CN118146376A - Hla-g抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
Hla-g抗体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种HLA‑G抗体及其制备方法和用途，属于生物医疗领域。更具体地，本发明涉及特异性结合HLA‑G的抗体或其抗原结合片段。还提供了该抗体或其抗原结合片段在预防、缓解和/或治疗癌症以及免疫病症药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗领域。更具体地，本发明涉及特异性结合HLA-G抗体或其抗原结合片段及其制备方法和用途，特别是在癌症以及免疫病症治疗中的用途。
背景技术
人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)是位于人第6号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)的I类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。
HLA-G分子的功能尚不清楚。有人认为它可能与血管生成和(或)胎盘形成有关,普遍接受的观点认为HLA-G是一种免疫耐受分子,可能与母胎耐受及抗感染免疫有关。大量的体内外实验及临床研究已证实这种观点，但也有少数报道否定上述观点，基于HLA-G是一种免疫耐受分子,其在习惯性流产，先兆子痫,感染性疾病，肿瘤和其他免疫相关性疾病发生中的作用，及在防治移植排斥反应中的应用受到关注。
有研究表明在癌症中，保护婴儿生长的HLA-G被肿瘤劫持，使其能够逃避免疫反应。HLA-G是一种肿瘤特异性抗原，在实体瘤中大量存在，但在主要健康组织中含量较低或缺失。因实体瘤约占所有癌症的90%，预期HLA-G将对绝大多数类型的癌症有效。
目前，本领域对HLA-G诸多方面研究还有许多的不足，没有广泛应用的HLA-G抗体药物产品，开发新的HLA-G抗体是治疗癌症以及自身免疫性疾病的迫切需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明创造性的提供一种特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段，该抗体具备高度的特异性和亲和力，能够阻断细胞与受体的结合，以及具备介导细胞内吞作用。同时，本发明还涉及特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗表达HLA-G的相关疾病的药物中的用途。
一方面，本申请提供一种特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，
所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示；
所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5、6所示。
在某些实施方案中，所述特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段包括SEQ IDNO:1所示的LCDR1，SEQ ID NO:2所示的LCDR2，和SEQ ID NO:3所示的LCDR3，或分别与所述LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至85%，86%，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段包括SEQ IDNO:4所示的HCDR1，SEQ ID NO:5所示的HCDR2，和SEQ ID NO:6所示的HCDR3，或分别与所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有至85%，86%，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体具有轻链和重链，所述轻链具有轻链可变区（VL）和轻链恒定区，所述重链具有重链可变区（VH）和重链恒定区。
在某些实施方案中，所述的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）包含分别与SEQ IDNOs: 7和8具有至85%，86%，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是鼠源、嵌合或人源化抗体。
在某些实施方案中，所述抗体为嵌合抗体。
在某些实施方案中，所述抗体进一步包含免疫球蛋白恒定区。
在某些实施方案中，所述恒定域选自IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD。
在某些实施方案中，所述恒定域为IgG1。
在某些实施方案中，所述的轻链和重链分别与SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10具有至85%，86%，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段具有介导细胞内吞作用。
在某些实施方案中，所述特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段具有细胞阻断功能，能够抑制与ILT2和/或ILT4的相互作用。
另一方面，本申请提供一种核酸分子，其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供一种载体，其包括本申请所述的核酸分子。
