JPH04504424A - 膜結合ＩｇＡに存在するが分泌ＩｇＡに存在しない抗原エピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 膜結合ＩｇＡに存在するが分泌Ｉ　、ｇ　Ａに存在しない抗原エピトープ ＬＬ辺」Ｌ！ 本発明は、Ｂ細胞に結合したＩｇＡ上に存在するが分泌ＩｇＡ上には存在しない エピトープに抗体を結合させ、該Ｂ細胞によるＩｇＡの生産を高めることにより 免疫系を増強することに関する。

！遣 Ｂリン４球は、異なる機能を媒介する５つの群の免疫グロブリンを産生ずる。Ｉ ｇＭは補体結合において最も有効であり、ｒｇＧは食細胞に対する感受性の増大 （ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及び細胞障害性を引き起こし、胎盤を通過するこ とができる。ＩｇＡは粘膜表面に作用し、ＩｇＥはマスト細胞及び好塩基性細砲 の脱粒状化を媒介する。

ＩｇＤの機能はよくわかっていない、これらの抗体は循環血流中に存在し、Ｉｇ Ｇ、ＩｇＡ及びｒｇＭは主たる血清成分である。Ｂ細胞は、免疫グロブリンを分 泌することに加え、異なる成熟段階において異なる免疫グロブリンのイソタイプ を表現する。ＩｇＭ及びＩｇＤは休止した未成熟のＢ細胞上に存在するが、細胞 表面上に表現されているものと同一の免疫グロブリンイソタイプを分泌する成熟 Ｂ細胞表面上には５つの群の免疫グロブリンのうち１つのみが存在することがあ る。　Ｔｅａｌｅ、　Ｊ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１２６：　１９５２ −１９５７　（１９８１）；　Ｇａｔｈｉｎｇｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、 ５７：１０７−１２６　（１９８１）；　Ｔａａｌｅ、Ｊ、Ｍ、Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、４１：５−９　（１９８２）　。

細菌やウィルスのような多くの病原性微生物は、呼吸、食物や水の摂取及び性的 接触時に気管、胃腸管及び泌尿生殖管を介してヒ、ト及び動物の体内に侵入する 。木、草及び花の花粉、はこり、菌類粒子及び動物のふけのような潜在的にアレ ルギー性の物質は気管を介して体内に侵入する０分泌ＩｇＡはこれらの病原体及 びアレルギー原に対して体を守る助けをする。

ＩｇＡは、上記管の内側の粘膜に沿って位置するプラズマ細胞によって生産され 、該プラズマ細胞は全て外部環境にさらされている。プラズマ細胞によって生産 されたα鎖及び軽鎖免疫グロブリンは粘膜組織中の上皮細胞によって生産された 分泌成分と結合して分泌ＩｇＡ分子を形成し、これは粘膜層の表面に分泌される 。一般的にＪ、Ｇ、Ｎｅｄｒｕｄら、”Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　 Ｍｕｃｏｓａｌ　Ｉｗａｉｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ”、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｖ ａｃｃｉｎｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ５ｐｉｇｇｇ、　Ｄ、 Ｅ、、　Ｋｏｆｆ、　Ｗ、Ｃ，編、　ＣＲＣｌ’ｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔ ｏｎ、　Ｆａ、を参照、これらの分泌ＩｇＡ分子は侵入してくる病原体に結合し 、該病原体が粘膜層を通過し、宿主の内部組織や血流中に侵入する能力を弱める 。一般的にＪ、　Ｇ、　Ｎｅｄｒｕｄら、　”Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ａｎｄ　ｔ ｈｅ　Ｍｕｃｏｓａｌ　ｌ１ｉｕｎｅ　５ｙｓｔｅ１１″、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉ ｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（Ｓｐｉｇｇｓ、 　Ｄ、Ｅ、、　Ｋｏｆｆ、　Ｗ、Ｃ，編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａ ｔｏｎ、　Ｆａ、を参照、ＩｇＡはまた、アレルギー原性物質をも結合すること ができ。

それによってアレルギー原がＩｇＡと結合する二と及び遅延型過敏症に関与する Ｔ細胞を活性化することを妨げる。

ＩｇＡ産生の低い人は、正常なＩｇＡ濃度を有する人よりも種々の感染症に罹り 易く、アレルギー性の疾病に罹患する傾向も高いことが見出された。従って、総 ＩｇＡ又は抗原特異的１ｇＡの濃度を高めることができれば、これらの疾病又は アレルギーを防止することができるかもしれない。

種々のアレルギー原性物質は呼吸又は食物消化を通じて体内に侵入し、急性の抗 体媒介過敏症及び遅延型細胞媒介過敏症を引き起こすことはよく知られている。

感作された人では、花粉２動物のフケ、はこり及び他のアレルゲンに対するＩｇ Ｅ媒介反応により、アレルギー性鼻炎（花粉症）や外因性喘息のような共通的な アレルギー徴候を示す、これらのアレルギー反応において、アレルゲンは気管又 は鼻腔内の粘膜層に入り、好塩基細胞及びマスト細胞の表面にあるアレルゲン特 異的１ｇＥと結合する。好塩基細胞及びマスト細胞の表面のｒｇＨにアレルゲン が結合すると、下層のＩｇＥＦＣレセプターが架橋され、それが引き金となって ヒスタミンや他の薬理的媒介物質が放出され９種々のアレルギー性徴候を示す。

細胞媒介過敏症では、遅延型過敏症に関与するＴヘルパー細胞が活性化される。

これらのＴ細胞はマクロファージを探し出してこれを活性化し、炎症徴候を引き 起こすＢ細胞の膜に結合した免疫グロブリンのエピトープに結合する抗体は、該 免疫グロブリンを産生ずるＢｍｍを排除するために用いることができることが示 されている、すなわち、１９８８年１２月２９日に山間された、公開サレタ国際 出願第ＰｃＴ／ＬＩＳ８８１０４７０１ｔに示されるように、Ｂ細胞膜結合１ｇ Ｅ（分泌１ｇＥ？はない）のトランスメンブラン固定ペプチドに存在する抗原エ ピトープに対して特異的な抗体は、ＩｇＥ媒介アレルギーを患っている患者から ＩｇＥ分泌Ｂ細胞を除去するために用いることができる。

