JPH11513025A

JPH11513025A - アレルゲン−ｘｃｄ３２融合タンパク質

Info

Publication number: JPH11513025A
Application number: JP9508953A
Authority: JP
Inventors: ムッデ，ヘールト・セー
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1995-08-16
Filing date: 1996-08-16
Publication date: 1999-11-09
Also published as: MX9801253A; SK19398A3; WO1997007218A1; BR9610239A; HUP9802349A2; IL122898A0; EP0846178A1; GB9516760D0; NO980566D0; CZ43798A3; TR199800214T1; CN1193353A; AU6873596A; HUP9802349A3; PL324897A1; NO980566L; CA2227795A1; KR19990036440A

Abstract

(57)【要約】１またはそれ以上の抗原およびヒトＦcγレセプターII(ＦcγＲII)(ＣＤ３２)と相互作用する１またはそれ以上の部分を含んでなる、融合タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】アレルゲン−ＸＣＤ３２融合タンパク質本発明は、ヒトＩgＧと抗原／アレルゲン（または複数の抗原／アレルゲンの組み合わせ）の複合体に関する。それは、抗−ＣＤ３２分子と抗原／アレルゲン（または複数の抗原／アレルゲンの組み合わせ）との融合タンパク質に関係する。アレルゲン類は、ここでは、アトピー患者がアレルギー反応を示す抗原と定義される。ここで使用した抗原類は、様々な起源のものであることができ、例えば、環境アレルゲン類（例えば、家内塵（ハウスダスト）ダニ、シラカンバ花粉、草本花粉、ネコ抗原、ゴキブリ抗原）、または食物アレルゲン類（例えば、牛乳、ピーナッツ、エビ、大豆）、またはこの両アレルゲンの組み合わせ、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの関連のない抗原である。アレルギーは、ＩgＥ抗体がエフェクター細胞（マスト細胞、好塩基球、好酸球）の活性化を媒介するだけでなく、さらにＩgＥに対する低親和性および高親和性レセプター（Ｂ細胞、単球、樹状細胞）による抗原提示を増強する疾患である。ＩgＥのこれらの作用は、エフェクター細胞およびインデューサー細胞のいずれにおいてもＣＤ３２（ＦcγＲII）と相互作用する特異的ＩgＧ抗体により中和され得る。従って、アレルギーは、Ｔｈ１細胞対Ｔｈ２細胞の不均衡を伴う疾患とみなすべきである。インビボでＩgＧがＩgＥをうまく中和するかどうかは、特異的ＩgＧに対する特異的ＩgＥの相対濃度、更にはＩgＧのアイソタイプに依存する。ヒトアイソタイプは全てＣＤ３２に対する親和性が低く、これはアレルゲンとの複合体形成により克服できるのであるが、多くのアレルゲンはＩgＧ分子とはＣＤ３２と安定に結合できる十分な大きさの複合体を形成しない。現在までのところ、アレルゲンを使用する２形態の能動的予防接種が採用されている。最も一般的なのは、いわゆる“免疫療法”であり、相対的に高濃度のアレルゲンによる頻繁な免疫化に頼るものである。この技術は、ハチアレルギー（ bee sting allergy）などの少数のアレルギー疾患において、鼻炎および結膜炎などの場合に適度に効果的であるにすぎず、最近になって、喘息やアトピー性皮膚炎における有効性を示す幾つかの報告がなされた。古典的に、アレルゲンの投与には皮下経路を使用するが、最近、この経路が経口施用あるいは局所施用とも比較されたところ、その結果は全体的に陽性ではあるが、必ずしも首尾一貫しているとはかぎらない。免疫療法のもっと最近のアプローチ、いわゆる、Sanint-Rem y技術（例えば、ＥＰ０１７８０８５号および０２８７３６１号参照）は、インビトロで関連アレルゲンと複合体形成した自己ＩgＧ抗体を使用するものである。このアプローチは、はるかに少量のアレルゲンをより少ない副作用で適用可能にするものである。これらの療法の背景にある機構はいずれも不明である。古典的なアプローチでは、その療法が特異的ＩgＧ抗体の増大を誘導する場合は有益な作用であると思われるが、特異的ＩgＧの顕著な増大がことごとく有効な免疫療法と相関するとは限らない。これについて考えられる理由は、Ｂ細胞、単球およびマスト細胞上のＣＤ３２に対するＩgＧ抗体の親和性が相対的に低いことである。Saint-Remy アプローチは、患者由来の特異的ＩgＧ抗体を選択し、これを続いて、関連アレルゲンとインビトロで混合する。こうして、アレルゲンが細胞または細胞上の他の抗体アイソタイプ、例えば、マスト細胞上のＩgＥと反応できないことを確約している。更に、抗イディオタイプ抗体が恐らく特異的ＩgＧ分子に対して生じ、その結果アレルギーを妨害するであろうが、このことは、実験データでは確認されていない。ＩgＧ分子は、免疫応答をＢ細胞から単球へと伝えるのに重要である。故に、S aint-Remyアプローチは、一般的なアレルゲン特異的ＩgＧをドナー特異的アレルゲン特異的ＩgＧの代わりに使用するときに役立つべきである。しかしながら、S aint-Remyアプローチには、Ｂ細胞上のＦcγレセプターに対するヒトＩgＧ抗体の親和性が低いという問題があり、これはＢ細胞を含む殆ど全ての抗原提示細胞と容易に結合するＩgＥとは対照的であって、アレルギーの蔓延およびＴｈ２細胞の誘導を導く。複合体を使用すれば、単一のＩgＧ分子に比べ複合体のアビジティーが高められるため、低親和性の問題を回避できるであろうが、それでも、複合体におけるアレルゲン／ＩgＧの組み合わせは、ヒトＩgＧ分子を結合させるアレルゲンの抗原決定基の自然数が５以下であり、レセプターに対する複合体のアビジティーを高めるにはあまりにも少ないため、好ましくない。本発明では、従来の免疫療法の危険因子を低減し、特異的ＩgＧ分子を単離する際に生じる問題およびこれらのＩgＧ抗体のＣＤ３２に対する低親和性を回避する。マスト細胞および好塩基球に結合したＩgＥは、抗原が架橋結合するとヒスタミン放出を誘発する。更に、ＩgＥは、ヒトＢ細胞による抗原提示を増強できる（図１）。言い換えれば、ＩgＥの不在下ではＢ細胞は、ほんの少しのＢ細胞を除いて、特定の抗原レセプターを有する貧抗原提示細胞である。抗原取り込みは、飲作用（ピノサイトーシス）により起こり得るが、これは、高い抗原濃度および／または長いインキュベーション時間を要する。図２には、アレルゲンの飲作用が５日にわたり、ＩgＥ媒介抗原提示を模擬できるが、ＩgＧ媒介抗原提示は、Ｔ細胞刺激を導かないことが示されている。事実、このデータは、アレルゲンとＩgＧとの複合体形成によりアレルゲン提示が妨害されたことを示す。その他一連の実験では、これらのＩgＧ−アレルゲン複合体のＩgＥ媒介抗原提示に対する、または飲作用によるアレルゲン取り込みに対する影響を研究した。図３には、ＩgＧ複合体が、用量依存的にＩgＥ媒介抗原提示を阻害し、更には飲作用後の抗原提示も阻害することが示されている。この作用は、抗原特異的ではなく（ＩgＧ／ＢＳＡ複合体はＤerＰ１−特異的刺激を阻害する）、単量体（非複合体）ＩgＧは抗原提示を阻害しない。