某些实施方案中，所述载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
另一方面，本申请提供一种宿主细胞，其包括本申请所述的分离的核酸分子，或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段，本申请所述的核酸分子，本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的组合物在制备药物中的用途。
某些实施方案中，所述药物用于预防和/或治疗表达HLA-G的相关疾病。
某些实施方案中，HLA-G相关疾病选自下组：癌症、病毒感染、移植物抗宿主病、炎症性疾病、免疫性疾病、或其组合。
某些实施方案中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。
另一方面，本申请提供一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本申请抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的组合物。
某些实施方案中，所述疾病为HLA-G相关疾病。
另一方面，本申请提供一种制备本申请所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得本申请所述的特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供一种抗HLA-G抗体在用于检测或监测生物样品中的HLA-G的体外诊断方法中的用途。
某些实施方案中，包括包含所述抗体的诊断试剂盒。
本发明提供的人源化特异性结合HLA-G的抗体及其制备方法，所提供的抗体特异性强，能够与人源和猴源的HLA-G蛋白均具有高度亲和力；所提供的抗体具备细胞阻断功能，能够抑制与ILT2和/或ILT4的相互作用；同时，所提供的抗体具备介导细胞内吞作用，细胞内吞效率大于43%。
附图说明
图1为抗体亲和力检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
术语“嵌合抗体”是指含有源自两种不同抗体的序列的抗体，所述抗体通常源自不同物种。例如，嵌合抗体包含人类和啮齿动物抗体片段，通常是人类恒定区和小鼠可变区。用于产生嵌合抗体的方法包含本领域一般技术人员已知的常规重组DNA和基因转染技术。
术语“抗体片段”指如本文所述抗体或抗体类物质的一部分，通常是指包括抗原结合部分或其可变区的部分。抗体片段可用任何方式来制造。例如，某些实施方式中，抗体片段可以通过将完整抗体或抗体类物质通过酶促或化学方法片段化来产生。或者，某些实施方式中，抗体片段可用重组技术产生(即通过工程化核酸序列的表达)。某些实施方式中，抗体片段可以全部或部分合成产生。某些实施方式中，抗体片段(尤其抗原结合性抗体片段)的长度可为至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190个氨基酸或更长，某些实施方式中至少约200个氨基酸。
术语“表达载体”或“载体”是指可将编码某蛋白的多核苷酸或核酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。
术语“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸或核酸和/或载体的细胞。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本申请中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
术语“治疗”是指减轻某种疾病或症状，降低某种疾病或症状兴起或发展的速度，减少发展出某种疾病或症状的风险，或延迟与某种疾病或症状相关的症状发展，减少或终止与某种疾病或症状相关的症状，产生某种疾病或症状的完全或部分的逆转，治愈某种疾病或症状，或以上的组合。
术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有家族病史的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在病征或症状发生前，特别是在具有风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“药物组合物”在此指这样的组合物即其中的活性物质与一种或多种药学上可接收的运载体配制在一起。某些实施方式中，组合物适合给予人或动物对象。某些实施方式中，活性物质以单位剂量存在，该单位剂量需适合在治疗方案中给药并在用于相关群体时显示出实现预定疗效的统计学显著性概率。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，其称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的确切边界根据不同的系统而不同定义。Kabat等人(Kabat et al , Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institutes of Health , Bethesda , Md .(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。每个互补决定区可以包含来自如由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基。Chothia等人(Chothia&Lesk , J .Mol . Biol ,196:901-917 (1987)和Chothia et al ., Nature 342:877-883 (−1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些子部分分别称为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。还有其它CDR边界定义可以不严格遵循上述系统之一，但是仍将与Kabat CDR重叠，本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。如本文所用，“抗体可变区”是指抗体分子的轻链和重链中包括互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。VH是指重链的可变域。VL是指轻链的可变域。