マウスＩｇＧ２やヒトＩｇＧ１のようなある免疫グロブリンクラス及びサブクラ スに属し、標的細胞の表面抗原に対して適当に高い親和性を有してこれに結合す る抗体は、それらの標的細胞を溶解し得る。しかしながら、上述のように、標的 ＩＩＩｊＩｍに特異的な全ての抗体が細胞溶解を引き起こすわけではないが、実 際、あるものはイソタイプのスイッチング、増殖及び抗体産生の増加又は減少を 引き起こす、　Ｖｉｔｅｔｔａ、　Ｅ、Ｄ、ら、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、 　５２二　２１１−２３１　（１９８）；　Ｃｏｏｐｅｒ　Ｍ、Ｄ、ら　、Ｉ　 ＠ｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、　５２：２９−５３　（１９８０）参照、多くの研究 において、ポリクローナル抗体もまたＢ細胞増殖を引き起こすことが示されてい る。　５ｅｌｌ　Ｓ、とＧｅ１ｌ、　Ｐ、Ｇ、Ｈ，Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、１ ２２：４２３−４４（１９６５）；　Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｔら、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、１１５：　１１７９−１１８４　（１９７５）；　Ｐａｒｋｅｒ、　 Ｄ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　２５８：３８１−３６３　（１９７５）；　Ｓｉｅｃ ｋｍａｎｎ、　Ｄ、ｇ、、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１４７：８１４−８２９ ；　Ｐｕｒｅ、　Ｅ、　とＶｉｔｅｔｔａ、　Ｅ、Ｓ、、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏ ｌ、　１２５：　１２４０−１２４２（１９８０）、抗体依存性細胞毒性及び補 体媒介細胞溶解とは異なり、この増殖反応には、抗体のｐｃが関与しているよう には思われない、増殖作用を誘起することにおいては、Ｆ　（ａｂ’　）２が全 抗体よりも有効であることが示されており　（Ｖｉｔｅｔｔａ、　Ｅ、Ｓ、ら、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ。５２：２１１−２３１　（１９８０）　、このこと はＦｃが関与しないことを示している多くの研究者達が、Ｂ細胞の活性に対する 抗免疫グロブリン抗体の効果を研究している。　Ｍｏ１ｌｅｒ、　Ｇ編集のレビ ューである「抗免疫グロブリン血清のＢリンパ球機能に対する効果」Ｉａ＋１ｕ ｎｏ１．　Ｒｅｖ、　ｖｏｌ、　５２には、抗免疫グロブリン抗体は、Ｂ細胞の 増殖を引き起こす能力を包含する、Ｂ細胞に対して種々の効果を有していること が記載されている。さらに、抗ＩｇＭ及び抗ＩｇＧ抗体は休止、未成熟（ｕｎｃ ｏｍｍｉｔｔｅｄ）　Ｂ細胞をＩｇＧ及びＩｇＡの生産細胞に変化させることが できるように思われる。これらの研究は、表面免疫グロブリンを架橋する二価抗 体が８細胞の増殖を刺激するために必要であることを示している。これらの効果 は抗体のＦｃ領域を必要とせず、実際、Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｂ細胞増殖刺激 において全ＩｇＧよりも有効であると思われる。

抗免疫グロブリン抗体でＢ細胞を増殖させることは。

生体内での抗体産生を高めるために極めて望ましいように思われる。しかしなが ら、増殖を達成することば固層である。循環血流中のＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ 抗体の濃度が高いために、投与した抗免疫グロブリン抗体は。

Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンに有意な膜結合する前に循環する免疫グロブリン と結合してしまうであろう、必要なものは、膜結合免疫グロブリンと反応して増 殖又はＢ細胞の変化を引き起こすが、分泌された循環する免疫グロブリンとは反 応しないＢ細胞増殖剤である。

１１立ＩＪ 本発明は、ヒトα鎖の膜結合ペプチド、該ペプチドの細胞外領域上のエピトープ （二こでは「細胞外ＬＬＬＬ！　−ａエピトープ」と記載する）に対する抗体及 びその関連物質５並びにこれらの抗体及び関連物質を用いた予陪及び治療を包含 する。これらの細胞外ペプチド領域は、全体的に又は部分的に、膜結合ＩｇＡに 固有で、分泌ＩｇＡには存在しない抗原エピトープを形成する。

ヒトＩｇＡの膜結合細胞外ペプチド領域は以下のアミノ酸配列を有する。

Ｇ５Ｃ８（ＸｉＩＣ）Ｖ−ＡＤＷＱＭ−ＰＰＰＹＶ−ＶＬＤＬ−ＰＱＥＴＬ−Ｅ ＥＥＰＧ−ＡＮ この配列を含むペプチド又は免疫学的に均等な配列（又はそのエピトープ）はタ ンパク質担体に結合することができ、細胞外ＬＬＬＬ！　−ａエピトープに対す る内発性抗体の生成を誘起するために用いることができる。これらの内発的に生 産された抗体はｒｇＡの合成を変化、すなわち増加させる。細胞外し田−αエピ トープに対して特異的な抗体が、マウスＩｇＧ１やヒトＩｇＧ２のような、ある 免疫グロブリンクラス及びサブクラスに属するものである場合や、Ｆ（ａ、ｂ’ ）２のような二価の抗原結合断片の形態にある場合には、それらを直接投与して ＩｇＡの合成を促進することができる。さらに、ＩｇＭ又はＩｇＤのようなペプ チド又はこれらのペプチドに特異的な抗体はＩｇＡの生産を刺激するために用い ることができる。これらのペプチドや抗体は単独で又はワクチン若しくはアレル ギー原性抗原と組合せてＩｇＡ合成を増大させることができる。対象患者は、感 染症に罹り易い人及びアレルギー性疾病により影響される人を包含する。

の 図１は、ヒトαｌ膜結合ペプチドの２つのイソフオームの膜エクソンの演鐸アミ ノ酸配列及びヌクレオチド配列（１つのイソフオームは小文字で示したアミノ酸 を含む）並びに約１７００ｂｐの５′フランキング配列及び約５００ｂｐの３′ 非翻訳領域を示す。

図２Ａは１図１に示すヒトα１及びα２の膜エキソンのヌクレオチド配列及びマ ウスα鎖からの対応する配列を示す。

１ｍ２Ｂは、図２Ａの膜エクソンによってコードされるアミノ酸配列を示し、提 案される細胞外領域には下線が付されれている。

の　な　の　−法 １．８細胞膜結合免疫グロブリンの膜固定（ａｎｃｈｏｒｊｎｇ）Ｂ細胞の表面 で発現される膜結合免疫グロブリンは、該免疫グロブリンを細胞表面に固定する 、免疫グロブリン重鎖のＣ末端から伸びる余分のペプチド領域を持っているとい う点において、同じＢ細胞によって生産される分泌型の免疫グロブリンと異なる 。これらの余分の領域はそれぞれのイソタイプに固有のものであり、ここでは膜 固定ペプチドと呼ぶ。