ＩgＧ／アレルゲン複合体の毒性は、図４に示した実験により除外される。ヒト単球と共に（プレ）インキュベーションしたＩgＧ３−ＤerＰ１複合体は、正常Ｔ細胞応答を誘導できる。このことは、ＩgＧ／アレルゲン複合体がＢ細胞によるアレルゲン提示を阻害し、同時に単球および樹状細胞を刺激することを暗示している。同様に、ウェル底にコーティングしたaＣＤ３２抗体または凝集ＩgＧもまた、そのウェルに刺激を与えると、Ｂ細胞による抗原提示を阻害する（図５）。ＣＤ３２標的化分子が抗原提示を阻害するその効率は、ほとんどＣＤ３２分子の架橋結合量に依存するようである。しかしながら、抗原の標的をＢ細胞上のＣＤ３２とすると、天然ＩgＧ／抗原複合体におけるように（図２）または本発明のaＣＤ３２／抗原融合タンパク質におけるように（図１３aおよび１３b）、複合体中の抗原の抗原提示を導かない。その一方で、同じ複合体でも単球を標的とするものは、抗原−特異的Ｔ細胞応答を誘導する（図４、１３aおよび１３b）。この現象はＢ細胞上にＣＤ３２Ｂが存在すること、それに対して単球、更には樹状細胞がＣＤ３２Ａを発現することによって説明できる。故に、ＩgＧ／抗原複合体、並びに、ａＣＤ３２／抗原融合タンパク質は、免疫応答を、主にＴｈ１タイプＢ細胞のＴ細胞応答を誘導する単球および樹状細胞系譜の細胞へと伝えるものであり、またＣＤ３２Ｂを優勢的に発現するその他のＡＰＣは複合体中の抗原を提示しないであろうから、よって、これらの複合体はＢ細胞による（更なる）Ｔｈ２細胞応答の誘導を妨害する。複合体とＣＤ３２との相互作用は、複合体の結合が安定に相互作用できる程十分に強ければ、重架橋結合(heavy cross-linki ng)(ＣＤ３２２分子以上)に左右されない。実際、単球細胞上でのＣＤ３２の多重架橋結合（コーティングした凝集ＩgＧにより模擬される）を誘導する非常に大きな複合体の結合は、Ｔ細胞の抗原特異的刺激に重要なＣＤ８０などのコレセプター（co-receptors）のダウンレギュレーションを導くことが示されている（表１）。抗原提示とは別に、ＩgＧ／抗原複合体または本発明のaＣＤ３２／抗原融合タンパク質はまた正常ヒトＢ細胞によるＩg産生も阻害する。図１４には、aＣＤ３２抗体またはコーティング化凝集ヒトＩgＧの存在下、aＣＤ４０およびＩＬ−４で刺激した扁桃Ｂ細胞は、ＣＤ３２と効率よく相互作用するが、もはや抗体を産生できないことが示されている。aＣＤ３２Ｆ(ab)フラグメントでの処理は、完全な抗体の使用と同程度に効率よく（図１５）、aＣＤ４０およびＩＬ−４刺激後のＩg産生の阻害には、レセプターの架橋結合は必要でないことを示している。Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）を介して抗原により刺激されるＢ細胞は、ＢＣＲおよびＣＤ３２の架橋結合を必要とする。Ｉg産生のダウンレギュレーションは、可逆的かつ時間依存的である。aＣＤ４０とＩＬ−４で刺激後４日目にaＣＤ３２抗体をＢ細胞に加えると、Ｉg産生の阻害はみられない。図１６には、抗体産生の抗原特異的誘導もまた、Ｂ細胞のaＣＤ３２処理により阻害されることが示されている。自然の状態では、ＩgＧ分子はＣＤ３２との相互作用によりＢ細胞の応答を制御する。特に、ＩgＥ抗体の作用は、一般に（ＣＤ２３ポジティブ）Ｂ細胞に対するポジティブ作用を有するが、ＩgＧ分子により中和され得る。これにより、生物体の抗原に対する過反応性免疫反応を妨げる。アレルギーでは、ＩgＥ抗体が豊富に存在するので、天然ＩgＧ抗体が免疫応答を制御できないのは明らかである。興味深いことに、ヒトの場合、ＩgＥおよびＩgＧ４は同じインターロイキンにより、即ち、ＩＬ−４により調節される。しかしながら、ＩgＧ４は、全てのヒトＩgＧサブクラスの中でもＣＤ３２に対して最も親和性が低い。本発明は、ａ）１またはそれ以上の抗原、および、ｂ）ヒトＦcγレセプターII(ＦcγＲII)(ＣＤ３２)と相互作用する、例えば、抗体分子由来の、１またはそれ以上の部分を含んでなる融合タンパク質に関し、本明細書では、簡単に“本発明の融合タンパク質”と称する。本発明の融合タンパク質は、ヒトＩgＧ分子のＣＤ３２に対する親和性の低さに起因する問題を克服するものである。Ｋ_d＜１０^-6を有するaＣＤ３２抗体と抗原を結合させることにより、抗体産生の不在下、Ｔｈ１／Ｔｈ０メモリー誘導を導く免疫系の選択的刺激を含む、天然ＩgＧ分子のネガティブ（Ｂ細胞）作用とポジティブ作用の両方が得られる。この作用は無害であり、ＣＤ３２を発現する抗原提示細胞へ免疫応答を伝えるので、それによって優勢にＣＤ３２Ａを発現する細胞は抗原提示を媒介し、ＣＤ３２Ａ発現抗原提示細胞によりＩＬ−１２が産生された結果として、Ｔｈ１細胞の誘導および活性化へと至る。本発明の融合タンパク質は、好ましくは、重架橋結合（heavy cross-linking ）が全くない。ＣＤ３２に対する結合部位の数を制限することにより、ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６などの刺激性コレセプター(stimulatory co-receptor s)のダウンレギュレーションを回避している。これらは、また、融合タンパク質のＩgＥ特異的部分を有するマスト細胞のエフェクター機能も失効させる。これらは下記の独創的な特性を有する：１）Ｂ細胞媒介抗原提示の静止（Ｔｈ２細胞の誘導を阻止する）；２a）ＩgＥスウィッチ誘導を阻止する；２b）Ｂ細胞におけるＩg産生を阻止する；３）単球細胞および／または樹状細胞との相互作用によりＴ細胞コンパートメントを刺激する（Ｔｈ１細胞の刺激）；および、４）融合タンパク質部分に対して特異的なＩgＥを有するマスト細胞の静止。これらは、ａ）１またはそれ以上の抗原およびｂ）ヒトＦcγレセプターIIと相互作用する、例えば抗体由来の、１またはそれ以上の部分を含んでなる。ＦcγレセプターIIと相互作用する融合タンパク質の部分は、例えば、１）それらのレセプターとの相互作用が依然として起こる可能性があり、そのことがＦcフラグメントの全体または一部が存在することを暗示している限り、完全なまたは不完全な（修飾された）ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体部分；または２）依然として、Ｂ細胞、マスト細胞、単球および樹状細胞上で発現されるようなＦcγＲII（ＣＤ３２）抗原を特異的に認識し、これに結合する、ヒトまたはヒト化aＣＤ３２抗体部分またはその一部、例えばＦabフラグメントのいずれか、例えば、天然aＣＤ３２またはＩgＧ抗体よりも高い親和性でＦcγ ＲII（ＣＤ３２）を認識するように手を加えたヒトまたはヒト化aＣＤ３２またはＩgＧ抗体部分、またはその一部であり得る。抗原は、完全なタンパク質、または融合タンパク質中に存在する配列上にＴ細胞に対するエピトープを依然有しているその一部に由来するものであり得る。アレルギー患者がＩgＥ媒介過敏性反応を示す抗原であればどれでも使用することができ、例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性結膜炎のアレルゲン類である。最も一般的な環境アレルゲンは、家内塵（ハウスダスト）ダニ、シラカンバ花粉、草本花粉、ネコ、ゴキブリである。これらのアレルゲンはそれぞれ、１またはそれ以上の“主要アレルゲン” （例えば、家内塵ダニの場合、主要アレルゲンはＤer Ｐ１であり；シラカンバ花粉の場合、主要アレルゲンはＢet Ｖ１である）を有する。しかしながら、融合タンパク質は通常、Ｔ細胞応答を誘導するのみであり、またＴ細胞は小（８−１２アミノ酸長）ペプチドに応答するので、完全な抗原が必要なのではない。従って、選択したＴ細胞エピトープを各アレルゲンに対する融合タンパク質に含めればよく、そうすることによって、複合体のサイズおよび分子量を小さくする。そのため、融合タンパク質は、完全な抗原に対する遺伝子からよりもむしろ１またはそれ以上のＴ細胞エピトープ含有ＤＮＡストレッチから製造できる。各アレルゲン間で重複する交差反応性エピトープが好ましい。融合タンパク質は、ＣＤ３２に特異的に結合し、かつ１またはそれ以上の抗原／アレルゲンに対する、１またはそれ以上の、例えば、２またはそれ以上のＴ細胞エピトープを含有すべきである。抗原の正確なプロセッシングを可能にするためには、融合タンパク質製造の際、好ましくは実際のＴ細胞エピトープよりも僅かに長いＤＮＡストレッチを含めるべきである。 aＣＤ３２抗体をコードする遺伝子に融合させるためには、好ましくは、家内塵ダニ主要アレルゲンＩ（Ｄer Ｐ１）またはシラカンバ花粉アレルゲン（Ｂet Ｖ１）のような主要アレルゲンのクローン化遺伝子に由来する短いＤＮＡ配列を使用する。これらの短いＤＮＡ配列は、プロセッシング後に抗原提示細胞の表面に現れて、応答しているアレルゲン特異的Ｔ細胞における免疫応答を誘導する、１またはそれ以上のＴ細胞エピトープの遺伝子コードを含有する。Ｄer Ｐ１の場合、Ｔ細胞エピトープの大部分は、配列中のアミノ酸１文字コードの１０１− １４３位に見つけることができる（配列番号１）：特に、アミノ酸１文字コードの１０１−１３１位のアミノ酸配列（配列番号２）：は、少なくとも３つのＴ細胞エピトープを含有し、これは多くのＨＬＡクラスII 分子に結合する。例えば、aＣＤ３２と抗原との融合は、タンパク質レベル（化学的融合）または遺伝子レベル（組換え融合タンパク質）のいずれかで遂行でき、本発明は、また、上記定義の融合タンパク質の製法もまた含んでなる。それは、常法にて実施でき、好ましくは、組換え遺伝子技術または化学的架橋の使用を含む。組換え融合タンパク質が好ましい。組換え遺伝子技術を用いる製造は、知られている方法、例えば、下記の方法により実施することができる：aＣＤ３２モノクローナル抗体（例えばクローンＩＶ.３）のＣＨ２エクソンの下流にある抗原結合部位およびＦc領域の部分を含有する遺伝子セグメントを例えば、ＩＶ.３ cＤＮＡからＰＣＲ増幅し、クローン化する。適切なＲＮＡをＰＣＲ増幅用の供給源として、例えば、Ｄer Ｐ１遺伝子の増幅用の家内塵ダニから精製する。アレルゲン遺伝子を、単離した重鎖セグメントとｐ３５０などの適切な哺乳動物発現ベクター中で同時ライゲート（co-l igated）する。更に、例えばＩＶ.３の対応する完全な軽鎖遺伝子を単離し、ｐ３５０と類似の特徴を持つｐ３４５などの適切な哺乳動物発現ベクター中でクローン化する。両方の組換えプラスミドを、例えば、ＣＯＳ細胞における同時トランスフェクション（co-transfection）に使用して、得られた組換え融合タンパク質を培地中に放出させる。生成物の精製は、好ましくは、大量に入手容易な抗軽鎖抗体カラムに基づくイムノアフィニティー精製により行う。あるいは、適切なファージ展示ライブラリー（phage display library）、例えば、De Kruif等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)3938-3942に記載、から得られたＣＤ３２（scＦv）に特異的な単鎖抗体を使用して、クローン化アレルゲンの遺伝子を持つ組換え融合タンパク質を作成できる（図６）。ＤＮＡを結合ファージから抽出し、フレキシブルリンカーを介してＶＬ鎖の１つに融合させた半合成ＶＨＤＪＨ領域を含有するＤＮＡフラグメント（scＦvフラグメント）を単離し、クローン化する。例えば、Ｄer Ｐ１遺伝子との融合は、Ｔ細胞エピトープをコードする指定の合成オリゴヌクレオチドを用いて、Ｄer Ｐ１とその高い（Ｔ細胞）交差反応性能力により選択したその他の主要アレルゲンとから行い、１つの融合タンパク質でできるだけ多くの患者をカバーできるようにする。これらのオリゴヌクレオチドをscＦv抗体フラグメントと適切な哺乳動物発現ベクター中で同時ライゲートする。組換えベクター、例えば、プラスミドを、ＣＯＳおよび／またはＣＨＯ細胞などの適切な細胞中へ安定にトランスフェクションし、得られた融合タンパク質を、例えば、上記のイムノアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製する。得られた遺伝子構築物は、特に大規模生産の場合、例えば、ＣＨＯ細胞中で発現させることができるが、特に、Ｔ細胞エピトープのみを使用する場合、即ち、グリコシル化を必要としない場合は組換え遺伝子技術によるその他の製造システムも適している。aＣＤ３２抗体は、例えば、天然抗体のＦ(ab)フラグメントを含有するヒトＩgファージ展示ライブラリーから入手できる。しかしながら、抗体または抗原／アレルゲンのいずれかをコードする遺伝物質の供給源は、重要ではない。化学的架橋による製造もまた、知られている方法により、例えば、Ｍc.a−ＣＤ３２およびＤer Ｐ１との融合タンパク質の場合、Calsson等［Biochem.J．173 (1978)723-737］、Cumber等［Meth.Enzymol.112(1985)207-224］およびPeeters 等［J.Immunol.Meth．120(1989)133-143］に記載の方法を用いて実施できる。要約すれば、Ｄer Ｐ１およびＭc.a−ＣＤ３２は、２−ピリジルジスルフィド残基を導入するために、別個にＳＰＤＰを用いてそれぞれモル比率１／２０および１／５で誘導体化する。穏やかに還元し、ゲルクロマトグラフィーにより脱塩した後、ＳＰＤＰ誘導体化Ｍc.a−ＣＤ３２（そのジスルフィド基をチオール基へと還元する）をＳＰＤＰ−誘導体化Ｄer Ｐ１と共にモル比率１／１.６でインキュベーションする。次いで、得られたＤer Ｐ１−Ｍc.a−ＣＤ３２生成物を、例えば、スペロース−１２（Superose-12）でのゲル濾過、および例えば、ＦＰＬＣＭono−Ｑによるアニオン交換クロマトグラフィーにより、精製する。出発物質は、既知であるか、または既知の方法に従い、または既知の方法と同様にして、または本明細書に、例えば実施例に記載の方法と同様にして、製造できるかのいずれかである。本発明の融合タンパク質は、アレルギー、特に食物アレルギーの予防および／または処置に有用である。特定のアレルゲンに対してアナフィラキシー反応を受ける患者が１またはそれ以上の他のアレルゲンに対してもそのような反応を受けることはまれである。本発明の方法によれば、そのような患者を２またはそれ以上のアレルゲンに関して、同時に各アレルゲンに対する抗原を含む融合タンパク質を投与することにより、脱感作させることが可能である。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、食物アレルギー、例えばミルクに対するアレルギーの危険のある新生児におけるアレルギー、または、使用した特定の融合タンパク質に含まれるアレルゲン（類）に対するアレルギーを有する患者の慢性アレルギー（es tablished allergies）の予防および／または処置に使用される。これらの適用の場合、適切な投与量はもちろん、例えば、使用した特定の融合タンパク質、宿主、適用様式および目的とする適用症によって変わる。しかしながら、一般に、１−２年かけて１ないし３回の予防接種により満足のゆく結果が得られたことが示されており、ただし、必要ならば、更なる予防接種を繰り返し実施できる。これらの処置には、本発明の融合タンパク質を従来採用されているのと同様の投与量および適用スケジュールで投与できる。従って、本発明は、食物アレルギーを含むアレルギーの予防および／または処置における上記定義の融合タンパク質の使用および処置の必要な対象に予防上または治療上有効な量の上記定義の融合タンパク質を少なくとも１種の常用の医薬的に許容し得る担体または希釈剤と共に投与することを含んでなるアレルギーの処置法、並びに医薬品として、特に抗アレルギー剤として使用する上記定義の融合タンパク質にも関係する。本発明の融合タンパク質は、常用の医薬的に許容し得る希釈剤および担体、および所望により、その他の賦形剤と混合し、非経口的、静脈内または腸内、例えば、筋肉内または皮下的に投与できる。融合タンパク質濃度はもちろん、例えば、採用した化合物、所望の処置および医薬形態の性質によって変わる。従って、本発明は、また、上記定義の融合タンパク質を少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体または希釈剤と共に含んでなる医薬組成物も含む。更に、上記定義の融合タンパク質を医薬的に許容し得る担体または希釈剤と混合することを含んでなる、アレルギーに対する薬物の製法、アレルギーの予防および／または処置用の薬物製造のための上記定義の融合タンパク質の使用にも関係する。本明細書では下記の略語を使用する： aＣＤ３２ＣＤ３２に対する抗体（抗ＣＤ３２抗体）Ａg 抗原ＡＰＣ抗原提示細胞ＢＣＲＢ細胞レセプターＢetＶ１シラカンバ花粉の主要アレルゲンＢＳＡウシ血清アルブミンＣＮＢＲシアノブロミドＤerＰ１家内塵ダニ（デルマトファゴイド・プテロニシヌス）の主要アレルゲンＤＰＴ家内塵ダニの抗原ＤＴＴジチオトレイトールＥＢＶエップシュタイン−バールウイルスＥＬＩＳＡ酵素結合免疫吸着アッセイ(enzime-linked immunosorbent assay) ＦＡＣＳ蛍光活性化細胞ソーターＦcγＲII ヒトＦcγレセプターII（＝ＣＤ３２）Ｆig．図番号ＦＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーＧaＭヤギ抗マウス抗体ＨＡｃ酢酸ＨＬＡヒト白血球抗原ＨＰＨＴヒドロキシアパタイトＩＣ免疫複合体Ｉg 免疫グロブリンＩＬ−12 インターロイキン−１２ＬＳＴリンパ球刺激試験 min 分ＭＲモル比率ＰＢＳホスフェート緩衝化塩水ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応 p−ＮＰＰｐ−ニトロフェニルホスフェート sd 標準偏差ＳＰＤＰＮ−スクシンイミジル３−(２−ピリジルチオ)プロピオネート本発明を限定することなく例示説明するものである下記の実施例では、温度は全てセ氏℃である。実施例：Ｄer Ｐ１--モノクローナル抗ＣＤ３２融合タンパク質の製造および精製Ａ）方法：二官能性結合剤であるＳＰＤＰを用いてＤer Ｐ１をＭc.a−ＣＤ３２と共有結合的にコンジュゲートさせる。要約すると、２−ピリジルジスルフィド残基を導入するために、ＳＰＤＰをそれぞれモル比率１／２０および１／５で用いて、Ｄ er Ｐ１およびＭc.a−ＣＤ３２を別個に誘導体化する。穏やかに還元し、ゲルクロマトグラフィーにより脱塩した後、ＳＰＤＰ−誘導体化Ｍc.a−ＣＤ３２（そのジスルフィド基がチオール基に還元されている）をＳＰＤＰ−誘導体化Ｄer Ｐ１と共にモル比率１／１.６でインキュベーションする。得られたＤer Ｐ１-- Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートをスペロース(Superose)−１２でのゲル濾過により、およびＦＰＬＣＭono−Ｑでのアニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。Ｂ）材料：ａ）ＳＰＤＰ：分子量３１２.４；ジメチルホルムアミド中２５.６１mＭストック溶液（８mg／ml）、結合直前に調製。ｂ）Ｄer Ｐ１：ＣＮＢＲ−セファロース４Ｂに共有結合させたＭc.a−Ｄer Ｐ１（４Ｃ１／Ｂ８／３Ｆ８）でのイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製。分子量２８kＤ；等電点５.０（ＰＨＡＳＴ−ＩＥＦ）；滅菌濾過、ＰＢＳで希釈。ｃ）モノクローナル抗−ＣＤ３２（ＩＶ.３）：アイソタイプ：マウスＩgＧ２b −К鎖；分子量１５０kＤ：等電点６.２（ＰＨＡＳＴ−ＩＥＦ）；プロテインＡおよびＨＰＨＴの培地上清から精製およびＰＢＳで透析。反応混合物Ａ：Ｄer Ｐ１溶液１.２ml（０.８４mg）に、ＳＰＤＰストック溶液（２０モル過剰）２３.４μlを加え、混合物を２.５ml円錐形反応バイアル（Pierce）中、室温（２２℃）で４５分間撹拌する。反応混合物にＰＢＳおよび非コンジュゲート化ＳＰＤＰを２.５mlまで満たし、解離したＮ−ヒドロキシスクシンイミドをＰＢＳ５０mlで平衡化した９.１mlファルマシアＰＤ−１０使い捨て脱塩カラム（セファデックスＧ−２５）で脱塩して除去する。実施後、２−ピリジルジスルフィド活性化Ｄer Ｐ１を含有するフラクションが溶出し、これをＰＢＳ３.５mlを用いて集める。濃度は約０.１７mg／mlであり、０.６mgに相当する。２−ピリジルジスルフィドでの置換度の見積もり：サンプル１００μlにＰＢＳを１５０μlまで満たし、ＰＢＳで希釈した１５０ mＭＤＴＴ５０μlを加える。ＤＴＴ添加後解離したピリジン−２−チオンの濃度は３４３nm（モル消光係数：８０８０Ｍ^-1cm^-1）での吸光度を計測することにより測定でき、これは導入された２−ピリジル−ジスルフィド残基に相当する。測定したＯＤ３４３nmの増加が０.０７４（希釈のために補正）の場合、その置換度は１.５Ｍol２−ピリジルジスルフィド／Ｍol Ｄer Ｐ１と計算される。反応混合物Ｂ：Ｍc.a−ＣＤ３２溶液０.５ml（４.２mg）にＳＰＤＰストック溶液（５モル過剰）５.５μlを加え、混合物を室温で４５分撹拌する。反応混合物を２.５mlPie rceＧＦ−５使い捨て脱塩カラム（０.１Ｍ酢酸Ｎa／ＨＡc緩衝液、０.１ＭＮa Ｃl、ｐＨ４.５の１０mlで平衡化）にかける。実施後、脱塩されたフラクションが溶出し、これを酢酸緩衝液１.５ml（ｐＨ４.５）を用いて集め、０.２２μmＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（低タンパク質結合）濾過ユニットで濾過する。ＳＨ基の導入：タンパク質結合２−ピリジルジスルフィド基をＤＴＴで還元することにより、タンパク質結合チオール基へと変換する。脱塩したサンプル１.５mlを６２.５m ＭＤＴＴ１ml（酢酸緩衝液中で希釈）と共に撹拌しながら室温で３０分間インキュベーションする（最終ＤＴＴ濃度２５mＭ）。２−ピリジルジスルフィドは酸性ｐＨでその親電子性を増すため、天然タンパク質ジスルフィド結合に影響のない低ｐＨでも還元を実施できる。測定したＯＤ３４３nmの増加が０.４４７の場合、その置換度は７Ｍolチオール基／Ｍol Ｍc.a−ＣＤ３２と計算される。反応混合物をファルマシアＰＤ−１０カラム（ＰＢＳ５０mlで平衡化）にかけると、脱塩したフラクションが溶出し、これをＰＢＳ３.５mlを用いて集める。サンプルをセントリプラス(CENTRIPLUS)−１０(ＹＭ１０膜)濃縮ユニットにより０.６mlまで濃縮する。濃度は、約３.１mg／mlであり、１.８６mgに相当する。Ｃ）結合操作：Ｄer Ｐ１（ピリジンジスルフィド活性化したもの）３.３ml（０.５６mg）とＭc.a−ＣＤ３２（ＳＨ活性化したもの）０.６ml（１.８６mg）を混合し、５mlP ierce反応性バイアル中、室温（２２℃）で２時間および＋４℃で１５時間撹拌する。反応混合物中のＤer Ｐ１／Ｍc.a−ＣＤ３２の分子比率は、１.６／１である。結合反応は、解離したピリジン−２−チオールの増加によるＯＤ３４３nm の増加を測定することにより監視する：時間ＯＤ（３４３nm）開始０.１１１２１５分０.１２５７３０分０.１３４２４５分０.１４１２６０分０.１４７０７５分０.１５１９１２０分０.１５９０Ｄ）コンジュゲートの精製：スペロース(Superose)−１２：反応混合物（３.９ml）をＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ濾過ユニット０.２２μmで濾過し、セントリプラス−１０濃縮ユニットを用いて０.５mlまで濃縮する。コンジュゲートの最終濃度は、３.７mg／mlであり、１.９mgに相当する。サンプルをＰＢＳで平衡化したスペロース−１２(ＨＲ１０／３０)カラム(ファルマシア)にかける。ベッド容量２４ml；流速０.２ml／分；容量／フラクション０.４ml；記録機チャート速度１.５mm／分；圧力０.３ＭＰa；走査波長２８０ nm。溶出した高分子量フラクションを溶出プロフィールに従い３プールに分ける。１.２mlプールＡ：フラション番号２１−２３１.２mlプールＢ：フラション番号２４−２６１.２mlプールＣ：フラション番号２９−３１これらのプールを滅菌濾過（０.２２μmＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ）し、滅菌条件下＋４℃で貯蔵する。総タンパク質濃度は、プールＡ：約１００μg／ml；プールＢ：約２００μg／ml；プールＣ：３９０μg／mlである。ＦＰＬＣ−ＭonoＱ：プールＣ（３９０μg）１mlを２０mＭのエタノールアミン／ＨＣl、０.０１％ＮaＮ₃緩衝液、ｐＨ９.０に対して透析し、ＦＰＬＣ−ＭonoＱ（ＨＲ５／５）アニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。緩衝液Ａ：２０mＭエタノールアミン／ＨＣl、０.０１％ＮaＮ₃、ｐＨ９.０；制限緩衝液Ｂ：Ａ＋０.５ＭＮaＣl、ｐＨ９.０；流速１ml／分、容量／フラクション１ml；記録機チャート速度５mm／分；圧力１.２ＭＰａ；走査波長２８０nm。実施後、直線勾配プログラムが３０分間開始される(伝導度５０−１２６０μＳ／cm)。適切なピークは、フラクション番号８で溶出する（３４０μＳ／cm）。タンパク質濃度は約４５μg／ml(ＯＤ２８０nm、Ｅ１％１４.０)である。サンプルをＰＢＳに対して透析し、滅菌濾過する。最終精製物質のタンパク質濃度は２０μg／ml（ＯＤ２８nm）である。Ｅ）分析測定：ａ）総タンパク質濃度：総タンパク質濃度は、ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイキットＩ；標準；ウシＩgＧを用いてBradfordに従い推定する。ｂ）ＥＬＩＳＡによるＤer Ｐ１、Ｍc.a−ＣＤ３２およびＤer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの測定：固相ＥＬＩＳＡをＰＶＣマイクロタイタープレートで実施する。０.０５％トゥイーン−２０を含むコーティング緩衝液０.１ＭＮaＨＣＯ₃／Ｎa₂ＣＯ₃、０. ０１％ＮaＮ₃ ｐＨ９.６、ＰＢＳを洗浄溶液として用い、洗浄緩衝液中２％ウシ胎児血清をサンプル、ビオチンおよび酵素コンジュゲートの希釈剤として用いる。基質は１Ｍジエタノールアミン／ＨＣl緩衝液、ｐＨ９.８で希釈した１mg／ml ｐ−ＮＰＰである。停止溶液は２ＭＮaＯＨである。全てのインキュベーション工程は、加湿チャンバーにて行う。サンプル処理および４０５nmでのＯＤ読み取りのための装置は、ベックマンＢiomek−１０００実験室ワークステーションである。定量評価：ベックマンＩmmunofit；曲線適合：４−パラメーター論理。ｂ)１)Ｄer Ｐ１の測定（図７）：コーティング：１００μl／ウェルのＭc.a−Ｄer Ｐ１(５Ｈ８)１０μg／ml、＋４℃で一晩。洗浄後、１００μl／ウェルのサンプルを添加する：ａ）標準としてＤer Ｐ１(結合開始物質)(２５０−０.４９ng／ml) ｂ）スペロース−１２プールＡ（４０００−７.８１ng／ml）ｃ）スペロース−１２プールＢ（４０００−７.８１ng／ml）ｄ）スペロース−１２プールＣ（４０００−７.８１ng／ml）＋３７℃で２時間インキュベーション。洗浄後、１／５００に希釈した１００ μl／ウェルＭc.a−Ｄer Ｐ１(４Ｃ１／Ｂ８／３Ｆ８)−ビオチンコンジュゲートを加え、＋３７℃で２時間インキュベーションする。洗浄後、１／１０００に希釈した５０μl／ウェルストレプトアビジン−アリカリホスファターゼコンジュゲートを加え、＋３７℃で１時間インキュベーションする。洗浄後、１００μ l／ウェル基質を加え、３７℃で６０分間インキュベーションし、停止する。標準曲線からの定量評価：スペロース−１２プールＡ：１６.１μg／ml スペロース−１２プールＢ：５４.９μg／ml スペロース−１２プールＣ：１３５μg／ml ｂ)２)Ｍc.a−ＣＤ３２(マウスＩgＧ２b)の測定(図８)：コーティング：１００μl／ウェルのヤギＰc.a−マウスＩgＧ２b（サザン)５ μg／ml、＋４℃で一晩。洗浄後、１００μl／ウェルのサンプルを添加する：ａ）標準としてＭc.a−ＣＤ３２(結合開始物質)(１０００−１.９６ng／ml) ｂ）スペロース−１２プールＡ（８０００−１５.６３ng／ml）ｃ）スペロース−１２プールＢ（８０００−１５.６３ng／ml）ｄ）スペロース−１２プールＣ（４０００−１５.６３ng／ml）＋３７℃で２時間インキュベーション。洗浄後、１／１０００に希釈した５０ μl／ウェルのヤギＰc.a−マウスＩｇＧ２ｂ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（サザン）を加え、＋３７℃で２時間インキュベーションする。洗浄後、１００μl／ウェルの基質を加え、室温で１５分間インキュベーションし、停止する。標準曲線からの定量評価：スペロース−１２プールＡ：１７.７μg／ml スペロース−１２プールＢ：５８.８μg／ml スペロース−１２プールＣ：１９０μg／ml ＥＬＩＳＡによるコンジュゲート中のＤer Ｐ１／Ｍc.a−ＣＤ３２モル比率の評価：スペロース−１２プールＡ：４.９／１スペロース−１２プールＢ：５.０／１スペロース−１２プールＣ：３.８／１ｂ)３)Ｄer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの検出：ｂ)３)１)コーティング：Ｍc.a−Ｄer Ｐ１(マウスＩgＧ２a)（図９）：コーティング：１００μl／ウェルのＭc.a−Ｄer Ｐ１（５Ｈ８）１０μg／ml 、＋４℃で一晩。洗浄後、１００μl／ウェルのサンプルを添加する：ａ）Ｄer Ｐ１(結合開始物質)(４０００−７.８１ng／ml) ｂ）スペロース−１２プールＡ（４０００−７.８１ng／ml）ｃ）スペロース−１２プールＢ（４０００−７.８１ng／ml）ｄ）スペロース−１２プールＣ（４０００−７.８１ng／ml）＋３７℃で２時間インキュベーション。洗浄後、１／１０００に希釈した５０ μl／ウェルのヤギＰc.a−マウスＩgＧ２ｂ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（サザン）を加え、＋３７℃で２時間インキュベーションする。洗浄後、１００μl／ウェルの基質を加え、室温で３０分間インキュベーションし、停止する。Ｍc.a−Ｄer Ｐ１結合Ｄer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートは、各スペロース−１２精製フラクションプールにおけるＭc.a−ＣＤ３２分割により検出する。ｂ)３)２)コーティング：Ｐc.a−マウスgＧ２ｂ（図１０）：コーティング：１００μl／ウェルのヤギＰc.a−マウスＩgＧ２ｂ（サザン)５ μg／ml、＋４℃で一晩。洗浄後、１００μl／ウェルのサンプルを添加する：ａ）Ｄer Ｐ１(結合開始物質)(１０００−１.９５ng／ml) ｂ）スペロース−１２プールＡ（８０００−１５.６３ng／ml）ｃ）スペロース−１２プールＢ（８０００−１５.６３ng／ml）ｄ）スペロース−１２プールＣ（８０００−１５.６３ng／ml）＋３７℃で２時間インキュベーション。洗浄後、１／５００に希釈した１００ μl／ウェルのＭc.a−Ｄer Ｐ１(４Ｃ１／Ｂ８／３Ｆ８)−ビオチンコンジュゲート（マウスＩgＧ１）を加え、＋３７℃で２時間インキュベーションする。洗浄後、１／１０００に希釈した５０μl／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを加え、＋３７℃で１時間インキュベーションする。洗浄後、１００μl／ウェルの基質を加え、３７℃で６０分インキュベーションし、停止する。Ｐc.a−マウスＩgＧ２b結合Ｄer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートは、各スペロース−１２精製フラクションプールにおけるＤer Ｐ１分割により検出する。ｃ）天然ポリアクリルアミドゲル勾配電気泳動によるＤer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの分子量の測定：スペロース−１２精製フラクションプールにおけるＤer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの分子量は、天然ＰＨＡＳＴゲル４−１５％勾配(ファルマシア)(分離範囲：１０００kＤ−１５０kＤ）を用い、天然高分子量標準タンパク質（キット、ファルマシア）と比較して推定する。検出：銀染色(銀染色キット、ファルマシア)(図１１) 評価：スペロース−１２プールＡ：ＭＷ７００kＤのバンドスペロース−１２プールＢ：ＭＷ４６０kＤ、３３０kＤのバンドスペロース−１２プールＣ：ＭＷ３３０kＤ、１７０kＤのバンド最終ＦＰＬＣ−ＭonoＱ精製Ｄer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの分子量は３３０kＤと思われる（図１２）。Ｆ）試験結果：ａ）a ＣＤ３２Ｄer Ｐ１融合タンパク質によるＴ細胞クローンＣＦＴＳ４：３．１の抗原特異的刺激：精製Ｄer Ｐ１と化学的に結合した上記aＣＤ３２（MedarexクローンＩＶ.３）を、標準ＬＳＴを用いて異なる濃度でＤer Ｐ１特異的Ｔ細胞クローンＣＦＴＳ４：３.１を刺激するのに使用する。第１組の実験では、化学的融合調製物由来のプールＡおよびプールＢを用いるが、プールＡは７００kＤの単一バンド（Ｄe r Ｐ１１０分子と融合したａＣＤ３２２分子）を含有し、プールＢは４６０k Ｄと３３０kＤの２つのバンド(それぞれ、Ｄer Ｐ１１０分子と融合したaＣＤ３２１分子、およびＤer Ｐ１５分子と融合したaＣＤ３２１分子)からなる。第２組の実験では、およそ３３０kＤの単一バンド（Ｄer Ｐ１５分子と融合したaＣＤ３２１分子）からなるプールＣ由来の精製タンパク質を用いる。単球およびＢ細胞を、図１３ａおよび１３ｂに示した様々なフラクションと共に室温で１時間プレインキュベーションする。対照刺激として、ＤＰＴ１００μg／ml を、全培養期間中、Ｔ細胞足す抗原提示細胞に加える。Ｂ細胞はＤＰＴでＣＦＴＳ４：３.１を刺激できるが、プールＡ、プールＢまたはプールＣでは刺激できないのに対し、単球はＤＰＴでも、プールＡ、プールＢおよびプールＣでもＣＦＴＳ４：３.１を刺激できる。このことは、上記参照の天然ＩgＧアレルゲン複合体に関する前述の発見を確認するものである。更に、このことは、単球による抗原刺激の場合、全てのフラクションがＴ細胞を等しく刺激するため、ＣＤ３２架橋結合が必要でないことを示している。ｂ）ＩgＥ合成の阻害：精製ヒト扁桃Ｂ細胞を、指定濃度中に添加した市販のaＣＤ３２抗体の存在または不在下でaＣＤ４０およびＩＬ−４で刺激する(図１４)。９日後、培養上清をＩgＥおよびＩgＧ１含量について試験する。全てのaＣＤ３２抗体は、用量依存的にＩgＥ並びにＩgＧ１産生を阻害する。図１５では、MedarexクローンＩＶ. ３由来のＦabフラグメントでさえもＩgＥ合成を阻害できることを示している。これは、そのＢＣＲにより活性化されていないＢ細胞を、その抗体産生においてＣＤ３２とのモノマー相互作用により遮断できることを示している。抗原特異的に刺激されるＢ細胞の場合、ＣＤ３２とＢＣＲとの同時架橋結合が必要である。これは、例えば、Ｂ細胞がＩgＥおよびＣＤ２３により抗原（例えば、Ｄer Ｐ１）を取り込み、続いて、Ｄer Ｐ１特異的Ｔｈ２細胞を刺激してＢ細胞によるＩg Ｅ産生を導くようなアレルギーでは、これらのＢ細胞がＢ細胞表面上のＣＤ３２との相互作用により閉鎖され得ることを意味する。更に、連結による（コグネイト）Ｂ細胞Ｔ細胞相互作用においてさえ、aＣＤ３２抗体は抗体合成を遮断する( 図１６)。傾瀉法により正常ドナーから得られた単球（９１％ＣＤ１４ポジティブ）を１００Ｕ／mlＩＦＮ−γと共に５μg／ml凝集ヒトＩgＧ（４℃で一晩ウェルヘコーティング）および／または１０μg／mlモノクローナルマウス抗ヒトaＣＤ３２（ Medarex IV.3）の存在下または不在下で２４時間インキュベーションし、続いて、ＦＡＣＳ分析用の指定のマーカー用に染色する。ＣＤ８０とＣＤ４０のＩＦＮ −γ誘導化アップレレギュレーションは、単球上の凝集ヒトＩgＧによるＦcγレセプターの重架橋結合により阻害できる。aＣＤ３２とのプレインキュベーションは、凝集ヒトＩgＧにより阻害を中和し、このことは、１）凝集ヒトＩgＧによる阻害がＣＤ３２により媒介されること、２）ＣＤ３２への単なる結合は、コレセプターのダウンレギュレーションを引き起こさないこと、を示している。ＨＬＡ−ＤＲ発現は、この処置に影響されない。図面の説明：図１：抗原提示に関するＣＤ２３へのＤer−Ｐ１−(３)ＮＩＰ複合体の結合パネルＡ＝蛍光；パネルＢ＝増殖。ＥＢＶＢ細胞に、一定濃度のＩgＥ（▲７.５μg／ml、●５.０μg／ml、■２ .５μg／ml）と様々な濃度のＤer−Ｐ１−(３)ＮＩＰからなる予め作成したＩＣをパルス（pulse）する。