného v Superose-12 testem ELISA • ·
Obrázek 9: Stanoveni konjugátu Der Pl—Mc.a-CD32 ve frakčních skupinách purifikovaných v Superose-12 testem ELISA:
Povlak: Mc.a-Der Pl.
ve tanov·
Obrá ν'
| nick | skt | i nac ii | purifikovaných v | Superose-12 teste | |
| Pcvla | r . o | c. a- | _ m ’ ; | ši IgG2b. | |
| θ k 11 | : Barvě | O 1 | frakcí ze skupin A, | B a C stříbrem: | |
| Dráha | 1 : | 350 | ng | Der Pl | |
| Dráha | z ; | 50 | ng | Mc.a-CD32 | |
| Dráha | 3 : | 500 | ng | standardu o vysoké | molekulové hmotnosti |
| Dráha | 4 : | 500 | ng | počáteční látka pro | Superose-12 |
| Dráha | 5: | 100 | ng | Superose-12 skupina | A |
| Dráha | 6: | 100 | ng | Superose-12 skupina | B |
| Dráha | / . | 200 | ng | Superose-12 skupina | C |
| D r a n a | 8 : | 250 | ng | standardu o vysoké | molekulové hmotnosti |
| Star | idard o vysoké molekulové hmotnosti: |
| 669 | kD: thyreoglobulin |
| 440 | kD: feritin |
| 232 | kD: kataláza |
| 140 | kD: laktátdehydrogenáza |
| 67 | kD: bovinní sérový albumin |
Obrázek
12: Barvení purifikovaného fúzního proteinu ze skupiny C stříbrem:
250 ng standardu o vysoké molekulové hmotnosti
Dráha 2:
ng látky purifikované na
FPLC-Mono-S.
·«··
Obrázky 13a a 13b: Ag-specifická T buněčná proliferace:
Obr. 13a: A.PC-MO 25049c a CFB4:2
13b:
Vliv moncmerického purifikovaného CD32/Der PÍ aCD32 (klon Medarex purif i kovaným Der PÍ byl specifického T buněčného
IV. 3} chemicky spojený s použit ke stimulaci Der Plklonu CFTS4:3.1, v různých koncentracích, za použití standardu LST (Van Reijsen, F.C. a kol., 1992, J. Allergy Clin. Immunol. 90, 184). V první sérii experimentů (obr. 13a) byly použity skupiny A a B z chemicky fúzovaných preparátů: skupina A. obsahující jeden pás o velikosti 700 kD (což jsou 2 molekuly aCD32 fúzované s 10 molekulami Der Pl) a skupina B skládající se ze dvou pásů 460 kD a 330 kD (což je 1 aCD32 fúzovaná s 10 Der Pl, a 1 aCD32 s 5 molekulami Der Pl).
Ve druhé sérii pokusů (obr. 13b) byl použit purifikovaný protein (CP230595) ze skupiny C, skládající se z jednoho pásu o velikosti 330 kD (1 molekula aCD32 fúzovaná s 5 molekulami Der Pl).
Monocyty a B buňky byly preinkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti s různými frakcemi, jak ukazuje obrázek. Jako kontrolní stimulace bylo k T buňkám a buňkám prezentujících antigen přidáno 100 μα/ml DPT během celého kultivačního období. T buněčná stimulace se měřila jako inkorporace 3H-thymidinu (průměr ± sd ze 4 jamek) po 5 dnech, jak popsáno (Van Reijsen a kol., výše). B buňky byly schopny stimulovat CFTS4.-3.1 s DPT, ale ne se skupinou k, B nebo C, zatímco monocyty byly schopny stimulovat CFTS4:3.1 s DPT a se skupinou A, B a C. Toto odpovídá předchozím nálezům s přirozenými komplexy IgG/alergen (Bheekha Escura, R. a kol.,
Immunology, 1995, 86, 343). Navíc to naznačuje, že pro antigenní stimulaci monocyty není nutné obsazení více než 2 molekul CD32, protože všechny frakce byly stejně účinné ve stimulaci T buněk.
Obrázek 14: Inhibice IgE a syntéza IgGl:
Purifikované lidské tonzilárni B buňky byly stimulovány aCD40 a IL-4, jak popsáno v práci Armerding, D., a kol.,
Immunobiology,
188, 1993, 259-2/3, v přítomnosti nepřítomnosti komerčně dostupných protilátek v udaných koncentracích.
aCD32 přidaných
tkáňových kultur testovány na obsah IgE a IgGl, jak popsáno (Armerding, D., a kol.,výše). Výsledky jsou ukázány jako tvorba protilátek ze tří spojených frakcí z devíti opakování (průměr ± sd) . Všechny protilátky aCD32
Inhibice igM a
IgE, a také IgGl, způsobem závislým, na dávce.
IgA byla srovnatelná.
Obrázek 15: Inhibice syntézy IgE:
Purifikované lidské tonzilárni B buňky byly stimulovány aCD40 a IL-4, jak popsáno v práci Armerding, D., a kol., výše, v přítomnosti a nepřítomnosti komerčně dostupné protilátky aCD32 (Medarex IV.3) nebo jejích fragmentů Fab, přidaných v udaných koncentracích. Po 9 dnech byly supernatanty z tkáňových kultur teszovány na obsah IgE a IgGl, jak popsáno (Armerding, D., a kol.,výše). Výsledky jsou ukázány jako tvorba protilátek ze tří spojených frakcí z devíti opakování (průměr ± sd). Jak kompletní protilátka, tak fragmenty Fab, z klonu Medarex IV.3, byly schopny inhibovat syntézu IgE (IgGl, IgM a IgA).
Obrázek 16: DPT specifická indukce IgE: vliv aCD32:
Lidské tonzilárni B buňky jsou pulsně modulovány s (černé sloupce) nebo bez (bílé sloupce) 250 ,ug/ml DPT přes • to • · · to · ·*« to • to « toto·· to to toto « 9 to * · 9 9 99
9 9 9 9 to · · · 9 99
9 9 9 9 9 to «· ··« ·· ·· ·«·· «· *· noc. Po ozářeni jsou B buňky smiseny s T buňkami z Der Plspecifického T buněčného klonu (CFTS4:3.1) a buňkám je umožněno 9 dnů proliferovat a tvořit protilátky. Po 9 dnech byly supernatanty z tkáňových kultur testovány na obsah IgE a IgGl, jak popsáno v práci Armerding, D., a kol., výše. Výsledky jsou ukázány jako tvorba protilátek ze tři spojených frakci z devíti opakování (průměr ± sd; . V přítomnosti různých koncentrací protilátek aCD32 je pozorována inhibice tvorby IgE závislá na dávce. To naznačuje, že dokonce u analogické interakce B a T buněk, protilátky aCD32 blokují syntézu protilátek.
V následujících příkladech, které ilustrují vynález, aniž by ho omezovaly, jsou všechny teploty ve stupních Celsia.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Příprava a purifikace Der Pl-monoklonálního anti-CD32 fúzního proteinu
A) Metoda:
Der PÍ je kovalentně konjugován k Mc.a-CD32 za použití SPDP, dvojfunkční spojovací reagencie. Ve stručnosti, Der PÍ a Mc.a-CD32 jsou odděleně derivátizovány s SPDP v molárních poměrech 1/20 a 1/5 pro vložení reziduí 2-pyridyldisulfidu. Po mírné redukci a vysolení gelovou chromatografií je Mc.aCD32 derivatizovaný SPDP (jehož disulfidové skupiny jsou redukovány na thiolové skupiny) inkubován s Der PÍ derivatizovaným SPDP v molárním poměru 1/1,6. Výsledný konjugát Der Pl--Mc.a-CD32 je purifikován gelovou filtrací na « ♦
Superose-12 a aniontovou výměnnou
Mono-Q.
B) Materiál:
a) SPDP: molekulová hmotnost 312,4, 25,61 mM zásobní roztek (8 mg/ml v dimetylformamidu, připravený bezprostředně před kopulační reakcí,
b) Der Pl: purifikovaný imunoafinitní chromatografií na Mc.aDer Pl (4C1/B8/3F8) kovalentně spojeného s CNBR-Sepharose 4B. Molekulová hmotnost 28 kD, izoelektrický bod 5,0 (PHAST-IEF) , sterilizován filtrací, naředěný v PBS,
c) monoklonální anti-CD32 (IV.3): izotyp: κ řetězec myšího IgG2b, molekulová hmotnost 150 kD, izoelektrický bod 6,2 (PHAST-IEF), purifikovaný ze supernatantu tkáňové kultury na Protein-A a HPHT a dialyzován proti PBS.
Reakční směs A:
K 1,2 ml roztoku Der Pl (0,84 mg) se přidá 23,4 ul zásobního roztoku SPDP (v nadbytku molárního dvacetinásobku) a směs se míchá v konické reakční zkumavce o objemu 2,5 ml (Pierce) po dobu 45 minut při teplotě místnosti (22°). Reakční směs se doplní na 2,5 ml PBS a nekonjugovaný SPDP a uvolněný N-hydroxysukcinimid se odstraní vysolením na vysolovací koloně Pharmacia PD-10 o objemu 9,1 ml pro jedno použití (Sephadex G-25), která je ekvilibrovaná 50 ml PBS. Po aplikaci je eluována frakce obsahující Der Pl aktivovaný
2-pyridyldisulfidem a sloučena s 3,5 ml PBS. Koncentrace je 0,17 mg/ml, což odpovídá 0,6 mg.
Stanovení stupně substituce 2-pyridyldisulfidem:
100 μΐ vzorku se doplní na 150 μΐ PBS a přidá se 50 μΐ 150 mM DTT, naředěného PBS. Koncentrace pyridin-2-thionu uvolněného po přidání DTT se určuje měřením absorbance ve
343 nm (molární extinkční koeficient: 8080 M cm 7 a oapovroa vloženými reziduím 2-pyridyldisulfidu. Substituční stupen ie vypočítán jako 1,5 mol 2-pyridyldisulf idu / mol Der PÍ z nárůstu OD 0,074 měřené při 343 nm (korigováno s ohledem na ředění).
Reakční směs B:
K 0,5 ml roztoku Mc.a-CD32 (4,2 mg) se přidá 5,5 μΐ zásobního roztoku SPDP (v nadbytku molárního pětinásobku) a směs se míchá po dobu 45 minut při teplotě místnosti. Reakční směs se aplikuje na vysolovací kolonu Pierce GF-5 o- objemu
2.5 ml pro jedno použití (ekvilibrovanou 10 ml 0,1 M pufru Na-acetát/HAc, 0,1 M NaCl, pH 4,5). Po aplikaci se eluuje vysolená frakce a sloučí se s 1,5 ml acetátového pufru (pH 4,5) a filtruje se na filtrační jednotce MILLEX-GV s velikostí pórů 0,22 jim (s nízkou vazbou proteinu).
Vložení skupin SH:
2-pyridyldisulfidové skupiny vázající protein jsou konvertovány na thiolové skupiny vázající protein redukcí s DTT. 1,5 ml vysoleného vzorku se inkubuje za míchání s 1 ml
62.5 mM DTT (ředěného acetátovým pufrem) při teplotě místnosti po dobu 30 minut (konečná koncentrace DTT je 25 mM) . Protože 2-pyridyldisulfidy zvyšují svoji elekrofilnost při kyselém pH, redukce může být stále prováděna při nízkém pH, kdy nejsou poškozeny nativní proteinové disulfidové vazby.
Pro nárůst OD 0,447 měřené při 343 nm je vypočten substituční stupeň jako 7 mol thiolových skupin / mol Mc.a-CD32.
Reakční směs se aplikuje na kolonu Pharmacia PD-10 (ekvilibrovanou 50 ml PBS) a po aplikaci je vysolená frakce eluována a sloučena s 3,5 ml PBS. Vzorek se koncentruje na 0,6 ml koncentrační jednotkou CENTRIPLUS-10 (membrána YM10;. Koncentrace je 3,1 mg/ml, což odpovídá 1,86 mg.
C) Kopulační postup:
3,3 ml (0,56 mg) Der PÍ (aktivovaného pyridyldisulfidem) a 0,6 ml (1,86 mg) Mc.a-CD32 (aktivovaného SH) se smísí a míchají v Pierceho reakční zkumavce o objemu 5 ml po dobu 2 hodin při teplotě místnosti (22°) a 15 hodin při teplotě +4°. Molární poměr Der P1 / Mc.a-CD32 v reakční směsi je 1,6/1. Kopulační reakce se monitoruje měřením zvýšení OD při 343 nm následkem nárůstu uvolněného pyridin-2-thionu:
| Čas | OD(343 nm) |
| začátek | 0,1112 |
| 15 min | 0,1257 |
| 30 min | 0,1342 |
| 4 5 min | 0,1412 |
| 60 min | 0,1470 |
| 7 5 min | 0,1519 |
| 120 min | 0,1590 |
| D) Purifikace | konj ugátu: |
| Superose-12: |
Reakční směs (3,9 ml) se filtruje filtrační jednotkou MILLEX-GV s velikostí pórů 0,22 um a koncentruje se na 0,5 ml koncentrační jednotkou Centriplus-10. Konečná koncentrace konjugátu je 3,7 mg/ml, což odpovídá 1,9 mg.
Vzorek se aplikuje na kolonu Superose-12 (HR10/30) (Pharmacia) ekvilibrovanou PBS. Objem vrstvy 24 ml, průtoková rychlost 0,2 ml/min, objem/frakce 0,4 ml, rychlost posunu zapisovače 1,5 mm/min, tlak 0,3 MPa, vlnová délka snímáni • ·
280 nm. Eluované frakce s vysokou molekulovou hmotností jsou rozděleny podle elučního profilu do 3 skupin:
| 1,2 | ml skupina A: | frakce | č. | 21-23 | ||
| 1,2 | ml skupina B: | frakce | č. | 24-26 | ||
| 1,2 | ml skupina C: | frakce | č. | 29-31 | ||
| S kupiny | jsou sterilizovány | filtrací | (MILLE | :x- |
velikosci pórů 0,22 ,um) a uskladněny za sterilních podmínek v +4°. Celková proteinová koncentrace je: skupina A: 100 μσ/ml, skupina B: 200 μς/ιηΐ, skupina C: 390 μσ/ml.
FPLC-Mono Q:
ml skupiny C (390 μς) se dialyzuje v pufru 20 mM ethanolamin/HCl, 0,01% NaN3, pH 9,0, a purifikuje se iontovou výměnnou chromatografii na aniontovém výměníku FPLC-Mono Q (HR5/5). Počáteční pufr A: 20 mM ethanolamin/HCl, 0,01% NaN3, pH 9,0, konečný pufr B: A + 0,5 M NaCl, pH 9,0, průtoková rychlost 1 ml/min, objem/frakce 1 ml, rychlost posunu zapisovače 5 mm/min, tlak 1,2 MPa, vlnová délka snímání 280 nm. Po aplikaci se nastartuje lineární gradientový program po· dobu 30 minut (konduktivita 50 - 1260 μΞ/οη). Příslušný vrchol se eluuje ve frakci č. 8 (ve 340 μ5/αη) . Proteinová koncentrace je 45 μς/ιηΐ (OD 280 nm, Ei% 14,0) . Vzorek se dialyzuje v PBS a sterilizuje filtrací. Proteinová koncentrace konečné purifikované látky je 20 μς/πιΐ (OD 280 nm) .
E) Analytická stanovení:
a) Konečná proteinová koncentrace:
Konečné proteinové koncentrace se stanovují podle standard se používá bovinní Ig.
Bradforda, za použití Protein Assay Kit I,
BIO-RAD, jako
b) Stanoveni Der Pl, Mc.a-CD32 a testem ELISA:
Testy ELISA na pevné mikrotitračních destičkách z PVC.
0,1 M NaHCO3/Na2CO3, 0,01% se použije promývacím biotinové
konjugátu Der P1--MC.a-CD32 fázi se
Povlakový provádějí na
NaN3, pH 9,6, PBS a 2% fetální roztok jako ředidlo
Substrát je telecí sérum v pro vzorky, mg/ml p-NPP jako promývací použije konjugáty.
diethanolamin/HCl, pH 9,8. Zastavovací pufru se a enzymové naředěný v pufru 1 M roztok je 2 M NaOH. Všechny inkubačni kroky se provádějí ve zvlhčované komoře. Zařízeni pro zpracováni vzorků a čtení OD Biomek-1000.
ve 405 nm je laboratorní stanice
Kvantitativní stanovení: Beckman
Beckman
Immunofit, křivky: křivkou se čtyřmi parametry.
B)l) Stanovení Der Pl (obr. 7):
(coating): 100 μΐ/jamku μς/ml přes noc ve +4°. Po promytí se přidá
Povlak
Mc.a-Der koncentraci
100 μΐ/jamku vzorku:
a)
Der Pl (výchozí látka pro spojování) (250-0,49 ng/ml) jako standard
Superose-12 skupina skupina skupina
Inkubace je 2 hodiny
100 μΐ/jamku Mc.a-Der Pl biotinem, naředěného 1/500 a
c)
d)
Superose-12
Superose-12 promytí se fosfatáza, přidá 50 μΐ/jamku naředěného 1/1000 (4000-7,81 ng/ml) (4000-7,81 ng/ml) (4000-7,81 ng/ml) +37°. Po promytí se přidá (4C1/B8/3F8) konjugovaného s inkubuje se 2 hodiny v +37°. Po konjugátu streptavidin-alkalická a inkubuje se 1 hodinu v +37°.
se přidá 100 μΐ/jamku substrátu, inkubuje se 60 minut ve 37° a reakce se zastaví. Kvantitativní vyhodnocení
Po promytí ze standardní křivky:
Superose-12 skupina A: 16,1 pg/ml • *
Superose-12 skupina B: 54,9 μρ/πιΐ
Superose-12 skupina C: 135 μς/ιηΐ
b)2) Stanovení Mc.a-CD32 (myší IgG2b) (obr. 8): Pc.a-myšího IgG2b (Southern) ve +4°. Po promytí se
Povlak: 100 μΐ/jamku kozího v koncentraci 5 pg/ml přes noc přidá
100 ul/jamk vzorku:
1, 96
Mc.a-CDJ2 (výchozí látka pro sp ng/ml) jako standard
A (8000-15,63 skupina
d) skupina
C (8000-15,63 přidá ng/ml) ng/ml) ng/ml)
Po promytí se (Southern) konjugovaného
1/1000 a inkubuje se 2 hodiny v +37°. co promyt se přidá inkubuje se 15 minut při teplotě
100 μΐ/jamku substrátu, místnosti a reakce se zastaví
Kvantitativní vyhodnocení ze
17,7
Superose-12 skupina
A:
SuOerose-12
B:
58,3
C:
Superose-12 skupina
Stanovení molárního poměru standardní křivky:
μρ/ιηΐ μς/πιΐ
190 μς/ΐΓί!
Der Pl /Mc.a-CD32 v konjugátu podle testu ELISA:
Superose-12 skupina
Superose-12 skupina
Superose-12 skupina
b)3) Detekce konjugátu Der
b)3)l) Povlak: Mc.a-Der Pl
Povlak: 100 μΐ/jamku pg/ml přes noc ve +4°.
vzorku:
4,9/1
5,0/1
Pl--Mc.a-CD32:
Po promytí se přidá 100 μΐ/jamku
a) Der PÍ (výchozí látka pro spojováni) (4000-7,81 ng/ml)
| b) | Superose-12 | skupina | A ( | 4000-7,81 ng/ml) |
| c) | Superose-12 | skupina | B ( | 4000-7,81 ng/ml) |
| d) | Superose-12 | skupina | C ( | 4000-7,81 ng/ml) |
| Inkubace | je 2 hodiny v | + 37 | °. Po promytí se přidá |
μΐ/jamku kozího Pc.a-myšiho IgG2b (Southern) konjugovaného s alkalickou fosfatázou, naředěného 1/1000 a inkubuje se 2 hodiny v +37°. Po promytí se přidá 100 μΐ/jamku substrátu, inkubuje se 30 minut při teplotě místnosti a reakce se zastaví. Na Mc.a-Der PÍ navázaný konjugát Der Pl--Mc.a-CD32 se detekuje oddělením Mc.a-CD32 v každé frakční skupině purifikované na Superose-12.
b)3)2) Povlak: Pc.a-myší IgG2b (obr. 10):
Povlak: 100 μΐ/jamku kozího Pc.a-myšiho IgG2b (Southern) v koncentraci 5 μς/ιηΐ přes noc ve +4°. Po promytí se přidá
| 100 μΐ/jamku | vzorku: |
| a) | Der PÍ (výchozí látka pro spojování) (1000-1,95 |
| ng/ml) | |
| b) | Superose-12 skupina A (8000-15,63 ng/ml) |
| c) | Superose-12 skupina B (8000-15,63 ng/ml) |
| d) | Superose-12 skupina C (8000-15,63 ng/ml) |
Inkubace je 2 hodiny v +37°. Po promytí se přidá 100 μΐ/jamku Mc.a-Der PÍ (4C1/B8/3F8) konjugovaného s biotinem (myší IgGl), naředěného 1/500 a inkubuje se 2 hodiny v +37°. Po promytí se přidá 50 μΐ/jamku konjugátu streptavidin-alkalická fosfatáza, naředěného 1/1000 a inkubuje se 1 hodinu v +37°. Po promytí se přidá 100 μΐ/jamku substrátu, inkubuje se 60 minut ve 37° a reakce se zastaví. Na Pc.a-myší IgG2b navázaný konjugát Der Pl--Mc.a-CD32 se
detekuže oddělením Der P1 v každé frakční skupině purif1 kované na Superose-12.
C; Stanovení molekulové hmotnosti konjugátu Der PÍ—Mc.a-CD32 nativní gradientovou elektroforézou v pólyakrylamidovém gelu:
Molekulová hmotnost konjugátů Der Pl--Mc.a-CD32 ve trakčních skupinách purifikovaných na Superose-12 se stanoví pomoci nativního gelu PHAST o gradientu 4 až 15 % (Pharmacia) (separační rozmezí: 1000 kD až 150 kD) srovnáním s nativními standardními proteiny s vysokou molekulovou hmotností (kit, Pharmacia).
Detekce: barvení stříbrem (Silver staining kit,
Pharmacia) (obr. 11)
Stanovení:
| Superose-12 | skupina | A | : pás | o | m. h. | 700 | kD | ||
| Superose-12 | skupina | B | : pás | o | m. h. | 460 | kD, | 330 | kD |
| Superose-12 | skupina | C | : pás | o | m.h. | 330 | kD, | 170 | kD |
| Molekulová hmotnost kon | eč | ného | konj ugátu | Der | Pl- | -Mc.a- |
CD32 purif ikovaného na FPLC-Mono Q je určena jako 330 kD (obr. 12).
F) Výsledky testu:
a) Antigen-specifická stimulace T buněčného klonu CFTS4:3.1 fúzním proteinem aCD32 Der Pl:
aCD32 (Medarex klon IV.3) chemicky spojený, jak uvedeno výše, s purifikovaným Der Pl, je použit ke stimulaci Der Pl specifického T buněčného klonu CFTS4:3.1 v různých koncentracích za použití standardního LST. V první sérii pokusů jsou použity skupiny A a B z chemicky fúzovaných preparátů, skupina A obsahuje jeden pás o velikosti 700 kD (2 molekuly aCD32 fúzované s 10 molekulami Der Pl) a skupina B • · ·· ·♦ • 4·· »t 9 ···· · · ·· • · · · · · · · · • ·«« · 9 · 99 9 99
9 9 9 9 9 9 99
999 99 99 9999 »··· se skládá ze dvou pásů, ve 460 kD a 330 kD (1 aCD32 s 10 Der Pl, a 1 aCD32 s 5 molekulami Der PÍ).
Ve druhé sérii pokusů je použit purifikovaný protein ze skupiny C, obsahující jeden pás o velikosti 330 kD (1 molekula aCD32 fúzovaná s 5 molekulami Der Pl). Monocyty a B buňky isou oreinkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti s různými frakcemi, jak je ukázáno na obrázcích 13a a 13b. Jako kontrolní stimulace je k T buňkám a buňkám prezentujícím antigen přidáno 100 μρ/ml DPT během celého kultivačního období. B buňky jsou schopné stimulovat CFTS4:3.1 s DPT, ale ne se skupinou A, B nebo C, zatímco monocyty jsou schopny stimulovat CFTS4:3.1 s DPT a se skupinami A, B a C. Toto potvrzuje dřívější nálezy s přirozenými komplexy IgG/alergen, které jsou zmíněny výše. Kromě toho to naznačuje, že pro antigenovou stimulaci monocyty není nutné obsazení CD32, protože všechny frakce stimulují T buňky stejně dobře.
b) Inhibice syntézy IgE:
Puritikované lidské tonzilární B buňky jsou stimulovány aCD40 a IL-4 v přítomnosti .neoří tomnosti komerčně dostupných protilátek aCD32, které jsou přidány v udaných koncentracích (obr. 14).
Po dnech jsou testovány supernatanty tkáňových kultur na obsah IgE a IgGl. Všechny protilátky aCD32 inhibují tvorbu IgE, a také IgG, způsobem závislými na dávce. Na obr. 15 je ukázáno, že dokonce fragmenty Fab z klonu Medarex IV. 3 jsou schopny inhibovat syntézu IgE. To naznačuje, že B buňky, které nejsou aktivovány přes své BCR, mohou být blokovány ve své protilátkové tvorbě monomerickou interakci s CD32. Pro B buňky, které jsou stimulovány způsobem antigen-specifickým, je nezbytné společné obsazení vazeb mezi CD32 a BCR. To naznačuje, že např. u alergie,· kde B buňky vychytávají
antigen (např. Der Pl) přes IgE a CD23, a následně se stávají stimulovanými Der Pl-soecifickými buňkami Th2, což vede ke tvorbě IgE B buňkami, mohou tyto B buňky ukončit činnost interakcí s CD32 na povrchu B buněk. Vskutku, dokonce u analogické interakce B a T buněk, blokují protilátky aCD32 protilátkovou syntézu (obr. 16).
Tabulka 1
| Stimulace | %CD80 | %CD40 | %HLA-DR |
| den 0 (čerstvě izolováno) | 1 | 26 | 99 |
| den í IFN-γ | 31 | 82 | 99 |
| den 1 IFN-γ + agregovaný IgG | 13 | 61 | 99 |
| den 1 IFN-γ + agregovaný IgG + aCD32 | 32 | 82 | 99 |
Monocyty (91 % CD14 pozitivních) získané od zdravého dárce elutriací jsou inkubovány se 100 U/ml IFN-γ po dobu 24 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti agregovaného lidského IgG v koncentraci 5 ug/ml (povlak v jamkách, přes noc ve 4°) a/nebo monoklonálního myšího anti-lidského aCD32 (Medarex IV. 3) v koncentraci 10 pg/ml, a následně obarveny pro určení uvedených markérů analýzou FACS. Zvýšení CD80 a CD40 indukované IFN-γ může být inhibováno silným obsazením receptorů Fcy agregovaným lidským IgG na monocytech. Preinkubace s aCD32 působí proti inhibici agregovaným lidským IgG, což naznačuje, že
1) inhibice agregovaným lidským IgG je zprostředkována CD32,
2) pouhá vazba na CD32 nezpůsobí utlumeni společných receptoru.
Exorese HLA-DR není ošetřením ovlivněna.
Průmyslová využitelnost
Předkládaný vynález se týká komplexů lidského IgG a antigenu/alergenu. Týká se fúzních proteinů obsahujících molekuly anti-CD32 a antigenu/alergenu. Alergeny jsou v tomto textu definovány jako antigeny, na které odpovídají atopičtí pacienti alergickými reakcemi. Vynález se také týká použití fúzního proteinu podle vynálezu v prevenci a/nebo léčbě alergií, včetně potravinových alergií, a způsobu léčby alergií, který obsahuje podávání pacientovi profylakticky nebo léčebně účinného množství fúzního proteinu podle vynálezu. Fúzni proteiny, jak jsou definovány výše, jsou vhodné pro· použití jako farmaceutický, zejména antialergický přípravek.
·· ·» ·· ·· • · · «··> ···· • · ·· · · · · · • · · · · · · ···· · ··*··· ··· ··· ·♦ ·· ···· ♦ ♦ ♦·
| c | 'Φ | ||
| •H | fa | ||
| • · | r-4 | 0 | |
| fa | Φ | 3 | |
| o | <n | (ΰ Ό | -<0 |
| z | >1 | β 0 | β |
| fa | Λ! | •H β | -3 |
| 0 | r-i 9 | β | |
| β | Φ Φ | N | |
| fa | rl | tn -m | Φ |
| cn | >1 | β |
| to | ||||
| r—< | ||||
| β | β | |||
| W in | 0) | |||
| H | ||||
| (ΰ | ||||
| <y | t—1 o | |||
| ω | < cn | |||
| o | β | |||
| f—1 | í—4 | |||
| ·· | H | 0 | ||
| rd | ||||
| — | >1 | tn | ||
| H | r~1 | |||
| ω | fa | o | ||
| 3 | CQ | |||
| β | Ή | (D | Φ | |
| rí | >u | Λ | :—1 | Λ |
| OT <n | S | ífa | H | |
| >1 | Ή | |||
| β | Z | tn | W | |
| 0 | >u | M o | >1 | |
| M Φ | tíj rH | F< | ||
| +J PU | H fa | β | β | |
| H | rH | m m | Sl | |
| <n | O | < CN | ||
| Φ | z | |||
| ú •rí | fa Q | (ΰ | 05 | W |
| 0 | H | 1—1 | r—1 | •H |
| tn | < | < | K | |
| <0 | cn | |||
| Λ & 0 P | w o 55 | β w | β w < | tn < |
| λ | 0 | 0 | W | |
| Φ Q | fa cn | μ | >1 | |
| cu | ífa | U |
CM (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
cd
C rl
CO
Φ 4J a
| •r4 | Λ | Λ | |||||
| rH | U | CL | |||||
| Φ | 0 | ||||||
| co | (ti | Ό | '«1 | -P | |||
| >1 | β | 0 | g | Ή | (ti | ||
| Λί | •H | β | 'iu | Ό | β | g | |
| 0 | Ό | c | •rl | >M | Q | ||
| c | Φ | Φ | N | 4J | 4J | Φ | |
| Ή | CD | •Γ1 | Φ | Λ | •rl | Q | |
| g | >1 | c | Φ Φ | β | |||
| ctí | Λί | CM C | CD | > | .. | ||
| 0 | • · | β | • · | cn | |||
| rM | C | w | .. .. | ·· 0 | g | ||
| cn | •rl | E | H | >4 'Kť | • · | P 2 | 5* |
| Ě | -2 | 0 | .4 £ | M | Em Pí | OT | |
| (u | l_4 | O | P L> | w | Z Q | H | |
| i4 | Μ H | % | ω n | 2 | |||
| • · | O | M Em | M | 2* | |||
| CM | CM | CM | .4 M | OT | 0 Ή | 0 | |
| M | >4 | >4 | O | 2 H | 1 | *5 !Z | Pí |
| Q | Em | Em | Em | 2 O | H | « Q | o |
| CM | Em | £ o | |||||
| CM >m | Z | > | |||||
| cti | o | a | >4 « | <! | CM ·& |
| >1 E- | ||
| β | β | |
| W | ιη | φ |
| < | τΗ | |
| μ | (ti | |
| Φ | γΗ ο | |
| ω | < m | |
| Φ | Ú | |
| rH | r-4 | |
| H | 0 | |
| >1 | 0 | |
| rH | μι | |
| 0 | < | |
| Φ | φ | |
| Λ | ι—I | |
| řh | Η | |
| Cd | W | |
| Ο | >1 | |
| τΗ | ||
| β | β | |
| rH | w ιη | |
| 0 | < CM | |
| (ti | (ti | |
| rH | rH | |
| < | < | |
| β | β | |
| ω | ω | |
| < | ||
| 0 | 0 | |
| Μ | Μ | |
| Ρ< | Ρμ | |
| 0 | 0 | |
| Μ | ||
| LD | £Μ | |
| μι | ||
| μι | >ιθ | |
| Em CM | ||
| W | Φ | |
| >1 | γΗ | |
| 0 | Η | |
| μι | β | |
| φ | Γ—1 | |
| ω | 0 | |
| β | « | |
| γΗ | >1 | |
| 0 | νΙ | 0 |
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Fúzni protein obsahujícía) jeden nebo více antigenů ab) jednu nebo více skupin inzeragujících s lidským receptorem Fcy II (FcyRII)
- 2. Fúzni protein podle nároku 1, ve kterém antigeny jsou alergeny atopické dermatitidy, alergického astmatu, alergické rýmy nebo alergické konjunktivitidy.
- 3. Fúzni protein podle nároku 1, který je tvořen z jednoho genů kompletních antigenu.ne ž
- 4. Fúzni protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 kterém skupiny interagující s FcyRiI jsou lidské nebo humanizované protilátky protilátek, které stále specificky rozpoznávají a váží se k antigenuFcyRII (CD32).kterém skupiny interagující sFcyRiI j sou lidské nebo humanizované protilátky IgG nebo části těchto protilátek, které stále interaguji s antigenem FcyRII (CD32).
- 6. Fúzni protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, ve kterém skupiny interagující s FcyRII jsou manipulované lidské nebo humanizované protilátky aCD32 nebo IgG nebo jejich části, které rozpoznávají FcyRII (CD32) s vyšší afinitou než nativní protilátky aCD32 nebo IgG.···· ··
- 7. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein podle nároku 1 spolu s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.Způsob přípravy fúzního proteinu podle nároku 1 vyznačující se m, že užívá techniku rekombinantních genů nebo chemické
- 9. Použití fúzního proteinu podle nároku 1 v prevenci a/nebo léčbě alergií (včetně potravinových alergií).
10. Použiti fúzního pr Oteinu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro prevenc i a/nebo léčbu alergií (včetně potravinových alergií). 11. Fúzní protein podle nároku 1 pro použití jako farmaceutický přípravek. - 12. Způsob léčby alergií vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, potřebujícímu tuto léčbu, profylakticky nebo terapeuticky účinného množství fúzního proteinu podle nároku 1 spolu s alespoň jedním obvyklým farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
- 13. Způsob přípravy léčiva proti alergiím vyznačující se t i m, že zahrnuje smísení fúzního proteinu podle nároku 1 s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9516760.7A GB9516760D0 (en) | 1995-08-16 | 1995-08-16 | Organic compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ43798A3 true CZ43798A3 (cs) | 1998-06-17 |
Family
ID=10779307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ98437A CZ43798A3 (cs) | 1995-08-16 | 1996-08-16 | Fúzní proteiny, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0846178A1 (cs) |
| JP (1) | JPH11513025A (cs) |
| KR (1) | KR19990036440A (cs) |
| CN (1) | CN1193353A (cs) |
| AU (1) | AU6873596A (cs) |
| BR (1) | BR9610239A (cs) |
| CA (1) | CA2227795A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ43798A3 (cs) |
| GB (1) | GB9516760D0 (cs) |
| HU (1) | HUP9802349A3 (cs) |
| IL (1) | IL122898A0 (cs) |
| NO (1) | NO980566L (cs) |
| PL (1) | PL324897A1 (cs) |
| SK (1) | SK19398A3 (cs) |
| TR (1) | TR199800214T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997007218A1 (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9724531D0 (en) | 1997-11-19 | 1998-01-21 | Smithkline Biolog | Novel compounds |
| WO1999028349A2 (en) | 1997-12-02 | 1999-06-10 | Medarex, Inc. | CELLS EXPRESSING ANTI-Fc RECEPTOR BINDING COMPONENTS |
| EP1221317A1 (en) * | 2000-12-28 | 2002-07-10 | SHAN-Beteiligungsgesellschaft m.b.H. | Vaccines containing hybrid polypeptides consisting of at least two different allergenic proteins |
| US8025873B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
| US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
| US8007805B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
| BG65715B1 (bg) * | 2003-09-04 | 2009-08-31 | Чавдар ВАСИЛЕВ | Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки |
| BG65954B1 (bg) * | 2005-01-05 | 2010-07-30 | Чавдар ВАСИЛЕВ | Средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни в-клетки |
| EP1829895A1 (en) * | 2006-03-03 | 2007-09-05 | f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Bispecific molecule binding TLR9 and CD32 and comprising a T cell epitope for treatment of allergies |
| US9636415B2 (en) | 2006-03-03 | 2017-05-02 | S-Target Therapeutics Gmbh | Bispecific molecule binding TLR9 and CD32 and comprising a T cell epitope for treatment of allergies |
| DK2861240T3 (da) | 2012-06-15 | 2020-09-28 | Immunomic Therapeutics Inc | Nukleinsyrer til behandling af allergier |
| US10434170B2 (en) | 2012-07-13 | 2019-10-08 | S-Target Therapeutics Gmbh | Immunoregulatory vaccine |
| WO2014067993A1 (en) * | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Veterinærinstituttet | New fusion proteins for the treatment of allergic diseases |