数種類の種からの１１個の膜結合免疫グロブリンのアミノ酸配列が決定されてい る。　Ｗｏｒｄ、　ＣＪ、ら、ＥＭＢＯＪ、２：８８７−８９８　（１９ｇ３） ：　ｌ５ｈｉｄａ、　Ｎ。ら、ＥＭＢＯＪ、１：１１１７−１１２３（１９８２ ）；　５ｔｅｅｎ、　Ｍ、Ｌ、ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１．７７：１９ −３２　（１９ｇ４）；　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｊ、ら、Ｃｅ１ｌ、　２Ｂ：　１９ −２７　（１９８１）；　Ｙａｍａｗａｋｔ−Ｋａｔａｏｋａ、　Ｙ、ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７９：２００８−２ ０１２　（１９８２）；　Ｋａｍａｒｏａｉｙ、　Ｍ、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｋｄｓ　Ｒｅｓ、、１１：６７７５−６７５８　（１９８３）：　Ｒｏｇ ｅｒｓ　Ｊ、ら、Ｃｅ１ｌ、　２０：３０３−３１２　（１９８０；　Ｂｅｒｎ ｓｔｅｔｎ、　Ｋ、Ｅ、　Ｊ、　■Ｉｌ＋ＩＩｕｎｏ１．１３２：　４９０−４ ９５　（１９ｇ４）；　Ｃｈａｎｇ、　Ｅｌ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９６：４ １０　（１９８２）；Ｒｏｂｂｉｔｔｓ、Ｔ、Ｈ，ら、Ｎｕｃｌｅｆｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、９：４５０９−４５２４参照、これらの配列は膜固定ペプチドの ある共通の特徴を示している１表１に示すように、膜固定ペプチドは、原形質膜 に対する位置に基づいて識別可能な３つの領域を有している。これらのペプチド は、４１〜１３０アミノ酸から成る短いものであり、しばしば「膜結合領域Ｊと 呼ばれるが、これらのペプチドは膜の脂質二重層中に全部が存在するわけではな い、実際、ペプチドの中央部分に位置する、疎水性の強い残基、スレオニン及び セリンから成る２５アミノ酸残基のみが脂質二重層中に存在する。３２８アミノ 酸残基から成るＣ末端親水性領域は、細胞質側の膜表面に存在する。免疫グロブ リン重鎮の第３又は第４定常領域（ＣＨ３又はＣＨ４）に結合する、Ｎ末端領域 は、非常に親水性が高く、原形質膜の細胞外。

側上の表面に存在する。

（↓゛ス１；侶ミ白） 表１．　８細胞上の膜結合免疫グロブリンに固有なペプチド領域の重要な特徴第 １領域　中部領域　最終領域　合計 性質　疎水性１強酸性　疎水性、非帯電　疎水性工旦は膜結合、二二は細胞外、 １ｍは膜中、１旦は細胞内を示す。

膜結合免疫グロブリンの最も短い細胞外領域（ｍｂ／ｅｃ領域と表示）は１３個 のアミノ酸残基を有する（マウス及びヒトμ鎖）０表２参照、全ての免疫グロブ リンのｍ　ｂ　／　６　Ｃ領域は、帯電した。酸性アミノ酸残基の含有率が高い 、帯電酸性アミノ酸残基及び極性親木性残基は、ｍ　ｂ　／　ｅ　Ｃ領域中のア ミノ酸の非常に高い割合を占める（表３）、二のことは、全てのｍ　ｂ　／　ｅ 　Ｃ領域は露出しており、抗体によって接触可能な十分な長さを有していること を示している。免疫グロブリン重鎖は、マウス、ラット及びヒトを包含する種々 の哺乳動物の前に進化した。従って、ヒトαｍ　ｂ　／　ｅ　ｅに最も関係が深 いものはおそらくマウスαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃである。マウスαｍｂ／　ｅ　ｃ は２６アミノ酸残基を有し、このうち５個がＧＩＵで２個がＡｓｐであり、これ らは共に酸性である。このことは、提案されたＷＩ似のヒトαｍ　ｂ　／　ｅ　 Ｃ領域もまた酸性残基を有しており、露出されて抗体が接触可能であることを示 している。

表２．　膜結合免疫グロブリンに固有なペプチド領域の細胞外部分（ｙｎｂ／ｅ ｃ）領域のアミノ酸配列 Ｍ亘２旦二皿撞 マウスＩｇＡ　Ｅ−ＲＱＥＰＬ−ＳＹＶＬＬ−ＤＱＳＱＤ−ＩＬＥＥＥＡＰＧＡ Ｓ？’ＦＸＩｇＥ　ＥＬＤＩ　・ＱＤＬＣＩ　・ＥＥＶＥＧ−ＥＥＬＥＥ５ット ＩｇＥ　ＥＬＤＩ−ＧＤＬＣＴＥＥＶＥＧ−ＥＥＬＥＥマウスＩｇＧ、　ＧＬＱ −ＬＤＥＴＣ−ＡＥＡＱＤ−ＧＥＬＤＧマウスｒ　ｇＧｘａ　Ｇ　Ｌ　Ｄ−Ｌ　 ＤＤＶＣ−ＡＥＡＱＤ−Ｇ　Ｅ　Ｌ　ＤＧマウスＩｇＧ、、　ＧＬＤ−ＬＤＤＩ Ｃ−ＡＥＡＫＤ”ＧＥＬＤＧマウスＩｇＧ、　ＥＬＥ−ＬＮＧＴＣ＠ＡＥＡＱＤ 　ＩＩＧＥＬＤＧｖ’ｙＸＩｇＭ　ＥＧＥ−ＶＮＡＥＥ−ＥＧＦＥＮヒトＩｇＭ 　ＥＧＥ・ＶＮＡＥＥ−ＥＧＦＥＮ１ニドＩｇＤ　ＹＬ−ＡＭＴＰＬ−ＩＰＱＳ Ｋ−ＤＥＮＳＤ−ＤＹＴＴＦ−Ｄｆ）ＶＧＳｖ’ｙＸＩｇＤ　ｒ−ＶＮＴＩＱ− ＨＳＣＩＭ−ＤＥＱＳＤ−５ＹＭＤＬ−ＥＥＥＮＧ表３．　Ｍｌ結合免疫グロブ リンに固有なペプチド領域の細胞外領域（惠亘Ｚ旦旦領１ｍり中の帯電アミノ酸 及び極性、疎水性アミノ酸残基の組成マウスＩｇＡ　７　１　７　１５　５Ｂマ ウスＩｇＥ　１０　０　２　１２　６３ラットＩｇＥ　１０　０　２　１２　６ ３マウスＩｇＧ、　６　０　４　１０　５６マウスＩｇＧ、、　７　０　２　９ 　５０マウスＩｇＧ麿ｈ？　Ｌ　ｌ　９　５０マウスＩｇＧｓ　６　０　４　１ ０　５６マウスＩｇＭ　６　０　２　８　６１ ヒトＩｇＭ　６　０　２　８　６１ ヒトＩｇ０　６　１　８　１５　５６ マウスＩｇＤ　７　０．５　９　１６．５　６３酸性残基　Ｅ　（Ｇｌｕ）、Ｄ 　（Ａｓｐ）４　、　Ｉ　Ａ　ｍｂ　ｅｃ　α　ｍｂ　ｅｃヒトαｍ　ｌ）　／ 　６　Ｃ領域に対応するＤＮＡ配列を、下記に例示するようにして決定した。ペ プチド領域をコードするエクソンのヌクレオチド配列及び外領域のアミノ酸配列 を図１及び２に示した。

本発明のαｍｂ／ｅｃペプチドは図２に示すアミノ酸配列、該配列のあらゆる免 疫学的に活性な部分及び該配列に含まれるあらゆるエピトープを包含する。さら に。

αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドは、該ペプチドの免疫学的活性を有意に損なうこ となく図２に示す配列に付加、挿入、欠失又は置換が行なわれたＮ２に示す配列 のあらゆる修飾物をも包含する。該ペプチドの免疫学的活性は、抗体との反応性 及び単独で又は担体に結合した状態で免疫応答を誘起する能力（αｍ　ｂ　／　 ｅ　Ｃ領域及び細胞膜上のネイティブＩｇＡの両方に対する交差反応性を包含す る）を包含する。

このような免疫学的ペプチドは、Ｆｍｏｃケミストリーを適用するランプシステ ム（デュポン社）のような従来技術により合成する二とができる。あるいは、こ れらの組換えペプチド又はこれらのペプチドのエピトープを含む免疫グロブリン 重鎖は、該ペプチドをコードする配列を含む遺伝子断片を大腸菌又は噌乳動物細 胞中で発現させることにより生合成する二とができる。

５、ｍｂｅｃに αｍ　ｂ　／　ｅ　ｅペプチドは、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体 を調製するための、動物の免疫に用いる二とができる。また、これは特定のモノ クローナル抗体のスクリーニングのために又は特定のポリクローナル抗体の特徴 づけのためにも用いることができる。また、これはモノクローナル抗体及びポリ クローナル抗体の精製に用いることもできる。

αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドに特異的なモノクローナル抗体の調製方法におい ては、合成又は組換えαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドを免疫化及び抗体同定過程 のいずれにも用いる必要はない８例えば、ミエローマ細胞との融合のための免疫 牌細胞を調製するためのマウスの免疫化において、免疫原は、例えばＤＡＫ　Ｉ 　Ｋ　Ｉリンパ芽球（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ。

ｉｄ）のようなＩｇＡ−担持ミエローマ細胞の原形質膜から単離された膜結合Ｉ ｇＡであってもよいし、ＩｇＡ−担持ミエローマ細胞自身であってもよい、マウ スミエローマ細胞をヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子でトランスフェク トし、細胞表面に膜結合免疫グロブリンを発現するトランスフェクトマス（ｔｒ ａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ）もまた免疫原として用いることができる。免疫化の後 の最初のモノクローナル抗体同定のために、ウシ血清アルブミン又はオバルブミ ンに後述の方法により結合された上記合成ペプチドが好ましく用いられる。

合成又は組換えαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドを免疫原として用いる場合には、 これらを例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原、コア抗原又は好ましくはキーホール リンビットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなタンパク質担体に結合するとより効 果的である。ペプチド領域がリジン残基を欠いているか又はリジン残基がペプチ ド領域の中央部分にある場合には、Ｃ末端にリジン残基を加えることが好ましい 、Ｎ−末端は既にα−アミノ基を有しているので、この修飾合成ペプチドは結合 のための２つのアミノ基を有することになる。

複数のペプチド分子を担体タンパク質分子のそれぞれに結合することができる。

ＫＬＨの場合には、ペプチド体ＫＬＨの好ましいモル比は１０である。結合の方 法は十分確立されている。スペリン酸ビス（スルホサクシンイミジル）又は酒石 酸ジスルホサクシンイミジル（カタログ番号２１５７９．２０５９１、ピアスケ ミカル社、イリノイ州ロックフォード）又は好ましくはグルタルアル・デヒドの ような架橋剤を用いることができる。

例えばＫＬＨ結合体のような免疫原は、αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドに特異的 なポリクローナル抗体を調製するためにウサギ、ヤギ、ラット又はマウスを免疫 化するために用いることができる。免疫マウス及びラットの膵臓やリンパ節から のリンパ球はまたαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドに特異的なモノクローナル抗体 を分泌するハイブリドーマを調製するために取得することができる。モノクロー ナル抗体を調製するための好ましいプロトコールはマウスの免疫牌細胞を、ポリ エチレングリコールを用いてＮ５−１細胞やＳ　Ｐ　２１０細胞のような非分泌 マウスミエローマ細胞と融合する二とである。

マウスを免疫化する好ましい方法は、フロイントの完全アジュバント中に５０μ ｇのペプチド−ＫＬＨ結合体を含む液を皮下注射することである。２週間及び４ 週間後に同量の抗原をフロイントの不完全アジュバントと共に投与する。約６週 間後、食塩水中に抗原を含む液を腹腔内投与して４回目の抗原注射を行なう、マ ウスを最終注射４日後に殺し、ミニコーマ細胞との融合のための単一細胞懸濁液 を調製するために膵臓を取り出す。

同様なプロトコールは他の免疫原で免疫を行なう場合にも用いることができる０ 例えば、免疫原が、ＤＡＫ　ＩＫＩリンパ芽球細胞のようなＩｇＡ−担持ヒトミ エローマ細胞の原形質膜から単離され°た精製ネイティブヒト膜結合ＩｇＡ（結 合された膜固定ペプチドを有する）又は遺伝子操作された細菌によって生産され る組換えα鎖である場合に同様なプロトコールを用いることができる。

ポリエチレングリコールを用いた融合操作並びにクローニング及びハイブリドー マ培養に関する他の種々の操作は十分に確立されている。好ましいプロトコール は２例えば、Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｌ及び）ｌａｙ、　Ｆ、Ｃ，（Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第　２　版、　ｐｐ、３０３−３１３．　１９８０ ．　Ｂｌａｅｋｗｅｌｌ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、　、ボストン）に記載さ れた周知の方法である。

αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドと反応するモノクローナル抗体（又はポリクロー ナル抗体の同定）のためのハイブリドーマのスクリーニングは、固相抗原として 合成又は組換えαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドを用いたＥＬＩＳＡにより行なう ことができる。固相抗原としては、αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドと免疫原とし て用いたものとは異なる、オバルブミンやウシ血清アルブミンのような担体タン パク質との結合体を用いることもできる。

モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のさらなる特徴を表５に示す、これ らの試験に用いた分析方法をも示す、これらの分析方法は、１９８８年７月２９ 日に出願された米国特許出願第０７／２２６，４２１号及び１９８７年１２月３ １日に出願された米国特許出願第０７／１４０，０３６号に詳細に記載されてい る。

合成ａ　ｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチド　＋　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ可溶性ＩｇＡ　−Ｅ ＬＩＳＡ ＤＡＫ　Ｉ　Ｋ　Ｉミエローマ細胞　＋　ＥＬＩＳＡＩｇＡ−担持Ｂ細胞　＋　 免疫蛍光染色ＩｇＡを発現していない細胞　免疫蛍光染色６．１１ｉｆ互遺１ 動物モデル系を用いて物質及び方法を試験した１種々の免疫グロブリンのｅ　ｃ 　／　ｍ　ｂを表わすペプチド及びこれらのｅ　ｃ　／　ｍ　ｂ領域上のエピト ープに特異的な抗体が動物において種々のイソタイプの免疫グロブリンの生産を 促進するかどうかを調べるために多くの実験が考えられる。特定のイソタイプに 関するペプチド及び抗体は数種のイソタイプ及びサブクラスに影響を与えるかも しれない、以下に述べる検討において、我々はαｅ　ｃ　／　ｍ　ｂ領域に関す るペプチド及び抗体に主として焦点を当てる、動物実験は以下のことを試験する ことを目的とする。

ａ）ペプチド及び抗体は抗体産生を高めるか。

ｂ）ペプチド及び抗体は粘膜表面における分泌１ｇＡの生産を高めるか。

Ｃ）ペプチド及び抗体が感染症を防止するために予防的に使用できるか。

ｄ）ペプチド及び抗体が免疫不全症の患者に使用できるか。

ｅ）ペプチド及び抗体がアレルギー疾患の徴候を防止するために患者に使用でき るか。

最も関連の深い系の２つは以下の通りである。

Ａ−１ｕＬ豆１１Ｊ ヒトαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドに特異的なモノクローナル抗体及び本発明の その関連物質Ｃよ、これらがアヵゲザルのＩｇＡ担持細胞と反応するか否かを決 定する。

線虫Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍに感染したアヵゲザルの一部は、線虫の抽出物に 対する感受性を持っている。これらの感受性サルに線虫抗原を含むスプレーを与 えると、それらは喘息に似た呼吸障害を生じる。パダーリン、Ｒ，Ｊ、　ｅｌｆ ■、江■ム、Σ：５８６−５９３　（１９７６）　。

喘息／アカゲザルモデル系を用いて本発明の種々の組成物を調べることができる 。線虫感受性サルに試験処理又は対照処理を行ない、以下のことを調べる。

（ａ）線虫を投与することに伴う喘息徴候は減少するか（ｂ）循環ＩｇＡは増加 するか。

（Ｃ）肺洗浄において分泌ＩｇＡは増加するか。

（ｄ）線虫抗原特異的１ｇＡは増加するか。

（ｅ）循環血液及び粘膜層中のＩｇＡ−担持Ｂ細胞は増加するか。

Ｂ、マ　モル マウスのαｍ　ｂ　／　ｓ　ｃ領域は既に配列が決定されている。　Ｗｏｒｄ、 　Ｃ，Ｊ、ら、ＥＭＢＯＪ、　２：８Ｂ’ｌ−８９８（１９８３）、２８個のア ミノ酸配列は次のとおりである。

Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ４ｙｒ−Ｖａ ｌ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉｎ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ　・Ｉ　１ ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　１ｕ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ・Ａ Ｉａ−Ｓｅｒ ′このペプチドは、Ｃ末端にさらにＬｅｕ−Ｌｙｓ残基を有するものを包含する 。数種類の形態で合成される。

このペプチド及びそのＫＬＨ結合体はウサギ及びヤギを免疫化するための抗原と して用いられる。抗原特異的抗体は、該ペプチド（Ｌｅｕ−ＬｙＳ付加を有する ）又は該ペプチドがオバルブミン若しくはウシ血清アルブミンに結合したものを 結合するセファノース４Ｂカラムを用いて精製される。あるいは、該ペプチドと ＫＬＨとの結合物は、ラットに免疫化して上述（セクション５）の方法によりマ ウスαｍ　ｂ　／　６　Ｃに特異的なモノクローナル抗体を精製させるために用 いられる。

正常なマウスに、精製抗体又はその関連物質を静脈内注射又は腹腔内注射する。

マウスにはまた、ＫＬＨに結合したαｅ　ｃ　／　ｍ　ｂペプチドを投与して免 疫応答を誘起し、抗αｅ　ｃ　／　ｍ　ｂ抗体を内発的に産生させることもでき る。それらはまた、抗体又はペプチド処理と組合せて例えばロータウィルスのよ うなウィルス抗原で免疫することもできる。ｒ１４べるべき点は以下の通りであ る。

（ａ）循環血流中の総１ｇＡは増加するか。

（ｂ）腸管内の総分泌ＩｇＡは増加する゛か。

（ｃ）抗原特異的１ｇＡは増加するか。

（ｄ）膵臓及びバイエル集腺中のＩｇＡ担持Ｂ細胞の数は増加するか。

（ｅ）マウスは生きたウィルスによる攻撃により良く耐えられるか。

７、　Ｌｉｈ　−−に′（αｅ Ｃｍｂべ　１　このエ　−ブに　−的」Ｌ坑」（の１護 αｅ　ｃ　／　ｍ　ｂペプチド及びαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃエピトープに特異的な 抗体はヒト及び他の動物（例えばイヌ、ネコ及びウマ）において総１ｇＡ、分泌 ＩｇＡ又は抗原特異的ＩｇＡを増加させるために用いることが７きる。

Ａ、ＩｇＡ−担持細胞に特異的な抗体 マウスＩｇＧ１並びにヒトＩｇＧ２及び１ｇＧ４のようなあるＩｇＧサブクラス の抗体やＦ　（ａｂ’　）２断片は抗体産生を促進するために用いることができ る。抗体は、■ｇＡ担持Ｂ細胞の増殖を誘起するのに十分な量患者に遊離抗体（ 好ましくは静脈内投与により）として投与することができる。

抗体はまた経鼻投与することができる。ＩｇＡ産生Ｂ細胞の濃度は鼻腔及び気管 の内側において最もその濃度が高い、経鼻投与（例えば経鼻スプレー）は、鼻腔 及び気管に比較的高濃度の抗体を分配することができ、それによってより迅速で 効果的な結果を得ることができる。

抗体はまた１点眼投与することもできる。

ヒトの治療、特に反復投与又は長期間にわたる投与が必要な場合には、ヒト又は キメラのより免疫原性の低い抗体が好ましい、ヒト抗体又はその断片はヒトゲノ ム発現ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州うジ ョラ）から容易に調製することができる。キメラ抗体は動物抗体から誘導された 可変又は抗原結合（超可変又は相補性決定）領域とヒト抗体から誘導された残り の領域を有する。キメラ抗体（例えばマウス／ヒト）を生産する方法は十分確立 されている。キメラ抗体は大量に生産することができる。ヒト又はキメラ抗体の 抗体断片ちまた用いることができる。

本発明の抗体を用いる免疫治療は従来のワクチン接種及び脱感作免疫治療と組合 せて用いることができる１例えば、アレルゲンによる脱感作は抗αｍｂ／ｅｃ抗 体の投与と組合せて行なうことができる。

Ｂ、ａｍ工乙６Ｃ生グー」−厘」Ｌ生に工Ｚ」」ニーとΣ二ｊに　−七 ヒトαｍ、　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドはおそらくヒトにおいて免疫原的ではない けれども、同一の配列を有する合成又は組換えペプチド又はその免疫学的な均等 物をＢｆｉ肝炎ウィルス表面抗原、コア抗原又はＫＬＨのような担体タンパク質 に結合することにより、免疫原性を付与し、正式なαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃエピト ープと交差反応する抗体を誘起することができるようになる。好ましい合成又は 組換えベプチＦ（＊Ｇ５Ｃ５（又はＣ）Ｖ−ＡＤＷＱＭ−ＰＰＰＹＶ−ＶＬＤＬ Ｐ−ＱＥＴＬＥ−ＥＥＰＧＡ−Ｎの７ミ／酸配列を有し又は上述の免疫学的均等 物である。これらのαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチド結合体は感染症又はＩｇＥ− 媒介アレルギーに罹り易い患者に投与する二とができる。

この能動免疫により誘起される抗体は、セクションＡで記載した抗体と同一の機 能を達成することができる。

Ｃ、イ　−　プ　−び一久一用一互一／ｅＣ−Ｚ工に’ｌ二ニニプ； 上述したαｍ　ｂ　／　ｅ　ｃ特異的抗体は、ＩｇＡ産生を刺激する他の形態を 提供する、パラトープ特異的抗イデイオタイプ抗体を生成させるために用いるこ とができる。

αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃに特異的な抗体のバラトープに対する抗体は、抗ＩｇＡ抗 体が特異的なエピトープに構造的に類似しており、すなわち、それらはαｍ　ｂ 　７　ｅ　ｅエピトープに類似している。これらの抗イデイオタイプ抗体（好ま しくはキメラ若しくはヒト抗イデイオタイプ又はそれらの断片又はそれらの抗原 結合部位を含むペプチド）を免疫量投与し、αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃ〜に対して能 動免疫し、αｍｂ／　ｅ　ｃエピトープに対する抗体の内発的生成を誘起するこ とができる０ｍ起された抗体はαｍｂ／ｅｃ特異的抗体の種々の予防的及び治療 的効果を媒介するであろう。

８．１１見１ αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃエピトープに対する抗体は、混合白血球細胞中のＩｇＡ担 持リンパ球の数及び相対比率を決定するために用いることができる。αｍ、　ｂ 　／　ｅ　ｃ特異的抗体は、細胞のＦｃレセプター上に分泌免疫グロブリンを担 持する細胞とは反応しない、このような細胞はマクロファージ及び活性化Ｔ細胞 を包含する。ＩｇＡ−担持Ｂ細胞の比率はその人の免疫状態を示しているかもし れない、該情報は、ＩｇＡ−発現Ｂ細胞の増殖を引き起こすためにどれだけの量 の抗体を投与すべきかを示し得る。この目的のために、細胞表面抗原を決定する ために用いられる標準的な分析形式を用いることができる。一般的に、抗体は、 試料中のＩｇＡ担持細胞との結合が許容される条件下において被検白血球試料と 接触される。細胞は次いで抗体との結合について調べられる。これは従来の細胞 染色操作によって行なうことができ、例えば、蛍光ラベルした第２抗体を用いて 抗ＩｇＡ抗体の結合を検出実施例　αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃペプチドの配列決定ヒ トゲノムＤＮＡライブラリーはストラタジーン社（カリフｔルニア州うジョラ） から購入した。二のライブラリーはヒト肺フィブロブラストセルラインＷＩ３８ のゲノムＤＮＡを用いて構築され、ファージＦＩＸにパッケージされている。免 疫グロブリンアロタイプα１及びα２のＣＨ３コード領域中に位置する領域に対 応する、３０塩基から成るオリゴヌクレオチド５’　ＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣ ＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＣＣＧＧＣ３″　（オリゴ＃１）を合成し、プロー ブとして用いて、インサイチュ−ハイブリダイゼーションによりα１又はα２を 含むファージクローンをスクリーニングした。

１−−　ンＩ　ぐヨン　ＰＣＲ ゲノムＤＮＡ断片を増幅するために、陽性クローンからの精製ＤＮＡを鋳型とし て用いた。１つのプライマーは、ＣＨ３エクソンの約１ｋｂ下流に位置するイン トロン中に位置する１７塩基のオリゴヌクレオチド５’　ＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣ ＡＡＧＴＣＴＣ３″　（オリゴ＃２）であり、他方のプライマーは、報告された マウスα膜エクソン（Ｗｏｒｄら、ＥＭＢＯＪ、２：８８７，１９８３）中の非 常に保存性の高い（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）領域である、２１塩基のオリゴ ヌクレオチド５’　ＧＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＡＧ３’　（オリ ゴ＃３）であった、ヒトＣＨ３及び膜エクソンにわたるｃＤＮＡを増幅するため に、表面１ｇＡ発現セルライン（後述）からのｍＲＮＡから逆転写された精製ｅ ＤＮＡを鋳型として用いた。１つのプライマーはＣＨ３エクソン中に位置する、 ゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた３０塩基のオリゴヌクレオチド（ ＃ｌ）であった、他のプライマーは、ヒトα膜エクソンと３°非翻訳領域の接点 に位置する１８塩基のオリゴヌクレオチド５’　ＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＡ ＣＴＧＧ３’　（オリゴ＃４）であフた。

ＰＣＲはＤＮＡサーマルサイクラ−（パーキンエルマーシータス社製）中で行な った９反応条件は変性が９４℃、１分間、アニーリングが５０℃、２分間、Ｔａ ｑポリメラーゼ（バーキンエルマーシータス社製）による反応がゲノムＤＮＡに ついては７２℃、５分間、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａについては７２℃、４５秒間であった １反応サイクルはゲノムＤＮＡについては３０回、ｃ　ＤＮＡについては４０回 であった。

ローニン　シーヱ之り上グ ＰＣＲ産物をフェノールで抽出した。新しく合成されたＤＮＡ断片をヤエナリ（ Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（ユナイテッドスティンバイオケミカル社製 ）で平滑末端化し、その５′末端をポリヌクレオチドキナーゼにューイングラン ドバイオラブス社製）でリン酸化した。増幅された所望のＤＮＡ断片はアガロー スゲル電気泳動で単離し、プラスミドｐＵｃ１９（ユナイテッドスティッパイオ ケミカル社製）のＳｍａｒ部位に挿入した。大腸菌ＤＨ５α（ベセスダリサーチ ラボラトリーズ社製）に形質転換した後、増幅したプラスミドをＣＩ　ＲＣＬ　 Ｅ　Ｐ　ＲＥＰキット（ＢＩＯＩＯＩ）を用いて精製した。挿入断片のＤＮＡ配 列は、Ｔ７シーケンシングキツト（ファルマシア社製）を用い、二本鎖ＤＮＡに ついてジデオキシ法により決定した。膜エクソン領域は、エラーを最少にするた めにＤＮＡの両方の鎖について行な７た。ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅された α遺伝子断片の挿入物を含むクローンを同定するためにさらなる工程を行なった 、コロニーは、ＰＣＨに用いた２つのプライマーの間に位置する２２ヌクレオチ ド５’　ＣＣＴＣＣＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴ３″　（オリゴ＃５、 図１における領域＃１７７４−１７９５）であるオリゴヌクレオチドとパイプリ ダイズさせた。

ン　ロψ　ローン 上述のように、シーケンシングに用いた第１のゲノムＤＮＡ断片は、２つのプラ イマーを用いたＰＣＲ増幅により得られたちのであり、用いた３′末端プライマ ーは膜エクソンの中央部分に存在するものであった。膜エクソンの３′末端の残 部及び３°非翻訳領域の配列を決定するために、これらの領域を含む遺伝子断片 を調製した、ヒトαｌ及びα２断片を含むクローンからの精製ゲノムＤＮＡを制 限酵素Ａｖａｌで消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、標準的なサ ザンプロット法に従ってニトロセルロースろ紙上にプロットした。上述した膜エ クソン中に存在する３２ＰＩ［識オリゴヌクレオチド（オリゴ＃５）をプローブ として用いてオリゴヌクレオチドプローブに隣接する領域を含むＤＮＡ断片を同 定した。陽性の領域を次いで単離し、ｐＵｃ１９のＡｖａｌ制限部位にサブクロ ーニングし、サザンプロット分析で用いたのと同じオリゴヌクレオチドを用いて 下流に向けて配列決定を行なった。

ＲＮＡ　ｃＤＮＡの 膜ＩｇＡ−発現セルラインであるＤＡＫＩＫＩ　（ＡＴＣＣＴｌＢ２０６）をｍ ＲＮＡ源として用いた。グアニジウム法を用いて総ＲＮＡを分離するために約５ ｘＬＯ７細胞を収穫した。精製ＲＮＡを鋳型として用い、膜エクソンの末端のオ リゴヌクレオチド（オリゴ＃４）をプライマーとして用い、ｃ　ＤＮＡ第１鎖を 逆転写酵素ＡＭＶ　（ライフサイエンス社製）を用いて、該製品の指示書に従っ てポリメライズした。

紋ｊ Ｌム星ＤＮＡ　％−α１　α２　玉ユｍユヱ」１１盈ガ」」巳己ＯｆｆムＺ先上 上ＪＪヒトゲノムライブラリーからヒトα１及びα２重鎖遺伝子領域を含む９つ のラムダファージクローンが同定された。これらのクローンは、オリゴ＃３及び オリゴ＃２をプライマーとして用いるＰＣＲの鋳型として直接用いた。ＰＣＲの ための５′末端プライマー（オリゴ＃２）は、報告されたＤＮＡ配列の３′末端 付近に位置するヒトα１及びα２遺伝子間と同一の領域から選択され、該領域は ＣＨ３の約１．ｌｋｂ下流のイントロン中で終わるものである。Ｆｌｎａｇｅｎ 、　Ｊ、Ｇ、ら、　Ｃｅ１ｌ　３６：　６８１−６８８　（１９８４）　、遺伝 子がα１及びα２サブクラスに属するか否かは、オリゴ非２プライマーの直下流 のサブクラス特異的配列により識別できる。αｌ及びα２膜遺伝子領域は両方と も我々の９つののラムダゲノムクローン中に同定された。アガロースゲル電気泳 動により、ＰＣＲ産物は３つのバンド、すなわち１８ｋｂと３００ｂｐの大きな ２つのバンドと２．２ｋｂの小さなバンドに分離された。既に配列決定されてい るマウスα遺伝子中の対応する領域のサイズから判断して、１．８ｋｂの断片が 所望の断片であると考えられた。このＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、 サブクローニングし、配列を決定した。

この１．８ｋｂの断片は、その３′末端上にマウスα膜エクソンのものと非常に 相同性の高い約１２０ｂｐの配列があることを示した。スプライシングアクセプ ター配列であり得る５゛・ＴＴＧＣＡＧＡ３′がこの１２０ｂｐの領域の近傍に 同定された。１．８ｋｂ断片は膜エクソンの中央で終わるので、１にエクソンの 残部及び３′非翻訳領域の配列は、膜エクソンにフランキングする領域を含む他 のラムダクローンをサブクローニングしシーケンシングすることにより得られた 。これらのクローンは、膜エクソンからのプローブ（オリゴ＃５）を用いたサザ ンプロット分析により同定された。

膜エクソン（１９４ｔＭ））の配列、約１７００ｂｐの５′フランキング配列及 びα１サブクラスの３″非翻訳領域中の約５００ｂｐの配列が図１に示されてい る。二の配列は、停止コドンＴＧＡがマウスα膜エクソンのものと全く同じ位置 に存在することを示しており、このことはヒト及びマウスのα膜エクソンが共に １９４ヌクレオチドの長さを有していることを示している。膜エクソンから約４ ｏｏｂｐ下流に、ｍＲＮＡ停止及びポリアデニル化シグナルであり得る５’　Ａ ＡＴＡＡＡ３°　（！Ｅｌｌ中下線を引いたヌクレオチド）が存在する。マウス α遺伝子と同様に、ヒトα遺伝子もただ１つの膜エクソンのみを有するが、他の 全てのクラスの公知のヒト及びマウス重鎖遺伝子は２つの膜エクソンを有する。

ＣＨ３と膜エクソンとの間のイントロンは約２５７９ｂｐであり、これはマウス の２３５０ｂｌ）よりもやや長い、このイントロン中に約６３０ｂｐ　Ｃ図１に おいて鍵括弧で囲んだ部分）が存在し、この部分にはＣ塩基がわずかに数個しか なく、５’　ＧＧＡＴＧＧＡ３’　の配列が２０回以上繰り返され、他の繰り返 し配列も存在する。この意義は道である。

ｃＤＮＡ二ついて　ＰＣＲＤＮＡ 上述のように、ヒトα膜エクソンは、ゲノムＤＮＡから増幅された領域の配列を マウスのα膜エクソンの配列と比較し、また、スプライシングアクセプターコン センサス配列を探すことによって突き止められた。１９４ヌクレオチドの領域（ 図１においてヌクレオチド＃１７６０から＃１９５３）は膜エクソンであると最 初に考えられた。これを確認するために、我々は、ヒト膜１ｇＡ−発現セルライ ンＤＡＫ　Ｉ　Ｋ　Ｉからの総ＲＮＡを単離し、そのｃＤＮＡを調製した。この ｃＤＮＡを鋳型として用い、ＣＨ３及び膜エクソンにまたがる領域をＰＣＨによ り増幅した。ＰＣＲサイクルを３０から４０に増やしたけれども、増幅の効率は ゲノムＤＮＡのＰＣＲの場合はど高くはなかった。これはおそらく総ＲＮＡから 調製されたｃＤＮＡ中の所望の鋳型の比率が比較的低かフたことによるものと考 えられる。アガロースゲル電気泳動において、ＰＣＲ産物はその近傍に大きなじ みがある、正しい大きさの弱いバンドを示した。このバンドを切り出し、サブク ローニングした。特定のクローンを同定することを助けるために、ＰＣＨの２つ のプライマー間に存在するプローブを用いてインサイチュ−コロニーハイブリダ イゼーションを行なった。陽性のクローンをピックアップし、精製し、ゲノムＤ ＮＡについて用いたのと同じ方法を用いて配列決定した。

結果は、ヒト膜結合αｌのｍ　ＲＮ　Ａの２つの種に対応するＤＮＡ挿入物を含 むクローンが存在することを示した。該２つのｍＲＮＡ種は、２つの異なるスプ ライシングアクセプタ一部位を用いたことに起因する。スプライシングアクセプ タ一部位の１つはマウスα遺伝子中にその対応部位が存在する５’　ＴＴＧＣＡ ＧＡ３’　であり、もう１つは、マウスα遺伝子中に対応する部位が存在しない 、同一のリーディングフレーム中の１８ヌクレオチド上流の５″ＴＧＧＣＡＧＧ ３’　であった（スラッシュは開裂／スプライシング部位を示す）、該２つのｍ ＲＮＡ種は、膜固定ペプチド領域中の６５アミノ酸及び７１アミノ酸から成る２ つの膜結合α１ポリペプチドを与える（図１及び２Ｂ）、これらの２つのｍ　Ｒ Ｎ　Ａ種及びこれらの対応するα１ペプチドはイソフｔ−ムと呼ばれる、図１及 び１ｉｉｌ１２Ｂに示されるように、イソフオーム２（長い方）中の６つの余分 のアミノ酸残基は小文字で示されている。

これらの２つのイソフォーの膜固定ペプチドの提案された細砲外領域は、それぞ れ２５アミノ酸又は３１アミノ酸残基の長さを有する（αｍ　ｂ　／　ｅ　ｃと 表示）、これらの領域は、酸性残基の比率が高いという事実に基づき細砲外のも のであると考えられる。これらのｍ　ｂ　／　６　Ｃ−α１領域は抗体に基づく 治療のための標的抗原エピトープである０図２Ａはマウスαと比較したヒトα１ 及びα２の膜エクソンのヌクレオチド配列を示す９図２Ｂはヒトα１及びα２の 膜エクソンの演鐸アミノ酸配列並びにマウスαとの比較を示す、ヒトα１及びα ２がマウスαと非常に相同性が高い二とがわかる。イソフオーム１についてはα ｌとα２のｍ　ｂ　／　ｅ　ｃ−αペプチドが同一であり、イソフｔ−ム２につ いてはわずか１つのアミノ酸残基が異なる。

当業者は、本発明の上述した実施例に均等な多くの均等物を認め、ルーチンな実 験を超えるものを用いることなくそれらを確認することができるであろう、この ような均等物は以下の請求の範囲に含まれる。

ＦＩＧＵＲＥ　１ １　ｃｔｃｃｃａｔｃｃｃｔｔｃｃｔａａｇｃｃｃａａｃｔａｇｇａｃｃｃａａ ａｇｃａｔａｇａｃａｇｇｇａｇｇｇｇｃｅａｅｇｔｇｇ６１　ｇｇｔｇｇｃａ ｔｃａｇａａｇＣＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＣＡＧＬ８１　ＣＡＣＴＣＡＧＡＣ ＴＣＣＣＡＣＡＡＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣ ＴＧＧＴＣｃｌ：Ｃ’！’（ＪＧＧＣＣ（ｊ３１Ａ。

６耗 国際調査報告 ｌｌ１１１１Ｑ＠１４８６１　ａｅ１１１１ｃｍ嚇Ｎｏ、　Ｐ（ゴ／ｌｌｓＱｏ １０ＩＳ１７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂ細胞の膜に結合された免疫グロブリンＡに特異的に結合するが、分泌され た免疫グロブリンＡには結合しない抗体製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。 ２．抗体又は抗原結合部位を含む抗体断片若しくはペプチドを含む請求項１記載 の抗体製剤。 ３．免疫グロブリンＡ鎖の膜結合領域の細胞外領域に特異的に結合する抗体製剤 。 ４．ペプチドＧＳＣＳ（又はＣ）Ｖ・ＡＤＷＱＭ・ＰＰＰＹＶ・ＶＬＤＬＰ・Ｑ ＥＴＬＥ・ＥＥＰＧ・ＡＮ又はそのエピトープと結合する請求項３記載の抗体製 剤。 ５．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが，分泌された可溶性ＩｇＡとは結合し ないモノクローナル抗体。 ６．ＧＳＣＳ（又はＣ）Ｖ・ＡＤＷＱＭ・ＰＰＰＹＶ・ＶＬＤＬＰ・ＱＥＴＬＥ ・ＥＥＰＧ・ＡＮ又はそのエピトープと結合する請求項５記載のモノクローナル 抗体。 ７．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが、分泌された可溶性１ｇＡとは結合せ ず、ネズミ科動物抗原結会領域及びヒト重鎖定常領域を有するキメラ抗体。 ８．ＩｇＡの膜結合領域の細胞外領域に結合する請求項７記載のキメラ抗体。 ９．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが、分泌された可溶往ＩｇＡとは結合し ないモノクローナル抗体を産生する継続的、安定なセルライン。 １０．ハイプリドーマである請求項９記載のセルライン１１．ネズミ科動物ハイ プリドーマである請求項１０記載のセルラインル １２．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが、分泌された可溶性１ｇＡとは結合 しない抗体の可変領域をコードする、機能的に再構成された遺伝子を含む単離さ れたＤＮＡ。 １３．ヒト定常領域をコードするＤＮＡに結合された請求項１２記載のＤＮＡを 含むＤＮＡ構薬物。 １４．キメラ抗体を分泌する、請求項１３のＤＮＡ構薬物でトランスフェクトさ れたミエローマ細胞。 １５．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが、分泌された可溶性１ｇＡとは結合 しない抗体を投与するニヒを含む、生体内での１ｇＡの生産を刺激する方法。 １６．Ｂ細胞上の膜結合ＩｇＭ又はＩｇＤに結合するが分泌された可溶性のＩｇ Ｍ又はＩｇＤには結合しない抗体を動物に投与することを含む、生体内での１ｇ Ａの生産を刺激する方法。 １７．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが、分泌された可溶性ＩｇＡとは結合 しない抗体のパラトープに対して特異的なモノクローナル抗イディオタイプ抗体 。 １８．ペプチドＧＳＣＳ（又はＣ）Ｖ・ＡＤＷＱＭ・ＰＰＰＹＶ・ＶＬＤＬＰ・ ＱＥＴＬＥ・ＥＥＰＧ・ＡＮに結合する抗体のパラトープに特異的な請求項１７ 記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。 １９．ネズミ科動物由来の抗原結合領域とヒト由来の定常領域を有するキメラ抗 体である請求項１７記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。 ２０．請求項１７記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体の抗原結合性断片 。 ２１．請求項１７記載のモノクローナル抗体を分泌する継続的、安定なセルライ ン。 ２２．Ｂ細胞表面のヒトＩｇＡと結合するが、分泌された可溶性１ｇＡとは結合 しない抗体のパラトープに対して特異的な抗イディオタイプ抗体を人に投与する ことを含むＩｇＡ生産を刺激する方法。 ２３．Ｂ細胞上のＩｇＡの膜結合領域の細胞外領域に対応するアミノ酸配列を含 むペプチド及びその免疫学的に均等な配列。 ２４．ＧＳＣＳ（又はＣ）Ｖ・ＡＤＷＱＭ・ＰＰＰＹＶＶＬＤＬＰ・ＱＥＴＬＥ ・ＥＥＰＧ・ＡＮ又はそのエピトープを含むペプチド及び該ペプチドの免疫学的 活性に有意に影響を与えることなく該ペプチド若しくはそのエピトープにアミノ 酸が付加され、挿入され、欠失され若しくは置換された該ペプチド若しくはその エピトープの修飾物。 ２５．担体タンパク質に結合された請求項２４記載のペプチド。 ２６．Ｂ細胞表面上のＩｇＡの膜結合領域の細胞外領域に対応するアミノ酸配列 を有するペプチドを投与することを含む、生体内におけるＩｇＡの生産を刺激す る方法発明の詳細な説明