パネルＡには、予め作成したＩＣのＢ細胞への結合を示す。同一のＭＲを有するＩＣを直線で結び、実際のＭＲ（０.１、０.２５、０.５、１、７）を直線の近くにアラビア数字で示す。ＩgＥ結合は、０.２μg／mlのＤer Ｐ１濃度で安定水準に達した。Ｄer Ｐ１−(３)ＮＩＰ不在下のＩgＥ結合は、右Ｙ軸下方の点で囲った四角の部分に示している。パネルＢには、同じＩＣをパルスした照射化ＥＢＶ−Ｂ細胞による抗原提示を示す。ここで、直線で結んだものは、同一のＩgＥ濃度で作成された複合体を示しており、抗原提示がＩＣのＭＲに影響されないことを強調している(相関係数＝０.９６)。モノマー複合体［各直線の最大Ｄer Ｐ１−(３)ＮＩＰ濃度］もまた、Ｔ細胞へ効率的に与えられる。Ｔ細胞の刺激は、ＩgＥ分子の不在下ではどのようなＤer Ｐ１−(３)ＮＩＰ濃度を使用しても観察されなかった(黒塗り帯状部分)。データは、５目の³Ｈ−チミジン取り込み（三回実験したウェルの平均± sd）を示している。図２：非パルス化Ｂ細胞での抗原提示の比較全刺激期間中培地に残された遊離のＤer Ｐ１−(２)ＮＩＰは、Ｔ細胞の用量依存的刺激を誘導した。自家組織の（照射をうけた）ＥＢＶ−Ｂ細胞を抗原提示細胞として使用した。複合体中に存在するＩgＥは抗原提示をそれほど増加させなかったが、ＩＣ中に存在するＩgＧ１およびＩgＧ３はいずれも、遊離のＤer Ｐ１−(２)ＮＩＰと比べて、Ｔ細胞に対するＤer Ｐ１−(２)ＮＩＰの抗原提示を妨げた。結果は、５日目の³Ｈ−チミジン取り込み（三回実験したウェルの平均±sd）として与える。図３：ＩgＧ−Ｄer Ｐ１−(３)ＮＩＰ複合体による抗原提示の阻害：ＩgＧ３の不在下、ＩgＥ−Ｄer Ｐ１−(３)ＮＩＰ複合体を使用すると、良好なＴ細胞刺激が見られる。同一（１：１）比率で予め作成したＩgＧ３−Ｄer Ｐ１−(３)ＮＩＰ複合体の滴定は、ＩgＥ−媒介抗原提示の用量依存的阻害を導く。この効果を有するためには、ＩgＧ３複合体がＴ細胞刺激時点で培地に存在する必要がある。Ｂ細胞とＩgＧ３複合体とのプレインキュベーションまたは“パルシング(pulsing)”は、Ｂ細胞上のＣＤ３２に対するＩgＧ３の親和性が低いためうまく行かない。ＩgＥ不在下での抗原提示、更にはＩgＧ３−ＢＳＡ−(３)ＮＩＰ複合体の場合でも同様の阻害が見られる。図４：新たなヒト単球によるＩgＧ３媒介抗原提示ヒト単球に予め作成したＩgＧ３−Ｄer Ｐ１−(３)ＮＩＰ複合体（比率１：１）を氷上で１時間、関連のない凝集ヒトＩgＧの不在下または存在下でパルスする。パルスを与えた単球を続いて洗浄し、Ｄer Ｐ１に特異的なＨＬＡ−ＤＰ適合Ｔ細胞クローンと混合し、５日後、増殖を³Ｈ−チミジン取り込みとして測定する。ヒト単球により与えられるＩgＧ３複合体は、凝集ＩgＧにより遮断され得るアレルゲン特異的Ｔ細胞応答を誘導し、このことは、単球とのＩgＧ３相互作用の特異性をしている。データは、三回実験したウェルの平均±sdとして示す。図５：ＤＰＴ−特異的Ｔ細胞増殖；抗原提示に対するaＣＤ３２または凝集ヒトＩgＧの影響ヒトＥＢＶＢ細胞に２５０μg／mlのＤＰＴを一晩パルスする（斜かけ棒グラフ）かまたはパルスしない(白色棒グラフ)。照射後、Ｂ細胞をＤer Ｐ１特異的Ｔ細胞クローン由来のＴ細胞と混合し、この細胞を５日間増殖させる。ＧaＭにより交差結合した異なる濃度のaＣＤ３２抗体の存在下で、増殖の用量依存的阻害が見られる。同じ効果は、aＣＤ３２または非特異的凝集ヒトＩgＧを培養ウェルにコーティングした場合にも観察される。図６：ファージ展示ライブラリーかaＣＤ３２scＦv（Ｆab）フラグメント間の組換え融合タンパク質の例：Ｆabフラグメントは、De Kruif等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）3938- 3942に記載のようなファージ展示ライブラリーから得ることができる。しかしながら、ヒトＣＤ３２と効率良く相互作用する分子（または分子の一部）ならばどんなものでもaＣＤ３２フラグメントの代わりに使用できる。アレルゲンは、アレルギーを引き起こすあらゆるタンパク質またはタンパク質の組み合わせであり得る。更に、アレルゲンは、Ｔ細胞エピトープを含有するアレルゲンのフラグメントを代わりに使用してもよい。組換えタンパク質は、グリコシル化およびその他の翻訳後修飾とは無関係にあらゆる発現系にて製造できる。このような融合タンパク質は、不要なＩg分子の（過剰）生産を特徴とする疾患、例えば、慢性関節リウマチ、対宿主移植片病、または自己抗体が役割を果すその他の疾患などにも使用できる。これらの場合において、アレルゲンの代わりに単純な不定のリンカーを用いて、２つのaＣＤ３２部分を結合させることもできるが、最良の結果が得られるのは、疾患を引き起こす“自己抗原”をアレルゲンの代わりに使用する場合であろう。図７：サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡによるスペロース−１２精製Ｄer Ｐ１--Ｍc .a−ＣＤ３２コンジュゲートフラクションプールにおけるＤer Ｐ１の測定図８：サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡによるスペロース−１２精製Ｄer Ｐ１--Ｍc .a−ＣＤ３２コンジュゲートフラクションプールにおけるＭc.a−ＣＤ３２の測定図９：サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡによるスペロース−１２精製フラクションプールにおけるＤer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの検出コーティング：Ｍc.a−Ｄer Ｐ１図１０：サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡによるスペロース−１２精製フラクションプールにおけるＤer Ｐ１--Ｍc.a−ＣＤ３２コンジュゲートの検出コーティング：Ｐc.a−マウスＩgＧ２b図１１：プールＡ、ＢおよびＣ由来のフラクションの銀染色：レーン１：３５０ng Ｄer Ｐ１レーン２：５０ng Ｍc.a−ＣＤ３２レーン３：５００ng 高分子量マーカーレーン４：５００ng スペロース−１２に対する出発物質レーン５：１００ng スペロース−１２プールＡレーン６：１００ng スペロース−１２プールＢレーン７：２００ng スペロース−１２プールＣレーン８：２５０ng 高分子量マーカー高分子量マーカー：６６９kＤ：チログロブリン４４０kＤ：フェリチン２３２kＤ：カタラーゼ１４０kＤ：乳酸デヒドロゲナーゼ６７kＤ：ウシ血清アルブミン図１２：プールＣ由来の精製融合タンパク質の銀染色：レーン１：２５０ng 高分子量マーカーレーン２：４５ng ＦＰＬＣＭono−Ｓ精製物質。図１３aおよび１３b ：Ａg−特異的Ｔ細胞増殖：図１３a：ＡＰＣ−Ｍｏ２５０４９５およびＣＦＢ４：２図１３b：モノマー精製ＣＤ３２／ＤerＰ１の影響精製Ｄer Ｐ１と化学的に結合したaＣＤ３２（Ｍedarex クローンＩＶ.３）を、標準ＬＳＴを用いて異なる濃度でＤer Ｐ１特異的Ｔ細胞クローンＣＦＴＳ４：３.１を刺激するために使用した[Van Reijsen,F.C.等（1992）J.Allergy Clin .Immunol.90 184]。第１組の実験（図１３a）では、化学的融合調製物由来のプールＡおよびプールＢを使用した：プールＡは７００kＤの単一バンド（Ｄer Ｐ１１０分子と融合したaＣＤ３２２分子）を含有し、プールＢは４６０kＤと３３０kＤの２つのバンド（それぞれ、Ｄer Ｐ１１０分子と融合したaＣＤ３２１分子、およびＤer Ｐ１５分子と融合したaＣＤ３２１分子）からなる。第２組の実験（図１３b）では、およそ３３０kＤの単一バンド（Ｄer Ｐ１５分子と融合したaＣＤ３２１分子）からなるプールＣ由来の精製タンパク質（ＣＰ２３０５９５）を用いた。単球およびＢ細胞を、図に示した様々なフラクションと共に室温で１時間プレインキュベーションした。対照刺激として、ＤＰＴ１００μg／mlを、全培養期間中、Ｔ細胞足す抗原提示細胞に加えた。Ｔ細胞刺激は、記載（Van Reijsen等、前述）の通り５日後の³H−チミジン取り込み（４ウェルの平均±ｓｄ）として測定した。Ｂ細胞はＤＰＴでＣＦＴＳ４：３.１を刺激できるが、プールＡ、プールＢまたはプールＣでは刺激できなかったのに対し、単球はＤＰＴでも、プールＡ、プールＢおよびプールＣでもＣＦＴＳ４：３.１を刺激できた。このことは、天然ＩgＧアレルゲン複合体に関する前述の発見に相当する［Bheekha Escur a,R.等、Immunology(1995)86 343］。更に、このことは、単球による抗原刺激の場合、全てのフラクションがＴ細胞刺激に等しく有効であったため、２分子以上のＣＤ３２の交差結合が必要でないことを示している。図１４：ＩgＥおよびＩgＧ１合成それぞれの阻害：精製ヒト扁桃Ｂ細胞を、Armerding,D.等、Immunobiology 188(1993)259-273に記載のように指定濃度中に添加した市販のaＣＤ３２抗体の存在または不在下でa ＣＤ４０およびＩＬ−４で刺激した。９日後、培養上清を記載（Armerding,D.等、前述）のようにＩgＥおよびＩgＧ１含量について試験した。結果は、９回の実験の３プールフラクションの抗体産生（平均±sd）として示す。全てのaＣＤ３２抗体は、用量依存的にＩgＥ並びにＩgＧ１産生を阻害する。ＩgＭおよびＩgＡの阻害はこれに匹敵した。図１５：ＩgＥ合成の阻害：精製ヒト扁桃Ｂ細胞を、Armerding,D.等、前述に記載のように指定濃度中に添加した市販のaＣＤ３２抗体(Medarex ＩＶ.３)またはそのＦabフラグメントの存在または不在下でaＣＤ４０およびＩＬ−４で刺激した。９日後、培養上清を記載（Armerding,D.等、前述）のようにＩgＥおよびＩgＧ１含量について試験した。結果は、９回の実験の３プールフラクションの抗体産生（平均±sd）として示す。MedarexクローンＩＶ.３由来の完全なフラグメントおよびＦabフラグメントのいずれもが、ＩgＥ合成（ＩgＧ１、ＩgＭおよびＩgＡ）を阻害できた。図１６：ＤＰＴ特異的ＩgＥ誘導：aＣＤ３２の影響ヒト扁桃Ｂ細胞に２５０μg／mlのＤＰＴを一晩パルスする（斜かけ棒グラフ）かまたはパルスしない(白色棒グラフ)。照射後、Ｂ細胞をＤer Ｐ１特異的Ｔ細胞クローン（ＣＦＴＳ４：３.１）由来のＴ細胞と混合し、この細胞を９日間増殖させ、抗体を産生させる。９日後、培養上清をArmerding,D.等、前述に記載のようにＩgＥおよびＩgＧ１含量について試験した。結果は、９回の実験の３プールフラクションの抗体産生（平均±ｓｄ）として示す。異なる濃度のaＣＤ３２抗体の存在下で、ＩgＥ産生の用量依存的阻害が見られる。このことは、連結による（コグネイト）Ｂ細胞Ｔ細胞相互作用においてさえ、aＣＤ３２抗体が抗体合成を遮断することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＵＣ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡＣ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ 16/00 16/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）１またはそれ以上の抗原、および、ｂ）ヒトＦｃγレセプターII(ＦcγＲII)(ＣＤ３２)と相互作用する１またはそれ以上の部分を含んでなる、融合タンパク質。２．抗原が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性結膜炎におけるアレルゲンである、請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質。３．完全な抗原に対する遺伝子からよりはむしろＤＮＡストレッチを含有する１またはそれ以上のＴ細胞エピトープから生産される、請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質。４．ＦcγＲIIと相互作用する部分が、ヒトまたはヒト化aＣＤ３２抗体、または依然としてＦcγＲII（ＣＤ３２）抗原を特異的に認識および結合するこれらの抗体の部分である、請求の範囲第１項ないし３項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。５．ＦcγＲIIと相互作用する部分が、ヒトまたはヒト化ＩgＧ抗体、または依然としてＦcγＲII（ＣＤ３２）抗原と相互作用するこれらの抗体の部分である、請求の範囲第１項ないし３項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。６．ＦcγＲIIと相互作用する部分が、天然aＣＤ３２またはＩgＧ抗体よりも高い親和性でＦcγＲII（ＣＤ３２）を認識するように手を加えたヒトまたはヒト化aＣＤ３２またはＩgＧ抗体またはその部分である、請求の範囲第１項ないし３項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。７．少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体または希釈剤と共に請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質を含んでなる医薬組成物。８．組換え遺伝子技術または化学的架橋の使用を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質の製法。９．アレルギー（食物アレルギーを含む）の予防および／または処置における請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質の使用。１０．アレルギー（食物アレルギーを含む）の予防および／または処置用の薬物の製造のための請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質の使用。１１．医薬品として使用するための請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質。１２．処置の必要な対象に請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質の予防上または治療上有効量を少なくとも１つの常用の医薬的に許容し得る担体または希釈剤と共に投与することを含んでなる、アレルギーの処置法。１３．請求の範囲第１項に記載の融合タンパク質を医薬的に許容し得る担体または希釈剤と混合することを含んでなる、アレルギーに対する薬物の製法。