术语“EC50”，也称为半最大有效浓度，是指抗体或其抗原结合部分在特定暴露时间后在基线和最大值之间的中间诱导应答的浓度。
术语“受试者”包括人或非人动物。示例性人受试者包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人(称为患者)或正常个体。本发明中术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
实施例1 抗HLA-G抗体的制备
1.1 免疫原及受体的制备
将人HLA-G与β2M 以及抗原小肽作为MHC复合物表达，生成有活性的重组人HLA-G（SEQ ID NO:11）。并以该方式生成有活性的食蟹猴HLA-G（SEQ ID NO:12）。同时，构建二聚体ILT2-MFC（SEQ ID NO:13）以及ILT4-MFC（SEQ ID NO:14）。
1.2 HLA-G细胞系的生成
使用pLVX慢病毒载体转导K562慢性髓系白血病细胞 (ATCC，CCL-243)，以表达慢病毒颗粒(Genecopoeia)中的HLA-G1，并且培养于RPMI、10 ％FBS。在第一代中用0.5 μg/mL嘌呤霉素(索莱宝，P8230)进行选择以确保稳定的HLA-G表达。当细胞活率高于80 %，以每孔0.6个细胞进行单克隆铺板及筛选。挑选阳性率高于99 %或MFI比野生型高至少1个logshift的单克隆细胞并放大培养。
使用pLVX慢病毒载体转导CHOK1中国仓鼠卵巢细胞 (ATCC，CCL-61)，以表达慢病毒颗粒(Genecopoeia)中的HLA-G1-IRES(内部核糖体进入位点)-β-2-微球蛋白，并且培养于F12K、10 ％FBS。在第一代，用600 μg/mL遗传霉素(索莱宝，G8160)进行选择以确保稳定的HLA-G表达。当细胞活率高于80 %，以每孔0.5个细胞进行单克隆铺板及筛选。挑选阳性率高于99 %或MFI比野生型高至少1个log shift的单克隆细胞并放大培养。
1.3 小鼠免疫及杂交瘤筛选
取6-8周龄Balb/c、ICR、KM小鼠若干只，使用重组人HLA-G复合体以及重组食蟹猴HLA-G复合体进行免疫。初次免疫用抗原与完全弗氏佐剂（CFA）乳化后进行皮下免疫。在第14、28、42天时用抗原与不完全弗氏佐剂（IFA）乳化后进行腹腔免疫。第60天，采集尾血进行ELISA和FACS检测。
用JEG-3细胞(ATCC，HTB36)(天然表达HLA-G)进行FACS检测。根据阴性对照，依次检测待测样本及阳性。最终选择ELISA效价最好，且FACS阳性的小鼠进行冲刺免疫。冲刺阶段使用过表达细胞CHOK1-HLAG-B2M进行冲刺免疫。
无菌操作获得小鼠脾细胞并进行单个细胞技术，与骨髓瘤细胞按照1：1的比例混合后电融合。培养7-10天经ELISA和FACS检测筛选，选取与重组人HLA-G复合体、重组食蟹猴HLA-G复合体、过表达细胞K562-HLAG、JEG-3细胞结合的杂交瘤细胞进行2-3轮的克隆。最终选取与重组人HLA-G复合体、重组食蟹猴HLA-G复合体、过表达细胞K562-HLAG、JEG-3细胞结合的杂交瘤单克隆细胞，冻存保存。
1.4 杂交瘤细胞序列分析
将放大培养获得杂交瘤单克隆细胞进行TRIzol裂解，mRNA，再进行cDNA以及RACE扩增，确定轻重链的类型。并将阳性单克隆进行测序分析，根据测序结果进一步分析，排除重复序列、具有高风险的翻译后修饰位点的序列、含有未配对半胱氨酸的序列等，最终获得候选分子的重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列。
1.5 嵌合抗体制备
Anti-HLAG抗体(以下称为N1抗体)轻链和重链可变区基因（SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16）与库存的pcDNA3.1-hIgG1、pcDNA3.1-CK进行PCR基因桥接，获得全长的重、轻链，并分别克隆至pcDNA3.4载体中。
使用PEI转染的方法将质粒pcDNA3.4-N1-HC和pcDNA3.4- N1-LC共转入Expi-CHO细胞。转染后，置于37 ℃、8 % CO2、120 rpm振荡培养16-20小时。向摇瓶中添加7.5 %（v/v）补料后将摇瓶放于32 ℃、120 rpm、8 %CO2振荡培养。转染后第3天、5天分别补加7.5 %（v/v）补料，糖含量保持在4 g/L以上。当细胞活率低于60 %时收获细胞上清，离心过滤后经过ProteinA亲和纯化，得到N1抗体。
N1抗体的轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1~3（Kabat编号），SEQ ID NO:17~19（Chothia编号）；重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4~6（Kabat编号），SEQ ID NO:20~22（Chothia编号）；轻链可变区（VL）序列：SEQ ID NO:7；重链可变区(HL)序列：SEQ ID NO:8，轻链序列：SEQ ID NO:9；重链序列：SEQ ID NO:10。详细结果见表1所示。