| US9005630B2 (en) | 2012-11-01 | 2015-04-14 | Veterinaerinstituttet | Fusion proteins for the treatment of allergic diseases |
| CA2912736C (en) | 2013-05-21 | 2021-09-07 | Tyg Oncology Ltd. | Gastrin peptide immunogenic composition |
| CN113186167B (zh) * | 2021-04-28 | 2021-11-30 | 中国食品药品检定研究院 | 用于测定抗cd20单克隆抗体药物adcp生物学活性的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994024281A1 (en) * | 1993-04-14 | 1994-10-27 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | T cell epitopes of the major allergens from dermatophagoides (house dust mite) |
| AU2670995A (en) * | 1994-05-26 | 1995-12-21 | Innogenetics N.V. | New methods and compounds for the selective modulation of antigen-specific t-cell responsiveness |
-
1995
- 1995-08-16 GB GBGB9516760.7A patent/GB9516760D0/en active Pending
-
1996
- 1996-08-16 JP JP9508953A patent/JPH11513025A/ja active Pending
- 1996-08-16 BR BR9610239A patent/BR9610239A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-08-16 HU HU9802349A patent/HUP9802349A3/hu unknown
- 1996-08-16 KR KR1019980701110A patent/KR19990036440A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-08-16 PL PL96324897A patent/PL324897A1/xx unknown
- 1996-08-16 EP EP96929263A patent/EP0846178A1/en not_active Withdrawn
- 1996-08-16 SK SK193-98A patent/SK19398A3/sk unknown
- 1996-08-16 TR TR1998/00214T patent/TR199800214T1/xx unknown
- 1996-08-16 IL IL12289896A patent/IL122898A0/xx unknown
- 1996-08-16 CN CN96196311A patent/CN1193353A/zh active Pending
- 1996-08-16 WO PCT/EP1996/003616 patent/WO1997007218A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-08-16 CA CA002227795A patent/CA2227795A1/en not_active Abandoned
- 1996-08-16 CZ CZ98437A patent/CZ43798A3/cs unknown
- 1996-08-16 AU AU68735/96A patent/AU6873596A/en not_active Abandoned
-
1998
- 1998-02-10 NO NO980566A patent/NO980566L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL122898A0 (en) | 1998-08-16 |
| NO980566D0 (no) | 1998-02-10 |
| MX9801253A (es) | 1998-05-31 |
| NO980566L (no) | 1998-02-10 |
| HUP9802349A2 (hu) | 1999-01-28 |
| HUP9802349A3 (en) | 1999-04-28 |
| EP0846178A1 (en) | 1998-06-10 |
| TR199800214T1 (xx) | 1998-06-22 |
| KR19990036440A (ko) | 1999-05-25 |
| CA2227795A1 (en) | 1997-02-27 |
| CN1193353A (zh) | 1998-09-16 |
| BR9610239A (pt) | 1999-06-15 |
| GB9516760D0 (en) | 1995-10-18 |
| JPH11513025A (ja) | 1999-11-09 |
| SK19398A3 (en) | 1998-09-09 |
| WO1997007218A1 (en) | 1997-02-27 |
| AU6873596A (en) | 1997-03-12 |
| PL324897A1 (en) | 1998-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6665139B2 (ja) | 新規ＶＩＳＴＡ−Ｉｇコンストラクト及び自己免疫、アレルギー性及び炎症性障害の処置のためのＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用 | |
| JP6917952B2 (ja) | 癌の診断および治療のためのｖｉｓｔａ調節剤 | |
| US12071473B2 (en) | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders | |
| KR100320631B1 (ko) | 항-Fc수용체항체로구성된치료화합물 | |
| RU2201766C2 (ru) | Мультиспецифическая или биспецифическая молекула (варианты), способ уничтожения или уменьшения количества клеток-мишеней в организме субъекта, способ лечения субъекта, инфицированного патогеном и способ вакцинации субъекта | |
| CN114929278A (zh) | 抗ccr8抗体及其用途 | |
| CZ43798A3 (cs) | Fúzní proteiny, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje | |
| CN111902428B (zh) | 一种双特异性抗体及其用途 | |
| JP2003520828A (ja) | Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用 | |
| JP2009515827A (ja) | 治療薬 | |
| KR20200113228A (ko) | 항-4-1bb 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 | |
| Zhang et al. | A recombinant human IgG1 Fc multimer designed to mimic the active fraction of IVIG in autoimmunity | |
| US5942229A (en) | Method for prolonged suppression of humoral immune response to a thymus-dependent antigen therapeutic agent | |
| AU6235800A (en) | Therapeutic compounds comprised of anti-fc receptor binding agents | |
| JP2840131B2 (ja) | 液性免疫の持続性抑制方法 | |
| CN110606892B (zh) | 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用 | |
| CN113412130A (zh) | 用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对促肿瘤癌症相关成纤维细胞的识别和靶向 | |
| KR20190063765A (ko) | 항-ceacam1 항체 및 이의 용도 | |
| CN117964767B (zh) | 抗rage抗体、细胞外囊泡及其制备方法和应用 | |
| TW202438531A (zh) | 抗ccr8抗體及其用途 | |
| CN118146376A (zh) | Hla-g抗体及其制备方法和用途 | |
| MXPA98001253A (en) | Allergen fusion proteins -xc |