表1 N1抗体氨基酸序列
阳性对照抗体参照上述方法制备获得，轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18。
实施例2 抗体结合能力分析
分别包被重组人HLA-G复合体以及重组食蟹猴HLA-G复合体，并使用2 % BSA封闭。将抗体稀释为10 ug/mL，再进行5倍梯度稀释并加入酶标板，设置阳性对照。在37 ℃孵育40分钟后洗板并使用封闭液按1/8000比例稀释HRP-羊抗人IgG进行孵育。在37 ℃孵育30分钟后洗板并使用100 μL TMB显色液进行显色。37 ℃显色10分钟后每孔加入50 μL终止液进行终止。最后使用酶标仪，在450 nm处测OD值，详细结果见表2和图1所示。
表2 抗体亲和力检测
上述结果表明，在分子水平上，N1抗体的与Human HLA-G 结合的EC50约为159 ng/mL，N1抗体的与Cyno HLA-G结合的EC50约为126.3ng/mL。说明本申请N1抗体能够特异性地结合HLA-G，并且结合的EC50高于阳性对照抗体。
将N1抗体和阳性对照抗体稀释为10 ug/ml，按每个待测样品准备2E5个细胞计算，取出相应数量JEG-3细胞、K562细胞、K562-HLAG细胞、CHOK1细胞、CHOK1-HLAG-B2M细胞进行FACS检测。根据阴性对照，依次检测待测样本及阳性对照，详细结果见表3所示。
表3 抗体细胞结合力检测
上述结果表明，在细胞水平，本发明N1抗体能够特异性地结合天然高表达细胞（如JEG-3细胞）和过表达细胞（如K562-HLAG细胞、CKO-K1-HLAG-B2M细胞）。并且，N1抗体在结合天然高表达细胞（如JEG-3细胞）方面优于阳性对照抗体。
实施例3 细胞阻断实验
将N1抗体、阳性对照抗体和阴性对照稀释为50 ug/mL，将受体ILT2-MFC、ILT4-MFC稀释为100 ug/mL。按每个待测样品准备6E5个细胞计算，取出相应数量CHOK1-HLAG-B2M细胞进行阻断检测。将抗体与细胞悬液1:1混匀并在室温孵育30分钟，完成后洗净抗体并将细胞一分为二，分别加入50 uL受体ILT2-MFC、ILT4-MFC室温孵育30分钟。完成后洗净受体，并按1/50比例稀释荧光二抗（抗鼠IgG）进行孵育。在室温孵育30分钟后洗净二抗，并上机检测，详细结果见表4。
表4 细胞阻断检测
上述结果表明，N1抗体阻断过表达细胞（如CKO-K1-HLAG-B2M细胞）与受体ILT2结合的百分率为97.97 %；阻断过表达细胞（如CKO-K1-HLAG-B2M细胞）与受体ILT4结合的百分率为77.46 %。
可以看出，N1抗体能够阻断HLA-G与受体ILT2及ILT4的结合，阻断百分率分别大于97 %和77 %。并且N1抗体在阻断过表达细胞（如CKO-K1-HLAG-B2M细胞）与受体ILT4的结合方面优于阳性对照抗体（阳性对照抗体阻断率为63.52 %）。
实施例4 细胞内吞实验
将N1抗体、阴性对照稀释为50 ug/mL，按每个待测样品准备6E5个细胞计算，取出相应数量JEG-3细胞进行内吞检测。
将抗体与细胞悬液1:1混匀并在4 ℃避光孵育1小时。完成后洗净抗体并将细胞一分为二，分别放在4 ℃以及37 ℃孵育4小时。孵育完成后清洗细胞，并按1/50比例稀释荧光二抗（抗人IgG）进行孵育。在4 ℃避光孵育30分钟后洗净二抗，并使用流式细胞仪检测，详细结果见表5所示。
表5 抗体细胞内吞检测
上述结果表明， N1抗体具有介导细胞内吞的作用，并且内吞率大于43 %。
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种能够特异性结合HLA-G的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，其中，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1、2、3所示；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4、5、6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段是鼠源、嵌合或人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，进一步包含免疫球蛋白恒定区，其中所述恒定域选自IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，具有SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的重链。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
7.一种载体，其包含根据权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子，或权利要求7所述的载体。
9.一种药物组合物，包括：权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体和/或权利要求8所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
10.一种权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的细胞和/或权利要求9所述的组合物在制备用于治疗表达HLA-G的相关疾病的药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |